CN112608895A - 一种人多能干细胞分化的自然杀伤细胞及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及干细胞生物学领域,公开了一种人多能干细胞分化的自然杀伤细胞的制备方法,包括以下步骤:S1、形成拟胚体;S2、拟胚体定向永久造血分化获得造血前体细胞;S3、造血前体细胞分化获得自然杀伤细胞。本发明还公开了由前述方法制得的自然杀伤作为细胞预防和/或治疗肿瘤的药物组合物的应用。本发明实现了高效稳定的NK细胞的分化,在诱导分化期间使EB贴壁分化以及延长TGFB抑制剂处理,可快递诱导获得10%以上的CD34+CD45+永久造血HPCs,具备高效稳定、成本低、适于规模化细胞制剂生产的优势;本发明的方法操作简便,分化获得的NK细胞具有典型的NK细胞表面标记分子,其抗肿瘤功能要优于脐带血来源的NK细胞,具有极大的科研及临床应用潜能。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞生物学领域,具体涉及一种人多能干细胞分化的自然杀伤细胞及其制备方法与应用。
背景技术
自然杀伤(Nature Killer,NK)细胞对肿瘤细胞具有杀伤作用,特别是嵌合抗原受体NK(CAR-NK)细胞,已经在临床上被报道具有良好的癌细胞清除作用。然而,直接从脐带血或者外周血分离扩增NK细胞具有一定的难度,并且需要对T细胞进行清除,否则会发生严重的移植物抗宿主病(GVHD)。特别地,很多患者体内的NK细胞偏少,可能会导致NK细胞分离扩增失败。同时,不同供体NK细胞质量差异大,致使难以形成标准化产品。
从人的多潜能干细胞(human pluripotent stem cells;hPSCs),包括胚胎干细胞(human embryonic stem cells;hESCs)以及诱导多能干细胞(human inducedpluripotent stem cell;hiPSCs),分化获得自然杀伤细胞(nature killer cells,NK),具有十分重要的应用前景。由于hPSCs具有无限增值的能力,为NK细胞的获得提供稳定的细胞来源。因此,在体外从hPSCs大规模标准化地制备NK细胞,是NK细胞产品成药的有效的解决途径。
在造血分化过程中,hPSCs首先分化为造血前体细胞,然后再进一步分化为自然杀伤细胞。值得注意的是,在造血分化过程中存在着原始造血(primitive hematopoiesis)和永久造血(definitive hematopoiesis)两个阶段,而原始造血分化获得的造血前体细胞(hematopoietic progenitor cells,HPCs)不具备有效分化为淋巴细胞(包括T、B和NK细胞)的能力,而只有永久造血分化获得的HPCs具备有效分化为淋巴细胞,如NK细胞的能力。已有报道表明,在早期造血分化过程中,通过短暂地添加TGFB抑制剂,可以抑制原始造血;并且通过上述方法,可以特异地富集永久造血分化得到HPCs,具备高效分化为NK细胞的能力;但是,现有的永久造血分化体系,分化获得HPCs的效率较低,从而限制了从人多能干细胞高效诱导获得NK细胞。
现有技术中,专利CN102388130A公开了一种多能细胞的分化,其至少存在以下问题:造血分化未绕过原始造血阶段,且未进行NK细胞分化。
专利CN107429230A公开了一种用于诱导造血细胞分化的方法和组合物,其至少存在以下问题:(1)EB 3D培养效率低;(2)使用成分不确定的商业培养基以及血清等异源物质,不利于临床级别的细胞产品制备;(3)需要富集CD34+CD45+细胞进行NK细胞诱导,过程繁琐。
专利CN102822332A公开了一种从源于hESC的成血管细胞产生自然杀伤细胞和树突细胞的方法,其至少存在以下问题:(1)使用了成分不明确的昂贵的商业培养基以及含血清培养基;(2)没有绕过原始造血阶段;(3)分化过程中涉及将EB消化为单细胞并接种到Methylcellulose培养体系中以进行下一步分化,过程繁琐,不利于临床级细胞的规模化生产。
专利CN111235105A公开了一种从人多能干细胞分化为自然杀伤细胞的方法及应用,其至少存在以下问题:(1)永久造血得到的CD34+CD45+HPCs比例低,不利于后续大规模地分化获得NK;(2)专利中提到的分化得到的造血干细胞或者造血祖细胞,大部分为CD34+CD45-的内皮细胞或者间充质细胞,因而,其通过各种优化所得的诱导分化条件,并不确定是否可以直接有助于HPCs的生成。
综上所述,NK细胞具有重要的肿瘤免疫治疗前景,而人多能干细胞可以为NK细胞的制备提供稳定可靠的细胞来源。鉴于已有NK细胞分化体系效率较低、操作复杂,因此急需开发一种高效、稳定、简便的人多能干细胞向NK细胞制备体系,为NK细胞的规模化制备和临床应用奠定基础。
发明内容
本发明的目的是针对已有人多能干细胞分化获得NK细胞体系的低效、操作复杂等一系列问题,提供一种快速高效、简便的人多能干细胞诱导分化为自然杀伤细胞的方法。
本发明的另一目的是提供由上述方法分化而得的自然杀伤细胞。
本发明的另一目的是提供上述自然杀伤细胞作为药物组合物的应用。
为达到上述目的,本发明采用以下技术方案:
第一方面,一种从人多能干细胞诱导分化获得的自然杀伤细胞,其表达表面标记分子CD56、NKp46、CD94和CD16。
第二方面,一种从人多能干细胞定向诱导分化为自然杀伤细胞的方法,包括以下步骤:
S1、形成拟胚体;
S2、拟胚体定向永久造血分化获得造血前体细胞;
S3、造血前体细胞分化获得自然杀伤细胞。
进一步地,所述步骤S1包括:将人多能干细胞制备成单细胞悬液,然后接种到培养容器中,在添加有抗凋亡抑制剂的情况下,静置以形成拟胚体。
进一步地,所述步骤S2包括:
S21、将拟胚体静置,使之自然沉降,然后去除原有培养基,并加入第一分化培养基重悬拟胚体,再转移到包被有基质蛋白的培养器皿中,使拟胚体贴壁分化培养;
所述第一分化培养基是在基础培养基中,添加BMP信号通路激活剂和细胞因子;
S22、去除第一分化培养基,加入第二分化培养基进行诱导分化,直至高效获得永久造血的HPCs;
所述第二分化培养基是在第一分化培养基的基础上加上TGFB抑制剂。
进一步地,所述基质蛋白为纤维粘连蛋白(Fibronectin)、层粘连蛋白(Laminin)、玻璃粘连蛋白(Vitronectin)、胶原蛋白(Collagen)、粘接细胞黏附分子-1(MAdCAM-1)、血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)、细胞间黏附分子(ICAM)及其变体中的至少一种。
进一步地,所述BMP信号通路激活剂选自BMP2、BMP4、SB4、SJ000291942、SJ000063181、SJ000370178、异甘草素、香叶木素、芹菜素、鹰嘴豆芽素中的至少一种。
进一步地,所述细胞因子选自EGF、VEGF、bFGF、SCF、FLT3L、IL3、IL6、IGF-1、TPO、PGF、PDGF中的至少一种。
进一步地,所述TGFB抑制剂选自Lefty-A、Lefty-B、Lefty-1、Lefty-2、SB431542、SB202190、SB505124、NPC30345、SD093、SD908、SD208、LY2109761、LY364947、LT580276、A83-01及其衍生物中的至少一种。
第二分化培养基中TGFB抑制剂累计的处理时间为1~2周。
进一步地,所述步骤S3包括:去除第二分化培养基,然后加入第三分化培养基,造血前体细胞诱导分化为自然杀伤细胞;所述第三分化培养基是在基础培养基中添加集落刺激因子、白细胞介素。
进一步地,所述集落刺激因子选自G-CSF、M-CSF、GM-CSF、IL-3、EPO、TPO、SCF、FLT3-L中的至少一种。
进一步地,第三分化培养基所述白细胞介素选自IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-27中的至少一种。
进一步地,所述方法还包括步骤S4:去除第三分化培养基,加入第四分化培养基进行自然杀伤细胞的扩增培养;所述第四分化培养基是在基础培养基中添加白细胞介素和促进自然杀伤细胞成熟和扩增的物质。
进一步地,第四分化培养基所述白细胞介素选自IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-27中的至少一种;所述促进自然杀伤细胞成熟和扩增的物质为维生素C及其衍生物的至少一种。
更具体地,制备上述自然杀伤细胞的方法的步骤如下:
1、Day-1到Day0:拟胚体(Embryoid body,EB)的形成
将生长状态良好的hPSCs消化为单细胞,并重悬在人多能干细胞培养基中,在添加有抗凋亡抑制剂的情况下,静置过夜,形成大小和形态较为均匀的EB球。
上述过程的实验细节如下
(1)实验所用hPSCs为hiPSCs以及商品化的hESCs,经过严格的多能性验证,在正常的人多能干细胞培养基(包括E8、mTeSR或其它类似培养基等)中维持培养。
(2)EB的形成
上述方法培养的hPSCs在生长密度处于80%左右时进行拟胚体形成实验。具体方法为:使用TrypLE或Accutase或EDTA将hPSCs完全消化为单细胞悬液,并加入抗凋亡抑制剂,如Rock抑制剂(Y27632、Thiazovivin、HA100、HA1152和Blebbistatin等),抑制剂的浓度为0.1~100μM,细胞浓度为0.01×106~10×106/mL。
2、Day0到Day12:EB向永久造血HPCs分化
(1)Day0:更换第一分化培养基
将EB悬液收集到离心管中,静置,使EB下沉,然后去除原有培养基,并加入新的第一分化培养基重悬EB,再转移到包被有基质蛋白的培养器皿中,使EB贴壁分化培养;培养的时长是2~4天。其中,基础培养基的成分为:DMEM/F12+1~10μg/ml Human Insulin+1~500μg/ml Human Transferrin+1~500ng/ml Na Selenium+1~500μg/mL维生素C。其中所述第一分化培养基是在基础培养基中添加BMP信号通路激活剂,例如BMP2、BMP4、SB4、ventromorphins(SJ000291942,SJ000063181,SJ000370178)、异甘草素(isoliquiritigenin)、香叶木素(diosmetin)、芹菜素(apigenin)和鹰嘴豆芽素(biochanin)等,以及细胞因子,例如EGF、VEGF、bFGF、SCF、FLT3L、IL3、IL6、IGF-1、TPO、PGF和PDGF等。BMP信号通路激活剂的浓度不超过500ng/mL;细胞因子的浓度不超过500ng/mL。
(2)Day2~12:更换第二分化培养基
去除第一分化培养基,加入新鲜的第二分化培养基。第二分化培养基是在基础培养基中添加BMP信号通路激活剂、细胞因子、TGFB抑制剂。BMP信号通路激活剂如BMP2、BMP4、SB4、ventromorphins(SJ000291942,SJ000063181,SJ000370178)、异甘草素(isoliquiritigenin)、香叶木素(diosmetin)、芹菜素(apigenin)和鹰嘴豆芽素(biochanin)等;细胞因子如EGF、VEGF、bFGF、SCF、FLT3L、IL3、IL6、IGF-1、TPO、PGF和PDGF等;TGFB抑制剂选自Lefty-A、Lefty-B、Lefty-1、Lefty-2、SB431542、SB202190、SB505124、NPC30345、SD093、SD908、SD208、LY2109761、LY364947、LT580276、A83-01,以及它们的衍生物。TGFB抑制剂的浓度为0.1~20μM,细胞因子、BMP信号通路激活剂的浓度与前一步骤相似。视细胞密度,每隔2~4天更换培养基。
(3)在贴壁分化的Day6~12天,可对所得永久造血分化的HPCs进行检测。永久造血HPCs的表面标记分子为CD34+CD45+。
3、永久造血所得HPCs向NK细胞分化
更换第三分化培养基,使永久造血所得HPCs向NK细胞分化两周。在第2周结束时(Day20-26)收获含有高CD3-CD56+的NK细胞。
HPCs向NK细胞分化的实验细节
(1)在EB贴壁分化的Day6~12天,培养基上清中存在少量悬浮的CD34+CD45+细胞,可一并收集,并进行下一步分化。将收集的悬浮细胞与新鲜的第三分化培养基混合,并加入贴壁培养细胞的器皿中,使细胞进行下一步分化。第三分化培养基是在基础培养基中添加集落刺激因子和白细胞介素。集落刺激因子选自G-CSF、M-CSF、GM-CSF、IL-3、EPO、TPO、SCF、FLT3-L中的至少一种。白细胞介素选自IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-27中的至少一种。
集落刺激因子是TPO、SCF、FLT3-L时,浓度分别为≤100ng/mL、1~500ng/mL、1~500ng/mL,作用的时间段是接种后的第1周、第2周或第1~2周。
白细胞介素是IL-2、L-7、IL-15时,浓度分别为≤1000IU/mL、1~500ng/mL和1~500ng/mL,作用的时间段是EB接种后的第1周、第2周或第1-2周。
第三分化培养基的时间点可以在Day6~Day12之间。视细胞密度,每隔3~4天换液或补液。
(2)NK细胞分化两周后,收集悬浮细胞用流式细胞术检测细胞表面相关指标蛋白的表达情况。检测指标包括:CD56、NKp46、CD94、CD16。
4、NK细胞的扩增
第三步形成的NK细胞转移到扩增培养基进行细胞扩增,扩增时间为1~2周,其实验操作细节如下:收集上清中的NK细胞,转入第四分化培养基中。第四分化培养基是在基础培养基中添加白细胞介素及其它促进NK细胞成熟和扩增的物质。白细胞介素是选自IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-27中的至少一种。当所选白介素白细胞介素是IL-2、IL-12、IL-18、IL-21、IL-27和IL-15时,浓度分别为100~1000IU/mL、≤100ng/mL、≤100ng/mL、≤100ng/mL、≤100ng/mL、5~100ng/mL;其它促进NK细胞成熟和扩增的物质是Vc,浓度不超过1000μg/mL。经过扩增的NK细胞,用流式细胞术检测细胞表面相关指标蛋白的表达情况。检测指标包括:CD56、NKp46、CD94、CD16。
本领域技术人员还可以利用上述永久造血的诱导方法,从人多能干细胞诱导分化获得永HPCs,并进一步诱导为T、B等其它淋巴细胞。
在本发明中:
BMP信号通路激活剂是激活BMP信号通路的物质,可选择BMP2、BMP4、SB4、SJ000291942、SJ000063181、SJ000370178、异甘草素、香叶木素、芹菜素和鹰嘴豆芽素等,优选为BMP4。培养基中BMP4的浓度只要是激活BMP信号通路即可,没有特别的限定,例如1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml,优选为2~20ng/ml。
TGFB抑制剂是抑制TGFB信号通路的物质,可选择Lefty-A、Lefty-B、Lefty-1、Lefty-2、SB431542、SB202190、SB505124、NPC30345、SD093、SD908、SD208、LY2109761、LY364947、LT580276、A83-01,以及它们的衍生物。优选SB431542。培养基中TGFB抑制剂浓度只要是能移植TGFB信号通路即可,没有特别的限定,例如为1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、20μM、25μM、50μM,但不限于此,优选为1~20μM。
集落刺激因子是能刺激的造血干细胞增殖和分化的细胞因子。可选择G-CSF、MCSF、GM-CSF、multi-CSF(IL-3)、EPO、TPO、SCF和FLT3-L等。优选G-CSF、GM-CSF、TPO、SCF、FLT3-L和IL3中的至少一种。培养基中集落刺激因子的浓度只要是能刺激造血干细胞增殖和分化即可,没有特别的限定,例如TPO的浓度为2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml;SCF的浓度为10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、80ng/ml、100ng/ml、150ng/ml、200ng/ml;FLT3-L的浓度为1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、80ng/ml、100ng/ml、150ng/ml、200ng/ml。
细胞因子是能刺激细胞增殖和细胞分化天然的蛋白。可选择EGF、VEGF、bFGF、IGF-1、PGF、PDGF等。优选VEGF和bFGF。培养基中细胞因子的浓度只要是能刺激细胞增殖和细胞分化即可,没有特别的限定。VEGF的浓度为1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、150ng/ml、200ng/ml;bEGF的浓度为5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、150ng/ml、200ng/ml。
白细胞介素是能介导免疫细胞激活、增殖与分化的细胞因子。在不同的分化阶段可选择IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-27等中的至少一种。优选的白细胞介素为IL-2、IL-7和IL-15。培养基中白细胞介素的浓度只要是能介导免疫细胞激活、增殖与分化即可,没有特别的限定,例如IL-2的浓度为50IU/ml、100IU/ml、200IU/ml、300IU/ml、400IU/ml、500IU/ml、700IU/ml、800IU/ml、1000IU/ml、2000IU/ml;IL-7的浓度为1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml;IL-15的浓度为1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、80ng/ml、100ng/ml、150ng/ml、200ng/ml。
抗凋亡ROCK抑制剂是抑制Rho激酶(ROCK)功能的物质。可选择Y-27632、Thiazovivin、HA100、HA1152和Blebbistatin等。优选Y-27632。培养基中抗凋亡ROCK抑制剂的浓度只要是抑制Rho激酶的浓度即可,没有特别限定,例如为1μM、1.5μM、2μM、2.5μM、3μM、3.5μM、4μM、4.5μM、5μM、5.5μM、6μM、6.5μM、7μM、7.5μM、8μM、9μM、10μM、15μM、20μM、30μM、50μM。
第三方面,一种自然杀伤细胞,其由上述的方法制备而得。
第四方面,一种细胞群,其富集有上述的自然杀伤细胞。
第五方面,预防和/或治疗肿瘤的药物组合物,作为有效成分包含上述的自然杀伤细胞。
本发明的关键创新点在于:
第一,在起始造血分化时促使EB贴壁,进而提高人多能干细胞造血分化的效率。
第二,现有研究会在早期造血分化过程中(day2~4,这一阶段决定了细胞是向原始造血分化还是向永久造血分化)添加TGFB抑制剂抑制TGFB信号通路,其目的是抑制原始造血,仅保留永久造血,在这之后(day5之后)并不添加TGFB抑制剂,最终,永久造血生成的HPCs得率较低。本发明在内皮向造血前体细胞转变时(day5~12)继续添加TGFB抑制剂,通过延长TGFB抑制剂的处理时间(1~2周),发现可以促进永久造血,富集并提高人多能干细胞永久造血分化得到HPCs的得率。
第三,优化了NK细胞的诱导和扩增条件,使得可以在成分确定的条件下,简单高效地诱导并获得NK细胞。
本发明具有以下有益效果:
1、本发明实现了高效稳定的NK细胞的分化,在诱导分化期间使EB贴壁分化以及延长TGFB抑制剂处理时间,可在1~2周左右诱导获得10%以上的CD34+CD45+永久造血HPCs;可进一步在4~5周左右从1×105的hiPSC获得大于1×108的具有功能的NK细胞,其纯度达到90%以上,具备高效稳定、成本低、适于规模化细胞制剂生产的优势。
2、本发明的方法操作简便,整个过程不使用成分不明确的商品化培养基、血清以及基质细胞,同时无需复杂的仪器设备、也不需要进行细胞分选及重铺;并且尽量减少了细胞因子的使用,具有操作简便成本低廉的特点,且分化获得的NK细胞具有典型的NK细胞表面标记分子,其抗肿瘤功能要优于脐带血来源的NK细胞,具有极大的科研及临床应用潜能。
3、NK细胞分化和扩增培养基的成分简单,不需要用到外源基质细胞或者额外添加NOTCH信号的激活配体,如DLL1或者DLL4等。这是由于分化过程中的其它细胞,如内皮细胞等自身会表达NOTCH信号。本发明的方法不需要对CD34+CD45+细胞进行富集,也不需要对细胞进行细化处理或者重铺,因此简便了NK的诱导流程,有利于NK细胞的工业化生产。
附图说明
图1为实施例1和对比例1的流式细胞术结果图;
图2为实施例1和对比例2的流式细胞术结果图;
图3为实施例1分化第四周NK细胞表达表面标记分子的流式细胞图;
图4为实施例1的NK细胞扩增后表达表面标记分子的流式细胞图;
图5为实施例1的NK细胞对K562癌细胞的作用曲线图。
具体实施方式
下列实施例中未注明具体条件的实验方法,按照常规方法和条件,或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均通过市售可得。
实施例1
一种从人多能干细胞定向诱导分化为自然杀伤细胞的方法,包括以下步骤:
S1、形成拟胚体;
S2、拟胚体定向永久造血分化获得造血前体细胞;
S3、造血前体细胞分化获得自然杀伤细胞;
S4:自然杀伤细胞的扩增。
具体步骤如下:
1、Day-1到day0:拟胚体的形成
将生长状态良好的hPSCs消化为单细胞,并重悬在人多能干细胞培养基中,在添加有抗凋亡抑制剂的情况下,静置过夜,形成大小和形态较为均匀的EB球。实验所用hPSCs为hiPSCs以及商品化的hESCs,经过严格的多能性验证,在正常的人多能干细胞培养基E8中维持培养。
上述方法培养的hPSCs在生长密度处于80%左右时进行拟胚体形成实验。具体方法为:使用TrypLE将hPSCs完全消化为单细胞悬液,并加入抗凋亡抑制剂Y27632,抑制剂的浓度为10μM,细胞浓度为5×106/mL。
2、Day0到Day12:EB向永久造血HPCs分化
(1)Day0:更换第一分化培养基
将EB悬液收集到离心管中,静置,使EB自然沉降,然后去除原有培养基,并加入新的第一分化培养基重悬EB,再转移到包被有基质蛋白的培养器皿中,使EB贴壁分化培养;培养的时长是2~4天。
基础培养基的成分为:DMEM/F12+5μg/ml Human Insulin+200μg/ml HumanTransferrin+300ng/ml Na Selenium+50μg/mL维生素C。
第一分化培养基是在基础培养基中,添加BMP信号通路激活剂BMP4和细胞因子VEGF。BMP信号通路激活剂浓度为300ng/mL;细胞因子浓度为200ng/mL。基质蛋白为接细胞黏附分子-1。
(2)Day2~12:更换第二分化培养基
去除第一分化培养基,加入新鲜的第二分化培养基。第二分化培养基是在基础分化培养基中添加BMP信号通路激活剂、细胞因子和TGFB抑制剂,BMP信号通路激活剂、细胞因子与第一分化培养基相同,TGFB抑制剂为SB431542。BMP信号通路激活剂、细胞因子的浓度与第一分化培养基相同或相近,TGFB抑制剂浓度是50μM。视细胞密度,每隔2~4天更换培养基。
(3)在贴壁分化的day6~12天,可对所得永久造血分化的HPCs进行检测,永久造血HPCs的表面标记分子为CD34+CD45+。
3、永久造血所得HPCs向NK细胞分化:更换第三分化培养基,使永久造血所得HPCs向NK细胞分化两周,在第2周结束时(Day20-26)收获含有高CD3-CD56+的NK细胞。
(1)在EB贴壁分化的day6~12天,培养基上清中存在少量悬浮的CD34+CD45+细胞,可一并收集,并进行下一步分化。将收集的悬浮细胞与新鲜的第三分化培养基混合,并加入贴壁培养细胞的器皿中,使细胞进行下一步分化。
第三分化培养基是在基础培养基中添加集落刺激因子和白细胞介素。
集落刺激因子是TPO、SCF、FLT3-L。
白细胞介素是IL-2、IL-7、IL-15。
集落刺激因子TPO、SCF、FLT3-L的浓度分别为50ng/mL、100ng/mL、100ng/mL
白细胞介素IL-2、L-7、IL-15的浓度分别为800IU/mL、200ng/mL和400ng/mL。
集落刺激因子、白细胞介素作用的时间段是EB接种后的第1周至第2周,第三分化培养基的时间点可以在Day6至Day12间。视细胞密度,每隔3~4天半换液或补液。
(2)NK细胞分化两周后,收集悬浮细胞用流式细胞术检测细胞表面相关指标蛋白的表达情况,检测指标包括:CD56、NKp46、CD94、CD16。图3显示了分化第4周左右,所得NK细胞表达CD56、NKp46、CD94、CD16的情况,说明获得了NK细胞。
4、NK细胞的扩增
第三步形成的NK细胞转移到第四分化培养基进行扩增培养,扩增时间为1~2周,实验操作细节如下:
收集上清中的NK细胞,转入第四分化培养基中。第四分化培养基是在基础培养基中添加白细胞介素和促进NK细胞成熟和扩增的物质。
白细胞介素是IL-2,浓度为500IU/mL。
促进NK细胞成熟和扩增的物质是Vc,浓度为600μg/mL。
经过扩增的NK细胞,可用流式细胞仪进一步检测NK细胞表面标记蛋白的表达情况,如图4所示,检测到扩增后的NK细胞表达NK细胞的标记分子CD56,但不表达T细胞的表面标记分子CD3;且人多能干细胞诱导分化而来的NK细胞期肿瘤杀伤作用比脐带血来源的NK细胞要强,如图5所示,NK对K562癌细胞产生了显著的细胞毒作用,细胞杀伤能力比脐带血来源的NK细胞(CB-NK)要强。
对比例1
研究普通的EB培养方法对永久造血分化生成CD34+CD45+造血前体细胞的影响。
与实施例1的不同在于,在Day0更换第一分化培养基重悬EB后,转移到普通的培养器皿(没有包被基质蛋白)中,使EB分化培养;而且都没有在Day5~12添加TGFB抑制剂。
图1中,左边为对比例1方法(EB法)的流式细胞术结果图,右边为EB贴壁法(参照实施例1,但是在Day5~12的第二分化培养基不加TGFB抑制剂)的流式细胞术结果图,通过将EB贴壁分化到第12天,与不贴壁的EB分化法相对比,永久造血CD34+CD45+HPCs的得率更高(6.16>0.77)。这说明直接将EB贴壁分化有助于高效地获得永久造血分化而来的CD34+CD45+HPCs,而高效的HPCs诱导,有助于提高最终NK细胞的得率。
对比例2
研究在Day5~12添加TGFB抑制剂对HPCs得率的影响。
与实施例1的不同在于,在EB向永久造血HPCs分化时,仅在Day2~4的分化培养基中添加TGFB抑制剂,在Day5~12的分化培养基中不添加TGFB抑制剂。
图2中,左边为对比例2方法第12天的流式细胞术结果图,右边为实施例1方法第12天的流式细胞术结果图,TGFB抑制剂的SB431542的处理时间会显著影响最终永久造血分化生成CD34+CD45+HPC的得率,通过延长SB431542的处理时间,可以显著提高HPCs的得率(19.6>8.39)。
实施例2
一种从人多能干细胞定向诱导分化为自然杀伤细胞的方法,具体步骤如下:
1、Day-1到day0:拟胚体的形成
将生长状态良好的hPSCs消化为单细胞,并重悬在人多能干细胞培养基中,在添加有抗凋亡抑制剂的情况下,静置过夜,形成大小和形态较为均匀的EB球。实验所用hPSCs为hiPSCs以及商品化的hESCs,经过严格的多能性验证,在正常的人多能干细胞培养基mTeSR中维持培养。
上述方法培养的hPSCs在生长密度处于80%左右时进行拟胚体形成实验。具体方法为:使用Accutase将hPSCs完全消化为单细胞悬液,并加入抗凋亡抑制剂HA100,抑制剂的浓度为1μM,细胞浓度为8×106/mL。
2、Day0到Day12:EB向永久造血HPCs分化
(1)Day0:更换第一分化培养基
将EB悬液收集到离心管中,静置,使EB自然沉降,然后去除原有培养基,并加入新的第一分化培养基重悬EB,再转移到包被有基质蛋白的培养器皿中,使EB贴壁分化培养;培养的时长是2~4天。
基础培养基的成分为:DMEM/F12+2μg/ml Human Insulin+100μg/ml HumanTransferrin+50ng/ml Na Selenium+200μg/mL维生素C。
第一分化培养基是在基础培养基中,添加BMP信号通路激活剂SJ000291942、SJ000063181和细胞因子bFGF、SCF。BMP信号通路激活剂浓度为500ng/mL;细胞因子浓度为400ng/mL。基质蛋白为玻璃粘连蛋白。
(2)Day2~12:更换第二分化培养基
去除第一分化培养基,加入新鲜的第二分化培养基。第二分化培养基是在基础分化培养基中添加BMP信号通路激活剂、细胞因子和TGFB抑制剂,BMP信号通路激活剂与第一分化培养基相同,细胞因子为PGF,TGFB抑制剂为NPC30345和SD093。BMP信号通路激活剂、细胞因子的浓度与第一分化培养基相同或相近,TGFB抑制剂浓度是1μM。视细胞密度,每隔2~4天更换培养基。
(3)在贴壁分化的day6~12天,可对所得永久造血分化的HPCs进行检测,永久造血HPCs的表面标记分子为CD34+CD45+。
3、永久造血所得HPCs向NK细胞分化:更换第三分化培养基,使永久造血所得HPCs向NK细胞分化两周,在第2周结束时(Day20-26)收获含有高CD3-CD56+的NK细胞。
(1)在EB贴壁分化的day6~12天,培养基上清中存在少量悬浮的CD34+CD45+细胞,可一并收集,并进行下一步分化。将收集的悬浮细胞与新鲜的第三分化培养基混合,并加入贴壁培养细胞的器皿中,使细胞进行下一步分化。
第三分化培养基是在基础培养基中添加集落刺激因子和白细胞介素。
集落刺激因子是M-CSF、GM-CSF。
白细胞介素是IL-12。
集落刺激因子M-CSF、GM-CSF的浓度分别为60ng/mL、200ng/mL。
白细胞介素IL-12的浓度为300ng/mL。
集落刺激因子、白细胞介素作用的时间段是EB接种后的第1周至第2周,第三分化培养基的时间点可以在Day6至Day12间。视细胞密度,每隔3~4天半换液或补液。
(2)NK细胞分化两周后,收集悬浮细胞用流式细胞术检测细胞表面相关指标蛋白的表达情况,检测指标包括:CD56、NKp46、CD94、CD16。
4、NK细胞的扩增
第三步形成的NK细胞转移到第四分化培养基进行扩增培养,扩增时间为1~2周,实验操作细节如下:
收集上清中的NK细胞,转入第四分化培养基中。第四分化培养基是在基础培养基中添加白细胞介素和促进NK细胞成熟和扩增的物质。
白细胞介素是IL-12、IL-18;IL-12浓度为100ng/mL,IL-18浓度为50ng/mL。
促进NK细胞成熟和扩增的物质是Vc,浓度为500μg/mL。
经过扩增的NK细胞,可用流式细胞仪进一步检测NK细胞表面标记蛋白的表达情况。
实施例3
一种从人多能干细胞定向诱导分化为自然杀伤细胞的方法,具体步骤如下:
1、Day-1到day0:拟胚体的形成
将生长状态良好的hPSCs消化为单细胞,并重悬在人多能干细胞培养基中,在添加有抗凋亡抑制剂的情况下,静置过夜,形成大小和形态较为均匀的EB球。实验所用hPSCs为hiPSCs以及商品化的hESCs,经过严格的多能性验证,在正常的人多能干细胞培养基mTeSR中维持培养。
上述方法培养的hPSCs在生长密度处于80%左右时进行拟胚体形成实验。具体方法为:使用EDTA将hPSCs完全消化为单细胞悬液,并加入抗凋亡抑制剂Blebbistatin,抑制剂的浓度为50μM,细胞浓度为0.1×106/mL。
2、Day0到Day12:EB向永久造血HPCs分化
(1)Day0:更换第一分化培养基
将EB悬液收集到离心管中,静置,使EB自然沉降,然后去除原有培养基,并加入新的第一分化培养基重悬EB,再转移到包被有基质蛋白的培养器皿中,使EB贴壁分化培养;培养的时长是2~4天。
基础培养基的成分为:DMEM/F12+10μg/ml Human Insulin+400μg/ml HumanTransferrin+20ng/ml Na Selenium+300μg/mL维生素C。
第一分化培养基是在基础培养基中,添加BMP信号通路激活剂异甘草素、鹰嘴豆芽素和细胞因子IL3、TPO。BMP信号通路激活剂浓度为100ng/mL;细胞因子浓度为50ng/mL。基质蛋白为纤维粘连蛋白和细胞间黏附分子。
(2)Day2~12:更换第二分化培养基
去除第一分化培养基,加入新鲜的第二分化培养基。第二分化培养基是在基础分化培养基中添加BMP信号通路激活剂、细胞因子和TGFB抑制剂,BMP信号通路激活剂与第一分化培养基相同,细胞因子为bFGF,TGFB抑制剂为Lefty-A。BMP信号通路激活剂、细胞因子的浓度与第一分化培养基相同或相近,TGFB抑制剂浓度是10μM。视细胞密度,每隔2~4天更换培养基。
(3)在贴壁分化的day6~12天,可对所得永久造血分化的HPCs进行检测,永久造血HPCs的表面标记分子为CD34+CD45+。
3、永久造血所得HPCs向NK细胞分化:更换第三分化培养基,使永久造血所得HPCs向NK细胞分化两周,在第2周结束时(Day20-26)收获含有高CD3-CD56+的NK细胞。
(1)在EB贴壁分化的day6~12天,培养基上清中存在少量悬浮的CD34+CD45+细胞,可一并收集,并进行下一步分化。将收集的悬浮细胞与新鲜的第三分化培养基混合,并加入贴壁培养细胞的器皿中,使细胞进行下一步分化。
第三分化培养基是在基础培养基中添加集落刺激因子和白细胞介素。
集落刺激因子是EPO。
白细胞介素是IL-21、IL-27。
集落刺激因子EPO的浓度为300ng/mL。
白细胞介素IL-21、IL-27的浓度分别为50ng/mL和200ng/mL。
集落刺激因子、白细胞介素作用的时间段是EB接种后的第1周至第2周,第三分化培养基的时间点可以在Day6至Day12间。视细胞密度,每隔3~4天半换液或补液。
(2)NK细胞分化两周后,收集悬浮细胞用流式细胞术检测细胞表面相关指标蛋白的表达情况,检测指标包括:CD56、NKp46、CD94、CD16。
4、NK细胞的扩增
第三步形成的NK细胞转移到第四分化培养基进行扩增培养,扩增时间为1~2周,实验操作细节如下:
收集上清中的NK细胞,转入第四分化培养基中。第四分化培养基是在基础培养基中添加白细胞介素和促进NK细胞成熟和扩增的物质。
白细胞介素是IL-27,浓度为100ng/mL。
促进NK细胞成熟和扩增的物质是Vc,浓度为800μg/mL。
经过扩增的NK细胞,可用流式细胞仪进一步检测NK细胞表面标记蛋白的表达情况。
实施例4
一种从人多能干细胞定向诱导分化为自然杀伤细胞的方法,具体步骤如下:
1、Day-1到day0:拟胚体的形成
将生长状态良好的hPSCs消化为单细胞,并重悬在人多能干细胞培养基中,在添加有抗凋亡抑制剂的情况下,静置过夜,形成大小和形态较为均匀的EB球。实验所用hPSCs为hiPSCs以及商品化的hESCs,经过严格的多能性验证,在正常的人多能干细胞培养基E8中维持培养。
上述方法培养的hPSCs在生长密度处于80%左右时进行拟胚体形成实验。具体方法为:使用TrypLE将hPSCs完全消化为单细胞悬液,并加入抗凋亡抑制剂Thiazovivin,抑制剂的浓度为5μM,细胞浓度为0.5×106/mL。
2、Day0到Day12:EB向永久造血HPCs分化
(1)Day0:更换第一分化培养基
将EB悬液收集到离心管中,静置,使EB自然沉降,然后去除原有培养基,并加入新的第一分化培养基重悬EB,再转移到包被有基质蛋白的培养器皿中,使EB贴壁分化培养;培养的时长是2~4天。
基础培养基的成分为:DMEM/F12+1μg/ml Human Insulin+80μg/ml HumanTransferrin+400ng/ml Na Selenium+200μg/mL维生素C。
第一分化培养基是在基础培养基中,添加BMP信号通路激活剂BMP2和细胞因子FLT3。BMP信号通路激活剂浓度为50ng/mL;细胞因子浓度为150ng/mL。基质蛋白为胶原蛋白。
(2)Day2~12:更换第二分化培养基
去除第一分化培养基,加入新鲜的第二分化培养基。第二分化培养基是在基础分化培养基中添加BMP信号通路激活剂、细胞因子和TGFB抑制剂,BMP信号通路激活剂与第一分化培养基相同,细胞因子为TPO、SCF,TGFB抑制剂为LY364947。BMP信号通路激活剂、细胞因子的浓度与第一分化培养基相同或相近,TGFB抑制剂浓度是8μM。视细胞密度,每隔2~4天更换培养基。
(3)在贴壁分化的day6~12天,可对所得永久造血分化的HPCs进行检测,永久造血HPCs的表面标记分子为CD34+CD45+。
3、永久造血所得HPCs向NK细胞分化:更换第三分化培养基,使永久造血所得HPCs向NK细胞分化两周,在第2周结束时(Day20-26)收获含有高CD3-CD56+的NK细胞。
(1)在EB贴壁分化的day6~12天,培养基上清中存在少量悬浮的CD34+CD45+细胞,可一并收集,并进行下一步分化。将收集的悬浮细胞与新鲜的第三分化培养基混合,并加入贴壁培养细胞的器皿中,使细胞进行下一步分化。
第三分化培养基是在基础培养基中添加集落刺激因子和白细胞介素。
集落刺激因子是FLT3-L。
白细胞介素是IL-6。
集落刺激因子FLT3-L的浓度为300ng/mL。
白细胞介素IL-6的浓度为500ng/mL。
集落刺激因子、白细胞介素作用的时间段是EB接种后的第1周至第2周,第三分化培养基的时间点可以在Day6至Day12间。视细胞密度,每隔3~4天半换液或补液。
(2)NK细胞分化两周后,收集悬浮细胞用流式细胞术检测细胞表面相关指标蛋白的表达情况,检测指标包括:CD56、NKp46、CD94、CD16。
4、NK细胞的扩增
第三步形成的NK细胞转移到第四分化培养基进行扩增培养,扩增时间为1~2周,实验操作细节如下:
收集上清中的NK细胞,转入第四分化培养基中。第四分化培养基是在基础培养基中添加白细胞介素和促进NK细胞成熟和扩增的物质。
白细胞介素是IL-15、IL-21。IL-15浓度位10ng/mL,IL-21浓度为60ng/mL。
促进NK细胞成熟和扩增的物质是Vc,浓度为200μg/mL。
经过扩增的NK细胞,可用流式细胞仪进一步检测NK细胞表面标记蛋白的表达情况。
本发明中的诱导方法具备工业化生产的优势,比如EB的形成方法简便;永久造血分化生成HPCs的得率高,且添加的细胞因子经过优化后组合简单、成本降低;HPCs向NK细胞分化的过程中,无需对HPCs进行富集分选,也无需消化重铺,由于HPCs具有较高的得率,且分化所得内皮细胞中表达NOTCH信号配体;因此,可以直接通过更换培养基,实现诱导HPCs向NK细胞诱导分化。因此,整个hPSCs诱导分化NK的过程简便,以利于工业化生产。
以上所述,仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种从人多能干细胞诱导分化获得的自然杀伤细胞,其表达表面标记分子CD56、NKp46、CD94和CD16。
2.一种从人多能干细胞定向诱导分化为自然杀伤细胞的方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、形成拟胚体;
S2、拟胚体定向永久造血分化获得造血前体细胞;
S3、造血前体细胞分化获得自然杀伤细胞。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述步骤S1包括:将人多能干细胞制备成单细胞悬液,然后接种到培养容器中,在添加有抗凋亡抑制剂的情况下,静置以形成拟胚体。
4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述步骤S2包括:
S21、将拟胚体静置,使之自然沉降,然后去除原有培养基,并加入第一分化培养基重悬拟胚体,再转移到包被有基质蛋白的培养器皿中,使拟胚体贴壁分化培养;
所述第一分化培养基是在基础培养基中,添加BMP信号通路激活剂和细胞因子;
S22、去除第一分化培养基,加入第二分化培养基进行诱导分化;
所述第二分化培养基是在第一分化培养基的基础上加上TGFB抑制剂。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述基质蛋白为纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、玻璃粘连蛋白、胶原蛋白、粘接细胞黏附分子-1、血管细胞粘附分子-1、细胞间黏附分子及其变体中的至少一种;所述BMP信号通路激活剂选自BMP2、BMP4、SB4、SJ000291942、SJ000063181、SJ000370178、异甘草素、香叶木素、芹菜素、鹰嘴豆芽素中的至少一种;所述细胞因子选自EGF、VEGF、bFGF、SCF、FLT3L、IL3、IL6、IGF-1、TPO、PGF、PDGF中的至少一种;所述TGFB抑制剂选自Lefty-A、Lefty-B、Lefty-1、Lefty-2、SB431542、SB202190、SB505124、NPC30345、SD093、SD908、SD208、LY2109761、LY364947、LT580276、A83-01及其衍生物中的至少一种。
6.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述步骤S3包括:去除第二分化培养基,然后加入第三分化培养基,造血前体细胞诱导分化为自然杀伤细胞;所述第三分化培养基是在基础培养基中添加集落刺激因子、白细胞介素。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述集落刺激因子选自G-CSF、M-CSF、GM-CSF、IL-3、EPO、TPO、SCF、FLT3-L中的至少一种;所述白细胞介素选自IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-27中的至少一种。
8.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述方法还包括步骤S4:去除第三分化培养基,加入第四分化培养基进行自然杀伤细胞的扩增培养;所述第四分化培养基是在基础培养基中添加白细胞介素和促进自然杀伤细胞成熟和扩增的物质。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述白细胞介素选自IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-27中的至少一种;所述促进自然杀伤细胞成熟和扩增的物质为维生素C及其衍生物的至少一种。
10.一种自然杀伤细胞,其由权利要求2~9中任意一项所述的方法制备而得。
预防和/或治疗肿瘤的药物组合物,其特征在于,作为有效成分包含权利要求1或10中所述的自然杀伤细胞。
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