CN115322948A - 一种微量原代组织类器官培养前的扩增培养方法 - Google Patents

一种微量原代组织类器官培养前的扩增培养方法 Download PDF

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Abstract

一种微量原代组织类器官培养前的扩增培养方法，包括如下步骤：(1)将微量组织放入带有培养基的低吸附离心管中；(2)离心；(3)离心物料去除上清，加入DMEM培养基重悬清洗，一次细胞液离心获得二次离心物料；(4)去除上清；加入组织处理液，消化处理；(5)终止消化，然后离心；(6)去除上清；(7)加入DMEM/F1培养基，进行重悬沉淀；(8)滴加到超低粘附培养板中；置于摇床上，启动摇床；置于恒温培养箱中培养；(9)培养2～8天后离心，然后去除上清，获得细胞回收液。本发明可以在类器官培养前扩增细胞，恢复细胞活性，提高类器官样本培养成功率；可以培养微量样本，适用于多种组织来源和类型的样本。

Description

一种微量原代组织类器官培养前的扩增培养方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，特别涉及一种微量原代组织类器官培养前的扩增培养方法。
背景技术
类器官是一种三维细胞培养技术，可以在体外模拟体内器官的组织结构与基因表达。类器官为包含干细胞在内的多种细胞在体外经过自分化及自组装形成三位聚集体，其细胞种类、比例及细胞的空间结构及排列与体内器官具有较高的相似性，并可以模拟体内器官的部分功能。此外，与传统的二维细胞培养相比，类器官的基因表达与体内更为接近；因此，基于类器官的生物活性检测结果与体内更具有相关性；所以，目前类器官被广泛用于生物学研究、药物研究、医学研究、精准医学的转化应用等。
目前，类器官的培养主要包括组织清洗、消化处理和种胶培养等主要步骤；在类器官培养过程中，穿刺样本由于样本量少而消化收获细胞不足，且处理过程中细胞活性低，导致类器官培养的成功率非常低，制约了类器官在小样本培养中的应用。
发明内容
针对类器官在小样本培养中存在的上述问题，本发明提供一种微量原代组织类器官培养前的扩增培养方法，将微量样本采用优化处理，收获细胞，扩增培养，再次收获细胞，然后进行类器官培养的方式，达到细胞量增多、活性高、培养成功率高的效果。
本发明的方法包括如下步骤：
(1)将微量组织放入带有培养基的低吸附离心管中；
(2)将低吸附离心管离心处理，获得离心物料；
(3)将离心物料去除上清后，剩余一次细胞液；向一次细胞液中加入含5％FBS的DMEM培养基进行重悬清洗，将重悬清洗后的一次细胞液离心处理，获得二次离心物料；
(4)将二次离心物料去除上清后，剩余二次细胞沉淀；向二次细胞液中加入组织处理液，消化处理，获得消化处理物料；所述的组织处理液是向细胞回收液加入1～10mM的EDTA和10～100μM的Y27632制成；
(5)向消化处理物料中加入带有入含5％FBS的DMEM培养基终止消化，然后离心处理，获得三次离心物料；
(6)将三次离心物料去除上清，剩余三次细胞液；
(7)向三次细胞液中加入含1～10％Matrigel的且含10％FBS的DMEM/F1培养基，进行重悬沉淀，获得细胞悬液滴；
(8)用移液器将细胞悬液滴加到超低粘附培养板中；将超低粘附培养板置于摇床上，启动摇床，摇床转速为20～400rpm，保持持续转动；然后将超低粘附培养板置于恒温培养箱中，在37℃和CO2的体积浓度5％条件下培养；
(9)培养2～8天后，获得扩增细胞液；培养完成后，将扩增细胞液在800～1200g条件下离心10±5min，然后去除上清，获得细胞沉淀。
上述的步骤(2)中，离心处理是在2～8℃和800～1200g条件下离心10±5min。
上述的步骤(3)中，离心处理是在2～8℃和800～1200g条件下离心10±5min。
上述的步骤(4)中，消化处理是在2～8℃条件下处理10～30min。
上述的步骤(5)中，离心处理是在2～8℃和800～1200g条件下离心10±5min。
上述的步骤(9)中，培养过程中，每天补加10μl浓度为10～100mM的Y27632。
上述的步骤(9)中，获得细胞沉淀后，加入细胞回收液在2～8℃条件下处理10～30min，收获的细胞使用类器官培养基+基质胶按照常规方法进行类器官培养。
上述的步骤(1)中，微量组织采集后，12h内放入带有保存液的低吸附离心管。
上述的步骤(4)中，加入组织处理液的量以覆盖二次细胞液为准。
本发明的培养方法，可以在类器官培养前扩增细胞，恢复细胞活性，提高类器官样本培养成功率；可以培养微量样本，低至500个细胞，经过扩增培养后用于类器官的培养；本发明适用于多种组织来源和类型的样本，包括肺癌、肠癌、胃癌和肝癌等穿刺和内镜取材样本。
附图说明
图1为本发明实施例1中培养后的类器官显微照片图；
图2为本发明实施例2中培养后的类器官显微照片图；
图3为本发明实施例3中培养后的类器官显微照片图；
图4为本发明实施例4中培养后的类器官显微照片图；
图5为本发明实施例5中培养后的类器官显微照片图；
图6为本发明实施例6中培养后的类器官显微照片图。
具体实施方式
本发明实施例中采用的药剂、设备，如无特别说明均为市购产品。
本发明实施例中的微量组织为穿刺或内镜取材，样本量为500～5000个细胞。
本发明实施例中微量组织采集后，12h内放入带有保存液的低吸附离心管。
本发明实施例中加入组织处理液的量以覆盖二次细胞液为准。
本发明的细胞回收液为cell recovery solution。
本发明的培养成功率60～80％。
实施例1肺癌细针穿刺组织扩增培养
将微量组织放入带有培养基的低吸附离心管中；
将低吸附离心管在5℃和1000g条件下离心10±5min，获得离心物料；
将离心物料去除上清后，剩余一次细胞液；向一次细胞液中加入含5％FBS的DMEM培养基进行重悬清洗，将重悬清洗后的一次细胞液在5℃和1000g条件下离心10±5min，获得二次离心物料；
将二次离心物料去除上清后，剩余二次细胞沉淀；向二次细胞液中加入组织处理液，在5℃条件下处理20min，获得消化处理物料；所述的组织处理液是向细胞回收液加入5mM的EDTA和50μM的Y27632制成；
向消化处理物料中加入带有入含5％FBS的DMEM培养基终止消化，然后在5℃和1000g条件下离心10±5min，获得三次离心物料；
将三次离心物料去除上清，剩余三次细胞液；
向三次细胞液中加入含10％Matrigel的且含10％FBS的DMEM/F1培养基，进行重悬沉淀，获得细胞悬液滴；
用移液器将细胞悬液滴加到超低粘附培养板中；将超低粘附培养板置于摇床上，启动摇床，摇床转速为100rpm，保持持续转动；然后将超低粘附培养板置于恒温培养箱中，在37℃和CO2的体积浓度5％条件下培养；
培养5天后，获得扩增细胞液；培养过程中，每天补加10μl浓度为50mM的Y27632；培养完成后，将扩增细胞液在1000g条件下离心10±5min，然后去除上清，获得细胞沉淀；
获得细胞沉淀后，加入细胞回收液在5℃条件下处理20min，收获的细胞使用类器官培养基+基质胶按照常规方法进行类器官培养；
进行培养后，得到的类器官图片如图1所示；
按照此方法连续测试20例样本，其中有15例样本培养出了肺癌类器官，类器官成功率为75％。
实施例2
方法同实施例1，不同点在于：
(1)将低吸附离心管在2℃和800g条件下离心10±5min，获得离心物料；
(2)将重悬清洗后的一次细胞液在2℃和800g条件下离心10±5min，获得二次离心物料；
(3)向二次细胞液中加入组织处理液，在2℃条件下处理10min，获得消化处理物料；所述的组织处理液是向细胞回收液加入1mM的EDTA和10μM的Y27632制成；
(4)在2℃和800g条件下离心10±5min，获得三次离心物料；
(5)向三次细胞液中加入含5％Matrigel的且含10％FBS的DMEM/F1培养基，进行重悬沉淀；
(6)启动摇床，摇床转速为20rpm；
(7)培养2天后，获得扩增细胞液；培养过程中，每天补加10μl浓度为10mM的Y27632；培养完成后，将扩增细胞液在800g条件下离心10±5min；
(8)获得细胞沉淀后，加入细胞回收液在2℃条件下处理10min，收获的细胞使用类器官培养基+基质胶按照常规方法进行类器官培养；
进行培养后，得到的类器官图片如图2所示。
实施例3
方法同实施例1，不同点在于：
(1)将低吸附离心管在8℃和1200g条件下离心10±5min，获得离心物料；
(2)将重悬清洗后的一次细胞液在8℃和1200g条件下离心10±5min，获得二次离心物料；
(3)向二次细胞液中加入组织处理液，在8℃条件下处理30min，获得消化处理物料；所述的组织处理液是向细胞回收液加入10mM的EDTA和100μM的Y27632制成；
(4)在8℃和1200g条件下离心10±5min，获得三次离心物料；
(5)向三次细胞液中加入含1％Matrigel的且含10％FBS的DMEM/F1培养基，进行重悬沉淀；
(6)启动摇床，摇床转速为400rpm；
(7)培养8天后，获得扩增细胞液；培养过程中，每天补加10μl浓度为100mM的Y27632；培养完成后，将扩增细胞液在1200g条件下离心10±5min；
(8)获得细胞沉淀后，加入细胞回收液在8℃条件下处理30min，收获的细胞使用类器官培养基+基质胶按照常规方法进行类器官培养；
进行培养后，得到的类器官图片如图3所示。
实施例4
肠癌细针穿刺组织扩增培养：
培养方法与实施例1相同，不同点在于将肺癌类器官培养基更换为肠癌类器官培养基；
进行培养后，得到的类器官图片如图4所示，肠癌类器官呈圆球实心状。
实施例5
胃癌细针穿刺组织扩增培养：
培养方法与实施例1相同，不同点在于将肺癌类器官培养基更换为胃癌类器官培养基；
进行培养后，得到的类器官图片如图5所示，胃癌类器官呈圆球实心状。
实施例6
肝癌细针穿刺组织扩增培养：
培养方法与实施例1相同，不同点在于将肺癌类器官培养基更换为肝癌类器官培养基；
进行培养后，得到的类器官图片如图6所示，肝癌类器官多呈非圆球实心状。
对比例1
样本类器官培养方法与实施例1相同，将微量细胞直接回收细胞进行类器官培养；
进行培养后，细胞量少，培养10天后无法观察到类器官。
对比例2
选取20例样本，方法同实施例1，不同点在于：
不进行步骤(4)和(8)；
进行培养后，结果仅成功1例，培养成功率为5％。

Claims (9)

1.一种微量原代组织类器官培养前的扩增培养方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将微量组织放入带有培养基的低吸附离心管中；
(2)将低吸附离心管离心处理，获得离心物料；
(3)将离心物料去除上清后，剩余一次细胞液；向一次细胞液中加入含5％FBS的DMEM培养基进行重悬清洗，将重悬清洗后的一次细胞液离心处理，获得二次离心物料；
(4)将二次离心物料去除上清后，剩余二次细胞沉淀；向二次细胞液中加入组织处理液，消化处理，获得消化处理物料；所述的组织处理液是向细胞回收液加入1～10mM的EDTA和10～100μM的Y27632制成；
(5)向消化处理物料中加入带有入含5％FBS的DMEM培养基终止消化，然后离心处理，获得三次离心物料；
(6)将三次离心物料去除上清，剩余三次细胞液；
(7)向三次细胞液中加入含1～10％Matrigel的且含10％FBS的DMEM/F1培养基，进行重悬沉淀，获得细胞悬液滴；
(8)用移液器将细胞悬液滴加到超低粘附培养板中；将超低粘附培养板置于摇床上，启动摇床，摇床转速为20～400rpm，保持持续转动；然后将超低粘附培养板置于恒温培养箱中，在37℃和CO2的体积浓度5％条件下培养；
(9)培养2～8天后，获得扩增细胞液；培养完成后，将扩增细胞液在800～1200g条件下离心10±5min，然后去除上清，获得细胞沉淀。
2.根据权利要求1所述的微量原代组织类器官培养前的扩增培养方法，其特征在于步骤(2)中，离心处理是在2～8℃和800～1200g条件下离心10±5min。
3.根据权利要求1所述的微量原代组织类器官培养前的扩增培养方法，其特征在于步骤(3)中，离心处理是在2～8℃和800～1200g条件下离心10±5min。
4.根据权利要求1所述的微量原代组织类器官培养前的扩增培养方法，其特征在于步骤(4)中，消化处理是在2～8℃条件下处理10～30min。
5.根据权利要求1所述的微量原代组织类器官培养前的扩增培养方法，其特征在于步骤(5)中，离心处理是在2～8℃和800～1200g条件下离心10±5min。
6.根据权利要求1所述的微量原代组织类器官培养前的扩增培养方法，其特征在于步骤(9)中，培养过程中，每天补加10μl浓度为10～100mM的Y27632。
7.根据权利要求1所述的微量原代组织类器官培养前的扩增培养方法，其特征在于步骤(9)中，获得细胞沉淀后，加入细胞回收液在2～8℃条件下处理10～30min，收获的细胞使用类器官培养基+基质胶按照常规方法进行类器官培养。
8.根据权利要求1所述的微量原代组织类器官培养前的扩增培养方法，其特征在于步骤(1)中，微量组织采集后，12h内放入带有保存液的低吸附离心管。
9.根据权利要求1所述的微量原代组织类器官培养前的扩增培养方法，其特征在于步骤(4)中，加入组织处理液的量以覆盖二次细胞液为准。
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