CN114540276A - 一种体外子宫内膜腺体类器官的三维培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种体外子宫内膜腺体类器官的三维培养方法。具体地，本发明涉及体外子宫内膜腺体类器官的三维培养、传代、冷冻、解冻方法、以及由所述方法获得的体外子宫内膜腺体类器官以及其用途。

Description

一种体外子宫内膜腺体类器官的三维培养方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，主要涉及一种人子宫内膜腺体类器官的三维培养方法。
背景技术
子宫是一个复杂的器官，其内部子宫内膜由单层假复层腔上皮(LE)和分支的柱状腺上皮(GE)组成，并由间质成纤维细胞以及免疫细胞，血管和淋巴系统支持，这些腺体被认为通过与其他子宫内膜细胞和胚胎的相互作用对建立妊娠很重要。同时，子宫内膜是人体中最有活力的组织之一，每月经历激素调节的生长周期和脱落。有证据表明，子宫内膜干/祖细胞负责子宫内膜的再生特性。
人类的胚胎植入的过程是一项复杂的生理过程，目前，没有理想的体外模型对这一过程进行研究，胚胎植入过程一直被称为生殖领域的“黑匣子”。然而，这一过程中的任何异常都会导致疾病，例如不孕症、先兆流产等。
另一方面，子宫内膜疾病是常见的妇科问题，也是不孕症的主要原因之一。由子宫内膜样组织异位生长引起的子宫内膜异位症影响了10％的育龄妇女，但由于缺乏合适的研究模型，其病因和发病机制仍不清楚，治疗仍不能令人满意。子宫内膜癌(EC)是第四大最常见的女性癌症，具有雌激素依赖性的I型EC的预后良好，而具有雌激素依赖性的II型EC的预后较差并伴有高转移风险。临床上由于缺乏可靠的临床前研究模型，导致EC病理生物学的基本机制仍然未知，治疗效率和总生存率也没有实质性改善。
迄今为止，鉴于子宫内膜基质细胞易于生长、繁殖和传代，子宫内膜的研究主要集中在基质细胞的研究上，当子宫内膜上皮细胞及腺体细胞以单层培养时，上皮细胞及腺体细胞具有细胞生长不良，衰老，丧失极性和不能传代扩增的特征。这一直是女性生殖系统研究领域的最大障碍之一，也正因为如此，由子宫内膜因素引起的不育及子宫内膜癌的致病机理仍不清楚。同时，传统二维细胞培养方法使培养细胞处于同一平面，长时间培养后，其形态特性、生理功能、遗传物质等均与来源细胞产生较大差异，对临床研究的参考意义有限。类器官(organoid)是将组织干细胞在体外进行培养，保持原始干细胞功能并不断分裂分化形成在空间和结构与来源器官组织、基因、结构和功能相似的微组织。与现有二维培养相比，类器官是不同类型和功能细胞的有机结合体，更接近体内细胞生存空间、生长状态及功能。类器官以其在体外长期增殖、可传代性、高度保持源器官结构和功能等特性在生物医学领域备受关注。目前类器官在机体生长发育、疾病病理、药物筛选及毒理学评价、再生医学、生物材料等研究中显示出巨大潜力。
目前国内还未有关于利用人子宫内膜诊刮组织体外进行人子宫内膜腺体类器官的三维培养、传代、冻存、复苏的方法，成功在体外构建人子宫内膜腺体类器官，可以使我们更好的研究子宫内膜生理过程及病理疾病，可用于临床前药物筛选、用药安全性及生殖毒性的检测，在临床上可以作为“精准治疗”和“个性化治疗”的有力工具，帮助促进子宫内膜疾病的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人子宫内膜腺体类器官的三维培养方法，旨在解决目前国内还未有关于利用人子宫内膜诊刮组织体外进行人子宫内膜腺体类器官的三维培养、传代、冻存、复苏方法的问题；
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种人子宫内膜腺体类器官的三维培养的方法，包括以下步骤：
步骤1:获取子宫内膜组织；
步骤2:利用多种酶溶解液将所述子宫内膜组织解离为完整的腺体片段；
步骤3:将所述的子宫内膜完整的腺体片段接种到基质胶中进行三维培养并建立子宫内膜腺体类器官模型；
步骤4:扩大培养所述的子宫内膜腺体类器官并建立子宫内膜腺体类器官系；
步骤5:冻存子宫内膜腺体类器官并建立子宫内膜腺体类器官库；
步骤6:复苏子宫内膜腺体类器官并重新培养。
在本发明的一个方面，本发明提供了一种体外子宫内膜腺体类器官的三维培养方法，所述方法包括：
1)获得哺乳动物子宫内膜组织，
2)洗涤所述哺乳动物子宫内膜组织，并剪成碎片，
3)将剪碎的哺乳动物子宫内膜组织与胶原酶V和分散酶II混合，在37摄氏度下孵育10分钟到120分钟，优选地20-110分钟，优选地30-100、30-90、30-80、30-70、30-60分钟；或其之间的任何点值；
4)将步骤3)中的混合液通过细胞筛过滤，反向冲洗残留在细胞筛表面的腺体；优选地，所述细胞筛孔径为10-200微米，优选地20-180、30-160、40-150、50-130、60-120、70-100微米，或其之间的任何点值；
5)离心后收集完整的子宫内膜腺体片段；
6)将步骤5)中获得的完整的子宫内膜腺体片段与液体基质胶Matrigel混合后铺板，优选地，体积比为1:5至1:100；优选地，体积比为1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:100；或其间的任意点值；
7)将铺板后的完整的子宫内膜腺体片段与液体基质胶Matrigel混合物置于37摄氏度、湿度为5％的二氧化碳中20分钟，使基质胶固化；和
8)向固化的基质胶中加入子宫内膜腺体类器官条件培养基，在37摄氏度、湿度为5％的二氧化碳中培养，获得子宫内膜腺体类器官；
优选地，所述子宫内膜腺体类器官条件培养基为添加有N-乙酰-L-半胱氨酸、烟酰胺、重组人R-sponding-1、重组人FGF-10、A-83-01、抗生素的DMEM/F12培养基。
优选地，在上述方法的步骤3)中，进一步包括每隔10分钟将孵育容器震荡一次，在倒置显微镜下观察子宫内膜腺体消化情况的步骤。
进一步地，本发明的方法包括扩大培养的步骤，其在步骤8)之后进一步包括：
9)用细胞回收液取代步骤8)中的子宫内膜腺体类器官条件培养基，移入离心管中，
10)通过吹打离心管，使子宫内膜腺体类器官团块分散，
11)离心，获得沉淀物，和
12)重复上述步骤6)至8)，进行扩大培养。
通过本发明的所述扩大培养的步骤，可对子宫内膜腺体类器官进行传代培养，优选地，传代10-30代，优选传代15-25代，优选地，传代16、17、18、19、20、21、22、23、24、25代。
另一方面，本发明提供了冷冻子宫内膜腺体类器官的方法，其包括以下步骤：
a)将子宫内膜腺体类器官重悬于细胞回收液中，移入离心管中，
b)通过吹打离心管，使子宫内膜腺体类器官团块分散，
c)离心，获得沉淀物，
d)将沉淀物重悬于细胞冻存液中，和
e)将细胞悬液转移至冻存管中，在零下80摄氏度冻存；
优选地，所述细胞冻存液包含DMEM/F12、血清和DMSO。
优选地，在缓慢冻结条件下冷冻细胞；进一步优选地，按每1分钟降1摄氏度的速度降温至零下80摄氏度，冷冻细胞。
另一方面，本发明提供了根据本发明所述的冷冻子宫内膜腺体类器官的方法获得的冷冻的子宫内膜腺体类器官。
另一方面，本发明提供了一种解冻的子宫内膜腺体类器官，其通过解冻本发明所述的冷冻的子宫内膜腺体类器官获得。
优选地，所述子宫内膜腺体类器官的解冻需要在1-2分钟内完成。
另一方面，本发明提供了根据本发明所述的子宫内膜腺体类器官在制备用于研究子宫内膜正常生理过程及病理状态、用于临床前药物筛选、用药安全性及生殖毒性检测的体外模型中的用途。
与现有的技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明能够培养出大量与来源器官遗传角度高度一致的体外培养细胞，并进行长期保存，为研究子宫内膜正常生理过程及病理状态提供可靠准确的体外生理病理模型，可用于临床前药物筛选、用药安全性及生殖毒性的检测，在临床上可以作为“精准治疗”和“个性化治疗”的有力工具，为再生医学与药物发现提供新的思路。Takahashi等通过导入4个转录因子包括SOX2、OCT4、KLF4和CMYC将鼠体细胞重编程为类似ESC的诱导多能干细胞(induced pluripotent stemcell,iPSC)，标志着iPSC时代的到来。SOX2(sex determiningregion Y-box2)：转录因子SOX2是SOX区域Y相关的蛋白家族成员之一,在哺乳动物的生长发育、神经发育及血细胞形成等过程中均起重要作用。SOX-2通过与靶DNA结合来调节特定细胞的发育过程，在特定细胞的增殖，分化中起着至关重要的作用。研究发现SOX2是干细胞自我更新维持多项分化潜能的重要因子,在乳腺癌、卵巢癌、肝癌以及非小细胞肺癌等肿瘤中均出现差异表达,且通过调控肿瘤细胞增殖、侵袭转移等过程促进肿瘤细胞恶性进展,在肿瘤干细胞的干性维持中亦起着关键调控作用。OCT4:OCT4是含有POU结构域的转录因子，主要表达于胚胎干细胞(ESC)、生殖系干细胞和生殖细胞肿瘤如睾丸生殖细胞瘤等，是维持ESC自我更新能力和多向分化潜能所必需的转录因子，也是体细胞重编程过程中所不可少的转录因子。OCT4除了通过干性转录因子网络调控多能干细胞包括hESC、iPSC的多潜能性和自我更新能力的维持之外，还在多种实体肿瘤中参与了肿瘤干细胞生物学行为的调控。子宫内膜腺体类器官经过长期的传代纯化，监测到可以表达SOX2及OCT4蛋白，表明其已具有干细胞特性。在电镜下观察可见子宫内膜腺体类器官具有游离面具有微绒毛，胞质中具有丰富的高尔基体，核糖体，线粒体及内质网，同时在胞质中可见大量的分泌颗粒，说明子宫内膜腺体类器官已具有分泌蛋白质的功能。
以下将结合附图以及具体实施例进一步说明本发明的实施方案，但是，不应理解为将本发明的范围限于这些具体实施例。
附图说明
图1为本发明的人子宫内膜腺体类器官培养方法的示例性流程图；
图2A至图2D为通过本发明的人子宫内膜腺体类器官培养方法获得的人子宫内膜腺体类器官的光镜图；
图3为通过本发明的人子宫内膜腺体类器官培养方法获得的人子宫内膜腺体类器官免疫荧光法检测的阳性角蛋白；
图4为SOX2在第22代子宫内膜腺体类器官中的阳性表达(红色荧光为SOX2蛋白的表达)；
图5为OCT4在第22代子宫内膜腺体类器官中的阳性表达(红色荧光为OCT4蛋白的表达)；
图6为电镜下子宫内膜腺体类器官具有分泌的功能。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。在下面的描述中，提供诸如具体的配置和组件的特征细节仅仅是为了帮助全面理解本发明的实施例。因此，本领域技术人员应该清楚，可以对这里描述的实施例进行各种改变和修改而不脱离本发明的范围和精神。另外，为了清楚和简洁，省略了对已知功能和构造的描述。
应理解，说明书通篇中提到的“一个实施例”或“一实施例”意味着与实施例有关的特定特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施例中。因此，在整个说明书各处出现的“在一个实施例中”或“在一实施例中”未必一定指相同的实施例。此外，这些特定的特征、结构或特性可以任意适合的方式结合在一个或多个实施例中。
在本发明的各种实施例中，应理解，下述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本发明实施例的实施过程构成任何限定。
应理解，本文中术语“和/或”，仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。另外，本文中字符“/”，一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
在本申请所提供的实施例中，应理解，“与A相应的B”表示B与A相关联，根据A可以确定B。但还应理解，根据A确定B并不意味着仅仅根据A确定B，还可以根据A和/或其它信息确定B。
本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
在一个具体的实施方案中，如图1所示，本发明提供了人子宫内膜腺体类器官的三维培养方法，其主要包括以下6个步骤：获取子宫内膜组织；利用多种酶溶解液将所述子宫内膜组织解离为完整的腺体片段；将所述的子宫内膜完整的腺体片段接种到基质胶中进行三维培养并建立子宫内膜腺体类器官模型，优选地，所述基质胶为Matrigel MatrixBasement Membrane，美国康宁公司，货号：356231；扩大培养所述的子宫内膜腺体类器官并建立子宫内膜腺体类器官系；冻存子宫内膜腺体类器官并建立子宫内膜腺体类器官库；复苏子宫内膜腺体类器官并重新培养。
在一个具体的实施方案中，子宫内膜组织是通过诊刮术获取，具体的说，将诊刮出的子宫内膜组织置于缓冲液中，然后放置于冰袋上快速转移至无菌环境的实验室。
在一个具体的实施方案中，将提取的子宫内膜组织从转运的容器中取出置于无菌培养皿中，用磷酸盐缓冲液及青、链霉素混合液清洗多遍后，用眼科剪将子宫内膜组织剪碎；将剪碎的子宫内膜组织与胶原酶V和分散酶II(Dispase II)混合并置于37摄氏度培养箱中孵育30分钟到60分钟，其中，每隔10分钟将孵育容器震荡一次，同时在倒置显微镜下观察子宫内膜腺体消化情况；待子宫内膜组织消化成完整的子宫内膜腺体片段时终止消化过程。
在本发明人的研究中发现，腺体片段的完整性对于体外子宫内膜腺体的培养非常关键，消化不充分、或者消化过度，将导致所获得的子宫内膜腺体在形态学上和/或免疫组化上与所来源的细胞的差异较大。若腺体消化不充分，腺体周围有大量结缔组织包绕，接种到基质胶中后影响类器官的生长；若腺体消化过度，则腺体碎片会漏过细胞筛，降低腺体的获得率，降低类器官的形成率。
然后，将细胞悬液通过100微米的细胞筛过滤，反向冲洗残留在细胞筛表面的腺体；离心后收集所述子宫内膜腺体片段。
在进一步的具体实施方案中，将子宫内膜腺体片段与液态基质胶按照1:20的体积比混匀后接种到培养板中，并置于温度为37摄氏度，湿度为5％的二氧化碳培养箱中固化20分钟得到三维结构；向培养板孔中加入子宫内膜腺体类器官条件培养基并重新置于温度为37摄氏度，湿度为5％的二氧化碳培养箱中培养。
在优选的实施方案中，所述类器官条件培养基是添加了N-乙酰-L-半胱氨酸、烟酰胺、重组人R-sponding-1、重组人FGF-10、A-83-01、抗生素的DMEM/F12培养基。
在人子宫内膜腺体类器官的三维培养方法的进一步具体的实施方案中，还包括对子宫内膜腺体类器官进行扩大培养的步骤，其包括：去除子宫内膜类器官条件培养基并加入细胞回收液(Cell Recovery Solution，美国康宁公司，货号：354253)溶解基质胶；将子宫内膜腺体类器官收集到离心管中，将子宫内膜腺体类器官用移液器上下吹打300次，在温度4℃，800g，离心8分钟后，将子宫内膜腺体类器官按照1:2传代的稀释度稀释；将得到的子宫内膜腺体片段稀释液与融化的基质胶溶液按照1:20的体积比混匀后接种到培养板中，并置于温度为37摄氏度，湿度为5％的二氧化碳培养箱中固化20分钟得到三维结构；所述培养板孔中加入子宫内膜腺体类器官条件培养基(优选地，所述子宫内膜腺体类器官条件培养基为添加了N-乙酰-L-半胱氨酸、烟酰胺、重组人R-sponding-1、重组人FGF-10、A-83-01、抗生素的DMEM/F12培养基)并重新置于温度为37摄氏度，湿度为5％的二氧化碳培养箱中进行扩大培养；子宫内膜腺体类器官经过多次扩大培养后建立子宫内膜腺体类器官系。
在一个具体的实施方案中，本发明提供了冷冻保存的子宫内膜腺体类器官，其通过以下步骤获得：去除根据本发明的上述方法获得的子宫内膜腺体类器官中的条件培养基，并加入细胞回收液(Cell Recovery Solution，美国康宁公司，货号：354253)溶解基质胶；将子宫内膜腺体类器官收集到离心管中，将子宫内膜腺体类器官用移液器上下吹打80次，在温度4℃、800g下离心8分钟后，将子宫内膜类腺体器官用细胞冻存液(包含5:4:1的DMEM/F12、血清和DMSO)重悬；细胞悬液转移至2mL冻存管中；将冻存管放入程序降温盒并在零下80摄氏度保存24小时后将冻存管转移至液氮中长期储存。
在一个具体的实施方案中，本发明提供了解冻的根据本发明方法获得的冷冻保存的子宫内膜腺体类器官，其通过以下步骤获得：取出冻存管，置于37摄氏度水浴锅中迅速回温；在4℃、800g下离心8分钟后收集子宫内膜腺体类器官混合物；将子宫内膜腺体类器官混合物与液态基质胶按照1:20的体积比混匀后接种到培养板中，并置于温度为37摄氏度，湿度为5％的二氧化碳培养箱中固化20分钟，得到三维结构；向培养板孔中加入如上所述的子宫内膜腺体类器官条件培养基并重新置于温度为37摄氏度，湿度为5％的二氧化碳培养箱中进行培养。
实施例1.子宫内膜腺体类器官的体外三维培养、其冷冻保存和解冻
临床获取10例签署知情同意书的年龄18-38岁、无其他疾病受试者的清宫术后新鲜子宫内膜组织，取子宫内膜中的蜕膜部分置于磷酸盐缓冲液中迅速转移至无菌实验室，如图1所示的方法步骤，建立三维子宫内膜腺体类器官模型。冷冻保存部分样本，建立子宫内膜腺体类器官库。具体步骤如下所示：
样本采集：
子宫内膜组织样本采集：利用清宫术获取新鲜子宫内膜组织。
子宫内膜组织样本转运：将子宫内膜组织放入磷酸盐缓冲液中，记录患者信息，封紧管盖，将转运容器置于冰上，迅速转移至无菌实验室。
类器官培养：
1)将提取的子宫内膜组织从转运的容器中取出置于无菌培养皿中，用磷酸盐缓冲液及青、链霉素混合液清洗多遍后，用通过眼科剪将子宫内膜组织剪碎；
2)将剪碎的子宫内膜组织与胶原酶V和分散酶II(Dispase II)混合并置于37摄氏度培养箱中孵育30分钟到60分钟，其中，每隔10分钟将孵育容器震荡一次，同时在倒置显微镜下观察子宫内膜腺体消化情况；待子宫内膜组织消化成完整的子宫内膜腺体片段时终止消化过程；将细胞悬液通过100微米的细胞筛过滤，反向冲洗残留在细胞筛表面的腺体；在温度4℃，800g，离心8分钟后收集所述子宫内膜腺体片段；
3)将子宫内膜腺体片段与液态Matrigel Matrix Basement Membrane，(美国康宁公司，货号：356231)按照1:20体积比混匀后接种到培养板中，并置于温度为37摄氏度，湿度为5％的二氧化碳培养箱中固化20分钟得到三维结构；向培养板孔中加入子宫内膜腺体类器官条件培养基，其中包含N-乙酰-L-半胱氨酸、烟酰胺、重组人R-sponding-1、重组人FGF-10、A-83-01、DMEM/F12、抗生素并重新置于温度为37摄氏度，湿度为5％的二氧化碳培养箱中培养；
4)对子宫内膜腺体类器官进行扩大培养，去除子宫内膜类器官条件培养基并加入细胞回收液(Cell Recovery Solution，美国康宁公司，货号：354253)溶解基质胶；将子宫内膜腺体类器官收集到离心管中，将子宫内膜腺体类器官用移液器上下吹打300次，在温度4℃，800g，离心8分钟后，将子宫内膜腺体类器官按照1:2传代比例的稀释度稀释；将得到的子宫内膜腺体稀释液与融化的基质胶溶液按照1:20的体积比混匀后接种到培养板中，并置于温度为37摄氏度，湿度为5％的二氧化碳培养箱中固化20分钟得到三维结构；所述培养板孔中加入子宫内膜腺体类器官条件培养基并重新置于温度为37摄氏度，湿度为5％的二氧化碳培养箱中进行扩大培养；子宫内膜腺体类器官经过多次扩大培养后建立子宫内膜腺体类器官系；
5)类器官冻存建库：
去除子宫内膜腺体类器官条件培养基并加入Cell Recovery Solution溶解基质胶；将子宫内膜腺体类器官收集到离心管中，将子宫内膜腺体类器官用移液器上下吹打80次，在4℃，800g下离心8分钟后将子宫内膜类腺体器官用细胞冻存液(包含5:4:1的DMEM/F12、血清和DMSO)重悬；细胞悬液转移至2mL冻存管中；将冻存管放入程序降温盒并在零下80摄氏度保存24小时后将冻存管转移至液氮中长期储存；在程序降温盒中，按每1分钟降1摄氏度的速度降温至零下80摄氏度，冷冻细胞；
6)类器官复苏：
取出冻存管，置于37摄氏度水浴锅中迅速回温；在4℃，800g下离心8分钟收集子宫内膜腺体类器官混合物；将子宫内膜腺体类器官混合物与液态基质胶按照1:20体积比的比例混匀后接种到培养板中，并置于温度为37摄氏度，湿度为5％的二氧化碳培养箱中固化20分钟得到三维结构；向培养板孔中加入子宫内膜腺体类器官条件培养基并重新置于温度为37摄氏度，湿度为5％的二氧化碳培养箱中进行培养。
实施例2.子宫内膜腺体类器官的光镜、电镜和免疫荧光检测
本发明进一步通过以下实验例验证的通过本发明的上述体外方法获得的人子宫内膜腺体类器官与所来源的器官遗传角度的一致性。
首先，我们光学显微镜下观察在实施例1的步骤3)、4)和6)后、以及在重复实施例1的1)至4)步骤22次后获得的人子宫内膜腺体类器官的形态，发现其与所来源的人子宫内膜相似(上述步骤后获得的人子宫内膜腺体类器官的示例性光学显微镜下形态，分别显示子图2A-图2D中)。
光镜下可见单层柱状细胞紧密排列成腺腔样结构，管腔内可见分泌物及少量脱落的死细胞，一些球形腺体由高柱状上皮细胞紧密排列形成并显示出活跃的分泌状态，而有些腺体类器官则为矮柱状或立方形上皮。子宫内膜腺体类器官的外观与体内子宫内膜腺体高度相似。
进一步地，我们通过免疫荧光法检测了在实施例1的步骤3)、4)和6)后、以及在重复实施例1的1)至4)步骤22次后获得的人子宫内膜腺体类器官的角蛋白、SOX2和OCT4的表达。
免疫荧光法检测的步骤如下所述：
1)去除孔板中的培养基，将子宫内膜腺体类器官基质胶滴用冷PBS缓冲液清洗两遍；
2)向每个孔中加入200μL细胞回收液，置于冰上1小时，以去除基质胶；
3)1小时后，观察到基质胶已溶解，腺体类器官悬浮在细胞回收液中，用低吸附性移液器枪头将含有腺体类器官的细胞回收液收集入低吸附性EP管中，4℃、800g离心8min，弃上清，以沉淀类器官；
4)向类器官沉淀中加入4％多聚甲醛固定液，室温固定30min，离心后，缓慢弃去固定液，0.01Mol/L PBS洗三次，每次5min；
5)0.2％Triton X-100破膜10-30min，离心后，PBS洗两遍；
6)用和二抗种属来源相同的血清室温封闭1小时；
7)用含有0，05％Triton X-100的PBS缓冲液稀释一抗，一抗的浓度可适当提高，一抗4℃冰箱孵育过夜，第二日用PBS洗三遍；
8)用PBS缓冲液稀释二抗，二抗室温避光孵育1小时，PBS洗三遍；
9)用DAPI衬染细胞核，室温避光孵育10分钟，PBS洗三遍；
10)将腺体类器官用低吸附性移液器枪头转移至倒置共聚焦显微镜专用八孔皿中；
11)倒置激光共聚焦显微镜下观察并照相。
免疫荧光法检测的结果证实了在这些步骤后获得的人子宫内膜腺体类器官均表达角蛋白、SOX2和OCT4。图3示例性地代表步骤6)后的获得的人子宫内膜腺体类器官的阳性角蛋白表达；图4和图5分别示例性地显示了在重复实施例1的1)至4)步骤22次后(即，连续传代至第22代细胞，不含冻存过程)，获得的子宫内膜腺体类器官中SOX2和OCT4蛋白的阳性表达。
进一步地，我们观察了在电镜下观察了实施例1的步骤3)、4)、6)后、以及在重复实施例1的1)至4)步骤22次后获得的人子宫内膜腺体类器官，发现这些子宫内膜腺体类器官游离面具有微绒毛，胞质中具有丰富的高尔基体、核糖体、线粒体及内质网，同时在胞质中可见大量的分泌颗粒，说明子宫内膜腺体类器官已具有分泌蛋白质的功能(参见图6)。
由以上实施例结果可见，本发明能够培养出大量与来源器官遗传角度高度一致的体外培养细胞，并进行长期保存，为研究子宫内膜正常生理过程及病理状态提供可靠准确的体外生理病理模型，可用于临床前药物筛选、用药安全性及生殖毒性的检测，在临床上可以作为“精准治疗”和“个性化治疗”的有力工具，为再生医学与药物发现提供新的思路。
最后应该说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前叙述实施对本发明进行了详细的说明，本领域的技术人员应当理解，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行同等替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神与范围。

Claims (8)

1.一种体外子宫内膜腺体类器官的三维培养方法，所述方法包括：
1)获得哺乳动物子宫内膜组织，
2)洗涤所述哺乳动物子宫内膜组织，并剪成碎片，
3)将剪碎的哺乳动物子宫内膜组织与胶原酶V和分散酶II混合，在37摄氏度下孵育10分钟到120分钟，优选地20-110分钟，优选地30-100、30-90、30-80、30-70、30-60分钟；或其之间的任何点值；
4)将步骤3)中的混合液通过细胞筛过滤，反向冲洗残留在细胞筛表面的腺体；优选地，所述细胞筛孔径为10-200微米，优选地20-180、30-160、40-150、50-130、60-120、70-100微米，或其之间的任何点值；
5)离心后收集完整的子宫内膜腺体片段；
6)将步骤5)中获得的完整的子宫内膜腺体片段与液体基质胶Matrigel混合后铺板，优选地，体积比为1:5至1:100；优选地，体积比为1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:100；或其间的任意点值；
7)将铺板后的完整的子宫内膜腺体片段与液体基质胶Matrigel混合物置于37摄氏度、湿度为5％的二氧化碳中20分钟，使基质胶固化；和
8)向固化的基质胶中加入子宫内膜腺体类器官条件培养基，在37摄氏度、湿度为5％的二氧化碳中培养，获得子宫内膜腺体类器官；
优选地，所述子宫内膜腺体类器官条件培养基为添加有N-乙酰-L-半胱氨酸、烟酰胺、重组人R-sponding-1、重组人FGF-10、A-83-01、抗生素的DMEM/F12培养基。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤3)中，进一步包括每隔10分钟将孵育容器震荡一次，在倒置显微镜下观察子宫内膜腺体消化情况的步骤。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤8)之后进一步包括扩大培养的步骤，所述扩大培养的步骤包括：
9)用细胞回收液取代步骤8)中的子宫内膜腺体类器官条件培养基，移入离心管中，
10)通过吹打离心管，使子宫内膜腺体类器官团块分散，
11)离心，获得沉淀物，和
12)重复上述步骤6)至8)，进行扩大培养。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物选自人、猪、牛、羊、马、猴。
5.一种子宫内膜腺体类器官，其通过权利要求1-4中任一项所述的方法获得。
6.一种冷冻的子宫内膜腺体类器官，其通过以下步骤获得：
a)将权利要求5中所述的子宫内膜腺体类器官重悬于细胞回收液中，移入离心管中，
b)通过吹打离心管，使子宫内膜腺体类器官团块分散，
c)离心，获得沉淀物，
d)将沉淀物重悬于细胞冻存液中，和
e)将细胞悬液转移至冻存管中，在零下80摄氏度冻存；
优选地，所述细胞冻存液包含DMEM/F12、血清和DMSO。
7.一种解冻的子宫内膜腺体类器官，其通过以下步骤获得：解冻权利要求6所述的冷冻的子宫内膜腺体类器官。
8.根据权利要求5所述的子宫内膜腺体类器官、根据权利要求6所述的冷冻的子宫内膜腺体类器官、或根据权利要求7所述的解冻的子宫内膜腺体类器官在制备用于研究子宫内膜正常生理过程及病理状态、用于临床前药物筛选、用药安全性及生殖毒性检测的体外模型中的用途。
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