CN115975908A - 一种子宫内膜类器官模型及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种人子宫内膜类器官体外培养方法，该方法采用基于Matrigel基质胶中培养为基础，利用类器官旋转生物反应器进行培养和传代分化，通过人子宫内膜特定基因表达检测及施加激素刺激证实该方法得到分化人子宫内膜类器官，该方法与Matrigel基质胶方案相比，大幅度降低实验和技术成本，操作简单，可重复性好，可获得大量的人子宫内膜类器官，进而被更好的用于科研及临床应用。

Description

一种子宫内膜类器官模型及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地说，涉及一种子宫内膜类器官模型及其构建方法和应用。

背景技术

子宫是女性形成月经和孕育胎儿的重要器官，为胚胎着床提供生理微环境，建立母体/胎儿功能性联系并保障胎儿生长发育，最终孕育健康子代。不同物种动物具有各自特有的生殖特性，表现出不同的子宫生理结构。女性子宫则表现出月经周期的生殖特征，具有其复杂性和进化上的独特性。由此，科学家们对女性子宫解剖学和生理学等开展了一系列的相关研究工作，然而由于女性子宫复杂性及其缺乏易于操作的实验系统，很多关键生理机制问题仍未解决。当前干细胞-三维(3D)培养类器官，为体外探究人子宫组织器官提供了研究可能性和体外实验范式。

2017年Turco MY报道优化建立人成体干细胞来源子宫类器官，推进了对人子宫内膜生理功能机制的科研探究。然而，目前，人子宫内膜类器官培养效率还比较低，在Matrigel^TM基质胶中培养传代操作复杂，每次操作都需要置于冰上缓慢融化至少1小时，一旦温度升高就易出现凝胶现象，传代扩增效率低，且基质胶作为类器官生长在基质胶中不易进行类器官表型分析及实验操作，严重制约了利用人子宫类器官在科研及医学领域的应用。

发明内容

鉴于此，为了解决上述现有技术中存在的弊端，本发明提出一种类器官培养方法，旨在提高类器官高效传代培养，本发明方法通过类器官生物反应器进行类器官三维悬浮旋转培养，即可促进人子宫内膜类器官快速增殖，可获得大量的人子宫内膜类器官。

本发明的第一方面，提供一种类器官模型的构建方法，所述的构建方法包括1)分离人子宫内膜上皮、基质细胞；2)将人子宫内膜上皮、基质细胞使用基质胶和类器官培养基进行培养；3)去除基质胶并移至生物反应器继续培养并传代。

优选的，所述的类器官培养基包含基础培养基、细胞培养添加剂、N-乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine)、L-谷氨酰胺(L-Glutamine)、细胞生长因子、BMP抑制剂、Wnt激动剂、TGFβreceptor I(TβRI)抑制剂和烟酰胺中的一种或两种以上的组合。

优选的，所述基础培养基可以是任意适合类器官培养的基础培养基。例如：所述基础培养基为E6(Essential 6)、KO-DMEM、KO-DMEM/F12、DMEM/F12、TL、DMEM、α-MEM、F-12、MEM、BME、RPMI 1640、G-MEM及其任意组合。

优选的，所述的细胞生长因子包括表皮细胞生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和/或肝细胞生长因子(HGF)，其中，所述的FGF包括FGF-9或FGF-10。

优选的，所述的BMP抑制剂包括LDN-212854、DMH-1和/或Noggin。

优选的，Wnt激动剂包括CHIR-99021、IM-12、AT7519、CHIR-98014、KY19382、CWP232291、Tideglusib、WNT蛋白和/或Rspondin-1，所述的WNT蛋白包括但不限于WNT1、WNT3、WNT3a、WNT7a或WNT8。

优选的，所述的TGFβreceptor I(TβRI)抑制剂包括Galunisertib(LY2157299)、SB525334、SB505124、LY364947(HTS 466284)和/或A83-01。

优选的，所述的类器官培养基包括DMEM/F12、N2、B27、N-乙酰半胱氨酸、L-谷氨酰胺、EGF、Noggin、Rspondin-1、FGF-10、HGF、A83-01和烟酰胺。

优选的，所述的N-乙酰半胱氨酸浓度为1.0-2.0(例如1.0、1.20、1.25、1.30、1.40、1.50、1.55、1.70、2.0)mM。

优选的，所述的L-谷氨酰胺浓度为1.5-2.5(例如1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5)mM。

优选的，所述的EGF浓度为20-80(例如20、30、40、45、50、55、60、70、80)ng/ml。

优选的，所述的Noggin浓度为50-150(例如50、55、60、70、80、90、95、100、105、110、120、130、140、150)ng/ml。

优选的，所述的Rspondin-1浓度为400-600(例如400、450、500、550、600)ng/ml。

优选的，所述的FGF-10浓度为50-150(例如50、55、60、70、80、90、95、100、105、110、120、130、140、150)ng/ml。

优选的，所述的HGF浓度为20-80(例如20、30、40、45、50、55、60、70、80)ng/ml。

优选的，所述的A83-01浓度为400-600(例如400、450、500、550、600)mM。

优选的，所述的烟酰胺浓度为5-15(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15)mM。

优选的，所述的生物反应器为类器官旋转生物反应器。

优选的，所述类器官旋转生物反应器包括细胞培养板盖子和旋转组件，所述的旋转组件在细胞培养板盖子的孔内内嵌设置。

优选的，所述的细胞培养板盖子为12孔、48孔或96孔细胞培养板盖子。

优选的，所述旋转组件由旋转轴、旋转轴底部径向延设的旋转桨、旋转桨顶部的旋转轴上径向延设的支架，旋转轴顶部套装的齿轮组成。

优选的，所述的细胞培养板盖子上还设有电机孔，细胞培养板盖子的孔陈列中，延伸出所述的孔外的各齿轮相互啮合，所述电机的输出轴安装的齿轮与孔陈列中的一个齿轮啮合。

在一个具体实施方式中，电机带动孔陈列中的每个齿轮以相同的速度带动旋转桨旋转，螺旋桨部分与细胞培养物接触，将分离后的子宫类器官放入低吸附的细胞孔板中，加入类器官培养基，放在类器官生物反应器中培养；培养过程中，类器官生物反应器由所述直流电机带动齿轮旋转，齿轮带动螺旋轴螺旋桨旋转，有利于人子宫内膜类器官进行营养物质和氧气交换。

优选的，所述步骤1)还包括以下步骤：

(1)在无菌条件下刮取组织3-5g；将组织置于PBS中洗涤，去除红细胞；

(2)将内膜组织剪碎成2-3mm³组织小块，使用胶原酶V，置37℃恒温消化10-30(例如10、15、20、25、30)min，终止消化。

(3)将消化后的组织细胞悬液吹打，然后使用细胞筛网过滤组织悬液，用100μm细胞筛网去除黏液及未消化组织，利用40μm细胞筛网过滤腺上皮细胞；

(4)使用PBS反向冲洗细胞筛网，获取清洗液体；

(5)使用PBS反冲筛网，所得反冲液主要含腺上皮细胞团，离心5min，1000rpm后去除培养基，收集上皮细胞。

优选的，所述步骤2)还包括以下步骤：

(1)冰上预冷基质胶及枪头，准备类器官培养基。

(2)预冷基质胶重悬上述步骤1)中收集的腺上皮细胞，取30μL，接种到48孔板上，放入培养箱中10-20(例如10、15、20)min以加速凝固。

(3)在48孔板培养孔中加入步骤(1)中基质胶及类器官培养基，保持基质胶形状。

(4)腺上皮细胞团在基质胶中置于培养箱培养2-4天，直至细胞团形成圆球形的类器官。

优选的，所述步骤3)还包括以下步骤：

(1)将类器官从基质胶中移出：

提前于冰上预冷DMEM/F12完全培养基，弃去原类器官培养基，用枪头将基质胶刮下，加入500μL预冷DMEM/F12完全培养基，将含有基质胶的完全培养基转移到15ml离心管中，置于冰上30min待基质胶融化为液体状，于冰上吹打80-100下，放入提前预冷至4℃离心机中，离心5min，1000rpm，弃上清液，得到无基质胶类器官；

(2)类器官转移到生物反应器上：

去除基质胶的类器官加入类器官培养基重悬，加入悬浮12孔板中，盖上盖子，确认反应器螺旋桨完全浸入培养基中，设置电压，接通电源。

(3)类器官在生物反应器的持续培养及传代：

类器官可在生物反应器中持续培养，2-3天换一次培养基，根据类器官增殖情况传代，进一步优选的，所述的传代步骤包括：将类器官及培养基转移至离心管中，竖直静置约3-5min待类器官完全沉降至管底，吸取上清液弃去，加入新培养基，吹打30-50下，再将类器官和培养基加入新的悬浮培养基中，在生物反应器中培养。

优选的，生物反应器螺旋桨完全浸入培养基中，所述的生物反应器电压为3-5V(例如3V、3.5V、4V、4.5V、5V)。

在一个具体实施方式中，所述的生物反应器电压为3.5V，所述的生物反应器螺旋桨转速为60转。

优选的，所述的生物反应器电压根据培养天数进行调整。

在一个具体实施方式中，生物反应器中培养第一天电压3.5V，第二天之后调整为4.5V，培养第三天后调整为5V。

优选的，所述类器官不包括胚外组织，不会发育为动物体或人体。

在一个具体实施方式中，所述的类器官为人类类器官模型。

优选的，所述的类器官为人子宫内膜。

本发明的第二方面，提供一种类器官培养基，所述的类器官培养基包含基础培养基、细胞培养添加剂、N-乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine)、L-谷氨酰胺(L-Glutamine)、细胞生长因子、BMP抑制剂、Wnt激动剂、TGFβreceptor I(TβRI)抑制剂和烟酰胺中的一种或两种以上的组合。

优选的，所述基础培养基可以是任意适合类器官培养的基础培养基。例如：所述基础培养基为E6(Essential 6)、KO-DMEM、KO-DMEM/F12、DMEM/F12、TL、DMEM、α-MEM、F-12、MEM、BME、RPMI 1640、G-MEM及其任意组合。

优选的，所述的细胞生长因子包括表皮细胞生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和/或肝细胞生长因子(HGF)，其中，所述的FGF包括FGF-9或FGF-10。

优选的，所述的BMP抑制剂包括LDN-212854、DMH-1和/或Noggin。

优选的，Wnt激动剂包括CHIR-99021、IM-12、AT7519、CHIR-98014、KY19382、CWP232291、Tideglusib、WNT蛋白和/或Rspondin-1，所述的WNT蛋白包括但不限于WNT1、WNT3、WNT3a、WNT7a或WNT8。

优选的，所述的TGFβreceptor I(TβRI)抑制剂包括Galunisertib(LY2157299)、SB525334、SB505124、LY364947(HTS 466284)和/或A83-01。

优选的，所述的类器官培养基包括DMEM/F12、N2、B27、N-乙酰半胱氨酸、L-谷氨酰胺、EGF、Noggin、Rspondin-1、FGF-10、HGF、A83-01和烟酰胺。

优选的，所述的N-乙酰半胱氨酸浓度为1.0-2.0(例如1.0、1.20、1.25、1.30、1.40、1.50、1.55、1.70、2.0)mM。

优选的，所述的L-谷氨酰胺浓度为1.5-2.5(例如1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5)mM。

优选的，所述的EGF浓度为20-80(例如20、30、40、45、50、55、60、70、80)ng/ml。

优选的，所述的Noggin浓度为50-150(例如50、55、60、70、80、90、95、100、105、110、120、130、140、150)ng/ml。

优选的，所述的Rspondin-1浓度为400-600(例如400、450、500、550、600)ng/ml。

优选的，所述的FGF-10浓度为50-150(例如50、55、60、70、80、90、95、100、105、110、120、130、140、150)ng/ml。

优选的，所述的HGF浓度为20-80(例如20、30、40、45、50、55、60、70、80)ng/ml。

优选的，所述的A83-01浓度为400-600(例如400、450、500、550、600)mM。

优选的，所述的烟酰胺浓度为5-15(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15)mM。

优选的，所述类器官不包括胚外组织，不会发育为动物体或人体。

在一个具体实施方式中，所述的类器官为人类类器官模型。

优选的，所述的类器官为人子宫内膜。

本发明的第三方面，提供一种类器官生物反应器，所述的类器官生物反应器为类器官旋转生物反应器，所述类器官旋转生物反应器包括细胞培养板盖子和旋转组件，所述的旋转组件在细胞培养板盖子的孔内内嵌设置。

优选的，所述的细胞培养板盖子为12孔、48孔或96孔细胞培养板盖子。

优选的，所述旋转组件由旋转轴、旋转轴底部径向延设的旋转桨、旋转桨顶部的旋转轴上径向延设的支架，旋转轴顶部套装的齿轮组成。

优选的，所述的细胞培养板盖子上还设有电机孔，细胞培养板盖子的孔陈列中，延伸出所述的孔外的各齿轮相互啮合，所述电机的输出轴安装的齿轮与孔陈列中的一个齿轮啮合。

在一个具体实施方式中，电机带动孔陈列中的每个齿轮以相同的速度带动旋转桨旋转，螺旋桨部分与细胞培养物接触，将分离后的子宫类器官放入低吸附的细胞孔板中，加入类器官培养基，放在类器官生物反应器中培养；培养过程中，类器官生物反应器由所述直流电机带动齿轮旋转，齿轮带动螺旋轴螺旋桨旋转，有利于人子宫内膜类器官进行营养物质和氧气交换。

本发明第四方面，提供一种类器官模型，所述的类器官模型由上述的构建方法、上述的类器官培养基或上述的类器官生物反应器培养获得。

优选的，所述类器官不包括胚外组织，不会发育为动物体或人体。

在一个具体实施方式中，所述的类器官为人类类器官模型。

优选的，所述的类器官为人子宫内膜。

本发明的第五方面，提供了一种上述的类器官模型的应用，所述的应用包括在制备用于研究子宫内膜正常生理过程及病理状态、用于临床前药物筛选、用药安全性及生殖毒性检测的体外模型中的用途或作为移植产品的应用。

发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。

本发明所述的“包含”或“包括”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。然而在用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。

以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。

本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。

本发明有益效果：

本发明公开一种人子宫内膜类器官体外培养方法，采用基于Matrigel基质胶中培养为基础，利用类器官旋转生物反应器进行培养和传代分化，该方法与现有技术相比，大幅度降低实验和技术成本，操作简单，可重复性好，可获得大量的人子宫内膜类器官，进而被更好的用于科研及临床应用。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1：实施例1中经旋转生物反应器培养后的人子宫内膜类器官的光镜图；

图2：生物反应器相较于Matrigel基质胶培养方式人子宫内膜类器官数量统计分析；

图3：人子宫内膜类器官免疫荧光图；

图4：Matrigel基质胶未清除条件下的类器官培养结果，其中，黑色聚集部分为基质胶；

图5：类器官生物反应器的不同电压设定下的类器官培养结果，其中，A为恒定电压5V，B为电压变化在3V-5V，黑色箭头指示细胞碎片(细胞死亡)。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1人多能性干细胞分化多器官协同发育模型的制备

一种人子宫内膜类器官体外培养方法，所述方法包括以下步骤：

1.分离人子宫内膜上皮、基质细胞

1.1在医院无菌条件下刮取子宫内膜组织3-5g；将内膜组织置于PBS(加1％青链霉素)中洗涤，尽量去除红细胞；

1.2将内膜组织剪碎成2-3mm³组织小块，使用胶原酶V，置37℃恒温消化约20min，DMEM/F12完全培养基(含10％FBS，1％青链霉素)终止消化。

1.3将消化后的组织细胞悬液轻柔吹打，然后使用细胞筛网过滤组织悬液,用100μm细胞筛网去除黏液及未消化组织，利用40μm细胞筛网过滤腺上皮细胞；

1.4使用PBS反向冲洗细胞筛网，获取清洗液体；

1.5使用PBS反冲筛网，所得反冲液主要含内膜腺上皮细胞团。离心5min，1000rpm后去除培养基，收集上皮细胞。

2.人子宫类器官培养

2.1冰上预冷Matrigel及枪头。

其中，所述人子宫内膜类器官培养基包含：DMEM/F12,N2 supplement,B27supplement,N-Acetyl-L-cysteine 1.25mM,L-glutamine 2mM,recombinant humanEGF50ng/ml,recombinant human Noggin 100ng/ml,recombinant human Rspondin-1500ng/ml,recombinant human FGF-10 100ng/ml,recombinant human HGF 50ng/ml,A83-01 500nM,烟酰胺(nicotinamide)10nM。

2.2预冷Matrigel100μL重悬上述步骤1.5中收集的上皮细胞，取30μL，接种到48孔板上，放入培养箱中15min以加速凝固。

2.3在48孔板培养孔中轻柔加入300μL上述步骤2.1所述培养液，保持Matrigel形状。

2.4人子宫腺体上皮团在Matrigel中置于培养箱培养2-4天，直至细胞团基本形成圆球形的类器官。

2.5将类器官从Matrigel中移出

提前于冰上预冷DMEM/F12完全培养基。

弃去原类器官培养基，用枪头轻轻将Matrigel刮下，加入500μL预冷DMEM/F12完全培养基。将含有Matrigel的完全培养基转移到15ml离心管中，置于冰上30min待Matrigel融化为液体状，于冰上轻柔吹打80-100下，放入提前预冷至4℃离心机中，离心5min，1000rpm，弃上清液，得到无Matrigel类器官。

2.6类器官转移到生物反应器上

去除基质胶的类器官加入3ml类器官培养基重悬，加入悬浮12孔板中。盖上盖子，确认反应器螺旋桨完全浸入培养基中，设置电压3V-5V，接通电源。后续根据培养天数进行电压调整，如可以进行以下设定：第一天电压3.5V，第二天之后调整为4.5V，培养第三天后调整为5V。

2.7类器官在生物反应器的持续培养及传代

类器官可在生物反应器中持续培养，2-3天换一次培养基，根据类器官增殖情况传代。

传代：将类器官及培养基转移至15ml离心管中，竖直静置约3min待类器官完全沉降至管底，吸取上清液弃去。加入新培养基，轻柔吹打约30下，再将类器官和培养基平均加入新的悬浮培养基中，在生物反应器中培养。

2.8所述类器官生物反应器包括设置12孔的细胞培养板盖子，所述12孔内嵌设旋转组件，所述旋转组件由旋转轴、旋转轴底部径向延设的旋转桨、旋转桨顶部的旋转轴上径向延设的支架，旋转轴顶部套装的齿轮组成；

位于细胞培养板盖子12孔陈列中的细胞培养板盖子上还设有电机孔，12孔陈列中延伸出所述12孔外的各齿轮相互啮合，所述电机的输出轴安装的齿轮与12孔陈列中的一个齿轮啮合；

工作时，电机带动12孔陈列中的每个齿轮以相同的速度带动旋转桨旋转，螺旋桨部分与细胞培养物接触，将分离后的子宫类器官放入低吸附12孔细胞孔板中，加入上述步骤2.1子宫类器官培养基，放在类器官生物反应器中培养；将直流电机调到3.5V，此时旋转速度大约在60转；

培养过程中，类器官生物反应器由所述直流电机带动12个齿轮旋转，齿轮带动螺旋轴螺旋桨旋转，有利于人子宫内膜类器官进行营养物质和氧气交换。

最终获得的人子宫内膜类器官如图1所示。

实施例2子宫内膜类器官免疫学验证

在体外培养的第六天，收集子宫类器官，然后通过免疫荧光染色法进行分析。可选地，在进行免疫荧光染色分析时，以CK7和MUC1为特异性标记，具体结果如图3所示。

同时用Matrigel基质胶培养方式获得人子宫内膜类器官，获得的人子宫内膜类器官数量远远少于本申请，结果如图2所示。

为了进一步验证本申请技术方案的优越性，将实验中途未去除Matrigel基质胶直接转移到生物反应器培养作为对照组，与本申请类器官模型的构建方法进行比较，结果如图4所示，若中途未去除基Matrigel基质胶直接转移到生物反应器培养，会使类器官缠绕到生物反应器的旋转齿轮上，影响生长。

为了进一步验证本申请技术方案的优越性，将实验中类器官生物反应器的电压设定进行比较。具体为将恒定电压5V作为对照组，与本申请步骤2.6中设定电压变化在3V-5V的情况进行比较，结果如图5所示，通过类器官培养形态判断，电压变化的类器官分化良好，而电压恒定下的类器官分化质量差，尤其在其培养液中明显的细胞碎片，如黑色箭头所指部分显示细胞死亡，恒定电压培养效果不佳。

上述结果表明，本申请类器官模型的构建方法相对于现有技术，大幅度降低技术成本，操作更简单，可以获得大量的人子宫内膜类器官，进而被更好的用于科研及临床应用。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种类器官模型的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括：

1)分离细胞；2)将细胞使用基质胶和类器官培养基进行培养；3)去除基质胶并移至生物反应器继续培养并传代。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的类器官培养基包含基础培养基、细胞培养添加剂、N-乙酰半胱氨酸、L-谷氨酰胺、细胞生长因子、BMP抑制剂、Wnt激动剂、TGFβreceptor I抑制剂和烟酰胺中的一种或两种以上的组合；

优选的，所述的细胞生长因子包括EGF、FGF和/或HGF，其中，所述的FGF包括FGF-9或FGF-10；

优选的，所述的BMP抑制剂包括LDN-212854、DMH-1和/或Noggin；

优选的，Wnt激动剂包括CHIR-99021、IM-12、AT7519、CHIR-98014、KY19382、CWP232291、Tideglusib、WNT蛋白和/或Rspondin-1，所述的WNT蛋白包括WNT1、WNT3、WNT3a、WNT7a或WNT8；

优选的，所述的TGFβreceptor I(TβRI)抑制剂包括Galunisertib、SB525334、SB505124、LY364947和/或A83-01。

3.根据权利要求1-2任一所述的构建方法，其特征在于，所述步骤1)还包括以下步骤：

(1)在无菌条件下刮取组织3-5g；将组织置于加入PBS中洗涤，去除红细胞；

(2)将组织剪碎成2-3mm³组织小块，使用胶原酶V，置37℃恒温消化10-30min，终止消化；

(3)将消化后的组织细胞悬液吹打，然后使用细胞筛网过滤组织悬液，用100μm细胞筛网去除黏液及未消化组织，利用40μm细胞筛网过滤腺上皮细胞；

(4)使用PBS反向冲洗细胞筛网，获取清洗液体；

(5)使用PBS反冲筛网，所得反冲液主要含腺上皮细胞团，离心5min，1000rpm后去除培养基，收集腺上皮细胞。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤2)还包括以下步骤：

(1)冰上预冷基质胶及枪头，准备类器官培养基；

(2)预冷基质胶重悬上述步骤1)中收集的腺上皮细胞，取30μL，接种到48孔板上，放入培养箱中10-20min以加速凝固；

(3)在48孔板培养孔中加入步骤(1)中基质胶及类器官培养基，保持基质胶形状；

(4)腺上皮细胞团在基质胶中置于培养箱培养2-4天，直至细胞团形成圆球形的类器官。

5.根据权利要求3-4任一所述的构建方法，其特征在于，所述步骤3)还包括以下步骤：

(1)将类器官从基质胶中移出：

提前于冰上预冷DMEM/F12完全培养基，弃去原类器官培养基，用枪头将基质胶刮下，加入500μL预冷DMEM/F12完全培养基，将含有基质胶的完全培养基转移到15ml离心管中，置于冰上30min待基质胶融化为液体状，于冰上吹打80-100下，放入提前预冷至4℃离心机中，离心5min，1000rpm，弃上清液，得到无基质胶类器官；

(2)类器官转移到生物反应器上：

去除基质胶的类器官加入类器官培养基重悬，加入悬浮12孔板中，盖上盖子，确认反应器螺旋桨完全浸入培养基中，设置电压，接通电源；

(3)类器官在生物反应器的持续培养及传代：

类器官在生物反应器中持续培养，2-3天换一次培养基，根据类器官增殖情况传代，优选的，所述的传代步骤包括：将类器官及培养基转移至15ml离心管中，竖直静置3-5min待类器官完全沉降至管底，吸取上清液弃去，加入新培养基，吹打30-50下，再将类器官和培养基加入新的悬浮培养基中，在生物反应器中培养。

6.根据权利要求3-5任一所述的构建方法，其特征在于，所述的生物反应器为类器官旋转生物反应器，所述的类器官旋转生物反应器电压为3-5V，

优选的，所述类器官旋转生物反应器包括细胞培养板盖子和旋转组件，所述的旋转组件在细胞培养板盖子的孔内内嵌设置，

进一步优选的，所述的细胞培养板盖子为12孔、48孔或96孔细胞培养板盖子；

进一步优选的，所述旋转组件由旋转轴、旋转轴底部径向延设的旋转桨、旋转桨顶部的旋转轴上径向延设的支架，旋转轴顶部套装的齿轮组成；

进一步优选的，所述的细胞培养板盖子上还设有电机孔，细胞培养板盖子的孔陈列中，延伸出所述的孔外的各齿轮相互啮合，所述电机的输出轴安装的齿轮与孔陈列中的一个齿轮啮合；

进一步优选的，电机带动孔陈列中的每个齿轮以相同的速度带动旋转桨旋转，螺旋桨部分与细胞培养物接触，将分离后的类器官放入低吸附的细胞孔板中，加入类器官培养基，放在类器官生物反应器中培养；培养过程中，所述生物反应器由所述电机带动齿轮旋转，齿轮带动螺旋轴螺旋桨旋转。

7.根据权利要求1-6任一所述的构建方法，其特征在于，所述的类器官模型为人类类器官模型，优选的，所述的类器官为人子宫内膜。

8.一种类器官培养基，其特征在于，所述的类器官培养基包含基础培养基、细胞培养添加剂、N-乙酰半胱氨酸、L-谷氨酰胺、细胞生长因子、BMP抑制剂、Wnt激动剂、TGFβreceptorI抑制剂和烟酰胺中的一种或两种以上的组合，

优选的，所述的细胞生长因子包括EGF、FGF和/或HGF，其中，所述的FGF包括FGF-9或FGF-10；

优选的，所述的BMP抑制剂包括LDN-212854、DMH-1和/或Noggin；

优选的，Wnt激动剂包括CHIR-99021、IM-12、AT7519、CHIR-98014、KY19382、CWP232291、Tideglusib、WNT蛋白和/或Rspondin-1，所述的WNT蛋白包括WNT1、WNT3、WNT3a、WNT7a或WNT8；

优选的，所述的TGFβreceptor I(TβRI)抑制剂包括Galunisertib、SB525334、SB505124、LY364947和/或A83-01。

9.一种类器官模型，其特征在于，所述的类器官模型由权利要求1-7任一所述的构建方法或权利要求8所述的类器官培养基培养获得。

10.一种根据权利要求9所述的类器官模型的应用，其特征在于，所述的应用包括在制备用于研究子宫内膜正常生理过程及病理状态、用于临床前药物筛选、用药安全性及生殖毒性检测的体外模型中的用途或作为移植产品的应用。

Images