CN116200333A - 一种sd乳鼠肾小管上皮细胞的分离培养及鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生命科学领域，公开了一种SD乳鼠肾小管上皮细胞的分离培养及鉴定方法。该分离培养方法选细胞活力佳的“SD乳鼠”，采用胰蛋白酶+胶原酶Ⅱ多次重复分批次消化，包括：(1)取SD乳鼠；(2)无菌取出SD乳鼠双肾放在PBS缓冲液中并去除所有肾脏的多余脂肪、肾外包膜及肾蒂等；(3)将肾组织剪碎，并采用PBS冲洗后进行离心分离；(4)先后采用胰蛋白酶和胶原酶Ⅱ次多次重复分批次消化出肾小管上皮细胞；(5)将分离的肾小管上皮细胞用完全培养基接种于培养皿后，静置培养，即得；(6)采用CK18免疫荧光鉴定。本发明分离培养方法条件温，对细胞伤害小，所提取的肾小管上皮细胞不仅数量多，纯度高、活力好，而且增殖速度快，可传代次数高。

Description

一种SD乳鼠肾小管上皮细胞的分离培养及鉴定方法
技术领域
本发明属于生命科学领域，涉及一种细胞的分离培养方法，尤其涉及一种SD乳鼠肾小管上皮细胞的分离培养及鉴定方法。
背景技术
肾脏是药物重要的代谢消除器官，其中肾小管是葡萄糖和水重吸收以及大部分药物排泄的主要部位，作为肾小管主要组成成分的近端肾小管上皮细胞便自然而然地成为肾脏功能最主要的执行者，同时也是驱动急性到慢性肾脏疾病进展的首要靶器官，在药源性肾损伤和药理研究中具有极其重要的地位。
在当前药物研发的流程中，动物实验仍然是临床前肾毒性评估的金标准，但是由于细胞功能和进程的研究在动物实验中不具备高操作性，因此细胞体外培养便成为众多科研工作者的首选方案。尽管细胞系因其容易培养且产量可观的优势已在科学发展中起了重要作用，然而仅仅由细胞系得来的数据却越来越难有说服力。其中主要的原因是它们会不断发生突变，连续传代导致它们的基因型和表型发生变化，且存在着鉴定错误和交叉污染的问题。
相比之下，原代细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性更大，且保持了细胞在体内的许多重要标志和功能作用，更接近于机体内细胞的新陈代谢过程，因此逐日成为科研学者青睐的研究工具。但是原代细胞是出了名的难培养，容易出现提取污染、酶的作用浓度及时间无法把控、细胞纯度不够、生长缓慢和传代有限等问题。
结合当前研究现状，建立理想的高仿生的体外肾小管模型，将有助于搭建肾脏功能研究、药物吸收排泄以及药物肾毒性等研究“快车”，以加快药物筛选进程、提高大规模开发生物化合物效率和临床试验成功率。
为此本发明提供了一种SD乳鼠肾小管上皮的分离培养及鉴定方法，以期对肾原代细胞培养及鉴定提供可靠的理论支撑和实践依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种SD乳鼠肾小管上皮细胞的分离培养及鉴定方法，主要用于解决肾原代提取易污染、消化酶的不合理使用以及细胞纯度低、生长缓慢等问题。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的第一个方面是提供一种SD乳鼠肾小管上皮细胞的分离培养方法，选细胞活力佳的“SD乳鼠”，采用胰蛋白酶+胶原酶Ⅱ多次重复分批次消化，具体包括如下步骤：
(1)禁乳消毒：取禁乳4～6h的SD乳鼠，洗净擦干消毒备用；
(2)取材：无菌打开SD乳鼠腹腔，取出双肾放在PBS缓冲液中用组织剪和镊子去除所有肾脏的多余脂肪、肾外包膜及肾蒂等；
(3)机械分离肾脏组织：将所有的肾脏用无菌预冷的PBS洗净后置于倾斜皿底，用剪刀将肾组织剪碎后转移至离心管，加入适量PBS用移液枪反复吹打后进行离心分离，弃上清，直至上清澄清且无明显血色；
(4)酶分离法：先用胰蛋白酶快速地消化并排除掉肾脏组织块中的其他非肾小管上皮细胞及杂质后，再加入胶原酶Ⅱ从“网织状”、“长线样”或“短棒状”的肾小管节段中多次重复分批次消化出肾小管上皮细胞；
(5)原代细胞培养：将分离的肾小管上皮细胞用完全培养基重悬细胞沉淀接种于培养皿后，静置孵箱中培养，即得SD乳鼠肾小管上皮细胞。
优选地，步骤(1)中所述禁乳4～6h，洗净擦干消毒的方法为：
取出生3～5天断乳4～6h的SD乳鼠，先用清水洗去身上脏物，再用75％的酒精棉球依次擦拭每一只新生SD乳鼠体表；
采用颈椎脱位法使SD乳鼠迅速死亡，将整只动物浸入盛有75％乙醇的烧杯中消毒5min，持镊子依次夹取每只SD乳鼠放在大平皿中携入紫外消杀后的超净工作台，备用。
优选地，步骤(2)中所述取材的具体操作方法为：
左手捏紧SD乳鼠颈背部皮肤充分暴露腹部，右手持镊子夹取酒精棉球再次消毒SD乳鼠腹部；
将SD乳鼠腹部朝上平置于操作台面，左手持镊子上提SD乳鼠腹部皮肤与肌肉，右手持灭过菌的眼科剪沿后腿根部连线横向剪开，再向头部方向纵向剪出“倒T”字形路径，依次无菌取出双肾并置于无菌预冷的PBS缓冲液中；
持镊子夹取酒精棉球擦拭操作台面，将眼科剪及镊子置于酒精灯上消毒，继续重复上述步骤直至完成所有SD乳鼠双侧肾脏取材；并用组织剪和镊子逐个去除所有肾脏的多余脂肪、肾外包膜及肾蒂等。
优选地，步骤(3)中所述离心分离的方法为：
将剪碎后的组织碎块转移至15ml离心管中，加入适量PBS用移液枪反复吹打直至组织块发白，离心800～1200rpm，5～8min弃去上清，反复操作直至上清澄清且无明显血色为止。
优选地，步骤(4)中，所述胰蛋白酶采用如下方法配置：
称取胰蛋白酶粉0.2g溶于100mlPBS中，再加100ul5mol的EDTA和5ul酚红，于超净工作台用0.22um无菌注射过滤器过滤，即得。
优选地，步骤(4)中，所述先用胰蛋白酶快速地消化并排除掉肾脏组织块中的其他非肾小管上皮细胞及杂质的操作方法为：
先向肾脏组织沉淀中加入现配现用的浓度为0.002g/ml的胰蛋白酶，消化5min后离心弃上清，此时肉眼可看到肾脏组织块已经出现明显分解，显微镜下可观察到部分肾小管节段已暴露出来；
继续向肾脏组织沉淀中加入浓度为0.002g/ml的胰蛋白酶，消化5min后已经可以明显看到很多“网织状”或“长线样”的肾小管节段，离心弃上清。
优选地，步骤(4)中，所述胶原酶Ⅱ采用如下方法配置：
称取125mg胶原酶溶于50ml1640培养基，于超净工作台用0.22um无菌注射过滤器过滤，即得。
优选地，步骤(4)中，所述加入胶原酶Ⅱ从“网织状”、“长线样”或“短棒状”的肾小管节段中多次重复分批次消化出肾小管上皮细胞的操作方法为：
在胰蛋白酶消化离心后的沉淀中加入现配现用的浓度为0.0025g/ml胶原酶Ⅱ，用移液枪缓慢吹打至出现明显浑浊，静置离心管将上清取到含完全培养基的新离心管中；
继续于原离心管中加入浓度为0.0025g/ml胶原酶Ⅱ重复以上步骤，多次重复分批次收集肾小管上皮细胞和部分“长线样”或“短棒状”肾小管节段于含完全培养基的新离心管中，直至原离心管肉眼无明显的肾脏组织团块出现；
将上述所有的新离心管800～1200rpm，离心5～8min，沉淀即为“长线样”或“短棒状”的肾小管节段和肾小管上皮细胞；
在上述沉淀中加入2ml胶原酶Ⅱ消化30s后，加入完全培养基终止消化，离心弃上清，沉淀即为“短棒状”的肾小管节段和肾小管上皮细胞。
优选地，步骤(5)中所述完全培养基采用含有15％胎牛血清和1％青霉素－链霉素－支原体清除剂的1640完全培养基。
本发明的第二个方面是提供一种如所述SD乳鼠肾小管上皮细胞的鉴定方法，采用CK18免疫荧光测定法对所培养的肾小管上皮细胞进行鉴定；
其中，鉴定阳性结果为：倒置荧光显微镜下可见胞核着蓝色，胞浆未着色，细胞膜带有红色荧光的即为肾小管上皮细胞。
本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明在选材上采用原材料易获取且繁殖周期短的SD乳鼠，其优势在于SD乳鼠的肾脏组织较其他小型鼠的体积更大，便于去除包膜和脂肪等且其肾脏细胞较成年鼠分裂能力更强，细胞活力更佳；此外，在分离方法上其优势在于先用胰蛋白酶能够缩短酶作用时间，快速分离出肾小管节段并弃去非肾小管上皮细胞及杂质，大大提高了提取纯度和细胞活力，再用胶原酶Ⅱ多次重复分批次消化，大大提高了提取产量。进而有效地解决原代细胞难培养，易污染、酶的作用浓度及时间难把控、提取的细胞纯度不够、生长缓慢和传代有限等问题。采用本发明方法的分离培养条件温和对细胞伤害小，所提取的肾小管上皮细胞不仅数量多，纯度高，活力好，而且细胞增殖速度快，可传代次数高，其效果明显优于现有的提取方法。
附图说明
图1为洗净备用的SD乳鼠；
图2为未消化的肾脏组织、细胞团块；
图3为经0.002g/ml的胰蛋白酶消化5分钟后，肾脏组织块已经出现明显分解且暴露出部分肾小管节段；
图4为向离心沉淀中第二次加胰蛋白酶；
图5为经胰蛋白酶消化处理的“网织状”或“长线样”的长条肾小管节段；
图6为向离心沉淀中首次加入0.0025g/ml胶原酶Ⅱ；
图7为经胶原酶Ⅱ消化处理后的部分“长线样”或“短棒状”的肾小管节段和肾小管上皮细胞；
图8为向离心沉淀中二次加入0.0025g/ml胶原酶Ⅱ；
图9为收集的肾小管上皮细胞和部分“短棒状”肾小管节段；
图10为接种的肾小管节段以及圆形透亮的单个游离肾小管上皮细胞；
图11为接种第12小时，细胞胞体透明且已贴壁，体积较大，形态呈典型鹅卵石铺路样，细胞间相连紧，呈“蚕豆样”；
图12为接种第24小时，“蚕豆样”的细胞团不断向外延伸，细胞部落之间的间隙逐渐减小，胞体饱满，折光性强；
图13为接种第48小时，细胞生长迅速，已基本铺满皿底，细胞形态已完全伸展呈典型鹅卵石铺路样，单层贴壁生长；
图14为对肾小管上皮细胞进行CK18鉴定，结果显示此法所获的SD乳鼠肾原代细胞纯度较高。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以便更好地理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
针对现有技术中肾原代提取易污染、消化酶的不合理使用以及细胞纯度低、生长缓慢等问题。本实施例首先提供一种SD乳鼠肾小管上皮细胞的分离培养及鉴定方法，该SD乳鼠肾小管上皮细胞的分离培养方法，其核心方案是选细胞活力佳的“SD乳鼠”，采用胰蛋白酶+胶原酶Ⅱ多次重复分批次消化，具体的主要包括如下步骤：
(1)禁乳消毒：取如图1所示的禁乳4～6h的SD乳鼠，洗净擦干消毒备用；
(2)取材：无菌打开SD乳鼠腹腔，取出双肾放在PBS缓冲液中用组织剪和镊子去除肾脏多余的组织、肾外包膜及肾蒂等；
(3)机械分离肾脏组织：将所有的肾脏用无菌预冷的PBS洗净后置于倾斜皿底，用剪刀将肾组织剪碎后转移至离心管，加入适量PBS用移液枪反复吹打后进行离心分离，弃上清，直至上清澄清且无明显血色；
(4)酶分离法：先用胰蛋白酶快速地消化并排除掉肾脏组织块中的其他非肾小管上皮细胞及杂质后，再加入胶原酶Ⅱ从“网织状”、“长线样”或“短棒状”的肾小管节段中多次重复分批次消化出肾小管上皮细胞；
(5)原代细胞培养：将分离的肾小管上皮细胞用完全培养基重悬细胞沉淀接种于培养皿后，静置孵箱中培养，即得SD乳鼠肾小管上皮细胞；
(6)细胞形态学观察：将培养的SD乳鼠肾小管上皮细胞在倒置生物显微镜下观察原代和第一代细胞的形态、贴壁、密度及融合度等生长状况，并拍照记录。
该SD乳鼠肾小管上皮细胞的分离培养的主要技术方案是，提取前通过多种方式，包括禁食、清洗、消毒等方式降低潜在的污染风险；提取中用胰蛋白酶和胶原酶Ⅱ分批次重复温和地分离出肾小管上皮细胞，以提高细胞活力和提取纯度及产量；提取后用含15％胎牛血清和1％青霉素－链霉素－支原体清除剂的1640完全培养基培养以解决原代细胞难培养的问题。
该细胞培养方法在选材上，采用原材料易获取且繁殖周期短的SD乳鼠，其优势在于肾脏组织较其他小型鼠的体积更大，便于去除包膜和脂肪等且其肾脏细胞较成年鼠分裂能力更强，细胞活力更佳。此外，在分离方法上其优势在于先用胰蛋白酶能够缩短酶作用时间，快速分离出肾小管节段并弃去非肾小管上皮细胞及杂质，大大提高了提取纯度和细胞活力，再用胶原酶Ⅱ多次重复分批次消化，大大提高了提取产量。
具体地，如图1所示，步骤(1)中所述禁乳4～6h，洗净擦干消毒的方法为：取出生3～5天断乳4～6h的SD乳鼠，先用清水洗去身上脏物包括垫料、粪便、尿渍及灰尘等，以降低提取过程中的污染风险，再用75％的酒精棉球擦拭每一只SD新生乳鼠体表；
采用颈椎脱位法使SD乳鼠迅速死亡，将整只动物浸入盛有75％乙醇的烧杯中消毒5min，持镊子依次夹取每只SD乳鼠放在大平皿中携入紫外消杀后的超净工作台，备用。
步骤(2)中所述无菌打开SD乳鼠腹腔，取出双肾放在PBS缓冲液中用组织剪和镊子去除肾脏多余的脂肪、肾外包膜及肾蒂等的具体操作方法为：
左手捏紧SD乳鼠颈背部皮肤充分暴露腹部，右手持镊子夹取酒精棉球再次消毒SD乳鼠腹部；
将SD乳鼠腹部朝上平置于操作台面，左手持镊子上提SD乳鼠腹部皮肤与肌肉，右手持灭过菌的眼科剪沿后腿根部连线横向剪开，再向头部方向纵向剪出“倒T”字形路径，依次无菌取出双肾并置于无菌预冷的PBS缓冲液中。
持镊子夹取酒精棉球擦拭操作台面，将眼科剪及镊子置于酒精灯上消毒，继续重复上述步骤直至完成所有SD乳鼠的双侧肾脏取材，并用组织剪和镊子逐个去除所有肾脏的多余脂肪、肾外包膜及肾蒂等。
步骤(3)中，所述的离心分离为将剪碎后的组织碎块转移至15ml离心管中，加入适量PBS用移液枪反复吹打直至组织块发白，离心800～1200rpm，5～8min弃去上清，反复操作直至上清澄清且无明显血色为止。
步骤(4)中，所述胰蛋白酶采用如下方法配置：称取胰蛋白酶粉0.2g溶于100mlPBS中，再加100ul5mol的EDTA和5ul酚红，于超净工作台用0.22um无菌注射过滤器过滤，即得胰蛋白酶。
步骤(4)中，分两次采用胰蛋白酶快速地消化并排除掉肾脏组织块中的其他非肾小管上皮细胞及杂质，其具体操作方法为：
如图2所示，向沉淀中加入现配现用的浓度为0.002g/ml的胰蛋白酶消化5分钟后离心弃上清，沉淀中可见未完全消化的肾脏组织、细胞团块。
如图3所示，经0.002g/ml的胰蛋白酶消化5分钟，离心弃上清后，此时肉眼可看到肾脏组织块已经出现明显分解，且显微镜下可观察到部分肾小管节段已暴露出来；
如图4所示，继续向沉淀中加入浓度为0.002g/ml的胰蛋白酶消化5分钟后，可以明显看到如图5所示的很多“网织状”的长条肾小管节段，离心弃上清，此时已经可以初步快速地消化并排除掉肾脏组织块中的其他非肾小管上皮细胞及杂质。
此外，步骤(4)中，所述胶原酶Ⅱ采用如下方法配置：称取125mg胶原酶溶于50ml1640培养基，于超净工作台用0.22um无菌注射过滤器过滤，即得胶原酶Ⅱ溶液。分三次加入胶原酶Ⅱ将“网织状”或“长线样”的肾小管节段消化出肾小管上皮细胞，其具体操作方法为：
如图6所示，向经胰蛋白酶二次消化离心处理后的沉淀中加入现配现用的浓度为0.0025g/ml胶原酶Ⅱ，用移液枪缓慢吹打之后，静置离心管将上清取到含完全培养基的新离心管中1000rpm，离心5min，沉淀即为“长线样”或“短棒状”的肾小管节段和肾小管上皮细胞如图7所示。
如图8所示，继续于原离心管中加入0.0025g/ml胶原酶Ⅱ重复以上步骤，多次重复分批次收集肾小管上皮细胞和部分“长线样”或“短棒状”肾小管节段和肾小管上皮细胞于含完全培养基的新离心管中，直至原离心管无明显的肾脏组织团块出现。
如图9所示，为肾小管上皮细胞和部分“短棒状”肾小管节段。
将上述所有的新离心管1000rpm，离心5min，沉淀即为“长线样”或“短棒状”的肾小管节段和肾小管上皮细胞。
最后，继续向上述沉淀中加入2ml胶原酶Ⅱ消化30s后，加入完全培养基终止消化，离心弃上清，即得“短棒状”的肾小管节段和肾小管上皮细胞。
该步骤(4)中，采用多次重复分批次消化的方式，可以使得先消化下的细胞先接种，以免消化过度同时降低对细胞的机械损伤。故而该方法条件温和对细胞伤害小，提取细胞数量多，纯度高且活力好，获得的肾小管上皮细胞增殖速度快，可传代次数高。
步骤(5)中，所述原代细胞培养的具体方法为：
将分离的近端肾小管上皮细胞用1640完全培养基重悬细胞至成为均匀的混悬液后接种于培养皿中，并将该接种的培养皿置于37℃、5％CO2孵箱中静置培养。所采用的1640完全培养基含有15％胎牛血清和1％青霉素－链霉素－支原体清除剂。
如图10所示，接种的肾小管节段以及圆形透亮的单个游离肾小管上皮细胞，该混悬液在倒置显微镜下可见刚分离的肾小管节段以及单个游离且圆形透亮肾小管上皮细胞。
如图11所示，培养12h后初次更换新鲜培养液，在倒置生物显微镜下可见大部分细胞胞体透明且已贴壁，体积较大，形态呈典型鹅卵石铺路样，细胞间相连紧，呈“蚕豆样”。
如图12所示，培养24h后，“蚕豆样”的细胞团不断向外延伸，细胞部落之间的间隙逐渐减小，胞体饱满，折光性强。
如图13所示，培养48h后，细胞生长迅速，已基本铺满皿底，细胞形态已完全伸展呈典型鹅卵石铺路样，单层贴壁生长。
此外，基于上述实施例提供的SD乳鼠肾小管上皮细胞的分离培养方法，本实施例还提供用于SD乳鼠肾小管上皮细胞的鉴定方法，主要基于CK18免疫荧光测定法对所分离培养的肾小管上皮细胞进行鉴定。
如图14所示，对上述实施例分离培养的SD乳鼠肾小管上皮细胞进行CK18免疫荧光鉴定，可在倒置荧光显微镜下观察到胞核着蓝色，胞浆未着色，细胞膜标记有红色荧光的即为肾小管上皮细胞。该鉴定结果表明，采用本发明细胞培养方法获得的肾原代细胞纯度较高。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种SD乳鼠肾小管上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，选细胞活力佳的“SD乳鼠”，采用胰蛋白酶+胶原酶Ⅱ多次重复分批次消化，具体包括如下步骤：
(1)禁乳消毒：取禁乳4～6h的SD乳鼠，洗净擦干消毒备用；
(2)取材：无菌打开SD乳鼠腹腔，将取出的双肾放在PBS缓冲液中，用组织剪和镊子去除肾脏多余的脂肪、肾外包膜及肾蒂等；
(3)机械分离肾脏组织：将所有的肾脏用无菌预冷的PBS洗净后置于倾斜皿底，用剪刀将肾组织剪碎后转移至离心管，加入适量PBS用移液枪反复吹打后进行离心分离，弃上清，直至上清澄清且无明显血色；
(4)酶分离法：先用胰蛋白酶快速地消化并排除掉肾脏组织块中的其他非肾小管上皮细胞及杂质后，再加入胶原酶Ⅱ从“网织状”、“长线样”或“短棒状”的肾小管节段中多次重复分批次消化出肾小管上皮细胞；
(5)原代细胞培养：将分离的肾小管上皮细胞用完全培养基重悬细胞沉淀接种于培养皿后，静置孵箱中培养，即得SD乳鼠肾小管上皮细胞。
2.根据权利要求1所述的SD乳鼠肾小管上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(1)中所述禁乳4～6h，洗净擦干消毒的方法为：
取出生3～5天断乳4～6h的SD乳鼠，先用清水洗去身上脏物，再用75％的酒精棉球依次擦拭每一只新生SD乳鼠体表；
采用颈椎脱位法使SD乳鼠迅速死亡，将整只动物浸入盛有75％乙醇的烧杯中消毒5min，持镊子依次夹取每只SD乳鼠放在大平皿中携入紫外消杀后的超净工作台，备用。
3.根据权利要求1所述的SD乳鼠肾小管上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(2)中所述取材的具体操作方法为：
左手捏紧SD乳鼠颈背部皮肤充分暴露腹部，右手持镊子夹取酒精棉球再次消毒SD乳鼠腹部；
将SD乳鼠腹部朝上平置于操作台面，左手持镊子上提SD乳鼠腹部皮肤与肌肉，右手持灭过菌的眼科剪沿后腿根部连线横向剪开，再向头部方向纵向剪出“倒T”字形路径，依次无菌取出双肾并置于无菌预冷的PBS缓冲液中；
持镊子夹取酒精棉球擦拭操作台面，将眼科剪和镊子置于酒精灯上消毒，继续重复上述步骤直至完成所有双侧肾脏取材，并用组织剪和镊子逐个去除所有肾脏的多余脂肪、肾外包膜及肾蒂等。
4.根据权利要求1所述的SD乳鼠肾小管上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(3)中所述离心分离的方法为：
将剪碎后的组织碎块转移至15ml离心管中，加入适量PBS用移液枪反复吹打直至组织块发白，离心800～1200rpm，5～8min弃去上清，反复操作直至上清澄清且无明显血色为止。
5.根据权利要求1所述的SD乳鼠肾小管上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(4)中，所述先用胰蛋白酶快速地消化并排除掉肾脏组织块中的其他非肾小管上皮细胞及杂质的操作方法为：
先向肾脏组织沉淀中加入浓度为0.002g/ml的胰蛋白酶，消化5min后离心弃上清，此时肉眼可看到肾脏组织块已经出现明显分解，显微镜下可观察到部分肾小管节段已暴露出来；
继续向沉淀中加入浓度为0.002g/ml的胰蛋白酶，消化5min后显微镜下可以明显看到很多“网织状”的长条肾小管节段，继续离心弃上清。
6.根据权利要求1所述的SD乳鼠肾小管上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(4)中，所述胰蛋白酶采用如下方法配置：
称取胰蛋白酶粉0.2g溶于100mlPBS中，再加100ul5mol的EDTA和5ul酚红，于超净工作台用0.22um无菌注射过滤器过滤，即得。
7.根据权利要求1所述的SD乳鼠肾小管上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(4)中，所述加入胶原酶Ⅱ从“网织状”、“长线样”或“短棒状”的肾小管节段中消化出肾小管上皮细胞的操作方法为：
在胰蛋白酶消化离心后的沉淀中加入浓度为0.0025g/ml胶原酶Ⅱ，用移液枪缓慢吹打至出现明显浑浊，静置离心管将上清取到含完全培养基的新离心管中；
继续于原离心管中加入浓度为0.0025g/ml胶原酶Ⅱ重复以上步骤，多次重复分批次收集肾小管上皮细胞和部分“长线样”或“短棒状”肾小管节段于含完全培养基的新离心管中，直至原离心管无明显的肾脏组织团块出现；
将上述所有的新离心管800～1200rpm，离心5～8min，沉淀即为“长线样”或“短棒状”的肾小管节段和肾小管上皮细胞；
在上述沉淀中加入2ml胶原酶Ⅱ消化30s后，加入完全培养基终止消化，离心弃上清，沉淀即为“短棒状”的肾小管节段和肾小管上皮细胞。
8.根据权利要求1所述的SD乳鼠肾小管上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(4)中，所述胶原酶Ⅱ采用如下方法配置：
称取125mg胶原酶溶于50ml1640培养基，于超净工作台用0.22um无菌注射过滤器过滤，即得。
9.根据权利要求1所述的SD乳鼠肾小管上皮细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(5)中所述完全培养基采用含有15％胎牛血清和1％青霉素－链霉素－支原体清除剂的1640完全培养基。
10.一种如权利要求1至9任一项所述SD乳鼠肾小管上皮细胞的鉴定方法，其特征在于，采用CK18免疫荧光测定法对所培养的肾小管上皮细胞进行鉴定；
其中，鉴定阳性结果为：倒置荧光显微镜下可见胞核着蓝色，胞浆未着色，细胞膜标记有红色荧光的即为肾小管上皮细胞。
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