CN111808813A - 一种神经干细胞的取材培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种神经干细胞的取材培养方法，包括以下步骤：a.选取合格的人工流产胚胎组织；b.无菌条件下分离胚胎组织：分离胚胎组织，再找到并分离外胚层形成的神经板或者神经管；c.获得符合接种浓度的单细胞悬液：无菌条件下取出室管膜层组织并缓冲液清洗后，再用机械分离或酶消化分离法分离神经管上皮细胞，以1×105个/毫升的密度接种于含有促有丝分裂诱导因子的DMEM/F12无血清培养基中；d.传代培养；e.倒置显微镜观察细胞生长情况。本发明在取材的组织上创新，增加了原材取材的便捷性，更有效的选取了更具有活性的原始细胞进行培养，提高了神经干细胞的培养成功率，为各类神经干细胞的临床、基础研究提供了可靠保证。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种神经干细胞的取材培养方法。
背景技术
干细胞研究是当前生命科学研究的热点，神经干细胞则是目前研究最多、应用最多的干细胞种类之一。自从神经组织不可以再生的论断被打破后，神经干细胞进入了广大科研工作者的视野，许多的临床医生也做了很多尝试。一些相关的理论也渐渐被大家熟知：90年代中期的许多研究表明人类新生的神经元、胶质细胞来自于神经干细胞，它们大多集中在嗅球、侧脑室的脑室区脑室下区、海马、脊髓，他们在体内可以分化为神经元和角质细胞，体外培养则可以生成神经球。而这些神经球的许多性状已经被证实可以加以利用，在许多疾病的细胞移植中起作用，这也使得许多的神经科医生围绕着他开展了丰富多样的临床实验。
伴随着神经干细胞基础理论的进展，临床实验已经如火如荼的开展，许多医院已经在诸如脑出血后遗症、脑梗塞后遗症、视神经损伤、持续植物状态、癫痫、脑瘫、脊髓损伤、脑胶质瘤等方面取得了很大的进展。这些缺乏特效治疗手段而又严重危害人类健康的疾病，许多年来一直的困扰也许在不久的将来借助神经干细胞的力量会给患者带来福音。在取得成绩的同时也应该看到，在这一领域内依然存在着这样那样、林林总总的问题，比如细胞来源稀少，病历数量有限，远期疗效无法预见，没有大规模的科学的临床对照实验，没有统一的规章指南等等，但是毫无疑问神经干细胞已经提供了一个更加革命化的细胞武器。以往的神经干细胞实验，取材往往是大月份引产的完整胎儿，在一切检查合格后，通过解剖中枢神经系统的相应的功能区域（比如脑室区、脑室下区、海马、齿状回等），进行原代取材后通过细胞原代培养的方法获得。当然也有利用其它来源的干细胞如骨髓、脐带、羊水等经过诱导后使其跨胚层分化为神经细胞，但是实验操作复杂。现在可以直接利用的合格的引产胎儿越来越少，甚至科研人员不得不耗费大量的时间精力去解决这个问题，病人不得不在整个治疗过程中用等待来占据大多数住院时间。随着医疗制度的不断完善，随着人民医疗保健常识的提高，将来的大月份引产胎儿将会越来越少，所以，解决这个问题迫在眉睫。
发明内容
本发明为了解决上述的技术问题，而提供一种神经干细胞的取材培养方法。
本发明是按照以下技术方案实现的：
一种神经干细胞的取材培养方法，包括以下步骤：
a. 选取合格的人工流产胚胎组织
选择年龄20-35岁的妇女，妊娠 2周以上、8周以内，经常规手术前检查无禁忌症；经负压吸引出的胚胎组织离体不超过4小时，柔软、粉红的绒毛组织和类纽扣形的胚胎组织完好；
b. 无菌条件下分离胚胎组织
在无菌条件下剥除血管、筋膜组织，冲洗去血液，分离胚胎组织，再找到并分离外胚层形成的神经板或者神经管；
c. 获得符合接种浓度的单细胞悬液
无菌条件下取出室管膜层组织并缓冲液清洗后，再用机械分离或酶消化分离法分离神经管上皮细胞，以1×105个/毫升的密度接种于DMEM/F12无血清培养基中，同时添加N2、NGF、b-FGF或EGF促有丝分裂诱导因子，在湿度100%、温度37℃、5%CO2条件下培养细胞；
d. 传代培养
每隔3天换液传代一次，传代时使用机械分离法和酶消化分离法中的一种或两种方式分散细胞；
e. 每天倒置显微镜观察细胞生长情况，根据生长情况判断是否有神经干细胞产生，待生长总数量级达106-107时，稳定传代3代以上时，鉴定神经干细胞。
进一步的，步骤c中，细胞悬液用消毒的筛网过滤杂质。
进一步的，筛网的孔径为200目。
进一步的，步骤c中，所述机械分离法的具体操作如下：采用剪切、轻柔吹打的方法将组织分离，再将组织放入离心管中自然沉淀1-2分钟，弃掉最下层沉淀组织，吸取上层细胞混悬液，调整细胞密度为1×105/ml，接种到神经干细胞完全培养基，于37℃、5%CO2条件下培养；每天观察生长情况，倒置显微镜下观察到有神经球样集落生长，并见培养液颜色变黄、变淡时，进行半量换液；当神经干细胞集落长到75%-80%时，轻轻吹打分散开后进行传代培养。
进一步的，步骤c中，酶消化分离法的具体操作如下：将组织放入0.25%的胰蛋白酶溶液中，于37℃条件下消化5分钟，镜下见细胞分散后，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12终止消化，再用无血清DMEM/F12培养基清洗，用神经干细胞完全培养基调整细胞密度为1×105/ml，于37℃、5%CO2条件下培养；每天观察生长情况，倒置显微镜下观察到有神经球样集落生长，并见培养液颜色变黄、变淡时，进行半量换液；当神经干细胞集落长到75%-80%时，轻轻吹打分散开后进行传代培养。
进一步的，所述神经干细胞完全培养基为含有20ng/ml BFGF和20ng/ml EGF的DMEM/F12培养基。
本发明具有的优点和有益效果是：
本申请采用全新的原代材料取材，极大方便了神经干细胞的培养。对在干细胞各类基础临床应用领域来说提供了广阔的研究基材，对国内外已经有结论或者争议中的许多常见病、多发病都是一个极好的消息。神经干细胞可以治疗的疾病是大量的，诸如脑出血后遗症、脑梗塞后遗症、视神经损伤、持续植物状态、癫痫、脑瘫、脊髓损伤、脑胶质瘤等等，这些疾病又是常见疾病、多发疾病。它们缺乏特异性治疗、治疗成本巨大、致死率和致残率高，危害人类健康最为严重，给社会和家庭带来了沉重的负担。本申请的是一种方便、简洁的培养神经干细胞的方法，探索新的原代取材之路，为广大的临床和科研工作者提供大量的、取材方便的神经干细胞培养方案，应用前景十分广阔。
附图说明
图1是本发明采用的原代取材材料图；
图2是本发明培育出来的神经干细胞图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明进行详细的说明。
一种神经干细胞的取材培养方法，包括以下步骤：
1.选取合格的人工流产胚胎组织
入选标准为年龄20-35岁的妇女，孕产史无特殊要求，人工流产术史无特殊要求，妊娠2周以上、8周以内。经常规手术前检查无禁忌症。入选标准同妇产科人工流产手术病人适应症（但应排除因各种疾病不宜继续妊娠者）。如血常规、心电图、局部无感染、无心、肾肝等重大脏器功能障碍、出凝血时间正常范围、输血5项、艾滋病、梅毒、性病检查正常。经付压吸引出的胚胎组织离体不超过4小时，可以看见柔软、粉红的绒毛组织和类纽扣形的胚胎组织完好。
禁忌证为：各种急慢性疾病的急性期，生殖器炎症如阴道炎、重读宫颈糜烂等，周身情况不良不能耐受手术者，术前两次体温在37.5度以上。
人流术后的胚胎组织则作为医疗废物予以丢弃。从干细胞发育的角度看：这些8周龄内的孕胚组织富含更为早期、更为幼稚的前体干细胞，它们离开人体的时间更短，细胞活力更强，即使不加以利用它们也是被当作医疗废弃物销毁，没有伦理学的限制。从胚胎学的角度看：人类的神经系统最起源于外胚层细胞形成的神经管（神经板）和神经嵴。随着神经管头泡的形成，头端形成大脑，中间的官腔相成相应的脑室系统以及脊髓的中央管。而在中央管内部被覆的神经上皮细胞，是具有旺盛的分裂能力的，在高峰期其每分钟可以产生25000个新生神经元，这些细胞形成所谓的脑室带，经过不断的分化形成神经元和胶质细胞组成复杂的神经系统 。这些细胞中的部分还会进一步深入脑组织，组成室下带。而成年后在室下带就是最常用的神经干细胞采集部位之一。那么采用比室管膜下区细胞更幼稚的神经管细胞同样可以得到神经干细胞。而毫无疑问的是，得到一个8周龄内的人流后胚胎组织远远要比得到一个合格的大月份水囊引产的胎儿要容易的多，要丰富的多，要方便的多。那么也许这样神经干细胞的来源就被大大的丰富了。
2.无菌条件下转移至中心实验室超净工作台上，使用普通外科解剖显微镜，以及消毒的显微外科手术剪、钳、探针等器械有效分离胚胎组织。剥除血管、筋膜等组织、冲洗去血液、仔细分离胚胎组织，找到外胚层形成的神经板或者神经管，并分离该组织。（注意：此时胚胎组织因实际操作可能无法分离出类似于教科书般的示意结构，但需尽量沿着神经管发育的部位显露取材，必要时可以使用眼科探针、经烧灼打磨光滑针尖的大号针头协助取材）
3.获得符合接种浓度的单细胞悬液
在无菌条件下用解剖显微镜取出室管膜层组织并用缓冲液清洗后用机械分离或酶消化法获取细胞悬液，必要时可以用消毒的筛网过滤杂质，筛网可以使用不锈钢200目左右，以50ml注射器复制过滤，注意动作轻柔，避免细胞悬液高速冲击而通过筛网细孔，而划伤细胞膜损伤活性。以大约约1×105个/毫升的密度接种于DMEM/F12等无血清培养基中，同时添加N2、NGF、b-FGF、EGF等促有丝分裂诱导因子，在湿度100%、温度37℃、CO2浓度5%的细胞培养箱内培养。
机械分离法：采用剪切、轻柔吹打的方法将组织分离为单细胞悬液。放入10ml的离心管中自然沉淀1分钟，弃掉试管最下层沉淀组织，用玻璃吸管吸取上层细胞混悬液，调整细胞密度为1×105/ml，接种到装有神经干细胞完全培养基（DMEM/F12，BFGF20ng/ml，EGF20ng/ml）的25cm2细胞培养瓶中。放于37℃、5%CO2体积百分比的细胞培养箱中培养。每天观察生长情况，约2天左右倒置显微镜下观察到有神经球样集落生长，并见培养液颜色变黄、变淡时，进行半量换液。当神经干细胞集落张到大约75%-80%时，用巴斯德吸管轻轻吹打分散开后进行传代培养。
酶消化分离法：该方法取材同机械分离法，将组织放入0.25%的胰蛋白酶溶液中，放于37℃的环境中消化5分钟，镜下见细胞分散，立刻加入含10%胎牛血清的DMEM/F12终止消化，用无血清的DMEM/F12培养基清洗2遍（800rpm，8min），用神经干细胞完全培养基（DMEM/F12，BFGF，EGF）调整细胞密度为1×105/ml，接种于细胞培养瓶中，其余步骤同机械分离法。
4.传代培养
每隔3天换液传代一次，传代时使用机械吹打发吹散细胞，如细胞团块较为结实不必一味用吸管吹打，配合使用酶消化分离法。机械分离法和酶消化法可以配合使用，但建议优先使用机械分离法，因轻柔的力度可以达到分离细胞团的效果同时避免各类酶干扰细胞的生物学活性，既有利于细胞生长也有利于后续其他研究减少相关干扰因素。
5.每天倒置显微镜观察细胞生长情况，根据生长情况判断是否有神经干细胞产生（神经克隆球），待生长总数量级达106-107时，稳定传代3代以上时，做免疫组织化学染色检测神经干细胞的表面标志巢蛋白（nestin），结合神经干细胞特有的悬浮集落球生长方式鉴定为神经干细胞。本发明方法培育出来的神经干细胞参见图2。
本发明分析了胚期胚胎的各个组织胚胎学结构，以及各个组织结构对未来神经板、神经管以及中枢神经系统的组织胚胎学发育关系，外胚层神经板（神经管）一般在流产胚胎内可以使用解剖显微镜分离，分离的原材细胞取材组织活力较传统大脑室管膜区、海马区、SVZ区取材的细胞活性无特殊差异。理论上可能细胞活性更加良好，生物学特性更加原始，端粒酶活性更高、端粒消耗及细胞分裂更少。本发明在利用取材的组织上创新，增加了原材取材的便捷性，更有效的选取了更具有活性的原始细胞进行培养，提高了神经干细胞的培养成功率，极大的方便了原代取材的来院，有效伦理学、孕妇大月份引产等生理病理损伤，为各类神经干细胞的临床、基础研究提供了可靠保证。
Claims (6)
1.一种神经干细胞的取材培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
a. 选取合格的人工流产胚胎组织
选择年龄20-35岁的妇女，妊娠 2周以上、8周以内，经常规手术前检查无禁忌症；经负压吸引出的胚胎组织离体不超过4小时，柔软、粉红的绒毛组织和类纽扣形的胚胎组织完好；
b. 无菌条件下分离胚胎组织
在无菌条件下剥除血管、筋膜组织，冲洗去血液，分离胚胎组织，再找到并分离外胚层形成的神经板或者神经管；
c. 获得符合接种浓度的单细胞悬液
无菌条件下取出室管膜层组织并缓冲液清洗后，再用机械分离或酶消化分离法分离神经管上皮细胞，以1×105个/毫升的密度接种于DMEM/F12无血清培养基中，同时添加N2、NGF、b-FGF或EGF促有丝分裂诱导因子，在湿度100%、温度37℃、5%CO2条件下培养细胞；
d. 传代培养
每隔3天换液传代一次，传代时使用机械分离法和酶消化分离法中的一种或两种方式分散细胞；
e. 每天倒置显微镜观察细胞生长情况，根据生长情况判断是否有神经干细胞产生，待生长总数量级达106-107时，稳定传代3代以上时，鉴定神经干细胞。
2.根据权利要求1所述的一种神经干细胞的取材培养方法，其特征在于：步骤c中，细胞悬液用消毒的筛网过滤杂质。
3.根据权利要求2所述的一种神经干细胞的取材培养方法，其特征在于：筛网的孔径为200目。
4.根据权利要求1所述的一种神经干细胞的取材培养方法，其特征在于：步骤c中，所述机械分离法的具体操作如下：采用剪切、轻柔吹打的方法将组织分离，再将组织放入离心管中自然沉淀1-2分钟，弃掉最下层沉淀组织，吸取上层细胞混悬液，调整细胞密度为1×105/ml，接种到神经干细胞完全培养基，于37℃、5%CO2条件下培养；每天观察生长情况，倒置显微镜下观察到有神经球样集落生长，并见培养液颜色变黄、变淡时，进行半量换液；当神经干细胞集落长到75%-80%时，轻轻吹打分散开后进行传代培养。
5.根据权利要求1所述的一种神经干细胞的取材培养方法，其特征在于：步骤c中，酶消化分离法的具体操作如下：将组织放入0.25%的胰蛋白酶溶液中，于37℃条件下消化5分钟，镜下见细胞分散后，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12终止消化，再用无血清DMEM/F12培养基清洗，用神经干细胞完全培养基调整细胞密度为1×105/ml，于37℃、5%CO2条件下培养；每天观察生长情况，倒置显微镜下观察到有神经球样集落生长，并见培养液颜色变黄、变淡时，进行半量换液；当神经干细胞集落长到75%-80%时，轻轻吹打分散开后进行传代培养。
6.根据权利要求4、5任一所述的一种神经干细胞的取材培养方法，其特征在于：所述神经干细胞完全培养基为含有20ng/ml BFGF和20ng/ml EGF的DMEM/F12培养基。
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| CN113913383A (zh) * | 2021-10-08 | 2022-01-11 | 山东万海生物科技有限公司 | 一种胚胎神经干细胞体外培养基及培养方法 |
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| CN102443570A (zh) * | 2011-12-27 | 2012-05-09 | 陆华 | 人胚中脑神经干细胞的体外分离培养及分化方法 |
| CN103013918A (zh) * | 2012-11-30 | 2013-04-03 | 陆华 | 人胚中脑神经干细胞的原代细胞的分离传代培养方法 |
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