CN116376835A - 一种比格犬乳腺肿瘤细胞系及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种比格犬乳腺肿瘤细胞系及其构建方法和应用，涉及生物技术领域。本发明的比格犬乳腺肿瘤细胞系可连续传代，能够提供大量的比格犬乳腺肿瘤细胞系，用于犬乳腺肿瘤机制研究、药物筛选以及其他涉及免疫学、细胞生物学、分子生物学等领域犬科动物的基础研究。其性状优良，为成纤维细胞样，中央可见1‑2个圆形或椭圆形细胞核，竹节状，细胞贴壁性好，分裂旺盛，漩涡状生长，传代时间短。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及比格犬乳腺肿瘤细胞系及其构建方法和应用。
背景技术
乳腺肿瘤是母犬中最常见的病变类型之一，是兽医临床的常见病，约占母犬所有肿瘤的50%，占母犬生殖系统疾病的82%，起源于乳腺中不同类型的组织：上皮或腺体组织以及间充质或结缔组织。犬乳腺肿瘤的影响因素主要是品种、年龄、生育和绝育情况、饮食等。成年及老年犬易发，基因的定点突变、雌激素的变化都将诱导乳腺肿瘤的发生。目前手术摘除是治疗犬乳腺肿瘤的优选方法，已转移的肿瘤需进行放射、化疗等其他辅助手段进行治疗。
细胞是体外研究的基本生物材料，犬乳腺肿瘤的发病原因、组织学来源、分类、以及转移等方面与人乳腺肿瘤极为相似，因此犬乳腺肿瘤细胞系的建立将为研究人和犬乳腺肿瘤机制研究、药物筛选等奠定基础。除此之外，由于国内犬科动物基础研究生物材料的缺失，犬科动物现有的研究远不足以支撑其食物、药物的开发与应用。因此，本发明的比格犬乳腺肿瘤细胞系将促进犬科动物其他涉及免疫学、细胞生物学、分子生物学等领域的基础研究，在丰富犬种质资源具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种比格犬乳腺肿瘤细胞系。
本发明的另一目的在于提供比格犬乳腺肿瘤细胞系在犬乳腺肿瘤机制研究、药物筛选以及其他涉及免疫学、细胞生物学、分子生物学等领域犬科动物的基础研究中的应用。
所述比格犬乳腺肿瘤细胞系的构建方法包括以下步骤：
步骤S1:将获取的比格犬乳腺肿瘤组织采用胶原酶Ⅳ进行消化，将消化后的组织进行研磨并过滤，经红细胞裂解液处理后过滤获得细胞并进行原代培养；
步骤S2: 待细胞覆盖培养基85-90%，用1ml胰酶在37℃消化处理，经离心后获取细胞进行1:2传代培养；
步骤S3:经过30次以上传代观察细胞的形态，判断其传代稳定性；
步骤S4:所述比格犬乳腺肿瘤细胞系建立成功后进行冻存处理。
优选的，所述的比格犬乳腺肿瘤来源于8岁的比格犬乳腺肿瘤组织。
优选的，上述步骤S1所用的原代培养液为基础DMEM培养基，10%胎牛血清，1%100×谷氨酰胺，1%100×青霉素-链霉素溶液（双抗）。
优选的，上述步骤S2所用的传代培养液为基础DMEM培养基，12%胎牛血清，1%100×谷氨酰胺，1%100×青霉素-链霉素溶液（双抗），2%50×MEM氨基酸溶液，1%100×MEM维生素溶液，1‰1000×β-巯基乙醇。
本发明的优点在于：
1.本发明的比格犬乳腺肿瘤细胞系细胞性状良好，为成纤维细胞样，中央可见1-2个圆形或椭圆形细胞核，竹节状，贴壁率高，能够稳定传代。
2.本发明的比格犬乳腺肿瘤细胞系是将比格犬乳腺肿瘤细胞进行原代培养和传代培养，利用胶原酶消化法制备原代细胞，经体外传代培养，最终建立细胞系，本发明方法简单、快速。
3.由于犬科动物生物材料的大量缺乏，犬科动物的基础研究无法开展，犬乳腺肿瘤细胞系将成为有效的体外细胞模型，将为犬乳腺肿瘤相关研究以及其他犬基础研究奠定基础，促进犬科动物的研究发展。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1为显微镜下（100×）体外长期培养的细胞形态示意图。
实施方式
以下仅是本发明的优选实施方式，仅用于解释本发明，而不用于限制本发明的范围，凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。
实施例 1 比格犬乳腺肿瘤细胞系的建立
S1.肿瘤组织的研磨：将获得的乳腺肿瘤组织包裹放置于台子上，用剪刀剪开封条，准备剪刀和镊子。将肿瘤组织周围的组织液吸出，用加入双抗的PBS清洗组织，直至组织表面的组织液和血液完全洗净。将22*8cm的组织块剪碎至0.5mm3左右，转移至15ml的离心管，加入250×的胶原酶Ⅳ后颠倒混匀，37℃，200rpm，30min消化。随后将消化完成的组织放于无菌的滤网上，用注射器活塞柄进行研磨，收集至50ml的离心管。
S2.原代培养：将研磨后的细胞液离心，4℃，2000rmp，4min。弃上清，加入10ml红细胞裂解液（ACK），吹吸混匀后静置2min，之后离心，4℃，1800rmp，4min。弃上清，用PBS重悬并过滤，之后离心，室温，1000rmp，4min。离心后弃上清，用4ml原代培养液重悬，转移至6cm培养皿中，吹打数次后放置于培养箱中，37℃、5%CO2培养。
S3.传代培养：培养4小时后观察发现有一部分细胞已经出现贴壁现象，两天后换液，当细胞有80-90%细胞贴壁时进行传代。弃掉6cm培养皿中的培养上清，用PBS清洗1-2遍培养皿，加入0.25%胰酶-0.02%EDTA消化3分钟，加入培养基终止消化；将细胞收集在1个无菌的15ml离心管中，室温，1000rpm，离心5min。弃上清，用培养液重悬细胞，移入新的10cm皿中，补充培养液。每天观察细胞生长状况，当细胞生长至80%以上时，将其消化、离心、传代培养，细胞重新贴壁生长。细胞以后连续传代，以后每2-3天传代1次。细胞状态良好，如图1，为成纤维细胞样，中央可见1-2个圆形或椭圆形细胞核，竹节状，细胞贴壁性好，漩涡状生长。
实施例 2 比格犬乳腺肿瘤细胞系的冻存与复苏
S1.冻存：配置细胞冻存液：含10%FBS的DMEM和DMSO以9：1的比例混合。采用胰酶消化法，离心后收集细胞沉淀，用配置好的细胞冻存液重悬，并轻轻吹打细胞，使其均匀分散在细胞冻存液中，使用移液枪将液体移入冻存管中。将冻存盒置于-80℃放置1天，最后取出冻存管并浸入液氮中，可长期冻存。
S2.复苏：将冻存管从液氮中取出，迅速放置在已经调节好温度（37℃）的水浴锅中，融化细胞的过程中应不断地摇晃冻存管，使其快速均匀解冻，直至完全融化。将融化的细胞悬液
转移到15ml离心管中，加入10ml基础DMEM培养基，混匀后1000rmp，离心4min，弃上清，用4ml培养液重悬，加入6cm培养皿中，吹打混匀后放入培养箱，37℃、5%CO2培养。
Claims (4)
1.一种比格犬乳腺肿瘤细胞系，其特征在于，所述细胞系来源于8岁的比格犬乳腺肿瘤组织。
2.如权利要求1所述的比格犬乳腺肿瘤细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1:将获取的比格犬乳腺肿瘤组织采用胶原酶Ⅳ进行消化，将消化后的组织进行研磨并过滤，经红细胞裂解液处理后过滤获得细胞并进行原代培养；
步骤S2: 待细胞覆盖培养基85-90%，用1ml胰酶在37℃消化处理，经离心后获取细胞进行1:2传代培养；
步骤S3:经过30次以上传代观察细胞的形态，判断其传代稳定性；
步骤S4:所述比格犬乳腺肿瘤细胞系建立成功后进行冻存处理。
3.如权利要求1所述的比格犬乳腺肿瘤细胞系在犬乳腺肿瘤机制研究、药物筛选中的应用。
4.如权利要求1所述的比格犬乳腺肿瘤细胞系在其他涉及免疫学、细胞生物学、分子生物学等领域犬科动物的基础研究中的应用。
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