CN112375730B - 一种小肠组织消化组合物、消化液体系及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种小肠组织消化组合物、消化液体系及其应用。所述组合物包括EDTA、DDT、卵磷脂、青霉素、链霉素、Triple、新生牛血清。消化液体系包括消化液I、消化液II和洗涤液，所述消化液I包括以下终浓度的组分：EDTA 2.0‑3.0mg/ml、DDT 2.0‑3.0mg/ml，卵磷脂1.0‑3.0mg/ml，溶剂为Advanced DMEM培养基；所述消化液II包括以下终浓度的组分：Triple 5‑10v％，新生牛血清4‑6v％，溶剂为Advanced DMEM培养基；所述洗涤液包括以下终浓度的组分：青霉素0.8‑1.5wt％、链霉素0.8‑1.5wt％，溶剂为生理盐水。该消化液体系用于小肠组织的消化，可以尽量去除小肠组织中的杂质和绒毛结构，最大程度的保留、提取出具有干性且利于类器官扩增的细胞，增加小肠类器官的培养成功率。

Description

一种小肠组织消化组合物、消化液体系及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种小肠组织消化组合物、消化液体系及其应用。

背景技术

小肠是生物体内重要的消化器官。从结构上来看，小肠由黏膜、黏膜下层、肌层和浆膜构成，具有环形褶皱，粘膜上有大量绒毛，绒毛根部的上皮下陷至固有层，形成管状的肠腺，肠腺的细胞有柱状细胞、杯状细胞、潘氏细胞等。

小肠由于其独特的结构，在类器官领域掀起了研究的热潮。2009年Hans Clever团队首次在体外环境中培养出了老鼠小肠类器官，这一标志性事件宣告类器官领域的研究进入加速阶段，2009年亦被称为类器官元年。但由于小肠和结肠组织含有大量的绒毛、杂质，如何从消化后的细胞中去除这些杂质，最大程度地获得具有干性的细胞成为了提高小肠类器官建模成功的关键因素。

发明内容

针对现有小肠类器官消化过程存在的上述问题，本发明旨在提供一种小肠组织消化组合物、消化液体系及其应用。本发明的技术方案为：

第一个方面，本发明提供一种小肠组织消化组合物，所述组合物包括EDTA、DDT、卵磷脂、青霉素、链霉素、Triple、新生牛血清。

第二个方面，本发明提供一种小肠组织消化液体系，所述消化液体系包括消化液I、消化液II和洗涤液，所述消化液I包括以下终浓度的组分：EDTA 2.0-3.0mg/ml，DDT 2.0-3.0mg/ml，卵磷脂1.0-3.0mg/ml，溶剂为Advanced DMEM培养基；所述消化液II包括以下终浓度的组分：Triple 5-10v％，新生牛血清4-6v％，溶剂为Advanced DMEM培养基；所述洗涤液包括以下终浓度的组分：青霉素0.8-1.5wt％、链霉素0.8-1.5wt％，溶剂为生理盐水。

第三个方面，本发明提供一种小肠组织的消化方法，包括以下步骤：

1)将小肠组织用所述洗涤液洗涤并剪成碎片，再在碎片中加入所述洗涤液振摇数次后静置，去上清；重复前述的振摇数次后静置的操作多次，离心去上清，收集组织沉淀；

2)在步骤1)获得的组织沉淀中加入消化液I，混合均匀后进行一次消化，之后加入生理盐水混匀，静置后去上清；

3)在步骤2)获得的组织沉淀中加入消化液II，混合均匀后进行二次消化，之后加入生理盐水混匀，静置后收集上清，并将组织沉淀再用生理盐水处理数次，每次收集上清，最后合并步骤3)的所有上清液；

4)将步骤3)获得的上清液过滤，收集滤液，离心后收集细胞。

优选地，所述步骤1)中加入所述洗涤液振摇数次后静置的操作次数不低于8次。

优选地，所述步骤2)中一次消化的参数控制为：温度为2-8℃，时间为15-20min。

优选地，所述步骤3)中二次消化的参数控制为：温度为22-26℃，时间为3-5min。

进一步地，所述步骤4)中上清液过滤采用100μm滤网。

第四个方面，本发明提供一种小肠组织细胞，是采用上述消化方法获得。

第五个方面，本发明提供上述小肠组织消化组合物、消化液体系、小肠组织的消化方法或者小肠组织细胞在小肠组织类器官培养中的应用。

本发明的消化液与传统消化液比，具有以下几个优点：

本发明的消化液体系及消化方法可以尽量去除小肠组织中的杂质和绒毛结构，最大程度的保留、提取出具有干性且利于类器官扩增的细胞，并且降低消化过程中对细胞的损伤，保持细胞活力，以增加小肠类器官的培养成功率。此外，本发明的消化液体系还可以有效减少培养过程中微生物污染的概率。

附图说明

图1为本发明实施例4和对比例1获得的消化细胞在培养0d和3d的细胞状态对比图，其中，1-1和1-2为实施例4获得的细胞在0d和3d的细胞状态图，1-3和1-4为对比例1获得的细胞在0d和3d的细胞状态图。

图2为本发明实施例5和对比例2获得的消化细胞在培养0d和3d的细胞状态对比图，其中，2-1和2-2为实施例5获得的细胞在0d和3d的细胞状态图，2-3和2-4为对比例2获得的细胞在0d和3d的细胞状态图。

图3为本发明实施例6和对比例3获得的消化细胞在培养0d和3d的细胞状态对比图，其中，3-1和3-2为实施例6获得的细胞在0d和3d的细胞状态图，3-3和3-4为对比例3获得的细胞在0d和3d的细胞状态图。

图4为本发明实施例4中获得活细胞比例与对比例1,4,5的对比图。

图5为本发明实施例4获得细胞量与对比例6,7的对比图。

图6为实施例5消化家兔小肠获得的细胞量与对比例2的对比图。

图7为实施例6消化大鼠小肠获得的活细胞比例与对比例3的对比图。

图8为对比例9中用实施例4的配方和方法分别消化小鼠小肠、小鼠肝脏、小鼠肺、家兔肾组织获得细胞量对比图。

具体实施方式

在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

实施例1

本实施例提供一种小肠组织消化组合物及其制备的消化液体系，该组合物包括EDTA、DDT、卵磷脂、青霉素、链霉素、Triple、新生牛血清。消化液体系包括消化液I、消化液II和洗涤液，所述消化液I包括以下终浓度的组分：EDTA 2.5mg/ml、DDT 2.5mg/ml，卵磷脂2.0mg/ml，溶剂为Advanced DMEM培养基；所述消化液II包括以下终浓度的组分：Triple7v％，新生牛血清5v％，溶剂为Advanced DMEM培养基；所述洗涤液包括以下终浓度的组分：青霉素1.1wt％、链霉素1.1wt％，溶剂为生理盐水。该消化液体系的制备方法包括：配料，将青霉素和链霉素溶解于生理盐水中得到洗涤液，-20℃避光保存；将EDTA、DTT、卵磷脂溶解于Advanced DMEM中得到消化液I；将Triple、新生牛血清溶解于Advanced DMEM中得到消化液II。消化液I和II于2-8℃保存。

实施例2

本实施例提供一种小肠组织消化组合物及其制备的消化液体系，该组合物包括EDTA、DDT、卵磷脂、青霉素、链霉素、Triple、新生牛血清。消化液体系包括消化液I、消化液II和洗涤液，所述消化液I包括以下终浓度的组分：EDTA 2.0mg/ml、DDT 3.0mg/ml，卵磷脂3.0mg/ml，溶剂为Advanced DMEM培养基；所述消化液II包括以下终浓度的组分：Triple5v％，新生牛血清4v％，溶剂为Advanced DMEM培养基；所述洗涤液包括以下终浓度的组分：青霉素0.8wt％、链霉素1.5wt％，溶剂为生理盐水。该消化液体系的制备方法同实施例1。

实施例3

本实施例提供一种小肠组织消化组合物及其制备的消化液体系，该组合物包括EDTA、DDT、卵磷脂、青霉素、链霉素、Triple、新生牛血清。消化液体系包括消化液I、消化液II和洗涤液，所述消化液I包括以下终浓度的组分：EDTA3.0mg/ml、DDT 2.0mg/ml，卵磷脂1.0mg/ml，溶剂为Advanced DMEM培养基；所述消化液II包括以下终浓度的组分：Triple10v％，新生牛血清6v％，溶剂为Advanced DMEM培养基；所述洗涤液包括以下终浓度的组分：青霉素1.5wt％、链霉素0.8wt％，溶剂为生理盐水。该消化液体系的制备方法同实施例1。

实施例4

本实施例提供一种小鼠小肠组织的消化方法，采用实施例1的消化液体系，该消化方法包括以下步骤：

1)取新鲜的小鼠小肠组织，用无菌注射器吸取洗涤液清洗小肠内部数次。清洗完毕后纵向剪开，用清洗液漂洗数次，清洗后剪切为碎片，再加入清洗液8ml，猛力振摇数次后静置沉淀10s，弃去上清液；重复清洗-沉淀操作8次，最后一次离心去上清，收集组织沉淀。

2)步骤1)中收集到的组织沉淀加入2ml消化液I，猛力振摇均匀后在冰盒上振摇消化20min，加入5ml生理盐水终止消化，静置沉淀15s后吸取上清弃去；再加入1ml消化液II，在常温震荡消化3min，迅速加入5ml生理盐水终止消化，大力猛力振摇数次后静置沉淀，收集上清，组织沉淀中再加入5ml生理盐水猛力振摇，如此反复操作5次以上，收集上清液。

3)将步骤2)中上清液用100um滤网过滤，收集滤液，离心收取细胞备用。

以上操作(离心、消化操作除外)均在生物安全柜内进行。

将本实施例消化完成后的细胞进行3D类器官培养(培养方法采用现有的培养即可，并且本实施例和对比例1的培养方法相同)，并获取培养0d和3d的细胞状态图，如图1所示，其中1-1和1-2为本实施例获得的细胞在0d和3d的细胞状态图，1-3和1-4为对比例1获得的细胞在0d和3d的细胞状态图，可以看出实施例4得到的细胞悬液较市售的胰酶消化液(上海源培)消化后(对比例1)过100um滤网得到的细胞悬液杂质少很多，小肠绒毛很少。再分别培养3d后，在十倍显微镜下观察，实施例4得到的细胞已经长成类器官，而市售胰酶消化液消化得到的细胞状态较差，几乎无成团的类器官。

实施例5

本实施例提供一种家兔小肠组织的消化方法，采用实施例2的消化液体系，消化方法同实施例4。

将本实施例消化完成后的细胞进行培养(培养方法采用现有的培养即可，并且本实施例和对比例2的培养方法相同)和细胞活性检测，并获取培养0d和3d的细胞状态图，如图2所示，其中2-1和2-2为本实施例获得的细胞在0d和3d的细胞状态图，2-3和2-4为对比例2获得的细胞在0d和3d的细胞状态图，可以看出实施例5得到的细胞悬液较市售的组织解离液(Stemcell)消化后得到的细胞悬液(对比例2)杂质少很多，小肠绒毛很少。再分别培养3d后，在十倍显微镜下观察，实施例5得到的细胞已经长成类器官，而市售组织解离液(Stemcell)消化得到的细胞状态较差，类器官数量明显少于本实施例配方的培养结果。细胞活性检测结果如图6所示，结果证明本实施例的活细胞比例远高于对比例2。

实施例6

本实施例提供一种大鼠小肠组织的消化方法，采用实施例3的消化液体系，消化方法同实施例4。消化后的细胞与对比例3中所得的细胞悬液进行活细胞比例对比，如图7所示。获取培养0d和3d的细胞状态图，如图3所示，其中3-1和3-2为本实施例获得的细胞在0d和3d的细胞状态图，3-3和2-4为对比例3获得的细胞在0d和3d的细胞状态图。从图3中可以看出本实施例获得的活细胞比例远多于对比例3，在培养3d后，本实施例获得的细胞已经生长出明显的类器官，而对比例3获得的细胞在培养3d几乎无类器官，细胞出现大量凋亡。图7的结果表明本实施例的活细胞比例远高于对比例3。

对比例1

本对比例提供一种小鼠小肠组织的消化方法，采用市售的胰酶消化液(上海源培)进行消化，该消化方法包括以下步骤：

1)取新鲜的小鼠小肠组织，用无菌注射器吸取洗涤液清洗小肠内部数次，剪碎小肠组织，离心后去除上清。

2)在步骤1)组织沉淀中，加入1.5ml胰酶消化液，在37℃环境下震荡消化20min，消化结束后立即加入3ml无菌生理盐水终止消化，猛力振摇后自然沉降收集上清液。

3)将步骤2)中上清过100um滤膜，离心收取细胞备用。

以上操作(离心、消化操作除外)均在生物安全柜内进行。

将本对比例消化完成后的细胞悬液进行细胞活性检测，用流式细胞仪筛选具有Lgr5干性的细胞比例，收取细胞悬液进行平板涂布检测微生物限度，并获取培养0d和3d的细胞状态图，如图1所示，其中1-3和1-4为对比例1获得的细胞在0d和3d的细胞状态图。此外，将本对比例的细胞活性检测结果与实施例4、对比例4、对比例5的细胞活性检测结果进行比较，如图4所示，细胞活力检测结果证明本对比例的活细胞比例远低于实施例4。

对比例2

本对比例提供一种家兔小肠组织的消化方法，采用市售的组织解离液(stemcell)和生理盐水作为洗涤液，该消化方法包括以下步骤：

1)取新鲜的小鼠小肠组织，用无菌注射器吸取洗涤液清洗小肠内部数次。清洗完毕后纵向剪开，用清洗液漂洗数次，清洗后剪切为碎片，再加入清洗液5-10ml，猛力振摇数次后静置沉淀10-15s，弃去上清液；重复清洗-沉淀操作8次以上，最后一次离心去上清，收集组织沉淀。

2)步骤1)中收集到的组织沉淀加入市售的组织解离液，在常温震荡消化20min，迅速加入5ml生理盐水终止消化，猛力振摇数次后静置沉淀，收集上清，组织沉淀中再加入5ml生理盐水猛力振摇，如此反复操作5次以上，收集上清液。

3)将步骤2)中上清液用100um滤网过滤，收集滤液，离心收取细胞进行细胞量检测，并采集细胞悬液进行微生物限度检测。

以上操作(离心、消化操作除外)均在生物安全柜内进行。

将本对比例消化完成后的细胞进行3D类器官培养和细胞活性检测，并获取培养0d和3d的细胞状态图，如图2所示，图2-3和图2-4为对比例2获得的细胞在0d和3d的细胞状态图。细胞活性检测结果如图6所示，结果证明本对比例的活细胞比例远低于实施例5。

对比例3

本对比例提供一种大鼠小肠组织的消化方法，采用市售的胰酶消化液(上海源培)以及生理盐水作为洗涤液，该消化方法包括以下步骤：

1)取新鲜的家兔小肠组织，用无菌注射器吸取洗涤液清洗小肠内部数次。清洗完毕后纵向剪开，用清洗液漂洗数次，清洗后剪切为碎片，再加入清洗液5-10ml，猛力振摇数次后静置沉淀10-15s，弃去上清液；重复清洗-沉淀操作8次以上，最后一次离心去上清，收集组织沉淀。

2)步骤1)中收集到的组织沉淀加入市售的胰酶消化液，在常温震荡消化20min，迅速加入5ml生理盐水终止消化，大力猛力振摇数次后静置沉淀，收集上清，组织沉淀中再加入5ml生理盐水猛力振摇，如此反复操作5次以上，收集上清液。

3)将步骤2)中上清液用100um滤网过滤，收集滤液，离心收取细胞并进行细胞活性检测，细胞活性检测结果如图7所示，结果证明本对比例的活细胞比例远低于实施例6。

对比例4。

采用实施例1的洗涤液、消化液I和市售的胰酶消化液(作为该对比例的消化液II)，应用实施例4的消化方法对小鼠小肠组织进行消化。将消化完成后的细胞进行细胞活性检测。并与实施例4、对比例1、对比例5的细胞活性检测结果进行比较，如图4所示，细胞活力检测结果证明本对比例的活细胞比例远低于实施例4。

对比例5

采用实施例1的洗涤液、市售的胰酶消化液(作为该对比例的消化液I)和消化液II，应用实施例4的消化方法对小鼠小肠组织进行消化。将消化完成后的细胞进行细胞活力检测。并与实施例4、对比例1、对比例4的细胞活性检测结果进行比较，如图4所示，细胞活力检测结果证明本对比例的活细胞比例远低于实施例4。

对比例6

本对比例提供一种小鼠小肠组织的消化方法，与实施例4的区别在于：消化液体系中不含有EDTA。消化完成后对获得的细胞进行细胞计数。并与实施例4、对比例7的细胞计数结果进行比较，如图5所示，从图5中可以看出本对比例的配方进行消化后细胞得率明显降低。

对比例7

本对比例提供一种小鼠小肠组织的消化方法，与实施例4的区别在于：消化液体系中不含有Triple。消化完成后对获得的细胞进行细胞计数。并与实施例4、对比例6的细胞计数结果进行比较，如图5所示，图5的结果说明：缺少Triple的对比例7消化得到的细胞数量大大降低。

对比例8

将实施例4-6、对比例1-3消化后的细胞悬液3ml进行平皿涂布，将涂布好的平皿倒扣在25℃培养箱中培养，培养72h后进行菌落计数。平行试验十次，统计数据如表1所示。

表1不同消化液及消化方法处理后细胞悬液的微生物限度检测结果

以上结果可以看出，采用本发明的消化液体系及消化方法对小肠组织进行消化后，较比市售的胰酶消化液或者组织解离液可以大大降低小肠组织携带的微生物，减少污染的风险。

对比例9

取同等质量的小鼠小肠、小鼠肺组织、小鼠肝组织、家兔肾组织。按实施例1所示的配方及实施例4所示的消化方法进行消化，消化后检测细胞量。从图8中可以看出，本对比例消化肺、肝、肾组织的细胞得率远低于小肠组织的细胞得率。

综上，本发明的消化液体系及消化方法可以尽量去除小肠组织中的杂质和绒毛结构，最大程度的保留、提取出具有干性且利于类器官扩增的细胞，并且降低消化过程中对细胞的损伤，保持细胞活力，以增加小肠类器官的培养成功率。此外，本发明的消化液体系还可以有效减少培养过程中微生物污染的概率。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (7)

1.一种小肠组织消化液体系，其特征在于：所述消化液体系由消化液I、消化液II和洗涤液组成，所述消化液I由以下终浓度的组分组成：EDTA 2.0-3.0mg/ml，DTT 2.0-3.0mg/ml，卵磷脂1.0-3.0mg/ml，溶剂为Advanced DMEM培养基；所述消化液II由以下终浓度的组分组成：TrypLE 5-10v%，新生牛血清4-6v%，溶剂为Advanced DMEM培养基；所述洗涤液由以下终浓度的组分组成：青霉素0.8-1.5wt%、链霉素0.8-1.5wt%，溶剂为生理盐水。

2.一种小肠组织的消化方法，其特征在于：是采用权利要求1所述的消化液体系，包括以下步骤：

1）将小肠组织用所述洗涤液洗涤并剪成碎片，再在碎片中加入所述洗涤液振摇数次后静置，去上清；重复前述的振摇数次后静置的操作多次，离心去上清，收集组织沉淀；

2）在步骤1）获得的组织沉淀中加入所述消化液I，混合均匀后进行一次消化，之后加入生理盐水混匀，静置后去上清；

3）在步骤2）获得的组织沉淀中加入所述消化液II，混合均匀后进行二次消化，之后加入生理盐水混匀，静置后收集上清，并将组织沉淀再用生理盐水处理数次，每次收集上清，最后合并步骤3）的所有上清液；

4）将步骤3）获得的上清液过滤，收集滤液，离心后收集细胞。

3.根据权利要求2所述的一种小肠组织的消化方法，其特征在于：所述步骤1）中加入所述洗涤液振摇数次后静置的操作次数不低于8次。

4.根据权利要求2所述的一种小肠组织的消化方法，其特征在于：所述步骤2）中一次消化的参数控制为：温度为2-8℃，时间为15-20min。

5.根据权利要求2所述的一种小肠组织的消化方法，其特征在于：所述步骤3）中二次消化的参数控制为：温度为22-26℃，时间为3-5min。

6.根据权利要求2所述的一种小肠组织的消化方法，其特征在于：所述步骤4）中上清液过滤采用100µm滤网。

7.权利要求1所述的消化液体系或者权利要求2~6任意一项所述的小肠组织的消化方法在小肠组织类器官培养中的应用。

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