KR20000005120A - 파라폭스바이러스 벡터 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 파라폭스바이러스(parapoxvirus) 벡터에 관한 것이다. 특히, 외생 DNA를 포함하는 orf 바이러스 벡터가 제공된다. 외생 DNA 는 발현을 원하는 이형성 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화 하거나 면역반응을 유도 할 수 있는 항원을 암호화 한다. 항원을 발현하는 능력은 이러한 벡터들을 백신에 사용하기에 적합하게 해준다.
Description
폭스바이러스(poxvirus)는 감염된 세포의 세포질 안에서 복제되는 커다란 DNA 바이러스 이다. 폭스바이러스 계통군의 수많은 구성원들이 외래 유전자를 발현시키는데 사용되어 왔다. 이러한 구성원들은 백시니아(우두) 바이러스 및 아비폭스(avipox) 바이러스를 포함한다. 그와같은 바이러스들은 다양한 종의 동물들에게 백신 항원을 전달하는 가능성을 가지고 있다. 그러나, 변형된 우두 바이러스 및 아비폭스 바이러스를 사용하는데 있어 수많은 장애가 따른다.
우두 바이러스는 포유동물에 있어 광범위한 숙주범위를 갖고 있다. 따라서, 종간의 교차감염 및 하나의 종에서 다른 종으로 질병이 잇따라 퍼지는 중대한 위험성을 안고 있다. 이러한 사실은 어떤 벡터가 주위의 환경에서 사용되어질때 중대한 결점을 나타낸다.
또 다른 결점은 특히, 우두 바이러스가 인간에게 열성반응 및 반흔, 그리고 경우에 따라서는 감염된 동물에서 심각한 질병을 야기하는 것으로 나타났다는 사실이다.
아비폭스바이러스(Avipoxvirus)는 그들의 숙주범위 특이성에 있어 더욱 다양하고, 그 반면에 그것들은 일반적으로 포유동물에서 번식하지 않고, 만약에 그들이 아비폭스바이러스의 게놈에 포함되고 적절한 프로모터(promoter)의 제어 하에서 발현된다면 최소한 어떤 외래 유전자에 면역반응를 유도하는데 충분한 불현성 감염을 종종 겪게 될것이다.
또한 우두 바이러스 벡터로의 첫 번째 감염은 항원의 전 투여량을 전달하기 위해 벡터와의 후속 감염될 가능성을 제한하는 방식으로 벡터에의 면역성을 유도 할 것이다.
농업과 관련해서, 가축을 생산하는데 있어 주된 한계점은 기생충병을 제어 하는 것이다. 사육된 동물집단에서 먹이는 약에 대한 내성이 생기고, 가축생산이 있어 화학물질 사용을 소비자들이 점점 더 싫어하기 때문에, 질병을 제어하기 위한 또 다른 수단이 필요하게 되었다. 숙주에 항원을 전달하는 파라폭스 바이러스 벡터를 이용해 값싸고,안전하며, 효력이 있는 백신의 이용은 이러한 문제점들을 해결하는 하나의 대안이 될 수 있다.
파라폭스 바이러스 벡터 및 더욱 구체적으로 orf 바이러스 벡터들에 대한 개념은 일반적으로 Robinson, A.J. 및 Lyttle,D.J."Parapoxviruses:their biology and potential as recombinant vaccines" in Recombinant Poxviruses, Chapter 9, 306-317 eds M.Binns 및 G. Smith CRC Press,(1992), Boca Raton 에 의해 개시되어있다. 그러나, 이 참고문헌에는 그 대신에 orf 바이러스를 벡터로 사용되게 하는 적절한 유전자 삽입자리 또는 이를 암호화하는 서열암호에 관해 교시가 없다.
그러므로 본 발명의 목적은 현존하는 폭스바이러스 벡터와 관련해 위에서 개략한 단점을 극복하는데 효과가 있거나 또는 최소한 일반에게 유용한 선택을 하게 해주는 바이러스 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 개요
따라서, 한 관점에서, 본 발명은 외생 DNA를 포함하고 있는 파라폭스 바이러스로 구성되는 파라폭스바이러스 벡터를 제공한다.
바람직하게는, 파라폭스 바이러스는 orf 바이러스 이다.
바람직하게는, 외생 DNA는 최소한 하나의 유전자 산물을 암호화하고 가장 유용한 것은 이 산물은 면역반응을 유도할수 있는 항원일 것이다.
그외에, 외생 DNA는 바람직하게는 생물학적 작용인자 분자인 최소한 하나의 유전자 산물, 가장 유용하게는 면역보강제로 작용할수 있는 시토킨(cytokine)을 암호화한다.
게다가, 외생 DNA 는 또한 바람직하게는 천연 바이러스 단백질과의 잡종 또는 키메라 단백질로서 발현된 펩티드 부분을 암호화 한다.
또한, 동등한 면역활성을 갖는 벡터의 단편 또는 변이체도 본 발명의 범주 안에 있다.
외생 DNA가 바이러스 게놈의 비 필수 지역안에 포함되는 것이 바람직하다.
외생 DNA는 바람직하게는 폭스바이러스 프로모터 및 편리하게는 orf 바이러스 프로모터의 제어하에 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 파라폭스바이러스 벡터의 생산방법, 본 발명의 방법에서 사용되는 복제가능한 전이 벡터 그리고 이러한 벡터로 형질전환된 숙주를 제공한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 약제학적 으로 허용가능한 담체 및 선택적으로 또는 다른 대안으로 면역보강제를 조합해 위에서 규정한 파라폭스 바이러스 벡터를 포함하는 백신에 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 파라폭스 바이러스 벡터로 세포를 감염시키는 단계와 일단 발현된 이형성 폴리펩티드를 분리하는 단계를 분리하는 단계로 이루어진 진핵생물 세포에서 이형성 폴리펩티드를 제조하기 위해 파라폭스 바이러스 벡터를 사용하는 것에 관한 것이다.
본 발명이 상기 기술한 대로 광범위하다 할지라도, 본 발명은 전술한 바에 한정되지 않고 다음의 실시예로 이어지는 구체예를 또한 포함한다는 것이 당업자에 의해 인정될 것이다. 특히, 본 발명의 어떤 점들은 첨부되는 도면을 참고함으로써 더욱 분명하게 이해 될 것이다.
본 발명은 파라폭스바이러스(paroxvirus) 벡터, 그것의 구성 방법 및 용도에 관한 것이다.
도 1은 제한엔도뉴클레아제 KpnⅠ의 절단자리를 보여주는 orf 바이러스 균주 NZ-2, NZ-7 및 NZ-10 의 게놈 지도를 보여준다. 게놈은 이중 가닥으로된 DNA 분자이며 수평선으로 나타내어진다. 게놈의 말단들과 관련된 각 게놈 상에 제한엔도뉴클레아제 절단자리의 위치는 수직선으로 나타내진다. 제한엔도뉴클레아제로 절단되어서 생기는 각각의 게놈 단편들은 알파벳 문자로 칭한다.
도 2는 orf 바이러스 균주 NZ-2 게놈의 KpnⅠ E 단편 지역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 대쉬(-) 선으로 밑줄쳐진 서열은 삽입가능한 자리를 포함한다. 콜론(:) 으로 밑줄쳐진 서열은 삽입가능한 자리를 포함하는 혈관 내피 성장인자 유사 유전자의 그 부분을 나타낸다.
도 3은 도 1에 있는 orf 바이러스 균주 NZ-7 게놈의 Kpn1 D 단편지역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 대쉬 선으로 밑줄친 서열은 외래 유전자의 삽입자리를 나타낸다. 콜론으로 밑줄친 서열은 삽입가능한 자리를 포함하는 혈관 내피 성장인자 유사 유전자의 그 부분을 나타낸다.
도 4는 제한엔도뉴클레아제 HindⅢ 의 절단자리를 보여주는 orf 바이러스 균주 NZ-2 의 게놈 지도를 나타낸다. 그 게놈은 이중 가닥 DNA 분자이며 여기서는 수평선으로 나타내어진다. 게놈의 말단들과 관련된 게놈상의 제한엔도뉴클레아제 절단 자리의 위치는 수직선으로 나타낸다. 제한엔도뉴클레아제로 절단해 생기는 각각의 게놈 단편은 알파벳 문자로 칭한다. 단편 F의 부분, J 및 I 단편 전부 그리고 DNA 서열이 결정되어진 단편 E의 부분 으로 구성된 지역이 보여진다. 추정상의 유전자들을 암호화 하는 전사해독 프레임(open reading frames) 들이 보여진다. 추정상의 유전자 (H)I1L 과 (H)I2L을 암호화 하는 전사해독 프레임 은 삽입가능한 자리를 포함한다. 이외에도, rpo132 와 (H)I1L, (H)I1L 과 (H)I2L, (H)I2L 과 (H)E1L 그리고 (H)E1L 과 (H)E2L 사이의 유전자간 지역은 삽입가능한 자리를 나타낸다.
도 5는 도 4에서 서술한 전사해독 프레임의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 삽입가능한 자리를 포함하는 유전자 (H)I1L 과 (H)I2L 은 콜론으로 밑줄이 쳐져있다. 유전자간 지역내에 있는 삽입가능한 자리는 점선으로 밑줄 쳐져있다. 추정상의 프로모터 서열은 별표로 표시된다.
도 6은 제한엔도뉴클레아제 BamHⅠ 의 절단자리를 보여주는 orf 바이러스 균주 NZ-2 의 게놈 지도를 보여준다. 그 게놈은 이중 가닥으로된 DNA 분자이며 여기에서 수평선으로 나타내어 진다. 게놈의 말단들과 관련된 게놈 상의 제한엔도뉴클레아제 절단부위의 위치는 수직선으로 나타내어 진다. 제한엔도뉴클레아제로 절단해 생기는 각각의 게놈 단편은 알파벳 문자로 칭한다. 단편 BamHI F 및 DNA 서열이 결정되어진 BamHI C 의 일부로 이루어진 지역이 보여진다. DNA 위상이성질화효소(topoisomerase)(F4R) 및 추정상의 유전자 F1L, F2L, F3R 및 C1L을 암호화 하는 전사해독 프레임은 내부가 빈 화살표로 보여진다.
도 7은 도 6에서 보여진 orf 바이러스 균주 NZ-2 게놈의 BamHI F 단편 및 BamHI C 단편의 일부의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 대쉬 선으로 밑줄친 서열은 삽입가능한 자리를 나타낸다. 추정상의 프로모터 서열 PF1L, PF2L, PF3R,PF4R 및 PC1R 은 별표로 표시된다.
도 8은 제한엔도뉴클레아제 BamH1 의 절단자리를 보여주는 orf 바이러스 균주 NZ-2 의 게놈 지도를 나타낸다. 게놈은 이중 가닥으로된 DNA 분자이며 여기에서 수평선으로 나타낸다. 게놈의 말단들과 관련된 게놈 상의 제한엔도뉴클레아제의 절단자리의 위치는 수직선으로 나타내어 진다. 제한엔도뉴클레아제로 절단해 생기는 각각의 게놈 단편은 알파벳 문자로 칭한다. DNA 서열이 결정된 단편들 BamHI H, BamHI E, BamHI G 및 BamHI B 의 일부로 이루어진 지역이 보여진다. 추정상의 유전자들을 암호화 하는 전사해독 프레임은 내부가 빈 화살표로 보여진다. 전사해독 프레임 E2L, E3L 및 G1L을 둘러 싸고 있는 결실된 3.3 킬로베이스 염기쌍의 위치를 보여준다.
도 9는 도 8에서 보여준 orf 바이러스 균주 NZ-2 게놈의 BamHI E 단편 및 BamHI G 단편 지역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 콜론으로 밑줄쳐진 삽입가능한 자리는 추정상의 유전자 E2L, E3L 및 G1L을 암호화 하는 지역에 존재한다. 유전자간 지역 내에 있는 삽입가능한 자리는 점선으로 밑줄쳐 있다. 추정상의 프로모터 서열은 별표로 표시된다. ITR 접합점 및 표시된 결실 종말점 사이의 지역은 NZ-2에서 얻은 변이균주에는 없다.
도 10은 전사 프로모터로 작용하는 orf 바이러스 게놈 균주 NZ-2 로 부터의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 초기 및 말기 프로모터 서열이 표시되어 있다. 각 서열에 대해서 왼쪽 끝은 5' 말단이다.
도 11은 플라스미드 pSP-PFlac를 구성하는 단계들을 나타내는 도식이다.
도 12는 플라스미드 pSP-SFPgpt32를 구성하는 단계들을 나타내는 도식이다.
도 13은 플라스미드 pFS-gpt를 구성하는 단계들을 나타내는 도식이다.
도 14는 플라스미드 pVU-DL104 및 pVU-DL106을 구성하는 단계들을 나타내는 도식이다.
도 15는 플라스미드 ptov2 및 ptov3 의 구성단계들을 나타내는 도식이다.
도 16은 플라스미드 ptov6 의 구성단계들을 나타내는 도식이다.
도 17은 플라스미드 ptov8 의 구성단계들을 나타내는 도식이다.
도 18은 플라스미드 pVU-DL45W 및 pVU-DL45W1 의 구성단계들을 나타내는 도식이다.
도 19는 플라스미드 pVU-DL45Wlac 및 pVU-DL45W1lac 의 구성단계들을 나타내는 도식이다.
도 20은 재조합형 orf 바이러스를 생성하는 전략을 개설한다.
도 21A는 전이 벡터 pTvec50을 만드는데 사용된 orf 바이러스 서열을 증폭 시키는데 사용된 시발체 zxs-1, zxs-2, zxs-3 및 zxs-4 들에 대한 핵산서열을 제공한다.
도 21B는 제한엔도뉴클레아제 ApoI, NsiI, NcoI 및 EcoRI 에 대해 새로 생겨난 제한자리를 보여주는 RNA 중합효소(polymerase) 소단위 유전자, rpo 132, 와 pTvec50 에 있는 (H)I1L 사이에 있는 변형된 유전자간 지역의 핵산서열을 제공한다. zxs-3 시발체에 대한 본래의 OV 서열상의 시발체 자리들은 별표로 표시되고, 새로 생겨난 전사 종료신호(TTTTTAT)는 획이 굵은 형태로 보여진다.
도 22는 플라스미드 pTvec1 및 pTvec-50을 구성하는 단계들을 나타내는 도식이다.
도 23은 전이 벡터 pTvec50lac-1 및 pTvec50lac-2 를 구성하는 단계들을 나타내는 도식이다.
첫 번째 관점에서, 본 발명은 외생 DNA를 포함하는 파라폭스 바이러스로 구성된 파라폭스바이러스 벡터를 제공한다. 바람직하게는 파라폭스바이러스는 orf 바이러스 이다. orf 바이러스는 일반적으로 양, 염소, 원숭이 및 인간에 한정된 비교적 좁은 숙주 범위를 갖고 있다. 좁은 숙주범위는 주위 환경에 있는 벡터로서 우두 바이러스를 사용하는데 따른 단점을 극복할수 있다. 특히, 종간의 교차감염은 제한될 것이다. 대부분의 동물 및 새들은 단지 orf 바이러스의 불현성 감염을 겪으나 orf 바이러스는 아직 어떤 항원들의 면역투여량을 전달할수 있다.
따라서, 좁은 숙주범위는 면역반응을 자극시키기 위해 orf 바이러스로 감염에 정상적으로 저항하는 동물에 orf 바이러스를 사용할수 있게 해준다. orf 바이러스는 또한 새에 항원을 전달하는데 특히 사용될수 있고, 거기서 바이러스는 새의 종에서 번식하지 않는다. orf 바이러스는 또한 인간에 있는 우두 바이러스 보다 덜 유해하다는 장점을 갖고 있다. 우두 바이러스와 달리, orf 바이러스는 열성반응을 일으키지 않고 병변은 흉터없이 치유됨을 보여준다. 이상적으로는 orf 바이러스 벡터는 그것의 본래의 독성인자가 없을 것이다. orf 바이러스는 Robinson, A.J. 및 Balassu, T.C.(1981) Contagious pustular dermatitis(orf). Vet Bull 51 771-761 및 Robinson, A.J. 및 Lyttle, D.J. (1992) "Parapoxviruses:their biology and potential as recombinant vaccines" in Recombinant Poxviruses, Chapter 9, 306-317 eds M.Binns and G.Smith CRC Press, (1992), Boca Raton에서 검토 되어 있다.
여기서 사용되는 용어 "외생 DNA를 함유하고 있는"은 바이러스 게놈 안으로 도입되는 외생 DNA를 말한다.
바람직하게는, orf 바이러스 벡터에 있는 외생 DNA는 유전자 산물 또는 산물들을 암호화 하는 유전자 이다. 유전자 산물은 이형성 펩티드 또는 폴리 펩티드 이나, 가장 유용하게는 유전자 산물은 항원이거나 또는 감염된 숙주에서 면역반응을 유발 할 수 있는 항원들이다. 외생 DNA는 또한 항원의 조합체에 대한 유전자를 암호화하는 것이 가능하다. 그 항원은 또한 필요하다면 안정성 또는 면역원성을 증진시키기 위해 적절한 억제제, 변형제, 가교제 및/또는 변성제로 처리될 수도 있다.
orf 바이러스 안으로 포함시키는 것이 가능한 의학적 및 수의학적 중요성을 갖는 외래 유전자의 몇가지 실례는 HIV 외피 단백질, 헐프스 심플렉스 바이러스 글리코프로테인(herpes simplex virus glycoprotein), Taenia ovis 항원, Echinococcus granulosus(포충) 항원, Trichostrongylus 및 Haemonchus 및 Ostertagia 또는 그것의 조합체들 같은 위장 기생체의 항원들을 포함하나, 그것에 한정되지는 않는다.
바람직한 항원은 여기에 참고로 포함되는 WO 94/22913에서 개시된 것과 같은 Taenia ovis 45W, 16kd 및 18kd 항원을 포함한다.
또다른 바람직한 구체예에서, 외생 DNA는 외생의 항원성 DNA와 조합해서, 면역반응을 변경 또는 증강 시키는 다른 생물학적 작용인자 분자를 암호화하는 시토킨(cytokine) 유전자 또는 유전자들을 더 포함할 수도 있다. 바람직한 시토킨 유전자는 감마 인터페론 및 IL-1, IL-2, IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12 그리고 가장 바람직하게는 IL-1 및 IL-2 및 IL-12 단독으로 또는 조합해서 구성된 인터루킨(interleukins)을 포함한다.
또다른 구체예에서, 외생 DNA는 하나 또는 그 이상의 리포터(reporter) 유전자 그리고/또는 선택성 마커(selectable marker)를 암호화 하는 최소한 하나의 유전자를 더 포함할 수도 있다. 잘 알려진 적절한 리포터 유전자들의 실례는 대장균 베타-갈락토시다아제(lacz), Photinus pyralis 개똥벌레 루시퍼라아제(lux), 분비된 태반의 알칼리성 포스파타아제(SEAP) 및 Aequorea victoria 녹색 형광 단백질 (gfp)을 포함한다.
본 발명에서 사용하는데 적합하고 잘알려진 선택성 마커 유전자는 크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 유전자 (xgpt) 및 니오마이신 포스포트랜스퍼라제 (aphI)를 포함한다.
특히 바람직한 구체예에서, 외생 DNA는 면역반응을 증진시키기 위해 하나 또는 그 이상의 생물학적 작용인자 DNA 분자와 조합되어서 다중 항원을 암호화 하는 유전자들로 구성될 것이다. 실제적으로 말하면 다수의 항원들이 암호화 되는 경우에 그것들은 일반적으로 20 이하, 바람직하게는 10 이하의 수가 정해질 것이다.
추가적으로, DNA는 바람직하게는 천연 바이러스 단백질과의 잡종 또는 키메라 단백질로 발현된 펩티드 부분을 암호화 한다.
본 발명의 구체예에서, 외생 DNA는 바이러스 단백질의 일부를 형성하는 펩티드 서열을 암호화 한다. 천연 단백질은 그것의 본래 성질을 간직하나 추가적인 항원 에피토프, 효소 성질 또는 외생 DNA에 의해 암호화된 수용체 결합 기능을 나타낸다. 그와같은 키메라 단백질은 분비되거나, 또는 바이러스 외피의 일부를 형성할수 있거나 또는 바이러스 껍질의 일부를 형성할수 있다.
또한 동등한 면역활성을 갖는 본 발명의 벡터의 단편 또는 변이체는 본 발명의 범주안에 있다. 그와같은 변이체는 본 분야에서 알려진 기술을 이용해 하나 또는 그 이상의 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 만들어 질수 있다(Sambrook, J.Fritsch, E.F. and Maniatis, T.Molecular Cloning, A Laboratory Manual(Second Edition) Cold Spring Harbour Laboratory Press 1989).
당 업자에 의해 인정되는 것 처럼, 외래 유전자가 orf 바이러스 게놈의 비필수 지역 안으로 포함되는 것이 바람직하다. 특히, 그 유전자는 바이러스 복제를 방해하지 않는 지역안으로 삽입되야만 한다.
놀랍게도, 우두 바이러스에서 삽입자리로 사용되는 비필수 티미딘 키나제(thymidine kinase) 유전자는 orf 바이러스 에서는 발견되지 않았다. 그러므로, orf 바이러스에서 다른 대안의 비필수 자리를 동정하는 것이 필요하였다.
비 필수 자리는 orf 바이러스 DNA를 제한엔도뉴클레아제로 유전자 지도작성(mapping) 해서 동정되었다. orf 바이러스 균주 NZ-2, NZ-7 및 NZ-10 의 DNA 지도는 첨부된 도 1에 보여진다.
삽입가능한 자리는 균주 NZ-2 의 제한단편 KpnI E, 균주 NZ-7 의 KpnI D 및 균주 NZ-10 의 KpnI D 안에 포함되어있다. 삽입가능한 자리는 도 8 및 도 9에서 보여준 균주 NZ-2 의 제한단편들인 BamHI E 및 BamHI G 안에 위치하고 있다. 다른 삽입가능한 자리는 바이러스 유전자를 암호화하는 지역사이에 놓여있는 유전자간 지역으로서 동정 되어졌다. 또 다른 실례들이 도 4 및 도 5 (균주 NZ-2 의 제한단편들 HindⅢ F, J, I 및 E) 와 도 6 및 7 (균주 NZ-2 의 제한단편들 BamHI F 및 C) 에 예시된다. 또한 다른 삽입자리들이 본 발명의 범주내에서 있는데, 예를들면, orf 바이러스 게놈 DNA 서열 내에 있는 유전자간 지역 또는 어떤 비필수 유전자이다. 더군다나, 하나 또는 그 이상의 삽입자리가 때때로 선택되거나 사용 되어진다.
현재 2개의 선호되는 삽입자리가 있다. 이러한 삽입 자리들 중의 첫 번째 것은 RNA 중합효소 소단위 유전자, rpo132 와 추정상의 유전자 (H) I1L (도 4) 의 전사해독 프레임 사이에 있는 유전자간 지역이다. 도 5에서 보여진 것 처럼, 이 삽입자리는 길이가 90 뉴클레오티드이고 위치 11에서 96까지 신장된다.
두 번째로 선호되는 삽입자리는 유전자 E3L이 시작되는 곳에 위치한 NcoI 자리이다(도 8). 도 9에서 보여진 것 처럼, 이 삽입자리는 길이가 61 뉴클레오티드이고 위치 2226에서 2286 까지 신장된다.
또한 인정되는 바와같이, 만약에 외래 유전자가 발현된다면, 그것은 그 유전자를 발현할수 있는 전사 프로모터의 제어하에 있어야 된다.
폭스바이러스에 관한 설명은 여기에 참고문헌으로 포함되는 Moss,B.(1990) 우두 바이러스 전사의 조절. Annu Rev Biochem. 59, 661-688 에 나타나있다. 나타난 바와 같이, mRNA를 만들기 위한 유전자를 복제 해야되는 폭스바이러스 RNA 중합효소 복합체는 폭스바이러스 프로모터가 선행되는 어떤 유전자를 전사 할 것이다.
그것을 위해 바람직하게는, 사용된 프로모터는 폭스바이러스 프로모터, 특히 파라폭스바이러스 프로모터 이다. 현재 선호되는 프로모터는 orf 바이러스 프로모터 이다. orf 바이러스 프로모터는 초기, 중기 또는 후기 프로모터가 있다. 초기, 중기 및 후기 프로모터를 포함하는 수많은 orf 바이러스 전사 프로모터 들이 뉴클레오티드 서열 결정으로 동정되었다. Orf 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 도 10에 보여진다.
바람직한 하나의 orf 바이러스 프로모터는 원래 Fraser, K. M.,Hill, D.F., Mercer, A.A. 및 Robinson, A.J.(1990) 에 의해 ORF-3 로 기술된 추정상의 유전자 E1L 의 초기 프로모터 이다. 파라폭스 바이러스, orf 바이러스의 게놈에 있는 역 종료 반복의 서열분석. Virology. 176, 379-389 및 Fleming, S.B., Fraser, K.M., Mercer, A.A. 및 Robinson, A.J. (1991). 우두 바이러스 같은 초기 전사 제어 서열은 orf 파라폭스 바이러스에 있는 초기 유전자에 접해있음. Gene. 97, 207-212.
후기 프로모터들 중에서, PF1L 및 PF3R 이 선호된다. 프로모터의 상대길이 및 일시적인 발현에 관한 초기 연구는 PF3R 은 초기-후기 프로모터 이고 그러므로 항원 폴리펩티드를 암호화하는 클로닝된 유전자들을 발현하는데 있어 현재 선호되는 프로모터 라는 사실을 가리킨다. PF1L은 강한 후기 프로모터이고 베타-갈락토시다제 리포터 유전자를 발현하는데 있어 현재 선호되는 프로모터이다. 프로모터와 그것이 제어하는 유전자의 정위는 적절하게 배열된다.
또한 프로모터들의 조합이 사용될 수도 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 본 발명의 변형된 orf 바이러스 벡터를 조제하는데 사용하기에 적당한 복제 될 수있는 전이벡터에 있다. 복제 될 수 있는 전이벡터는 본 분야에서 잘 알려진 기술에 따라 구성되거나(Sambrook, J, Fritsch,E.F. 및 Maniatis, T. Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2 판))Cold Spring Harbour Laboratory 출판부 1989), 또는 본 분야에서 이용할수 있는 클로닝 벡터들에서 선택될수도 있다.
클로닝 벡터는 사용되는 숙주세포에 따라 선택된다. 일반적으로 유용한 벡터는 다음과 같은 특징을 가질 것이다:
(1) 스스로 복제할수 있는 능력;
(2) 어떤 특정한 제한엔도뉴클레아제에 대한 단일 표적을 소유; 및
(3) 바람직 하게는, 항생물질 내성 같은 쉽게 선택할수 있는 마커에 대한 유전자를 지닌다.
앞에서 언급한 특징들을 갖는 2가지 중요한 형태의 벡터들은 플라스미드 및 세균성 바이러스(박테리오파아지 또는 파아지) 이다. 플라스미드 벡터는 본 발명에서 선호되어 사용된다. 플라스미드 벡터는 orf 바이러스 게놈의 비필수 지역, 하나 또는 그 이상의 orf 바이러스 프로모터의 제어하에 있는 외래 유전자 또는 유전자들, 그리고 박테리아 플라스미드 DNA 의 단편으로 구성될 것이다. 벡터는 선형 DNA 분자일 수도 있고 원형이 더 바람직하다.
변형된 orf 바이러스를 구성하는데 있어, 또한 편리하고 신속한 분석에 의해 변형되지 않은 바이러스로부터 변형된 바이러스를 구분 할 수 있는 장점이 있다. 그와 같은 분석은 측정가능한 색변화, 항생물질 내성등을 포함한다. 신속하게 분석할 목적으로, 바이러스 벡터는 더욱 바람직하게는 lacz 같은 최소한 하나의 리포터 유전자 그리고/또는 x-gpt 같은 최소한 하나의 선택성 마커 유전자를 포함한다.
바람직한 구체예에서, 크산신-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 유전자(x-gpt) 및 베타-갈락토시다제 유전자는 적절한 orf 바이러스 전사 프로모터의 제어 하에서 플라스미드 안으로 삽입된다. 삽입된 유전자 들의 정위는 재조합체가 형질전환 감염(transfection)으로부터 회수될수 있는지를 결정하는데 있어 중요하다. 도 14는 pVU-DL101 및 pVU-DL102 에서 다른 정위에 있는 x-gpt 유전자를 보여준다.
다른 관점에서, 본 발명은 변형된 orf 바이러스 벡터를 만드는 방법을 제공한다. 본 방법은 위에서 규정된 플라스미드 클로닝 벡터를 orf 바이러스로 감염시켜 선택되어진 숙주세포 안으로 형질전환 감염시키는 것으로 구성된다. 적절한 형질전환 감염 기술이 본 분야에 잘 알려져 있는데, 예를들면, Graham,F.L. 및 Van der Eb,A.J.(1973) 에 의해 기술된 것 처럼 칼슘 포스페이트(calcium phosphate)로 매개된 형질전환 감염 같은 것이다. 인간 아데노바이러스(adenovirus) 타입 5 DNA 의 감염을 분석하는 새로운 기술. Virology. 52, 456-467. 다른 기술들은 전기삽입법(electroporation), 미세주입법, 또는 리포좀 또는 세포외막(spheroplast) 매개된 전이를 포함하나 그것에 한정되지는 않는다. 바람직하게는, 리포좀이 매개된 형질전환 감염이 사용된다. 이 방법은 Felgner,P.L.,Gadek, T.R., Holm, M., Roman, R., Chan, H. W., Wenz, M., Northrop, J.P., Ringold, G.M. 및 Danielson, M. (1987) 리포펙션(Lipofection); 고 효율의 지방이 매개된 DNA-형질전환 감염 절차. Proc Natl Acad Sci USA. 84, 7413-7417.
클로닝 벡터로 선택된 숙주를 형질전환시, 재조합체 또는 변형된 orf 바이러스 벡터가 만들어진다. 변형된 바이러스는 위에서 지적한 대로 신속한 분석에 의해 검출된다. 바람직한 벡터에 대해서는, 클론이 쉽게 선택할수 있게해주는 X-gal 평판상에 푸른색의 표현형을 보여주는 경우에 베타-갈락토시다제 유전자의 존재가 검출될수 있다. 선택되어졌을 때, 벡터는 냉동-해동 추출 같은 일상적인 절차를 이용하여 배양액 으로부터 분리된다. 종래 기술을 사용하여 필요에 따라 정제를 실행한다. 변형된 orf 바이러스를 만드는 전략이 도 20 에 보여진다. 형질전환된 숙주세포는 또한 본 발명의 일부를 형성한다. 세균, 곤충, 식물 및 동물세포를 포함하는 많은 숙주세포 들이 본 분야에 알려져있다. 바람직하게는, 숙주세포는 진핵생물의 세포이다. 특히 포유동물의 숙주세포가 바람직하다. 본 발명에서 선호되는 숙주세포는 일차 소의 고환 세포 또는 일차 양의 고환 세포(새끼양 고환 세포)이다.
인정되는 것처럼 본 발명의 다른 관점에서, 위에서 기술된 프로토콜은 항원은 물론 이형성 폴리펩티드를 제조하는데 사용된다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 약제학적 으로 허용가능한 희석제 또는 담체 및 선택적으로 또는 다른 대안으로 면역 보강제를 조합해 외생의 항원 DNA를 포함하는 변형된 orf 바이러스 또는 그것에 동등한 면역활성을 갖는 그것의 변이체, 또는 단편으로 구성된 백신제제로 이루어진다. 당 업자에게 알려진 적절한 면역 보강제의 예들은 사포닌, 프론드 보강제, 유중수형 유제, 글리세롤, 솔비톨, 덱스트란 및 많은 다른 것들을 포함한다. 일반적으로, 면역 보강제는 단지 살아있지 않은 바이러스 백신을 제제와만 사용될 것이다.
다른 관점에서, 본 발명은 현존하는 면역반응을 변경 시키거나 증강시키는 다른 생물학적 작용인자 분자에 대한 유전자 또는 시토킨 유전자를 암호화 하는 외생 DNA 와 조합하여 외생의 항원 DNA를 포함하는 변형된 orf 바이러스로 구성되는 백신의 제제를 포함한다.
백신은 어떤 편리하게 생리학적으로 허용가능한 형태로도 조제된다. 마마에 대한 백신 조제기술은 Kaplan, Br.Med Bull.25, 131-135 (1969) 에 개시되어있다.
더욱 유용한 것은 백신은 비경구 투여용으로 조제된다. 여기서 사용된 용어"parenteral(비경구적)"은 정맥내, 근육내, 피내의 및 피하 주사를 말한다.
그 외에, 백신은 경구 투여용으로 조제된다.
다른 치료제들을 또한 백신과 조합해서 사용할 수도 있다.
필요하다면, 백신은 외래항원에 대한 항체반응을 극대화 하기위해 규정된 기간에 걸쳐 여러번 투여할 수도 있다.
orf 바이러스 안으로 외래 유전자를 삽입하는 다른 방법을 또한 생각 할 수 있다. 가능하게는, 한번 orf 바이러스 DNA를 자른 제한엔도뉴클레아제가 사용된다. 절단자리는 시험관에서 돌연변이를 유발시켜 제거해 라이게이션에 의해 연결시킬수도 있다. 만약에 그 자리가 필수 유전자 내에 있다면, 돌연변이 유발은 유전자 기능에 영향을 미치지 않는 방식으로 배열된다. 이것은 특정한 제한엔도뉴클레아제의 절단자리를 없애기 위해 새로운 코돈이 치환이 아니라면 같은 아미노산을 암호화 하게 해주는 다른 염기로 제한엔도뉴클레아제 절단자리에 전적으로 또는 부분적으로 놓여있는 코돈에서 염기를 치환함으로써 가능하다. 그때 돌연변이를 유발시켜 어느 비필수 유전자 내에도 절단자리를 만들 수 있다. 그 절단부위는 외래 유전자를 삽입하는 자리로 작용한다. 외래 유전자의 삽입은 연속된 orf 바이러스 DNA 가 재생성되는 것을 방지하기 위해 DNA 의 절단된 말단 으로부터 인산을 제거하고, 인산화된 말단들을 갖는 외래 유전자를 라이게이션 반응에서 orf 바이러스 DNA에 연결한 다음, 세포 밖에서 삽입될수 있고 그때 orf 바이러스의 허용세포 안으로 결과물인 라이게이션 혼합물을 형질전환 감염시킨다. 바이러스를 회수하기 위해 세포는 이러한 세포들이 수용하지 못했던 폭스바이러스, 예를들면 계두(fowlpox) 바이러스 및 일차 소 고환 세포 로 감염된다.
이제 무제한적인 실시예들이 제공될 것이다.
실시예 1 - 적절한 세포배양 체계의 선택
본 출원에서 기술된 방법들 중에서 배양에 이용되는 세포의 원천은 태어난지 1일에서 석달 사이에있는 새끼 송아지였다. 고환은 본 절차에 숙련된 수의사에 의해 마취없이 동물의 음낭에서 떼어내었다. 배양세포를 살균상태로 유지하기 위해 손상됨이 없이 고환을 벽막과 같이 떼어내었다. 조직은 얼음위에 놓인 상태로 실험실로 운반되었고 고환으로부터 고환조직을 떼어내 단세포 및 작은 세포들 집합체 안으로 분산시키고 당업자들 에게 친숙한 살균절차로 적절한 배양배지 안에 있는 배양용기 에서 배양시켰다.
실시예 2 - 삽입자리의 동정
다양한 orf 바이러스 분리균의 DNA들은 제한엔도뉴클레아제를 이용해 물리적으로 유전자 지도작성을 해왔다. 그와같은 유전자 지도작성은 균주들이 반드시 그들의 표현형에서 다르지 않다 할지라도 제한엔도뉴클레아제로 절단해 생긴 단편의 크기 및 순서로 구별할수 있는 많은 다른 바이러스 균주가 있다는 사실을 나타내었다. 이 데이타로 부터, 게놈의 오른쪽 끝에서 제한엔도뉴클레아제 KpnI 단편 유전자 지도 작성에서 2개의 균주간의 크기가 다르다는 사실을 알게 되었다(Robinson A.J., Barns. G., Fraser.K. Carpenter.E. 및 Mercer, A.A. (1987). orf 바이러스 게놈에서 보존 및 변이. Virology. 157, 13-23). 이러한 2개의 균주들은 NZ-2 및 NZ-7 그리고 단편들은 KpnI E 및 KpnI D 로 각각 칭해졌다. NZ-7은 2개의 단편중에서 더 큰 단편을 포함하였다. 크기에 있어 차이는 약 1킬로베이스 염기쌍 이었다. NZ-10으로 명칭이 붙여진 또다른 균주는 NZ-2 및 NZ-7에 있는 상응하는 단편간의 크기에서 중간인 단편 KpnI D 단편을 갖는 것으로 알려졌으나 게놈에서 동일한 상대 위치에 놓여 있었다(도 1 참조). 이런 변이는 그 지역의 일부 또는 전부가 비필수 지역이었고 이 단편내에서 외래 DNA가 삽입되는 자리가 발견되기도 하였다. 기술된 지역을 이어서 서열결정하였고 잠재적인 삽입자리가 동정되었다(도 2 및 도 3).
또 다른 삽입가능한 자리는 균주사이, 예를들면 NZ-2 및 NZ-7 사이에 DNA/DNA 잡종형성이 2.75 킬로베이스 염기쌍에 걸쳐 신장되는 비상동 지역을 검출했을 때 동정되었고 이 삽입자리는 게놈의 오른쪽 끝에서부터 약 30 킬로베이스 염기쌍이 되는 지역까지 염색체 지도가 작성되었다(Robinson A. J., Barns, G., Fraser,K, Carpenter, E. 및 Mercer, A.A.(1987). orf 바이러스 게놈에서 보존 및 변이. Virology. 157, 13-23 및 Naase, M., Nicholson, B.H., Fraser, K.M., Mercer, A.A. 및 Robinson, A.J.(1991). 우두 바이러스의 융합 단백질 유전자에 상동성을 보여주는 orf 바이러스 서열. J. Gen Virol. 72, 1177-1181)(도 4). 이 지역을 그다음 완전히 서열결정하였고 2개의 유전자, HI1L 및 HI2L이 동정되었고, 그것의 각각은 삽입가능한 자리를 포함한다(도 5).
세 번째로 삽입 가능한 자리는 NZ-41로 명명된 균주에 있는 BamHI G 단편 과 검사된 다른 균주들에 있는 대등한 지역 사이에 크기에 있어 100개의 염기쌍 차이를 보인 게놈의 중앙에 위치했다(Robinson. A. J., Barns, G., Fraser, K., Carpenter,E. 및 Mercer,A.A.(1987). orf 바이러스 게놈에서 보존 및 변이. Virology. 157, 13-23). 균주 NZ-2의 게놈에 있는 동등한 지역인, BamHI F 단편의 뉴클레오티드 서열이 결정되었고 2개의 삽입가능한 자리가 동정되었다(도 6 및 도 7).
네 번째로, 세포배양액에 있는 바이러스가 계열 증식후 균주 NZ-2 의 orf 바이러스 게놈의 자발적인 유전자 재편성이 탐지되었고 이런 유전자 재편성은 왼쪽 끝에 오른쪽 끝 DNA 서열의 16 킬로베이스 염기쌍이 추가되었고 왼쪽 끝으로부터 DNA의 3.3 킬로베이스 염기쌍이 결실되었다. orf 바이러스의 전위-결실 변이주의 게놈 분석은 3.3Kbp 의 비필수 DNA 지역을 나타낸다(Fleming, S.B., Lyttle, D.J., Sullivan,J.T., Mercer,A.A. 및 Robinson,A.J.(1995). J Gen Virol., 76, 2969-2978). 결실에 견딜수 있는 게놈의 지역을 구성하고 있는 뉴클레오티드의 순서는 Sanger 방법에 의해 추론되었고 동정된 3개의 유전자가 거기에 포함되었다. 이러한 유전자들은 E2L, 전에는 ORF-1 에 해당된다(Fraser,K.M.,Hill,D.F.,Mercer,A.A. 및 Robinson, A.J.(1990). 파라폭스바이러스, orf 바이러스의 게놈에서 역 종료 복제. Virology.176, 379-389), E3L 전에는 ORF-PP (Mercer, A.A., Fraser, K., Stockwell,P.A. 및 Robinson, A.J.(1989). 파라폭스바이러스, orf 바이러스에서 레트로바이러스 슈도프로테아제의 상동염색체. Virology 172, 665-668) 및 G1L (Sullivan, J.T., Fraser, K., Fleming,S.B.,Robinson,A.J. 및 Mercer, A.A.(1995). 안키린(ankyrin)같은 중복 서열을 암호화 하는 orf 바이러스 유전자의 서열 및 전사분석. Virus Genes, 9,277-282). 이 지역(도 8) 은 유전자를 삽입할수 있는 또 다른 삽입이 가능한 자리이다(도 9 참조).
실시예 3 - orf 바이러스 프로모터의 동정
orf 바이러스 게놈의 선택된 지역의 뉴클레오티드 서열결정은 첫 번째 경우에 다른 폭스바이러스 전사 프로모터에의 그들의 유사성에 의해서와 나중경우에는 기능분석에 의해 수 많은 orf 바이러스 전사 프로모터의 동정을 가능하게 하였다.
orf 바이러스의 초기 및 후기 프로모터들이 도 10에 보여진다. 초기 프로모터 E1L(ORF-3)은 세포주기의 초기에 mRNA를 만드는 것으로 나타났다(Fleming, S.B.,Fraser,K.M.,Mercer, A.A. 및 Robinson, A.J.(1991). 우두 바이러스 유사체의 초기 전사 제어 서열은 orf 파라폭스바이러스에 있는 초기 유전자에 접해있다. Gene. 97,207-212) 그리고 후기 프로모터 F1L은 우두 바이러스 후기 프로모터에의 그 유사성 때문에 후기 프로모터 일 것 이라고 추론되었다. orf 바이러스의 후기 프로모터는 일시적인 분석에서 기능을 한다. 그와 같은 분석들은 예를들면(Cochran, M.A., Mackett,M. 및 Moss.B.(1985) 에 의해 기술되었다. 우두 바이러스의 전사 인자 및 조절 DNA 서열에 달려있는 진핵생물 일시 발현 체계. Proc Natl Acad Sci USA. 82, 19-23). 초기-후기 프로모터로 동정된 세 번째 프로모터 F3R 은 또한 일시적인 분석에서 기능을 하는 것으로 보여진다. orf 바이러스 후기 프로모터, F1L을 포함하고 있는 플라스미드 pSP-PF1ac 의 구성 그리고 베타-갈락토시다제 유전자가 orf 바이러스 후기 프로모터의 제어 하에있는 베타-갈락토시다제(lacz)에 대한 대장균 유전자는 실시예 6에서 기술되고 도 11에서 예시되어있다.
(A) 일시적인 분석에서 프로모터 활성도의 측정
프로모터가 일시적인 분석에서 활성적 이라는 사실을 보여주기 위해, 세포배양 작업에 적당하고 세포들이 부착하는 표면적이 25cm2인 플라스틱으로된 플라스크에 있는 소 고환 세포의 융합성 단층을 세포당 대략 10개의 용균반을 형성하는 단위가 중복적 감염으로 orf 바이러스로 감염되었다. 감염후 2시간에서, 조사했을 때 프로모터에 연결된 lacz 유전자를 포함하는 플라스미드를 (Felgner, P.L., Gradek, T.R.,Holm,M.,Roman,R.,Chan,H.W.,Wenz,M.,Northrop, J.P., Ringold,G.M. 및 Danielsen,M. (1987). 리포펙션(Lipofection): 고 효율의 지질이 매개된 DNA-형질전환 감염 절차. Proc Natl Acad Sci USA. 84, 7413-7417) 에 의해 기술되고 실시예 B에서 설명된 대로 리포좀이 매개된 전이 기술을 이용해 orf 바이러스가 감염된 소 고환 세포안으로 도입하였다. 감염후 48시간 후에, 물중의 농도 2% w/v 의 5-브로모-4-클로로-3-인돌일-베타-D글루코시다제(X-gal) 용액 35 마이크로리터를 액상배지를 제거한 후에 세포위에 깔린 세포 배양액 배지에 있는 1% 아가로오스 1ml 에 첨가하고 실온(15-25℃ 범위내에서)에서 겔을 형성토록 하였다. 상기 세포 및 겔에서 24시간 연속적으로 푸른 색깔을 나타나게 한다음, 감염세포가 관찰되었다. 유사하게 그러나 전사 프로모터의 제어하에 있지않은 베타-갈락토시다제 유전자를 포함하는 플라스미드로 처리된 세포에서 보여진 푸른색 보다 더 커다란 푸른색이 나타난다는 사실은 시험되는 프로모터가 활성적 이었다라는 사실을 가리켰다.
프로모터 기능을 조사하는 다른 관점에서, 일시적으로 감염된 소 고환 세포의 베타-갈락토시다제 활성도가 정량적으로 분석된다. 세포들은 직경이 1.5cm 인 24개의 well(웰)로 되어있는 멀티웰 플라스틱 조직 배양 용기에서 융합성 단층으로서 자랐다. 각각의 웰들은 10 모이(moi)에서 orf 바이러스로 감염되었고 감염후 2시간에서 베타-갈락토시다제 유전자에 연결된 프로모터를 함유하는 플라스미드 구성이 위에서 기술된 리포좀이 매개된 형질전환 감염 기술을 이용해 감염된 세포안으로 도입된다. 세포들은 PBS(phosphate-buffered saline)용액의 부피 1ml 안으로 긁어서 수거해 원심분리에 의해 수거되고 PBS 로 세척한다음 200 마이크로미터 PBS 용액에 재현탁 시킨다. 세포들은 동결 및 해동의 3 싸이클을 거쳐 파열시켜 원심분리 하고 효소분석을 하기위해 상층액은 보관한다. 베타-갈락토시다제 의 분석은 편리하게 96-웰 마이크로타이터(micrititer) 용기에서 수행된다. 반응혼합물 0.1ml은 1.3mg/ml 의 최종농도로 100mM 인산 나트륨, pH 7.3, 1mM 염화 마그네슘, 50mM 베타-머켑토에탄올, O-니트로페닐-베타-D-갈락토시드(ONPG) 및 10-20 마이크로리터 의 세포 여액 부분을 포함한다. 반응 혼합물은 37℃에서 1시간 동안 배양하고 동일한 부피 1M 탄산나트륨을 첨가해 반응은 종료된다. 각 웰의 흡수도는 마이크로타이터 플레이트 리더(microtitre plate reader)를 이용해 420 nm에서 측정된다. 흡수값은 본래 추출액에 존재하는 베타-갈락토시다제 활성도의 양에 비례하고 이것은 각 프로모터 구성의 상대강도 및 발현되는 시간경로를 결정하게 해준다.
실시예 4- Orf 바이러스 게놈 안으로 외래 유전자를 삽입하는데 적절한 벡터 플라스미드 의 구성
선택된 비필수 DNA 는 orf 바이러스의 유전자가 재배열된 돌연변이주 에서 결실되는 것으로 알려진 지역이었고 이 지역에 관련된 뉴클레오티드의 서열은 Fraser,K.M.,Hill,D.F., Mercer,A.A. 및 Robinson,A.J. (1990)에서 발견될수 있다. 파라폭스 바이러스,orf 바이러스의 게놈에 있는 역 종료 복제의 서열분석. Virology. 176, 379-389 및 in Sullivan, J.T., Fraser, K.M., Fleming,S.B.,
Robinson, A.J. 및 Mercer,A.A.(1995). 안키린 유사체 중복 서열을 암호화 하는 orf 바이러스 유전자의 서열 및 전사 분석. Virus Genes 9,277-282 및 도 8에 보여진다. 사용된 orf 바이러스 유전자 는 Fraser,K.M.,Hill,D.F.,Mercer,A.A. 및 Robinson,A.J.(1990)에서 기술된 초기 프로모터,E1L 이었다. 파라폭스바이러스, orf 바이러스의 게놈에서 역 종료 복제의 서열분석. Virology. 176, 379-389 및 Fleming, S.B.,Fraser,K.M.,Mercer,A.A. 및 Robinson,A.J.(1991). 도 10에서 보여준대로 우두 바이러스 와 orf 바이러스 사이에 있는 유전자 구조 및 배열의 보존. Virology. 195,175-184). 돌연변이된 orf 바이러스를 만드는 과정을 설명하기 위해 선택된 외래 유전자는 대장균 베타-갈락토시다제 유전자였는데, 그것은 발현됐을때 단백질 산물을 색깔반응 으로 탐지될수 있다는 장점을 갖고 있다(Miller, J. H. (1972). "Experiments in Molecular Genetics." Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. Moss,B.(1990). "폭스비리데 및 그들의 복제" in Virology,Fields et al., eds, 2nd ed.Raven Press,New York,2079-2111), 및 발현됐을 때 돌연변이 되지않은 바이러스로부터 돌연변이주를 선택하는데 사용될수 있는 대장균 구아닐포스포라이보실 트랜스퍼라제(X-gpt) 유전자(Mulligan,R.C. and Berg,P.(1980). 포유동물 세포에서 세균 유전자의 발현. Science. 209, 1422-1427). 다음은 벡터 플라스미드의 구성을 설명한 것이다. 도 11-13은 구성을 도식형태로 개략한다.
(A)대장균 LacZ 유전자 앞에있는 Orf 바이러스 후기 프로모터의 클로닝
돌연변이주 orf 바이러스를 구성하는데 있어 그것은 편리하고 신속한 방법으로 돌연변이 되지 않은 바이러스로부터 돌연변이 바이러스를 구분할수 있는 장점이 있다. 그와같은 분석은 orf 바이러스 전사 프로모터의 제어하에 있는 베타-갈락토시다제 효소에 대한 대장균 유전자를 벡터 플라스미드 안으로 삽입해서 제공된다. 후기 orf 바이러스 프로모터는 BamHI F(Fleming.S.B.,Blok,J.,Fraser,K.M.,Mercer,
A.A. and Robinson.A.A.(1993)으로 명명된 orf 바이러스 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열을 결정해서 동정되었다. 우두 바이러스와 orf 바이러스 사이에 유전자 구조 및 배열의 보존. Virology. 195, 175-184). 이 구성에서 사용된 프로모터 F1L 서열은 도 10에 보여진다. 구성에 있어 후기 프로모터의 충분한 양은 기술된(Mercer,A.A.,Fraser,K.,Barns,G. 및 Rpbinson,A.J.(1987) pVU-6 으로 명칭된 플라스미드로부터 얻을수 있다. orf 바이러스 DNA 의 구조 및 클로닝. Virology. 157, 1-12).
총 2.62 킬로베이스 DNA는 프라스미드 pUC-8(Viera,J. 및 Messing,J.(1982)안으로 클로닝된 orf NZ-2 의 BamHI 단편을 포함하는 플라스미드 pVU-6을 절단해 orf NZ-2의 BamHI 단편으로부터 결실된다. pUC 플라스미드 인 M13mp7 은 AvaI 과 같이 보편적인 합성시발체로 삽입 돌연변이 유발 및 서열화에 대한 체계를 끌어내었다 Gene. 19,259-268). 이 효소는 BamHI E 에 있는 6개의 내부 AvaI 자리 및 pUC-8 폴리링커(polylinker)의 SmaI 자리를 절단한다. 벡터 단편에 남아있는 AvaI 자리는 클리노(Klenow) DNA 중합효소로 끝부분이 채워지고 플라스미드 pVU-Av6를 만들기 위해 재 연결된다. 플라스미드 pVU-Av6 은 BamHI 및 EcoRI 으로 절단해 orf 바이러스 후기 프로모터를 함유하는 725 염기쌍 단편을 방출한다. 이 단편은 pMLB 1034(Weinstock, G.M.,Berman,M.L. 및 Silhavy,T.J.(1983) 안으로 클로닝된다. "머리가 없는" lacZ 유전자를 함유하는 원핵 및 진핵생물(Cells,papas et al., eds. Elsevier,New York,27-64)에서 클로닝된 유전자를 발현하는데 있어 "유전자 증폭 및 분석에 있어 베타-갈락토시다제를 가진 키메릭 유전학". 이 클로닝은 orf 바이러스 후기 프로모터를 lacZ 앞에 위치 시키고 그것에게 베타-갈락토시다제를 합성하게 해주는 ATG 개시 코돈을 제공한다. 이 클로닝 단계로부터 초래되는 균락들은 필요한 클론을 선택 시켜주는 X-gal 평판상에 푸른색 표현형을 나타낸다. pMLB-1034 의 lacZ 삽입체로부터 하류에 있는 독특한 BalI 자리는 다음의 클로닝 절차에 의해 EcoRI 자리로 전환된다. Tn5 아미노글리코시드 3' 포스포트랜스퍼라제 유전자는 플라스미드 pNEO(Beck,E.,Ludwig, A.,Aurswald,E.A.,Reiss,B. 및 Schaller,H.(1982) 로부터 방출된다. EcoRI 및 BamHI 과 함께 전이인자 Tn5 (Gene.19,327-336)로부터 니오마이신 포스포트랜스퍼라제 의 뉴클레오티드 서열 및 정확한 위치. 제한자리 들은 클리나우 DNA 중합효소 로 끝이 채워지고 BalI 으로 잘린 플라스미드 pMBL-PF 안으로 그 단편은 연결 봉합된다. 재 조합체들은 카나마이신 배지상에 깔아 선택된다. 이것은 클로닝된 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제2(aph2) 유전자의 정위에 달려있는 본래자리 BglI의 위치에 EcoRI 및 BamHI 자리를 만든다. BalI은 흔히 비효율적 으로 DNA를 절단하나 그 방법은 바람직한 방식으로 계속 변형되 BalI에 의해 절단되고 삽입체를 받은 플라스미드를 선택하게 해준다. 플라스미드 pMBL-PFneo 는 EcoRI 으로 절단되고 PF-lacZ 융합체를 함유하는 4059 bp EcoRI 단편은 pSP-70 안으로 클로닝된다(Melton,D.A.,P.A.,R.,Rebagliati,M.R.,Maniatis,T.,Zinn,R. 및 Green,M.R.(1984). 도식 도 11 에 보여준 pSP-PF1ac 로 명명된 플라스미드를 만들기위해 EcoRI 자리에서 박테리오파지 SP6 프로모터(NUcleic Acids Res.12,7035-7056)를 함유하는 플라스미드로부터 생물학적 으로 활성적인 RNA 및 RNA 의 잡종분자 형성 표지물의 효율적인 생체외 합성.
(B) 대장균 X-GPT 유전자 앞에있는 Orf 바이러스 초기 프로모터의 클로닝
돌연변이된 orf 바이러스를 구성하는데 있어 비돌연변이체, 둘다의 혼합체로부터 돌연변이체를 선택하는 수단이 필요하다. 다른 사람들이 사용한 방법은 대장균의 구아닐 포스포라이보실 트렌스페라제 유전자를 이용하는 것이다. 그 유전자가 진핵생물 세포에서 발현됐을 때 대사 억제제, 미코피놀릭산에 내성이 생긴다. 초기 프로모터의 제어하에 이 유전자를 벡터 플라스미드 안으로 도입하는 방법이 Falkner,F.G. 및 Moss,B.(1988) 에 의해 기술된다. 대장균 gpt 유전자는 우두 바이러스 의 해독 전사 프레임 발현 벡터에 대한 우성선택을 제공한다. J Virol.62,1849-1854 및 Boyle,D.B. 및 Coupar,B.E.(1988). 가금백신의 벡터로서 재조합 계두 바이러스의 구성. Virus Res.10,343-356.
pVU-5로 명명된 플라스미드는 초기 orf 바이러스 프로모터를 제공하는데 사용된다. 플라스미드 pVU-5는 pUC-8 안으로 클로닝된 orf 바이러스 NZ-2 BamHI E 단편을 포함하고 이 플라스미드의 구성은 Mercer,A.A., Fraser,K.,Barns,G. 및 Robinson,A.J.(1987)에서 기술된다. orf virus DNA 의 구조 및 클로닝. Virology. 157,1-12.
초기 프로모터 E1L은 Fraser,K.M.,Hill,D.F.,Mercer,A.A. 및 Robinson, A.J.
(1990) 에 의해 pVU-5에서 본래 ORF-3로 명명된 추정상의 유전자에 대해 기술해 왔다. 파라폭스바이러스, orf 바이러스의 게놈에서 역 종료 복제의 서열분석. Virology. 176,379-389 and by Fleming,S.B.,Fraser,K.M.,Mercer,A.A. and Robinson,A.J.(1991). 우두 바이러스 유사체의 초기 전사 제어 서열은 orf 파라폭스 바이러스에 있는 초기 유전자에 접해있다. Gene.97,207-212; 그리고 그것은 돌연변이체 orf 바이러스를 구성하기 위해 본 출원에 기술된 방법에서 사용되는 이 초기 프로모터 이다. 도 12에 보여준 A 503 bp AluI A+T 가 많은 단편은 pVU-5로부터 절단되고 Mead,D.A.,Szczesna-Skorupa,E. 및 Kemper,B.(1986)에서 기술된 다기능 플라스미드 벡터 pTZ18R의 HincⅡ 자리안으로 클로닝 된다. 단일 가닥으로된 DNA "blue" T7 프로모터 플라스미드: 클로닝 및 단백질 공학에 대한 다양한 반복배열 프로모터 시스템. pSFAlu-6 에 관해서는 단백질 공학. 1, 67-74. 플라스미드 pSFAlu-6 은 DdeI 로 절단되고 그 단편은 클리노우 DNA 중합효소로 끝부분이 봉하여 진다. 그 단편은 Hind3Ⅲ 로 재 절단되고 467 bp Hind3Ⅲ-DdeI 단편은 Hind3Ⅲ 로 재 절단하고 끝부분을 봉하고, BglII 로 절단해서 조제된 pSP-70 안으로 연결 봉합 되었다. 그 결과 얻어진 플라스미드 pSV-SFP 는 클로닝을 하는 동안 재 형성된 Bgl2 자리를 갖고 있다. 그 플라스미드 pSV-gpt2 는 대장균 x-gpt 유전자를 함유하고 있는(Mulligan,R.C. 및 Berg,P.(1981). 잔신-구아닌 포스포라이보실 트랜스퍼라제를 암호화하는 대장균 유전자를 발현하는 선택된 동물세포. Proc Natl Acad Sci USA. 78, 2072-2076) 플라스미드 pSV-gpt 는 BamHI 및 BglⅡ로 절단된다. 이것은 x-gpt 유전자를 pSP-SFPgpt32를 생성하는 x-gpt 유전자에 orf 바이러스 단편을 융합시켜 pSP-SFP 의 Bgl2 Ⅱ 자리 안으로 클로닝 된 1788 bp 단편 으로서 방출한다. 플라스미드 pVU-5 는 그때 SmaI 및 SphI 로 절단된다. 도 10 에서 보여진 서열인 초기 프로모터 E1L을 포함하는 150 bp SmaI-SphI 단편이 플라스미드 pSF-1를 생성하는 SmaI 및 SphI 자리 사이에 있는 pTZ18R 안으로 클로닝 된다. 플라스미드 pFS-1 은 SphI 으로 절단되고 T4 DNA 중합효소와 같이 배양되었다. aphⅡ 유전자는 EcoRI 및 BamHI 로 절단되 플라스미드 pNEO 로부터 방출되었다. EcoRI 및 BamHI 자리는 클리노우 DNA 중합효소로 끝부분이 봉하여지고 그 단편은 pSF-1 안으로 연결 봉합 되었다. 그 결과 플라스미드 pFS-neo3 는 그것과 초기 orf 바이러스 프로모터 사이에 놓여있는 EcoRI 자리 및 BamHI 자리 옆에 인접해 있는 aphⅡ 유전자를 함유한다. 이러한 조작결과는 초기 프로모터의 말단에 있는 SphI 자리는 BamHI 자리로 전환된다. aphⅡ 유전자 및 초기 프로모터는 머리맞춤 정위에 놓여있고 EcoRI 으로 절단해 제거된다. 그 다음에, 플라스미드 pSP-sSFPgpt32 는 PvuⅡ로 절단된다. aphⅡ-초기 프로모터 구성은 EcoRI으로 pFSneo3 중에서 잘려 나갔고, 클리노우 DNA 중합효소로 끝이 봉하여 졌고, PvuⅡ 자리 안으로 연결봉합 되었다. 503 bp AluI 단편이 선택되어지는 것처럼 똑같은 방향으로 작용하는 초기 프로모터를 함유하는 플라스미드를 FSneo-SFPgpt로 이름을 붙였다. 플라스미드 FSneo-SFPgpt32는 BamHI 및 BglⅡ 로 절단된다. 이 절차는 BamHI-BglⅡ 단편처럼 aph2Ⅱ 유전자와 함께 뉴클레오티드 a 및 b(도 13) 사이에 있는 서열을 제거한다. 벡터 단편은 아가로오스 겔에서 전기영동 되고(Vogelstein,B. and Gillespie,D.(1979) 에 의해 기술된 (파우더드 글래스 밀크)powdered glass milk 방법을 이용해 정제된다. 아가로오스에서 DNA의 조제 및 분석정제. Proc Natl Acad Sci USA. 76,615-619) 그리고 자유 BamI 및 Bgl2Ⅱ 말단은 초기 프로모터를 x-gpt 유전자에 융합해 같이 연결시켰다. 단계4,5,6, 및 7(도 13)에서 기술된 조작의 총 결과는 pFS-gpt를 형성하는 FS 프로모터와 같이 pSP-SFPgpt32 에 있는 뉴클레오티드 a 및 b 사이의 서열을 바꾸는 것이었다.
실시예 5 - Orf 바이러스 게놈의 비필수 지역의 동정 및 플라스미드 안으로 이 자리의 삽입
159 아미노산의 펩티드를 암호화할 가능성이 있는 유전자가 orf 바이러스 게놈의 ITR 접합부에 걸쳐있는 4.47 Kb BamHI E 단편의 서열로부터 발견되었다. 이것은 E3L 로 명명했고 레프로바이러스 (Mercer,A.A.,Fraser,K.M.,Stockwell, P.A.
and Robinson,A.J.(1989)에 있는 전사해독 프레임에 상동성을 보여준다. 파라폭스바이러스, orf 바이러스에서 레트로바이럴 슈도프로테아제 및 대장균 dUTPase 에 상동염색체. Virology. 172, 665-668) 및 (McGeoch, D. J.(1990). 단백질 서열 비교는 폭스바이러스 및 어떤 레트로바이러스에 의해 암호화된 '슈도프로테아제' 는 디옥시유리딘 트리포스페타제 계통군에 속한다는 것을 보여준다. Nucleic Acids Res. 18, 4105-4110). 실험실에서 분리된 orf 바이러스의 자발 돌연변이체 는 그 유전자좌에 있는 게놈의 반대편 끝으로부터 복제된 DNA 단편 및 BamHI E 단편의 일부 결실을 포함하는 복잡한 유전자 재배열 때문에 E3L 유전자를 포함하지 않는 것으로 발견되었다. 그러므로, E3L 유전자는 비필수 유전자 이고 orf 바이러스는 외래유전자의 삽입에 견딜수 있다는 것을 나타내기 위해 그리고 외래 DNA를 삽입하기 위한 표적으로 선택되었다. NZ-2 BamHI E 라는 독특한 지역을 포함하고 있는 2587 bp SmaI-BamHI 단편은 pVU-5 밖으로 잘려나갔고 PvuⅡ 및 BglⅡ 로 잘린 pSP-70 안으로 클로닝 되었다. 그 결과 생긴 플라스미드, pVU-DL100은 E3L 유전자의 암호서열과 그 프로모터 사이에 놓여있는 독특한 NcoI 자리를 포함한다.
실시예 6 - 대장균 X-GPT 의 삽입 및 벡터 플라스미드를 생성하기 위해 pVU-DL100 안으로 LacZ 유전자 구성
플라스미드 pVU-DL100 은 NcoI 으로 절단되고 클리노우 중합효소로 끝부분이 봉해져 있다. E3L-gpt 구성은 EcoRI 및 DraI 으로 pFSP-gpt 로부터 절단되고, 클리노우 중합효소로 끝부분이 봉하여지고 NcoI 자리에서 pVU-DL100 안으로 봉합 연결된다. 플라스미드 상에있는 끝부분이 봉하여진 NcoI 부위에 삽입자리의 끝부분이 봉하여진 EcoRI 자리를 연결시키면 초기 프로모터의 상류에 EcoRI 자리가 생긴다. 그 삽입자리는 슈도프로테아제 유전자에 반대방향 으로 이동하는 x-gpt 유전자가 있는 pVU-DL101 및 슈도프로테아제 유전자와 똑같은 방향으로 이동하는 x-gpt 유전자가 있는 pVU-DL102 인 2가지 정위에서 회복된다. F1L-lac 구성은 EcoRI 으로 pSP-PFlac에서 잘려 나가고 pVU-DL101 및 pVU-DL102 둘다의 EcoRI 자리 안으로 클로닝된다. 삽입된 단편의 여러 가지 정위를 가진 4개의 플라스미드는 클로닝 으로부터 그러나 단지 2개의, 등을 맞대는 정위에서 E3L-gpt 및 F1L-lac를 포함하는
pVU-DLI01에서 파생된 pVU-DLI04, 및 pVU-DLI02에서 파생된 pVU-DLI06 으로부터 회복되고 형질전환 감염 실험에 사용된다.
실시예 7 - T. ovis 45W 항원을 발현하는 키메릭 유전자의 구성
orf 바이러스 NZ-7 으로부터 VEGF 같은 유전자의 64bp 단편 (Lyttle,D.J.,
Fraser,K.M.,Fleming,S.B.,Mercer,A.A. and Robinson,A.J.(1993) 혈관 내피 성장 인자의 동족체들은 5개의 3' 시발체 말단 코돈, 해독 말단 코돈 TAA, 및 폭스바이러스 전사 말단 서열 5TNT를 함유하고 있는 폭스바이러스 orf 바이러스. J Virol. 68,84-92)에 의해 암호화되고 증폭된 서열에 인접하는 BglⅡ 및 NcoI 제한 자리를 제공하도록 설계된 올리고뉴클레오티드 시발체 쌍을 이용해서 증폭되었다. 이 단편들은 BglⅡ 및 NcoI 로 절단되었고 플라스미드 ptov1을 구성하기 위해 BglⅡ 및 NcoI 으로 절단된 벡터 pSL301 안으로 연결되었다 (Brosius,J.(1989) 클로닝 하는데 있어 초 연결기들 및 발현 벡터들. DNA 8, 759-777). aphⅡ 유전자 및 F1L 그리고 orf 바이러스의 F3R 프로모터를 함유하는 DNA 단편은 한 끝부분에서 MluI 자리 그리고 다른 끝에서 NsiI 및 EcoRI 자리를 도입했던 특수 시발체를 이용해 PCR 로 증폭 되었다. 증폭된 산물의 한 부분은 MluI 및 EcoRI 으로 절단되었고 플라스미드 ptov2를 생성하기 위해 MluI 및 EcoRI 으로 절단한 ptov1 안으로 연결되었다. 두 번째 부분은 MluI 및 NsiI 으로 절단했고 플라스미드 ptov3을 구성하기 위해 ptov1 안으로 봉합 연결시켰다. 이 구성을 보여주는 단계들이 도 15 에 나타나있다.
aphⅡ 유전자는 플라스미드 ptov5를 구성하기 위해 제한엔도뉴클레아제 BamHI 및 BglⅡ 로 절단해 벡터단편을 정제하고 자유말단 들을 재 봉인 및 연결시켜 플라스미드 ptov2 로부터 제거되었다. Taenia ovis 45W 항원단편을 암호화 하는 DNA 서열은 플라스미드 pGEX 45W 로부터 제거되었다(Johnson,K.S.,Harrison,G.B.L.,Lightowers,M.W.,O'Hoy,K.L.,Cougle,W.G.,Dempster,R.P.,Lawrence,S.B.,Vinton,J.G.,Heath,D.D., and Ricard,M.D.(1989). 제한엔도뉴클레아제 EcoRI 및 BamHI 로 절단하고 그것을 ptov6를 구성하기 위해 BamHI 및 EcoRI 으로 절단된 ptov5 안으로 연결시켜 규정된 재조합 항원(Nature 338, 585-587)을 이용해 면양 포낭충병 에 대한 백신. 이것은 orf 바이러스 PF3R 프로모터의 제어하에 있는 45 W 항원단편을 암호화 하는 DNA 서열을 위치시키고 그것에 해독 및 전사 종결서열을 제공했다. 이러한 단계들은 도 16 에 나타나있다.
추정되는 배출 리더(secretory leader) 서열을 암호화 하는 orf 바이러스 NZ-7 으로부터 VEGF 유사체 유전자의 5' 부분 으로부터 73 bp 단편은 새로운 개시 코돈, 증폭된 DNA 단편 안으로 PstI 및 EcoRI 제한자리를 도입한 특수 시발체로 증폭되었다. 증폭된 단편은 PstI 및 EcoRI 으로 절단되었고 플라스미드 ptov4를 만들기 위해 NsiI 및 EcoRI 으로 절단된 ptov3 안으로 클로닝 되었다.
플라스미드 ptov4 는 aphⅡ 유전자를 제거하기 위해 BamHI 로 절단하였고, 아가로오스 겔 전기영동 으로 정제하였고 ptov7을 구성하기 위해 재 봉인 및 연결 시켰다. 45W 항원 단편을 암호화 하는 DNA 서열은 제한엔도뉴클레아제 EcoRI 및 BamHI 으로 절단하고 ptov8을 구성하기 위해 BamHI 및 EcoRI 으로 절단된 ptov7 안으로 연결시켜 플라스미드 pGEX 45W 로부터 제거되었다. 이것은 orf 바이러스 PF3R 프로모터의 제어하에 45W 항원단편을 위치시켰고 ptov6 에 존재하는 3' 해독 및 전사 종료체외에 5' 단백질 배출 신호 서열을 제공했다. 이 단계들은 도 17 에 기술된다.
플라스미드 pVU-DL101는 EcoRI 으로 절단했고 BamHI 및 NcoI 제한자리를 함유하는 올리고뉴클레오티드 연결기는 플라스미드 pVU DL101L4를 구성하기 위해 안에서 연결되었다. 이 플라스미드는 그때 ptov6 및 ptov8 로부터 키메릭 45W 유전자의 양 버전(version)이 삽입되도록 BamHI 및 NcoI 로 절단되었다. 그 결과 생긴 플라스미드 는 pVU-dl45W (ptov6 으로부터) 및 pVU-dl45W1 (ptov8 로부터) 로 명칭을 붙였다. 이 단계들은 도 18 에 예시된다. 프로모터가 없는 lacZ 유전자는 BamHI 및 BglⅡ 로 절단되어 도 11 에 나타난 pSP PFlac 의 유도체인 플라스미드 pVUsp-PF2lac 밖으로 절단되었다. 플라스미드의 후자 버전에서, F1L 프로모터 단편은 100 개의 염기쌍으로 잘라졌고 BglⅡ 제한부위는 lacZ 유전자 말단에 도입되었다. lacZ 단편은 겔상에서 정제되었고 유일한 BamHI 부위에서 pVU-DL45W 및 pVU-D145W1 둘 다 안으로 연결되었다. 이것은 F1L 프로모터의 제어하에 lacZ 유전자를 위치시켰고 orf 바이러스 게놈 안으로 T. ovis 45W 유전자를 도입하는 전이벡터의 구성을 완성했다. 이 단계는 도 19 에 나타나있다.
BamHI 및 NcoI 제한자리를 포함하고 있는 동일한 올리고뉴클레오티드 연결기는 플라스미드 pVU-DL102 안으로 연결되었다. 이 플라스미드는 pVU-DL101에서 정위와 반대 정위에서 클론된 x-gpt 유전자를 포함한다(도 14). pVU-DL101 에 기술된 절차와 평행한 클로닝 절차가 연속적으로 수행되었고 생겨난 전이 벡터들은 pVU-DL45W6lac 및 pVU-DL45W8lac 로 명명되었다. 이러한 것들은 각각 pVU-DL45Wlac 및 pVU-DL45W1lac 와 동일한 서열을 포함했으나 삽입된 전 지역은 도 19 에 있는 이러한 플라스미드 들에 대해 기술된 정위와는 반대정위에 있었다는 점에서 달랐다.
실시예 8 - 형질전환 감염 절차
일차 소의 고환 세포들은 락트알부민 가수분해물 (5 g/L) 과 5% 송아지 태아 혈청 으로 보충된 Eagle's 최소 필수 배지(Minimal Essential Medium)(MEM; Sigma Cat.No.MO0643)에 있는 단층 배양액에서 자랐다. x-gpt를 발현하는 orf 바이러스 형질변환체의 선택배지는 미코피놀산, 25 pg/ml, 잔신(xanthine) 250 pg/ml, 히포잔신(hypoxanthine) 15 pg/ml, 아미노프테린(aminopterin) 1 pg/ml, 싸이미딘(thymidine) 5 pg/ml 및 2% 송아지 태아 혈청을 포함한다. 락트알부민 가수분해물은 선택배지에 없었고 추가된 비필수 아미노산 으로 교체되었다(MEM 비필수 아미노산 혼합물, Sigma Cat.No.M2025).
BT 세포는 적절한 세포배양 용기안에서 단층으로 자랐다. 감염전 24시간에서, 세포성장 배지는 미코피놀릭산을 함유하고 있는 선택배지로 교체되었다. 세포들은 orf 바이러스, 균주 NZ-2(moi 0.05-0.1) 로 감염되었고 바이러스가 1시간동안 흡수하도록 했다. 단층으로 깔린 세포는 잔여 송아지 태아 혈청을 제거하기 위해 opti-MEM 혈청없는 배지 (Life Technologies Inc, Gaithersburg,MD U.S.A) 로 2번 세척했고 배출했다. 제조자의 지침에 따라 희석된 대략 2.0 μg 플라스미드 DNA 및 10 마이크로리터 리포펙틴 시약(Life Technologies Inc, Gaithersburg, MD,U.S.A)을 함유하는 부피 1.0ml opti-MEM을 각 플라스크에 첨가했고 밤새 배양하였다. 밤새 흡수시킨 다음, 2% 송아지 태아 혈청을 함유하는 선택배지 5.0ml 이 첨가되었고 감염후 대략 3-5일 에서 세포병변 효과 가 관찰될 때 까지 계속 배양하였다.
단층 세포들은 플라스크에서 긁어 내어졌고, 저속원심 분리로 원심분리 튜브의 밑바닥에 침전되었고, PBS 용액으로 세척하고 PBS 용액안에 재현탁 되었다. 적절한 조직배양 용기는 전면 단일층을 만들기 위해 BT 세포로 접종되었다. 보통, 직경이 60mm인 폴리스티렌 디쉬가 사용되고 디쉬당 1.5 x 106세포로 접종되고 약 7.2의 pH를 유지하기 위해 CO2 대기상에서 배양하였다. 배양배지가 제거되고 PBS 에 있는 orf 바이러스가 적절하게 희석된 용액 0.5ml 이 첨가되고 37℃에서 1시간 동안 배양되었다. 액체가 골고루 분산되었는 지를 확인하기 위해 15분 간격으로 디쉬가 기울여졌다. 이 시간 끝무렵에 접종이 제거되고 1% 아가로오스를 함유하는 성장배지가 첨가되었다. 용균반이 보통 보이게되는 시간인 5일후에, 1% 아가로오스 가 입혀진 디쉬에 X-gal 이 첨가되었고 색깔이 나타나게 12시간 더 배양하였다. 용균반 들을 하나씩 집어내 PBS 용액에 재현탁 시키고 2 X 105세포로 접종되고 기술된 것 처럼 전면으로 자란 부분적으로 배출된 세포배양 용기 안으로 접종되었다. 배지 1 ml이 각 웰에 첨가되었고 완벽한 세포병변 효과가 관찰될 때 까지 37℃에서 계속 배양하였다. 세포 배양용기는 그들이 해동된 바로 그 시간 후에 그 내용물이 얼려질 때 까지 -20℃ 에 놓았다. 세포 여액은 더욱 용균반을 정제하기 위해 바이러스 및 잡종 분자형성을 위한 바이러스 DNA의 원천으로 사용되었다. 바이러스 DNA는 Moyer,R.W. 및 Graves,R.L.(1981) 의 방법에 의해 BT 세포의 세포질 추출물로부터 제조되었다. 세포질 오소폭스바이러스(orthopoxvirus)DNA 복제의 기구. Cell.27,391-401. 분리된 DNA는 외래 유전자가 삽입되었나를 확인하기 위해 제한엔도뉴클레아제로 절단되었다. 빈번하게, 첫 번째 용균반 정제단계는 모든 야생형 바이러스를 제거하지 못하고 돌연변이된 바이러스의 순수 배양액을 얻기위해 연속적으로 용균반 정제과정을 수행한다. 대부분의 바이러스 배양액은 150cm2의 조직배양 플라스크 안에서 자라고 Robinson,A.J.,Ellis,G 및 Balassu,T.(1982)에서 기술된 방법에 의해 바이러스가 정제되었다. orf 바이러스의 유전체: 양에있는 orf의 병변으로부터 분리된 바이러스 DNA의 제한엔도뉴클레아제 분석. Arch Virol. 71, 43-55. DNA는 Balassu,T.C. 및 Robinson,A.J.(1987)에서 기술된 방법에 의해 정제된 바이러스 입자로부터 추출된다. 소의 고환세포에서 orf 바이러스 복제: 바이러스 DNA, 폴리펩티드 의 반응속도 및 전염성의 바이러스 생산 및 바이러스 입자 폴리펩티드의 분석. Arch Virol.97,267-281.
실시예 9 - Orf 바이러스 변형의 평가
형질전환감염 및 용균반 정제로부터 회수된 바이러스가 삽입된 유전자를 옮기기위해 변형되었는지의 여부를 결정하기 위해 DNA는 감염된 세포로부터 제조되었고, 당업계, 예를들면, Merchlinsky,M. 및 Moss,B.(1989) 에 잘 알려진 방법인 잡종분자형성 에 의해 검사되었다. 우두 바이러스 DNA 연쇄체 접합의 분획은 후기-유전자 발현을 필요로 한다. J Virol.63, 1595-1603. 이러한 시험을 하기위해 돌연변이된 orf 바이러스 DNA를 조제하는데 있어, PBS에 있는 orf 바이러스 감염된 BT 세포의 100 마이크로리터 분액이 대략 12,000g 에서 30분 동안 원심분리 되었다. 세포 소형 응집체는 50 마이크로리터의 0.15M NaCl, 20mM Tris, 10mM EDTA, pH8.0 안에서 재현탁 되었다. 적당한 농도(예: 0.5 mg/ml 의 프로티나제 K)에서 프로테아제를 함유하고 있는 20mM Tris, 10mM EDTA, 0.75% SDS 의 부피 250 마이크로리터가 각 시료에 첨가되었고 37℃에서 3시간 동안 배양되었다. 시료는 에탄올로 침전 시키기 전에 페놀:클로르폼(1:1)의 동등한 부피로 추출되었다. 원심분리후
에탄올로 침전시킨 DNA를 50 마이크로리터의 TE 용액에 다시 녹였다. 다양한 통과물로 부터 수거된 물질을 특이적인 x-gpt 표지물로 잡종 분자형성 반응을 시켰다. 통과 1처럼 초기에 2시간후 감염인 형질전환 감염을 위해 pVU-DL106 으로 양성 결과를 얻을수 있다. 재조합 바이러스에 있는 이형성 DNA 표지물질을 탐지하는데 사용된 대체절차는 외래 DNA 서열을 증폭시키기 위해 설계된 특수한 시발체를 이용한 효소 연쇄중합반응 에 의해 DNA 서열을 증폭 시키는 것이었다. 다른 형질전환 감염은 재조합 바이러스를 탐지하기 위해 더 다른 통과를 필요로 한다. 2시간에서 플라스미드 pVU-DL106 으로 수행된 형질전환 감염은 CPE 로 하여금 DNA-DNA 잡종 분자형성 반응에 의해서 결정된 것 처럼 x-gpt 유전자를 함유하는 돌연변이된 바이러스의 탐지 및 통과 3에서 3일후 접종에서 탐지되게 하였다. 색소생산 기질 5-브로모-4-클로로-3-인돌일-베타-D-갈락토시다제(X-gal)를 이용한 베타-갈락토시다제의 정성분석은 베타-갈락토시다제 유전자를 함유하는 돌연변이된 orf 바이러스를 탐지하는데 사용되었다.
실시예 10 - 오소폭스바이러스 AT1-지역에 일치하는 orf 바이러스 게놈의 지역 안으로 외래 유전자를 삽입하는데 적절한 벡터 플라스미드의 구성
RNA 폴리머레이스 소단위 유전자, rpo 132 및 추정되는 유전자 (H)11L 의 해독전사 프레임 사이의 유전자간 지역이 외래 DNA를 삽입할수 있는 적절한 표적 자리로서 동정되었다. 그 지역은 길이에 있어 90 뉴클레오티드이고 필수 유전자인 rpo 132 중의 어느 하나인 2개의 수렴하는 전사 구성성분 사이에 놓여있다. 플라스미드, PB-23△Sal 은 위치 178에 있는 PstI 자리에서 종료되고 도 5 에서 예시된 서열에서 보여진 위치 1 윗쪽의 서열화 되지않은 지역 안으로 신장되는 1.6 킬로베이스의 서열을 포함하고 PCR 클로닝 반응에서 주형으로 사용되었다. 1.0 Kb의 서열은 Bgl2, NsiI 및 ApoI 제한자리를 도입하는 현존하는 XhoI 제한자리 및 zxs-2 GTCAGATCTATGCATAAAAATTTCGCATCAGTCGAGATA (역순)를 포함하는 PB-23Sal에서 동정된 서열에 상보적인 시발체 zxs-1 GATCCCGCTCGAGAACTTCAA를 이용해 그것으로부터 증폭되었다. 증폭된 단편은 1% 아가로오스 겔상에서 전기영동 으로 정제되었고 제한엔도뉴클레아제 XhoI 및 BglⅡ 로 절단되었다. 정제된 단편은 플라스미드 pTvec1을 만드는 대응하는 XhoI 및 BglⅡ에서 플라스미드 pSP-70 안으로 연결되었다. 또한 이 클로닝 절차는 벡터 안으로 폭스바이러스 전사 종료 신호(5TNT)를 도입한다.
뉴클레오티드 위치 66 과 1069 사이에 위치한 서열로 구성되는 두 번째 단편은 BamHI 제한자리를 도입하는 zxs-4 GACGGATCCGTATAATGGAAAGATTC (역순) 및 NsiI, NcoI 및 EcoRI 제한자리를 도입하는 시발체 zxs-3 GACATGCATCAGTGCCATGGAATTCTCGCGACTTTCTAGC (앞쪽) 로 증폭 되었다. 증폭된 단편은 제한엔도뉴클레아제 BamHI 및 NsiI 로 절단되었고 첫 번째 단편에서 했던 것과 똑같은 방식으로 정제되었다. 정제된 단편은 그때 NsiI 및 Bgl2 로 절단된 pTvec1 안으로 클로닝 되었다. 그 결과물인 pTvec50 은 또 다른 클로닝 절차에 이용될수 있는 연속적인 제한 자리와 전사 종료 신호를 포함한다. 이 제한자리 들은 ApoI, NsiI, NcoI 및 EcoRI 이다. 시발체의 서열, 제한자리 및 변형된 유전자간 지역의 서열은 도 20A 및 20B 에 보여진다. ptvec50 을 구성하는데 있어 포함되는 클로닝 절차가 도 21 에 예시된다.
orf 바이러스 후기 프로모터 PF1L 의 제어하에 있는 lacZ 유전자는 EcoRI 으로 플라스미드 pVUsp-PF2lac 밖으로 절단 되었다. 단편은 겔 상에서 정제 되었고 pTvec50 의 EcoRI 자리 안으로 연결되었다. 두 개의 가능한 정위에 있는 lacZ 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드가 회수되었고 pTvec50lac-1 및 pTvec50lac-2 로 명명되었다. pTvec50lac-1 및 pTvec50lac-2 를 구성하는데 포함된 클로닝 절차가 도 22 에 예시된다. 이것은 rpo 132 의 해독전사 프레임과 도 5 에서 보여진 (H)11L 사이에 있는 유전자간 자리 안으로 외래 유전자 lacZ를 도입하도록 설계된 전이 벡터의 구성을 완성했다.
본 실시예에서 xgpt 유전자는 전이 벡터안에 포함되지 않았고 미코피놀릭 산의 존재에서 증식해 xgpt를 발현하는 재조합 orf 바이러스의 연속적인 선택은 선택방법 으로서 사용될수 없었다. 바이러스 재조합체는 ATI 지역에 삽입을 포함하는 재조합체를 동정하는 기본적인 방법으로서 lacZ 발현을 이용해서 선택된다.
실시예 8에 기술된 방법중에서 다음과 같은 변이가 사용된다.
일차 소의 고환(BT) 세포는 락트알부민 가수분해물(5g/L) 및 5% 송아지 태아혈청 으로 보충된 Eagle's 최소 필수 배지(MEM); (Sigma Cat.No.Mo643) 에 있는 단층 배양액에서 자랐다. 감염되기 전에 세포성장 배지는 제거되었고 세포는 잔여 혈청을 제거하기 위해 PBS 용액으로 간단하게 세척했다. 세포는 1시간동안 바이러스로 하여금 흡수하게 하고 orf 바이러스, 균주 NZ-2,(moi 0.05-0.1) 로 감염되었다. 세포단층은 흡수되지 않은 바이러스 및 잔여 송아지 태아 혈청을 제거하기 위해 opti-MEM 혈청이 없는 배지,(Life Technologies Inc,Gaithersburg,MD,U.S.A) 로 2번 세척되었다. 제조자의 지침에 따라 10 마이크로리터 리포펙틴 반응물질을 함유하는 opti-MEM 부피 1.0ml(Life Technologies Inc,Gaithersburg,MD,U.S.A) 및 대략 희석된 2.0 마이크로 그램 플라스미드 DNA 가 각 플라스크에 첨가되고 밤새 배양되었다. 밤새 흡수시킨 후에, 2% 송아지 태아 혈청을 함유하는 5.0ml 선택배지가 첨가되고 대략 감염후 3-5일에 세포병변 효과(CPE)가 관찰될 때 까지 계속 배양하였다.
세포 단층은 플라스크 로부터 긁어져서 저속 원심분리로 원심분리 튜브의 밑바닥에 침전되고, PBS로 세척해서 PBS 용액에 재 현탁시킨다. 재현탁된 세포들은 냉동 및 해동의 3 싸이클을 거치고 간단하게 초음파 처리한다. 수거된 배양액의
바이러스 역가가 결정되고 대략 디쉬당 2000 바이러스 용균반을 주도록 계산된 희석에서 BT 세포가 있는 신선한 디쉬상에 그 물질을 깔았다. 충분한 물질이 50,000 용균반(25 디쉬)을 스크리닝 하기위해 깔리어졌다. 감염된 단층은 1% 아가로오스 막 아래서 자랐고, 용균반이 보이게 될 때 5일간 배양을 한 후에 1% 아가로오스 막 안에 있는 X-gal이 디쉬에 첨가되었고 색깔을 나타내기 위해 12시간 더 배양하였다. 이 단계에서, 어떤 색깔을 나타낸 용균반을 집어내 실시예 8에서 기술된 대로 처리되었다. lacZ (+) 바이러스의 순수 배양액이 얻어 질때까지 깔고, 단일 용균반을 집어내고 색깔있는 용균반이 나타나는 싸이클을 반복해서 수행하여 재조합 바이러스를 더욱 정제한다.
본 발명의 출원
본 발명에 따라 외생 DNA를 함유하는 제공된 파라폭스바이러스 벡터, 특히 orf 바이러스 벡터가 있다. 외생 DNA 는 면역반응을 유도할수 있는 항원을 암호화 하거나 또는 발현되는 것이 바람직한 이형성 폴리펩티드를 암호화 한다. 그러므로, 본 발명의 벡터들은 이형성 펩티드 및 항원을 발현하는 특이한 출원이다. 항원을 발현하는 능력은 이러한 벡터들을 특이하게 벡터에 사용하는데 적절하게 만들어 준다.
Orf 바이러스 벡터는 우두 바이러스 벡터보다 많은 장점을 갖고 있다. Orf 바이러스는 우두와 비교했을 때 비교적 좁은 숙주범위를 갖고 있다. 이것은 우두 에게 종간에 감염될 위험 및 질병의 퍼짐을 감소시킨다. 또 다른 장점은 orf 바이러스는 열반응 및 병변의 위험을 감소시켜, 인간에 있어 우두 보다 덜 유해하다.
상기 기술은 단지 실시예에 의해 제공되고 본 발명은 첨부된 청구범위의 범주에 단지 제한된다는 사실이 당 업계에 의해 인정될 것이다.
[참고 문헌]
Claims (25)
- 외생 DNA를 포함하는 파라폭스 바이러스로 구성되는 것을 특징으로 하는 파라폭스바이러스 벡터.
- 제 1 항에 있어서, 파라폭스 바이러스는 orf 바이러스 인 것을 특징으로 하는 벡터.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 외생 DNA 는 최소한 하나의 유전자 산물에서 암호화 하는 것을 특징으로 하는 벡터.
- 제 3 항에 있어서, 암호화된 하나의 유전자 산물은 면역반응을 유도할수 있는 항원인 것을 특징으로 하는 벡터.
- 제 4 항에 있어서, HIV 외피 단백질, 헐피스 심플렉스 바이러스 당단백질(herpes simplex virus glycoprotein), Taenia ovis, Echinococcus granulosis 항원, Trichostronglylus 항원, Haemonchus 항원, Ostertagia 항원 및 그것의 조합체로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 벡터.
- 제 5 항에 있어서, 항원은 Taenia ovis 45W, 16kd, 18kd 항원 및 그것의 조합체로 구성되는 그룹으로부터 선택된 Taenia ovis 항원인 것을 특징으로 하는 벡터.
- 제 3 항 내지 제 6 항에 있어서, 외생 DNA 는 생물학적 작용인자 분자인 최소한 하나의 생산물을 더 암호화 하는 것을 특징으로 하는 벡터.
- 제 7 항에 있어서, 생물학적 작용인자 분자는 감마 인터페론, IL-1, IL-2, IL-β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12 및 그것의 조합체로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 벡터.
- 제 8 항에 있어서, 생물학적 작용인자 분자는 IL-1, IL-2, IL-12 및 그것의 조합체로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 벡터.
- 제 3 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 외생 DNA는 천연 바이러스 단백질과의 잡종 또는 키메라 단백질로 발현된 최소한 하나의 펩티드 부분을 더 암호화 하는 것을 특징으로 하는 벡터.
- 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 외생 DNA 는 바이러스 염색게놈의 하나 또는 그이상의 비 필수 지역에 포함되는 것을 특징으로 하는 벡터.
- 제 11 항에 있어서, 비 필수 지역은 수반되는 도 2,3,5 및 7에서 동정된 비 필수 지역으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 벡터.
- 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, 비 필수 지역은 도 5의 서열에서 핵산 11에서 16까지 또는 도 9의 서열에서 핵산 2226에서 2286까지 인 것을 특징으로 하는 벡터.
- 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 외생 DNA 는 폭스바이러스 프로모터의 제어하에 있는 것을 특징으로 하는 벡터.
- 제 14 항에 있어서, 폭스바이러스 프로모터는 orf 바이러스 프로모터인 것을 특징으로 하는 벡터.
- 제 15 항에 있어서, orf 바이러스 프로모터는 도 10에서 설명된 E1L, F1L 및 F3L 로 구성되는 그룹 으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 벡터.
- 제 3 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 외생 DNA 는 리포터 유전자를 더 암호화 하는 것을 특징으로 하는 벡터.
- 제 3 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 외생 DNA 는 선택성 마커를 더 암호화 하는 것을 특징으로 하는 벡터.
- 제 4 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항의 벡터의, 그것에 대등한 면역 활성도를 갖는 것을 특징으로 하는 단편 또는 변이체.
- 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 따르는, 바이러스 벡터 또는 제 19항의 그것의 단편 또는 변이체로 구성되는 것을 특징으로 하는 백신.
- 제 20 항에 있어서, 더욱이 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 면역 보강제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
- 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
- 제 22 항에 있어서, 진핵생물 세포 인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
- 제 22 항 또는 제 23 항에 있어서, 소의 고환 세포 또는 양의 고환 세포 인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
- 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항의 벡터를 orf 바이러스로 감염된 선택된 숙주세포 안으로 트랜스펙션시키는 단계, 재조합 바이러스를 선택하는 단계 그리고 선택된 바이러스를 선택적으로 정제하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 재조합 파라폭스바이러스 벡터를 생산하는 방법.
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