JPH0761955B2 - 凍結乾燥ａ型肝炎ワクチン - Google Patents
凍結乾燥ａ型肝炎ワクチンInfo
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- JPH0761955B2 JPH0761955B2 JP63106749A JP10674988A JPH0761955B2 JP H0761955 B2 JPH0761955 B2 JP H0761955B2 JP 63106749 A JP63106749 A JP 63106749A JP 10674988 A JP10674988 A JP 10674988A JP H0761955 B2 JPH0761955 B2 JP H0761955B2
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- hepatitis
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- dried
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
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- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、Ａ型肝炎ワクチンの凍結乾燥製剤に関する。
さらに詳しくは、組織培養法により得られたウイルスを
精製し、不活化後、安定化剤の存在下で凍結乾燥を行う
ことを特徴とするＡ型肝炎ワクチンの凍結乾燥製剤を提
供するものである。
さらに詳しくは、組織培養法により得られたウイルスを
精製し、不活化後、安定化剤の存在下で凍結乾燥を行う
ことを特徴とするＡ型肝炎ワクチンの凍結乾燥製剤を提
供するものである。
発明の背景 Ａ型肝炎は、Ａ型肝炎ウイルス（以下、HAVと略称す
る）によって起こり、疫学的にも、臨床的にも非常に重
要な感染症であり、いまだ有効な治療対策が見い出され
ていない。そのため、このようなＡ型肝炎に対してもっ
ぱら予防法が検討されており、現在はグロブリン製剤を
２〜３カ月おきに投与することが行われている。しか
し、グロブリン製剤中の抗HAV抗体力価の低下の問題や
頻回投与の必要性のため、ワクチンの開発が望まれてき
たが、まだ実用化されるまでには至っていない。
る）によって起こり、疫学的にも、臨床的にも非常に重
要な感染症であり、いまだ有効な治療対策が見い出され
ていない。そのため、このようなＡ型肝炎に対してもっ
ぱら予防法が検討されており、現在はグロブリン製剤を
２〜３カ月おきに投与することが行われている。しか
し、グロブリン製剤中の抗HAV抗体力価の低下の問題や
頻回投与の必要性のため、ワクチンの開発が望まれてき
たが、まだ実用化されるまでには至っていない。
ところで、Ａ型肝炎ワクチンは、HAVの常在地域への渡
航者の感染を防止する効果を有していると共に、世界中
いたるところで起こる散発性Ａ型肝炎の二次感染を防止
する効果を有している。これらの背景から、Ａ型肝炎ワ
クチン製剤は日本国内はもとより、広く世界各地におい
て使用可能であることが必要である。すなわち、安定性
がすぐれ、長期保存に充分に耐え得る製剤の提供は必須
の条件である。
航者の感染を防止する効果を有していると共に、世界中
いたるところで起こる散発性Ａ型肝炎の二次感染を防止
する効果を有している。これらの背景から、Ａ型肝炎ワ
クチン製剤は日本国内はもとより、広く世界各地におい
て使用可能であることが必要である。すなわち、安定性
がすぐれ、長期保存に充分に耐え得る製剤の提供は必須
の条件である。
本発明者らは、Ａ型肝炎患者の糞便より樹立されたHAV
KRM003株とHAV感受性細胞を用いた組織培養によるウイ
ルスを原料としてワクチンの開発を試みてきた。（第33
回日本ウイルス学会抄録 257頁、（1985）） 通常、液状ワクチンには防腐剤が加えられており、一般
的には広い抗菌スペクトルを有するチメロサールが加え
られている。ところが、本発明者らはワクチン開発中
に、精製HAV抗原にチメロサールを加えるとHAV抗原活性
が低下する現象を見い出した。（第35回日本ウイルス学
会総会抄録 234頁、（1987））さらに、あらかじめ精製
HAV抗原にエチレンジアミン四酢酸（以下、EDTAと略称
する）を加えておくと抗原活性の低下が抑えられること
より、前述の現象はチメロサール中の２価の水銀イオン
に起因するものと考えられた。しかしながら、EDTA添加
はある程度効果は認められるものの完全ではなく、ま
た、EDTAの添加は注射時に痛みを伴うことより、該EDTA
を含まない凍結乾燥製剤が好ましいと考えられた。しか
し、通常の液状製剤にみられるような条件下でそのまま
凍結乾燥を行うと、乾燥の過程において力価が低下する
欠点が生じることが判明した。
KRM003株とHAV感受性細胞を用いた組織培養によるウイ
ルスを原料としてワクチンの開発を試みてきた。（第33
回日本ウイルス学会抄録 257頁、（1985）） 通常、液状ワクチンには防腐剤が加えられており、一般
的には広い抗菌スペクトルを有するチメロサールが加え
られている。ところが、本発明者らはワクチン開発中
に、精製HAV抗原にチメロサールを加えるとHAV抗原活性
が低下する現象を見い出した。（第35回日本ウイルス学
会総会抄録 234頁、（1987））さらに、あらかじめ精製
HAV抗原にエチレンジアミン四酢酸（以下、EDTAと略称
する）を加えておくと抗原活性の低下が抑えられること
より、前述の現象はチメロサール中の２価の水銀イオン
に起因するものと考えられた。しかしながら、EDTA添加
はある程度効果は認められるものの完全ではなく、ま
た、EDTAの添加は注射時に痛みを伴うことより、該EDTA
を含まない凍結乾燥製剤が好ましいと考えられた。しか
し、通常の液状製剤にみられるような条件下でそのまま
凍結乾燥を行うと、乾燥の過程において力価が低下する
欠点が生じることが判明した。
発明の目的 本発明者らは、上記のような問題点を解決すべく鋭意検
討を重ねた結果、抗原力価の低下や性状の悪化を伴わず
に凍結乾燥することを可能ならしめ、かつ乾燥品の保存
安定性も液状製剤に比して格段に良好となる凍結乾燥の
条件と、安定化のための製剤の配合組成とを見い出すこ
とにより本発明を完成した。
討を重ねた結果、抗原力価の低下や性状の悪化を伴わず
に凍結乾燥することを可能ならしめ、かつ乾燥品の保存
安定性も液状製剤に比して格段に良好となる凍結乾燥の
条件と、安定化のための製剤の配合組成とを見い出すこ
とにより本発明を完成した。
発明の構成および効果 本発明に用いるＡ型肝炎ウイルスは、組織培養より得ら
れたウイルスが使用される。HAVは長い間培養細胞で増
殖出来なかったが、1979年に至りようやくProvostとHil
leman（Provost,P.J.et al.,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,1
60,213,（1979））による初の成功が報告された。彼ら
はムネアカハラタマリンを使ってHAVの継代を行い、肝
臓から抽出したウイルスをムネアカハラタマリンの肝臓
の培養切片に接種し、初めてHAVが増殖するのを確かめ
るとともにアカゲザルの胎児の腎培養細胞（FRhk6）で
も増殖することを発見した。その後世界各地でいろいろ
な培養細胞を用いて追試された結果、原発生肝癌由来の
培養細胞（Alexander hepatomacell）（Frosner,G.G.et
al.,Infection ７,303（1979））、Vero細胞（Locarni
ni,S.A.et al,J.Virol.,37,216,（1981））、アフリカ
ミドリザル腎初代培養細胞（Daemer,R.J.et al.,Infec
t.Immun.,32,388,（1981））などでも増殖することが確
かめられた。本発明者らは、アフリカミドリザル腎培養
細胞によりコロニー培養法によるクローニングによって
樹立されたHAV高産生細胞株GL−37細胞と、同じくＡ型
肝炎患者の糞便より分離しGL−37細胞に感受性のすぐれ
ているHAV株KRM003株を用いた組織培養により、大量いH
AVを得ることができた。
れたウイルスが使用される。HAVは長い間培養細胞で増
殖出来なかったが、1979年に至りようやくProvostとHil
leman（Provost,P.J.et al.,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,1
60,213,（1979））による初の成功が報告された。彼ら
はムネアカハラタマリンを使ってHAVの継代を行い、肝
臓から抽出したウイルスをムネアカハラタマリンの肝臓
の培養切片に接種し、初めてHAVが増殖するのを確かめ
るとともにアカゲザルの胎児の腎培養細胞（FRhk6）で
も増殖することを発見した。その後世界各地でいろいろ
な培養細胞を用いて追試された結果、原発生肝癌由来の
培養細胞（Alexander hepatomacell）（Frosner,G.G.et
al.,Infection ７,303（1979））、Vero細胞（Locarni
ni,S.A.et al,J.Virol.,37,216,（1981））、アフリカ
ミドリザル腎初代培養細胞（Daemer,R.J.et al.,Infec
t.Immun.,32,388,（1981））などでも増殖することが確
かめられた。本発明者らは、アフリカミドリザル腎培養
細胞によりコロニー培養法によるクローニングによって
樹立されたHAV高産生細胞株GL−37細胞と、同じくＡ型
肝炎患者の糞便より分離しGL−37細胞に感受性のすぐれ
ているHAV株KRM003株を用いた組織培養により、大量いH
AVを得ることができた。
上記の方法により得られたHAVは、ポリエチレンクリコ
ール分画、超遠心、有機溶媒処理、酵素処理、ゲルろ過
等の生物学的活性物質の分離精製に用いられる方法の組
合せにより、高度に精製して精製標品とし、ホルマリン
にて不活化した後、本発明の凍結乾燥ワクチン製剤化に
供する。
ール分画、超遠心、有機溶媒処理、酵素処理、ゲルろ過
等の生物学的活性物質の分離精製に用いられる方法の組
合せにより、高度に精製して精製標品とし、ホルマリン
にて不活化した後、本発明の凍結乾燥ワクチン製剤化に
供する。
得られた不活化HAV抗原精製標品を用い凍結乾燥に供す
るには、中性付近の適当な濃度のバッファー（例えば0.
01Mリン酸バッファー）中で、また好ましくはTween 80
を0.002V/V％になるよう添加したバッファー中で、HAV
および各添加物質の組成が次のようになるよう調整され
る。
るには、中性付近の適当な濃度のバッファー（例えば0.
01Mリン酸バッファー）中で、また好ましくはTween 80
を0.002V/V％になるよう添加したバッファー中で、HAV
および各添加物質の組成が次のようになるよう調整され
る。
すなわち、HAV抗原は蛋白質濃度として0.05W/V％以下、
好ましくは0.002W/V％以下含有される。添加される安定
化剤としては、塩基性アミノ酸またはその塩、酸性
アミノ酸またはその塩及び糖及び／または糖アルコー
ルが単独が含有される。
好ましくは0.002W/V％以下含有される。添加される安定
化剤としては、塩基性アミノ酸またはその塩、酸性
アミノ酸またはその塩及び糖及び／または糖アルコー
ルが単独が含有される。
塩基性アミノ酸としてはアルギニン及びリジンなどが挙
げられ、通常0.1〜2.0W/V％の濃度で凍結乾燥に供され
るHAV抗原含有液中に存在させる。また、酸性アミノ酸
としてはグルタミン酸が挙げられ、通常0.1〜2.0W/V％
の濃度で凍結乾燥に供されるHAV抗原含有液中に存在さ
せる。また、グリシン、アラニン等のその他のアミノ酸
を含有していてもよい。
げられ、通常0.1〜2.0W/V％の濃度で凍結乾燥に供され
るHAV抗原含有液中に存在させる。また、酸性アミノ酸
としてはグルタミン酸が挙げられ、通常0.1〜2.0W/V％
の濃度で凍結乾燥に供されるHAV抗原含有液中に存在さ
せる。また、グリシン、アラニン等のその他のアミノ酸
を含有していてもよい。
糖または糖アルコールとしては、ラクトース、グルコー
ス、キシロース、ガラクトース、フルクトース、マルト
ース、サッカロース等の単糖類もしくは二糖類、ソルビ
ット、マンニット、キシリット等の糖アルコールが挙げ
られ、これらの１種もしくは２種以上を用い、通常、0.
1〜15W/V％の濃度で存在させる。また、膠質剤としては
ゼラチン、ヒトアルブミン、デキストラン等が挙げら
れ、通常0.01〜0.1W/V％の濃度で存在させる。
ス、キシロース、ガラクトース、フルクトース、マルト
ース、サッカロース等の単糖類もしくは二糖類、ソルビ
ット、マンニット、キシリット等の糖アルコールが挙げ
られ、これらの１種もしくは２種以上を用い、通常、0.
1〜15W/V％の濃度で存在させる。また、膠質剤としては
ゼラチン、ヒトアルブミン、デキストラン等が挙げら
れ、通常0.01〜0.1W/V％の濃度で存在させる。
さらに凍結乾燥ワクチンの使用時、溶解した際に生理的
に等張となるようにするため中性塩を添加する。中性塩
としては塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシ
ウムが含まれるが、好ましくは塩化ナトリウムでこれに
適宜、上記他の中性塩が添加される。これらの中性塩は
0.1〜3W/V％程度、通常0.5〜2W/V％程度の濃度で含まれ
る。凍結乾燥に供すべく調製されたワクチン液は、所要
の包装単位に従い適宜0.1μｇ〜10μｇのHAV抗原を含む
ように小分容器に分注する。この分注液は、急速凍結乾
燥または緩速凍結乾燥し、凍結乾燥製剤とする。凍結乾
燥の条件としては、例えば−50℃、常圧にて予備凍結を
６時間行い、次に圧力を0.008 Torrに下げ、設定温度を
−15℃から０℃に段階的に上げ、50時間１次乾燥を行
う。この時点での製品温度は０℃程度である。次に25℃
設定温度にて圧力0.008 Torrで20時間２次乾燥を行う。
に等張となるようにするため中性塩を添加する。中性塩
としては塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシ
ウムが含まれるが、好ましくは塩化ナトリウムでこれに
適宜、上記他の中性塩が添加される。これらの中性塩は
0.1〜3W/V％程度、通常0.5〜2W/V％程度の濃度で含まれ
る。凍結乾燥に供すべく調製されたワクチン液は、所要
の包装単位に従い適宜0.1μｇ〜10μｇのHAV抗原を含む
ように小分容器に分注する。この分注液は、急速凍結乾
燥または緩速凍結乾燥し、凍結乾燥製剤とする。凍結乾
燥の条件としては、例えば−50℃、常圧にて予備凍結を
６時間行い、次に圧力を0.008 Torrに下げ、設定温度を
−15℃から０℃に段階的に上げ、50時間１次乾燥を行
う。この時点での製品温度は０℃程度である。次に25℃
設定温度にて圧力0.008 Torrで20時間２次乾燥を行う。
この凍結乾燥製剤は、その組成として少なくとも組織培
養由来HAV抗原、安定化剤、中性塩を含有する。
養由来HAV抗原、安定化剤、中性塩を含有する。
かくして得られた製剤は、力価の低下がなく、その保存
安定性がよく、使用時の溶解性が速やかで極めて優れた
Ａ型肝炎ワクチンの凍結乾燥製剤である。
安定性がよく、使用時の溶解性が速やかで極めて優れた
Ａ型肝炎ワクチンの凍結乾燥製剤である。
以下、本発明の効果を実施例及び参考例によりさらに詳
細に説明する。
細に説明する。
参考例１ HAVの培養 GL−37細胞を10V/V％牛血清添加イーグル−MEM培地で７
日間培養し、細胞シートを形成させる。0.01Mリン酸バ
ッファーで洗浄後、0.05W/V％トリプシン、0.02W/V％ED
TA添加0.01Mリン酸バッファーにて細胞をはがし、牛胎
児血清（以下FBSと略称する）を添加し、1000rpmで３分
間遠心してトリプシン溶液を除く。細胞沈査を8V/V％FB
R添加Ｅ−MEM培地にて浮遊させ、この浮遊液にM.O.I
（細胞当りのウイルス感染価）0.1になるように種ウイ
ルス液を感染させ、37℃１時間吸着後８％FBR添加Ｅ−M
EM培地を加えて３〜４倍拡張し、３週間培養する。
日間培養し、細胞シートを形成させる。0.01Mリン酸バ
ッファーで洗浄後、0.05W/V％トリプシン、0.02W/V％ED
TA添加0.01Mリン酸バッファーにて細胞をはがし、牛胎
児血清（以下FBSと略称する）を添加し、1000rpmで３分
間遠心してトリプシン溶液を除く。細胞沈査を8V/V％FB
R添加Ｅ−MEM培地にて浮遊させ、この浮遊液にM.O.I
（細胞当りのウイルス感染価）0.1になるように種ウイ
ルス液を感染させ、37℃１時間吸着後８％FBR添加Ｅ−M
EM培地を加えて３〜４倍拡張し、３週間培養する。
この間１週間に１回、2V/V％FBS添加Ｅ−MEM培地にて培
地交換を行う。３週間後、培地を吸引除去し、続いて0.
01Mリン酸バッファーにて２回細胞を洗浄後、1V/V％NP
−40（半井化学社製）を含む可溶化液をローラーボトル
１本（容量約２）当り15ml加え37℃１時間反応させ、
HAV感染細胞を可溶化する。可溶化液を3000rmp30分間遠
心し、上清を集める。この上清液にはHAV抗原が３〜６
μg/mlの濃度で含まれている。
地交換を行う。３週間後、培地を吸引除去し、続いて0.
01Mリン酸バッファーにて２回細胞を洗浄後、1V/V％NP
−40（半井化学社製）を含む可溶化液をローラーボトル
１本（容量約２）当り15ml加え37℃１時間反応させ、
HAV感染細胞を可溶化する。可溶化液を3000rmp30分間遠
心し、上清を集める。この上清液にはHAV抗原が３〜６
μg/mlの濃度で含まれている。
参考例２ HAVの精製 上記上清液に最終濃度が7W/V％になるようにポリエチレ
ングリコール6000（和光純薬社製）を加えて４℃に置
く。一夜後にこのポリエチレングリコール添加溶液を80
00rmpで30分間遠心し上清を捨て、沈査に1V/V％NP40を
含む可溶化バッファーを加えて再懸濁し、HAV抗原を回
収する。さらに、このHAV抗原液を25000rpm16時間遠心
し上清をすて、開始時の1/5〜1/10量の0.01Mリン酸バッ
ファーを加えて沈査を完全に再溶解し、４℃に一夜置
く。次に超音波処理し、15000rpm15分間遠心後上清を集
める。この上清には通常15〜60μg/mlのHAV抗原が含ま
れる。この上清に等量のクロロホルムを加え室温で15〜
30分間抽出処理する。2000rpm30分間遠心し、上層にあ
る水溶液を集め軽く撹拌しながら陰圧脱気して残存する
クロロホルムを除く。
ングリコール6000（和光純薬社製）を加えて４℃に置
く。一夜後にこのポリエチレングリコール添加溶液を80
00rmpで30分間遠心し上清を捨て、沈査に1V/V％NP40を
含む可溶化バッファーを加えて再懸濁し、HAV抗原を回
収する。さらに、このHAV抗原液を25000rpm16時間遠心
し上清をすて、開始時の1/5〜1/10量の0.01Mリン酸バッ
ファーを加えて沈査を完全に再溶解し、４℃に一夜置
く。次に超音波処理し、15000rpm15分間遠心後上清を集
める。この上清には通常15〜60μg/mlのHAV抗原が含ま
れる。この上清に等量のクロロホルムを加え室温で15〜
30分間抽出処理する。2000rpm30分間遠心し、上層にあ
る水溶液を集め軽く撹拌しながら陰圧脱気して残存する
クロロホルムを除く。
さらに終濃度で20μg/mlのRNaseA（シグマ社製）を加
え、37℃、１時間処理し、次に5mM塩化マグネシウムと2
0〜40μg/mlのDNase 1（宝酒造社製）を加えて37℃で３
時間処理する。その後、50μg/mlになるようProteinase
K（メルク社製）を加えてさらに37℃、１時間処理す
る。2.5Mリン酸バッファーpH7.5、エトキシエタノール
とブトキシエタノールの2:1混液をそれぞれ１容及び0.8
容加え軽く混和し、2000rpm10分間遠心し中間層をと
り、2mM EDTA、0.002％ Tween 80（和光純薬社製）添加
0.01Mリン酸バッファー（pH7.4）で200〜300μg/mlの抗
原濃度になる様に溶解する。この有機溶媒処理操作を１
〜２回繰り返す。この溶液をセファクリルS400HR（ファ
ルマシア社製）によるゲルろ過により最終精製抗原液を
得る。最終精製抗原液は50〜100μg/mlの濃度であり、T
CA（トリクロロ酢酸）ローリー法にて測定した全蛋白量
に対するHAV抗原蛋白量の割合は90〜100％を示す。
え、37℃、１時間処理し、次に5mM塩化マグネシウムと2
0〜40μg/mlのDNase 1（宝酒造社製）を加えて37℃で３
時間処理する。その後、50μg/mlになるようProteinase
K（メルク社製）を加えてさらに37℃、１時間処理す
る。2.5Mリン酸バッファーpH7.5、エトキシエタノール
とブトキシエタノールの2:1混液をそれぞれ１容及び0.8
容加え軽く混和し、2000rpm10分間遠心し中間層をと
り、2mM EDTA、0.002％ Tween 80（和光純薬社製）添加
0.01Mリン酸バッファー（pH7.4）で200〜300μg/mlの抗
原濃度になる様に溶解する。この有機溶媒処理操作を１
〜２回繰り返す。この溶液をセファクリルS400HR（ファ
ルマシア社製）によるゲルろ過により最終精製抗原液を
得る。最終精製抗原液は50〜100μg/mlの濃度であり、T
CA（トリクロロ酢酸）ローリー法にて測定した全蛋白量
に対するHAV抗原蛋白量の割合は90〜100％を示す。
参考例３ 不活化 精製ウイルス液を0.002V/V％ Tween 80及び0.14M塩化ナ
トリウム添加0.01Mリン酸バッファー（pH7.5）にてウイ
ルス濃度が20μg/mlになるように希釈して無菌ろ過す
る。0.002V/V％ Tween 80添加0.01Mリン酸バッファー
（pH7.5）を用い1:2000希釈したホルマリンと等量混合
し37℃に12日間置く。途中８日目と12日目終了後に再度
無菌ろ過する。不活化を完了したウイルス液は４℃に保
存する。
トリウム添加0.01Mリン酸バッファー（pH7.5）にてウイ
ルス濃度が20μg/mlになるように希釈して無菌ろ過す
る。0.002V/V％ Tween 80添加0.01Mリン酸バッファー
（pH7.5）を用い1:2000希釈したホルマリンと等量混合
し37℃に12日間置く。途中８日目と12日目終了後に再度
無菌ろ過する。不活化を完了したウイルス液は４℃に保
存する。
参考例４ 凍結乾燥 参考例３で調製した不活化精製抗原液に、アミノ酸とし
て0.1W/V％アルギニン塩酸塩と0.1W/V％グルタミン酸ナ
トリウムを、糖として5W/V％ラクトースと1W/V％ソルビ
ットを添加してHAV抗原が最終的に１μg/mlの濃度にな
るように0.002W/V％ Tween 80添加0.01Mリン酸バッファ
ー（pH7.5）にてワクチン液を調製した。このワクチン
液0.5mlを2mlバイアルに入れ、−50℃常圧にて６時間予
備凍結後圧力を0.008Torrに下げ、設定温度を−15℃か
ら０℃に段階的に上げて50時間１次乾燥し、次いで25℃
にて圧力0.008Torrで20時間２次乾燥して凍結乾燥品を
得る。
て0.1W/V％アルギニン塩酸塩と0.1W/V％グルタミン酸ナ
トリウムを、糖として5W/V％ラクトースと1W/V％ソルビ
ットを添加してHAV抗原が最終的に１μg/mlの濃度にな
るように0.002W/V％ Tween 80添加0.01Mリン酸バッファ
ー（pH7.5）にてワクチン液を調製した。このワクチン
液0.5mlを2mlバイアルに入れ、−50℃常圧にて６時間予
備凍結後圧力を0.008Torrに下げ、設定温度を−15℃か
ら０℃に段階的に上げて50時間１次乾燥し、次いで25℃
にて圧力0.008Torrで20時間２次乾燥して凍結乾燥品を
得る。
実施例１ 参考例３で調製した不活化精製抗原液を液状にて37℃に
おける保存安定製試験を実施した。溶液中のHAV抗原の
力価をELISA法により測定し、調製後の抗原力価を１と
した時の抗原力価の相対値で示した。結果を第１表に示
す。
おける保存安定製試験を実施した。溶液中のHAV抗原の
力価をELISA法により測定し、調製後の抗原力価を１と
した時の抗原力価の相対値で示した。結果を第１表に示
す。
実施例２ 参考例３で調製したワクチン液を2mlバイアルに0.5mlず
つ分注し、様々な組成で凍結乾燥を行い、37℃における
保存安定性試験を実施した。結果を第２表に示す。
つ分注し、様々な組成で凍結乾燥を行い、37℃における
保存安定性試験を実施した。結果を第２表に示す。
実施例３ 参考例４に記したものと同様の方法によって得られた凍
結乾燥品の、保存安定性試験を実施した。凍結乾燥後の
抗原力価を１とした時の抗原力価の相対値で示した。結
果を第３表に示す。
結乾燥品の、保存安定性試験を実施した。凍結乾燥後の
抗原力価を１とした時の抗原力価の相対値で示した。結
果を第３表に示す。
実施例４ 参考例３で調製したワクチン原液と参考例４で調製した
凍結乾燥ワクチンをDDYマウスを用いて免疫原性を比較
した。HAV抗原量200ng、100ng、50ng、25ngの接種量で
各10匹ずつのDDYマウス腹腔内に接種した。６週間後採
血し、その血漿について、抗HAV抗体価をHAV抗原プレー
トとパーオキシダーゼラベル抗HAVウサギ血清を用いた
競合抑制ELISA法により測定した。その結果を第４表に
示す。
凍結乾燥ワクチンをDDYマウスを用いて免疫原性を比較
した。HAV抗原量200ng、100ng、50ng、25ngの接種量で
各10匹ずつのDDYマウス腹腔内に接種した。６週間後採
血し、その血漿について、抗HAV抗体価をHAV抗原プレー
トとパーオキシダーゼラベル抗HAVウサギ血清を用いた
競合抑制ELISA法により測定した。その結果を第４表に
示す。
各抗原量接種における原液接種の場合の平均抗体価を１
としたときの凍結乾燥ワクチン接種の場合の平均抗体価
の相対値の平均で示した。
としたときの凍結乾燥ワクチン接種の場合の平均抗体価
の相対値の平均で示した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 47/42 Ｊ (72)発明者 戸塚 敦子 東京都昭島市玉川町５―16―２―107 (72)発明者 佐藤 征他 新潟県新津市秋葉３―18―５ (72)発明者 森田 迪夫 千葉県千葉市千城台東１―10―４ (72)発明者 水野 喬介 熊本県熊本市龍田町上立田1725―１ (56)参考文献 特開 昭55−48389（ＪＰ，Ａ) 特公 昭45−18877（ＪＰ，Ｂ１)
Claims (8)
- 【請求項１】組織培養により得られ精製され不活化され
たＡ型肝炎ウイルス抗原液からなり、安定化剤として
塩基性アミノ酸またはその塩、酸性アミノ酸またはそ
の塩及び糖及び／または糖アルコールを含有し、凍結
乾燥されていることを特徴とする安定化された凍結乾燥
Ａ型肝炎ワクチン。 - 【請求項２】安定化剤として選択的にさらに膠着剤を含
有する請求項１記載の凍結乾燥Ａ型肝炎ワクチン。 - 【請求項３】塩基性アミノ酸が、アルギニン及びリジン
より選ばれ、0.1〜2.0W/V％の濃度（凍結乾燥前溶液中
濃度）で含有される請求項１記載の凍結乾燥Ａ型肝炎ワ
クチン。 - 【請求項４】酸性アミノ酸がグルタミン酸であり、0.1
〜2.0W/V％の濃度（凍結乾燥前溶液中濃度）で含有され
る請求項１記載の凍結乾燥Ａ型肝炎ワクチン。 - 【請求項５】糖がラクトース、グルコース、キシロー
ス、ガラクトース、フルクトース、マルトースおよびサ
ッカロースより選ばれ、0.1〜15W/V％の濃度（凍結乾燥
前溶液中濃度）で含有される請求項１記載の凍結乾燥Ａ
型肝炎ワクチン。 - 【請求項６】糖アルコールが、ソルビット、マンニット
およびキシリットより選ばれ、0.1〜15W/V％の濃度（凍
結乾燥前溶液中濃度）で含有される請求項１記載の凍結
乾燥Ａ型肝炎ワクチン。 - 【請求項７】膠質剤がゼラチン、ヒトアルブミンおよび
デキストランより選ばれ、0.01〜0.1W/V％の濃度（凍結
乾燥前溶液中濃度）で含有される請求項１もしくは２記
載の凍結乾燥Ａ型肝炎ワクチン。 - 【請求項８】0.1〜10μｇのＡ型肝炎ウイルス抗原を含
有し、安定化剤として、アルギニン、グルタミン酸ナト
リウム、ラクトースおよびソルビットを各々0.1〜2.0W/
V％:0.1〜2.0W/V％、0.1〜15W/V％および0.1〜15W/V％
の濃度（凍結乾燥前溶液中濃度）で含有する請求項１記
載の凍結乾燥Ａ型肝炎ワクチン。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP63106749A JPH0761955B2 (ja) | 1988-04-28 | 1988-04-28 | 凍結乾燥ａ型肝炎ワクチン |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63106749A JPH0761955B2 (ja) | 1988-04-28 | 1988-04-28 | 凍結乾燥ａ型肝炎ワクチン |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01279843A JPH01279843A (ja) | 1989-11-10 |
| JPH0761955B2 true JPH0761955B2 (ja) | 1995-07-05 |
Family
ID=14441563
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63106749A Expired - Lifetime JPH0761955B2 (ja) | 1988-04-28 | 1988-04-28 | 凍結乾燥ａ型肝炎ワクチン |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0761955B2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| FR2696748B1 (fr) * | 1992-10-14 | 1994-12-30 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Procédé de préparation d'antigènes et de vaccins de l'hépatite A (HAV). |
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| HRP950097A2 (en) | 1994-03-08 | 1997-06-30 | Merck & Co Inc | Hepatitis a virus culture process |
| DE19539574A1 (de) | 1995-10-25 | 1997-04-30 | Boehringer Mannheim Gmbh | Zubereitungen und Verfahren zur Stabilisierung biologischer Materialien mittels Trocknungsverfahren ohne Einfrieren |
| ATE550429T1 (de) | 1996-11-20 | 2012-04-15 | Crucell Holland Bv | Adenovirus-zusammensetzungen erhältlich durch ein verbessertes produktions- und reinigungsverfahren |
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| CN1053590C (zh) * | 1998-10-19 | 2000-06-21 | 卫生部长春生物制品研究所 | 冻干甲型肝炎减毒活疫苗及其保护剂 |
| DE19916085A1 (de) * | 1998-10-28 | 2000-05-04 | Sonntag Hans Guenther | Verfahren zur Herstellung eines antiviralen Mittels |
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| EP1559433A4 (en) * | 2002-10-22 | 2009-11-04 | Dainippon Sumitomo Pharma Co | STABILIZED COMPOSITION |
| AU2005305347A1 (en) | 2004-11-03 | 2006-05-18 | Introgen Therapeutics Inc. | Method of producing and purifying of adenoviral vectors |
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| JP5969731B2 (ja) * | 2008-10-17 | 2016-08-17 | 国立大学法人東京海洋大学 | 鮮度測定用試薬キット |
| TW201043267A (en) * | 2009-03-19 | 2010-12-16 | Intervet Int Bv | In situ constituting a vaccine for administration to a predetermined herd of animals |
| JP6253161B2 (ja) * | 2012-03-05 | 2017-12-27 | デ スタート デル ネーデルランデン， ヴェルト． ドール デ ミニステル ヴァン ヴイダブリューエス ミニステリー ヴァン ボルクスゲツォントヘイト， ベルジーン エン シュポルトＤｅ Ｓｔａａｔ Ｄｅｒ Ｎｅｄｅｒｌａｎｄｅｎ， Ｖｅｒｔ． Ｄｏｏｒ Ｄｅ Ｍｉｎｉｓｔｅｒ Ｖａｎ Ｖｗｓ Ｍｉｎｉｓｔｅｒｉｅ Ｖａｎ Ｖｏｌｋｓｇｅｚｏｎｄｈｅｉｄ， Ｗｅｌｚｉｊｎ Ｅｎ Ｓｐｏｒｔ | 乾燥された生物学的材料を安定化するための方法及び組成物 |
| JP6609110B2 (ja) * | 2015-04-28 | 2019-11-20 | Ｋｍバイオロジクス株式会社 | 繊維材質支持体を用いたウイルス培養法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4164566A (en) * | 1978-08-17 | 1979-08-14 | Merck & Co., Inc. | Hepatitis a virus cell culture in vitro |
-
1988
- 1988-04-28 JP JP63106749A patent/JPH0761955B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01279843A (ja) | 1989-11-10 |
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