JPH01279843A - 凍結乾燥ａ型肝炎ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、Ａ型肝炎ワクチンの凍結乾燥製剤に関する。

さらに詳しくは１組織培養法により得られたウィルスを
精製し、不活化後、安定化剤の存在下で凍結乾燥を行う
ことを特徴とするＡ型肝炎ワクチンの凍結乾燥製剤を提
供するものである。

」１五１遣 Ａ型肝炎は、Ａ型肝炎ウィルス（以下、ＨＡＹと略称す
る）によって起こり、疫学的にも、臨床的にも非常に重
要な感染症であり、いまだ有効な治療対策が見い出され
ていない、そのため、このようなＡ型肝炎に対してもっ
ばら予防法が検討されており、現在はグロブリン製剤を
２〜３力月おきに投与することが行われている。しかし
、グロブリン製剤中の抗ＨＡＹ抗体力価の低下の問題や
頻回投与の必要性のため、ワクチンの開発が望まれてき
たが、まだ実用化されるまでには至っていない。

ところで、Ａ型肝炎ワクチンは、＋１　Ａ　Ｖの常在地
域への渡航者の感染を防止する効果を有していると共に
、世界中いたるところで起こる散発性Ａ型肝炎の二次感
染を防止する効果を有している。これらの背景から、Ａ
型肝炎ワクチン製剤は日本国内はもとより、広く世界各
地において使用可能であることが必要である。すなわち
、安定性がすぐれ、長期保存に充分に耐え得る製剤の提
供は必須の条件である。

本発明者らは、Ａ型肝炎患者の糞便より樹立されたＨＡ
Ｙ　ＫＲＭＯ０３株とＨＡＹ感受性細胞を用いた組織培
養によるウィルスを原料としてワクチンの開発を試みて
きた。（第３３回日本ウィルス学会抄録２５７頁、通常
、液状ワクチンには防［削が加えられており、一般的に
は広い抗菌スペクトルを有するチメロサールが加えられ
ている。ところが、本発明者らはワクチン開発中に、精
製１（ＡＶ抗原にチメロサールを加えると）ＩＡＶ抗原
活性が低下する現象を見い出した。（第３５回日本ウィ
ルス学会総会抄録２３４頁、（１９８７）　）さらに、
あらかじめ精製１（ＡＶ抗原にエチレンジアミン四酢酸
（以下、ＥＤＴＡと略称する）を加えておくと抗原活性
の低下が抑えられることより、前述の現象はチメロサー
ル中の２１Ｍの水銀イオンに起因するものと考えられた
。　しかしながら、ＥＤＴＡ添加はある程度効果は認め
られるものの完全では′なく、また、　　ＥＤＴＡの添
加は注射時に痛みを伴うことより、該ＥＤＴＡを含まな
い凍結乾燥製剤が好ましいと考えられた。しかし、通常
の液状製剤にみられるような条件下でそのまま凍結乾燥
を行うと、乾燥の過程において力価が低下する欠点が生
じることが判明した。

１１立１１ 本発明者らは、上記のような問題点を解決すべく鋭意検
討を重ねた結果、抗原力価の低下や性状の悪化を伴わず
に凍結乾燥することを可能ならしめ、かつ乾燥品の保存
安定性も液状製剤に比して格段に良好となる凍結乾燥の
条件と、安定化のための製剤の配合組成とを見い出すこ
とにより本発明を完成した。

日 本発明に用いるＡ型肝炎ウィルスは、組織培養より得ら
れたウィルスが使用される。　　１（ＡＶは長い間培養
細胞で増殖出来なかったが、１９７９年に至りようや＜
　Ｐｒｏｖｏｓｔと旧！１ｅ＋ｗａｎ（Ｐｒｏｖｏｓｔ
、　Ｐ、Ｊ、ｅｔ　＆１．。

Ｐｒｏｃ、　Ｓｏｃ、　Ｅｘｐ、　Ｂｌｏｌ、　Ｍｅｄ
、、　ＬｉＱ、　２１３．　　（１９７９））による初
の成功が報告された。彼らはムネアカハラタマリンを使
ってＨＡＶの継代を行い、肝臓から抽出したウィルスを
ムネアカハラタマリンの肝臓の培養切片に接種し、初め
てＨＡＹが増殖するのを確がめるとともにアカゲザルの
胎児の腎培養細胞（ＦＲｈｋ６）でも増殖することを発
見しな、その後世界各地でいろいろな培養細胞を用いて
追試された結果、原発生肝癌由来の培養細胞（＾Ｉｅｘ
ａｎｄｅｒ　ｈｅｐａｔｏｍａｃｅｌｌ）　　（Ｆｒｏ
ｓｎｅｒ、　Ｇ、　Ｇ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｉｎｆｅｃ
ｔｉｏｎ　”ｌ。

３０３゜（１９７９））、Ｖｅｒｏｍ胞（Ｌｏｃａｒｎ
ｌｎｉ、　　Ｓ、　　Ａ、　　ｅｔ　　ａｌ。

Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、　’１１．２１６．（１９８１）
）、アフリカミドリザル腎初代培養細胞（Ｄａｅｓｅｒ
、　Ｒ，Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎｆｅｃｔ。

ｌｍ５ｕｎ、、　３２．３８８．（１９８１））などで
も増殖することが確かめられた１本発明者らは、アフリ
カミドリザル腎培養細胞よりコロニー培養法によるクロ
ーニングによって樹立されたＨＡＹ高産生細胞株ＧＬ−
３７細胞と、同じくＡ型肝炎患者の糞便より分離しＧＬ
−３７細胞に感受性のすぐれているＨＡＹ株ＫＲＭＯＯ
３株を用いた組織培養により、人員にＨＡｖを得ること
ができた。

上記の方法により得られたＨＡＹは、ポリエチレングリ
コール分画、超遠心、　有機溶媒処理、酵素処理、ゲル
ろ過等の生物学的活性物質の分離精製に用いられる方法
の組合せにより、高度に精製して精製標品とし、ホルマ
リンにて不活化した後、本発明の凍結乾燥ワクチン製剤
化に供する。

得られた不活化ＨＡＹ抗Ｖ、精製凛品を用い凍結乾燥に
供するには、中性付近の適当な濃度のバッファー（例え
ば０．０１１４リン酸バツフアー）中で、また好ましく
はＴｗｅｅｎ　８０を０．００２Ｖ／Ｖ％になるよう添
加したバッファー中で、ＭＡＹおよび各添加物質の組成
が次のようになるようｇｅされる。

すなわち、ＭＡＹＡＶ抗原白質濃度として０．０５Ｗ／
Ｖｘ以下、好ましくは０．００２ｗ／Ｈ以下合有される
。添加される安定化剤としては、アミンｌ［Ｊ［および
糖類の一方または好ましくは双方が含まれる。アミノ酸
類としてはグリシン、アラニン、グルタミン酸１ナトリ
ウム、アルギニン、リジンなどのアミノ酸またはそれら
の塩が挙げられ、それらの１種もしくは２種以上を用い
、通常０．１〜２．０ｗ／％Ｊ程度、凍結乾燥に供する
ＨＡＶ抗原含有液中に存在させる。

糖類としては、グルコース、キシロース、ガラクト−人
　フラクトースなどの単糖類、ラクトース、マルトース
、サッカロースなどの二糖類、マンニット、ソルビット
、キシリットなどの糖アルコール類が挙げられ、これら
の１種もしくは２１１以上を用い１通常０．１〜１５Ｗ
／Ｖπ程度存在させる。また、膠質剤としてはゼラチン
、ヒトアルブミン、デキストランなどが挙げられ、通常
０．０１〜０．ＩＷ／Ｖπ程度存在させる。

さらに凍結乾燥ワクチンの使用時、溶解した際に生理的
に等張となるようにするため中性塩を添加する。中性塩
としては塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシ
ウムが含まれるが、好ましくは塩化ナトリウムでこれに
適宜、上記他の中性塩が添加される。これらの中性塩は
０．１〜３Ｗ／Ｖχ程度、通常０．５〜２Ｗ／Ｖ％程度
の濃度で含まれる。凍結乾燥に供すべく調製されたワク
チン液は、所要の包装単位に従い適宜０．１μ９〜ｌＯ
刈のＭＡＹ抗原を含むように小分容器に分注する。この
分注液は、急速凍結乾燥または緩速凍結乾燥し、凍結乾
燥製剤と−する。凍結乾燥の条件としては、例えば−５
０℃、常圧にて予備凍結を６時間行い、次に圧力を０．
００８　Ｔｏｒｒに下げ、設定温度を一１５℃から０℃
に段階的に上げ、５０時間１次乾燥を行う、この時点で
の製品温度は０℃程度である０次に２５℃設定温度にて
圧力０．００８Ｔｏｒｒで２０時間２次乾燥を行う。

この凍結乾燥製剤は、その組成として少なくとも組織培
養由来ＨＡＹ抗原、安定化剤、中性塩を含有する。

かくして得られた製剤は、力価の低下がなく、その保存
安定性がよく、使用時の溶解性が速やかで極めて優れた
Ａ型肝炎ワクチンの凍結乾燥製剤である。

以下、本発明の効果を実施例及び参考例によりさらに詳
細に説明する。

（夕　　　ＨＡＶｆ＝ ＧＬ−３７細胞をＩＯＶ／ＶＸ牛血清添加イーグル−Ｍ
ＥＮ培地で７日間培養し、細胞シートを形成させる。　
　０．０１１４リン酸バツフアーで洗浄後、０．０５Ｗ
／Ｖ％トリプシン、０．０２Ｗ／ｖｘ　ＥＤＴ＾添加０
．０１Ｍリン酸バッファーにて細胞をはがし、牛胎児血
清（以下ＦＢＳと略称する）を添加し、１０００ｒｐ璽
で３分間遠心してトリプシン溶液を除く、細胞沈査を８
Ｖ／Ｖ％ＦＢＳ添加Ｅ−ＭＥ１４培地にて浮遊させ、こ
の浮遊液にＭ、Ｏ，１，（Ｉｔ胞当りのウィルス感染価
）０．１になるように種ウィルス液を感染させ、３７℃
１時間吸着後８χＦＢＳ添加Ｅ−ＨＥＭ培地を加えて３
〜４倍拡張し、３週間培養する。

コノ間１３！！間に１回、　　２Ｖ／Ｖ％　ＦＢＳ添加
Ｅ−ＭＥＭ培地にて培地交換を行う、３′Ａ間後、培地
を吸引除去し、続いて０．０１Ｍリン酸バッファーにて
２回細胞を洗浄後、ｌ　Ｖ／ＶχＮＰ−４０（牛丼化学
社製）を含む可溶化液をローラーボトル１本（容量的２
１１）当り１５−加え３７℃１時間反応させ、１（ＡＶ
感染細胞を可溶化する。可溶化液を３０００ｒｐ＋ｓ　
３０間分遠心し、上清を集める。

この上清液にはＨＡＶ抗原が３〜６μｇ／−の濃度で含
まれている。

膏　　　　　　■ 上記上清液に最終濃度が７Ｗ／Ｖ％になるようにポリエ
チレングリコール６０００　（和光純薬社製）を加えて
４℃に置く、−夜後にこのポリエチレングリコール添加
溶液を８０００ｒｐｍで３０分間遠心し上清を捨て、沈
査にＩＶ／Ｖ％ＮＴ’４０を含む可溶化バッファーを加
えて再懸濁し、ＭＡＹ抗原を回収する。さらに、このＭ
ＡＹ抗原液を２５０００ｒｐｍ　１６時間遠心し上清を
すて、開始時の１７５〜１７１０量の０．０１Ｍリン酸
バッファーを加えて沈査を完全に再溶解し、４℃に一装
置く０次に超音波処理し、１５０００ｒｐｍ　１５分間
遠心後上清を鶏める。

この上清には通常１５〜６０ｕｇ／−のＨＡＶ抗原が含
まれる。この上清に等量のクロロホルムを加え室温で１
５〜３０分間抽出処理する。　　２０００ｒｐＨ３０分
間遠心し、上層にある水溶液を集め軽く攪拌しながら１
圧脱気して残存するクロロホルムを除く。

さらに終濃度で２０ｔｓ　／ｄのＲＮａｓｅ人（シグマ
社製）を加え、３７℃、１時間処理し、次に５ｍＭ塩化
マグネシウムと２０〜４０μ９／−のＤＮａｓｅ　１　
（宝酒造社１）を加えて３７℃で３時間処理する。その
後、５０刈／−になるようＰｒｏｔｅｌｎａｓｅ　Ｋ　
（メルク社製）を加えてさらに３７℃、１時間処理する
。２．５Ｍリン酸バッファーｐＨ７，５、エトキシエタ
ノールとブトキシェタノールの２：１混液をそれぞれ１
容及び０．８容加え軽く混和し、２０００ｒｐｍ　１０
分間遠心し中間層をとり、２真１４ＥＤＴＡ、０．００
：Ｂ　Ｔｗｅｅｎ　８０　（和光補薬社製）添加０．０
１Ｍリン酸バッフ　ｙ　−（ｐＨ７，４）で２００〜３
００ｕｇ／−の抗原濃度になる様に溶解する。この有機
溶媒処理操作を１〜２回繰り返す、この溶液をセファク
リル３４００ＨＲ（ファルマシア社製）によるゲルろ過
により最終精製抗原液を得る。最終精製抗原液は５０〜
１００ｍ／−の濃度であり、ＴＣＡ　（トリクロロ酢酸
）ローリ−法にて測定した全蛋白量に対するＩ（ＡＶｔ
Ｊｌ（ＩＦ白量の割合は９０〜１００鴬を示す。

チ　　　）゛ 精製ウィルス液を０．００２Ｖ／ＶＫ　Ｔｗｅｅｎ　８
０及び０．１４１４塩化ナトリウム添加０．０１Ｍリン
酸バッファー（ｐＨ７，５）にてウィルス濃度が２０ｔ
ｔｇ／−になるように希釈して熱面ろ過する。０．θ０
２Ｖ／ＶＫ　Ｔｗｅｅｎ　８０添加０．０１Ｍリン酸バ
ッファー（ｐＨ７，５）を用いｌ：２０００希釈したホ
ルマリンと等全混合し３７℃に１２日間置く、途中８日
日と１２日日経了後に再度無菌ろ過する。不活化を完了
したウィルス液は４℃に保存する。

支１ 参考例３で調製した不活化精製抗原液に、アミノ酸とし
て０．１Ｗ／Ｖχアルギニン塩酸塩と０．　ＩＷ／Ｖ％
グルタミン酸ナトリウムを、糖として５１／Ｖ”ｌラク
トースとＩＷ／ＶＸソルビットを添加してＨＡＹ抗原が
最終的に１ｓ／−の濃度になるように０．００２Ｗ／Ｖ
％　Ｔｗｅｅｎ　８０添加（１，０１Ｍリン酸バッファ
ー（Ｐ）１７．５）にてワクチン液を調製した。このワ
クチン液０．５ｄを２−バイアルに入れ、−５０℃常圧
にて６時間予備凍結後圧力を０、００８Ｔｏｒｒに下げ
、設定温度を一１５℃から０℃に段階的に上げて５０時
間１次乾燥し、次いで２５℃にて圧力０、００８Ｔｏｒ
ｒで２０時間２次乾燥して凍結乾燥品を得る。

１１■ユ 参考例３で調製した不活化精製抗原液を液状にて３７℃
における保存安定性試験を実施した。溶液中ノ１（Ａｖ
ｒｉｔ原の力価をＥＬＩＳＡ法により測定し、！ＩＩＩ
製後の抗原力価を１とした時の抗原力価の相対値で示し
た。結果を第１表に示す。

第１表 ＰＢＳ−Ｔ：　０．００２Ｖ／Ｖ！　Ｔｗｅｅｎ　８０
．０．１４Ｍ塩化ナトリウム添加０、０１８リンＰｉバ
ー／７７−　（ｐＨ，７，５）０Ｕ 参考例３で調製したワクチン液を２−バイアルに０．５
−ずつ分注し、様々な組成で凍結乾燥を行い、３７℃に
おける保存安定性試験を実施した。結果を第２表に示す
。

第２表 ■ＰＢＳ−Ｔ ■ＰＢＳ−Ｔ＋５％ラクトース＋０．５Ｘアルギニン十
０．５％グルタミン酸ナトリウム■■＋０．５駕ゼラチ
ン １１口１ユ 参考例４に記したものと同様の方法によって得られた凍
結乾燥品の、保存安定性試験を実施した。

凍結乾燥後の抗原力価を１とした時の抗原力価の相対値
で示した。結果を第３表に示す。

第３表 本ｎｏｔ　ｔｅｓｔｅｄ 夾ＪＩＩＬユ 参考例３で調製したワクチン原液と参考例４で！ＩＩＩ
ＩＪした凍結乾燥ワクチンをＤＤＹマウスを用いて免疫
原性を比較した。　ＨＡＶｔｉｔＫ量２００ｎｇ、１１
００ｎ、５０ｎｇ、２５Ｂの接種量で各１０匹ずつのＤ
ＤＹマウス腹腔内に接種した。６週間後採血し、その血
漿について、抗ＨＡＹ抗体価をＨＡＶ抗原ル−トとパー
オキシダーゼラベル抗ＦＩＡＶウサギ血清を用いた競合
抑制ＥＬＩＳＡ法により測定した。その結果を第４表に
示す。

各抗原量接種における原液接種の場合の平均抗体価を１
としたときの凍結乾燥ワクチン接種の場合の平均抗体価
の相対値の平均で示した。

第４表

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）組織培養により得られたウィルス液を精製し、不
   活化した標品に安定化剤を添加し、凍結乾燥して得られ
   るＡ型肝炎ワクチンの凍結乾燥製剤。
2. （２）安定化剤としてアミノ酸またはその塩、及び糖類
   を添加する特許請求の範囲第（１）項記載の製剤。
3. （３）安定化剤としてアミノ酸またはその塩、糖類及び
   膠質剤を添加する特許請求の範囲第（１）項記載の製剤
   。
4. （４）アミノ酸またはその塩が、グリシン、アラニン、
   グルタミン酸１ナトリウム、アルギニン及びリジンから
   選ばれる少なくとも１種である特許請求の範囲第（２）
   項記載の製剤。
5. （５）糖類がグルコース、キシロース、ガラクトース、
   フラクトース、ラクトース、マルトース、サッカロース
   、マンニット、ソルビット及びキシリットから選ばれる
   少なくとも１種である特許請求の範囲第（２）項記載の
   製剤。
6. （６）膠質剤がゼラチン、ヒトアルブミンまたはデキス
   トランである特許請求の範囲第（３）項記載の製剤。