NO320090B1

NO320090B1 - Rekombinant adenovirus, dens fremstilling samt farmasoytisk preparat inneholdende virusen.

Info

Publication number: NO320090B1
Application number: NO19971764A
Authority: NO
Inventors: Patrice Yeh; Michel Perricaudet; Cecile Orsini
Original assignee: Aventis Pharma Sa
Priority date: 1994-10-28
Filing date: 1997-04-17
Publication date: 2005-10-24
Also published as: AU703539B2; NO971764L; NO971764D0; US6312946B1; FI971783A; IL115779A0; WO1996013596A1; US20010039046A1; CN1162338A; MX9702553A; EP0787199A1; CN1110564C; KR100424803B1; KR970707292A; JPH10507922A; US6482617B2; FI971783A0; ZA959086B; FR2726285A1; FR2726285B1

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en rekombinant adenovirus som er berøvet replikative partikler.

Oppfinnelsen angår videre en fremgangsmåte for fremstilling av slike rekombinante adenovirus samt farmasøytiske preparater inneholdende disse.

Genterapi består i å korrigere en defekt eller en anomali (mutasjon, feilaktig ekspresjon, og så videre) ved innføring av en genetisk informasjon i den påvirkede celle eller organ. Denne genetiske informasjon kan innføres enten in vitro i en celle fra organet, hvoretter cellen modifiseres og så gjeninnføres i organismen, eller direkte in vivo i det angjeldende vev. I det andre tilfellet foreligger det forskjellige teknikker blant hvilke skal nevnes de forskjellige transfeksjonsteknikker som implikerer komplekser av DNA og DEAE-dekstran (Pagano et al., "J. Virol.", 1 (1967) 891), DNA og nukleære proteiner (Kaneda et al., "Science", 243 (1989) 375), DNA og lipider (Felgner et al., "PNAS", 84 (1987) 7413), anvendelsen av liposomer (Fraley et al., "J. Biol. Chem.", 255 (1980) 10431) og så videre. I den senere tid har anvendelsen av vimser som vektor for overføring av gener kommet som et lovende alternativ til disse fysiske transfeksjonsteknikker. 1 denne forbindelse er forskjellige vimser prøvet med henblikk på deres evnen til å infisere visse cellepopulasjoner. Særlig gjelder dette retrovimsene (RSV, HMS, MMS, og så videre), HSV-viruset, de adeno-assosierte vimser og adenovirusene.

Blant disse vimser oppviser adenovirusene visse interessante egenskaper for anvendelse ved genterapi. Særlig har de et meget stort vertsspektrum, er i stand til å infisere hvilen-de celler, integreres ikke i den infiserte celles genom og assosieres til i dag ikke med vesentlige patologier hos mennesker. Adenovirusene har vært benyttet for å overføre gener av interesse til muskelen (Ragot et al., "Nature", 361 (1993) 647), leveren (Jaffe et al., "Nature genetics", 1 (1992) 372), nervesystemet (Akli et al., "Nature genetics" 3

(1993) 224), og så videre.

Adenovirusene er vimser med lineær, dobbelttrådet DNA med en størrelse på ca. 36 kb. Deres genom omfatter særlig en repetert, invers sekvens (ITR) ved hver ende, en enkapsideringssekvens (Psi), tidlige gener og sene gener (jevnfør figur 1). De vesentlige, tidlige gener er inneholdt i områdene El, E2, E3 og E4. Blant disse er genene som inneholdes i området El (særlig Ela og Elb) nødvendige for den virale replikasjon. Områdene E4 og L5 er for eksempel implikert i den virale propagering. De vesentlige sene gener inneholdes i områdene LI til L5. Genomet til adenovirusen Ad5 er helt og holdent sekvensert og tilgjengelig fra genbanker (se særlig Genebank M73260). Videre er deler henholdsvis totaliteten av genomet av adenovirusen av forskjellige serotyper (Ad2, Ad7, Adl2, og så videre) likeledes sekvensert.

Tatt i betraktning egenskapene hos adenovirusene som nevnt ovenfor har disse allerede vært benyttet for overføring av gener in vivo. For dette formål har det vært fremstilt

forskjellige vektorer avledet fra adenovirusen og som innarbeider forskjellige gener (B-gal, OTC, a-IAT, cytokiner, og så videre). I hver av disse konstruksjoner er adenovirusen modifisert for å gjøre den ute av stand til replikasjon i den infiserte celle. Således er de konstruksjoner som er beskrevet i den kjente teknikk, adenoviruser der områdene El (Ela og/eller Elb) og eventuelt E3 er deletert, og der det er innskutt heterologe DNA-sekvenser (Levera et al., "Gene", 101 (1991) 195; Gosh-Choudhury et al., "Gene", 50

(1986) 161). Andre konstruksjoner omfatter en delesjon på nivå med området El og

ikke-essensiell del av området E4 (WO 94/12649). Deke desto mindre oppviser vektorene som beskrevet i den kjente teknikk visse mangler som begrenser deres eksploatering ved genterapi. Særlig kan lottene av rekombinante vimser av typen som beskrevet i den kjente teknikk, være forurenset med replikative partikler, særlig av villtypen.

I dag blir vektorene som er avledet fra adenovirusene fremstilt i en komplemente-ringslinjen (linje 293) i hvilken del av genomet av adenovirusen er integrert. Mere spesielt inneholder linje 293 den venstre del (ca. 11-12%) av genomet av adenovirus-serotype 5 (Ad5), omfattende den venstre ITR, enkapsideringsområdet og området El inkludert Ela, Elb og en del av området som koder for proteinet pIX. Denne linje er i stand til å trans-komplementere de defektive, rekombinante adenoviruser for området El, det vil si berøvet for hele eller en del av området El som er nødvendig for replikering. Således kan de rekombinante El-vimser fremstilles i cellene 293 på grunn av den gode transkomplementering av området El inneholdt i denne linje. Ikke desto mindre foreligger det homologisoner mellom området av adenovirusen som er integrert i genomet i linjen og DNA av den rekombinante vims man ønsker å produsere. På grunn av dette kan det under produksjonen inntre forskjellige rekombineringsevenementer som gir replikative, virale partikler, særlig adenoviruser av typen E1+. Som antydet i figur 2 kan det dreie seg om en enkel rekombinering fulgt av en kromosom-oppbryting (figur 2A) eller en dobbeltrekombinering (figur 2B). Disse to typer modifisering fører til en erstatning av den venstre del av den rekombinante DNA, berøvet for et funksjonelt El-området, med en tilsvarende del som er til stede i cellens genom og som bærer en funksjonell kopi av området El. Videre tatt i betraktning de høye mengder av rekombinant vektor som fremstilles av linje 293 (over 10^), er sannsynligheten for at disse rekom-bineringshendelser skal inntre høy. Således er det fastslått at tallrike defektive, rekombinante adenoviruslotter har vært forurenset med replikative, virale partikler.

Kontamineringen med replikative partikler utgjør en vesentlig mangel. Således induse-rer nærværet av slike partikler i de terapeutiske preparater in vivo en viral propagering og en ukontrollert disseminasjon med risiki for inflammatoriske reaksjoner, rekombi-nasjoner og så videre. De forurensede lotter kan således ikke benyttes ved humanterapi.

Foreliggende oppfinnelse tillater å bøte på disse mangler. Foreliggende oppfinnelse beskriver således nye konstruksjoner som tillater fremstilling av defektive, rekombinante adenoviruser som er berøvet for enhver forurensning fra replikative partikler. Oppfinnelsen beskriver likeledes en fremgangsmåte for fremstilling av rekombinante adenoviruser. Oppfinnelsen tilveiebringer således nye defektive, rekombinante vektorer avledet fra adenoviruser og særlig egnet for bruk ved genterapi, særlig for overføring og ekspresjon av gener in vivo.

Foreliggende oppfinnelse ligger mer spesielt i konstruksjonen av defektive, rekombinante adenoviruser omfattende et adenovirusgenom hvis genetiske organisering er modifisert og der den eventuelle rekombinering med genomet av produksjonslinjen fører til dannelse av ikke-replikative og ikke-levedyktige virale partikler. Foreliggende søkere har således vist at det er mulig å modifisere den genomiske organisasjon hos adenovirusen for å unngå fremstilling av replikative partikler under produksjonen av forråd.

En første gjenstand for oppfinnelsen er således en rekombinant adenovirus som karakteriseres ved at den omfatter

et inaktivert El område der inaktiveringen omfatter en delesjon eller en disrupsjon,

et andre inaktivert område der inaktivering ved delesjon i et andre essensielt område ved dets opprinnelige lokasjon i genomet er nødvendig for replikasjonen

og propageringen av adenovirusen, og

et innskudd av et funksjonelt område ved en posisjon annet enn dets opprinnelige posisjon, som komplimenterer det andre inaktiverte område og som ikke in-aktiverer noe ytterligere vesentlig område.

Innenfor rammen av oppfinnelsen menes med genetisk eller genomisk organisasjon ordningen eller innretningen av de forskjellige gener eller funksjonelle områder som er til stede i genomet av den ville adenovirus som vist i figur 1. En modifisert genetisk eller genomisk organisasjon tilsvarer således et genom der visse gener eller visse områder ikke befinner seg i sin opprinnelige posisjon. Således kan visse gener eller visse områder være flyttet i genomet og innført i et annet sete. Det er likeledes mulig å innfø-re et gitt gen eller et område i et spesielt sete og å undertrykke eller inaktivere det opprinnelige området (ved mutasjon, delesjon, innskyting, og så videre).

Uttrykket ikke-levedyktig, viral partikkel slik det benyttes innenfor oppfinnelsens ramme, angir en adenovirus som ikke er i stand til å replikere sin DNA og/eller å propagere på autonom måte i de infiserte celler. En ikke-levedyktig, viral partikkel har således et adenovirusgenom som er berøvet i det minste de sekvenser som er nødvendig for replikering og/eller propagering i den infiserte celle. Disse områder kan enten være eliminert (helt eller delvis), gjort ikke-funksjonelle eller være erstattet med andre sekvenser. De sekvenser som er nødvendig for replikering og/eller propagering er for eksempel området El, området E4 eller området L5. Når det dreier seg om området E4, er de vesentlige gener mere spesielt genene ORF3 og ORF6.

Foreliggende søkere har helt spesielt vist at det er mulig å flytte en funksjon som er essensiell for viral replikering eller propagering uten å påvirke egenskapene til adenovirusen som vektor ved genterapi, nemlig den høye infeksjonskraft i særlig humane celler, og evnen til effektivt å overføre et gen av interesse til cellene. I en foretrukken utførel-sesform gjelder oppfinnelsen således rekombinante adenoviruser der et område som er essensielt for viral replikering og/eller propagering er til stede i en genomisk posisjon forskjellig fra den opprinnelige posisjon. Fortrinnsvis befinner dette området seg på nivå med eller nær et annet genomisk område som er gjort ikke-funksjonelt.

Vektorene ifølge oppfinnelsen er særlig fordelaktige for de tillater innarbeiding av store interessante gener og fordi de kan produseres i store mengder uten produksjon av kon-taminerende, replikative virale partikler.

I vektorene ifølge oppfinnelsen kan området El eller ethvert annet område inaktiveres eller gjøres ikke-funksjonelt ved forskjellige teknikker som er velkjent av fagmannen, særlig ved suppresjon, substitusjon, delesjon og/eller addisjon av en eller flere baser. Slike modifikasjoner kan oppnås in vitro (på isolert DNA) eller in situ, for eksempel ved hjelp av genpleisingsteknikker, eller også ved behandling med mutagene midler. Den eller de gjennomførte genetiske modifikasjoner kan være lokalisert i en kodende del av området eller utenfor et kodende område, for eksempel i områder som er ansvar-lige for ekspresjon og/eller transkripsjonen regulering av genene. Inaktiveringen kan manifesteres ved produksjon av proteiner som er inaktive på grunn av strukturelle eller konformasjonelle modifikasjoner, ved fravær av produksjon, eller produksjon av proteiner med en endret aktivitet eller også ved produksjon av naturlige proteiner i en øket mengde eller i henhold til en ønsket reguleringsmåte.

Blant de mutagene midler som benyttes for inaktivering kan for eksempel nevnes fysiske midler som energetisk bestråling (røntgen, y, UV, og så videre) eller kjemiske midler som er i stand å reagere med forskjellige funksjonelle grupper i DNA-basene og for eksempel alkyleringsmidler [etylmetansulfonat (EMS), N-metyl-N-nitro-N-nitroso-guanidin, N-nitrokinolein-1-oksyd (NQO)], bialkyleringsmidler, interkaleringsmidler og så videre.

De genetiske modifikasjoner kan likeledes oppnås ved genetisk disrupsjon, for eksempel ved den protokoll som i utgangspunktet er beskrevet av Rothstein [Meth. Enzymol., 101 (1983) 202]. I dette tilfellet blir hele eller en del av den kodende sekvens fortrinnsvis forstyrret for å tillate erstatning, ved homolog rekombinasjon, av den genomiske sekvens med en ikke-funksjonell eller mutant sekvens.

Fortrinnsvis er, i oppfinnelsens adenoviruser, det angjeldende området inaktivert ved mutasjon og/deler delesjon av en eller flere baser. Aller helst skjer inaktiveringen ved total eller partiell delesjon.

Mer spesielt menes med delesjon enhver suppresjon av hele eller en del av det angjeldende gen. Det kan særlig dreie seg om hele eller en del av området som koder genet og/eller hele eller en del av promoterområdet for transkripsjonen av genet. Suppresjonen kan gjennomføres ved fermentering ved hjelp av egnede restriksjonsenzymer med etter-følgende ligering i henhold til klassiske teknikker i molekylærbiologien, som vist i eksemplene.

Fortrinnsvis gjennomføres inaktiveringen av genene slik at man ikke påvirker annet enn det angjeldende gen og ikke andre virale gener, særlig nabogenene. Videre er visse endringer som punktmutasjoner pr. natur i stand til å kunne korrigeres eller forsterkes ved cellulære mekanismer og det er særlig foretrukket at inaktiveringen er segregasjonen og/eller ikke-reversibel stabil.

I tilfellet inaktivering ved total eller partiell delesjon befinner området som er essensielt for den virale levedyktighet seg fortrinnsvis på nivå med eller nær delesjonssetet. Det er videre runnet mulig å benytte andre innskytingsseter som for eksempel restriksjonssete-ne som allerede er til stede i villgenomet. I denne forbindelse foretrekker man ikke desto mindre at innskytingen gjennomføres i det minste nær delesjonssetet, det vil si utenfor delesjonssetet, men tilstrekkelig nær til at det ikke skjer rekombineringsevenementer i intervallet som separerer delesjonssetet fra innskytingssetet. Fortrinnsvis er avstanden mellom delesjonssetet og innskytingssetet ikke mer enn 50 pb.

I en foretrukken utførelsesform av oppfinnelsen er området som er essensielt for viral replikering og/eller propagering deplassert for å inkluderes på nivå med det inaktiverte området El og/eller området E3.

I henhold til en foretrukken utførelsesform blir i de rekombinante adenoviruser ifølge oppfinnelsen, området El inaktivert ved delesjon av et fragment PvuII-Blgll som går fra nukleotid 454 til nukleotid 3328, på sekvensen av adenovirus Ad5. Denne sekvens er tilgjengelig i litteraturen og likeledes i en bank (se særlig Genebank nr. M73260). I en annen foretrukken utførelsesform er området El inaktivert ved delesjon av et fragment HinfII-Sau3A som går fra nukleotidet 382 til nukleotidet 3446.

Området som er essensielt for viral replikering og/eller propagering ifølge oppfinnelsen velges fortrinnsvis blant hele eller en del av området E4 og/eller området pDC-IVa2 og/eller området L5, og så videre.

I en særlig foretrukken utførelsesform av oppfinnelsen består det essensielle området av hele eller en funksjonell del av området E4 og er innskutt på nivå med eller nær delesjonssetet av El. I henhold til en utførelsesform blir området E4, essensielt for den virale propagering, innskutt i en posisjon forskjellig fra den opprinnelige slik at dette området er fraværende i hele konstruksjonen som oppnås fra rekombinasjonen med genomet av produksjonslinjen (jevnfør figur 3). Foreliggende oppfinnelse angår således også en rekombinant adenovirus hvis genom karakteriseres ved nærværet av de inaktiverte områder El og E4 og ved at hele eller en funksjonell del av området E4 er innskutt på nivå med eller nær omradet El.

En slik adenoviral vektor omfatter fortrinnsvis to ITR, et enkapsideringsområde, en delesjon i området El på nivå med hvilken det er innskutt hele eller en funksjonell del av E4, og et område E4 av inaktivert opprinnelse.

Området E4 er implikert i reguleringen ekspresjonen av de sene gener, i stabiliteten av sene, nukleære RNA, i ekstinksjonen av ekspresjonen av vertscellens proteiner og i ef-fektiviteten for den virale DNA-replikasjon. Mutantene som er berøvet for E4 er ikke i stand til propagering. E4 utgjør også et område som er essensielt for viral replikasjon og/eller propagering. Dette området E4 består av 7 åpne lesefaser kalt ORF1, ORF2,

ORF3, ORF4, ORF3/4, ORF6 og ORF6/7 (figur 4). Blant disse er ORF3 og ORF6 de to gener som er essensielle for den virale propagering. Hvert av disse gener er i stand til å indusere den virale propagering. Til gjengjeld implikerer inaktivering av området E4 en inaktivering av ORF3 og ORF6.

I en særlig utførelsesform blir, i oppfinnelsens vektorer, totaliteten av området E4 innskutt på nivå med eller nær delesjonssetet El. Det kan særlig dreie seg om et fragment MaeU-MscI tilsvarende nukleotidene 35835-32720.

I en annen særlig utførelsesform blir kun en funksjonell del av E4, det vil si tilstrekkelig til å tillate viral propagering, innskutt. Denne del omfatter minst et funksjonelt gen ORF3 eller ORF6. Fortrinnsvis består av den funksjonelle del av E4 i det vesentlige av ORF3 eller ORF6. Som eksempel kan disse kodende faser isoleres fra området E4 i form av fragmenter PvuII-AluI henholdsvis Bglll-PvuII, tilsvarende nukleotidene 34801-34329 henholdsvis 34115-33126.

Fortrinnsvis omfatter området E4 eller en funksjonell del av dette området likeledes et promoterområde for transkripsjonen. Det kan dreie seg om promoteren for området E4 eller en hvilken som helst annen funksjonell promoter som de virale (Ela, SV40, LTR-RSV, og så videre), eukaryotiske eller mammifære promotere. Fortrinnsvis er den benyttede promoter den til området E4.

Som antydet ovenfor tilsvarer den funksjonelle del av E4, innskutt på nivå med El, ikke nødvendigvis den del av E4 som er deletert i den opprinnelige posisjon. Videre kan det opprinnelige området være inaktivert ved punktmutasjon (uten delesjon) og et funksjonelt E4-område være innskutt på nivå med El. På samme måte kan det opprinnelige E4-området være helt og holdent deletert og kun en funksjonell del innskutt på nivå med El.

Inaktiveringen av området E4 implikerer innenfor oppfinnelsens ramme den funksjonelle inaktivering av minst et områdene ORF3 og ORF6. Disse opprinnelsesområder kan inaktiveres ved en hvilken som helst av fagmannen kjent teknikk. Særlig kan alle de metoder som er antydet ovenfor anvendes for inaktivering av ORF3 og ORF6 eller et hvilket som helst supplementært område av E4. Som eksempel kan delesjonen av området E4 av virusen Ad2 dl808 eller virusene Ad5 dl 1004, Ad5 dl 1007, Ad5 dllOl 1 eller Ad5 dll014 benyttes innenfor rammen av oppfinnelsen (jevnfør eksempel 3).

Disse adenoviruser kan oppnås for eksempel ved ko-transfektering i en produksjonslinje for et første plasmid som bærer den venstre del av genomet av virusen man ønsker å produsere (som har en delesjon i området El på nivå med eller nær hvilket det innskytes minst en funksjonell del av E4) og et viralt, genomisk DNA-fragment som bærer den høyre del av genomet av virusen (med et inaktivert E4-område). Efter rekombinering blir de fremstilte viruser forsterket og isolert. Disse adenoviruser kan også oppnås ved permutering av endene av genomet omfattende ITR'ene pluss det tilstøtende området. I denne forbindelse angår oppfinnelsen også en rekombinant adenovirus som karakteriseres ved at dets genom har et inaktivert El-område og at den venstre ekstremitet omfattende ITR'en og enkapsideringsområdet og den høyre ekstremitet, omfattende ITR'en og hele eller en funksjonell av området E4, erpermutert. Mer spesielt inneholdes den venstre ekstremitet omfattende den venstre ITR og enkapsideirngsområdet i de 382 førs-te nukleotider av genomet av adenovirusen Ad5 (for eksempel akkurat til setet Hinfl). På samme måte inneholdes den høyre ekstremitet omfattende den høyre ITR og hele eller en funksjonell del av området E4, derunder promoteren for området E4, i de 3215 siste nukleotider av genomet av adenovirusen Ad5 (for eksempel fra setet Mscl i posisjon 32720). Kjente teknikker tillater å konstruere en rekombinant virus ifølge oppfinnelsen der den høyre ITR og hele eller en del av området E4 nu befinner seg til venstre i virusen fulgt av området 3446-32720 av genomet av adenovirusen Ad5 og deretter enkapsideringssekvensen og den venstre ITR som nu blir den høyre ekstremitet av den rekombinante virus (jevnfør figur 5). Genomet av den således oppnådde, rekombinante adenovirus er spesielt fordelaktig fordi det vesentlige E4-området som er plassert til venstre holdes i sin naturlige omgivelse og således under optimale aktivitetsbetingelser for en infeksjonscyklus med høy titer. Videre foregår dette området hvis nærvær i genomet i produksjonslinjen 293 var opprinnelsen for opptredenen av de levedyktige partikler.

I en annen særlig foretrukken utførelsesform av oppfinnelsen består det essensielle området av området som koder for proteinene pIX og IVa2 og det er innskutt på nivå med området E3, eventuelt som erstatning for deleterte sekvenser (jevnfør figur 6). Mer spesielt er området som koder for proteinene pIX og IVa2 omfattet i et fragment Bglll-Nrul som tilsvarer nukleotidene 328 til 6316 i sekvensen av den ville adenovirus Ad5.1 denne utførelsesform danner den eventuelle rekombinering av den rekombinante adenovirus med området av adenovirusen som er integrert i produksjonslinjen, ikke annet enn ikke-levedyktige virale partikler på grunn av delesjon av de sene prinsipielle gener som er essensielle for levedyktigheten.

I henhold til en foretrukken utførelsesform av oppfinnelsen blir to essensielle områder for genomet av adenovirusen deplassert fra sine opprinnelige posisjoner. Aller helst er disse essensielle områder representert ved områder som koder for proteinet pIX og området som koder for hele eller kun en funksjonell av området E4.1 henhold til en foretrukken utførelsesform deplasseres de på nivå med området El under erstatning av den deleterte sekvens og under eventuell bevaring av orienteringen i leserammen.

Som eksempel på denne type konstruksjon kan det mer spesielt henvises til den konstruksjon som er vist i figur 8.1 denne konstruksjon er området som koder for proteinet pIX deplassert i det deleterte området El, til høyre for den venstre ITR som er blitt den høyre ekstremitet av den rekombinante virus. Området som koder for proteinet pIX y er i tillegg plassert i invers leseretning. Hva angår det essensielle området av E4, er dette representert ved genene ORF3-ORF6/7, under kontroll av promoteren E4, og er likeledes innskutt på nivå med delesjonssetet av El, mellom området som koder for proteinet pIX og området som koder for proteinet IVa2 hvis posisjon ikke er påvirket; i det tilfellet det dreier seg om spesifikk konstruksjon som vist i figur 8, har de to områder som respektivt koder for proteinet pIX og proteinet IVa2 distinkte polyadenyleringsseter.

En slik konstruksjon er spesielt fordelaktig når det gjelder pålitelighet og sikkerhet. Således fører enhver parasittær rekombinasjon mellom to virale molekyler av denne type, for eksempel på nivå med området E4, til en rekombinant virus som er berøvet sin enkapsideringssekvens. På samme måte danner en rekombinasjon mellom et slikt viralt molekyl og det komplementære området av nevnte adenovirus, integrert i en produk-sjonscellelinje, ikke annet enn virale partikler som er deletert for sine prinsipale sene gener som er essensielle for levedyktigheten.

Som antydet tidligere omfatter de rekombinante adenoviruser ifølge oppfinnelsen med fordel ITR-sekvensene og et område som tillater enkapsidering.

De repeterte inverse sekvenser, ITR'ene, utgjør replikasjonsopprinnelsen for adenovirusene. De er lokalisert ved 3'- og 5'-endene av den virale genom (jevnfør figur 1), der de lett kan isoleres ved hjelp av velkjente teknologier innen molekylbiologien. Nukleotidsekvensen for ITR-sekvensen av humane adenoviruser (særlig serotypene Ad2 og Ad5) er beskrevet i litteraturen, på samme måte som caninadenovirusene (særlig CAV1 og CAV2). Hva for eksempel angår adenovirusen Ad5 tilsvarer den venstre ITR-sekvens området som omfatter nukleotidene l til 103 i genomet.

Enkapsideringssekvensen (også kalt Psi-sekvensen) er nødvendig for enkapsidering av det virale genom. Dette området må således være til stede for å tillate fremstilling av defektive, rekombinante adenoviruser ifølge oppfinnelsen. Enkapsideringssekvensen er lokalisert i genomet av vill-adenovirusen, mellom den venstre ITR og genet El (jevnfør figur 1). I oppfinnelsens adenoviruser kan den være lokalisert ved siden av den venstre ITR som høyre ITR (jevnfør figur 5). Den kan isoleres eller syntetiseres ved klassiske teknologier innen molekylærbiologien. Nukleotidsekvensen for enkapsideringssekvensen av humanadenovirusene (særlig serotypene Ad2 og Ad5) er beskrevet i litteraturen på samme måte som caninadenovirusene (særlig CAV1 og CAV2). Hva for eksempel angår adenovirusen Ad5 er en funksjonell enkapsideringssekvens anordnet mellom nukleotidene 194 og 358 av genomet.

Videre kan adenovirusene ifølge oppfinnelsen ha andre endringer i genomet. Særlig kan andre områder være deletert for å øke vimsens kapasitet og å redusere bivirkningene forbundet med ekspresjonen av virale gener. Således kan særlig hele eller en del av området E3 være deletert.

De rekombinante adenovimser ifølge oppfinnelsen har særlig gunstige egenskaper for anvendelse av genterapi. Disse vektorer kombinerer infeksjonsegenskaper, sikkerhet og meget øket genoverføringskapasitet.

Fortrinnsvis bærer de rekombinante adenovimser ifølge oppfinnelsen i tillegg en heterolog nukleinsyresekvens hvis overføring og/eller ekspresjon i en celle, et organ eller en organisme, er ønsket.

Særlig kan den heterologe DNA-sekvens omfattende ett eller flere terapeutiske gener. De terapeutiske gener som således kan overføres er et hvilket som helst gen hvis transkripsjon og eventuelt traduksjon i målcellen gir produkter med en terapeutisk virkning.

Det kan særlig dreie seg om gener som koder for proteinprodukter med en terapeutisk effekt. Proteinproduktet det kodes for kan være et protein, et peptid, en aminosyre, og så videre. Proteinproduktet kan være homologt vis-å-vis målcellen (det vil si et produkt som vanligvis uttrykkes i målcellen når denne ikke oppviser noen patologi). I dette til-feilet tillater ekspresjonen av et protein for eksempel å bøte på en utilstrekkelig ekspresjon i cellen eller ekspresjon av et protein som er inaktivt eller lite aktivt på grunn av en modifikasjon, eller også å overeksprimere proteinet. Det terapeutiske gen kan også kode for en mutant av et cellulært protein som har en øket stabilitet, en modifisert aktivitet og så videre. Proteinproduktet kan også være heterologt vis-å-vis målcellen. I dette tilfellet kan et protein som uttrykkes for eksempel komplettere eller tilveiebringe en aktivitet

som mangler i cellen og som tillater den å kjempe mot en patologi.

Blant de terapeutiske produkter som omfattes av oppfinnelsen kan særlig nevnes enzy-mer, blodderivater, hormoner, lymfokiner: interleukiner, interferoner, TNF, og så videre (FR 92 03120), vekstfaktorer, neurotransmittorer eller deres forløpere eller synteseen-zymer, trofiske faktorer: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, og så videre; apolipoproteinenene: ApoAI, ApoAIV, ApoE, og så videre (FR 93 05125), dystrofin eller et minidystrofin (FR 91 11947), tumorsuppressorgener: p53, Rb, Rapi A, DCC, k-rev, og så videre (FR 93 04745), gener som koder for faktorer implikert i koa-guleringen: faktorer VII, VIII, IX og så videre, selvmordsgener: thymidinkinase, cyto-sindesaminase, og så videre; eller et hvilket som helst helt eller en del av et naturlig eller kunstig immunoglobulin (Fab, ScFv, og så videre).

Det terapeutiske gen kan likeledes være et antiretningsgen eller -sekvens, hvis ekspresjon i målcellen tillater å kontrollere ekspresjonen av gener eller transkripsjonen av cellulær mRNA. Slike sekvenser kan for eksempel transkriberes, i målcellen, til RNA som er komplementær til cellulær mRNA og således blokkerer deres traduksjon til protein, i henhold til den teknikk som er beskrevet i EP 140 308.

Det terapeutiske gen kan likeledes være et gen som koder for et antigenisk peptid, i stand til å danne en immunrespons hos mennesker. I denne særlige utførelsesform tillater således oppfinnelsen å tilveiebringe vaksiner som tillater å immunisere mennesker, særlig mot mikroorganismer eller vimser. Det kan særlig dreie seg om antigeniske pep-tider som er spesifikke mot Epstein-Barr-vimsen, HIV-vimsen, hepatitt B-virusen (EP 185 573), pseudo-hundegalskap-virusen eller også tumorspesifikke tumorviruser (EP 259 212).

Generelt omfatter den heterologe nukleinsyresekvens også et promoterområde for den funksjonelle transkripsjon i den infiserte celle samt et område som befinner seg ved 3' av genet av interesse, og som spesifiserer et transkripsjonelt sluttsignal og et polyadenyleringssignal. Alle disse elementer utgjør ekspresjonskassetten. Hva angår promoterområdet, kan det dreie seg om et promoterområde som naturlig er ansvarlig for ekspresjonen av det angjeldende gen når dette er i stand til å funksjonere i den infiserte celle. Det kan likeledes dreie seg om områder av forskjellig opprinnelse (ansvarlig for ekspresjonen av andre proteiner, eller også syntetiske). Særlig kan det dreie seg om promotersekvenser av eukaryotiske eller virale gener. For eksempel kan det dreie seg om promotersekvenser som stammer fra genomet av den celle man ønsker å infisere. Videre kan det dreie seg om promotersekvenser fra genomet av en virus, og derunder den benyttede adenovirus. I denne forbindelse kan man for eksempel nevne promoterene av genene EIA, MLP, CMV, RSV, og så videre. Videre kan promoterområdene være modifisert ved addisjon av sekvenser for aktivering, regulering eller som tillater en vevspesiflkk eller overveiende ekspresjon. Når videre den heterologe nukleinsyre ikke omfatter promotersekvenser, kan den innskytes i genomet av den defektive virus nedstrøms en slik sekvens.

Videre kan den heterologe nukleinsyresekvens likeledes, særlig oppstrøms det terapeutiske gen, omfattende en signalsekvens som styrer det syntetiserte, terapeutiske produkt inn i målcellens sekresjons veier. Denne signalsekvens kan være den naturlige signalsekvens for det terapeutiske produkt, men det kan likeledes dreie seg om en hvilken som helst annen funksjonell signalsekvens eller en kunstig signalsekvens.

Ekspresjonskassetten for det terapeutiske gen kan innskytes på forskjellige steder av genomet av den rekombinante adenovirus ifølge oppfinnelsen. Den kan således skytes inn på nivå med delesjonen El. I dette tilfellet lokaliseres den ved siden av (ved 5' eller 3') området eller den funksjonelle del av E4. Den kan likeledes skytes inn på nivå med området E3 i tillegg til eller som erstatning for sekvenser. Den kan likeledes lokaliseres på nivå med det inaktiverte området E4.

Videre som spesielt fordelaktig utførelsesform har oppfinnelsens vektorer et funksjonelt gen E3 under kontroll av en heterolog promoter. Mer spesielt har vektorene en del av genet E3 som tillater ekspresjon av proteinet gpl9K. Dette protein tillater å unngå at adenovirusvektoren blir gjenstand for en immunreaksjon som (i) begrenser dens virkning og (ii) kan føre til uønskede bivirkninger.

De rekombinante adenoviruser ifølge oppfinnelsen kan være av forskjellige opprinnel-ser. Det foreligger således forskjellige adenovirus-serotyper hvis struktur og egenskaper varierer noe, men som oppviser en sammenlignbar, genetisk organisasjon. På grunn av dette kan de opplysninger som gis i foreliggende beskrivelse lett reproduseres av fag-

mannen for enhver type adenovirus.

Mer spesielt kan adenovirusene ifølge oppfinnelsen være av human, animalsk eller blandet human og animalsk opprinnelse.

Hva angår adenoviruser av human opprinnelse, foretrekker man å benytte de som er klassifisert i gruppe C. Blant de forskjellige humane adenoviruser-serotyper foretrekker man innenfor rammen av oppfinnelsen å benytte adenoviruser av type 2 eller 5 (Ad2 eller Ad5).

Som antydet ovenfor, kan adenovirusene ifølge oppfinnelsen likeledes være av animalsk opprinnelse eller omfatte sekvenser som stammer fra adenoviruser av animalsk opprinnelse. Foreliggende oppfinnere har vist at adenoviruser av animalsk opprinnelse er i stand til, med stor effektivitet, å infisere humane celler, og at de ikke er i stand til propagering i de humane celler i hvilke de har vært prøvet (jevnfør FR-søknad 93 05954). Foreliggende oppfinnere har likeledes vist at adenovirusene av animalsk opprinnelse overhodet ikke trans-komplementeres av adenoviruser av human opprinnelse, noe som eliminerer enhver risiko for rekombinering og propagering in vivo, i nærvær av en human adenovirus, noe som skulle kunne føre til dannelse av en infektiøs partikkel. Anvendelsen av adenoviruser eller områder av adenoviruser av animalsk opprinnelse er således særlig fordelaktig fordi de inherente risiki ved anvendelse av vimser som vektorer ved genterapi, ytterligere reduseres.

Adenovimser av animalsk opprinnelse som kan benyttes innenfor rammen av oppfinnelsen kan være av canin, bovin, murin (for eksempel: Mavl, Beard et al., "Virology", 75

(1990) 81), ovin, porcin, aviær eller også simien (eksempel: SAV) opprinnelse. Mere spesielt kan man blant de aviære adenovimser nevne serotypene 1 til 10, tilgjengelige fra ATCC, som for eksempel stammene Phelps (ATCC VR-432), Fontes (ATCC VR-280), P7-A (ATCC VR-827), IBH-2A (ATCC VR-828), J2-A (ATCC VR-829), T8-A (ATCC VR-830), K-l 1 (ATCC VR-921) eller også stammene som er gitt referansene ATCC VR-831 til 835. Blant de bovine adenovimser kan man benytte forskjellige kjente serotyper og særlig de som er tilgjengelige fra ATCC (typene 1 til 8) under referansene ATCC VR-313, 314, 639-642, 768 og 769. Man kan også nevne murine adenovimser FL (ATCC VR-550) og E20308 (ATCC VR-528), ovin-adenovirusetype 5 (ATCC VR-1343) eller type 6 (ATCC VR-1340); porcin-adenoviruset 5359), eller simien-adenoviruser som særlig adenovirusene som er gitt ATCC-referansene VR-591-594, 941-943, 195-203, og så videre. Fortrinnsvis benytter man, blant de forskjellige adenoviruser av animalsk opprinnelse, innenfor rammen av oppfinnelsen, adenoviruser eller områder av adenoviruser av canin-opprinnelse og særlig alle stammer av adenovirus CAV2 [for eksempel stammen Man-hattan eller A26/61 (ATCC VR-800)]. Canin-adenovirusene har vært gjort til gjenstand for tallrike strukturstudier. Således er de fullstendige restriksjonskart for adenovirusene CAV1 og CAV2 beskrevet i teknikken (Spibey et al., "J. Gen. Virol.", 70 (1989) 165), og genene Ela, E3 samt ITR-sekvenser er klonet og sekvensert (se særlig Spibey et al., "Virus Res.", 14 (1989) 241; Linné, "Virus Res.", 23 (1992) 119, WO 91/11525).

Som nevnt innledningsvis angår oppfinnelsen også en fremgangsmåte for fremstilling av en adenovirus som beskrevet ovenfor.

Oppfinnelsen angår således fremstilling av rekombinante adenoviruser som er berøvet replikative partikler, der fremgangsmåten karakteriseres ved at man ko-transfekterer en kompetent cellelinje med

en første DNA omfattende den venstre del av genomet av adenovirusen med en delesjon i området El på nivå med eller nær hvilken det er innskutt minst en funksjonell del av området E4, og

en andre DNA omfattende minst den høyre del av genomet av adenovirusen med et

inaktivert område E4, og en del felles med den første DNA, og

at man gjenvinner de fremstilte adenoviruser ved rekombinasjon.

I denne forbindelse beskriver oppfinnelsen også konstruksjonen av plasmider som bærer den modifiserte, venstre del av genomet av adenovirusen Ad5 (for eksempel plasmidene fra serien pC01-E4). Disse plasmider benyttes særlig for konstruksjon av rekombinante adenoviruser i stedet for genterapi vektorer. Således bærer plasmidene pC01-E4 det venstre området av genomet av adenovirusen, derefter den venstre ITR til nukleotid 6316, med en delesjon av området som ligger mellom nukleotidene 382-3446, tilsvarer locus El, på nivå med hvilket det er innskutt hele en funksjonell del av El. Plasmidene pC01-E4 inneholder således et kloningsmultisete som tillater innarbeiding av en heterolog nukleinsyresekvens av interesse. Plasmidene pC01-E4 kan benyttes for å fremstille de defektive, rekombinante adenoviruser ved ko-transfeksjon med et DNA, fortrinnsvis av viral opprinnelse, tilsvarende den høyre del av genomet av adenovirusen som har et inaktivert E4-område, i en kompetent cellelinje. Hva angår denne siste, kan det dreie seg om genomet av en defektiv virus som Ad2 dl808 som er deletert for området E4 (Weinberg et al., "J. Virol.", 57 (1986) 833), Ad5 dll004, Ad5 dll007, Ad5 dllOl 1 eller Ad5 dll014, og så videre (jevnfør eksemplene). I denne forbindelse angår oppfinnelsen likeledes en fremgangsmåte for fremstilling av rekombinante adenoviruser som er berøvet for replikative partikler, i henhold til hvilken man ko-transfekterer en kompetent cellelinje med

en første DNA som omfatter den venstre del av genomet av adenovirusen med en delesjon i området El på nivå med eller nær hvilken det er innskutt minst en funksjonell del av området E4, og

en andre DNA omfattende minst den høyre del av genomet av adenovirusen med et

inaktivert område E4, og en del av adenovirusen felles med den første DNA, og der man gjenvinner adenovirusene som fremstilles ved homolog rekombinasjon mellom disse DNA'er.

Blant de brukbare cellelinjer kan man særlig nevne den humane embryo-nyrelinje 293 (Graham et al., "J. Gen. Virol.", 36 (1977) 59). Som antydet tidligere inneholder denne linje særlig, integrert i sitt genom, den venstre del av genomet av den humane adenovirus Ad5 (12%). Fortrinnsvis blir ved oppfinnelsens fremgangsmåte den første DNA valgt blant plasmider av typen pC01-E4.

For videre å fremstille en rekombinant adenovirus omfattende et terapeutisk gen, bærer den første eller andre DNA som benyttes i oppfinnelsens fremgangsmåte videre en heterolog DNA-sekvens av interesse.

Derefter blir de multiplikerte, rekombinante vimser gjenvunnet, renset og forsterket i henhold til klassiske teknikker i virologien.

Plasmidene pC01-E4 tillater således konstmksjon av rekombinante adenovimser som bærer en delesjon i området El som går fra nukleotid 382 til nukleotid 3446, på nivå med hvilket hele eller en funksjonell del av El er innskutt, samt eventuelt et terapeutisk gen.

Til slutt angår oppfinnelsen, som angitt innledningsvis, et farmasøytisk preparat som karakteriseres ved at det inneholder minst en defektiv, rekombinant adenovims som beskrevet ovenfor. De farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen kan formuleres med henblikk på administrering ad topisk, oral, parenteral, intranasal, intravenøs, intra-muskulær, subkutan, intraokulær eller transdermal vei, og så videre.

Fortrinnsvis inneholder det farmasøytiske preparat farmasøytiske bærere som er aksep-

table for en injiserbar formulering. Det kan særlig dreie seg om sterile, isotoniske salt-oppløsninger (mono- eller dinatriumfosfat, natrium-, kalium-, kalsium- eller magnesi-umklorid og så videre, eller blandinger av slike salter), videre tørkede og særlig lyofili-serte forbindelser som, ved tilsetning for eksempel av sterilisert vann eller fysiologisk serum, tillater å konstituere injiserbare preparater.

Dosene av virusene som benyttes for injeksjon kan tilpasses som funksjon av forskjellige parametere og særlig som funksjon av den benyttede administreirngsmåte, den angjeldende patologi, genet som skal uttrykkes eller også den tilsiktede behandlings-varighet. Rent generelt blir de rekombinante adenoviruser ifølge oppfinnelsen formulert og administrert i form av doser som ligger mellom 10^ og 10<*4> pfu og fortrinnsvis 10^ til 10^ pfu. Uttrykket pfu eller "plaque forming unit" tilsvarer infeksjonskraften for en virusoppløsning og bestemmes ved infeksjon av en egnet cellekultur og måling, generelt efter 15 dager, av antallet populasjoner av infiserte celler. Bestemmelsesteknikkene for pfu-titeren for en viral oppløsning er vel dokumentert i litteraturen.

Alt efter den innskutte, heterologe DNA-sekvens, kan oppfinnelsens adenoviruser benyttes for terapi eller prevensjon av tallrike patologier inkludert genetiske sykdommer som dystrofi, cystisk fibrose, og så videre, neurodegenerative sykdommer som Alzhei-mers sykdom, Parkinsons syndrom, ALS, og så videre, videre cancere, patologier forbundet med mangler ved koagulering eller dyslipoproteinemier, videre patologier som henger sammen med virale infeksjoner som hepatitt, AIDS, og så videre.

Oppfinnelsen skal beskrives nærmere ved hjelp av de følgende illustrerende eksempler.

Figurforklaring

Figur 1: Genetisk organisasjon av adenovirusen Ad5. Den fullstendige sekvens av Ad5 er disponibel i baser og tillater fagmannen å seleksjonere eller skape et hvilket som helst restriksjonssete samt å isolere et hvilket som helst område av genomet.

Figur 2: Rekombineringsevenementer mellom adenovirusen og linje 293.

Figur 3: Presentasjon av en type vektorer ifølge oppfinnelsen og denne rekombinering med linje 293.

Figur 4: Organisasjon av området E4.

Figur 5: Presentasjon av en adenovirus ifølge oppfinnelsen med permuterte eks-tremiteter. E4+ angir et funksjonelt område E4; AE4 angir et ikke-funksjonelt område E4; Y angir en enkapsideringssekvens. Ekspresjonskassetten for genet av interesse er ikke vist, men kan innskytes som dis-kutert i beskrivelsen.

Figur 6: Presentasjon av en type vektorer ifølge oppfinnelsen (pIX-IVa2).

iDC+rVa2 inneholder minst et funksjonelt omrade IVa2. AE1 ApIX angir en delesjon av adenovirussekvenser mellom området Y og slutten av området som koder for proteinet 140 kD (posisjon 5200) av området E2. Denne delesjon inkluderer likeledes området IVa2 og angår sekvensen som vist i kromosomet i linje 293 nedstrøms området E&b.

Figur 7: Restriksjonskart for fragment Hindlll inneholdt i plasmid pCOl.

Figur 8: Presentasjon av ekspresjonsplasmidene pPY40 og pPY6.

Figur 9: Presentasjon av plasmid pGYlO.

Figur 10: Presentasjon av plasmid pCOl-(ORF6+ORF7).

Figur 11: Presentasjon av plasmid pPY78 og pPY77.

Figur 12: Presentasjon av plasmid pPY15 og pJYl.

Figur 13: Presentasjon av en type virus ifølge oppfinnelsen.

Figur 14: Presentasjon av plasmidene pXL2675 og pXL2757.

Figur 15: Presentasjon av restriksjonskartene for plasmidene pPY66, pPY82 og

pPY75.

Figur 16: (A) skjematiske presentasjon av en homolog rekombinasjon mellom

replikonet HincP/Ad5 og plasmid pPY66 og (B)

Figur 17: Protokoll for å danne det virale genom HincP/Ad[delE4(Y-ITR)] via homolog rekombinasjon av de to replikoner pPY82 og HincP/Ad8delE4-(SacB-SpecR)].

Figur 18: Presentasjon av

HincP/Ad5[ITRYdelE 1 (SacB-SpecR)delE4(Y-ITR)] og HincP/Ad5 [ITRYdelE 1 (ORF6-ORF7)delE4(Y -ITR)]

Figur 19: Restriksjonskart for plasmidene pPY70, pPY71 og pPY72.

Figur 20: Restriksjonskart for plasmidene pGY12, pGY14 og pMC2.

Figur 21: Restriksjonskart for plasmidene pPY91, pPY94 og pPY92.

Figur 22: Protokoll for fremstilling av defektive vimser ifølge oppfinnelsen.

Generelle teknikker i molekylærbiologien

De klassiske metoder som benyttes i molekylærbiologien som preparativ ekstrahering av plasmidisk DNA, sentrifugering av plasmidisk DNA i cesiumkloirdgradient, elektro-forese på agarose eller akrylamidgel, rensing av DNA-fragmenter ved elektroeluering, ekstrahering av proteiner med fenol eller fenol-kloroform, precipitering av DNA i salt-medium med etanol eller isopropanol, transformering i Escherichia coli, og så videre, er alle velkjente for fagmannen og rikelig beskrevet i litteraturen [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (utgivere), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].

Plasmidene av typen pBR322, pUC og fagene fra serie Ml3 er av kommersiell opprinnelse (Bethesda Research Laboratories).

For ligaturene kan fragmentene av DNA separeres i henhold til størrelse ved elektrofo-rese på agarose- eller akrylamidgel, ekstraheres med fenol eller med fenokkloroform, precipiteres fra etanol og inkuberes i nærvær av DNA-ligase av fagen T4 (Biolabs) i henhold til leverandørens anbefalinger.

Oppfyllingen av de proeminente 5'-ender kan gjennomføres med Klenow-rfagmentet av DNA-polymerase I av £. coli (Biolabs) i henhold til leverandørens spesifikasjoner. Destruksjonen av de proeminente 3'-ender gjennomføres i nærvær av DNA-polymerase av fagen T4 (Biolabs), benyttet i henhold til fabrikantens anbefalinger. Destruksjonen av de proeminente 5'-ender gjennomføres ved en behandling tilveiebragt med nukleasen Sl.

Den styrte mutagenese in vitro med syntetiske oligodeoksynukleotider kan gjennomfø-res i henhold til den metode som er utviklet av Taylor et al. ["Nucleic Acids Res.", 13

(1985) 8749-8764] under anvendelse av den kit som markedsføres av Amersham. En-zymatisk forsterkning av DNA-fragmentene ved den teknikk som kalles PCR ["Polymerase-catalyzed Chain Reaction", Saiki R.K. et al., "Science", 230 (1985) 1350-1354; Mullins K.B. og Faloona F.A., "Meth. Enzym.", 155 (1987) 335-350], kan gjennomfø-res ved anvendelse en "DNA thermal cycler" (Perkin Eimer Cetus) i henhold til fabrikantens spesifikasjoner. Verifiseringen av nukleotidsekvensene kan gjennomføres ved den metode som er utviklet av Sanger et al. ["Proe. Nati. Acad. Sei. USA", 74 (1977) 5463-5467] under anvendelse av den kit som markedsføres av Amersham.

Eksempel 1. Konstruksjon av plasmid pCOl ( figur 71.

A - Konstruksjon av plasmid pCE.

Fragmentet EcoRI-Xbal tilsvarende den venstre ende av genomet av adenovirusen Ad5 klones mellom setene EcoRI og Xbal av vektoren pIC19H. Dette gir plasmidet pCA. Plasmid pCA kuttes derefter med Hinfl og de proeminente 5'-ender fylles med Klenow-fragmentet av DNA-polymerase I av E. coli og kuttes derefter med EcoRI. Det således dannede fragment av plasmidet pCA og som inneholder den venstre ende av genomet av adenovirusen Ad5 klones derefter mellom setene EcoRI og Smal av vektoren pIC20H

(Marsh et al., "Gene", 32 (1984) 481). Dette gir plasmid pCB. Plasmidet pCB blir derefter kuttet med EcoRI. De proeminente 5'-ender fylles med Klenow-fragmentet av DNA-polymerase I av E.coli og kuttes derefter med BamHI. Det således dannede fragment av plasmid pCB og som inneholder den venstre ende av genomet av adenovirusen Ad5

klones derefter mellom setene Nrul og Bglll av vektoren pIC20H. Dette gir plasmidet pCE som har et interessant karakteristikum, idet det har de 382 første basepar av adenovirusen Ad5, fulgt av et kloningsmultisete.

B - Konstruksjon av plasmid pCD'.

Fragmentet Sau3A (3346) - Sstl (3645) og fragmentet Ssfl (3645) - Narl (5519) av genomet av adenovirusen Ad5 ligeres og klones mellom setene Clal og BamHI av vektoren pIC20H, noe som gir plasmid pPY53. Fragmentet Sall-Taql av plasmidet pPY53, fremstilt i henhold til en danr-kontekst, inneholdende den venstre del av genomet av adenovirusen Ad5 mellom setene Sau3A (3346) og Taql (5207), klones derefter mellom setene Sali og Clal av vektoren pIC20H, noe som gir plasmidet pCA'. Fragmentet Taql

(5207) - Narl (5519) av genomet av adenovirusen Ad5, fremstilt fra en dam"-kontekst, og fragmentet Sall-Taql av plasmid pCA', ligeres og klones derefter mellom setene Sali og Narl av vektoren pIC20H. Dette gir plasmidet pCC. Fragmentet Narl (5519) - Nrul

(6316) av genomet av adenovirusen Ad5, fremstilt fra en danr-kontekst, og fragmentet Sall-Narl av plasmid pCC blir derefter ligert og klonet mellom setene Sali og Nrul av vektoren pIC20R. Dette gir plasmidet pCD'.

C - Konstruksjon av plasmid pCOl.

En partiell fermentering med Xhol og derefter en fullstendig fermentering med Sali av plasmidet pCD' gir et restriksjonsfragment som inneholder sekvensen av adenovirusen Ad5, fra setet Sau3A (3446) til setet Nrul (6316). Dette fragment klones inn i Sall-setet av plasmidet pCE. Dette gir plasmidet pCOl (figur 7) som inneholder den venstre del av adenovirusen Ad5 helt til setet Hinfl (382), et kloningsmultisete og fragmentet Sau3A (3446) - Nrul (6316) av adenovirusen Ad5.

Eksempel 2. Konstruksjon av plasmider av typen pCQl- E4 ( figur 7).

Dette eksempel beskriver konstruksjonen av plasmider av typen pC01-E4, det vil si plasmider oppnådd ved innarbeiding av hele eller en funksjonell del av området E4 av en adenovirus i plasmidet pCOl (eksempel 1).

2.1. Kloning av området E4 i sin integralitet.

2.1.1. Uttrykt fra den opprinneli<g>e promoter av området E4

Plasmidet pPY2 tilsvarer kloning av fragment Avr2-Sall (ca. 1,3 kb inkludert promoteren/LTR av virusen MMTV) av plasmid pMSG (Pharmacia) mellom setene Xbal og Sali av plasmidet pIC20H fremstilt fra en E. coli dam<+->kontekst.

Plasmidet pPY4 stammer fra plasmid pPY2 ved delesjon av et fragment på 35 pb efter kutting med BamHI og Bgl2 og følgende religering.

Plasmid pPY5 tilsvarer kloning av fragmentet Taql-Bgl2 (posisjon 35576-32490) inkludert området E4 av Ad5 mellom setene Clal og BamHI av plasmidet pIC20H. I dette plasmid er totaliteten av området E4 av Ad5 således omgitt av setene EcoRV og SphI som stammer fra kloningsmultisetet. Den partielle fermenteringen av plasmidet pPY5 med EcoRV og etterfølgende fermentering med SphI tillater å rense et fragment EcoRV-SphI på ca. 3,1 kb inkludert totaliteten av området E4 av Ad5.

Kloning av dette fragment EcoRV-SphI mellom setene Smal og SphI av plasmidet pPY4 gir plasmidet pPY6 (figur 8).

Plasmidet PPY6<*> er identisk med plasmidet pPY6 bortsett fra setet XBal som er destru-ert efter kutting ved oppfylling ved hjelp av Klenow-rfagmentet av DNA-polymerase av E. coli (Biolabs) og etterfølgende religering. Plasmidet pPY6<*> inneholder således totaliteten av området E4 (fra setet Taql i posisjon 35576 og helt til posisjon 32490, lokalisert ca. 300 pb efter polyadenyleringssetet), uttrykt under kontroll av promoteren LTR av

virusen RSV.

Plasmidet pGF144 [F.L. Graham et al., "EMBO J.", (1989) 8 2077-2085] inneholder særlig et fragment Sau3A på 1162 pb inkludert den høyre ende av genomet av Ad5 fra posisjon 34773. Dette fragment klones så inn i setet BamHI av plasmid pIC20H, noe som gir plasmid pGY9 inn i hvilket fragmentet Sau3A nu er inkludert i et fragment BamHI-EcoRI på 1184 pb på grunn av orienteringen av fragmenter i forhold til vektoren. Dette fragment renses ved elektroeluering, kuttes med Acrll og underkastes derefter en partiell hydrolyse med enzymet Maell. Et av restriksjonsproduktene tilsvarer et fragment Maell (35835) - Avrll (35463) som inkluderer promoteren av området E4 av Ad5 og helt til grensen av høyre ITR. Dette fragment på 372 pb renses så elektroeluering og ligering i nærvær av et fragment Avrll-Sall av plasmidet pPY6<*> mellom setene Clal og Sali av plasmidet pCOl noe som gir plasmidet pGYlO (figur 9) og som er av typen pCOI-E4 (figur 7).

2.1.2. Uttrykt fra en heterolog promoter.

i) Ekspresjon av LTR av virusen MMTV.

Plasmidet pPY6 er kilden for et fragment Xhol-Sall på ca. 4,5 kb, tilsvarende ekspresjonskassetten LTR MMTV/E4. Kloningen av denne kassett til setet Sali av plasmidet pCOl gir plasmid pC01-MMTV/E4 (to mulige retninger for området E4 vis-å-vis ITR og sekvensen Y) som er av typen pC01-E4.

ii) Ekspresjon fra promoteren pGRE5.

Kloningen av fragmentet XBal (ca. 1 kb) av plasmid pGRE5 1 inkludert en ekspresjonskassett bestående av en minimal promoter som er høyt induserbar til glukokorticoider og et polyadenyleringssignal [Mader og White, "Proe. Nati. Acad. Sei.", (1993) 90 5603-5607]. Kloningen av dette fragment mellom setene Xbal av plasmidet pIC20H, fremstilt fra en dam"~-kontekst gir plasmidet pPY21 der de 5 bindingsseter for gluko-korticoidreseptoren nu er lokalisert i umiddelbar nærhet av setet Bgl2 som stammer fra kloningsmultisetet. Plasmidet pPY21 er kilde for et fragment Bgl2-EcoRI på ca. 0,8 kb tilsvarende den høyt indukterbare minimalpromoter for glukokorticoider. Kloningen av dette fragment mellom setene Bgl2 og EcoRI av plasmidet pIC20H gir plasmid pPY26.

Plasmidet pPY5 er opphavet til et fragment EcoRV-Hind3 på ca. 0,65 kb som inkluderer fragmentet Taql-Hind3 fra posisjonene 35576 til 34930 på genomet av Ad5. Kloningen av dette fragment mellom setene EcoRV og Hind3 av plasmidet pIC20R gir plasmidet pPY24 i hvilket det nu er lokalisert et EcoRI-sete nær setet Taql (posisjon 35576). Kloningen av fragmentet EcoRI-Hind3 (0,65 kb) av plasmidet pPY24 og fragmentet Hind3-Sphl (ca. 2,4 kb inkludert DNA av Ad5 mellom posisjonene 34930 og 32490) av plasmid pPY5, mellom setene EcoRI og SphI av plasmid pIC20H, gir plasmid pPY37. Dette plasmid er opphav til et fragment EcoRI-SphI på ca. 3,1 kb som bærer totaliteten av området E4 av Ad5 fra posisjon 35576 til 32490. Kloningen av dette fragment mellom setene EcoRI og SphI av plasmid pPY26 gir ekspresjonsplasmidet pPY40 (figur 8) i hvilket område E4 er eksprimert fra promoteren pGRE5.1 dette plasmid er det første donorsetet for spleising av området E4, bevart. Ekspresjonskassetten pGRE5/E4 av plasmidet pPY40 er disponibelt i form av et fragment Bgl2-Sall på ca. 3,9 kb hvis kloning mellom setene BamHI og Sali av plasmidet pCOl gir plasmidet pCOl-pGRE5Æ4 som av typen pC01-E4 (figur 7).

2.2. Kloning av et funksjonelt subområde E4.

2.2.1. Eksprimering fra den opprinnelige promoter av området E4,

i) Minimal sekvens ORF6+ORF7.

Plasmid pGY47' tilsvarer kloningen av fragmentet Bgl2-Sall (som inkluderer området E4 av Ad5 fra posisjonen 34115 til 32490, det vil si totaliteten av lesefasene ORF6 og ORF7 av området E4) av plasmidet pPY6 mellom de tilsvarende seter av plasmidet pIC20R. I plasmidet pGY47' er området ORF6+ORF7 av området E4 nu inkludert i et fragment Clal-Sall på ca. 1,65 kb.

Fragmentet Mae2-Avr2 som tilsvarer sekvensen av Ad5 fra posisjonene 35835 til 35464 renses ved elektroeluering efter partiell hydrolyse med Mae2 og total hydrolyse med Avr2. Dette fragment hydrolyseres så med Taql og fragmentet Mae2-Taql (posisjonene 35835 til 35576) klones i nærvær av fragmentet Clal-Sall (1,65 kb) som stammer fra plasmidet pGY47' mellom setene Clal og Sali av plasmidet pCOl. Et av produktene av reaksjonen tilsvarer plasmidet pC01-(ORF6+ORF7) (figur 10) som er av typen pCOl-E4.

I en annen spesielt interessant utførelsesform blir sekvensen som befinner seg mellom kodonstopperen av ORF7 og setet Bgl2 (helt til posisjon 32490 som inkluderer polyadenyleringssetet av E.4) deletert og erstattet med et heterologt polyadenyleringssete. Således blir fragmentet Xbal-Sall (ca. 0,25 kb) som tilsvarer det "sene" polyadenyleringssignal av virusen SV40, isolert fra plasmid pGL3 og klonet mellom de tilsvarende seter av plasmid pIC20H, fremstilt fra en dam<+->kontekst, noe som gir plasmid pPY76. Kloningen av fragmentet Kpnl-BssH2 (posisjonene 33598 til 33249 i genomet av Ad) og BssH2-Sau3A (posisjonene 33249 til 32891) mellom setene Kpnl og BamHI av plasmidet pPY76 gir plasmid pPY77 (figur 11). Dette plasmid er kilden for et fragment Kpnl-Sall (ca. 0,7 kb omfattende sekvensene mellom posisjonene 33598 til 32891) hvis kloning mellom de tilsvarende seter av plasmidet pC01-(ORF6+ORF7) gir plasmidet pPY78 (figur 11) som er av typen pC01-E4.

ii) Kun sekvens ORF6.

Kloningen av fragmentene Kpnl-BssH2 (posisjonene 33598 til 33249 i genomet av Ad5) og BssH2-Pvu2 (posisjonene 33249 til 33126) mellom setene Kpnl og Smal av plasmidet pPY76 gir plasmidet pPY79. Dette plasmid er kilde for et fragment Kpnl-Sali (ca. 0,5 kb inkludert sekvensene mellom posisjonene 33598 til 33126) hvis kloning mellom de tilsvarende seter av plasmid pC01-(ORF6+ORF7) gir plasmidet pC01-(ORF6) som er av typen pCO!-E4.

iii) Kun sekvens 0RF3.

Et plasmid av typen pC01-E4 i hvilket kun lesefasen 0RF3 av området E4 er til stede, kan også konstrueres på analog måte. Således er det kjent at kun ekspresjon av ORF3 er tilstrekkelig for å komplementere de deleterte vimser for området E4.

2.2.2. Uttrykt fra en heteroloe promoter.

i) Ekspresjon fra LTR av vimsen MMTV.

Fragmentet Bgl2-Xbal (ca. 1,65 kb) av plasmidet pPY6 inkluderer sekvensen av Ad5 mellom posisjonene 34115 og 32490 (ORF6+ORF7 av området E4). Kloningen av dette fragment mellom setene Bgl2 og Xbal av plasmidet pIC20H gir plasmidet pPY13. Dette plasmid omfatter nu under-området E4 (ORF6-ORF7) av Ad5 i et fragment Xhol-Sphl på ca. 1,65 kb. Kloningen av dette fragment mellom setene Sali og SphI av plasmidet pPY4 gir plasmidet pPY15 (figur 12) som omfatter fragmentet Xhol-Sall på ca. 3,1 kb og tilsvarer en ekspresjonskassett av (ORF6-ORF7) av området E4 av Ad5 under kontroll av promoteren LTR av vimsen MMTV. Kloningen av dette fragment i setet Sali av plasmidet pCOl gir plasmidet pC01-MMTV/(ORF6+ORF7) som er av typen pC01-E4.

ii) Ekspresjon fra promoteren pGRE5.

Fragmentet Bgl2-Sall av plasmidet pPY13 (ca. 1,65 kb) inkluderer under-området E4 (ORF6+ORF7) av Ad5. Kloningen av dette fragment mellom setene BamHI og Sali av plasmidet pIC20H gir plasmidet pPY45 i hvilket nu under-området (ORF6+ORF7) er inkludert i et fragment EcoRI-SphI på ca. 1,65 kb. Kloningen av dette fragment mellom setene EcoRI og SphI av plasmidet pPY26 gir plasmidet pJYl (figur 12) som inkluderer en ekspresjonskassett av under-området (ORF6+ORF7), uttrykt fra promoteren pGRE5 i form av et fragment Bgl2-Sall på ca. 2,5 kb. Kloningen av dette fragment Bgl2-Sall mellom setene BamHI og Sali av plasmidet pCOl gir plasmidet pCOl-pGRE5/(ORF6+ORF7) som er av typen pC01-E4 (figur 7).

Eksempel 3. Konstruksjon av rekombinante adenoviruser avledet fra plasmider av typen pCQl- E4.

Dette eksempel beskriver konstmksjonen av rekombinante adenovimser som bærer en delesjon i området El som går fra nukleotid 382 til nukleotid 3446, et inaktivert område E4 og hele eller en funksjonell del av E4 innskutt i delesjonen El.

Kjente teknikker tillater å konstruere og å propagere rekombinante adenoviruser El" E4<+> i linje 293. Plasmidet av typen pC01-E4 kan for eksempel ko-transfekteres i cellene 293 i nærvær av et viralt genom som bærer en modifikasjon/delesjon i området E4 slik at dette området ikke er funksjonelt (i det minste mutasjon i ORF3 og ORF6). Slike viruser er således ikke levedyktige i en linje som ikke funksjonelt transkomplementerer området E4. Derimot kan virusene på forhånd propageres i linjen W162 [Weinberg og Ketner, "Proe. Nati. Acad Sei. (1983) 80 5383-5386] eller i linjene 293E4<+> som beskrevet i FR 94/04590 (18.04.1994). Slike viruser inkluderer virusen Ad2dl808 [Challberg og Ketner, "Virology", (1981) 114,196-209], Ad5dll004, Ad5dll007 eller Ad5dll014 [Bridge og Ketner, "J. Virol." (1989) 63,631-638] eller også Ad5dll011 [Bridge et al., "Virology" (1993), 193, 794-801], og så videre. Således gir ko-transfektering av plasmider av typen pC01-E4, linearisert med enzymet XmmI og viral genomisk DNA av viruser som bærer et ikke-funksjonelt område E4 og begrenset av enzymet Clal, tilsvarende viruser efter homolog rekombinering mellom to DNA'er i linje 293. Disse viruser karakteriseres så ved nærværet av den venstre ITR og en funksjonell enkapsideringssekvens (sekvens Y, for eksempel nukleotidet 1-382), fulgt av et funksjonelt område E4 (hele eller i det minste ORF3 eller ORF6) uttrykt fra en funksjonell promoter og for eksempel den opprinnelige promoter for områder E4 [inkludert i fragmentet Taql

(35576) - Maell (35835)], eller en induktibel promoter, fulgt av området som befinner seg nedstrøms setet Sau3 A lokalisert ved posisjon 3446 av genomet Ad5, og som følger dette til den høyre ITR og således inkluderer delesjonen av funksjonene E4 som er til stede i utgangsvirusen E4" (figur 13). For eksempel kan virusene E1~E4<+> som karakteriseres ved en delesjon E4 til høyre i genomet som stammer fra virusen Ad5dll011, propageres i linje 293 i mengder over 10^ 1 pfu/ml.

Eksempel 4. Innføring av sekvensen til høvre for det virale genom.

4.1. Innføring av en kassett (SacB+SpecR) i området E4.

4.1.1. Konstruksjon av plasmidet pPY66.

Fragmentet Bcll-Avr2 (ca. 0,5 kb) fra plasmidet pFG144 tilsvarer den høyre ende av genomet Ad5 fra setet Avr2 i posisjon 35464. Kloningen av dette fragment mellom setene Xbal og BamHI av plasmidet pIC19H, fremstilt fra en E. coli danr-kontekst, gir plasmidet pPY23. Dette plasmid er opphavet til et fragment Sall-Hae3 på ca. 320 pb som inkluderer den høyre ende av genomet av Ad5 til setet Hae3 i posisjon 35617. Kloningen av dette fragment mellom setene Xhol og EcoRV av plasmidet pIC20H gir plasmidet pPY29.

Fragmentet Bgl2-Smal som tilsvarer genomet av Ad5 mellom posisjonene 32490 og 33093 klones så mellom setene BamHI og Smal av plasmidet pPY29, noe som gir plasmid pPY64. Dette plasmid er kilden til et fragment Xbal-Hind3 hvis kloning mellom de tilsvarende kloningsmultiseter av plasmidet pXL2675 (figur 14) gir plasmidet pPY65. Plasmidet pXL2675 (2513 pb) er en replikon av typen ColEl (som er inkludert i fragmentet BsAl -Pvu2 på ca. 1,15 kb og som stammer fra det kommersielle plasmid pBKS") med et gen som gir resistens mot kanamycin (fra Tn5, plasmid Pharmacia pUCKXXX) i E. coli og et syntetisk kloningsmultisete.

Plasmidet pXL2757 (figur 14) er opphav til et fragment Smal-ECoRV på ca. 4 kb inneholdende genet sacB av B. subtilis og et gen som gir motstandsevne mot spectinomycin i E. coli. Kassetten (SacB+SpecR) av dette fragment, klonet i setet Smal av plasmidet pPY65, gir plasmid pPY66 (figur 15).

4.1.2. Konstruksjon av det virale genom hos E. coli.

Plasmidet pPY66 kan anvendes for å innføre kassetten (SacB+SpecR) ved homolog rekombinasjon mellom et viral genom avledet fra Ad5 og inkludert i en funksjonell replikon hos E. coli polA. Denne teknikk, beskrevet i FR 95 016323, hviler på anvendelsen av visse egenskaper ved replikasjonen i E. coli. Således replikeres replikonene av inkompatibilitetsklassen HincP (og for eksempel RK2) i fravær av enzymet kodet av genet polA. På den annen side har replikonene av typen ColEl (plasmider av typen pUC, pIC, pBR) behov for dette enzym for replikering. På basis av denne observasjon er genomet av Ad5 avledet fra plasmidet pFG144 klonet på plasmid RK2 (av klassen HincP) og derefter innført ved elektroporering i en stamme av E. coli, mutert i genet polA. Fragmentet Xbal som bærer replikonen ColEl (pBR) inkludert i stedet for området E3 i plasmidet pFG144 deleteres så for genomet (søknad FR 95 016323). Dette gir stammen av E. coli kalt E. coli polA/Ad5. Et viktig punkt er at det adenovirale genom som er til stede i denne stamme omgis av setene Pacl på begge sider av ITR'ene og at slike genomer er infektiøse efter transfeksjon i cellene 293.

Innføringen av kassetten (SacB+SpecR) ved homolog rekombinasjon i E. coli polA/Ad5 skjer på følgende måte: a) Plasmidet pPY66 innføres ved elektroporering i E. coli polA/Ad5. En seleksjon i nærvær av spectinomycin og kanamycin gjennomføres. Klonene som er resistente

tilsvarer således dannelsen av et ko-integrat mellom replikonen HincP/Ad5 og plasmidet pPY66.1 kvasi-totaliteten av dette tilfellet har det vært en innskyting av

plasmidet pPY66 ved et homologt rekombinasjonsevenement mellom de to typer replikoner. En klon tilsvarende resultatet av en rekombinasjon på nivå med områdene E4 mellom posisjonene 32490 til 33093 (603 pb) isoleres så (figur 16A).

b) Denne bakterielle klon har en "direkte-retningsrepetisjon" av sekvensene (A og B) på begge sider av kassetten (SacB-SpecR). 603 pb på den ene side og 320 pb (den

høyre ende av genomet) på den annen side. Nærværet av slike sekvenser er en kilde for instabilitet og gir opphav til sjeldne homologe rekombinasjonsevenement er på begge sider av kassetten (SacB+SpecR). Disse homologe rekombinasjonsevenementer fører til ejeksjon av replikonen colEl og således til tapet av markøren for kanamycinresistens. De mest tallrike rekombinasjonsevenementer finner sted på nivå med sekvensen på 603 pb og er ikke interessante fordi de regenererer utgangs-situasjonen, c-a-d, et adenoralt genom med et ikke-modifisert område E4 og som har tapt sin spectinomycinresistenskarakter fordi det ikke lenger har kassetten (SacB+SpecR). De er således ømfintlige overfor dette antibiotikum og er videre i stand til å virke som kilde for karbon i nærvær av sucrose. På den annen side fører et homolog rekombinasjonsevenement på nivå med de 320 pb ved den høyre ende av genomet (sekvens B) til tapet av det i utgangspunktet tilstedeværende området E4 og dettes erstatning med kassetten (SacB+SpecR) (figur 16A). Dette gir kloner av E. coli som kalles E. coli polA/AdS[delE4/SacB+SpecR)]. Slike kloner er resistens mot spectinomycin og er ute av stand til å virke som eneste karbonkilde i nærvær av sucrose. En E. coli-klon med et slikt modifisert genom ved den høyre ende isoleres på grunn av sin spectinomycinresistente og sucrose-sensible "kanamycin-sensible" fenotype.

4.2. Innføring av sekvensen Y til høyre i det virale genom.

4.2.1. Konstruksjon av plasmid pPY83.

Fragmentet Sali-Smal som stammer fra plasmidet pPY6<*> og som tilsvarer genomet av Ad5 fra posisjonen 32490 til 33093 klones så mellom de tilsvarende seter av plasmidet pC07, noe som gir plasmidet pPY81. Plasmidet pC07, oppnådd efter total restriksjon av plasmidet pCOl med Pstl og religering, inneholder således den venstre ende av Ad5 til posisjon 382, kloningsmultisetet av plasmid pCOl, fulgt av sekvensen av Ad5 fra posisjonene 346 og helt til Pst I-setet, lokalisert ved posisjon 3788. Plasmidet pPY81 er opphavet til et fragment H3-Xbal på ca. 1,4 kb hvis kloning mellom de tilsvarende seter av plasmidet pXL2675 gir plasmidet pPY82 hvorav et restriksjonskart er gitt i figur 15.

4.2.2. Konstruksjon av det virale genom hos E. coli.

Innføringen av sekvensen Y i umiddelbar nærhet av den høyre ITR skjer likeledes ved homolog rekombinasjon efter innføring av plasmidet pPY82 ved elektroporering i E. coli, gir det virale genom HincP/Ad5[delE4(Y-ITR)]. Fusjonsevenementet for replikonene seleksjoneres så i nærvær av kanamycin. En klon tilsvarende et homolog rekombinasjonsevenement mellom sekvensene 324900 og 33093, felles med de to replikoner, isoleres derefter (figur 16B). Ejeksjonsevenementet for replikonen ColEl (fra plasmid pXL2675) blir derefter forsterket ved å gjennomføre seleksjonen mot kanamycin gjen-nom et tilstrekkelig antall generasjoner. Glukosen som karbonkilde erstattes så med sucrose og man isolerer derefter bakterieklonene for hvilke ejeksjonsevenementet av replikonen ColEl er skjedd ved homolog rekombinasjon på nivå med ITRen, noe som gir det virale genom HincP/Ad5[delE4(Y+ITR)] (figur 16B). En klon tilsvarende dette evenement isoleres derefter: E. coli polA/Ad5[delE4(Y+ITR)].

Eksempel 5. Gjennomføring av en konstruksjon, brukbar for åoppnå en virus hvis genom oppviser en delesjon av sekvensen Y til venstre.

5.1. Innføring av en kassett (SacB+SpecR) til venstre i det virale genom. Fragmentet Hind3-EcoRV (ca. 0,4 kb) av plasmidet pCOl omfatter den venstre ende av det virale genom til posisjon 382. Kloningen av dette fragment mellom de tilsvarende seter av plasmidet pXL2675 gir plasmidet pPY83. Plasmidet pCOlDSal oppnås efter fermentering av plasmid pCOl (fremstilt i en dam<+->kontekst) ved hjelp av enzymet Xbal, behandling med Klenow-fragmentet av DNA-polymerase I av E. coli og etter-følgende religering. Dette plasmid er kilde for et fragment BamHI-Nsil på ca. 1 kb som omfatter sekvensene av Ad5 fra posisjon 3446 til 4419 (sete Nsil). Kloningen av dette fragment mellom setene BamHI og Pstl av plasmid pIC20R gir plasmidet pPY86 i hvilket sekvensene mellom posisjonene 3446 og 4419 nu inneholdes i et fragment BamHl-Bgl2. Kloningen av dette fragment i setet BamHI av plasmid pPY83 gir plasmid pPY87. Fragmentet Smal-EcoRV tilsvarende kassetten (SacB-SpecR) av plasmidet pXL2757 blir så klonet inn i setet EcoRV av plasmid pPY878, noe som gir plasmid pPY88 (figur 17). Dette plasmid benyttes for, ved en prosedyre analogt den som er

beskrevet i figur 16A, å erstatte den venstre del av genomet HincP/Ad5[delE4(Y+ITR)] med den tilsvarende del som stammer fra plasmid pPY88, noe som gir det virale genom kalt HincP/Ad5[ITRYdelEl(SacB-SpecR)delE4(Y+ITR)] hvis struktur er vist i figur 18.

5.2. Delesjon av sekvensen Y og innføring av et funksjonelt område E4.

5.2.1. Konstruksjon av plasmid pGY50'.

Den høyre ende av genomet av adenovirusen forsterkes ved PCR med oligonukleotidene

5'-CGGCC GAATTCTTAATTAACATCATCAATAATATACCTTATTTTGG-3'

[SEQ ID Nr. 2]

(setene EcoRI og Pacl er understreket) og

5'-CACCACCTGCAGGGAGCCATAACAGTCAGCCTTACC-3' [SEQ ID Nr. 3]

(setet Pstl er understreket) under anvendelse av plasmidet pY23 som substrat (dette plasmid inneholder den høyre ende av det adenovirale genom helt til settet Avr2, lokalisert i posisjon 35464). PCR-forsterkning gir således et fragment på 418 pb tilsvarende den høyre ende av Ad5 og i hvilket et sete Pacl og derefter et sete EcoRI er innført umiddelbart oppstrøms ITR'en, mens et sete Pstl befinner seg lokalisert i umiddelbar nærhet av posisjon 35517. Kloningen av dette fragment mellom setene EcoRI og Pstl av plasmid pUC19, gir plasmidet pXL2624 (jevnfør FR 95 016323).

Fragmentet EcoRI-Taql av plasmidet pXL2624 som tilsvarer den høyre ende av det virale genom fra setet Taql i posisjon 35576 klones mellom setene EcoRI og Clal av plasmid pGY47', noe som gir plasmidet pPY89. Dette plasmid er opphav for et fragment EcoRI-Sali på ca. 2 kb inkludert den høyre ende av det virale genom helt til posisjon 35576, derefter subområdet E4 (ORF6-ORF7) fra posisjonene 34115 til 32490. Kloningen av fragmentene EcoRl-Sall av plasmidet pPY89 og Sall-Nsil (inkludert genomet av Ad5 i posisjonene 3446 til 4419) av plasmidet pCOl mellom setene EcoRI og Pstl av plasmidet pXL2675} gir plasmid pGY50' (figur 17).

5.2.2. Konstruksjon av plasmid pPY90'.

Fragmentet Kpnl-Sstl (ca. 0,95 kb) av plasmid pPY78 tilsvarer den C-terminale ende av området E4 mellom posisjonene 32891 og 33598, umiddelbart fulgt av det "sene" polyadenyleringssignal av virusen SV40. Kloningen av dette fragment mellom de tilsvarende seter av plasmidet pPY89 gir plasmidet pPY90. Dette plasmid er kilde for et fragment EcoRl-Sall på ca. 2 kb inkludert den høyre ende av det virale genom helt til posisjon 35576, efter subområdet E4 (ORF6+ORF7) i posisjonene 34115 til 32891. Kloningen av fragmentene Reol-Sali av plasmidet pPY90 og Sall-Nsil (inkludert genomet av Ad5 fra posisjonene 3446 til 4419) av plasmidet pCOl mellom setene EcoRI og Pstl av plasmidet pXL2675, gir plasmidet pGY90' (figur 17).

5.2.3. Innføring av et funksjonelt E4- område ved den venstre ekstremitet. Plasmidene pGY50' eller pPY90' benyttes for å erstatte, i henhold til en prosedyre analogt det som er beskrevet i figur 16B, den venstre del av genomet HincP/Ad5-[ITRYdelEl(SacB+SpecR)delE4(Y+ITR)] med den tilsvarende del fra nevnte plasmider. For eksempel gir anvendelsen av plasmidet pPY90' det virale genom angitt som

HincP/Ad5[ITRDYdelEl(ORF6+ORF7)[delE40F+ITR)] hvis struktur er gitt i figur 18.

Eksempel 6. Gjennomføring av en konstruksjon som kan benyttes for å oppnå en virus hvis genom har de nve E4- delesjoner til høyre.

6.1. I fravær av sekvensen ¥.

6.1.1. Delesion Mae2- Hae3 ( 32811 - 356171

Plasmidet pPY32 er beskrevet i FR 94 04590 (18.04.94). Dette plasmid er opphav for et fragment Bgl2-Hind3 på ca. 0,65 kb tilsvarende den høyre ende av genomet av Ad5 fra setet Bgl2 (posisjon 32490) og deletert mellom setene Mae2 (posisjon 32811) helt til setet Hae3 (posisjon 35617). Kloningen av dette fragment mellom setene BamHI og Hind3 av plasmidet pXL2675 gir plasmidet pPY70 for hvilket et restriksjonskart er vist i figur 19. Dette plasmid kan anvendes for å innføre en tilsvarende delesjon E4 ved homolog rekombinasjon, for eksempel i E. coli polA/Ad5[delE4(SacB+SpecR)].

6.1.2. Delesion Taql- Avr2 ( 33055- 35464).

Plasmidet pGY12 tilsvarer kloningen av fragmentet BssH2-Mscl (posisjonene 33249-32720) mellom setene BssH2 og EcoRV av det kommersielle plasmid pSLl 180 (figur 20). Kloningen av fragmentene EcoRl-Taql av plasmidet pXL2624 (dette fragment tilsvarer den høyre ende av genomet av Ad5 helt til setet Taql i posisjon 35576) og Taql-BssH2 (posisjonene 35576 til 33249) mellom setene EcoRI og BssH2 av plasmidet pGY12, gir plasmidet pGY13. Dette plasmid er således opphav for et fragment EcoRI-Hpal (ca. 3,25 kb) inkludert den høyre ende av genomet av Ad5 til posisjon 32720. Kloningen av dette fragment mellom setene EcoRI og Smal av plasmid pIC20H gir plasmid pGY14 (figur 20). Dette plasmid er opphav for et fragment EcoRl-BspHl tilsvarende den høyre ende av genomet av Ad5 til posisjon 34700. Kloningen av dette fragment med fragmentet BspHl-Xbal av genomet av Ad5 (posisjonene 33750 til 30470) mellom setene Xbal og EcoRI av plasmidet pIC20H, fremstilt fra en danr-kontekst, gir plasmidet pMC2 (figur 20).

Fragmentet Sphl-Taql som befinner seg mellom posisjonene 31224 og 33055 på genomet av Ad5 renses fra plasmid pMC2 og klones derefter mellom setene SphI og Clal av plasmid pIC20H, noe som gir plasmidet pYJ5. Efter overføring i en E. coli danr-kontekst er dette plasmid opphav til et fragment Bgl2-Xbal som inkluderer sekvensen av det virale genom som befinner seg mellom posisjonene 32490 og 33055. Dette fragment Bgl2-Xbal klones så med fragmentet Avr2-Xhol som stammer fra plasmid pMC2 og inkluderer den høyre ende av det virale genom fra setet Avr2 som befinner seg i posisjon 35464, mellom setene BamHI og Xhol av plasmid pXL2675, noe som gir pias-mid pPY71 (figur 19). Dette plasmid benyttes for å innføre den tilsvarende delesjon E4 ved homolog rekombinasjon, for eksempel E. coli polA/Ad5[delE4(sacB+SpecR)].

6.1.3. Delesion Smal- Smal ( 33093- 35356).

Plasmidet pMC2DSmal oppnås efter total fermentering av plasmidet pMC2 med Smal og etterfølgende religering. Dette plasmid er opphav for et fragment Bgl2-Hind3 på ca. 1,2 kb inkludert totaliteten av den høyre ende av genomet av Ad5 fra posisjon 32490 og er deletert i området E4 mellom posisjonen 33093 og 35356. Kloningen av dette fragment mellom setene BamHI og Hind3 av plasmidet pXL2675 gir plasmidet pPY72 for hvilket et restriksjonskart er gitt i figur 19. Dette plasmid kan anvendes for å innføre den tilsvarende delesjon E4 ved homolog rekombinasjon, for eksempel i E. coli poIA/Ad5-[delE4(SacB-SpecR)].

6.2. I nærvær av sekvensen Y.

6.2.1. Delesion Smal- Smal ( 33093- 35356).

Fragmentet BamHl-EcoRl av plasmidet pGY9 (ca. 1,2 kb) inkluderer den høyre ende

av genomet av Ad5 fra setet Sau3A i posisjon 34773. Dette restriksjonsfragment renses ved elektroeluering, kuttet med Smal og underkastes derefter en partiell hydrolyse med enzymet Mae2. Et av restriksjonsproduktene tilsvarer fragmentet Maell (35835) - Smal

(35356). Kloningen av dette fragment mellom setene Smal og Clal av plasmidet pPY82 gir plasmidet pPY75 (figur 15). Dette plasmid kan benyttes for å innføre den tilsvarende delesjon E4 ved homolog rekombinasjon, for eksempel hos E. coli polA/Ad5[delE4(SacB+SpecR)(Y+ITR)].

6.2.2. Delesion Taql- Smal ( 33055- 35356).

Fragmentet Taql av plasmid pPY82 som inkluderer posisjonene 32490 (sete Sali av kloningsmultisetet) til 33055 klones inn i setet Clal av plasmidet pIC20H, noe som gir plasmidet pICTaq i hvilket sete Xhol av multisetet er posisjonert i umiddelbar nærhet av posisjon 32490. Plasmidet pICTaq er opphav for et fragment Xhol-Smal som inkluderer posisjonene 32490 til 33055 hvis kloning mellom setene Sali og Smal av plasmidet pPY75 gir plasmidet pPY91 (figur 21).

6.2.3. Delesjon Hpa2- Smal ( 32980- 35356).

Fragmentet Sall-Hpa2 av plasmidet pPY82 som inkluderer posisjonene 32490 til 32980 klones mellom setene Sali og Clal av plasmidet pIC20H, noe som gir plasmid pPY93. Dette plasmid er opphav til et fragment Sali-EcoRV som inkluderer posisjonene 32490 til 32980 hvis kloning mellom setene Sali og Smal av plasmidet pPY75 gir plasmidet

pPY94 (figur 21).

6.2.1. Delesion Sau3A- Smal ( 32891- 35356).

Fragmentet Sau3A av plasmidet pPY82 som inkluderer posisjonene 32490 til 32891 klones inn i setet BamHI av plasmidet pIC20H noe som gir plasmidet pICSau hvori Sall-setet av multisetet er posisjonert i umiddelbar nærhet av posisjon 32490. Plasmidet pICSau er opphav for et fragment Sali-Smal som inkluderer posisjonene 32490 til 32891 hvis kloning mellom de tilsvarende seter av plasmidet pPY75 gir plasmidet pPY92 (figur 21).

Eksempel 7. Protokoll for transfeksion av 293- celler med rekombinante genomer, konstruert i E. coli i henhold til eksemplene 4 og 5.

Konstruksjonen av plasmidene som beskrevet i eksemplene 4 og 5 eller analoge plasmider som for eksempel karakteriseres ved forskjellige E4-delesjoner, eller ved modifiserte, funksjonelle E4-områder, eller for eksempel tilsvarende innføringen av en ekspresjonskassett for et gitt terapeutisk gen, anvendes for å tilveiebringe rekombinante, virale genomer ved homolog rekombinasjon hos E. coli polA. Efter verifisering ved restriksjon, isoleres en bakteriell klon og dens plasmiske innhold ekstraheres og renses. DNA'en underkastes så en total fermentering med enzymet Pacl og transfekteres inn i celler 293. Dette DNA er infektiøst (virus E1-E44") og cytopatisk effekt (CPE) kommer til syne efter ca. 2 uker. Denne CPE blir så progressivt forsterket i 293-celler og et viral forråd fremstilles (jevnfør FR 016323).

Eksempel 8. Konstruksjon for fremstilling av en virus hvis genom oppviser en fortrengning i området pIX.

8.1. Konstruksjon av et plasmid pCOl-pIX.

Det er nyttig å modifisere retningen av sekvensene som koder for viral pIX i stedet for genomet, slik at en rekombinasjon mellom det cellulære genom og de virale DNA'er ikke gir noen replikativ partikkel, men en virus som ikke inneholder annet enn sine ITR, områdene EIA og E1B samt sekvensen som koder for pIX. En slik virus er defektiv og meget mindre enn den rekombinante adenovirus, noe som lett tillater separering ved sentrifugering i cesiumklorid under fremstillingen av de virale forråds (figur 22).

Plasmidet pCR2-pIX konstrueres ved kloning i plasmidet PCR2 (Invitrogen) av produk-tet ved forsterkning ved PCR av plasmidet pCOl med oligonukleotidene

Plasmidet pIC-pIX-pA konstrueres ved kloning av fragmentet EcoRV-Eagl av pCR2-pIX, og fragmentet Eagl-BamHI av plasmidet pCI (Promega) inneholdende polyA av SV40 i plasmidet pIC20R, digerert med EcoRV og BamHI.

Plasmidet pCR2-IVa2 konstrueres ved kloning i plasmidet PCR2 (Invitrogen) av pro-duktet fra forsterkning med PCR av plasmidet pCOl med oligonukleotidene

Plasmidet pIC-IVa2-pA konstrueres ved kloning av fragmentet Hind3-Spel av pCR2-IVa2 og fragmentet Xbal-Sphl av plasmidet pCDNA3 (Invitrogen) inneholdende po-lyadenyleringssignalet av en av bovinveksthormonet, i plasmidet pIC20R, digerert med Hind3 og SphI. Fragmentet BstXl-Sall av plasmidet pIC-IVa2-pA klones derefter mellom setene BstXl-Sall av plasmiet pCOl, noe som gir plasmidet pC01-_pLX. Plasmidet pCOl-pIX konstrueres ved innføring av Clal-kassetten av pIC-pLX-pA i setet Clal av pC01-_pIX, slik at genet som koder for pIX er orientert i samme retning som det som koder for IVa2, motsatt sin retning i det adenovirale genom.

Plasmidet pCOl-pIX inneholder således sekvensene ITR-Y av Ad5, en ekpresjonskas-sett av pIX av virusen (promoter og gen av pIX, fulgt av polyA av SV40), orientert i invers retning av den naturlige orientering i Ad5, fulgt av sekvensene av IVa2 hvis polyA er erstattet med den til bovinveksthormonet.

8.2. Konstruksjon av virus.

De rekombinante viruser konstrueres "på klassisk måte" ved ko-transfeksjon i 293-celler av plasmid pCOl-pIX, linearisert med Xhol og med viralDNA av virusen AdRSVBGal, digerert med Clal.

Claims

1. Rekombinant adenovirus, karakterisert ved at den omfatter: et inaktivert El område der inaktiveringen omfatter en delesjon eller en dis rupsjon, et andre inaktivert område der inaktivering ved delesjon i et andre essensielt område ved dets opprinnelige lokasjon i genomet er nødvendig for replikasjonen og propageringen av adenovirusen, og et innskudd av et funksjonelt område ved en posisjon annet enn dets opprinneli ge posisjon, som komplimenterer det andre inaktiverte område og som ikke in-aktiverer noe ytterligere vesentlig område.

2. Adenovirus ifølge krav 1, karakterisert ved at minst et område som er essensielt for dets replikering og/eller propagering er til stede i en genomisk posisjon annen enn den opprinnelige posisjon.

3. Adenovirus ifølge krav 2, karakterisert ved at det essensielle området befinner seg nær eller på nivå med et annet ikke-funksjonelt, genomisk område.

4. Adenovirus ifølge krav 3, karakterisert ved at det ikke-funksjonelle, genomiske området er et område som er inaktivert ved mutasjon og/eller delesjon av en eller flere baser.

5. Adenovirus ifølge krav 3 eller 4, karakterisert ved at det ikke-funksjonelle området er inaktivert ved partiell eller total delesjon.

6. Adenovirus ifølge kravene 2 til 5, karakterisert ved at det ikke-funksjonelle området er representert ved det inaktiverte området El og/eller området E3.

7. Adenovirus ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, karakterisert ved at området El er inaktivert ved delesjon av et fragment PvuII-Bgin som går fra nukleotid 454 til nukleotid 3328 eller et fragment HindII-Sau3A som går fra nukleotid 382 til nukleotid 3446.

8. Adenovirus ifølge et hvilket som helst av kravene 2 til 7, karakterisert ved at området som er essensielt for replikasjonen og/eller den virale levedyktighet er valgt blant hele eller en del av området E4 og/eller området pIX-IVa2, og/eller området pIX og/eller området L5.

9. Adenovirus ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at dets genomiske organisasjon er slik at området E4 er posisjonert helt eller delvis på nivå med eller nær delesjonssetet for området El.

10. Adenovirus ifølge krav 9, karakterisert ved at området E4 er representert ved fragmentet Maell-Mscl tilsvarende nukleotidene 35835-32720.

11. Adenovirus ifølge krav 9, karakterisert ved at området E4 er representert ved minst fasen som koder ORF3.

12. Adenovirus ifølge krav 7 eller 8, karakterisert ved at området E4 er representert ved minst fasen som koder ORF6.

13. Adenovirus ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, karakterisert ved at dens genomiske organisasjon er slik at hele området som koder for proteinene pIX og IVa2 er posisjonert på nivå med området E3, eventuelt som erstatning for deleterte sekvenser.

14. Adenovirus ifølge krav 13, karakterisert ved at området som koder for pIX-IVa2 består av et fragment Bglll-Nrul omfattende nukleotidene 3328 til 6316 på sekvensen for adenovirusen Ad5.

15. Adenovirus ifølge krav 1, karakterisert ved at produksjonslinjen er linje 293.

16. Adenovirus ifølge krav 1, karakterisert ved at dens genom har områder El og E4 som er inaktivert og at hele eller en funksjonell del av området E4 er til stede på nivå med eller nær det inaktiverte området El.

17. Adenovirus ifølge krav 1, karakterisert ved at dens genomiske organisasjon er slik at hele området som koder for proteinet pIX og hele eller kun en funksjonell del av området E4 er flyttet fra sin opprinnelige posisjon.

18. Adenovirus ifølge krav 17, karakterisert ved at de to områder er flyttet til nivå med området El som erstatning for delerte sekvenser.

19. Adenovirus ifølge krav 17 eller 18, karakterisert ved at leserammen omfatter området som koder for proteinet pLX er anbragt der på invers måte.

20. Adenovirus ifølge kravene 17,18 eller 19, karakterisert ved at den venstre ende omfattende ITR og enkapsideringsområdet, og den høyre ende omfattende ITR, er permutert.

21. Adenovirus ifølge krav 1, karakterisert ved at dens genom har et inaktivert område El og ved at den venstre ende omfattende ITR og enkapsideirngsområdet og den høyre ende omfattende ITR og hele eller en funksjonell del av området E4, er permutert.

22. Adenovirus ifølge krav 20 eller 21, karakterisert ved at den venstre ende er inneholdt de første 382 nukleotider av genomet av Ad5 og den høyre ende er inneholdt i de siste 3215 nukleotider av genomet av Ad5.

23. Adenovirus ifølge krav 1, karakterisert ved at dens genom har inaktiverte områder El og L5 og at hele eller en funksjonell del av området L5 er til stede på nivå med eller nær det inaktiverte området El.

24. Adenovirus ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at den omfatter ITR'ene og et enkapsideringsområde.

25. Adenovirus ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at den omfatter en heterolog nukleinsyresekvens.

26. Adenovirus ifølge krav 25, karakterisert ved at den heterologe nukleinsyresekvens omfatter ett eller flere terapeutiske gener.

27. Adenovirus ifølge krav 25 eller 26, karakterisert ved at den heterologe nukleinsyresekvens er til stede på nivå med områdene El, E3 eller E4, som supplement for eller erstatning for delerte sekvenser.

28. Adenovirus ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, karakterisert ved at genomet av adenovirusen er av human, animalsk eller blandet opprinnelse.

29. Adenovirus ifølge krav 28, karakterisert ved at adenovirusen av human opprinnelse er valgt blant klassene i gruppe C, fortrinnsvis blant adenovirusene av type 2 eller 5 (Ad2 eller Ad5).

30. Adenovirus ifølge krav 28, karakterisert ved at adenovirusene av animalsk opprinnelse er valgt blant adenoviruser av canin, bovin, murin, ovin, porcin, aviær eller simien opprinnelse.

31. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det inneholder minst en defektiv, rekombinant adenovirus ifølge ett av kravene 1 til 30.

32. Farmasøytisk preparat ifølge krav 31, karakterisert ved at det omfatter en farmasøytisk akseptabel bærer for en injiserbar formulering.

33. Fremgangsmåte for fremstilling av rekombinante adenoviruser ifølge krav 1, berøvet replikative partikler, karakterisert ved at man ko-transfekterer en kompetent cellelinje med en første DNA omfattende den venstre del av genomet av adenovirusen med en delesjon i området El på nivå med eller nær hvilken det er innskutt minst en funksjonell del av området E4, og en andre DNA omfattende minst den høyre del av genomet av adenovirusen med et inaktivert område E4, og en del felles med den første DNA, og at man gjenvinner de fremstilte adenoviruser ved rekombinasjon.

34. Fremgangsmåte ifølge krav 33, karakterisert ved at cellelinjen er linje 293.

35. Fremgangsmåte ifølge krav 33, karakterisert ved at den første DNA velges blant plasmider av typen pC01-E4.

36. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 33 til 35, karakterisert ved at den første eller andre DNA i tillegg bærer en heterolog DNA-sekvens av interesse.