JP5905460B2 - 抗がんアデノウイルス - Google Patents

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Description

関連出願の引用
本願は、２０１０年８月１６日に出願された米国仮出願第６１／３７４，２１５号の利益を主張する。米国仮出願第６１／３７４，２１５号は、その全体が、全ての目的のために、本明細書中に参考として援用される。
発明の背景
連邦政府の後援による研究または開発の下でなされた発明に対する権利に関する記載
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）に認定されたＣＡ１３７０９４の下で政府支援によりなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
発明の背景
異なるヒト組織に感染する５２種のヒトアデノウイルス、および魚類から霊長類までにわたる他の種に感染する数百のアデノウイルスが存在する。これらのウイルスは、感染後１時間以内にそれらのゲノムのペイロードを核に送達する非常に効率的なナノマシンである。ＤＮＡウイルスと同様に、これらは宿主ＤＮＡ内には組み込まれず、確立されたＧＭＰプロトコールを使用して高力価に産生させることができ、また、異所性遺伝子を発現させることに関して、研究およびヒト遺伝子治療への適用において安全性が実証されている。しかし、現在まで、これらの潜在的な適用は、ほぼ１つの変種、Ａｄ５またはＡｄ２／５キメラのみが用いられていること、および急速かつ系統的に複数の遺伝子改変を工学的に作り出し、組み合わせることができないことによって妨げられてきた。したがって、アデノウイルスベクターのレパートリーをＡｄ２／５のそれを越えて広げる必要性および構成要素の部分から新規のアデノウイルスゲノムを急速に新規に構築することを容易にする科学技術的なプラットフォームを開発し、複数の改変および異種性エレメントの系統的な組み入れを可能にする必要性が高い。そのような系は、３６遺伝子（スプライスバリアントを含めず）の送達および発現の両方において非常に効率的な天然のウイルスの構築様式（ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ）を利用する。この系により、異なる腫瘍試料において調節解除された経路活性の複合的かつ定量的な測定を組み入れる有力な診断薬および治療薬がもたらされ得る。
いくつかの適用におけるアデノウイルスベクターの潜在性は、３６ｋｂのウイルスゲノムを急速かつ系統的に操作する能力により妨げられている。さらに、基礎研究、動物モデル、遺伝子治療および腫瘍細胞崩壊療法において使用されるアデノウイルスベクターはアデノウイルス（Ａｄ）血清型２型および５型に限られている。Ａｄ２およびＡｄ５は、最初に発見されたものであり、そのようなものとして、それらのゲノム、特にそのＥ１領域において操作するために用いるベクター／ツールが受け継がれている。Ａｄ２／５線維タンパク質は、受容体ＣＡＲに結合することによって上皮細胞に感染する。残念ながら、ＣＡＲは全ての細胞型において発現されるのではなく、また、多くの転移で下方制御される。さらに、ヒト集団のおよそ８０％がＡｄ２／５に対する既存の中和抗体を有し、それが、オフターゲットの肝臓取り込みおよび炎症と共に、全身への適用を制限している。したがって、遺伝子送達およびがん療法のためのＡｄ２／５ベクターの使用は、必ずしも最適な選択ではなく、それどころか、大部分は歴史上の偶然である。
本発明者らの最終の目標は、腫瘍選択的溶解性複製を行うだけでなく、何回も繰り返される処置において全身的に投与することができ、肝毒性を回避し、複雑な腫瘍脈管構造を効率的に標的化し、横断し、細胞に異なる受容体を介して感染し、プロドラッグ活性化酵素／毒素の発現を腫瘍内に局在化させることにより腫瘍バイスタンダー効果を生じ、有益な宿主抗腫瘍免疫応答を呼び起こす強力なウイルスがん療法を工学的に作製することである。これらは、ヒトアデノウイルスがマウスにおいて複製することができないことによりさらに複雑になる主要な難題である。これは、異種移植片モデルを超える多くの利点を有する、がんの、免疫コンピテントな遺伝子操作されたマウスモデル（ＧＥＭＭ）においてヒト腫瘍細胞崩壊ウイルスを評価することの妨げになる。
ヒトアデノウイルスは５２種あり、異なる宿主組織環境に感染し、複製するために高度に特殊化された適応を示す。これらのウイルスの多くは、種々の組織に感染し、ＣＡＲ以外の細胞受容体に結合する線維タンパク質ならびに「Ｅ３」免疫調節遺伝子の別個のコホートを有する。それらのゲノムを改変するために必要なツールがないので、それらの独特の性質についての広範囲にわたる試験や活用はなされていない。同様に、マウスアデノウイルス（ＭＡＶ−１）を含めた、他の種に感染するアデノウイルスもある。
本明細書では、当技術分野におけるこれらの問題および他の問題に対する解決法が提供される。
一態様では、改変アデノウイルスが提供される。上記改変アデノウイルスは、ｐ５３により複製が障害されるアデノウイルスであってよい。上記ｐ５３により複製が障害されるアデノウイルスは、ｐ５３発現細胞内に存在する場合には複製が障害され、ｐ５３が障害された細胞内に存在する場合は複製が障害されない。
別の態様では、がんを処置する方法が提供される。当該方法は、有効量（例えば、治療有効用量または量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｄｏｓｅ ｏｒ ａｍｏｕｎｔ））の改変アデノウイルス（上記の）または上記改変アデノウイルスをコードする１種または複数種の核酸を、それを必要とする被験体に投与するステップを含む。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
ｐ５３により複製が障害される、かつＥ４−ＯＲＦ３が障害されたアデノウイルス。
（項目２）
単離されている、項目１に記載のアデノウイルス。
（項目３）
組換え体である、項目１に記載のアデノウイルス。
（項目４）
変異したＥ４−ＯＲＦ３遺伝子を含む、項目１に記載のアデノウイルス。
（項目５）
前記Ｅ４−ＯＲＦ３遺伝子またはその機能部分が欠失している、項目４に記載のアデノウイルス。
（項目６）
前記Ｅ４−ＯＲＦ３が障害されたアデノウイルスはＥ１Ｂ−５５ｋもまた障害されている、項目１に記載のアデノウイルス。
（項目７）
変異したＥ１Ｂ−５５ｋ遺伝子を含む、項目６に記載のアデノウイルス。
（項目８）
前記Ｅ１Ｂ−５５ｋ遺伝子またはその機能部分が欠失している、項目７に記載のアデノウイルス。
（項目９）
項目１に記載のＥ４−ＯＲＦ３が障害されたアデノウイルスに感染した細胞。
（項目１０）
がんを処置する方法であって、有効量の、項目１に記載のアデノウイルスを、それを必要とする被験体に投与するステップを含む、方法。
（項目１１）
前記がんがｐ５３に関連するがんである、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記がんが肺がん、皮膚がんまたは乳がんである、項目１０に記載の方法
（項目１３）
処置しようとするがんが前がん状態の乳がんである、項目１０に記載の方法。
図１は、アデノウイルスを感染させた初代細胞または腫瘍細胞において、ＡＲＦの発現とは関係なく、Ｅ１Ｂ−５５ｋおよびｐ５３の分解が損失することにより、転写活性ではなく、ｐ５３レベルが誘導されることを示す。ａ．ヒト初代小気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）に、偽ウイルス、野生型（ｗｔ）ウイルスまたはΔＥ１Ｂ−５５ｋ（Δ５５ｋ）ウイルスのいずれかを感染させ、感染後２４時間（２４ｈ．ｐ．ｉ．）、感染後３６時間（３６ｈ．ｐ．ｉ．）および感染後４８時間（４８ｈ．ｐ．ｉ．）の時点で回収した。タンパク質溶解物を、ｐ５３、ｐ２１、ＭＤＭ２およびＡＲＦの発現について、正規化し、解析した。ローディングコントロールとしてアクチンの発現を解析した。ｂ．Ｕ２ＯＳ細胞に、偽ウイルス、ｗｔウイルスまたはΔ５５ｋウイルスを感染させ、２８ｈ．ｐ．ｉ．の時点で固定した。免疫蛍光法によってｐ５３を検出し、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素を用いてＤＮＡ対比染色を行った。ｃ．Ｕ２ＯＳ細胞に、偽ウイルス、ｗｔウイルスまたはΔ５５ｋウイルスを感染させ、２４ｈ．ｐ．ｉ．、３６ｈ．ｐ．ｉ．および４８ｈ．ｐ．ｉ．の時点で回収した。ｐ５３の活性化についての陽性対照として１２時間にわたるドキソルビシン（ｄｏｘ）処理を用いた。タンパク質溶解物を、ｐ５３、ｐ２１およびＭＤＭ２の発現について、正規化し、解析した。ローディングコントロールとしてアクチンの発現を解析した。ｄ．イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性ＡＲＦを有するＵ２ＯＳ安定細胞系（ＮＡＲＦ細胞）に、偽ウイルス、ｗｔウイルスまたはΔ５５ｋウイルスのいずれかを感染させた。細胞を無処理のままにしたか、または８ｈ．ｐ．ｉ．の時点でＩＰＴＧを加えてＡＲＦの発現を誘導した。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で、リアルタイムＰＣＲを用いてｐ２１およびＭＤＭ２のｍＲＮＡのレベルを定量化し（下のパネル）、それが偽感染細胞（−ＡＲＦ）に対する（ｗｉｔｈ ｒｅｓｐｅｃｔ ｔｏ）（ｗｒｔ）倍数変化としてプロットされており；垂直の棒は３連全体にわたる標準偏差を示す。タンパク質溶解物も回収し（４８ｈ．ｐ．ｉ．）、ｐ５３、ｐ２１、ＭＤＭ２およびＡＲＦの発現について、正規化し、解析した（上のパネル）。ローディングコントロールとしてアクチンを使用した。 図１は、アデノウイルスを感染させた初代細胞または腫瘍細胞において、ＡＲＦの発現とは関係なく、Ｅ１Ｂ−５５ｋおよびｐ５３の分解が損失することにより、転写活性ではなく、ｐ５３レベルが誘導されることを示す。ａ．ヒト初代小気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）に、偽ウイルス、野生型（ｗｔ）ウイルスまたはΔＥ１Ｂ−５５ｋ（Δ５５ｋ）ウイルスのいずれかを感染させ、感染後２４時間（２４ｈ．ｐ．ｉ．）、感染後３６時間（３６ｈ．ｐ．ｉ．）および感染後４８時間（４８ｈ．ｐ．ｉ．）の時点で回収した。タンパク質溶解物を、ｐ５３、ｐ２１、ＭＤＭ２およびＡＲＦの発現について、正規化し、解析した。ローディングコントロールとしてアクチンの発現を解析した。ｂ．Ｕ２ＯＳ細胞に、偽ウイルス、ｗｔウイルスまたはΔ５５ｋウイルスを感染させ、２８ｈ．ｐ．ｉ．の時点で固定した。免疫蛍光法によってｐ５３を検出し、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素を用いてＤＮＡ対比染色を行った。ｃ．Ｕ２ＯＳ細胞に、偽ウイルス、ｗｔウイルスまたはΔ５５ｋウイルスを感染させ、２４ｈ．ｐ．ｉ．、３６ｈ．ｐ．ｉ．および４８ｈ．ｐ．ｉ．の時点で回収した。ｐ５３の活性化についての陽性対照として１２時間にわたるドキソルビシン（ｄｏｘ）処理を用いた。タンパク質溶解物を、ｐ５３、ｐ２１およびＭＤＭ２の発現について、正規化し、解析した。ローディングコントロールとしてアクチンの発現を解析した。ｄ．イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性ＡＲＦを有するＵ２ＯＳ安定細胞系（ＮＡＲＦ細胞）に、偽ウイルス、ｗｔウイルスまたはΔ５５ｋウイルスのいずれかを感染させた。細胞を無処理のままにしたか、または８ｈ．ｐ．ｉ．の時点でＩＰＴＧを加えてＡＲＦの発現を誘導した。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で、リアルタイムＰＣＲを用いてｐ２１およびＭＤＭ２のｍＲＮＡのレベルを定量化し（下のパネル）、それが偽感染細胞（−ＡＲＦ）に対する（ｗｉｔｈ ｒｅｓｐｅｃｔ ｔｏ）（ｗｒｔ）倍数変化としてプロットされており；垂直の棒は３連全体にわたる標準偏差を示す。タンパク質溶解物も回収し（４８ｈ．ｐ．ｉ．）、ｐ５３、ｐ２１、ＭＤＭ２およびＡＲＦの発現について、正規化し、解析した（上のパネル）。ローディングコントロールとしてアクチンを使用した。 図１は、アデノウイルスを感染させた初代細胞または腫瘍細胞において、ＡＲＦの発現とは関係なく、Ｅ１Ｂ−５５ｋおよびｐ５３の分解が損失することにより、転写活性ではなく、ｐ５３レベルが誘導されることを示す。ａ．ヒト初代小気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）に、偽ウイルス、野生型（ｗｔ）ウイルスまたはΔＥ１Ｂ−５５ｋ（Δ５５ｋ）ウイルスのいずれかを感染させ、感染後２４時間（２４ｈ．ｐ．ｉ．）、感染後３６時間（３６ｈ．ｐ．ｉ．）および感染後４８時間（４８ｈ．ｐ．ｉ．）の時点で回収した。タンパク質溶解物を、ｐ５３、ｐ２１、ＭＤＭ２およびＡＲＦの発現について、正規化し、解析した。ローディングコントロールとしてアクチンの発現を解析した。ｂ．Ｕ２ＯＳ細胞に、偽ウイルス、ｗｔウイルスまたはΔ５５ｋウイルスを感染させ、２８ｈ．ｐ．ｉ．の時点で固定した。免疫蛍光法によってｐ５３を検出し、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素を用いてＤＮＡ対比染色を行った。ｃ．Ｕ２ＯＳ細胞に、偽ウイルス、ｗｔウイルスまたはΔ５５ｋウイルスを感染させ、２４ｈ．ｐ．ｉ．、３６ｈ．ｐ．ｉ．および４８ｈ．ｐ．ｉ．の時点で回収した。ｐ５３の活性化についての陽性対照として１２時間にわたるドキソルビシン（ｄｏｘ）処理を用いた。タンパク質溶解物を、ｐ５３、ｐ２１およびＭＤＭ２の発現について、正規化し、解析した。ローディングコントロールとしてアクチンの発現を解析した。ｄ．イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性ＡＲＦを有するＵ２ＯＳ安定細胞系（ＮＡＲＦ細胞）に、偽ウイルス、ｗｔウイルスまたはΔ５５ｋウイルスのいずれかを感染させた。細胞を無処理のままにしたか、または８ｈ．ｐ．ｉ．の時点でＩＰＴＧを加えてＡＲＦの発現を誘導した。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で、リアルタイムＰＣＲを用いてｐ２１およびＭＤＭ２のｍＲＮＡのレベルを定量化し（下のパネル）、それが偽感染細胞（−ＡＲＦ）に対する（ｗｉｔｈ ｒｅｓｐｅｃｔ ｔｏ）（ｗｒｔ）倍数変化としてプロットされており；垂直の棒は３連全体にわたる標準偏差を示す。タンパク質溶解物も回収し（４８ｈ．ｐ．ｉ．）、ｐ５３、ｐ２１、ＭＤＭ２およびＡＲＦの発現について、正規化し、解析した（上のパネル）。ローディングコントロールとしてアクチンを使用した。 図１は、アデノウイルスを感染させた初代細胞または腫瘍細胞において、ＡＲＦの発現とは関係なく、Ｅ１Ｂ−５５ｋおよびｐ５３の分解が損失することにより、転写活性ではなく、ｐ５３レベルが誘導されることを示す。ａ．ヒト初代小気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）に、偽ウイルス、野生型（ｗｔ）ウイルスまたはΔＥ１Ｂ−５５ｋ（Δ５５ｋ）ウイルスのいずれかを感染させ、感染後２４時間（２４ｈ．ｐ．ｉ．）、感染後３６時間（３６ｈ．ｐ．ｉ．）および感染後４８時間（４８ｈ．ｐ．ｉ．）の時点で回収した。タンパク質溶解物を、ｐ５３、ｐ２１、ＭＤＭ２およびＡＲＦの発現について、正規化し、解析した。ローディングコントロールとしてアクチンの発現を解析した。ｂ．Ｕ２ＯＳ細胞に、偽ウイルス、ｗｔウイルスまたはΔ５５ｋウイルスを感染させ、２８ｈ．ｐ．ｉ．の時点で固定した。免疫蛍光法によってｐ５３を検出し、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素を用いてＤＮＡ対比染色を行った。ｃ．Ｕ２ＯＳ細胞に、偽ウイルス、ｗｔウイルスまたはΔ５５ｋウイルスを感染させ、２４ｈ．ｐ．ｉ．、３６ｈ．ｐ．ｉ．および４８ｈ．ｐ．ｉ．の時点で回収した。ｐ５３の活性化についての陽性対照として１２時間にわたるドキソルビシン（ｄｏｘ）処理を用いた。タンパク質溶解物を、ｐ５３、ｐ２１およびＭＤＭ２の発現について、正規化し、解析した。ローディングコントロールとしてアクチンの発現を解析した。ｄ．イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性ＡＲＦを有するＵ２ＯＳ安定細胞系（ＮＡＲＦ細胞）に、偽ウイルス、ｗｔウイルスまたはΔ５５ｋウイルスのいずれかを感染させた。細胞を無処理のままにしたか、または８ｈ．ｐ．ｉ．の時点でＩＰＴＧを加えてＡＲＦの発現を誘導した。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で、リアルタイムＰＣＲを用いてｐ２１およびＭＤＭ２のｍＲＮＡのレベルを定量化し（下のパネル）、それが偽感染細胞（−ＡＲＦ）に対する（ｗｉｔｈ ｒｅｓｐｅｃｔ ｔｏ）（ｗｒｔ）倍数変化としてプロットされており；垂直の棒は３連全体にわたる標準偏差を示す。タンパク質溶解物も回収し（４８ｈ．ｐ．ｉ．）、ｐ５３、ｐ２１、ＭＤＭ２およびＡＲＦの発現について、正規化し、解析した（上のパネル）。ローディングコントロールとしてアクチンを使用した。 図２は、アデノウイルス感染細胞では、Ｅ１Ｂ−５５ｋが欠失することにより、高レベルのリン酸化ｐ５３が誘導されるが、ｐ５３の転写標的は優勢に抑制され、放射線、遺伝子毒性薬、ＡＲＦ、ＭＤＭ２アンタゴニストまたはヒストン脱アセチル化酵素阻害剤によって活性化することができないことを示す。ａ．Ｕ２ＯＳ細胞に、偽ウイルス、ｗｔウイルスまたはΔ５５ｋウイルスのいずれかを感染させた。２４ｈ．ｐ．ｉ．の時点で試料をビヒクル対照（−）または５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）で処理した。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点でタンパク質溶解物を回収し、ｐ５３およびｐ２１の発現について、正規化し、解析した。ローディングコントロールとしてアクチンを解析した。ｂ．ＳＡＥＣに、偽ウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはｗｔウイルスのいずれかを感染させた。細胞を無処理のままにしたか、または３１ｈ．ｐ．ｉ．の時点でγ線を１０Ｇｙで照射（ＩＲ）した。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点でタンパク質溶解物（下のパネル）を回収し、ｐ５３、ｐ２１およびＭＤＭ２の発現について、正規化し、解析した。リン酸化部位特異的（ｐｈｏｓｐｈｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体を使用してセリン（ｓｅｒ）１５におけるｐ５３のリン酸化を検出した。ローディングコントロールとしてアクチンを使用した。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で全ＲＮＡも回収し、ｐ５３の転写標的をリアルタイムＰＣＲによって定量化した（上のパネル）。ＰＵＭＡ、ＭＤＭ２、ｐ２１、ＧＡＤＤ４５Ａおよび１４−３−３σのレベルが、０時間における感染させていない細胞に対する（ｗｒｔ）倍数変化としてプロットされており；垂直の棒は３連全体にわたる標準偏差を示す。ｃ．ＳＡＥＣに偽ウイルスまたはΔ５５ｋウイルスを感染させ、３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で回収した。ｐ５３の活性化についての陽性対照として１２時間にわたるドキソルビシン処理を用いた。タンパク質溶解物を、総ｐ５３レベルおよびｐ２１レベルについて、正規化し、ウエスタンブロット法によって解析した。ｓｅｒ６およびｓｅｒ９（カゼインキナーゼ１）、ｓｅｒ１５（ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＤＮＡ−ＰＫ）、ｓｅｒ２０（ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、ＪＮＫ、ＭＡＰＫＡＰ２）、ｓｅｒ３３（ｐ３８、ＰＩＮ１）、ｓｅｒ４６（ＨＩＰＫ２およびＤＹＲＫ２）、トレオニン（ｔｈｒ）８１（ＪＮＫ、ＰＩＮ１）、ｓｅｒ３１５（オーロラキナーゼ、ＰＩＮ１、ＣＤＫ２およびＧＳＫ−３）およびｓｅｒ３９２（ＰＫＲ、ＣＤＫ９およびｐ３８ＦＡＣＴ−ＣＫ２）３におけるｐ５３のリン酸化を、ｐ５３リン酸化部位特異的抗体を使用して決定した。ｄ．ＳＡＥＣに、偽ウイルス、ｗｔウイルスまたはΔ５５ｋウイルスを感染させた。２４ｈ．ｐ．ｉ．の時点で、試料をビヒクル対照（−レーン）、ドキソルビシン（ｄｏｘ）、ＭＤＭ２アンタゴニスト、ヌトリン（ｎｕｔｌｉｎ）、またはトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）で処理した。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点でタンパク質溶解物を回収し、ｐ５３、ＭＤＭ２およびｐ２１について、正規化し、ウエスタンブロット法によって解析した。ローディングコントロールとしてアクチンを使用した。 図２は、アデノウイルス感染細胞では、Ｅ１Ｂ−５５ｋが欠失することにより、高レベルのリン酸化ｐ５３が誘導されるが、ｐ５３の転写標的は優勢に抑制され、放射線、遺伝子毒性薬、ＡＲＦ、ＭＤＭ２アンタゴニストまたはヒストン脱アセチル化酵素阻害剤によって活性化することができないことを示す。ａ．Ｕ２ＯＳ細胞に、偽ウイルス、ｗｔウイルスまたはΔ５５ｋウイルスのいずれかを感染させた。２４ｈ．ｐ．ｉ．の時点で試料をビヒクル対照（−）または５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）で処理した。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点でタンパク質溶解物を回収し、ｐ５３およびｐ２１の発現について、正規化し、解析した。ローディングコントロールとしてアクチンを解析した。ｂ．ＳＡＥＣに、偽ウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはｗｔウイルスのいずれかを感染させた。細胞を無処理のままにしたか、または３１ｈ．ｐ．ｉ．の時点でγ線を１０Ｇｙで照射（ＩＲ）した。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点でタンパク質溶解物（下のパネル）を回収し、ｐ５３、ｐ２１およびＭＤＭ２の発現について、正規化し、解析した。リン酸化部位特異的（ｐｈｏｓｐｈｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体を使用してセリン（ｓｅｒ）１５におけるｐ５３のリン酸化を検出した。ローディングコントロールとしてアクチンを使用した。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で全ＲＮＡも回収し、ｐ５３の転写標的をリアルタイムＰＣＲによって定量化した（上のパネル）。ＰＵＭＡ、ＭＤＭ２、ｐ２１、ＧＡＤＤ４５Ａおよび１４−３−３σのレベルが、０時間における感染させていない細胞に対する（ｗｒｔ）倍数変化としてプロットされており；垂直の棒は３連全体にわたる標準偏差を示す。ｃ．ＳＡＥＣに偽ウイルスまたはΔ５５ｋウイルスを感染させ、３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で回収した。ｐ５３の活性化についての陽性対照として１２時間にわたるドキソルビシン処理を用いた。タンパク質溶解物を、総ｐ５３レベルおよびｐ２１レベルについて、正規化し、ウエスタンブロット法によって解析した。ｓｅｒ６およびｓｅｒ９（カゼインキナーゼ１）、ｓｅｒ１５（ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＤＮＡ−ＰＫ）、ｓｅｒ２０（ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、ＪＮＫ、ＭＡＰＫＡＰ２）、ｓｅｒ３３（ｐ３８、ＰＩＮ１）、ｓｅｒ４６（ＨＩＰＫ２およびＤＹＲＫ２）、トレオニン（ｔｈｒ）８１（ＪＮＫ、ＰＩＮ１）、ｓｅｒ３１５（オーロラキナーゼ、ＰＩＮ１、ＣＤＫ２およびＧＳＫ−３）およびｓｅｒ３９２（ＰＫＲ、ＣＤＫ９およびｐ３８ＦＡＣＴ−ＣＫ２）３におけるｐ５３のリン酸化を、ｐ５３リン酸化部位特異的抗体を使用して決定した。ｄ．ＳＡＥＣに、偽ウイルス、ｗｔウイルスまたはΔ５５ｋウイルスを感染させた。２４ｈ．ｐ．ｉ．の時点で、試料をビヒクル対照（−レーン）、ドキソルビシン（ｄｏｘ）、ＭＤＭ２アンタゴニスト、ヌトリン（ｎｕｔｌｉｎ）、またはトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）で処理した。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点でタンパク質溶解物を回収し、ｐ５３、ＭＤＭ２およびｐ２１について、正規化し、ウエスタンブロット法によって解析した。ローディングコントロールとしてアクチンを使用した。 図２は、アデノウイルス感染細胞では、Ｅ１Ｂ−５５ｋが欠失することにより、高レベルのリン酸化ｐ５３が誘導されるが、ｐ５３の転写標的は優勢に抑制され、放射線、遺伝子毒性薬、ＡＲＦ、ＭＤＭ２アンタゴニストまたはヒストン脱アセチル化酵素阻害剤によって活性化することができないことを示す。ａ．Ｕ２ＯＳ細胞に、偽ウイルス、ｗｔウイルスまたはΔ５５ｋウイルスのいずれかを感染させた。２４ｈ．ｐ．ｉ．の時点で試料をビヒクル対照（−）または５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）で処理した。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点でタンパク質溶解物を回収し、ｐ５３およびｐ２１の発現について、正規化し、解析した。ローディングコントロールとしてアクチンを解析した。ｂ．ＳＡＥＣに、偽ウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはｗｔウイルスのいずれかを感染させた。細胞を無処理のままにしたか、または３１ｈ．ｐ．ｉ．の時点でγ線を１０Ｇｙで照射（ＩＲ）した。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点でタンパク質溶解物（下のパネル）を回収し、ｐ５３、ｐ２１およびＭＤＭ２の発現について、正規化し、解析した。リン酸化部位特異的（ｐｈｏｓｐｈｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体を使用してセリン（ｓｅｒ）１５におけるｐ５３のリン酸化を検出した。ローディングコントロールとしてアクチンを使用した。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で全ＲＮＡも回収し、ｐ５３の転写標的をリアルタイムＰＣＲによって定量化した（上のパネル）。ＰＵＭＡ、ＭＤＭ２、ｐ２１、ＧＡＤＤ４５Ａおよび１４−３−３σのレベルが、０時間における感染させていない細胞に対する（ｗｒｔ）倍数変化としてプロットされており；垂直の棒は３連全体にわたる標準偏差を示す。ｃ．ＳＡＥＣに偽ウイルスまたはΔ５５ｋウイルスを感染させ、３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で回収した。ｐ５３の活性化についての陽性対照として１２時間にわたるドキソルビシン処理を用いた。タンパク質溶解物を、総ｐ５３レベルおよびｐ２１レベルについて、正規化し、ウエスタンブロット法によって解析した。ｓｅｒ６およびｓｅｒ９（カゼインキナーゼ１）、ｓｅｒ１５（ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＤＮＡ−ＰＫ）、ｓｅｒ２０（ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、ＪＮＫ、ＭＡＰＫＡＰ２）、ｓｅｒ３３（ｐ３８、ＰＩＮ１）、ｓｅｒ４６（ＨＩＰＫ２およびＤＹＲＫ２）、トレオニン（ｔｈｒ）８１（ＪＮＫ、ＰＩＮ１）、ｓｅｒ３１５（オーロラキナーゼ、ＰＩＮ１、ＣＤＫ２およびＧＳＫ−３）およびｓｅｒ３９２（ＰＫＲ、ＣＤＫ９およびｐ３８ＦＡＣＴ−ＣＫ２）３におけるｐ５３のリン酸化を、ｐ５３リン酸化部位特異的抗体を使用して決定した。ｄ．ＳＡＥＣに、偽ウイルス、ｗｔウイルスまたはΔ５５ｋウイルスを感染させた。２４ｈ．ｐ．ｉ．の時点で、試料をビヒクル対照（−レーン）、ドキソルビシン（ｄｏｘ）、ＭＤＭ２アンタゴニスト、ヌトリン（ｎｕｔｌｉｎ）、またはトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）で処理した。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点でタンパク質溶解物を回収し、ｐ５３、ＭＤＭ２およびｐ２１について、正規化し、ウエスタンブロット法によって解析した。ローディングコントロールとしてアクチンを使用した。 図２は、アデノウイルス感染細胞では、Ｅ１Ｂ−５５ｋが欠失することにより、高レベルのリン酸化ｐ５３が誘導されるが、ｐ５３の転写標的は優勢に抑制され、放射線、遺伝子毒性薬、ＡＲＦ、ＭＤＭ２アンタゴニストまたはヒストン脱アセチル化酵素阻害剤によって活性化することができないことを示す。ａ．Ｕ２ＯＳ細胞に、偽ウイルス、ｗｔウイルスまたはΔ５５ｋウイルスのいずれかを感染させた。２４ｈ．ｐ．ｉ．の時点で試料をビヒクル対照（−）または５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）で処理した。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点でタンパク質溶解物を回収し、ｐ５３およびｐ２１の発現について、正規化し、解析した。ローディングコントロールとしてアクチンを解析した。ｂ．ＳＡＥＣに、偽ウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはｗｔウイルスのいずれかを感染させた。細胞を無処理のままにしたか、または３１ｈ．ｐ．ｉ．の時点でγ線を１０Ｇｙで照射（ＩＲ）した。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点でタンパク質溶解物（下のパネル）を回収し、ｐ５３、ｐ２１およびＭＤＭ２の発現について、正規化し、解析した。リン酸化部位特異的（ｐｈｏｓｐｈｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体を使用してセリン（ｓｅｒ）１５におけるｐ５３のリン酸化を検出した。ローディングコントロールとしてアクチンを使用した。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で全ＲＮＡも回収し、ｐ５３の転写標的をリアルタイムＰＣＲによって定量化した（上のパネル）。ＰＵＭＡ、ＭＤＭ２、ｐ２１、ＧＡＤＤ４５Ａおよび１４−３−３σのレベルが、０時間における感染させていない細胞に対する（ｗｒｔ）倍数変化としてプロットされており；垂直の棒は３連全体にわたる標準偏差を示す。ｃ．ＳＡＥＣに偽ウイルスまたはΔ５５ｋウイルスを感染させ、３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で回収した。ｐ５３の活性化についての陽性対照として１２時間にわたるドキソルビシン処理を用いた。タンパク質溶解物を、総ｐ５３レベルおよびｐ２１レベルについて、正規化し、ウエスタンブロット法によって解析した。ｓｅｒ６およびｓｅｒ９（カゼインキナーゼ１）、ｓｅｒ１５（ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＤＮＡ−ＰＫ）、ｓｅｒ２０（ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、ＪＮＫ、ＭＡＰＫＡＰ２）、ｓｅｒ３３（ｐ３８、ＰＩＮ１）、ｓｅｒ４６（ＨＩＰＫ２およびＤＹＲＫ２）、トレオニン（ｔｈｒ）８１（ＪＮＫ、ＰＩＮ１）、ｓｅｒ３１５（オーロラキナーゼ、ＰＩＮ１、ＣＤＫ２およびＧＳＫ−３）およびｓｅｒ３９２（ＰＫＲ、ＣＤＫ９およびｐ３８ＦＡＣＴ−ＣＫ２）３におけるｐ５３のリン酸化を、ｐ５３リン酸化部位特異的抗体を使用して決定した。ｄ．ＳＡＥＣに、偽ウイルス、ｗｔウイルスまたはΔ５５ｋウイルスを感染させた。２４ｈ．ｐ．ｉ．の時点で、試料をビヒクル対照（−レーン）、ドキソルビシン（ｄｏｘ）、ＭＤＭ２アンタゴニスト、ヌトリン（ｎｕｔｌｉｎ）、またはトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）で処理した。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点でタンパク質溶解物を回収し、ｐ５３、ＭＤＭ２およびｐ２１について、正規化し、ウエスタンブロット法によって解析した。ローディングコントロールとしてアクチンを使用した。 図３は、アデノウイルス感染細胞では、Ｅ１Ａ−１３ｓによりＥ４−ＯＲＦ３が誘導され、それによりＥ１Ｂ−５５ｋおよびｐ５３の分解とは関係なくｐ５３が不活化されることを示す。ａ．ＳＡＥＣに、以下のウイルスを感染させた：偽ウイルス、野生型（ｗｔ）ウイルス、Ｅ４−ＯＲＦ３の変異を有するウイルス（ΔＯＲＦ３）、Ｅ１Ｂ−５５ｋの変異を有するウイルス（Δ５５ｋ）またはＥ４遺伝子欠失の変異を有するウイルス（ΔＥ４）、Ｅ１Ｂ−５５ｋおよびＥ１Ａの複合変異を有するウイルス（Δ５５ｋ／Ｅ１ＡΔｐ３００）、Ｅ１Ｂ−５５ｋおよびＥ４−ＯＲＦ６の複合変異を有するウイルス（Δ５５ｋ／ΔＯＲＦ６）、Ｅ１Ｂ−５５ｋおよびＥ４−ＯＲＦ２の複合変異を有するウイルス（Δ５５ｋ／ΔＯＲＦ２）、Ｅ１Ｂ−５５ｋおよびＥ４−ＯＲＦ３の複合変異を有するウイルス（Δ５５ｋ／ΔＯＲＦ３）またはＥ１Ｂ−５５ｋおよびＥ１Ａ−１３ｓの複合変異を有するウイルス（Δ５５ｋ／Δ１３ｓ）（補足図４参照）。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点でタンパク質溶解物を回収し、ｐ５３、ＭＤＭ２、ｐ２１、Ｅ１Ｂ−５５ｋおよびＥ４−ＯＲＦ３の発現について、正規化し、ウエスタンブロット法によって解析した。ローディングコントロールとしてアクチンの発現を用いた。ｂ．ＳＡＥＣに、偽ウイルス、Δ５５ｋウイルス、Δ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスまたはΔ５５ｋ／Δ１３ｓウイルスのいずれかを感染させた。細胞に、対照ウイルス（Ａｄ−ＧＦＰ、＋レーン）またはＥ４−ＯＲＦ３を異所的に発現しているウイルス（Ａｄ−ＯＲＦ３、＋レーン）を同時に共感染させた。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点でタンパク質抽出物を回収し、ｐ５３、ＭＤＭ２、ｐ２１、ＧＦＰおよびＥ４−ＯＲＦ３の発現について、正規化し、解析した。ローディングコントロールとしてアクチンの発現を解析した。ｃ．ＳＡＥＣに、偽ウイルス、ｗｔウイルス、ΔＯＲＦ３ウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスを感染させた。０ｈ．ｐ．ｉ．、２４ｈ．ｐ．ｉ．、３６ｈ．ｐ．ｉ．および４８ｈ．ｐ．ｉ．の時点でタンパク質溶解物を回収し、ｐ５３、ＭＤＭ２、ｐ２１、Ｅ１Ｂ−５５ｋおよびＥ４−ＯＲＦ３の発現について、正規化し、ウエスタンブロット法によって解析した。ローディングコントロールとしてアクチンの発現を解析した。ｄ．ＳＡＥＣに、偽ウイルス、ｗｔウイルス、Δ５５ｋウイルス、ΔＯＲＦ３ウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスを感染させた。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点でＲＮＡを回収し、リアルタイムＰＣＲを用いてｐ５３の転写標的のｍＲＮＡのレベルを定量化し、それが偽感染細胞に対する（ｗｒｔ）倍数変化としてグラフに示されており；垂直の棒は、標準偏差を示す。ｅ．内在性のｐ５３を欠くが、ポナステロンＡ誘導性ｐ５３ ｃＤＮＡを保有するＨ１２９９−Ｄ１細胞に、偽ウイルス、ｗｔウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスを感染させ、非誘導条件（−ｐｏｎＡ）または誘導条件（＋ｐｏｎＡ）の下で解析した。上記細胞をドキソルビシン（ｄｏｘ）処理にも供した。４８ｈ．ｐ．ｉ．の時点でタンパク質抽出物を回収し、ｐ５３、ＭＤＭ２、およびｐ２１の発現について解析した。ローディングコントロールとしてアクチンの発現を解析した。 図３は、アデノウイルス感染細胞では、Ｅ１Ａ−１３ｓによりＥ４−ＯＲＦ３が誘導され、それによりＥ１Ｂ−５５ｋおよびｐ５３の分解とは関係なくｐ５３が不活化されることを示す。ａ．ＳＡＥＣに、以下のウイルスを感染させた：偽ウイルス、野生型（ｗｔ）ウイルス、Ｅ４−ＯＲＦ３の変異を有するウイルス（ΔＯＲＦ３）、Ｅ１Ｂ−５５ｋの変異を有するウイルス（Δ５５ｋ）またはＥ４遺伝子欠失の変異を有するウイルス（ΔＥ４）、Ｅ１Ｂ−５５ｋおよびＥ１Ａの複合変異を有するウイルス（Δ５５ｋ／Ｅ１ＡΔｐ３００）、Ｅ１Ｂ−５５ｋおよびＥ４−ＯＲＦ６の複合変異を有するウイルス（Δ５５ｋ／ΔＯＲＦ６）、Ｅ１Ｂ−５５ｋおよびＥ４−ＯＲＦ２の複合変異を有するウイルス（Δ５５ｋ／ΔＯＲＦ２）、Ｅ１Ｂ−５５ｋおよびＥ４−ＯＲＦ３の複合変異を有するウイルス（Δ５５ｋ／ΔＯＲＦ３）またはＥ１Ｂ−５５ｋおよびＥ１Ａ−１３ｓの複合変異を有するウイルス（Δ５５ｋ／Δ１３ｓ）（補足図４参照）。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点でタンパク質溶解物を回収し、ｐ５３、ＭＤＭ２、ｐ２１、Ｅ１Ｂ−５５ｋおよびＥ４−ＯＲＦ３の発現について、正規化し、ウエスタンブロット法によって解析した。ローディングコントロールとしてアクチンの発現を用いた。ｂ．ＳＡＥＣに、偽ウイルス、Δ５５ｋウイルス、Δ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスまたはΔ５５ｋ／Δ１３ｓウイルスのいずれかを感染させた。細胞に、対照ウイルス（Ａｄ−ＧＦＰ、＋レーン）またはＥ４−ＯＲＦ３を異所的に発現しているウイルス（Ａｄ−ＯＲＦ３、＋レーン）を同時に共感染させた。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点でタンパク質抽出物を回収し、ｐ５３、ＭＤＭ２、ｐ２１、ＧＦＰおよびＥ４−ＯＲＦ３の発現について、正規化し、解析した。ローディングコントロールとしてアクチンの発現を解析した。ｃ．ＳＡＥＣに、偽ウイルス、ｗｔウイルス、ΔＯＲＦ３ウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスを感染させた。０ｈ．ｐ．ｉ．、２４ｈ．ｐ．ｉ．、３６ｈ．ｐ．ｉ．および４８ｈ．ｐ．ｉ．の時点でタンパク質溶解物を回収し、ｐ５３、ＭＤＭ２、ｐ２１、Ｅ１Ｂ−５５ｋおよびＥ４−ＯＲＦ３の発現について、正規化し、ウエスタンブロット法によって解析した。ローディングコントロールとしてアクチンの発現を解析した。ｄ．ＳＡＥＣに、偽ウイルス、ｗｔウイルス、Δ５５ｋウイルス、ΔＯＲＦ３ウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスを感染させた。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点でＲＮＡを回収し、リアルタイムＰＣＲを用いてｐ５３の転写標的のｍＲＮＡのレベルを定量化し、それが偽感染細胞に対する（ｗｒｔ）倍数変化としてグラフに示されており；垂直の棒は、標準偏差を示す。ｅ．内在性のｐ５３を欠くが、ポナステロンＡ誘導性ｐ５３ ｃＤＮＡを保有するＨ１２９９−Ｄ１細胞に、偽ウイルス、ｗｔウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスを感染させ、非誘導条件（−ｐｏｎＡ）または誘導条件（＋ｐｏｎＡ）の下で解析した。上記細胞をドキソルビシン（ｄｏｘ）処理にも供した。４８ｈ．ｐ．ｉ．の時点でタンパク質抽出物を回収し、ｐ５３、ＭＤＭ２、およびｐ２１の発現について解析した。ローディングコントロールとしてアクチンの発現を解析した。 図３は、アデノウイルス感染細胞では、Ｅ１Ａ−１３ｓによりＥ４−ＯＲＦ３が誘導され、それによりＥ１Ｂ−５５ｋおよびｐ５３の分解とは関係なくｐ５３が不活化されることを示す。ａ．ＳＡＥＣに、以下のウイルスを感染させた：偽ウイルス、野生型（ｗｔ）ウイルス、Ｅ４−ＯＲＦ３の変異を有するウイルス（ΔＯＲＦ３）、Ｅ１Ｂ−５５ｋの変異を有するウイルス（Δ５５ｋ）またはＥ４遺伝子欠失の変異を有するウイルス（ΔＥ４）、Ｅ１Ｂ−５５ｋおよびＥ１Ａの複合変異を有するウイルス（Δ５５ｋ／Ｅ１ＡΔｐ３００）、Ｅ１Ｂ−５５ｋおよびＥ４−ＯＲＦ６の複合変異を有するウイルス（Δ５５ｋ／ΔＯＲＦ６）、Ｅ１Ｂ−５５ｋおよびＥ４−ＯＲＦ２の複合変異を有するウイルス（Δ５５ｋ／ΔＯＲＦ２）、Ｅ１Ｂ−５５ｋおよびＥ４−ＯＲＦ３の複合変異を有するウイルス（Δ５５ｋ／ΔＯＲＦ３）またはＥ１Ｂ−５５ｋおよびＥ１Ａ−１３ｓの複合変異を有するウイルス（Δ５５ｋ／Δ１３ｓ）（補足図４参照）。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点でタンパク質溶解物を回収し、ｐ５３、ＭＤＭ２、ｐ２１、Ｅ１Ｂ−５５ｋおよびＥ４−ＯＲＦ３の発現について、正規化し、ウエスタンブロット法によって解析した。ローディングコントロールとしてアクチンの発現を用いた。ｂ．ＳＡＥＣに、偽ウイルス、Δ５５ｋウイルス、Δ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスまたはΔ５５ｋ／Δ１３ｓウイルスのいずれかを感染させた。細胞に、対照ウイルス（Ａｄ−ＧＦＰ、＋レーン）またはＥ４−ＯＲＦ３を異所的に発現しているウイルス（Ａｄ−ＯＲＦ３、＋レーン）を同時に共感染させた。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点でタンパク質抽出物を回収し、ｐ５３、ＭＤＭ２、ｐ２１、ＧＦＰおよびＥ４−ＯＲＦ３の発現について、正規化し、解析した。ローディングコントロールとしてアクチンの発現を解析した。ｃ．ＳＡＥＣに、偽ウイルス、ｗｔウイルス、ΔＯＲＦ３ウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスを感染させた。０ｈ．ｐ．ｉ．、２４ｈ．ｐ．ｉ．、３６ｈ．ｐ．ｉ．および４８ｈ．ｐ．ｉ．の時点でタンパク質溶解物を回収し、ｐ５３、ＭＤＭ２、ｐ２１、Ｅ１Ｂ−５５ｋおよびＥ４−ＯＲＦ３の発現について、正規化し、ウエスタンブロット法によって解析した。ローディングコントロールとしてアクチンの発現を解析した。ｄ．ＳＡＥＣに、偽ウイルス、ｗｔウイルス、Δ５５ｋウイルス、ΔＯＲＦ３ウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスを感染させた。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点でＲＮＡを回収し、リアルタイムＰＣＲを用いてｐ５３の転写標的のｍＲＮＡのレベルを定量化し、それが偽感染細胞に対する（ｗｒｔ）倍数変化としてグラフに示されており；垂直の棒は、標準偏差を示す。ｅ．内在性のｐ５３を欠くが、ポナステロンＡ誘導性ｐ５３ ｃＤＮＡを保有するＨ１２９９−Ｄ１細胞に、偽ウイルス、ｗｔウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスを感染させ、非誘導条件（−ｐｏｎＡ）または誘導条件（＋ｐｏｎＡ）の下で解析した。上記細胞をドキソルビシン（ｄｏｘ）処理にも供した。４８ｈ．ｐ．ｉ．の時点でタンパク質抽出物を回収し、ｐ５３、ＭＤＭ２、およびｐ２１の発現について解析した。ローディングコントロールとしてアクチンの発現を解析した。 図３は、アデノウイルス感染細胞では、Ｅ１Ａ−１３ｓによりＥ４−ＯＲＦ３が誘導され、それによりＥ１Ｂ−５５ｋおよびｐ５３の分解とは関係なくｐ５３が不活化されることを示す。ａ．ＳＡＥＣに、以下のウイルスを感染させた：偽ウイルス、野生型（ｗｔ）ウイルス、Ｅ４−ＯＲＦ３の変異を有するウイルス（ΔＯＲＦ３）、Ｅ１Ｂ−５５ｋの変異を有するウイルス（Δ５５ｋ）またはＥ４遺伝子欠失の変異を有するウイルス（ΔＥ４）、Ｅ１Ｂ−５５ｋおよびＥ１Ａの複合変異を有するウイルス（Δ５５ｋ／Ｅ１ＡΔｐ３００）、Ｅ１Ｂ−５５ｋおよびＥ４−ＯＲＦ６の複合変異を有するウイルス（Δ５５ｋ／ΔＯＲＦ６）、Ｅ１Ｂ−５５ｋおよびＥ４−ＯＲＦ２の複合変異を有するウイルス（Δ５５ｋ／ΔＯＲＦ２）、Ｅ１Ｂ−５５ｋおよびＥ４−ＯＲＦ３の複合変異を有するウイルス（Δ５５ｋ／ΔＯＲＦ３）またはＥ１Ｂ−５５ｋおよびＥ１Ａ−１３ｓの複合変異を有するウイルス（Δ５５ｋ／Δ１３ｓ）（補足図４参照）。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点でタンパク質溶解物を回収し、ｐ５３、ＭＤＭ２、ｐ２１、Ｅ１Ｂ−５５ｋおよびＥ４−ＯＲＦ３の発現について、正規化し、ウエスタンブロット法によって解析した。ローディングコントロールとしてアクチンの発現を用いた。ｂ．ＳＡＥＣに、偽ウイルス、Δ５５ｋウイルス、Δ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスまたはΔ５５ｋ／Δ１３ｓウイルスのいずれかを感染させた。細胞に、対照ウイルス（Ａｄ−ＧＦＰ、＋レーン）またはＥ４−ＯＲＦ３を異所的に発現しているウイルス（Ａｄ−ＯＲＦ３、＋レーン）を同時に共感染させた。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点でタンパク質抽出物を回収し、ｐ５３、ＭＤＭ２、ｐ２１、ＧＦＰおよびＥ４−ＯＲＦ３の発現について、正規化し、解析した。ローディングコントロールとしてアクチンの発現を解析した。ｃ．ＳＡＥＣに、偽ウイルス、ｗｔウイルス、ΔＯＲＦ３ウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスを感染させた。０ｈ．ｐ．ｉ．、２４ｈ．ｐ．ｉ．、３６ｈ．ｐ．ｉ．および４８ｈ．ｐ．ｉ．の時点でタンパク質溶解物を回収し、ｐ５３、ＭＤＭ２、ｐ２１、Ｅ１Ｂ−５５ｋおよびＥ４−ＯＲＦ３の発現について、正規化し、ウエスタンブロット法によって解析した。ローディングコントロールとしてアクチンの発現を解析した。ｄ．ＳＡＥＣに、偽ウイルス、ｗｔウイルス、Δ５５ｋウイルス、ΔＯＲＦ３ウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスを感染させた。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点でＲＮＡを回収し、リアルタイムＰＣＲを用いてｐ５３の転写標的のｍＲＮＡのレベルを定量化し、それが偽感染細胞に対する（ｗｒｔ）倍数変化としてグラフに示されており；垂直の棒は、標準偏差を示す。ｅ．内在性のｐ５３を欠くが、ポナステロンＡ誘導性ｐ５３ ｃＤＮＡを保有するＨ１２９９−Ｄ１細胞に、偽ウイルス、ｗｔウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスを感染させ、非誘導条件（−ｐｏｎＡ）または誘導条件（＋ｐｏｎＡ）の下で解析した。上記細胞をドキソルビシン（ｄｏｘ）処理にも供した。４８ｈ．ｐ．ｉ．の時点でタンパク質抽出物を回収し、ｐ５３、ＭＤＭ２、およびｐ２１の発現について解析した。ローディングコントロールとしてアクチンの発現を解析した。 図３は、アデノウイルス感染細胞では、Ｅ１Ａ−１３ｓによりＥ４−ＯＲＦ３が誘導され、それによりＥ１Ｂ−５５ｋおよびｐ５３の分解とは関係なくｐ５３が不活化されることを示す。ａ．ＳＡＥＣに、以下のウイルスを感染させた：偽ウイルス、野生型（ｗｔ）ウイルス、Ｅ４−ＯＲＦ３の変異を有するウイルス（ΔＯＲＦ３）、Ｅ１Ｂ−５５ｋの変異を有するウイルス（Δ５５ｋ）またはＥ４遺伝子欠失の変異を有するウイルス（ΔＥ４）、Ｅ１Ｂ−５５ｋおよびＥ１Ａの複合変異を有するウイルス（Δ５５ｋ／Ｅ１ＡΔｐ３００）、Ｅ１Ｂ−５５ｋおよびＥ４−ＯＲＦ６の複合変異を有するウイルス（Δ５５ｋ／ΔＯＲＦ６）、Ｅ１Ｂ−５５ｋおよびＥ４−ＯＲＦ２の複合変異を有するウイルス（Δ５５ｋ／ΔＯＲＦ２）、Ｅ１Ｂ−５５ｋおよびＥ４−ＯＲＦ３の複合変異を有するウイルス（Δ５５ｋ／ΔＯＲＦ３）またはＥ１Ｂ−５５ｋおよびＥ１Ａ−１３ｓの複合変異を有するウイルス（Δ５５ｋ／Δ１３ｓ）（補足図４参照）。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点でタンパク質溶解物を回収し、ｐ５３、ＭＤＭ２、ｐ２１、Ｅ１Ｂ−５５ｋおよびＥ４−ＯＲＦ３の発現について、正規化し、ウエスタンブロット法によって解析した。ローディングコントロールとしてアクチンの発現を用いた。ｂ．ＳＡＥＣに、偽ウイルス、Δ５５ｋウイルス、Δ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスまたはΔ５５ｋ／Δ１３ｓウイルスのいずれかを感染させた。細胞に、対照ウイルス（Ａｄ−ＧＦＰ、＋レーン）またはＥ４−ＯＲＦ３を異所的に発現しているウイルス（Ａｄ−ＯＲＦ３、＋レーン）を同時に共感染させた。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点でタンパク質抽出物を回収し、ｐ５３、ＭＤＭ２、ｐ２１、ＧＦＰおよびＥ４−ＯＲＦ３の発現について、正規化し、解析した。ローディングコントロールとしてアクチンの発現を解析した。ｃ．ＳＡＥＣに、偽ウイルス、ｗｔウイルス、ΔＯＲＦ３ウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスを感染させた。０ｈ．ｐ．ｉ．、２４ｈ．ｐ．ｉ．、３６ｈ．ｐ．ｉ．および４８ｈ．ｐ．ｉ．の時点でタンパク質溶解物を回収し、ｐ５３、ＭＤＭ２、ｐ２１、Ｅ１Ｂ−５５ｋおよびＥ４−ＯＲＦ３の発現について、正規化し、ウエスタンブロット法によって解析した。ローディングコントロールとしてアクチンの発現を解析した。ｄ．ＳＡＥＣに、偽ウイルス、ｗｔウイルス、Δ５５ｋウイルス、ΔＯＲＦ３ウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスを感染させた。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点でＲＮＡを回収し、リアルタイムＰＣＲを用いてｐ５３の転写標的のｍＲＮＡのレベルを定量化し、それが偽感染細胞に対する（ｗｒｔ）倍数変化としてグラフに示されており；垂直の棒は、標準偏差を示す。ｅ．内在性のｐ５３を欠くが、ポナステロンＡ誘導性ｐ５３ ｃＤＮＡを保有するＨ１２９９−Ｄ１細胞に、偽ウイルス、ｗｔウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスを感染させ、非誘導条件（−ｐｏｎＡ）または誘導条件（＋ｐｏｎＡ）の下で解析した。上記細胞をドキソルビシン（ｄｏｘ）処理にも供した。４８ｈ．ｐ．ｉ．の時点でタンパク質抽出物を回収し、ｐ５３、ＭＤＭ２、およびｐ２１の発現について解析した。ローディングコントロールとしてアクチンの発現を解析した。 図４は、Ｅ４−ＯＲＦ３により、新規のＳＵＶ３９Ｈ１Ｈ３Ｋ９ｍｅ３ヘテロクロマチン形成およびＳＵＶ３９Ｈ２ Ｈ３Ｋ９ｍｅ３ヘテロクロマチン形成が誘導され、内在性プロモーター内のＤＮＡ標的部位へのｐ５３の結合および接近が特異的に妨げられることを示す。ａ．Ｕ２ＯＳ細胞に、ｐ５３−ルシフェラーゼレポーター（ｐ５３−ｌｕｃ）プラスミド、ｐ５３結合部位が変異したｐ５３−ルシフェラーゼレポーター（ｐ５３−変異体）プラスミドまたは対照ｐＧＬ３−ルシフェラーゼ（ｐＧＬ３−ｌｕｃ）プラスミドのいずれかをトランスフェクトした（３連で）（補足図１０）。トランスフェクトされた細胞にｗｔウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスのいずれかを感染させ、４ｈ．ｐ．ｉ．の時点でＤ−ルシフェリンを加えた。４８時間にわたって毎時、発光読み取り値を取得した。３連全体にわたる平均発光が、時間（ｈ．ｐ．ｉ．）に対してプロットされている。ｂおよびｃ．Ｕ２ＯＳ細胞に、偽ウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスを感染させた。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点でＲＮＡ、タンパク質溶解物、およびクロマチンを回収した。ｐ５３の活性化についての陽性対照として１２時間にわたるドキソルビシン処理を用いた。ｂ．ｐ２１およびＭＤＭ２のｍＲＮＡのレベルをリアルタイムＰＣＲによって決定し、それは偽感染に対する（ｗｒｔ）倍数変化としてグラフに示されている（上のパネル）；垂直の棒は、標準偏差を示す。タンパク質溶解物を、ｐ５３の発現について、正規化し、解析した；ローディングコントロールとしてアクチンを解析した（下のパネル）。ｃ．ｐ５３モノクローナル抗体を使用してｐ５３クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を実施した。特異性についての対照として、一致するＩｇＧアイソタイプを使用した。ＣｈＩＰ試料を、ｐ２１プロモーター内のｐ５３のＤＮＡ標的配列（５’側のｐ５３結合部位は−２.４ｋｂにあり、３’側の部位は−１.３ｋｂにある）およびＭＤＭ２プロモーター内のｐ５３のＤＮＡ標的配列について半定量的ＰＣＲによって解析した。上記ｐ２１プロモーターの−５ｋｂ領域はｐ５３結合配列を含有しないので、陰性対照として使用した。インプットＤＮＡが左側に示されている。ｄ．Ｕ２ＯＳ細胞に、偽ウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスを感染させ、３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で固定した。ｐ５３（緑色）およびリジン９におけるヒストンＨ３トリメチル（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、赤色）を免疫蛍光法によって検出し、Ｈｏｅｃｈｓｔを用いてＤＮＡ対比染色を行った（白色）。ｅ．Ｕ２ＯＳ細胞に、Δ５５ｋウイルスを感染させ、３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で固定した。Ｈ３Ｋ９メチルトランスフェラーゼであるＳＵＶ３９Ｈ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤＢ１およびＧ９ａをＨ３Ｋ９ｍｅ３（赤色）と共に免疫蛍光法によって検出した（緑色）。Ｈｏｅｃｈｓｔを用いてＤＮＡを対比染色した（白色）。 図４は、Ｅ４−ＯＲＦ３により、新規のＳＵＶ３９Ｈ１Ｈ３Ｋ９ｍｅ３ヘテロクロマチン形成およびＳＵＶ３９Ｈ２ Ｈ３Ｋ９ｍｅ３ヘテロクロマチン形成が誘導され、内在性プロモーター内のＤＮＡ標的部位へのｐ５３の結合および接近が特異的に妨げられることを示す。ａ．Ｕ２ＯＳ細胞に、ｐ５３−ルシフェラーゼレポーター（ｐ５３−ｌｕｃ）プラスミド、ｐ５３結合部位が変異したｐ５３−ルシフェラーゼレポーター（ｐ５３−変異体）プラスミドまたは対照ｐＧＬ３−ルシフェラーゼ（ｐＧＬ３−ｌｕｃ）プラスミドのいずれかをトランスフェクトした（３連で）（補足図１０）。トランスフェクトされた細胞にｗｔウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスのいずれかを感染させ、４ｈ．ｐ．ｉ．の時点でＤ−ルシフェリンを加えた。４８時間にわたって毎時、発光読み取り値を取得した。３連全体にわたる平均発光が、時間（ｈ．ｐ．ｉ．）に対してプロットされている。ｂおよびｃ．Ｕ２ＯＳ細胞に、偽ウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスを感染させた。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点でＲＮＡ、タンパク質溶解物、およびクロマチンを回収した。ｐ５３の活性化についての陽性対照として１２時間にわたるドキソルビシン処理を用いた。ｂ．ｐ２１およびＭＤＭ２のｍＲＮＡのレベルをリアルタイムＰＣＲによって決定し、それは偽感染に対する（ｗｒｔ）倍数変化としてグラフに示されている（上のパネル）；垂直の棒は、標準偏差を示す。タンパク質溶解物を、ｐ５３の発現について、正規化し、解析した；ローディングコントロールとしてアクチンを解析した（下のパネル）。ｃ．ｐ５３モノクローナル抗体を使用してｐ５３クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を実施した。特異性についての対照として、一致するＩｇＧアイソタイプを使用した。ＣｈＩＰ試料を、ｐ２１プロモーター内のｐ５３のＤＮＡ標的配列（５’側のｐ５３結合部位は−２.４ｋｂにあり、３’側の部位は−１.３ｋｂにある）およびＭＤＭ２プロモーター内のｐ５３のＤＮＡ標的配列について半定量的ＰＣＲによって解析した。上記ｐ２１プロモーターの−５ｋｂ領域はｐ５３結合配列を含有しないので、陰性対照として使用した。インプットＤＮＡが左側に示されている。ｄ．Ｕ２ＯＳ細胞に、偽ウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスを感染させ、３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で固定した。ｐ５３（緑色）およびリジン９におけるヒストンＨ３トリメチル（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、赤色）を免疫蛍光法によって検出し、Ｈｏｅｃｈｓｔを用いてＤＮＡ対比染色を行った（白色）。ｅ．Ｕ２ＯＳ細胞に、Δ５５ｋウイルスを感染させ、３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で固定した。Ｈ３Ｋ９メチルトランスフェラーゼであるＳＵＶ３９Ｈ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤＢ１およびＧ９ａをＨ３Ｋ９ｍｅ３（赤色）と共に免疫蛍光法によって検出した（緑色）。Ｈｏｅｃｈｓｔを用いてＤＮＡを対比染色した（白色）。 図４は、Ｅ４−ＯＲＦ３により、新規のＳＵＶ３９Ｈ１Ｈ３Ｋ９ｍｅ３ヘテロクロマチン形成およびＳＵＶ３９Ｈ２ Ｈ３Ｋ９ｍｅ３ヘテロクロマチン形成が誘導され、内在性プロモーター内のＤＮＡ標的部位へのｐ５３の結合および接近が特異的に妨げられることを示す。ａ．Ｕ２ＯＳ細胞に、ｐ５３−ルシフェラーゼレポーター（ｐ５３−ｌｕｃ）プラスミド、ｐ５３結合部位が変異したｐ５３−ルシフェラーゼレポーター（ｐ５３−変異体）プラスミドまたは対照ｐＧＬ３−ルシフェラーゼ（ｐＧＬ３−ｌｕｃ）プラスミドのいずれかをトランスフェクトした（３連で）（補足図１０）。トランスフェクトされた細胞にｗｔウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスのいずれかを感染させ、４ｈ．ｐ．ｉ．の時点でＤ−ルシフェリンを加えた。４８時間にわたって毎時、発光読み取り値を取得した。３連全体にわたる平均発光が、時間（ｈ．ｐ．ｉ．）に対してプロットされている。ｂおよびｃ．Ｕ２ＯＳ細胞に、偽ウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスを感染させた。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点でＲＮＡ、タンパク質溶解物、およびクロマチンを回収した。ｐ５３の活性化についての陽性対照として１２時間にわたるドキソルビシン処理を用いた。ｂ．ｐ２１およびＭＤＭ２のｍＲＮＡのレベルをリアルタイムＰＣＲによって決定し、それは偽感染に対する（ｗｒｔ）倍数変化としてグラフに示されている（上のパネル）；垂直の棒は、標準偏差を示す。タンパク質溶解物を、ｐ５３の発現について、正規化し、解析した；ローディングコントロールとしてアクチンを解析した（下のパネル）。ｃ．ｐ５３モノクローナル抗体を使用してｐ５３クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を実施した。特異性についての対照として、一致するＩｇＧアイソタイプを使用した。ＣｈＩＰ試料を、ｐ２１プロモーター内のｐ５３のＤＮＡ標的配列（５’側のｐ５３結合部位は−２.４ｋｂにあり、３’側の部位は−１.３ｋｂにある）およびＭＤＭ２プロモーター内のｐ５３のＤＮＡ標的配列について半定量的ＰＣＲによって解析した。上記ｐ２１プロモーターの−５ｋｂ領域はｐ５３結合配列を含有しないので、陰性対照として使用した。インプットＤＮＡが左側に示されている。ｄ．Ｕ２ＯＳ細胞に、偽ウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスを感染させ、３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で固定した。ｐ５３（緑色）およびリジン９におけるヒストンＨ３トリメチル（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、赤色）を免疫蛍光法によって検出し、Ｈｏｅｃｈｓｔを用いてＤＮＡ対比染色を行った（白色）。ｅ．Ｕ２ＯＳ細胞に、Δ５５ｋウイルスを感染させ、３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で固定した。Ｈ３Ｋ９メチルトランスフェラーゼであるＳＵＶ３９Ｈ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤＢ１およびＧ９ａをＨ３Ｋ９ｍｅ３（赤色）と共に免疫蛍光法によって検出した（緑色）。Ｈｏｅｃｈｓｔを用いてＤＮＡを対比染色した（白色）。 図４は、Ｅ４−ＯＲＦ３により、新規のＳＵＶ３９Ｈ１Ｈ３Ｋ９ｍｅ３ヘテロクロマチン形成およびＳＵＶ３９Ｈ２ Ｈ３Ｋ９ｍｅ３ヘテロクロマチン形成が誘導され、内在性プロモーター内のＤＮＡ標的部位へのｐ５３の結合および接近が特異的に妨げられることを示す。ａ．Ｕ２ＯＳ細胞に、ｐ５３−ルシフェラーゼレポーター（ｐ５３−ｌｕｃ）プラスミド、ｐ５３結合部位が変異したｐ５３−ルシフェラーゼレポーター（ｐ５３−変異体）プラスミドまたは対照ｐＧＬ３−ルシフェラーゼ（ｐＧＬ３−ｌｕｃ）プラスミドのいずれかをトランスフェクトした（３連で）（補足図１０）。トランスフェクトされた細胞にｗｔウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスのいずれかを感染させ、４ｈ．ｐ．ｉ．の時点でＤ−ルシフェリンを加えた。４８時間にわたって毎時、発光読み取り値を取得した。３連全体にわたる平均発光が、時間（ｈ．ｐ．ｉ．）に対してプロットされている。ｂおよびｃ．Ｕ２ＯＳ細胞に、偽ウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスを感染させた。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点でＲＮＡ、タンパク質溶解物、およびクロマチンを回収した。ｐ５３の活性化についての陽性対照として１２時間にわたるドキソルビシン処理を用いた。ｂ．ｐ２１およびＭＤＭ２のｍＲＮＡのレベルをリアルタイムＰＣＲによって決定し、それは偽感染に対する（ｗｒｔ）倍数変化としてグラフに示されている（上のパネル）；垂直の棒は、標準偏差を示す。タンパク質溶解物を、ｐ５３の発現について、正規化し、解析した；ローディングコントロールとしてアクチンを解析した（下のパネル）。ｃ．ｐ５３モノクローナル抗体を使用してｐ５３クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を実施した。特異性についての対照として、一致するＩｇＧアイソタイプを使用した。ＣｈＩＰ試料を、ｐ２１プロモーター内のｐ５３のＤＮＡ標的配列（５’側のｐ５３結合部位は−２.４ｋｂにあり、３’側の部位は−１.３ｋｂにある）およびＭＤＭ２プロモーター内のｐ５３のＤＮＡ標的配列について半定量的ＰＣＲによって解析した。上記ｐ２１プロモーターの−５ｋｂ領域はｐ５３結合配列を含有しないので、陰性対照として使用した。インプットＤＮＡが左側に示されている。ｄ．Ｕ２ＯＳ細胞に、偽ウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスを感染させ、３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で固定した。ｐ５３（緑色）およびリジン９におけるヒストンＨ３トリメチル（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、赤色）を免疫蛍光法によって検出し、Ｈｏｅｃｈｓｔを用いてＤＮＡ対比染色を行った（白色）。ｅ．Ｕ２ＯＳ細胞に、Δ５５ｋウイルスを感染させ、３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で固定した。Ｈ３Ｋ９メチルトランスフェラーゼであるＳＵＶ３９Ｈ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤＢ１およびＧ９ａをＨ３Ｋ９ｍｅ３（赤色）と共に免疫蛍光法によって検出した（緑色）。Ｈｏｅｃｈｓｔを用いてＤＮＡを対比染色した（白色）。 図４は、Ｅ４−ＯＲＦ３により、新規のＳＵＶ３９Ｈ１Ｈ３Ｋ９ｍｅ３ヘテロクロマチン形成およびＳＵＶ３９Ｈ２ Ｈ３Ｋ９ｍｅ３ヘテロクロマチン形成が誘導され、内在性プロモーター内のＤＮＡ標的部位へのｐ５３の結合および接近が特異的に妨げられることを示す。ａ．Ｕ２ＯＳ細胞に、ｐ５３−ルシフェラーゼレポーター（ｐ５３−ｌｕｃ）プラスミド、ｐ５３結合部位が変異したｐ５３−ルシフェラーゼレポーター（ｐ５３−変異体）プラスミドまたは対照ｐＧＬ３−ルシフェラーゼ（ｐＧＬ３−ｌｕｃ）プラスミドのいずれかをトランスフェクトした（３連で）（補足図１０）。トランスフェクトされた細胞にｗｔウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスのいずれかを感染させ、４ｈ．ｐ．ｉ．の時点でＤ−ルシフェリンを加えた。４８時間にわたって毎時、発光読み取り値を取得した。３連全体にわたる平均発光が、時間（ｈ．ｐ．ｉ．）に対してプロットされている。ｂおよびｃ．Ｕ２ＯＳ細胞に、偽ウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスを感染させた。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点でＲＮＡ、タンパク質溶解物、およびクロマチンを回収した。ｐ５３の活性化についての陽性対照として１２時間にわたるドキソルビシン処理を用いた。ｂ．ｐ２１およびＭＤＭ２のｍＲＮＡのレベルをリアルタイムＰＣＲによって決定し、それは偽感染に対する（ｗｒｔ）倍数変化としてグラフに示されている（上のパネル）；垂直の棒は、標準偏差を示す。タンパク質溶解物を、ｐ５３の発現について、正規化し、解析した；ローディングコントロールとしてアクチンを解析した（下のパネル）。ｃ．ｐ５３モノクローナル抗体を使用してｐ５３クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を実施した。特異性についての対照として、一致するＩｇＧアイソタイプを使用した。ＣｈＩＰ試料を、ｐ２１プロモーター内のｐ５３のＤＮＡ標的配列（５’側のｐ５３結合部位は−２.４ｋｂにあり、３’側の部位は−１.３ｋｂにある）およびＭＤＭ２プロモーター内のｐ５３のＤＮＡ標的配列について半定量的ＰＣＲによって解析した。上記ｐ２１プロモーターの−５ｋｂ領域はｐ５３結合配列を含有しないので、陰性対照として使用した。インプットＤＮＡが左側に示されている。ｄ．Ｕ２ＯＳ細胞に、偽ウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスを感染させ、３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で固定した。ｐ５３（緑色）およびリジン９におけるヒストンＨ３トリメチル（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、赤色）を免疫蛍光法によって検出し、Ｈｏｅｃｈｓｔを用いてＤＮＡ対比染色を行った（白色）。ｅ．Ｕ２ＯＳ細胞に、Δ５５ｋウイルスを感染させ、３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で固定した。Ｈ３Ｋ９メチルトランスフェラーゼであるＳＵＶ３９Ｈ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＥＴＤＢ１およびＧ９ａをＨ３Ｋ９ｍｅ３（赤色）と共に免疫蛍光法によって検出した（緑色）。Ｈｏｅｃｈｓｔを用いてＤＮＡを対比染色した（白色）。 図５は、Ｅ４−ＯＲＦ３により、ヘテロクロマチン集合体を直接特定し、ｐ５３の標的プロモーターにおける新規のＨ３Ｋ９トリメチルを誘導する核骨格が形成され、ｐ５３のＤＮＡの結合が妨げられることを示す。ａ．Ｕ２ＯＳ細胞に、偽ウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスを感染させた。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点でタンパク質溶解物およびクロマチンを回収した。タンパク質溶解物を、ｐ５３、アクチン、ヒストンＨ３（Ｈ３）およびリジン９におけるヒストンＨ３トリメチル（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）のレベルについて、正規化し、解析した。Ｈ３Ｋ９ｍｅ３に対する抗体およびｐ５３に対する抗体を使用してクロマチン免疫沈降を実施した。特異性についての対照としてマウスＩｇＧおよびウサギＩｇＧを使用した。ＣｈＩＰ試料をリアルタイム定量的ＰＣＲにより分析し、インプットＤＮＡに対して正規化した。ｐ５３およびＨ３Ｋ９ｍｅ３の、ｐ２１プロモーターおよびＭＤＭ２プロモーター内のｐ５３の標的配列への結合が、偽に対する（ｗｒｔ）倍数変化としてプロットされている。バックグラウンドの尺度ならびにｐ５３およびＨ３Ｋ９ｍｅ３のＣｈＩＰにおける標的ＤＮＡ配列の富化についての対照としてＩｇＧ対照がプロットされている。ｂおよびｃ．Δ５５ｋウイルスに感染させ、３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で固定したＵ２ＯＳ細胞および小気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）の共焦点像が示されている。左側のパネルは、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３（緑色）、Ｅ４−ＯＲＦ３（赤色）およびＨｏｅｃｈｓｔ（ＤＮＡ、白色）の対比染色を行った細胞の単一の共焦点切片を示す。ｚスタックの中心の薄片（ｓｌｉｃｅ）が右側のパネルに例示されており、水平方向の線および垂直方向の線はスタック全体を通して取得した直交的な切り口を示し、その次に、その画像の下部および右側にフラット投影（ｆｌａｔ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）として示されている。ｄ．３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点における、高解像度および高拡大率（ズーム比＝３、画素サイズ＝４０ｎｍ）の単一共焦点の、Δ５５ｋを感染させたＳＡＥＣ細胞の核を通した０．３μｍの薄片である（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３が緑色、Ｅ４−ＯＲＦ３が赤色の免疫蛍光）。合体したパネルは、Ｅ４−ＯＲＦ３の核の網目（ｍｅｓｈ）および付随するヘテロクロマチンドメインの拡大を示す（挿入図）。 図５は、Ｅ４−ＯＲＦ３により、ヘテロクロマチン集合体を直接特定し、ｐ５３の標的プロモーターにおける新規のＨ３Ｋ９トリメチルを誘導する核骨格が形成され、ｐ５３のＤＮＡの結合が妨げられることを示す。ａ．Ｕ２ＯＳ細胞に、偽ウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスを感染させた。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点でタンパク質溶解物およびクロマチンを回収した。タンパク質溶解物を、ｐ５３、アクチン、ヒストンＨ３（Ｈ３）およびリジン９におけるヒストンＨ３トリメチル（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）のレベルについて、正規化し、解析した。Ｈ３Ｋ９ｍｅ３に対する抗体およびｐ５３に対する抗体を使用してクロマチン免疫沈降を実施した。特異性についての対照としてマウスＩｇＧおよびウサギＩｇＧを使用した。ＣｈＩＰ試料をリアルタイム定量的ＰＣＲにより分析し、インプットＤＮＡに対して正規化した。ｐ５３およびＨ３Ｋ９ｍｅ３の、ｐ２１プロモーターおよびＭＤＭ２プロモーター内のｐ５３の標的配列への結合が、偽に対する（ｗｒｔ）倍数変化としてプロットされている。バックグラウンドの尺度ならびにｐ５３およびＨ３Ｋ９ｍｅ３のＣｈＩＰにおける標的ＤＮＡ配列の富化についての対照としてＩｇＧ対照がプロットされている。ｂおよびｃ．Δ５５ｋウイルスに感染させ、３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で固定したＵ２ＯＳ細胞および小気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）の共焦点像が示されている。左側のパネルは、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３（緑色）、Ｅ４−ＯＲＦ３（赤色）およびＨｏｅｃｈｓｔ（ＤＮＡ、白色）の対比染色を行った細胞の単一の共焦点切片を示す。ｚスタックの中心の薄片（ｓｌｉｃｅ）が右側のパネルに例示されており、水平方向の線および垂直方向の線はスタック全体を通して取得した直交的な切り口を示し、その次に、その画像の下部および右側にフラット投影（ｆｌａｔ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）として示されている。ｄ．３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点における、高解像度および高拡大率（ズーム比＝３、画素サイズ＝４０ｎｍ）の単一共焦点の、Δ５５ｋを感染させたＳＡＥＣ細胞の核を通した０．３μｍの薄片である（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３が緑色、Ｅ４−ＯＲＦ３が赤色の免疫蛍光）。合体したパネルは、Ｅ４−ＯＲＦ３の核の網目（ｍｅｓｈ）および付随するヘテロクロマチンドメインの拡大を示す（挿入図）。 図５は、Ｅ４−ＯＲＦ３により、ヘテロクロマチン集合体を直接特定し、ｐ５３の標的プロモーターにおける新規のＨ３Ｋ９トリメチルを誘導する核骨格が形成され、ｐ５３のＤＮＡの結合が妨げられることを示す。ａ．Ｕ２ＯＳ細胞に、偽ウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスを感染させた。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点でタンパク質溶解物およびクロマチンを回収した。タンパク質溶解物を、ｐ５３、アクチン、ヒストンＨ３（Ｈ３）およびリジン９におけるヒストンＨ３トリメチル（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）のレベルについて、正規化し、解析した。Ｈ３Ｋ９ｍｅ３に対する抗体およびｐ５３に対する抗体を使用してクロマチン免疫沈降を実施した。特異性についての対照としてマウスＩｇＧおよびウサギＩｇＧを使用した。ＣｈＩＰ試料をリアルタイム定量的ＰＣＲにより分析し、インプットＤＮＡに対して正規化した。ｐ５３およびＨ３Ｋ９ｍｅ３の、ｐ２１プロモーターおよびＭＤＭ２プロモーター内のｐ５３の標的配列への結合が、偽に対する（ｗｒｔ）倍数変化としてプロットされている。バックグラウンドの尺度ならびにｐ５３およびＨ３Ｋ９ｍｅ３のＣｈＩＰにおける標的ＤＮＡ配列の富化についての対照としてＩｇＧ対照がプロットされている。ｂおよびｃ．Δ５５ｋウイルスに感染させ、３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で固定したＵ２ＯＳ細胞および小気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）の共焦点像が示されている。左側のパネルは、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３（緑色）、Ｅ４−ＯＲＦ３（赤色）およびＨｏｅｃｈｓｔ（ＤＮＡ、白色）の対比染色を行った細胞の単一の共焦点切片を示す。ｚスタックの中心の薄片（ｓｌｉｃｅ）が右側のパネルに例示されており、水平方向の線および垂直方向の線はスタック全体を通して取得した直交的な切り口を示し、その次に、その画像の下部および右側にフラット投影（ｆｌａｔ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）として示されている。ｄ．３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点における、高解像度および高拡大率（ズーム比＝３、画素サイズ＝４０ｎｍ）の単一共焦点の、Δ５５ｋを感染させたＳＡＥＣ細胞の核を通した０．３μｍの薄片である（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３が緑色、Ｅ４−ＯＲＦ３が赤色の免疫蛍光）。合体したパネルは、Ｅ４−ＯＲＦ３の核の網目（ｍｅｓｈ）および付随するヘテロクロマチンドメインの拡大を示す（挿入図）。 図５は、Ｅ４−ＯＲＦ３により、ヘテロクロマチン集合体を直接特定し、ｐ５３の標的プロモーターにおける新規のＨ３Ｋ９トリメチルを誘導する核骨格が形成され、ｐ５３のＤＮＡの結合が妨げられることを示す。ａ．Ｕ２ＯＳ細胞に、偽ウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスを感染させた。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点でタンパク質溶解物およびクロマチンを回収した。タンパク質溶解物を、ｐ５３、アクチン、ヒストンＨ３（Ｈ３）およびリジン９におけるヒストンＨ３トリメチル（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）のレベルについて、正規化し、解析した。Ｈ３Ｋ９ｍｅ３に対する抗体およびｐ５３に対する抗体を使用してクロマチン免疫沈降を実施した。特異性についての対照としてマウスＩｇＧおよびウサギＩｇＧを使用した。ＣｈＩＰ試料をリアルタイム定量的ＰＣＲにより分析し、インプットＤＮＡに対して正規化した。ｐ５３およびＨ３Ｋ９ｍｅ３の、ｐ２１プロモーターおよびＭＤＭ２プロモーター内のｐ５３の標的配列への結合が、偽に対する（ｗｒｔ）倍数変化としてプロットされている。バックグラウンドの尺度ならびにｐ５３およびＨ３Ｋ９ｍｅ３のＣｈＩＰにおける標的ＤＮＡ配列の富化についての対照としてＩｇＧ対照がプロットされている。ｂおよびｃ．Δ５５ｋウイルスに感染させ、３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で固定したＵ２ＯＳ細胞および小気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）の共焦点像が示されている。左側のパネルは、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３（緑色）、Ｅ４−ＯＲＦ３（赤色）およびＨｏｅｃｈｓｔ（ＤＮＡ、白色）の対比染色を行った細胞の単一の共焦点切片を示す。ｚスタックの中心の薄片（ｓｌｉｃｅ）が右側のパネルに例示されており、水平方向の線および垂直方向の線はスタック全体を通して取得した直交的な切り口を示し、その次に、その画像の下部および右側にフラット投影（ｆｌａｔ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）として示されている。ｄ．３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点における、高解像度および高拡大率（ズーム比＝３、画素サイズ＝４０ｎｍ）の単一共焦点の、Δ５５ｋを感染させたＳＡＥＣ細胞の核を通した０．３μｍの薄片である（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３が緑色、Ｅ４−ＯＲＦ３が赤色の免疫蛍光）。合体したパネルは、Ｅ４−ＯＲＦ３の核の網目（ｍｅｓｈ）および付随するヘテロクロマチンドメインの拡大を示す（挿入図）。 図６は、発がん性細胞の複製およびウイルスの複製を駆動する全体的な転写性の変化を背景として、Ｅ４−ＯＲＦ３により、ｐ５３の標的が選択的にサイレンシングされることを示す。ａ．Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ発現アレイを使用して、偽ウイルス、Δ５５ｋウイルス、またはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスのいずれかを感染させたＳＡＥＣにおける、３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点での全体的な遺伝子発現の変化を解析した。ｐ５３の活性化についての陽性対照としてヌトリン処理したＳＡＥＣに対する発現解析も実施した。２つの独立した実験を実施し、各条件についてそれぞれ反復した。ベン図は、Δ５５ｋ／ΔＯＲＦ３を感染させたＳＡＥＣと偽感染させたＳＡＥＣにおいて有意に示差的に発現された遺伝子（２７１１遺伝子）と、Δ５５ｋを感染させたＳＡＥＣと偽感染させたＳＡＥＣにおいて有意に示差的に発現された遺伝子（２１７８遺伝子）との間の重複（１７３０遺伝子）を示す（対数（ｌｏｇ）倍数変化（ＦＣ）＞２または＜−２、偽発見率（ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ）（ＦＤＲ）０．０５）。偽感染させたＳＡＥＣ、Δ５５ｋを感染させたＳＡＥＣおよびΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３を感染させたＳＡＥＣにおいて重複している１７３０遺伝子のそれぞれの強度の値で標準化したヒートマップが右側に示されている。ｂ．Δ５５ｋ／ΔＯＲＦ３を感染させたＳＡＥＣとΔ５５ｋを感染させたＳＡＥＣとで示差的に上方制御された（ｌｏｇ ＦＣ＞２およびＦＤＲ０．０５）有意な転写物は２６５種存在する。これらの示差的に上方制御された２６５遺伝子のうち、７２遺伝子はそれらのプロモーター内に予測ｐ５３転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）を有し、５５遺伝子はヌトリンに反応してｌｏｇ ＦＣ＞１.５上方制御されるが、予測ｐ５３ＴＦＢＳを有さず；６２遺伝子は予測ｐ５３ＴＦＢＳを有し、かつヌトリンに反応して上方制御される。これらの上述のカテゴリーのいずれにも入らない他の有意な上方制御された遺伝子が７６種存在する（灰色）。ｃ．Δ５５ｋ／ΔＯＲＦ３感染およびヌトリン処理のどちらにおいても示差的に上方制御された転写物の上から４６種の教師なし階層クラスタリングを示す。ｄ．発がん性ストレスおよび遺伝子毒性ストレスに反応したｐ５３のレベルおよびリン酸化の誘導は、ｐ５３による転写活性化を決定すると考えられている。Ｅ１Ｂ−５５ｋは、ｐ５３に結合し、それを分解し、アデノウイルスの複製におけるｐ５３の不活化にとって決定的であると考えられていた。しかし、本明細書において本発明者らは、追加的なアデノウイルスのタンパク質であるＥ４−ＯＲＦ３が存在し、これが、ｐ５３の安定化およびリン酸化とは関係なく、新規かつ優勢の後成的機構を介してｐ５３を不活化することを示している。Ｅ４−ＯＲＦ３は、ｐ５３の標的プロモーターにおけるＳＵＶ３９Ｈ１／２Ｈ３Ｋ９ｍｅ３抑制的ヘテロクロマチンの集合を指示する新規の核骨格を形成する。接近拒否されたｐ５３にはウイルスの複製を妨げる力はない。 図６は、発がん性細胞の複製およびウイルスの複製を駆動する全体的な転写性の変化を背景として、Ｅ４−ＯＲＦ３により、ｐ５３の標的が選択的にサイレンシングされることを示す。ａ．Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ発現アレイを使用して、偽ウイルス、Δ５５ｋウイルス、またはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスのいずれかを感染させたＳＡＥＣにおける、３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点での全体的な遺伝子発現の変化を解析した。ｐ５３の活性化についての陽性対照としてヌトリン処理したＳＡＥＣに対する発現解析も実施した。２つの独立した実験を実施し、各条件についてそれぞれ反復した。ベン図は、Δ５５ｋ／ΔＯＲＦ３を感染させたＳＡＥＣと偽感染させたＳＡＥＣにおいて有意に示差的に発現された遺伝子（２７１１遺伝子）と、Δ５５ｋを感染させたＳＡＥＣと偽感染させたＳＡＥＣにおいて有意に示差的に発現された遺伝子（２１７８遺伝子）との間の重複（１７３０遺伝子）を示す（対数（ｌｏｇ）倍数変化（ＦＣ）＞２または＜−２、偽発見率（ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ）（ＦＤＲ）０．０５）。偽感染させたＳＡＥＣ、Δ５５ｋを感染させたＳＡＥＣおよびΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３を感染させたＳＡＥＣにおいて重複している１７３０遺伝子のそれぞれの強度の値で標準化したヒートマップが右側に示されている。ｂ．Δ５５ｋ／ΔＯＲＦ３を感染させたＳＡＥＣとΔ５５ｋを感染させたＳＡＥＣとで示差的に上方制御された（ｌｏｇ ＦＣ＞２およびＦＤＲ０．０５）有意な転写物は２６５種存在する。これらの示差的に上方制御された２６５遺伝子のうち、７２遺伝子はそれらのプロモーター内に予測ｐ５３転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）を有し、５５遺伝子はヌトリンに反応してｌｏｇ ＦＣ＞１.５上方制御されるが、予測ｐ５３ＴＦＢＳを有さず；６２遺伝子は予測ｐ５３ＴＦＢＳを有し、かつヌトリンに反応して上方制御される。これらの上述のカテゴリーのいずれにも入らない他の有意な上方制御された遺伝子が７６種存在する（灰色）。ｃ．Δ５５ｋ／ΔＯＲＦ３感染およびヌトリン処理のどちらにおいても示差的に上方制御された転写物の上から４６種の教師なし階層クラスタリングを示す。ｄ．発がん性ストレスおよび遺伝子毒性ストレスに反応したｐ５３のレベルおよびリン酸化の誘導は、ｐ５３による転写活性化を決定すると考えられている。Ｅ１Ｂ−５５ｋは、ｐ５３に結合し、それを分解し、アデノウイルスの複製におけるｐ５３の不活化にとって決定的であると考えられていた。しかし、本明細書において本発明者らは、追加的なアデノウイルスのタンパク質であるＥ４−ＯＲＦ３が存在し、これが、ｐ５３の安定化およびリン酸化とは関係なく、新規かつ優勢の後成的機構を介してｐ５３を不活化することを示している。Ｅ４−ＯＲＦ３は、ｐ５３の標的プロモーターにおけるＳＵＶ３９Ｈ１／２Ｈ３Ｋ９ｍｅ３抑制的ヘテロクロマチンの集合を指示する新規の核骨格を形成する。接近拒否されたｐ５３にはウイルスの複製を妨げる力はない。 図６は、発がん性細胞の複製およびウイルスの複製を駆動する全体的な転写性の変化を背景として、Ｅ４−ＯＲＦ３により、ｐ５３の標的が選択的にサイレンシングされることを示す。ａ．Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ発現アレイを使用して、偽ウイルス、Δ５５ｋウイルス、またはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスのいずれかを感染させたＳＡＥＣにおける、３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点での全体的な遺伝子発現の変化を解析した。ｐ５３の活性化についての陽性対照としてヌトリン処理したＳＡＥＣに対する発現解析も実施した。２つの独立した実験を実施し、各条件についてそれぞれ反復した。ベン図は、Δ５５ｋ／ΔＯＲＦ３を感染させたＳＡＥＣと偽感染させたＳＡＥＣにおいて有意に示差的に発現された遺伝子（２７１１遺伝子）と、Δ５５ｋを感染させたＳＡＥＣと偽感染させたＳＡＥＣにおいて有意に示差的に発現された遺伝子（２１７８遺伝子）との間の重複（１７３０遺伝子）を示す（対数（ｌｏｇ）倍数変化（ＦＣ）＞２または＜−２、偽発見率（ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ）（ＦＤＲ）０．０５）。偽感染させたＳＡＥＣ、Δ５５ｋを感染させたＳＡＥＣおよびΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３を感染させたＳＡＥＣにおいて重複している１７３０遺伝子のそれぞれの強度の値で標準化したヒートマップが右側に示されている。ｂ．Δ５５ｋ／ΔＯＲＦ３を感染させたＳＡＥＣとΔ５５ｋを感染させたＳＡＥＣとで示差的に上方制御された（ｌｏｇ ＦＣ＞２およびＦＤＲ０．０５）有意な転写物は２６５種存在する。これらの示差的に上方制御された２６５遺伝子のうち、７２遺伝子はそれらのプロモーター内に予測ｐ５３転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）を有し、５５遺伝子はヌトリンに反応してｌｏｇ ＦＣ＞１.５上方制御されるが、予測ｐ５３ＴＦＢＳを有さず；６２遺伝子は予測ｐ５３ＴＦＢＳを有し、かつヌトリンに反応して上方制御される。これらの上述のカテゴリーのいずれにも入らない他の有意な上方制御された遺伝子が７６種存在する（灰色）。ｃ．Δ５５ｋ／ΔＯＲＦ３感染およびヌトリン処理のどちらにおいても示差的に上方制御された転写物の上から４６種の教師なし階層クラスタリングを示す。ｄ．発がん性ストレスおよび遺伝子毒性ストレスに反応したｐ５３のレベルおよびリン酸化の誘導は、ｐ５３による転写活性化を決定すると考えられている。Ｅ１Ｂ−５５ｋは、ｐ５３に結合し、それを分解し、アデノウイルスの複製におけるｐ５３の不活化にとって決定的であると考えられていた。しかし、本明細書において本発明者らは、追加的なアデノウイルスのタンパク質であるＥ４−ＯＲＦ３が存在し、これが、ｐ５３の安定化およびリン酸化とは関係なく、新規かつ優勢の後成的機構を介してｐ５３を不活化することを示している。Ｅ４−ＯＲＦ３は、ｐ５３の標的プロモーターにおけるＳＵＶ３９Ｈ１／２Ｈ３Ｋ９ｍｅ３抑制的ヘテロクロマチンの集合を指示する新規の核骨格を形成する。接近拒否されたｐ５３にはウイルスの複製を妨げる力はない。 図６は、発がん性細胞の複製およびウイルスの複製を駆動する全体的な転写性の変化を背景として、Ｅ４−ＯＲＦ３により、ｐ５３の標的が選択的にサイレンシングされることを示す。ａ．Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ発現アレイを使用して、偽ウイルス、Δ５５ｋウイルス、またはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスのいずれかを感染させたＳＡＥＣにおける、３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点での全体的な遺伝子発現の変化を解析した。ｐ５３の活性化についての陽性対照としてヌトリン処理したＳＡＥＣに対する発現解析も実施した。２つの独立した実験を実施し、各条件についてそれぞれ反復した。ベン図は、Δ５５ｋ／ΔＯＲＦ３を感染させたＳＡＥＣと偽感染させたＳＡＥＣにおいて有意に示差的に発現された遺伝子（２７１１遺伝子）と、Δ５５ｋを感染させたＳＡＥＣと偽感染させたＳＡＥＣにおいて有意に示差的に発現された遺伝子（２１７８遺伝子）との間の重複（１７３０遺伝子）を示す（対数（ｌｏｇ）倍数変化（ＦＣ）＞２または＜−２、偽発見率（ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ）（ＦＤＲ）０．０５）。偽感染させたＳＡＥＣ、Δ５５ｋを感染させたＳＡＥＣおよびΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３を感染させたＳＡＥＣにおいて重複している１７３０遺伝子のそれぞれの強度の値で標準化したヒートマップが右側に示されている。ｂ．Δ５５ｋ／ΔＯＲＦ３を感染させたＳＡＥＣとΔ５５ｋを感染させたＳＡＥＣとで示差的に上方制御された（ｌｏｇ ＦＣ＞２およびＦＤＲ０．０５）有意な転写物は２６５種存在する。これらの示差的に上方制御された２６５遺伝子のうち、７２遺伝子はそれらのプロモーター内に予測ｐ５３転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）を有し、５５遺伝子はヌトリンに反応してｌｏｇ ＦＣ＞１.５上方制御されるが、予測ｐ５３ＴＦＢＳを有さず；６２遺伝子は予測ｐ５３ＴＦＢＳを有し、かつヌトリンに反応して上方制御される。これらの上述のカテゴリーのいずれにも入らない他の有意な上方制御された遺伝子が７６種存在する（灰色）。ｃ．Δ５５ｋ／ΔＯＲＦ３感染およびヌトリン処理のどちらにおいても示差的に上方制御された転写物の上から４６種の教師なし階層クラスタリングを示す。ｄ．発がん性ストレスおよび遺伝子毒性ストレスに反応したｐ５３のレベルおよびリン酸化の誘導は、ｐ５３による転写活性化を決定すると考えられている。Ｅ１Ｂ−５５ｋは、ｐ５３に結合し、それを分解し、アデノウイルスの複製におけるｐ５３の不活化にとって決定的であると考えられていた。しかし、本明細書において本発明者らは、追加的なアデノウイルスのタンパク質であるＥ４−ＯＲＦ３が存在し、これが、ｐ５３の安定化およびリン酸化とは関係なく、新規かつ優勢の後成的機構を介してｐ５３を不活化することを示している。Ｅ４−ＯＲＦ３は、ｐ５３の標的プロモーターにおけるＳＵＶ３９Ｈ１／２Ｈ３Ｋ９ｍｅ３抑制的ヘテロクロマチンの集合を指示する新規の核骨格を形成する。接近拒否されたｐ５３にはウイルスの複製を妨げる力はない。 補足図１（本明細書では図７とも称される）は、ΔＥ１Ｂ−５５ｋを感染させたヒト初代乳房上皮細胞またはヒト初代気管支上皮細胞においてｐ５３が誘導されたが、ｐ５３の分解の損失による活性化はなかったことを示す。図７ａ：初代ヒト乳房上皮細胞（ＨＭＥＣ）に、偽ウイルス、野生型（ｗｔ）ウイルス、またはΔＥ１Ｂ−５５ｋ（Δ５５ｋ）ウイルスのいずれかを感染させ、感染後２４時間（ｈ．ｐ．ｉ．）および感染後３６時間（ｈ．ｐ．ｉ．）の時点で回収した。タンパク質溶解物を、ｐ５３、ｐ２１およびＭＤＭ２の発現についてウエスタンブロット法によって解析した。ローディングコントロールとしてアクチンを解析した。図７ｂ：初代ヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥＣ）に、偽ウイルス、ｗｔウイルスまたはΔ５５ｋウイルスを感染させ、２４ｈ．ｐ．ｉ．の時点で回収した。タンパク質溶解物を、ｐ５３およびｐ２１の発現についてウエスタンブロット法によって解析した。 補足図１（本明細書では図７とも称される）は、ΔＥ１Ｂ−５５ｋを感染させたヒト初代乳房上皮細胞またはヒト初代気管支上皮細胞においてｐ５３が誘導されたが、ｐ５３の分解の損失による活性化はなかったことを示す。図７ａ：初代ヒト乳房上皮細胞（ＨＭＥＣ）に、偽ウイルス、野生型（ｗｔ）ウイルス、またはΔＥ１Ｂ−５５ｋ（Δ５５ｋ）ウイルスのいずれかを感染させ、感染後２４時間（ｈ．ｐ．ｉ．）および感染後３６時間（ｈ．ｐ．ｉ．）の時点で回収した。タンパク質溶解物を、ｐ５３、ｐ２１およびＭＤＭ２の発現についてウエスタンブロット法によって解析した。ローディングコントロールとしてアクチンを解析した。図７ｂ：初代ヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥＣ）に、偽ウイルス、ｗｔウイルスまたはΔ５５ｋウイルスを感染させ、２４ｈ．ｐ．ｉ．の時点で回収した。タンパク質溶解物を、ｐ５３およびｐ２１の発現についてウエスタンブロット法によって解析した。 補足図２（本明細書では図８とも称される）は、感染させた腫瘍細胞において、Ｅ１Ｂ−５５ｋが損失することにより、ｐ５３レベルが誘導されたが、転写標的は誘導されなかったことを示す。ｐ５３野生型の腫瘍細胞系（ＨＣＴ−１１６ｐ５３＋／＋、Ａ５４９）およびｐ５３変異体の腫瘍細胞系（ＨＣＴ−１１６ｐ５３−／−、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＣ３３Ａ）に、偽ウイルス、ｗｔウイルスまたはΔ５５ｋウイルスのいずれかを感染させた。ｐ５３の活性化についての陽性対照としてドキソルビシン（ｄｏｘ）処理を用いた。２４ｈ．ｐ．ｉ．および３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点でタンパク質溶解物を回収し、ｐ５３、ｐ２１およびＭＤＭ２の発現について解析した。ローディングコントロールとしてアクチンの発現を解析した。 補足図３（本明細書では図９とも称される）は、ＵＶ照射ではΔＥ１Ｂ−５５ｋを感染させた細胞におけるｐ５３の転写標的を活性化することができないことを示す。小気道上皮細胞に、偽ウイルスまたはΔ５５ｋウイルスのいずれかを感染させ、無処理のままにしたか、または２４ｈ．ｐ．ｉ．の時点でＵＶを照射した（１３Ｊ）。３２ｈ．ｐ．ｉ．の時点で全ＲＮＡを単離した。リアルタイムＰＣＲを用いて、ｐ５３の転写標的、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＭＤＭ２、ｐ２１および１４−３−３σのｍＲＮＡレベルを定量化した。感染させていない細胞に対する（ｗｔ）ｍＲＮＡのレベルの倍数変化がプロットされており；垂直の棒は３連全体にわたる標準偏差を示す。 補足図４（本明細書では図１０とも称される）は、初期ウイルス遺伝子のアデノウイルスゲノムマップを、それらの公知の細胞標的および機能と共に示す。 補足図５（本明細書では図１１とも称される）は、Δ５５ｋ／ΔＯＲＦ３感染では、Ａｄ−ＧＦＰにおけるＥ４−ＯＲＦ３の発現がＥ１Ａ−１３ｓによってトランスに活性化されるが、Δ５５ｋ／Δ１３ｓ感染ではそうではないことを示す（ウイルスゲノムの相互作用を説明するための概略図および図３ｂの補完の実験）。Ａｄ−ＧＦＰは、ＣＭＶプロモーターにより、欠失したＥ１領域の代わりにＧＦＰの発現が駆動される複製インコンピテントな（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎｃｏｍｐｉｔｅｎｔ）ウイルスである（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＡｄ−ＣＭＶ）。Ａｄ−ＣＭＶゲノム骨格はＥ４転写単位を含む。Ｅ４遺伝子（ならびに他のウイルスのＯＲＦ）は通常、それらの転写活性化のためにＥ１Ａ−１３ｓを必要とするので、Ａｄ−ＣＭＶ感染では発現されない。しかし、Ａｄ−ＧＦＰをΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３と共感染させた場合、（図３ｂの場合と同様に）、Δ５５ｋ／ΔＯＲＦ３感染におけるＥ１Ａ−１３ｓの発現により、Ｅ４−ＯＲＦ３を含めたＡｄ−ＧＦＰ Ｅ４遺伝子の転写が部分的にトランスに活性化され得る（左側のパネル）。対照的に、Ａｄ−ＧＦＰとΔ５５ｋ／Δ１３ｓとの共感染では、いずれのウイルスにおいてもＥ４−ＯＲＦ３の発現は活性化されない（右側のパネル）。 補足図６（本明細書では図１２とも称される）は、ｐ５３の転写標的ではない遺伝子のｍＲＮＡのレベルが、Ｅ４−ＯＲＦ３の発現とは関係なく、ΔＥ１Ｂ−５５ｋを感染させた細胞において同様であることを示す。ＳＡＥＣに、偽ウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスを感染させた。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点でＲＮＡを回収し、リアルタイムＰＣＲを用いてハウスキーピング遺伝子であるＧＵＳＢ、およびウイルス感染によって誘導されるｐ５３のｍＲＮＡのレベルを定量化した。ｍＲＮＡのレベルが、偽感染に対する（ｗｒｔ）倍数変化としてグラフに示されており；垂直の棒は３連全体にわたる標準偏差を示す。 補足図７（本明細書では図１３とも称される）は、ポナステロン誘導性ｐ５３ ｃＤＮＡを有するＨ１２９９（ｐ５３ヌル）安定細胞系（Ｈ１２９９−Ｄ１）を示す。Ｈ１２９９−Ｄ１細胞は、ｐ５３ ｃＤＮＡの発現がポナステロン誘導性プロモーターの制御下にある、Ｈ１２９９（ｐ５３ヌル）安定細胞系である。ポナステロンＡを０μＭ、１μＭ、２.５μＭおよび５μＭで加えた。１６時間後にタンパク質溶解物を回収し、ｐ５３およびｐ２１の発現をウエスタンブロット法によって解析した。 補足図８（本明細書では図１４とも称される）は、Ｅ４−ＯＲＦ３がｐ５３と共局在しないことを示す。Ｕ２ＯＳ細胞に、偽ウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスを感染させ、２８ｈ．ｐ．ｉ．の時点で固定した。ｐ５３およびＥ４−ＯＲＦ３を免疫蛍光法によって検出し、Ｈｏｅｃｈｓｔを用いてＤＮＡ対比染色を行った。 補足図９（本明細書では図１５とも称される）は、ｐ５３が、Ｅ４−ＯＲＦ３の存在下で、野生型の活性なＤＮＡ結合ドメインタンパク質コンフォメーションを有することを示す。ＳＡＥＣに、偽ウイルス、ｗｔウイルス、ΔＯＲＦ３ウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスを感染させた。ｐ５３の活性化についての陽性対照としてドキソルビシン（ｄｏｘ）処理を用いた。ｐ５３を、ｐ５３コンフォメーション特異的抗体であるＰＡｂ１６２０およびＰＡｂ２４０を用いて溶解物から免疫沈降させた。溶解物および免疫沈降物を、ｐ５３についてウエスタンブロットした。 補足図１０（本明細書では図１６とも称される）。ｐ５３−ｌｕｃ（図４ａ）とは対照的に、対照ｐＧＬ３−ルシフェラーゼレポータープラスミドが、野生型感染、Δ５５ｋ感染およびΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３感染において同様のレベルまで活性化される。Ｕ２ＯＳ細胞に、ｐ５３−ルシフェラーゼレポーター（ｐ５３−ｌｕｃ）プラスミド、ｐ５３結合部位が変異したｐ５３−ルシフェラーゼレポーター（ｐ５３−変異体）プラスミドまたは対照ｐＧＬ３−ルシフェラーゼ（ｐＧＬ３−ｌｕｃ）プラスミドのいずれかをトランスフェクトした（３連で）。トランスフェクトした細胞にｗｔウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスのいずれかを感染させ、感染後４時間の時点でＤ−ルシフェリンを加えた。４８時間にわたって毎時、発光読み取り値を取得した。３連全体にわたる平均発光が、感染後の時間（ｈ．ｐ．ｉ．）を単位として時間に対してプロットされている。対照ｐＧＬ３−ルシフェラーゼトランスフェクションについての発光読み取り値は上に示されている（ｐ５３−ｌｕｃのデータは図４ａの同じ実験についてのものである）。 補足図１１（本明細書では図１７とも称される）は、Ｅ４−ＯＲＦ３により、ｐ５３の、細胞のクロマチン内の標的プロモーターへの結合が妨げられることを示す。偽ウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスに感染させたＵ２ＯＳ細胞において、３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で、ｐ５３モノクローナル抗体を使用してｐ５３クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を実施した。陽性対照としてドキソルビシンを使用した。特異性についての対照として、一致するＩｇＧアイソタイプを使用した。ＣｈＩＰ試料を、ｐ２１プロモーター配列（５’側および３’側のｐ５３結合部位）およびＭＤＭ２プロモーター配列についてリアルタイム定量的ＰＣＲによって分析し、インプットＤＮＡに対して正規化した。ｐ５３およびＩｇＧＣｈＩＰについての％回収率がｙ軸にプロットされている。ＩｇＧ対照における回収率がバックグラウンドの尺度である。上記ｐ２１プロモーターの−５ｋｂ領域はｐ５３結合配列を含有しないので、陰性対照として使用した。 補足図１２（本明細書では図１８とも称される）は、Δ５５ｋ感染ではＨ３Ｋ９ｍｅ３ヘテロクロマチンドメインが核の周辺に誘導されるが、Δ５５ｋ／ΔＯＲＦ３では誘導されないことを示す。（図４ｄの感染についての対照）Ｕ２ＯＳ細胞に、偽ウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスのいずれかを感染させ、感染後３６時間の時点で固定した。Ｈ３Ｋ９トリメチル（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）、Ｅ１Ａ（Δ５５ｋ感染およびΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３感染のどちらにおいても発現されるアデノウイルスの初期タンパク質）およびＥ４−ＯＲＦ３（白色）を免疫蛍光法によって検出した。Ｈｏｅｃｈｓｔを用いてＤＮＡを対比染色した。Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ２顕微鏡を用いて画像を得た。 補足図１３（本明細書では図１９とも称される）は、Δ５５ｋを感染させた細胞では、メチルトランスフェラーゼＳＵＶ３９Ｈ２が、高密度な細胞ＤＮＡおよびＨ３Ｋ９トリメチルと特異的に共局在することを示す。（図４ｅについての対照）。Ｕ２ＯＳ細胞に、偽ウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスのいずれかを感染させ、３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で固定した。図１９ａ。ＳＵＶ３９Ｈ２に対して生じた抗体（Ａｂｃａｍ）およびＨ３Ｋ９トリメチル（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）に対して生じた抗体を用いて免疫蛍光法を実施した。Ｈｏｅｃｈｓｔを用いてＤＮＡを染色した（白色）。図１９ｂ．ＳＵＶ３９Ｈ２に対して生じた第２の独立抗体（ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ）（ｓｃ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて免疫蛍光法を行い、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３を共染色してＳＵＶ３９Ｈ２の再局在化を確認した。図１９ｃ。ＳＵＶ３９Ｈ２およびＨ３Ｋ９ｍｅ３の免疫蛍光についてのＩｇＧアイソタイプ対照および二次抗体対照。Ｌｅｉｃａ共焦点ＳＰ２顕微鏡を用いて画像を得た。 補足図１３（本明細書では図１９とも称される）は、Δ５５ｋを感染させた細胞では、メチルトランスフェラーゼＳＵＶ３９Ｈ２が、高密度な細胞ＤＮＡおよびＨ３Ｋ９トリメチルと特異的に共局在することを示す。（図４ｅについての対照）。Ｕ２ＯＳ細胞に、偽ウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスのいずれかを感染させ、３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で固定した。図１９ａ。ＳＵＶ３９Ｈ２に対して生じた抗体（Ａｂｃａｍ）およびＨ３Ｋ９トリメチル（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）に対して生じた抗体を用いて免疫蛍光法を実施した。Ｈｏｅｃｈｓｔを用いてＤＮＡを染色した（白色）。図１９ｂ．ＳＵＶ３９Ｈ２に対して生じた第２の独立抗体（ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ）（ｓｃ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて免疫蛍光法を行い、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３を共染色してＳＵＶ３９Ｈ２の再局在化を確認した。図１９ｃ。ＳＵＶ３９Ｈ２およびＨ３Ｋ９ｍｅ３の免疫蛍光についてのＩｇＧアイソタイプ対照および二次抗体対照。Ｌｅｉｃａ共焦点ＳＰ２顕微鏡を用いて画像を得た。 補足図１３（本明細書では図１９とも称される）は、Δ５５ｋを感染させた細胞では、メチルトランスフェラーゼＳＵＶ３９Ｈ２が、高密度な細胞ＤＮＡおよびＨ３Ｋ９トリメチルと特異的に共局在することを示す。（図４ｅについての対照）。Ｕ２ＯＳ細胞に、偽ウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスのいずれかを感染させ、３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で固定した。図１９ａ。ＳＵＶ３９Ｈ２に対して生じた抗体（Ａｂｃａｍ）およびＨ３Ｋ９トリメチル（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）に対して生じた抗体を用いて免疫蛍光法を実施した。Ｈｏｅｃｈｓｔを用いてＤＮＡを染色した（白色）。図１９ｂ．ＳＵＶ３９Ｈ２に対して生じた第２の独立抗体（ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ）（ｓｃ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて免疫蛍光法を行い、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３を共染色してＳＵＶ３９Ｈ２の再局在化を確認した。図１９ｃ。ＳＵＶ３９Ｈ２およびＨ３Ｋ９ｍｅ３の免疫蛍光についてのＩｇＧアイソタイプ対照および二次抗体対照。Ｌｅｉｃａ共焦点ＳＰ２顕微鏡を用いて画像を得た。 補足図１４（本明細書では図２０とも称される）は、Δ５５ｋを感染させた細胞では、メチルトランスフェラーゼＳＵＶ３９Ｈ１が、高密度な細胞ＤＮＡおよびＨ３Ｋ９トリメチルと特異的に共局在することを示す。（図４ｅに対する対照）Ｕ２ＯＳ細胞に、偽ウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスのいずれかを感染させ、３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で固定した。図２０ａ。ＳＵＶ３９Ｈ１に対して生じた抗体およびＨ３Ｋ９トリメチル（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）に対して生じた抗体を用いて免疫蛍光法を実施した。Ｈｏｅｃｈｓｔを用いてＤＮＡを染色した（白色）。図２０ｂ。ＩｇＧアイソタイプ対照および二次抗体対照を示す。図２０ｃ．内在性のＳＵＶ３９Ｈ１抗体を用いた結果を確認するために、Ｕ２ＯＳ細胞に、ｍｙｃタグを付けたＳＵＶ３９Ｈ１発現構築物をトランスフェクトし、Δ５５ｋウイルスに感染させ、３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で固定した。Ｍｙｃタグを付けたＳＵＶ３９Ｈ１およびＨ３Ｋ９ｍｅ３を免疫蛍光法によって検出し、Ｈｏｅｃｈｓｔを用いてＤＮＡを対比染色した（白色）。Ｌｅｉｃａ共焦点ＳＰ２顕微鏡を用いて画像を得た。 補足図１４（本明細書では図２０とも称される）は、Δ５５ｋを感染させた細胞では、メチルトランスフェラーゼＳＵＶ３９Ｈ１が、高密度な細胞ＤＮＡおよびＨ３Ｋ９トリメチルと特異的に共局在することを示す。（図４ｅに対する対照）Ｕ２ＯＳ細胞に、偽ウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスのいずれかを感染させ、３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で固定した。図２０ａ。ＳＵＶ３９Ｈ１に対して生じた抗体およびＨ３Ｋ９トリメチル（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）に対して生じた抗体を用いて免疫蛍光法を実施した。Ｈｏｅｃｈｓｔを用いてＤＮＡを染色した（白色）。図２０ｂ。ＩｇＧアイソタイプ対照および二次抗体対照を示す。図２０ｃ．内在性のＳＵＶ３９Ｈ１抗体を用いた結果を確認するために、Ｕ２ＯＳ細胞に、ｍｙｃタグを付けたＳＵＶ３９Ｈ１発現構築物をトランスフェクトし、Δ５５ｋウイルスに感染させ、３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で固定した。Ｍｙｃタグを付けたＳＵＶ３９Ｈ１およびＨ３Ｋ９ｍｅ３を免疫蛍光法によって検出し、Ｈｏｅｃｈｓｔを用いてＤＮＡを対比染色した（白色）。Ｌｅｉｃａ共焦点ＳＰ２顕微鏡を用いて画像を得た。 補足図１４（本明細書では図２０とも称される）は、Δ５５ｋを感染させた細胞では、メチルトランスフェラーゼＳＵＶ３９Ｈ１が、高密度な細胞ＤＮＡおよびＨ３Ｋ９トリメチルと特異的に共局在することを示す。（図４ｅに対する対照）Ｕ２ＯＳ細胞に、偽ウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスのいずれかを感染させ、３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で固定した。図２０ａ。ＳＵＶ３９Ｈ１に対して生じた抗体およびＨ３Ｋ９トリメチル（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）に対して生じた抗体を用いて免疫蛍光法を実施した。Ｈｏｅｃｈｓｔを用いてＤＮＡを染色した（白色）。図２０ｂ。ＩｇＧアイソタイプ対照および二次抗体対照を示す。図２０ｃ．内在性のＳＵＶ３９Ｈ１抗体を用いた結果を確認するために、Ｕ２ＯＳ細胞に、ｍｙｃタグを付けたＳＵＶ３９Ｈ１発現構築物をトランスフェクトし、Δ５５ｋウイルスに感染させ、３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で固定した。Ｍｙｃタグを付けたＳＵＶ３９Ｈ１およびＨ３Ｋ９ｍｅ３を免疫蛍光法によって検出し、Ｈｏｅｃｈｓｔを用いてＤＮＡを対比染色した（白色）。Ｌｅｉｃａ共焦点ＳＰ２顕微鏡を用いて画像を得た。 補足図１５（本明細書では図２１とも称される）は、Δ５５ｋを感染させた細胞では、メチルトランスフェラーゼＧ９ａが、高密度な細胞ＤＮＡまたはＨ３Ｋ９トリメチルと共局在しないことを示す。（図４ｅについての対照）Ｕ２ＯＳ細胞に、偽ウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスのいずれかを感染させ、３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で固定した。Ｇ９ａに対して生じた抗体およびＨ３Ｋ９トリメチル（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）に対して生じた抗体を用いて免疫蛍光法を実施した。Ｈｏｅｃｈｓｔを用いてＤＮＡを対比染色した（白色）。Ａｘｉｏｐｌａｎ顕微鏡を用いて画像を得た。 補足図１６（本明細書では図２２とも称される）は、Δ５５ｋを感染させた細胞では、メチルトランスフェラーゼＳＥＴＤＢ１が、高密度な細胞ＤＮＡまたはＨ３Ｋ９トリメチルと共局在しないことを示す。（図４ｅについての対照）Ｕ２ＯＳ細胞に、偽ウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスのいずれかを感染させ、３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で固定した。ＳＥＴＤＢ１に対して生じた抗体およびＨ３Ｋ９トリメチル（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）に対して生じた抗体を用いて免疫蛍光法を実施した。Ｈｏｅｃｈｓｔを用いてＤＮＡを染色した（白色）。Ｎｉｋｏｎ Ａ１共焦点顕微鏡を用いて画像を得た。 補足図１７（本明細書では図２３とも称される）は、Ｅ４−ＯＲＦ３により、ｐ５３の標的プロモーターにおけるＨ３Ｋ９トリメチルが誘導され、ｐ５３のＤＮＡの結合が妨げられることを示す（図５ａにおける結果を％回収率としてプロットした）。偽ウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスに感染させたＵ２ＯＳ細胞を３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で回収した。ｐ５３抗体（図２３ａ）またはＨ３Ｋ９トリメチル（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）抗体（図２３ｂ）を使用して、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を実施した。陰性対照として非免疫ウサギＩｇＧを使用した。ｐ２１プロモーター配列（５’側および３’側のｐ５３結合部位）、ＭＤＭ２プロモーター配列、ＧＡＤＤ４５Ａプロモーター配列およびアクチンプロモーター配列について、リアルタイム定量的ＰＣＲを実施した。全ての結果がインプットＤＮＡに対して正規化されている。上記ｐ２１プロモーターの−５ｋｂ領域がｐ５３の結合についての陰性対照である。 補足図１７（本明細書では図２３とも称される）は、Ｅ４−ＯＲＦ３により、ｐ５３の標的プロモーターにおけるＨ３Ｋ９トリメチルが誘導され、ｐ５３のＤＮＡの結合が妨げられることを示す（図５ａにおける結果を％回収率としてプロットした）。偽ウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスに感染させたＵ２ＯＳ細胞を３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で回収した。ｐ５３抗体（図２３ａ）またはＨ３Ｋ９トリメチル（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）抗体（図２３ｂ）を使用して、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を実施した。陰性対照として非免疫ウサギＩｇＧを使用した。ｐ２１プロモーター配列（５’側および３’側のｐ５３結合部位）、ＭＤＭ２プロモーター配列、ＧＡＤＤ４５Ａプロモーター配列およびアクチンプロモーター配列について、リアルタイム定量的ＰＣＲを実施した。全ての結果がインプットＤＮＡに対して正規化されている。上記ｐ２１プロモーターの−５ｋｂ領域がｐ５３の結合についての陰性対照である。 補足図１８（本明細書では図２４とも称される）は、Ｅ４−ＯＲＦ３により、ｐ５３のＤＮＡの、複数のｐ５３の標的プロモーターのうちのプロモーターへの結合が妨げられることによってｐ５３が不活化されることを示す。偽ウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスに感染させたＵ２ＯＳ細胞を３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で回収した。図５ａにおけるｐ５３の標的プロモーターのパネルを拡張するために、ｐ５３抗体または非免疫マウスＩｇＧ対照を使用してｐ５３クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を実施した。ＣｈＩＰ試料をリアルタイム定量的ＰＣＲによって分析した。ｐ２１の５’側および３’側のｐ５３結合部位を分析することにより、補足図１７におけるものと同じＣｈＩＰの結果が確認され、さらに、ＦＡＳプロモーター、ＰＵＭＡプロモーター、ＧＡＤＤ４５Ａプロモーター、およびＰＩＧ３プロモーターを、インプットＤＮＡに対して正規化した結果を用いて解析した。ｐ５３のＣｈＩＰについての％回収率がｙ軸にプロットされている。上記ＩｇＧ対照についての回収率がバックグラウンドの尺度である。 補足図１９（本明細書では図２５とも称される）は、Δ５５ｋ感染では、Ｅ４−ＯＲＦ３により、ｐ５３の標的プロモーターにおけるＨ３Ｋ９トリメチルが誘導されることを示す。偽ウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスを感染させたＵ２ＯＳ細胞を３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で回収した。図５ａのｐ５３の標的プロモーターおよび対照のパネルを拡張するために、Ｈ３Ｋ９トリメチル（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）抗体または非免疫マウスＩｇＧ対照を使用してＨ３Ｋ９ｍｅ３クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を実施した。ＣｈＩＰ試料をリアルタイム定量的ＰＣＲによって分析した。ｐ２１の５’側および３’側のｐ５３結合部位を分析することにより、補足図１７におけるＣｈＩＰの結果が確認される。さらに、ｐ５３の標的であるＦＡＳプロモーター、ＰＵＭＡプロモーター、およびＰＩＧ３プロモーターを分析した。陰性対照として、ｐ５３の標的ではないＰＯＬＲ２を使用した。結果をインプットＤＮＡに対して正規化した。Ｈ３Ｋ９ｍｅ３ ＣｈＩＰについての％回収率がｙ軸にプロットされている。 補足図２０（本明細書では図２６とも称される）は、Ｅ４−ＯＲＦ３が、Ｕ２ＯＳの核におけるＨ３Ｋ９トリメチルヘテロクロマチン形成に直接関連することを示す。（図５ｂについての対照）Ｕ２ＯＳ細胞に、偽ウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスのいずれかを感染させ、３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で固定した。Ｅ４−ＯＲＦ３に対して生じた抗体およびＨ３Ｋ９トリメチル（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）に対して生じた抗体を用いて免疫蛍光法を実施した。Ｈｏｅｃｈｓｔを用いてＤＮＡを染色する（白色）。Ｎｉｋｏｎ Ａ１共焦点顕微鏡を用いて画像を得た。 補足図２１（本明細書では図２７とも称される）は、Ｅ４−ＯＲＦ３が、ＳＡＥＣの核におけるＨ３Ｋ９トリメチルヘテロクロマチン形成に直接関連することを示す。（図５ｃで得た、高解像度の画像に対する対照）小気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）に、偽ウイルス、Δ５５ｋウイルスまたはΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３ウイルスのいずれかを感染させ、３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で固定した。Ｅ４−ＯＲＦ３に対して生じた抗体およびＨ３Ｋ９トリメチル（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）に対して生じた抗体を用いて免疫蛍光法を実施した。Ｈｏｅｃｈｓｔを用いてＤＮＡを染色した（白色）。Ｌｅｉｃａ共焦点ＳＰ２顕微鏡を用いて画像を得た。 補足図２２（本明細書では図２８とも称される）は、全ゲノムの発現解析を実施するためにＲＮＡを回収したＳＡＥＣにおける２つの独立した実験からの溶解物を示す。異なる細胞のバッチを用いた２つの独立した実験（ＩおよびＩＩ）を、示されている通りに実施した。小気道上皮細胞に、偽ウイルス、野生型（ｗｔ）ウイルス、ΔＥ１Ｂ−５５ｋ（Δ５５ｋ）ウイルスまたはΔＥ１Ｂ−５５ｋ／ΔＥ４−ＯＲＦ３（Δ５５ｋ／ΔＯＲＦ３）ウイルスのいずれかを感染させ、溶解物について感染後３６時間の時点で回収した。ｐ５３の活性化についての陽性対照として、１２時間にわたるヌトリン処理を用いた。偽試料、Δ５５ｋ試料、Δ５５ｋ／ΔＯＲＦ３試料およびヌトリン試料についてＲＮＡを回収し、精製し（各実験について２連で）、次いで、標識し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘエキソンアレイにハイブリダイズさせて、全ゲノム発現解析を実施した。 補足図２３（本明細書では図２９とも称される）は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイのプローブ強度分布を示す。偽処理したＳＡＥＣ試料、ΔＥ１Ｂ−５５ｋ処理したＳＡＥＣ試料（Δ５５ｋ）、ΔＥ１Ｂ−５５ｋ／ΔＥ４−ＯＲＦ３処理したＳＡＥＣ試料（Δ５５ｋ／ΔＯＲＦ３）およびヌトリン処理したＳＡＥＣ試料とハイブリダイズしたＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘエキソンアレイチップのプローブ強度分布（各条件について４回の独立した反復実験）。 補足図２４（本明細書では図３０とも称される）は、Δ５５ｋおよびΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイ試料についての、個々の遺伝子強度（発現）の値の箱ひげ図を示す。Δ５５ｋおよびΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３についての個々の遺伝子転写物の対数強度値がｙ軸にプロットされている。点のそれぞれは独立した反復実験を表す。アスタリスクによってｐ５３の転写標的が示されている。 補足図２５（本明細書では図３１とも称される）は、初代ＳＡＥＣでは、ΔＥ１Ｂ−５５ｋ／ΔＥ４−ＯＲＦ３ウイルスの複製が、ΔＥ１Ｂ−５５ｋと比較して阻害されることを示す。ＳＡＥＣに、偽ウイルス、ΔＥ１Ｂ−５５ｋ／ΔＥ４−ＯＲＦ３（Δ５５ｋ／ΔＯＲＦ３）ウイルス、ΔＥ１Ｂ−５５ｋ（Δ５５ｋ）ウイルス、またはｗｔウイルスのいずれかを感染多重度１０で感染させ、感染後４８時間（４８ｈ．ｐ．ｉ．）および感染後７２時間（７２ｈ．ｐ．ｉ．）の時点で回収した。プラーク形成単位（ｐ．ｆ．ｕ．）での総ウイルス産生を、本方法に記載の通り２９３／Ｅ４細胞においてウイルス複製アッセイを実施することによって決定した；垂直の棒は３連全体にわたる標準偏差を示す。 図３２は、Ｅ４−ＯＲＦ３の高次のオリゴマー形成が、ｐ５３、ＭＲＮを不活化し、ウイルスの複製を容易にすることにおけるその機能に対して決定的であることを示す。（ＡおよびＤ）初代ＳＡＥＣに、偽アデノウイルス、野生型Ａｄ５（ＷＴ）アデノウイルス、Ｅ４−ＯＲＦ３アデノウイルス、Ｅ１Ｂ−５５Ｋアデノウイルス、Ｅ１Ｂ−５５Ｋ／Ｅ４−ＯＲＦ３アデノウイルスまたはＥ１Ｂ−５５Ｋ／Ｅ４−ＯＲＦ３ Ｎ８２Ａアデノウイルスのいずれかを感染させた。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点でタンパク質溶解物を回収し、ｐ５３、ＭＤＭ２およびｐ２１について、正規化し、免疫ブロットした。ローディングコントロールとしてβアクチンを解析した。（Ｂ）ＳＡＥＣに、示されているウイルスを感染させ、３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で固定し、Ｅ４−ＯＲＦ３、ＮＢＳ１およびＤＮＡについて免疫染色した。（Ｃ）Ｅ２Ａウイルスの複製ドメインを免疫染色したことを除いて、（Ｂ）の通りに行った。（Ｄ）溶解物をＡｄ５カプシドタンパク質について免疫ブロットしたことを除いて、（Ａ）の通りに行った。 図３２は、Ｅ４−ＯＲＦ３の高次のオリゴマー形成が、ｐ５３、ＭＲＮを不活化し、ウイルスの複製を容易にすることにおけるその機能に対して決定的であることを示す。（ＡおよびＤ）初代ＳＡＥＣに、偽アデノウイルス、野生型Ａｄ５（ＷＴ）アデノウイルス、Ｅ４−ＯＲＦ３アデノウイルス、Ｅ１Ｂ−５５Ｋアデノウイルス、Ｅ１Ｂ−５５Ｋ／Ｅ４−ＯＲＦ３アデノウイルスまたはＥ１Ｂ−５５Ｋ／Ｅ４−ＯＲＦ３ Ｎ８２Ａアデノウイルスのいずれかを感染させた。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点でタンパク質溶解物を回収し、ｐ５３、ＭＤＭ２およびｐ２１について、正規化し、免疫ブロットした。ローディングコントロールとしてβアクチンを解析した。（Ｂ）ＳＡＥＣに、示されているウイルスを感染させ、３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で固定し、Ｅ４−ＯＲＦ３、ＮＢＳ１およびＤＮＡについて免疫染色した。（Ｃ）Ｅ２Ａウイルスの複製ドメインを免疫染色したことを除いて、（Ｂ）の通りに行った。（Ｄ）溶解物をＡｄ５カプシドタンパク質について免疫ブロットしたことを除いて、（Ａ）の通りに行った。 図３２は、Ｅ４−ＯＲＦ３の高次のオリゴマー形成が、ｐ５３、ＭＲＮを不活化し、ウイルスの複製を容易にすることにおけるその機能に対して決定的であることを示す。（ＡおよびＤ）初代ＳＡＥＣに、偽アデノウイルス、野生型Ａｄ５（ＷＴ）アデノウイルス、Ｅ４−ＯＲＦ３アデノウイルス、Ｅ１Ｂ−５５Ｋアデノウイルス、Ｅ１Ｂ−５５Ｋ／Ｅ４−ＯＲＦ３アデノウイルスまたはＥ１Ｂ−５５Ｋ／Ｅ４−ＯＲＦ３ Ｎ８２Ａアデノウイルスのいずれかを感染させた。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点でタンパク質溶解物を回収し、ｐ５３、ＭＤＭ２およびｐ２１について、正規化し、免疫ブロットした。ローディングコントロールとしてβアクチンを解析した。（Ｂ）ＳＡＥＣに、示されているウイルスを感染させ、３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で固定し、Ｅ４−ＯＲＦ３、ＮＢＳ１およびＤＮＡについて免疫染色した。（Ｃ）Ｅ２Ａウイルスの複製ドメインを免疫染色したことを除いて、（Ｂ）の通りに行った。（Ｄ）溶解物をＡｄ５カプシドタンパク質について免疫ブロットしたことを除いて、（Ａ）の通りに行った。 図３２は、Ｅ４−ＯＲＦ３の高次のオリゴマー形成が、ｐ５３、ＭＲＮを不活化し、ウイルスの複製を容易にすることにおけるその機能に対して決定的であることを示す。（ＡおよびＤ）初代ＳＡＥＣに、偽アデノウイルス、野生型Ａｄ５（ＷＴ）アデノウイルス、Ｅ４−ＯＲＦ３アデノウイルス、Ｅ１Ｂ−５５Ｋアデノウイルス、Ｅ１Ｂ−５５Ｋ／Ｅ４−ＯＲＦ３アデノウイルスまたはＥ１Ｂ−５５Ｋ／Ｅ４−ＯＲＦ３ Ｎ８２Ａアデノウイルスのいずれかを感染させた。３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点でタンパク質溶解物を回収し、ｐ５３、ＭＤＭ２およびｐ２１について、正規化し、免疫ブロットした。ローディングコントロールとしてβアクチンを解析した。（Ｂ）ＳＡＥＣに、示されているウイルスを感染させ、３６ｈ．ｐ．ｉ．の時点で固定し、Ｅ４−ＯＲＦ３、ＮＢＳ１およびＤＮＡについて免疫染色した。（Ｃ）Ｅ２Ａウイルスの複製ドメインを免疫染色したことを除いて、（Ｂ）の通りに行った。（Ｄ）溶解物をＡｄ５カプシドタンパク質について免疫ブロットしたことを除いて、（Ａ）の通りに行った。
発明の詳細な説明
定義
「核酸」とは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよび一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のそのポリマー、ならびにその相補物を指す。この用語は、公知のヌクレオチド類似体または修飾された骨格残基または結合（ｌｉｎｋａｇｅ）を含有する核酸、合成核酸、天然に存在する核酸、天然に存在しない核酸、参照核酸と同様の結合特性を有する核酸、および参照ヌクレオチドと同様に代謝される核酸を包含する。そのような類似体の例としては、限定することなく、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。
本明細書中に記載される場合、用語「Ａｄ５」および「アデノウイルスゲノム」は、配列番号３に記載の核酸配列（ｎｕｃｌｅｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）をいう。
別段の指定のない限り、特定の核酸配列は、明確に示される配列だけでなく、保存的に修飾されたそのバリアント（例えば、縮重コドン置換）および相補配列も暗黙のうちに包含する。詳細には、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの第３位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって実現することができる（Batzerら、Nucleic Acid Res. １９巻：５０８１頁（１９９１年）；Ohtsukaら、J. Biol. Chem. ２６０巻：２６０５〜２６０８頁（１９８５年）；Rossoliniら、Mol. Cell. Probes ８巻：９１〜９８頁（１９９４年））。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換的に使用される。
特定の核酸配列は、「スプライスバリアント」も暗黙のうちに包含する。同様に、核酸にコードされる特定のタンパク質は、その核酸のスプライスバリアントにコードされる任意のタンパク質を暗黙のうちに包含する。「スプライスバリアント」は、その名称が示すように、遺伝子の代替スプライシングの産物である。転写後に、最初の核酸転写物は、異なる（代替の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライシングされ得る。スプライスバリアントが産生される機構は変動するが、エキソンの代替スプライシングを含む。その同じ核酸から、読み通し（ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）転写によって生じる代替のポリペプチドもこの定義に包含される。この定義には、上記スプライス産物の組換え型を含めたスプライシング反応の任意の産物が含まれる。カリウムチャネルスプライスバリアントの例がLeicherら、J. Biol. Chem. ２７３巻（５２号）：３５０９５〜３５１０１頁（１９９８年）において考察されている。
所望の治療的な遺伝子のコード配列および制御配列を含有する適切なベクターの構築には、当技術分野においてよく理解されている標準のライゲーション技法および制限技法を用いることができる（Maniatisら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、New York（１９８２年）を参照されたい）。単離されたプラスミド、ＤＮＡ配列、または合成オリゴヌクレオチドは、所望の形態に切断すること、調整すること、および再ライゲーションすることができる。
核酸は、それが別の核酸配列と機能的関係に置かれている場合、「作動可能に連結している」。例えば、プレ配列または分泌リーダーのためのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、そのポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能に連結している；プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、その配列に作動可能に連結している；またはリボソーム結合部位は、それが、翻訳が容易になるように位置している場合、コード配列に作動可能に連結している。一般に、「作動可能に連結している」とは、連結しているＤＮＡ配列が互いに近くにあり、また、分泌リーダーの場合では、近接しており、読み取り相（ｒｅａｄｉｎｇ ｐｈａｓｅ）内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは近接している必要はない。連結は、都合のよい制限部位におけるライゲーションによって実現される。そのような部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを従来の実施に従って使用する。
２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列に関して、「同一の」またはパーセント「同一性」という用語は、ＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを下記の初期状態のパラメータで用いて、または手動のアラインメントおよび目視検査（例えば、ＮＣＢＩウェブサイトなどを参照されたい）によって測定したところ、同じである２つ以上の配列またはサブシーケンス、または同じアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定の百分率（すなわち、比較ウィンドウまたは示された領域にわたり最大の対応について比較しアラインメントした場合、特定の領域にわたって約６０％の同一性、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い同一性）を有する２つ以上の配列またはサブシーケンスを指す。そのような配列はそこで「実質的に同一」といわれる。この定義は、試験配列の相補体（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）も指す、またはそれに適用することができる。この定義は、欠失および／または付加を有する配列、ならびに置換を有する配列も包含する。下記の通り、好ましいアルゴリズムはギャップなどを説明することができる。少なくとも約２５アミノ酸またはヌクレオチドの長さの領域にわたって同一性が存在することが好ましい、または５０〜１００アミノ酸またはヌクレオチドの長さの領域にわたって同一性が存在することがより好ましい。
配列比較のために、一般には、１つの配列が、試験配列を比較するための参照配列として働く。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要であればサブシーケンス座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。初期状態のプログラムパラメータを使用することができる、あるいは、代替のパラメータを指定することができることが好ましい。次いで上記配列比較アルゴリズムにより、上記プログラムパラメータに基づいて、上記参照配列と比較した上記試験配列についてのパーセント配列同一性が算出される。
「比較ウィンドウ」は、本明細書で使用される場合、配列を、同じ数の連続した位置の参照配列と、その２つの配列を最適にアラインメントした後に比較することができる、２０から６００まで、通常約５０〜約２００、より通常には約１００〜約１５０からなる群から選択される連続した位置の数のうちの任意の１つのセグメントを参照することを含む。比較するために配列をアラインメントする方法は当技術分野で周知である。比較するための最適な配列のアラインメントは、例えば、Smith & Waterman、Adv. Appl. Math. ２巻：４８２頁（１９８１年）の局所相同性アルゴリズム（ｌｏｃａｌ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）によって、Needleman & Wunsch、J. Mol. Biol. ４８巻：４４３頁（１９７０年）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Pearson & Lipman、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA ８５巻：２４４４頁（１９８８年）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ内のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または手動のアラインメントおよび目視検査（例えば、Current Protocols in Molecular Biology（Ausubelら編、１９９５年、追補）を参照されたい）によって行うことができる。
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適したアルゴリズムの好ましい例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれAltschulら、Nuc. Acids Res. ２５巻：３３８９〜３４０２頁（１９７７年）およびAltschulら、J. Mol. Biol. ２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０年）に記載されている。本発明の核酸およびタンパク質についてのパーセント配列同一性を決定するために、本明細書に記載のパラメータを用いてＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０を使用する。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、当技術分野で公知の通り、National Center for Biotechnology Informationを通じて公的に入手可能である。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列内の同じ長さのワードとアラインメントした際にいくらかの正の値の閾値スコアＴと一致するか、またはそれを満たすかのいずれかの、クエリ配列内の長さＷの短いワードを同定することにより、高スコアの配列対（ＨＳＰ）を同定することを伴う。Ｔは、近傍ワードスコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ ｗｏｒｄ ｓｃｏｒｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）と称される（Altschulら、上記）。これらの最初の近傍ワードヒット（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ ｗｏｒｄ ｈｉｔ）は、それらを含むより長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するための種としての機能を果たす。累積アラインメントスコアが増加し得る限りは上記ワードヒットを各配列に沿って両方向に伸長させる。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータＭ（残基の一致する対についてのリワード（ｒｅｗａｒｄ）スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティスコア；常に＜０）を使用して算出する。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを使用して上記累積スコアを算出する。各方向へのワードヒットの伸長は、上記累積アラインメントスコアが、その最大達成値から数量Ｘまで低下するとき；上記累積スコアが、１つまたは複数のネガティブスコアリング（ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｓｃｏｒｉｎｇ）残基アラインメントが蓄積したことによってゼロ以下になるとき；または、いずれかの配列の末端に到達するときに停止する。上記ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ、およびＸにより、上記アラインメントの感度およびスピードが決定される。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）では、初期状態としてワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両方の鎖の比較を用いる。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムで、初期状態としてワード長３、および期待値（Ｅ）１０、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff & Henikoff、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８９巻：１０９１５頁（１９８９年）を参照されたい）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を用いる。
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が天然に存在するアミノ酸に対応する人工的な化学的模倣物であるアミノ酸のポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸のポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸のポリマーにあてはまる。
「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに上記天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号にコードされるアミノ酸、ならびに後で修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体とは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合したα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能する化合物を指す。
アミノ酸は、本明細書ではそれらの一般に公知の３文字記号によってまたはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨されている１文字記号のいずれかによって称することができる。同様に、ヌクレオチドは、それらの一般に認められている１文字コードによって称することができる。
「保存的に修飾されたバリアント」は、アミノ酸配列と核酸配列の両方にあてはまる。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾されたバリアントとは、同一または基本的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、または上記核酸が基本的に同一の配列に対するアミノ酸配列をコードしない場合の核酸を指す。遺伝暗号の縮重が原因で、多数の機能的に同一の核酸が任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは全てアミノ酸アラニンをコードする。したがって、コドンによりアラニンが特定される全ての位置で、コードされるポリペプチドを変化させることなく、上記コドンを、記載されているその対応するコドンのいずれかに変更することができる。そのような核酸の変異は、保存的に修飾された変異の１つの種である「サイレント変異」である。本明細書におけるポリペプチドをコードする核酸配列の全ても同様に、上記核酸の可能性のあるサイレント変異の全てを説明する。核酸の各コドン（普通はメチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、および普通はトリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除いて）を改変して機能的に同一の分子をもたらすことができることは、当業者には理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸のサイレント変異のそれぞれは、記載されている配列のそれぞれに、発現産物に関しては、潜在的に含まれるが、実際のプローブ配列に関しては、そうではない。
アミノ酸配列に関して、コードされる配列における単一のアミノ酸または低百分率のアミノ酸を変化させる、付加するまたは欠失させる核酸配列、ペプチド配列、ポリペプチド配列、またはタンパク質配列への個々の置換、欠失または付加は、その変更によりアミノ酸が化学的に同様のアミノ酸で置換される「保存的に修飾されたバリアント」であることが当業者には理解される。機能的に同様のアミノ酸をもたらす保存置換の表は当技術分野で周知である。そのような保存的に修飾されたバリアントは、本発明の多型バリアント、種間ホモログ、および対立遺伝子に追加され、それを排除するものではない。
以下の８群はそれぞれ、互いに保存置換であるアミノ酸を含有する：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton、Proteins（１９８４年）を参照されたい）。
「組換え」という用語は、例えば、細胞、ウイルス、核酸、タンパク質、またはベクターを参照して使用される場合、その細胞、ウイルス、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸またはタンパク質の導入またはネイティブな核酸またはタンパク質の変更によって改変されていること、またはその細胞が、そのように改変された細胞に由来する細胞であることを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、ネイティブな（非組換え）形態の細胞においては見いだされない遺伝子を発現する、または別の方法で異常に発現される、低発現である、もしくは全く発現されないネイティブな遺伝子を発現する。
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という句は、プローブが、一般には核酸の複合混合物（ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｉｘｔｕｒｅ）中のその標的サブシーケンスとハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況では異なる。より長い配列は、特により高い温度でハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについての広範な手引きは、Tijssen、Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes、「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays」（１９９３年）に見いだされる。一般に、ストリンジェントな条件は、定義済みのイオン強度、ｐＨにおける特定の配列についての熱融点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低くなるように選択する。上記Ｔｍは、上記標的と相補的な上記プローブの５０％が平衡状態（標的配列が過剰に存在するので、Ｔｍにおいて、上記プローブの５０％が平衡状態で占有される）でその標的配列とハイブリダイズする温度（定義済みのイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度において）である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤を添加することによって実現することもできる。選択的ハイブリダイゼーションまたは特異的ハイブリダイゼーションについて、陽性シグナルはバックグラウンドの少なくとも２倍であり、バックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍であることが好ましい。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は以下の通りであってよい：５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％のＳＤＳ、４２℃でインキュベートすること、または、５×ＳＳＣ、１％のＳＤＳ、６５℃でインキュベートし、０．２×ＳＳＣ、および０．１％のＳＤＳ中、６５℃で洗浄すること。
ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一であれば、それでも実質的に同一である。これは、例えば、上記遺伝暗号により許容される最大のコドンの縮重を用いて核酸のコピーを創製する場合に生じる。そのような場合では、上記核酸は、一般には中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。例示的な「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」としては、４０％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳの緩衝液中、３７℃でのハイブリダイゼーション、および１×ＳＳＣ中、４５℃での洗浄が挙げられる。陽性のハイブリダイゼーションは、バックグラウンドの少なくとも２倍である。同様のストリンジェンシーの条件をもたらすために代替のハイブリダイゼーション条件および洗浄条件を利用することができることは、当業者には容易に理解される。ハイブリダイゼーションのパラメータを決定するための追加の手引きは多数の参照、例えば、Current Protocols in Molecular Biology、Ausubelら編、John Wiley & Sonsにおいて提供される。
ＰＣＲに関して、低ストリンジェンシーの増幅のためには約３６℃の温度が典型的であるが、アニーリング温度は、プライマーの長さに応じて約３２℃から４８℃の間で変動し得る。高ストリンジェンシーのＰＣＲ増幅のためには、約６２℃の温度が典型的であるが、高ストリンジェンシーのアニーリング温度は、上記プライマーの長さおよび特異性に応じて約５０℃から約６５℃までの範囲であり得る。高ストリンジェンシーの増幅および低ストリンジェンシーの増幅の両方に対する典型的なサイクル条件は、９０℃〜９５℃で３０秒間〜２分間の変性相、３０秒間〜２分間続くアニーリング相、および約７２℃で１〜２分間にわたる伸長相を含む。低ストリンジェンシーの増幅反応および高ストリンジェンシーの増幅反応についてのプロトコールおよび手引きは、例えば、Innisら（１９９０年）PCR Protocols、A Guide to Methods and Applications、Academic Press, Inc. N.Y.）において提供される。
本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、白血病、癌腫および肉腫を含めた、哺乳動物に見いだされる全種類のがん、新生物、または悪性腫瘍を指す。例示的ながんとしては、脳がん、乳がん、子宮頸部がん、結腸がん、頭頸部がん、肝がん、腎がん、肺がん、非小細胞肺がん、黒色腫、中皮腫、卵巣がん、肉腫、胃がん、子宮がんおよび髄芽腫が挙げられる。さらなる例としては、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、卵巣がん、横紋筋肉腫、原発性血小板血症、原発性マクログロブリン血症、原発性脳腫瘍、がん、悪性膵臓インスリノーマ（insulanoma）、悪性カルチノイド、膀胱がん、前癌皮膚病変、精巣がん、リンパ腫、甲状腺がん、神経芽細胞腫、食道がん、泌尿生殖器がん、悪性高カルシウム血症、子宮体がん、副腎皮質がん、膵内分泌腺および膵外分泌腺の新生物、ならびに前立腺がんが挙げられる。
「白血病」という用語は、広範には造血臓器の進行性の悪性疾患を指し、一般に、血液および骨髄における白血球およびそれらの前駆体の増殖および発生の変形を特徴とする。白血病は、一般に、（１）疾患の持続時間および特性−急性または慢性；（２）関与する細胞の種類；骨髄系（ｍｙｅｌｏｉｄ）（骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ））、リンパ系（リンパ性）、または単球性；および（３）血液中の異常な細胞の数が増加するか増加しないか−白血病性または無白血病性（亜白血病性）に基づいて臨床的に分類される。Ｐ３８８白血病モデルは、ｉｎ ｖｉｖｏにおける抗白血病活性を予測するものとして広範に認められている。Ｐ３８８アッセイにおいて試験陽性の化合物は、一般に、処置されている白血病の種類にかかわらずｉｎ ｖｉｖｏでいくらかのレベルの抗白血病活性を示すと考えられている。したがって、本発明は、白血病を処置する方法、および好ましくは、急性非リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性顆粒球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性前骨髄球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、無白血病性白血病、白血球血症性白血病（ｌｅｕｋｏｃｙｔｈｅｍｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、好塩基球性白血病、芽細胞白血病、ウシ白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚白血病、胎生細胞性白血病（ｅｍｂｒｙｏｎａｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、好酸球性白血病、グロス白血病（Ｇｒｏｓｓ’ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、有毛細胞白血病、血球母細胞性白血病（ｈｅｍｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、血球芽細胞性白血病（ｈｅｍｏｃｙｔｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、組織球性白血病（ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、幹細胞性白血病、急性単球性白血病、白血球減少性白血病、リンパ性白血病（ｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、リンパ芽球性白血病、リンパ性白血病（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、リンパ性白血病（ｌｙｍｐｈｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、リンパ性白血病（ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、リンパ肉腫細胞性白血病、肥満細胞性白血病、巨核球性白血病、小骨髄芽球性白血病、単球性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄球性白血病、骨髄顆粒球性白血病（ｍｙｅｌｏｉｄ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、骨髄単球性白血病、ネーゲリ白血病（Ｎａｅｇｅｌｉ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、形質細胞白血病、多発性骨髄腫、形質細胞性白血病、前骨髄球性白血病、リーダー細胞性白血病、シリング白血病（Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ’ｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、幹細胞性白血病、亜白血性白血病、および未分化細胞性白血病（ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ）を処置する方法を包含する。
「肉腫」という用語は、概して、胚の結合組織のような物質でできている腫瘍を指し、一般に、線維状物質または均一な物質に埋め込まれた密に固まった（ｐａｃｋｅｄ）細胞で構成される。抗新生物性チオール結合性ミトコンドリアオキシダントと抗がん剤の組み合わせを用いて処置することができる肉腫としては、軟骨肉腫、線維肉腫、リンパ肉腫、黒色肉腫、粘液肉腫、骨肉腫、アバーネシー肉腫（Ａｂｅｍｅｔｈｙ’ｓ ｓａｒｃｏｍａ）、脂肪肉腫（ａｄｉｐｏｓｅ ｓａｒｃｏｍａ）、脂肪肉腫（ｌｉｐｏｓａｒｃｏｍａ）、胞状軟部肉腫、エナメル上皮肉腫、ブドウ状肉腫、緑色腫肉腫（ｃｈｌｏｒｏｍａ ｓａｒｃｏｍａ）、絨毛癌、胎生期肉腫、ウィルムス腫瘍肉腫（Ｗｉｌｍｓ’ｔｕｍｏｒ ｓａｒｃｏｍａ）、子宮内膜肉腫、間質肉腫、ユーイング肉腫、筋膜肉腫（ｆａｓｃｉａｌ ｓａｒｃｏｍａ）、線維芽細胞肉腫（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｉｃ ｓａｒｃｏｍａ）、巨細胞肉腫、顆粒球性肉腫、ホジキン肉腫、特発性多発性色素性出血性肉腫（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｓａｒｃｏｍａ）、Ｂ細胞の免疫芽球肉腫、リンパ腫、Ｔ細胞の免疫芽球肉腫、イエンセン肉腫（Ｊｅｎｓｅｎ’ｓ ｓａｒｃｏｍａ）、カポジ肉腫、クッパー細胞肉腫（Ｋｕｐｆｆｅｒ ｃｅｌｌ ｓａｒｃｏｍａ）、血管肉腫、白血肉腫、悪性間葉腫（ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍｏｍａ ｓａｒｃｏｍａ）、傍骨性肉腫（ｐａｒｏｓｔｅａｌ ｓａｒｃｏｍａ）、網状赤血球肉腫（ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｉｃ ｓａｒｃｏｍａ）、ラウス肉腫、漿液嚢腫性肉腫（ｓｅｒｏｃｙｓｔｉｃ ｓａｒｃｏｍａ）、滑膜肉腫、および毛細血管拡張性肉腫（ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｌｔｉｃ ｓａｒｃｏｍａ）が挙げられる。
「黒色腫」という用語は、皮膚および他の器官のメラニン細胞系から生じる腫瘍を意味すると解釈される。抗新生物性チオール結合性ミトコンドリアオキシダントと抗がん剤の組み合わせを用いて処置することができる黒色腫としては、例えば、末端部黒子黒色腫、無色素性黒色腫、良性若年性黒色腫、クラウドマン黒色腫（Ｃｌｏｕｄｍａｎ’ｓ ｍｅｌａｎｏｍａ）、Ｓ９１黒色腫、ハーディングパッセー黒色腫、若年性黒色腫、悪性黒子黒色腫、悪性黒色腫、結節性黒色腫、爪下黒色腫（subungal melanoma）、および表在拡大型黒色腫が挙げられる。
「癌腫」という用語は、周囲の組織に浸潤し、転移を生じさせる傾向がある、上皮細胞でできている悪性の新しい成長物を指す。抗新生物性チオール結合性ミトコンドリアオキシダントと抗がん剤の組み合わせを用いて処置することができる例示的な癌腫としては、例えば、細葉癌腫（ａｃｉｎａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、細葉状癌腫（ａｃｉｎｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腺嚢癌腫、腺様嚢胞癌腫、腺腫様癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｄｅｎｏｍａｔｏｓｕｍ）、副腎皮質癌腫、肺胞癌腫、肺胞細胞癌腫、基底細胞癌腫（ｂａｓａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、基底細胞癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｂａｓｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、類基底細胞癌腫、基底有棘細胞癌腫、細気管支肺胞癌腫、細気管支癌腫、気管支原性癌腫、大脳様癌腫（ｃｅｒｅｂｒｉｆｏｒｍ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、胆管細胞癌腫、絨毛癌腫、膠様癌腫、面皰癌腫、体癌腫（ｃｏｒｐｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、篩状癌腫（ｃｒｉｂｒｉｆｏｒｍ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、鎧状癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｅｎ ｃｕｉｒａｓｓｅ）、皮膚癌腫、円柱状癌腫（ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、円柱細胞癌腫、腺管癌腫、緻密癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｄｕｒｕｍ）、胎生期癌腫、脳様癌腫、類表皮癌腫（ｅｐｉｅｒｍｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、上皮腺様癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｅ ａｄｅｎｏｉｄｅｓ）、外方増殖性癌腫（ｅｘｏｐｈｙｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、潰瘍癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｅｘ ｕｌｃｅｒｅ）、線維性癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｆｉｂｒｏｓｕｍ）、ゼラチン状癌（ｇｅｌａｔｉｎｉｆｏｒｎｉ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、膠様癌腫（ｇｅｌａｔｉｎｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、巨細胞癌腫（ｇｉａｎｔ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、巨細胞癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｇｉｇａｎｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、腺癌（ｇｌａｎｄｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、顆粒膜細胞癌腫、毛母癌腫（ｈａｉｒ−ｍａｔｒｉｘ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、血液様癌腫（ｈｅｍａｔｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝細胞癌腫、ヒュルトレ細胞癌腫、ヒアリン癌腫（ｈｙａｌｉｎｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、副腎様癌腫（ｈｙｐｅｍｅｐｈｒｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳児胎生期癌腫（ｉｎｆａｎｔｉｌｅ ｅｍｂｒｙｏｎａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、上皮内癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎ ｓｉｔｕ）、表皮内癌腫、上皮内癌腫（ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、クロンペシェール癌腫（Ｋｒｏｍｐｅｃｈｅｒ’ｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、クルチツキー細胞癌腫、大細胞癌腫、レンズ状癌腫（ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、レンズ状癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒｅ）、脂肪腫性癌腫（ｌｉｐｏｍａｔｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、リンパ上皮癌（ｌｙｍｐｈｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、髄様癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｅｄｕｌｌａｒｅ）、髄様癌腫（ｍｅｄｕｌｌａｒｙ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、黒色癌腫、モール癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｏｌｌｅ）、粘液性癌腫、粘液分泌性癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｕｃｉｐａｒｕｍ）、粘液細胞癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｕｃｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、粘液性類表皮癌腫、粘液癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｕｃｏｓｕｍ）、粘液性癌腫、粘液腫性癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｙｘｏｍａｔｏｄｅｓ）、鼻咽腔癌腫、燕麦細胞癌腫、骨化性癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｓｓｉｆｉｃａｎｓ）、類骨癌腫（ｏｓｔｅｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳頭状癌腫、門脈周囲性癌腫（ｐｅｒｉｐｏｒｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、前浸潤癌、有棘細胞癌（ｐｒｉｃｋｌｅ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粥状癌腫（ｐｕｌｔａｃｅｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腎臓の腎細胞癌腫、予備細胞癌腫（ｒｅｓｅｒｖｅ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肉腫様癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｓａｒｃｏｍａｔｏｄｅｓ）、シュナイダー癌（ｓｃｈｎｅｉｄｅｒｉａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、硬性癌腫、陰嚢癌腫、印環細胞癌腫、単純癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｓｉｍｐｌｅｘ）、小細胞癌腫、ソラノイド癌腫（ｓｏｌａｎｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、球状細胞癌腫（ｓｐｈｅｒｏｉｄａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、紡錘体細胞癌腫、海綿様癌腫、扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ストリング癌腫（ｓｔｒｉｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、毛細血管拡張性癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｔｉｃｕｍ）、毛細血管拡張様癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔｏｄｅｓ）、移行上皮癌、結節癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、結節癌腫（ｔｕｂｅｒｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、疣状癌腫、および絨毛癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｖｉｌｌｏｓｕｍ）が挙げられる。
「治療有効用量または量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｄｏｓｅ ｏｒ ａｍｏｕｎｔ）」とは、本明細書では、それが投与されるものに効果を生じる用量を意味する。その正確な用量および処方は処置の目的に依存し、当業者は公知の技法を使用して確かめることができる（例えば、Lieberman、Pharmaceutical Dosage Forms（１〜３巻、１９９２年）；Lloyd、The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding（１９９９年）；Remington：The Science and Practice of Pharmacy、第２０版、Gennaro編（２００３年）、およびPickar、Dosage Calculations（１９９９年）を参照されたい）。
「薬学的に許容される塩」または「薬学的に許容されるキャリア」という用語は、本明細書に記載の化合物に見いだされる特定の置換基に応じて、比較的非毒性の酸または塩基を用いて調製される活性化合物の塩を含むことを意味するする。本発明の化合物が比較的酸性の官能基を有する場合、中性の形態のそのような化合物を十分な量の所望の塩基と、そのままで、または適切な不活性溶媒中で接触させることによって塩基付加塩を得ることができる。薬学的に許容される塩基付加塩の例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、有機アミノ塩、またはマグネシウム塩、または同様の塩が挙げられる。本発明の化合物が比較的塩基性の官能基を有する場合、中性の形態のそのような化合物を、十分な量の所望の酸と、そのままで、または適切な不活性溶媒中で接触させることによって酸付加塩を得ることができる。薬学的に許容される酸付加塩の例としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、一水素炭酸（ｍｏｎｏｈｙｄｒｏｇｅｎｃａｒｂｏｎｉｃ）、リン酸、一水素リン酸（ｍｏｎｏｈｙｄｒｏｇｅｎｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ）、二水素リン酸（ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ）、硫酸、一水素硫酸（ｍｏｎｏｈｙｄｒｏｇｅｎｓｕｌｆｕｒｉｃ）、ヨウ化水素酸、または亜リン酸などのような無機酸に由来する酸付加塩、ならびに、酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トリルスルホン酸（ｐ−ｔｏｌｙｌｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、クエン酸、酒石酸、およびメタンスルホン酸などのような比較的非毒性の有機酸に由来する塩が挙げられる。アルギン酸塩（arginate）などのようなアミノ酸の塩、およびグルクロン酸またはガラクツロン酸（galactunoric）のような有機酸の塩も包含される（例えば、Bergeら、Journal of Pharmaceutical Science ６６巻：１〜１９頁（１９７７年）を参照されたい）。ある特定の本発明の化合物は、その化合物を塩基付加塩または酸付加塩のいずれかに変換することを可能にする塩基性および酸性の官能基を含有する。当業者に公知の他の薬学的に許容されるキャリアは、本発明に適している。
Ｉ．改変アデノウイルス
一態様では、改変アデノウイルスが提供される。上記改変アデノウイルスは、ｐ５３により複製が障害されるアデノウイルスであってよい。上記ｐ５３により複製が障害されるアデノウイルスは、ｐ５３発現細胞内に存在する場合には複製が障害され、ｐ５３が障害された細胞内に存在する場合には複製が障害されない。「複製が障害される」という用語は、本明細書で使用される場合、ｐ５３発現細胞内に存在する場合に、ウイルスの複製が、ｐ５３が障害された細胞におけるウイルスの複製と比較して減弱されていることを意味する。ｐ５３発現細胞は、正常な活性を有する正常なレベルのｐ５３を発現する細胞である。
上記改変アデノウイルスは、ｐ５３により複製が障害されるアデノウイルスかつ／またはＥ４−ＯＲＦ３が障害されたアデノウイルスであってもよい。いくつかの実施形態では、上記改変アデノウイルスはｐ５３により複製が障害されかつＥ４−ＯＲＦ３が障害されている。上記改変アデノウイルスは、単離されたアデノウイルスであってよい。「改変アデノウイルス」という用語は、天然に見出されない遺伝子配列を有するアデノウイルス（例えば、非野生型アデノウイルス）を指す。いくつかの実施形態では、上記改変アデノウイルスは、組換えアデノウイルスである。
「ｐ５３により複製が障害される」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞に感染した際に、正常なレベルの機能的な細胞性ｐ５３の存在下で、アデノウイルスの複製が部分的にまたは完全に減弱されることを意味する。例えば、その感染細胞においてｐ５３が障害されている場合（すなわち、上記感染細胞が正常なレベルの完全に機能的なｐ５３を発現しない場合）、上記ｐ５３により複製が障害されるアデノウイルスの複製は正常に進行する。逆に、細胞が正常なレベルの機能的なｐ５３を発現する場合（例えば、正常な活性を有するｐ５３、本明細書では「ｐ５３発現細胞」とも称される）、上記ｐ５３により複製が障害されるアデノウイルスの複製は減弱される、または妨げられる。細胞は、ｐ５３を正常なレベルで発現することができないこと（例えば、ｐ５３遺伝子の制御領域（例えば、プロモーター）に対する変異）、または正常を下回るｐ５３活性を有する変異したｐ５３を発現することにより、ｐ５３障害性であり得る。正常なレベルのｐ５３および正常なｐ５３活性レベルは、健康な病的でない同じ種類の細胞において見出される。したがって、いくつかの実施形態では、上記ｐ５３が障害された細胞は、変異したｐ５３遺伝子を含む。いくつかの関連する実施形態では、上記ｐ５３が障害された細胞は、ｐ５３遺伝子が完全に、または部分的に欠失しているゲノムを含む。上記ｐ５３が障害された細胞は、がん（例えば、新生物）細胞であってよい。
「Ｅ４−ＯＲＦ３が障害された」という用語は、本明細書で使用される場合、上記アデノウイルスが正常なレベルのＥ４−ＯＲＦ３遺伝子産物かつ／または完全に機能的なＥ４−ＯＲＦ３遺伝子産物を産生することができないことを意味する。例えば、ウイルスは、配列番号１に記載のＥ４−ＯＲＦ３遺伝子産物を正常なレベルで発現することができないこと（例えば、上記Ｅ４−ＯＲＦ３遺伝子の制御領域（例えば、プロモーター）に対する変異）、または正常を下回るＥ４−ＯＲＦ３遺伝子産物活性を有する変異したＥ４−ＯＲＦ３遺伝子産物を発現することによりＥ４−ＯＲＦ３が障害され得る。したがって、いくつかの実施形態では、上記Ｅ４−ＯＲＦ３が障害されたアデノウイルスは、変異したＥ４−ＯＲＦ３遺伝子を含む。いくつかの関連する実施形態では、上記Ｅ４−ＯＲＦ３が障害されたアデノウイルスは、そのＥ４−ＯＲＦ３遺伝子が完全に、または部分的に欠失しているゲノムを含む。さらに限定することなく、障害されたＥ４ＯＲＦ３タンパク質についての例は、配列番号１に記載のもののアミノ酸残基８２が変異しているＥ４ＯＲＦ３タンパク質である（図３２）。
いくつかの実施形態では、上記アデノウイルスはＥ１Ｂ−５５ｋもまた障害されている。「Ｅ１Ｂ−５５ｋが障害された」という用語は、本明細書で使用される場合、上記アデノウイルスが、正常なレベル、かつ／または完全に機能的な配列番号２に記載のＥ１Ｂ−５５ｋ遺伝子産物を産生することができないことを意味する。例えば、ウイルスは、正常なレベルのＥ１Ｂ−５５ｋ遺伝子産物を発現することができないこと（例えば、上記Ｅ４−ＯＲＦ３遺伝子の制御領域（例えば、プロモーター）に対する変異）、または正常を下回るＥ４−ＯＲＦ３遺伝子産物活性を有する変異したＥ１Ｂ−５５ｋ遺伝子産物を発現することによりＥ１Ｂ−５５ｋが障害され得る。Ｅ１Ｂ−５５ｋ遺伝子産物およびＥ４−ＯＲＦ３遺伝子産物の正常なレベルおよび活性は、同じ種類の野生型アデノウイルス（例えば、変異していないアデノウイルス）によって産生されるレベルおよび活性である。したがって、いくつかの実施形態では、上記Ｅ１Ｂ−５５ｋが障害されたアデノウイルスは、変異したＥ１Ｂ−５５ｋ遺伝子を含む。いくつかの関連する実施形態では、上記Ｅ１Ｂ−５５ｋが障害されたアデノウイルスは、そのＥ１Ｂ−５５ｋ遺伝子が完全に、または部分的に欠失しているゲノムを含む。
タンパク質（例えば、ｐ５３、Ｅ１Ｂ−５５ｋ遺伝子産物、Ｅ４−ＯＲＦ３遺伝子産物など）のレベルおよび活性を決定するための種々のアッセイ、例えば、増大／発現方法、免疫組織学的検査方法、ＦＩＳＨおよびシェッド抗原アッセイ（ｓｈｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ ａｓｓａｙ）、サザンブロット法、またはＰＣＲ技法が利用可能である。さらに、上記タンパク質の発現または増大は、ｉｎ ｖｉｖｏ診断アッセイを用いて、例えば、検出しようとするタンパク質に結合し、検出可能な標識（例えば、放射性同位元素）でタグ付けされた分子（例えば、抗体など）を投与し、上記標識の局在化について患者を外部から走査することによって評価することができる。したがって、細胞内のタンパク質レベルのレベルを測定する方法は、一般に、当技術分野で公知であり、適用可能な本明細書において提供される方法および組成物と共にタンパク質レベルおよび／または活性を評価するために用いることができる。
別の態様では、上記の改変アデノウイルス感染細胞が提供される。いくつかの実施形態では、上記細胞は、上記の改変アデノウイルスで形質転換されている。ある特定の実施形態では、上記細胞は、上記の改変アデノウイルスの遺伝材料の取り込み、組み入れおよび発現の結果として遺伝子変換されている。
いくつかの実施形態では、上記細胞は、ヒト細胞などの哺乳動物の細胞である。いくつかの実施形態では、上記アデノウイルスは、ヒトアデノウイルスなどの哺乳動物のアデノウイルスである。いくつかの実施形態では、上記細胞は、両生類の細胞（例えば、カエル細胞）または爬虫類の細胞（例えば、ヘビ細胞）である。
いかなる特定の機構論にも縛られることなく、上記ウイルスのＥ１Ｂ−５５ｋ遺伝子産物およびＥ４−ＯＲＦ３遺伝子産物により、ウイルスの感染に反応した細胞性アポトーシスを含めた細胞性ｐ５３媒介性効果が低下すると考えられている。したがって、ウイルスのＥ１Ｂ−５５ｋ遺伝子産物およびＥ４−ＯＲＦ３遺伝子産物は、細胞内のｐ５３のレベル、細胞内のｐ５３の活性、またはｐ５３媒介性事象に関与するタンパク質（例えば、ＭＤＭ２、ＦＡＳ、ＰＩＧ３、ＴＰ５３ＩＮＰ１、ＢＴＧ２、ＬＲＤＤ／ＰＩＤＤ、ＨＲＨ１、ＲＮＡＳＥ７、およびＪＭＪＤ１Ｃのタンパク質遺伝子産物）の活性のレベルを低下させるように作用し得る。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で提供される改変アデノウイルスは、正常なｐ５３活性を有する細胞では効率的に複製することができないが、ｐ５３活性が減弱している細胞（例えば、がん細胞）では複製することができる。
本明細書では、上記の改変アデノウイルスをコードする核酸も提供される。いくつかの実施形態では、上記改変アデノウイルスをコードする１つの核酸（例えば、プラスミド）が提供される。他の実施形態では、上記改変アデノウイルスをコードする複数の核酸（例えば、複数のプラスミド）が提供される。
ＩＩ．がんを処置する方法
別の態様では、がんを処置する方法が提供される。当該方法は、有効量（例えば、治療有効用量または量の改変アデノウイルス（上記の通り）または上記改変アデノウイルスをコードする１種または複数種の核酸を、それを必要とする被験体に投与するステップを含む。
いくつかの実施形態では、上記がんは、ｐ５３に関連するがんである。本明細書に記載の「ｐ５３に関連するがん」とは、ｐ５３が障害されたがん細胞によって引き起こされるがんである。したがって、いくつかの実施形態では、本発明において処置されるがんは、ｐ５３の発現または活性が低下していること（例えば、正常を下回るレベルでまたは低レベルで発現されるｐ５３タンパク質）または、ｐ５３の発現の活性が低い（または活性がない）または正常な活性よりも低いことを特徴とするがんであってよい。がんが、ｐ５３が障害されたがん細胞であるかどうかを決定する方法は当技術分野で公知であり、一般に、本明細書において提供される方法および組成物と併せて適用可能である。
いくつかの実施形態では、上記がんは、肺がん、皮膚がん、または乳がんである。いくつかの実施形態では、処置されるがんは前がん状態の乳がんである。
ＩＩＩ．投与方法および製剤
上記改変ウイルス（または上記改変アデノウイルスをコードする１種または複数種の核酸）を、静脈内投与、例えば、ボーラスとしてまたはある期間にわたる連続的な注入によって、筋肉内経路、腹腔内経路、脳脊髄内（ｉｎｔｒａｃｅｒｏｂｒｏｓｐｉｎａｌ）経路、皮下経路、関節内経路、滑液包経路、髄腔内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）経路、経口経路、局所経路、腫瘍内経路または吸入経路による公知の方法に従ってヒト患者に投与する。その投与は局所的または全身的であってよい。
投与するための組成物は、一般に、薬学的に許容されるキャリア、好ましくは水性キャリアに溶解させた本明細書に記載の作用物質（ａｇｅｎｔ）（例えば、改変アデノウイルスまたは改変アデノウイルスをコードする１種または複数種の核酸）を含む。緩衝食塩水などの種々の水性キャリアを使用することができる。これらの溶液は滅菌されており、一般に、望ましくない物質（ｍａｔｔｅｒ）を含まない。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技法によって滅菌することができる。上記組成物は、生理的条件に近づけるために必要とされる薬学的に許容される補助物質（ａｕｘｉｌｉａｒｙｓｕｂｓｔａｎｃｅ）、例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含有してよい。これらの製剤中の活性剤（ａｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）の濃度は広範に変動し得、主に流体容積、粘度、体重などに基づいて、選択された特定の投与形式および患者の必要性に従って選択される。
したがって、静脈内投与するための典型的な薬学的組成物は上記作用物質によって変動する。非経口的に投与可能な組成物を調製するための実際の方法は当業者には公知であるまたは明らかであり、Remington's Pharmaceutical Science、第１５版、Mack Publishing Company、Easton、Pa.（１９８０年）などの刊行物においてより詳細に記載されている。
上記薬学的組成物は、投与方法に応じて種々の単位剤形で投与することができる。例えば、経口投与するために適した単位剤形としては、これらに限定されないが、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤およびロゼンジが挙げられる。
薬学的製剤、特に、改変ウイルスの薬学的製剤は、純度が所望の程度である改変アデノウイルス（またはその改変アデノウイルスをコードする１種または複数種の核酸）を、任意選択の薬学的に許容されるキャリア、賦形剤または安定剤と混合することによって調製することができる。そのような製剤は、凍結乾燥製剤または水性液剤であってよい。許容できるキャリア、賦形剤、または安定剤は、使用される投与量および濃度でレシピエントに対して非毒性である。許容できるキャリア、賦形剤または安定剤は、アセテート、ホスフェート、シトレート、および他の有機酸；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）、保存料、低分子量ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミンもしくはゼラチン、または親水性のポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン（polyvinylpyllolidone）；ならびにアミノ酸、グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含めた単糖、二糖、および他の炭水化物；キレート化剤；ならびにイオン性界面活性物質および非イオン性界面活性物質（例えば、ポリソルベート）；ナトリウムなどの塩形成性対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；ならびに／または非イオン性界面活性物質であってよい。上記改変アデノウイルス（またはその改変アデノウイルスをコードする１種または複数種の核酸）は、任意の適切な濃度の感染単位で製剤化することができる。
上記製剤により、化学療法剤、細胞傷害剤、サイトカイン、成長阻害剤、および抗ホルモン剤を含めた追加的な活性化合物を提供することもできる。
上記組成物は、治療的処置または予防的処置のために投与することができる。処置への適用では、組成物を、疾患（例えば、がん）に罹患している患者に、「治療有効用量」で投与する。この使用のために有効な量は、上記疾患の重症度および上記患者の全体的な健康状態に依存する。必要な投与量および頻度ならびに患者の耐容性に応じて、組成物の単回投与または多数回投与を行うことができる。本発明の目的に関して、「患者」または「被験体」とは、ヒトおよび他の動物の両方、特に哺乳動物を包含する。したがって、当該方法はヒト療法および獣医学的適用のどちらにも適用可能である。その好ましい実施形態では、上記患者は、哺乳動物、好ましくは霊長類であり、その最も好ましい実施形態では、上記患者はヒトである。他の公知のがん療法を本発明の方法と組み合わせて用いることができる。例えば、本発明に従って使用するための組成物も、細胞を、他のがん治療剤、例えば、５ＦＵ、ビンブラスチン、アクチノマイシンＤ、シスプラチン、メトトレキサートなどに対して標的化または感受性にするために用いることができる。
他の実施形態では、本発明の方法を、他のがん療法、放射線療法、ホルモン療法、または化学療法と組み合わせる。
併用投与とは、別々の製剤または単一の薬学的製剤を用いた共投与、およびいずれかの順序での連続的な投与を意図し、ここで、活性剤の両方（または全て）がそれらの生物活性を同時に発揮する期間があることが好ましい。
経口投与するために適した製剤は、（ａ）液体液剤（ｌｉｑｕｉｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、例えば、水、食塩水またはＰＥＧ４００などの希釈剤に懸濁させた有効量のパッケージングされた核酸；（ｂ）それぞれが所定量の活性成分を液体、固体、顆粒またはゼラチンとして含有する、カプセル剤、サシェ剤または錠剤；（ｃ）適切な液体中の懸濁剤；および（ｄ）適切なエマルションからなってよい。錠剤の形態は、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、微結晶性セルロース、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、および他の賦形剤、着色料、増量剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存料、香味剤、色素、崩壊剤、および薬学的に適合性のキャリアの１つまたは複数を含んでよい。ロゼンジ形態は、香味料、例えばスクロース中の活性成分、ならびに不活性な基剤、例えば、ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアラビアゴムエマルションに活性成分を含む香錠、または活性成分に加えて当技術分野で公知のキャリアを含有する、ゲル剤など含んでよい。
単独の、または他の適切な構成成分と組み合わせた上記改変アデノウイルス（またはその改変アデノウイルスをコードする１種または複数種の核酸）は、吸入によって投与するために、エアロゾル製剤にすることができる（すなわち、それらは「噴霧する」ことができる）。エアロゾル製剤は、加圧された許容できる噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などに入れることができる。
直腸投与するために適した製剤としては、例えば、坐薬基剤を伴うパッケージングされた核酸からなる坐剤が挙げられる。適切な坐薬基剤としては、天然または合成のトリグリセリドまたはパラフィン族炭化水素が挙げられる。さらに、選択された化合物と、例えば、液体トリグリセリド、ポリエチレングリコール、およびパラフィン族炭化水素を含めた、基剤との組み合わせからなるゼラチン直腸用カプセル剤を使用することも可能である。
例えば、関節内（ｉｎｔｒａａｒｔｉｃｕｌａｒ）（関節内（ｉｎ ｔｈｅ ｊｏｉｎｔ））経路、静脈内経路、筋肉内経路、腫瘍内経路、皮内経路、腹腔内経路、および皮下経路によってなど、非経口投与するために適した製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、およびその製剤に、意図されたレシピエントの血液との等張性を与える溶質を含有してよい水性の、および非水性の、等張滅菌注射液剤、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および保存料を含んでよい、水性の、および非水性の滅菌懸濁剤を含む。本発明の実施では、組成物は、例えば、静脈内注入によって、経口で、局所に、腹腔内に、嚢内に（ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃａｌｌｙ）、腫瘍内に、または髄腔内に投与することができる。好ましい投与方法は非経口投与、腫瘍内投与、および静脈内投与である。化合物の上記製剤は、単位用量または複数回用量の密封容器、例えば、アンプルおよびバイアルに入れて提供することができる。
注射用の液剤および懸濁剤は、上に記載された種類の滅菌された散剤、顆粒剤、および錠剤から調製することができる。ｅｘ ｖｉｖｏ療法のためにアデノウイルスを形質導入した、もしくはそれを感染させた、または核酸をトランスフェクトした細胞は、上記の通り静脈内投与または非経口投与することもできる。
薬学的調製物は、単位剤形であることが好ましい。そのような形態では、上記調製物は、適切な分量の活性成分を含有する単位用量に小分けされる。
好ましい薬学的調製物は、１つまたは複数の活性な改変アデノウイルス（またはその改変アデノウイルスをコードする１種または複数種の核酸）を、場合によって、１種または複数種の化学療法剤または免疫療法剤と組み合わせて徐放性製剤で送達する。一般には、改変アデノウイルス（またはその改変アデノウイルスをコードする１種または複数種の核酸）は、化学療法、放射線療法、免疫療法およびホルモン療法を含めた他の細胞傷害性がん療法に対する腫瘍細胞の感受性を増加させる増感剤（ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ）として治療的に投与する。
がんを処置するための治療的な使用では、本発明の薬学的方法に利用する改変アデノウイルス（またはその改変アデノウイルスをコードする１種または複数種の核酸）は、最初の投与量を毎日約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜 約１０００ｍｇ／ｋｇとして投与する。約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの範囲の１日量を使用することができる。しかし、その投与量は、上記患者の必要性、処置されている状態の重症度、および使用されている化合物に応じて変動し得る。例えば、投与量は、特定の患者において診断されたがんの型および病期を考慮して経験的に決定することができる。患者に投与される用量は、本発明に関しては、ある期間にわたって患者において有益な治療反応に影響を及ぼすのに十分であるべきである。その用量のサイズは、特定のベクターを投与することに伴う任意の有害な副作用の存在、本質、および程度、または特定の患者に形質導入された細胞型によっても決定される。特定の状況に適した投与量を決定することは、実施者の技術の範囲内である。一般に、処置は、上記化合物の最適用量未満である、より少ない投与量で開始する。その後、状況下で最適な効果に達するまでその投与量を少量きざみで増加させる。便宜上、所望であれば、１日の総投与量を分割し、１日の間に小分けして投与することができる。
本発明に従って使用するための薬学的調製物は、一般には、ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含めた哺乳動物に送達する。本方法を用いて処置される非ヒト哺乳動物としては、家畜動物（すなわち、イヌ、ネコ、ネズミ、げっ歯類、およびウサギ）ならびに農業動物（ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｉｍａｌ）（ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ）が挙げられる。
ＩＶ．実施例
以下の実施例は、例示のために提供されるが、特許請求された発明を限定するものではない。
がん細胞を決定的に除去するが、正常細胞は無傷のままにする新しいクラスの薬物および治療モダリティを同定する切実な必要性がある。腫瘍細胞の受容体に向かい、その腫瘍塊内で選択的に複製されるウイルス（腫瘍崩壊性ウイルス）を工学的に作製することは、溶解性がん療法としての莫大な潜在性を有する。「腫瘍崩壊性ウイルス」の開発は、がんの変異とアデノウイルスのタンパク質との間のきわめて大きな機能的重複を利用することによって実現することができる。臨床試験では、これらの作用物質の第１のプロトタイプにより、有望な有効性が実証されている。いかなる理論にも縛られることを望まず、その臨床試験ならびに腫瘍およびウイルスの複製を駆動する分子機構への新しい洞察を今や用いて、強力かつ改善された治療的性質を有する新規のウイルスを開発することができると考えられる。残念ながら、そのようなウイルスを工学的に作製するための以前の方法体系は、この目標に届かない。したがって、本明細書では、治療的なウイルスの急速な生成および標的化を対象とする技術の実現が提供される。本明細書では、複数の細胞受容体への感染を標的化する新規の、遺伝子にコードされた誘導性の化学的なアダプター系が提供される。腫瘍崩壊性ウイルス療法には、そのウイルスが脈管構造を横断し、１つのがん細胞から別のがん細胞に感染が広がる場合に限り、サイズに制限なく腫瘍塊を破壊する潜在性がある。したがって、以前のアデノウイルスベクターは、それらの取り込みを単一の細胞受容体に依拠することにより、それらの治療的な潜在性が限定される。主要な突破口は、ウイルスカプシドの化学的性質および結合性を、感染が任意の細胞型に対して特異的に標的化し得るように変化させることである。これは制がん剤であるラパマイシンの公知の性質を用いて、ＦＫＢＰドメインおよびＦＲＢドメインを有する異種タンパク質の二量体を形成することによって実現される（例えば、−ＦＫＢＰと融合した再標的化リガンドと共に線維−ＦＲＢカプシドタンパク質融合体を発現するウイルス）。これらのウイルスは、ラパマイシン処置に際して複数の再標的化リガンドを介して細胞に感染し、これは新規のがん療法を対象とする化学的武器およびウイルス性武器の合理的かつ有力な組み合わせである。さらに、これらの技術により、アデノウイルスの感染を介して、任意の細胞型において、多タンパク質複合体および全体の経路を組み立て、送達し、共発現させることが可能になる。これらの技術により、ｐ５３変異腫瘍および前がん状態の乳がん細胞を特異的に死滅させ、多くのがん患者の命を救う潜在性を有する「次世代」の腫瘍崩壊性（oncolytc）ウイルスの開発が可能になる。
Ａ．細胞のクロマチンにおけるサイレンシングｐ５３活性
ｐ５３は、ＤＮＡウイルスタンパク質であるＳＶ４０ラージＴ抗原の細胞標的として最初に発見された。しかし、ほぼ３０年のｐ５３についての研究にもかかわらず、ｐ５３による活性化転写を決定する決定的な因子については、依然として完全には理解されていない。ｐ５３は、正常細胞において構成的に発現されており、その活性は高度に制御されたｐ５３タンパク質分解により制限されていると考えられている。ｐ５３による活性化転写は、がん遺伝子およびＤＮＡ損傷シグナルに反応して誘発され、そのどちらもｐ５３を安定化する。これにより、ｐ５３のレベルおよびリン酸化の誘導が、細胞のクロマチン内の標的プロモーターにおけるｐ５３の転写活性と同義であるという一般的な考えが導かれる。それとして、ｐ５３レベルの誘導がｐ５３の活性化についての読み取り値として用いられ、また、それが、放射線および遺伝子毒性薬、ヌトリンなどのＭＤＭ２アンタゴニスト、およびＥ１Ｂ−５５ｋ欠失腫瘍崩壊性アデノウイルス療法、ＯＮＹＸ−０１５を含めたいくつかのがん療法についての理論的根拠になっている。
アデノウイルスＥ１Ｂ−５５ｋは、アデノウイルス感染細胞においてｐ５３のトランス活性化ドメインに結合し、ｐ５３を分解の標的にする。Ｅ１Ｂ−５５ｋは、細胞の形質転換アッセイにおいてｐ５３を阻害するために十分であり、また、アデノウイルスの複製におけるｐ５３の不活化に対して決定的であると考えられている。ΔＥ１Ｂ−５５ｋ変異体ウイルスであるｄｌ１５２０／ＯＮＹＸ−０１５は、感染細胞において高いｐ５３レベルを誘導する。これに基づいて、ＯＮＹＸ−０１５はｐ５３腫瘍選択的ウイルスがん療法として患者において試験され、現在いくつかの国において承認されている（現在Ｏｎｃｏｒｉｎｅとしてとして公知である）。しかし、ｐ５３の不活化ではなくウイルスＲＮＡの輸出におけるＥ１Ｂ−５５ｋの機能が損失することが、ΔＥ１Ｂ−５５ｋの腫瘍選択性の主要な決定因子である。予想に反して、本発明者らは、ΔＥ１Ｂ−５５ｋを感染させた、アデノウイルス感染に対する生理的標的細胞集団である初代小気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）において、ｐ５３は高レベルに蓄積するが、ｐ５３の転写標的、例えば、ｐ２１、ＭＤＭ２、サイクリンＧ、１４−３−３σ、ＰＥＲＰ、ＰＩＧ３、およびＧＡＤＤ４５は誘導されないことを見出した（図１ａ）。ｐ５３の転写標的を活性化することができないことは、ｐ５３制御の組織特異的な効果ではなく、ｐ５３は、ΔＥ１Ｂ−５５ｋを感染させた初代乳房上皮細胞および気管支上皮細胞においても安定化されるが、ｐ２１を誘導することはできなかい（補足図１）。ΔＥ１Ｂ−５５ｋ Ｕ２ＯＳ腫瘍細胞においても、ｐ５３は核内に高レベルに誘導されるが（図１ｂ）、ドキソルビシン処理とは対照的にｐ２１およびＭＤＭ２などの下流の転写標的の発現を誘発することはできず、同様の結論に達した（図１ｃおよび補足図２）。これらのデータは、ｐ５３の分解の損失により、アデノウイルス感染細胞において高いｐ５３レベルがもたらされるが、これにもかかわらず、ｐ５３の転写標的の誘導は、ｐ５３腫瘍変異を伴う細胞系（Ｃ３３Ａ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＨＣＴ−１１６ｐ５３−／−、補足図２）と同様の程度まで抑制されることを実証するものである。これは、アデノウイルスの生物学だけでなくｐ５３の活性化についても、本発明者らの理解における基本的なギャップを示している。
細胞性がん遺伝子およびウイルスがん遺伝子、例えば、ＲａｓおよびアデノウイルスＥ１Ａにより、ＡＲＦの発現が誘発されることによってｐ５３が活性化される。ＡＲＦによりＭＤＭ２が阻害され、その結果、ｐ５３レベルが誘導され、ｐ５３の転写標的が活性化される。ＡＲＦはヒトのがんの５８％において、主に野生型ｐ５３を保持するがんにおいて損失しており、これはΔＥ１Ｂ−５５ｋを感染させた腫瘍細胞においてｐ５３の活性化を妨げる決定的な因子として以前から引き合いに出されている。ＡＲＦがＩＰＴＧによって制御されているＵ２ＯＳ安定細胞系（ｐ５３野生型、ＡＲＦ陰性）を使用して、本発明者らは、偽感染細胞では、ＡＲＦの発現によりｐ５３が安定化し、ｐ２１の転写が活性化することを示している。しかし、野生型細胞およびΔ５５ｋを感染させた細胞のどちらにおいても、ＡＲＦおよび基底のｐ５３活性が誘導されたにもかかわらず、ｐ２１レベルは依然として同様のレベルまで抑制されている（図１ｄ）。さらに、ΔＥ１Ｂ−５５ｋを感染させた初代ＳＡＥＣでは、同様に、内在性のＡＲＦの発現によりｐ５３の転写標的を活性化することができない（図１ａ）。したがって、アデノウイルス感染細胞では、Ｅ１Ｂ−５５ｋおよびＡＲＦの発現とは関係なくｐ５３が不活化される。
ＤＮＡ損傷シグナルも、ｐ５３の活性化、ｐ５３のリン酸化の誘発およびタンパク質安定化において決定的な役割を果たす。本発明者らは、ΔＥ１Ｂ−５５ｋを感染させた細胞では、ｐ５３レベルを誘導すること単独では、ｐ５３を活性化するためには十分でない可能性があり、ＤＮＡ損傷シグナルも必要であると推論した。臨床試験では、そのΔＥ１Ｂ−５５ｋ変異体ウイルスであるＯＮＹＸ−０１５を、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの遺伝子毒性の化学療法剤と組み合わせて使用した。したがって、本発明者らは、ΔＥ１Ｂ−５５ｋを感染させた細胞においてｐ５３の標的を活性化するためにＤＮＡ損傷シグナルが必要かどうかを試験した。本発明者らは、５−ＦＵを用いた処置では、ΔＥ１Ｂ−５５ｋを感染させたＵ２ＯＳ細胞においてｐ５３を活性化することができないことを示す（図２ａ）。そのＤＮＡ損傷チェックポイントが多くの腫瘍細胞における変異によって混乱させられることを考慮に入れ、本発明者らは、初代細胞についても分析し、ｐ５３の転写標的は、ΔＥ１Ｂ−５５ｋを感染させたＳＡＥＣにおいて優勢に抑制され、γ線照射（図２ｂ）、ＵＶ照射（補足図３）またはドキソルビシン（図２ｄ）によって活性化できないことを実証する。
ＤＮＡ損傷に反応したｐ５３の活性化は、ｐ５３の重要な残基をリン酸化するキナーゼ、例えば、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＤＮＡ−ＰＫｃ、ＣＨＫ１およびＣＨＫ２に媒介される。例えば、ｐ５３のセリン１５およびセリン２０におけるリン酸化により、ＭＤＭ２を置き換え、ｐ５３の分解が防がれ、一方、他の部位におけるリン酸化により、標的プロモーターにおけるｐ５３のＤＮＡの結合性が強化される。したがって、ΔＥ１Ｂ−５５ｋを感染させた細胞においてＤＮＡ損傷により高いｐ５３レベルを活性化することができないことの可能性のある説明は、ウイルス感染でｐ５３のリン酸化が阻害されているということである。しかし、外因性の遺伝子毒性ストレスを導入することなしでさえも、ΔＥ１Ｂ−５５ｋを感染させた初代細胞では、ＤＮＡ損傷により活性化されたキナーゼの標的となる複数の部位においてｐ５３がすでに高度にリン酸化されている（図２ｃ）。したがって、Ｅ１Ｂ−５５ｋの非存在下で、がん遺伝子およびＤＮＡ損傷シグナルがｐ５３の安定化およびリン酸化の両方を誘発するが、これにもかかわらず、ｐ５３は生物学的に不活性であり、下流のエフェクターの転写を活性化することができない。
次に、本発明者らは、アデノウイルス感染細胞において、Ｅ１Ｂ−５５ｋの非存在下でＭＤＭ２がｐ５３に結合し、それを不活化するかどうかを検査した。ヌトリンは、ＭＤＭ２−ｐ５３結合およびｐ５３の分解の誘導を阻害するＭＤＭ２の低分子アンタゴニストである。偽感染細胞とは対照的に、ΔＥ１Ｂ−５５ｋを感染させたＳＡＥＣでは、ヌトリンによるＭＤＭ２−ｐ５３結合の阻害によりｐ５３をさらに安定化させることやｐ２１レベルを誘導することはできない（図２ｄ）。これらの結果は、同様の、ΔＥ１Ｂ−５５ｋを感染させたＵ２ＯＳ細胞においてＡＲＦの過剰発現によりｐ５３を活性化することはできないことと一致する（図１ｄ）。
総合すると、本発明者らのデータは、アデノウイルス感染細胞では、ｐ５３の誘導とは関係なくｐ５３の標的プロモーターの転写活性化が抑制されることを実証するものである。ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）は、ｐ２１（ならびに複数の他の細胞の遺伝子）の発現を誘導する一般的な転写活性化因子である。偽感染させた初代細胞では、ＴＳＡにより、ｐ５３の安定化またはリン酸化とは関係なくｐ２１の発現が誘導される（図２ｄ）。対照的に、ΔＥ１Ｂ−５５ｋを感染させた細胞では、ＴＳＡによりｐ２１の転写を誘導することはできない。本発明者らは、アデノウイルス感染細胞では、Ｅ１Ｂ−５５ｋとは関係なくｐ５３の転写標的が優勢に抑制され、放射線、遺伝子毒性薬、ＡＲＦ、ＭＤＭ２アンタゴニストまたはＨＤＡＣ阻害剤に反応して活性化することができないと結論づける。この機構を定義することは、ｐ５３の活性化だけでなく、がん療法のためにそれをどのように操作することができるかについても理解するために重要である。
本発明者らのデータは、Ｅ１Ｂ−５５ｋおよびｐ５３の分解とは関係なくｐ５３を不活化する、以前に発見されていないアデノウイルスのタンパク質が存在することを強力に示唆している。これを試験するために、本発明者らは遺伝的な手法を用い、また、Ｅ１Ｂ−５５ｋおよび他の初期ウイルス遺伝子に複合変異を有するアデノウイルスに感染させた初代細胞におけるｐ５３の活性化についてスクリーニングした（補足図４）。本発明者らは、アデノウイルス感染細胞においてｐ５３を活性化するためには、Ｅ１Ｂ−５５ｋの欠失に加えて、Ｅ１Ａの１３ｓスプライス型（Ｅ１Ａ−１３ｓ）またはＥ４−ＯＲＦ３のいずれかの損失が必要であることを発見した（図３ａ）。アデノウイルスが、Ｅ１Ｂ−５５ｋに加えて、ｐ５３を不活化する２つのウイルスタンパク質をコードするという本発明者らの知見は、特に、Ｅ１Ａは細胞の形質転換試験においてｐ５３の活性化を誘発する強力ながん遺伝子であるので、目ざましいことである。アデノウイルス感染では、Ｅ４−ＯＲＦ３を含めた他の初期ウイルス遺伝子をトランス活性化するためには代替のＥ１Ａの１３ｓスプライス型が必要である（図３ａ）。したがって、本発明者らは、ウイルス感染では、Ｅ１Ａ−１３ｓにより、Ｅ４−ＯＲＦ３の発現が誘導されることによってｐ５３が不活化されるという仮説を立てた。この仮説と一致して、本発明者らは、Ａｄ−ＧＦＰとは対照的に、Ｅ４−ＯＲＦ３の異所性発現が、ΔＥ１Ｂ−５５ｋ／ΔＥ４−ＯＲＦ３感染細胞およびΔＥ１Ｂ−５５ｋ／ΔＥ１Ａ−１３ｓ感染細胞のどちらにおいてもｐ５３の不活化をレスキューするために十分であることを示す（図３ｂ）。ΔＥ１Ｂ−５５ｋ／ΔＥ４−ＯＲＦ３共感染細胞におけるＡｄ−ＧＦＰによるｐ２１のわずかな低下は、Ｅ１Ａ−１３ｓによるＥ４−ＯＲＦ３の部分的な活性化（トランスで）に起因し、これはΔＥ１Ｂ−５５ｋ／ΔＥ１Ａ−１３ｓ共感染では起こらない（補足図５）。したがって、アデノウイルス感染細胞では、Ｅ１Ａ−１３ｓによるＥ４−ＯＲＦ３の発現の誘導により、新規のＥ１Ｂ−５５ｋ非依存性の機構によってｐ５３が不活化される。
提唱された上記ΔＥ１Ｂ−５５ｋ腫瘍崩壊性アデノウイルス療法であるＯＮＹＸ−０１５（Ｏｎｃｏｒｉｎｅ）が有するｐ５３の腫瘍選択性は、アデノウイルス感染細胞においてＥ１Ｂ−５５ｋがｐ５３を不活化する決定的かつ唯一の機構であることに基づく。ΔＥ１Ｂ−５５ｋを感染させた細胞では、野生型ウイルスと比較していくらかの基底のｐ５３活性が存在し得るが、本明細書において、本発明者らは、初代細胞におけるウイルス感染の時間経過にわたって下流の標的の転写を活性化するためのｐ５３レベルの誘導には、さらなるＥ４−ＯＲＦ３の欠失が必要であることを示す（図３ｃ）。ｐ５３の転写標的の活性化にはｐ５３レベルの誘導が必要であり、ｐ５３がＥ１Ｂ−５５ｋによる分解の標的になっているΔＥ４−ＯＲＦ３感染ではそれは起こらない。さらに、本発明者らは、Ｅ４−ＯＲＦ３により、細胞周期停止遺伝子、ＤＮＡ修復遺伝子およびアポトーシス遺伝子を含めた複数のｐ５３の転写標的の活性化が妨げられることを示す（図３ｄ）。偽感染と比較して、Ｅ４−ＯＲＦ３により、ｐ２１などのいくつかのｐ５３の標的の転写が抑制され、ＰＵＭＡおよびＭＤＭ２などの他の標的の誘導が妨げられる。ｐ５３の転写標的とは対照的に、ｐ５３ ｍＲＮＡのレベルの転写誘導およびハウスキーピング遺伝子であるＧＵＳＢの定常状態のｍＲＮＡのレベルは、Ｅ４−ＯＲＦ３の影響を受けない（補足図６）。ポナステロン誘導性ｐ５３を有するｐ５３ヌル安定細胞系（Ｈ１２９９−Ｄ１）を使用して（図３ｅおよび補足図７）、本発明者らは、ΔＥ１Ｂ−５５ｋ／ΔＥ４−ＯＲＦ３感染細胞におけるｐ２１およびＭＤＭ２の誘導がｐ５３依存性であり、Ｅ４−ＯＲＦ３の非存在下での全体的な転写活性化の結果ではないことを示す。Ｈ１２９９−Ｄ１細胞はｐ５３ ｃＤＮＡを発現するので、これらの実験は、Ｅ４−ＯＲＦ３が、代替のｐ５３のスプライシング型を誘導することによってｐ５３を不活化しないことも実証する。本発明者らは、Ｅ４−ＯＲＦ３は、ｐ５３の不活化において、Ｅ１Ｂ−５５ｋおよびｐ５３の分解とは関係なく機能する決定的かつ新規の役割を有すると結論づける。
ＤＮＡ腫瘍ウイルスタンパク質、例えば、Ｅ１Ｂ−５５ｋ、ＳＶ４０ ＬＴおよびＨＰＶ Ｅ６は、一般に、高親和性タンパク質間相互作用によってｐ５３を不活化する。しかし、この確立されたパラダイムに反して、Ｅ４−ＯＲＦ３はｐ５３と共局在しない（補足図８）。さらに、Ｅ１Ｂ−５５ｋとは対照的に、Ｅ４−ＯＲＦ３は、ウイルスを感染させた細胞またはエピトープタグを付けた構築物をトランスフェクトした細胞のいずれかからの溶解物中でｐ５３と免疫共沈降しない。これは、Ｅ４−ＯＲＦ３により、標準的ではない機構によってｐ５３が不活化されることを示唆している。
ｐ５３のレベルおよびリン酸化の誘導により、通常、ｐ５３の四量体形成およびコンフォメーションの変化が駆動され、それは、制御される遺伝子のプロモーターにおける、配列特異的なＤＮＡの結合を促進し、そこでは、それにより転写補因子が動員されてそれらの発現が活性化される。活性なｐ５３のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と不活性なｐ５３のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）とは、それぞれ、モノクローナル抗体であるＰＡｂ１６２０、ＰＡｂ２４０を用いた免疫沈降によって区別することができる。ΔＥ１Ｂ−５５ｋを感染させた細胞およびΔＥ１Ｂ−５５ｋ／ΔＥ４−ＯＲＦ３を感染させた細胞のどちらにおいても、ｐ５３はＰＡｂ１６２０によって選択的に免疫沈降し（補足図９）、これは、ｐ５３が、細胞のプロモーター内のＤＮＡ標的部位に結合することができるはずである活性なＤＮＡ結合ドメインタンパク質コンフォメーションを有することを実証している。Ｅ４−ＯＲＦ３によりｐ５３のＤＮＡの結合が妨げられるかどうかを機能的に決定するために、本発明者らは、Ｕ２ＯＳ細胞を、ｐ５３ルシフェラーゼレポータープラスミド（ｐ５３−ｌｕｃ）でトランスフェクトした。そこでは、ｐ５３がコンセンサスＤＮＡ配列に結合するとルシフェラーゼの転写が活性化される。これらの実験を、ウイルス感染の４８時間の時間経過にわたってリアルタイムでルシフェラーゼ活性を測定することによって実施した。全てのウイルス感染において、対照ｐＧＬ３−ルシフェラーゼレポーター（ｐ５３の標的プロモーターではない）が同様のレベルまで活性化される（補足図１０）。野生型ウイルスを感染させた細胞では、２４時間後にルシフェラーゼのｐ５３による活性化転写が阻害され（図４ａ）、これは、ｐ５３の分解によるものと予測される（図１ｃ）。対照的に、ΔＥ１Ｂ−５５ｋ感染およびΔＥ１Ｂ−５５ｋ／ΔＥ４−ＯＲＦ３感染の両方でｐ５３−ルシフェラーゼが活性化される（図４ａ）。ｐ５３の反応エレメントの変異を有するプロモーターによりルシフェラーゼ活性が無効になるので、ルシフェラーゼ活性の誘導には、ｐ５３がＤＮＡに結合することが必要である。これらの実験は、Ｅ４−ＯＲＦ３が、異所性のレポータープラスミドにおいて、コンセンサスＤＮＡ標的配列への結合についてｐ５３と競合しない、またはｐ５３によるプロモーターの転写活性化を妨げないことを実証するものである。
Ｅ４−ＯＲＦ３の、同じ細胞においてｐ５３による内在性標的の転写活性化を妨げるが、異所性のルシフェラーゼレポータープラスミドは妨げないという能力は、調和させることが難しい（図４ｂ）。プラスミドＤＮＡは、細胞のクロマチン内のＤＮＡと同じ構築上の制約およびパッケージング上の制約は受けない。したがって、本発明者らは、ｐ５３クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を実施して、細胞のクロマチンの状況において、Ｅ４−ＯＲＦ３によりｐ５３のＤＮＡの結合が特異的に妨げられるかどうかを決定した。ドキソルビシン処理およびΔＥ１Ｂ−５５ｋ／ΔＥ４−ＯＲＦ３による感染に際して、ｐ２１プロモーター内の標的部位（５’および３’部位）およびＭＤＭ２プロモーター内の標的部位へのｐ５３のＤＮＡの結合が誘導され、そこでは、それにより、ｐ２１ ＲＮＡおよびＭＤＭ２ ＲＮＡの転写が活性化される。（図４ｂ〜ｃ）。対照的に、ΔＥ１Ｂ−５５ｋを感染させた細胞では、ｐ５３は同様のレベルまで誘導されるが、本発明者らは、Ｅ４−ＯＲＦ３により、ｐ２１プロモーターおよびＭＤＭ２プロモーターの標的部位へのｐ５３のＤＮＡの結合が妨げられることを示す（図４ｂ〜ｃおよび補足図１１）。したがって、ΔＥ１Ｂ−５５ｋを感染させた細胞では、ｐ５３の誘導により下流のエフェクターの転写を誘発することはできない。したがって、細胞のクロマチンの状況において特異的に、Ｅ４−ＯＲＦ３により、ｐ５３のＤＮＡ標的部位への結合が妨げられることによってｐ５３が不活化される。
本発明者らは、ｐ５３のＤＮＡの結合が、ｐ５３のタンパク質コンフォメーションだけでなく、細胞のゲノム内の標的プロモーターの接近可能性にも依存すると推論した。発生的に制御される遺伝子は、胚形成において、それらがヘテロクロマチンに凝縮（ｃｏｍｐａｃｔｉｏｎ）されることによって後成的にサイレンシングされ、それにより、体細胞内の転写因子結合への接近が妨げられる。ヘテロクロマチンは、ヒストンのアセチル化の損失および抑制的なヒストンのメチル化マークの誘導に特定される。本発明者らは、Ｅ４−ＯＲＦ３により、内在性標的プロモーターにおいてヘテロクロマチンが誘導されることによって、ｐ５３が不活化され得、ｐ５３への接近が妨げられるという仮説を立てた。これと一致して、ΔＥ１Ｂ−５５ｋを感染させた初代細胞において、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるＴＳＡはｐ２１を誘導することができない（図２ｄ）。このことから、本発明者らは、Ｅ４−ＯＲＦ３により、ｐ５３により制御されるプロモーターが、ヒストンのメチル化などのヒストンの脱アセチル化の阻害が優勢である機構によって不活化されると推測する。がんでは、ヒストンＨ３のリジン９（Ｈ３Ｋ９）がメチル化されることによってｐ１６ＩＮＫ４ａなどの腫瘍抑制遺伝子の異常な後成的サイレンシングが開始される。ＳＵＶ３９Ｈ１およびＳＵＶ３９Ｈ２（５９％のアミノ酸同一性を共有し、重複する機能を有する）によるＨ３Ｋ９トリメチル化（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）の誘導も、凝縮の誘導および動原体周囲のヘテロクロマチン内のＤＮＡの転写抑制特性において決定的な役割を果たす。ｐ５３の局在化は、ΔＥ１Ｂ−５５ｋを感染させた細胞とΔＥ１Ｂ−５５ｋ／ΔＥ４−ＯＲＦ３を感染させた細胞とで区別できない（図４ｄ）。しかし、ｐ５３が不活性であるΔＥ１Ｂ−５５ｋを感染させた細胞では、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３抑制的なヘテロクロマチンの高密度な領域が核の周辺に誘導される（図４ｄおよび補足図１２）。本発明者らは、Ｈ３Ｋ９トリメチル化を触媒する公知のメチルトランスフェラーゼ４種のうち、ＳＵＶ３９Ｈ１およびＳＵＶ３９Ｈ２ ３１は、ΔＥ１Ｂ−５５ｋを感染させた核における新規のＨ３Ｋ９ｍｅ３ヘテロクロマチンドメインの形成に特に関連するが、ＳＥＴＤＢ１ ３２もＧ９ａもそれに特異的に関連しないことを示す（図４ｅ）。Ｈ３Ｋ９ｍｅ３ヘテロクロマチンドメインに関連するＳＵＶ３９Ｈ１／２の形成には、Ｅ４−ＯＲＦ３が必要であり、これは偽感染細胞またはΔＥ１Ｂ−５５ｋ／ΔＥ４−ＯＲＦ３を感染させた細胞のいずれにおいても起こらない（補足図１３−１６）。
これらのデータは、Ｅ４−ＯＲＦ３が、新規のＳＵＶ３９Ｈ１Ｈ３Ｋ９ｍｅ３ヘテロクロマチン形成およびＳＵＶ３９Ｈ２Ｈ３Ｋ９ｍｅ３ヘテロクロマチン形成を誘導し、これによりｐ５３の内在性標的プロモーターへの接近が拒否され得ることを実証するものである。これを直接試験するために、本発明者らは、ｐ５３およびＨ３Ｋ９ｍｅ３のＣｈＩＰを実施した。Ｅ４−ＯＲＦ３による抑制的なヘテロクロマチンの誘導は、総ヒストンＨ３またはＨ３Ｋ９ｍｅ３のいずれの全体的な上方制御にも関連せず、偽溶解物、ΔＥ１Ｂ−５５ｋ溶解物およびΔＥ１Ｂ−５５ｋ／ΔＥ４−ＯＲＦ３溶解物において同様のレベルである（図５ａ）。本発明者らは、ΔＥ１Ｂ−５５ｋ／ΔＥ４−ＯＲＦ３を感染させた細胞では、ｐ２１プロモーター部位およびＭＤＭ２プロモーター部位においてｐ５３の結合が誘導される（図４ｃと一致した）が、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３はＩｇＧレベルであることを示す（図５ａおよび補足図１７）。対照的に、ΔＥ１Ｂ−５５ｋを感染させた細胞では、ｐ２１プロモーターおよびＭＤＭ２プロモーターにおいてＨ３Ｋ９ｍｅ３が誘導され、ｐ５３の結合が妨げられる。ｐ２１プロモーターでは、−５ｋｂ領域においてもＨ３Ｋ９ｍｅ３が誘導され、ｐ５３結合部位だけに限られない（補足図１７）。したがって、Ｅ４−ＯＲＦ３を発現している細胞では、ｐ５３に制御されるプロモーターにおいてｐ５３とＨ３Ｋ９ｍｅ３との間に逆相関が存在する。ＧＡＤＤ４５Ａ、ＦＡＳ、ＰＵＭＡおよびＰＩＧ３を含めたΔＥ１Ｂ−５５ｋを感染させた細胞において抑制されている追加的なｐ５３の標的についても同じ結論に達した（補足図１７〜１９）。対照的に、ΔＥ１Ｂ−５５ｋを感染させた細胞では、偽と比較して、アクチンおよびＰＯＬＲ２などのｐ５３に制御されないプロモーターにおいてＨ３Ｋ９ｍｅ３は誘導されない（補足図１７および１９）。ΔＥ１Ｂ−５５ｋ／ΔＥ４−ＯＲＦ３を感染させた細胞では、これらのプロモーターにおいて基底のＨ３Ｋ９ｍｅ３が減少し、これは、ウイルス感染では、Ｅ４−ＯＲＦ３により、全体的なデメチラーゼ活性も抑止され得ることを示唆している。本発明者らは、Ｅ４−ＯＲＦ３が、ｐ５３の標的プロモーターにおいて新規のＨ３Ｋ９ｍｅ３ヘテロクロマチンのサイレンシングを誘導することによってｐ５３を不活化し、接近拒否されたｐ５３には下流のエフェクターの転写を活性化する力がないと結論づける。
哺乳動物の細胞およびがんにおけるヘテロクロマチン形成の誘導は、依然として理解が比較的乏しい。したがって、主要な問題は、Ｅ４−ＯＲＦ３が、ｐ５３の標的プロモーターにおける抑制的なＨ３Ｋ９ｍｅ３ヘテロクロマチンの誘導にどのように直接関与するか？、ということである。Ｅ４−ＯＲＦ３はｐ５３と共局在せず、核において特色のあるクモの巣様構造を形成する（補足図８）。本発明者らは、ΔＥ１Ｂ−５５ｋを感染させた腫瘍細胞および初代細胞のどちらにおいても、Ｅ４−ＯＲＦ３により、新規のＨ３Ｋ９ｍｅ３ヘテロクロマチンドメインの形成の境界が定められることを示す。核を横断する直交薄片により、ほとんどの場合Ｅ４−ＯＲＦ３はＨ３Ｋ９ｍｅ３に近接していることが示され、これは、Ｅ４−ＯＲＦ３が、一過性または長期の相互作用を通じたヘテロクロマチン形成を触媒する新規のプラットフォームとして作用することを示唆している（図５ｂ〜ｃ、および補足図２０〜２１）。高解像度の共焦点顕微鏡法を使用して、本発明者らは、Ｅ４−ＯＲＦ３が、核中にクモの巣様構造を作るにつれて新規のヘテロクロマチン集合体を組織化し、特性化することを示す（図５ｄ）。これらのデータは、ｐ５３の標的プロモーターにおけるＨ３Ｋ９ｍｅ３ヘテロクロマチンによるサイレンシングの編成におけるＥ４−ＯＲＦ３の直接的な役割を実証し、さらに、細胞ＤＮＡを組織化する既存の構築上の特徴に基づいて形成するか、またはｐ５３の標的プロモーターにヘテロクロマチン集合体を標的化する新規のウイルス構築物である、特別の核骨格を明らかにするものである。
これらのデータでは、ｐ５３の標的に対するＥ４−ＯＲＦ３によるサイレンシングの特異性ならびに細胞の転写に対するそのような企て（ｍａｃｈｉｎａｔｉｏｎ）の全体的な結果について、論点が自明のものとして論を進める。したがって、細胞の転写に対するＥ４−ＯＲＦ３の特異性および全体的な生理的影響を決定するために、本発明者らは、初代ヒト休止ＳＡＥＣに対して全ゲノム発現解析を実施した（補足図２２および２３）。これらの試験は、Ｅ４−ＯＲＦ３が、休止したＳＡＥＣにおいてウイルス感染すると誘導される全体的な転写性の変化において排他的に役割を果たすことを実証するものである。Δ５５ｋを感染させたＳＡＥＣおよびΔ５５ｋ／ΔＯＲＦ３を感染させたＳＡＥＣと偽感染させたＳＡＥＣとで、対数倍数変化が２を超えて上方制御または下方制御される遺伝子の重複が１７３０遺伝子存在し、これは同様に制御され、共通の転写プログラムを反映する（図６ａ）。本発明者らは、遺伝子発現におけるこれらの全体的な変化は、Ｅ１Ａによる腫瘍抑制因子タンパク質のＲＢファミリーの不活化に起因することが予測される、細胞周期およびＥ２Ｆの活性化に関連づけられることを示す。これらのデータは、細胞の成長、分裂およびＤＮＡ合成に関与する遺伝子のプロモーターにおけるｐ３００およびＰＣＡＦを介した活性なヒストンマーク（ｈｉｓｔｏｎｅ ｍａｒｋ）であるヒストンＨ３リジン１８アセチル（Ｈ３Ｋ１８ａｃ）のＥ１Ａ誘導性の富化とも一致している。したがって、Ｅ４−ＯＲＦ３により、ヘテロクロマチンによるサイレンシングが誘導され、Ｅ４−ＯＲＦ３によって核全体を通して形成される足場は、ウイルス感染によって誘導された細胞の転写物の全体的な活性化に影響を及ぼさない。
Ｅ４−ＯＲＦ３が特異的に標的とする遺伝子を定義するために、本発明者らは、ΔＥ１Ｂ−５５ｋ／ΔＥ４−ＯＲＦ３を感染させた細胞とΔＥ１Ｂ−５５ｋを感染させた細胞とを比較した。ΔＥ１Ｂ−５５ｋを感染させた細胞では、Ｅ４−ＯＲＦ３により、２６５遺伝子の転写活性化が２以上の対数倍数変化で妨げられる。これらのうちのいくつがｐ５３によって制御される可能性があるかを推定するために、本発明者らは、これらのプロモーター内のコンセンサスｐ５３のＤＮＡの結合部位の存在、および同じ遺伝子が、ＭＤＭ２アンタゴニストであるヌトリンで処理した細胞においても上方制御されるかどうかの２つの判断基準を用いた（図６ｂ）。本発明者らは、示差的に上方制御された２６５遺伝子の７１％がヌトリンに反応して誘導され、かつ／または予測ｐ５３結合部位を有することを示す。ΔＥ１Ｂ−５５ｋ／ΔＥ４−ＯＲＦ３およびヌトリンに反応して上方制御された上位の転写物のヒートマップは、増殖阻害およびアポトーシスに関連する周知のｐ５３の標的（ＭＤＭ２、ＦＡＳ、ＰＩＧ３、ＴＰ５３ＩＮＰ１、ＢＴＧ２、ＬＲＤＤ／ＰＩＤＤ）ならびに新規の標的（ＨＲＨ１、ＲＮＡＳＥ７、ＪＭＪＤ１Ｃ）を含む（図６ｃおよび補足図２４）。予測ｐ５３結合部位を有さないか、またはヌトリンに反応して上方制御される上方制御された遺伝子が７６遺伝子存在する。Ｅ４−ＯＲＦ３により制御される転写物の経路分析により、ｐ５３経路に加えて、免疫調節ならびに組織／血管のリモデリングに関連する遺伝子の有意な過剰提示があることが示されている。これらのデータにより、Ｅ４−ＯＲＦ３が、一般的な抗ウイルス転写サイレンシングプログラムの一部としてｐ５３プロモーターを標的とし得ることが示唆され、これは、ΔＥ１Ｂ−５５ｋ／ΔＥ４−ＯＲＦ３の複製に大いに欠陥があることと一致する（補足図２５）。
本発明者らの試験の結論は、いくつかのｐ５３標的化がん療法の前提である、ｐ５３の誘導およびリン酸化はｐ５３活性に等しいという一般的な仮定に異議を唱えるものである。本発明者らのデータにより、ヒト体細胞においてｐ５３の標的プロモーターの標的化後成的サイレンシングを介して作用するｐ５３の不活化の新規かつ優勢の機構が示されている。本発明者らは、ウイルスタンパク質であるＥ４−ＯＲＦ３を同定し、これは、遺伝子毒性ストレスおよび発がん性ストレスに反応して、核中にクモの巣様構造を作り、ｐ５３の標的プロモーターにおいてＳＵＶ３９Ｈ１／２ Ｈ３Ｋ９ｍｅ３ヘテロクロマチン集合を導いてｐ５３による活性化転写をサイレンシングする新規の足場を形成する（図６ｄ）。注目すべきことに、この抑制的な核のクモの巣はｐ５３および抗ウイルス遺伝子を選択的に捕え、病的細胞の複製およびウイルスの複製を駆動する全体的な転写性の変化の背景において作動する。
アデノウイルスのＥ１Ｂ−５５Ｋにより、ｐ５３がプロテアソーム分解の標的になる。しかし、Ｅ４−ＯＲＦ３により、Ｅ１Ｂ−５５Ｋとは関係なく、ｐ５３の標的プロモーターがサイレンシングされることによってｐ５３が不活化される。したがって、アデノウイルス感染細胞においてｐ５３が活性化するためには、Ｅ１Ｂ−５５ＫおよびＥ４−ＯＲＦ３の両方が欠失することが必要である。出願人による構造試験およびオリゴマー形成試験により、Ｅ４−ＯＲＦ３ Ｎ８２Ａ変異タンパク質は機能的に折りたたまれているが、高次のオリゴマー形成を妨げる、閉じた立体配置をとっていることが明らかになった。したがって、ｐ５３の不活化にＥ４−ＯＲＦ３の高次の集合が必要であるかどうかを決定するために、Ｅ１Ｂ−５５Ｋについてヌルであり、野生型Ｅ４−ＯＲＦ３の代わりにＥ４−ＯＲＦ３ Ｎ８２Ａを発現する新規のアデノウイルスを工学的に作製した。ΔＥ１Ｂ−５５ｋを感染させた細胞では、Ｅ４−ＯＲＦ３により、ｐ２１およびＭＤＭ２のｐ５３による活性化転写が妨げられる（図３２Ａ）。対照的に、ΔＥ１Ｂ−５５ｋ／Ｅ４−ＯＲＦ３ Ｎ８２Ａ感染細胞では、Ｅ４−ＯＲＦ３は高次のオリゴマー形成を受け、ｐ５３を不活化することができない（図３２Ａ）。異なるクラスのｐ５３の標的についても同様の結論に達した。したがって、Ｅ４−ＯＲＦ３ Ｎ８２Ａは、完全なヌルとして振る舞う。出願人らは、Ｅ４−ＯＲＦ３の高次のオリゴマー形成が、ｐ５３媒介性遺伝子発現の不活化に対して決定的であると結論づける。
アデノウイルス初期タンパク質と腫瘍変異の間にはきわめて大きな機能的重複が存在し、これにより、Ｅ２Ｆおよびｐ３００／ＣＢＰヒストンアセチルトランスフェラーゼを含めた重要な成長制御機構の多くが同定されている。したがって、主要な問題は、Ｅ４−ＯＲＦ３が、正常細胞または腫瘍形成における、同様にｐ５３の転写活性を検閲する既存の機構および核構造を反映または推進するかどうかである。目ざましいことに、Ｅ４−ＯＲＦ３の公知の細胞標的である、ＰＭＬ３９、ＭＲＥ１１／ＲＡＤ５０／ＮＢＳ１（ＭＲＮ）ＤＮＡ損傷／修復複合体およびＴｉｆ１αの全ても、腫瘍変異により破壊される。Ｅ４−ＯＲＦ３により、公知のもの、およびおそらくまだ発見されていないものの両方の、いくつかのがんの経路変異の阻害性効果が物理的に組み込まれ、それらが一緒になってｐ５３活性のサイレンシングにおける新生の機能を有すると推測することは興味深い。ウイルスタンパク質を用いたｐ５３の発見と同様に、Ｅ４−ＯＲＦ３により、ヒト体細胞においてｐ５３の標的プロモーターの新規のそして標的化した後成的サイレンシングを誘導する決定的な細胞因子を定義する有力な動的プローブがもたらされる。これは、どのようにしてがん細胞において高いｐ５３レベルも不活化され得るか、ならびに腫瘍形成において腫瘍抑制遺伝子座の異常な後成的サイレンシングを誘導する機構を理解することについて重要な意味を有する。最後に、本発明者らがＥ４−ＯＲＦ３を同定したことにより、アデノウイルス感染細胞においてｐ５３がどのように不活化されるかに関する基本的な定義が変化し、これは、今や、真のｐ５３腫瘍選択的なアデノウイルス療法の合理的な開発を可能にすることができる決定的な機構的洞察である。

Claims (4)

  1. がんを処置するための組成物であって、有効量の、組換えアデノウイルスを含み、該組換えアデノウイルスは、Ｅ１Ｂ−５５ｋおよびＥ４−ＯＲＦ３が障害されており、そして、該組換えアデノウイルスは、ｐ５３発現細胞内に存在する場合には複製が障害され、ｐ５３が障害された細胞内に存在する場合は複製が障害されない、組成物。
  2. 前記がんがｐ５３に関連するがんである、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記がんが肺がん、皮膚がんまたは乳がんである、請求項１に記載の組成物。
  4. 処置しようとするがんが前がん状態の乳がんである、請求項１に記載の組成物。
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112013003579A2 (pt) * 2010-08-16 2016-06-07 Salk Inst For Biological Studi adenovírus, células, e, métodos para tratar câncer
WO2013138505A1 (en) 2012-03-13 2013-09-19 Salk Institute For Biological Studies Selective cell targeting using adenovirus and chemical dimers
AU2014236207B2 (en) 2013-03-14 2019-05-23 Salk Institute For Biological Studies Oncolytic adenovirus compositions
AU2016333996B2 (en) 2015-10-05 2020-05-28 Salk Institute For Biological Studies Synthetic adenoviruses with tropism to damaged tissue for use in promoting wound repair and tissue regeneration
CA3013639A1 (en) 2016-02-23 2017-08-31 Salk Institute For Biological Studies Exogenous gene expression in therapeutic adenovirus for minimal impact on viral kinetics
WO2017147265A1 (en) 2016-02-23 2017-08-31 Salk Institute For Biological Studies High throughput assay for measuring adenovirus replication kinetics
CA3045892A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Salk Institute For Biological Studies Tumor-targeting synthetic adenoviruses and uses thereof
JP2020518648A (ja) 2017-05-08 2020-06-25 グリットストーン オンコロジー インコーポレイテッド アルファウイルス新生抗原ベクター
SG11202113187WA (en) * 2019-05-30 2021-12-30 Gritstone Bio Inc Modified adenoviruses

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA137094A (en) 1911-08-31 1911-11-28 Sheppe, Alice L. Cloth measuring and price calculating machine
FR2726285B1 (fr) * 1994-10-28 1996-11-29 Centre Nat Rech Scient Adenovirus depourvus de particules contaminantes viables, preparation et utilisation
DK1199368T3 (da) * 1998-07-07 2004-04-13 Transgene Sa Anvendelse af adenovirus-E4-læserammer til forbedring af ekspression af et gen af interesse
EP1083229A1 (en) * 1999-09-10 2001-03-14 Introgene B.V. Modified adenoviral vectors for use in gene therapy
JP4744771B2 (ja) 2000-05-26 2011-08-10 大日本住友製薬株式会社 副作用を軽減した新規な組換えアデノウイルスベクター
US20020106382A1 (en) * 2000-07-14 2002-08-08 Young Charles S.H. Modified adenovirus and uses thereof
US20030220284A1 (en) 2002-02-22 2003-11-27 Patricia Yotnda Delivery of adenoviral DNA in a liposomal formulation for treatment of disease
EP1499332A4 (en) 2002-04-29 2006-12-06 Hadasit Med Res Service COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING CANCER WITH A VIRAL ONCOLYTIC AGENT
WO2004031357A2 (en) 2002-10-01 2004-04-15 Duke University Targeted tumor therapy by use of recombinant adenovirus vectors that selectively replicate in hypoxic regions of tumors
US20050201978A1 (en) 2003-11-17 2005-09-15 Lipton James S. Tumor and infectious disease therapeutic compositions
WO2010037027A2 (en) * 2008-09-26 2010-04-01 Auburn University Immunization of avians by mucosal administration of non-replicating vectored vaccines
BR112013003579A2 (pt) * 2010-08-16 2016-06-07 Salk Inst For Biological Studi adenovírus, células, e, métodos para tratar câncer

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