CN103180448A - 抗癌腺病毒 - Google Patents

Abstract

本文提供了抗癌腺病毒、其使用方法和制备方法。

Description

抗癌腺病毒

相关申请的交叉引用

本申请要求2010年8月16日提交的美国临时申请61/374,215的权益，所述临时申请为了所有目的全部并入本文。

对联邦政府资助研发做出的发明的权利的声明

本发明是在National Institutes of Health授予的政府支持CA137094下做出的。政府对本发明拥有某些权利。

发明背景

有52种人类腺病毒感染不同的人组织，还有上百种腺病毒能够感染从鱼到灵长动物的其他物种。这些病毒是高效的纳米级机器，能够在感染1小时内将它们的遗传物质有效负载至细胞核内。这些DNA病毒不整合到宿主DNA中，利用成熟的GMP方案可以产生高滴度的病毒，而且它们在为了表达异位基因进行的研究和人类基因治疗应用中表现很安全。但是，到目前为止，由于使用几乎只限于一个变种Ad5或Ad2/5嵌合体以及不能快速和系统地构建和组合多个基因修饰，它们的潜在应用受到了局限。因此，需要将常用的腺病毒载体扩展到Ad2/5以外，并且要建立一个技术平台来协助由组成部分快速离体地组装新的腺病毒基因组，以便能够系统地引入多个修饰和异源元件。这样的系统可以利用天然的病毒架构在能够高效运送和表达36个基因(不包括剪接变体)方面的优点。所述系统可以提供有力的诊断剂和治疗剂，这些诊断剂和治疗剂包含对不同肿瘤样品中失去调控的途径活性的多重和定量测量。

腺病毒载体在多种应用中的潜力受限于快速和系统地操纵36kb病毒基因组的能力。而且，基础研究、动物模型、基因治疗和溶瘤治疗中使用的腺病毒载体只限于腺病毒(Ad)血清型2和5。Ad2和Ad5居于最早发现的腺病毒之列，因此传统上有大量载体/工具来操纵它们的基因组，特别是E1区域。Ad2/5纤维蛋白(Fiber proteins)通过结合受体CAR感染上皮细胞。不幸的是，不是所有类型的细胞都表达CAR，而且在许多转移病例中被下调。再者，接近80%的人口具有预先存在的抗Ad2/5的中和抗体，这与脱靶肝摄取和炎症一起限制了它的系统性应用。因此，使用Ad2/5载体进行基因递送和癌症治疗不一定是最佳选择，相反主要是历史的偶然事件。

我们的最终目的是建立强力的病毒癌症疗法，所述疗法不仅能够进行肿瘤选择性裂解复制，还可以在多轮治疗中进行系统地给药、避免对肝脏的毒性、有效地靶向和穿越令人苦恼的肿瘤血管、经由不同的受体感染细胞、在肿瘤内通过前药活化酶/毒素的局部表达产生肿瘤旁观者效应并且复苏有益的宿主抗病毒免疫反应。这些主要挑战又因为人类腺病毒不能在小鼠中复制而更加严重。这排除了相比异种移植模型有许多优势的在免疫活性癌症基因工程小鼠模型(GEMMs)中进行人溶瘤病毒评价的可以。

52种人类腺病毒的存在表明腺病毒高度专性适应不同宿主组织环境中的感染和复制。这些病毒中有许多可以感染不同组织，并且具有与除CAR之外的细胞受体结合的纤维蛋白以及各不相同的“E3”免疫调节基因群。由于缺少修饰它们的基因组所需要的工具，对它们的这些独特属性还没有广泛的研究或利用。类似地，还存在感染其他物种的腺病毒，包括小鼠腺病毒(MAV-1)。

本文提供了对现有技术中的这些和其他问题的解决方案。

发明概述

发明一方面提供了经过改造的腺病毒。所述经过改造的腺病毒可以是p53复制受损型腺病毒。p53复制受损型腺病毒处于p53表达细胞内时是复制受损的，但在p53受损型细胞内时不是复制受损的。

发明另一方面提供了治疗癌症的方法。所述方法包括将有效量(例如治疗有效剂量或者用量)的经过改造的腺病毒(如上所述)或者一或多个编码经过改造的腺病毒的核酸给予有此需要的受试对象。

附图简述

图1.腺病毒感染的原代或肿瘤细胞中E1B-55k的丢失或p53的降解诱导了p53水平，但对转录活性没有影响，这与ARF表达无关。a.用模拟物、野生型(wt)或ΔE1B-55k(Δ55k)病毒感染人原代小气道上皮细胞(SAECs)，并在感染后(hours post infection,h.p.i.)24、36和48小时收集。对蛋白裂解物进行归一化，并分析p53、p21、MDM2和ARF的表达情况。分析肌动蛋白的表达作为上样对照。b.用模拟物、wt或Δ55k病毒感染U2OS细胞并在28h.p.i.固定。通过免疫荧光检测p53，用Hoechst染料将DNA复染。c.用模拟物、wt或Δ55k病毒感染U2OS细胞，在24、36和48h.p.i.收集。多柔比星(Doxorubicin,dox)处理12小时作为p53激活的阳性对照。将蛋白裂解物归一化，并分析p53、p21和MDM2的表达。分析肌动蛋白的表达作为上样对照。d.用模拟物、wt或Δ55k病毒感染带有异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导性ARF的U2OS稳定细胞系(NARF细胞)。细胞不做处理或者在8h.p.i.加入IPTG以诱导ARF的表达。利用实时PCR在36h.p.i.定量p21和MDM2的mRNA水平(下方小图)，作图表示为相对于(with respect to,wrt)模拟物感染的细胞(-ARF)的倍数改变；竖线代表三个重复的标准差。还收集(48h.p.i.)了蛋白裂解物，归一化并分析p53、p21、MDM2和ARF的表达(上方小图)。肌动蛋白作为上样对照。

图2.E1B-55k的缺失在感染腺病毒的细胞内诱发了高水平磷酸化p53，而p53转录靶被明显阻遏，不能被辐射、基因毒性药物、ARF、MDM2拮抗剂或者组蛋白去乙酰化酶抑制剂激活。a.用模拟物、wt或Δ55k病毒感染U2OS细胞。样品在24h.p.i.用介质对照(-)或5-氟尿嘧啶(5-FU)处理。36h.p.i.收集蛋白裂解物，归一化并分析p53和p21的表达。分析肌动蛋白作为上样对照。b.用模拟物、Δ55k或wt病毒感染SAECs。细胞不做处理或者在31h.p.i.用10Gy进行γ-照射(IR)。在36h.p.i.收集蛋白裂解物(下方小图)，归一化并分析p53、p21和MDM2的表达。利用磷酸化特异性抗体检测p53在丝氨酸(ser)15处的磷酸化。肌动蛋白作为上样对照。还在36h.p.i.收集了总RNA，并通过实时PCR定量p53的转录靶(上方小图)。将PUMA、MDM2、p21、GADD45A和14-3-3σ的水平作图为相对于(wrt)未感染细胞在0小时的倍数改变；竖线代表三个重复的标准差。c.用模拟物或Δ55k病毒感染SAECs，并在36h.p.i.收集。多柔比星(dox)处理12小时作为p53活化的阳性对照。将蛋白裂解物归一化，并通过Western印迹分析总的p53和p21水平。利用p53磷酸化特异性抗体确定p53在ser6和9(酪蛋白激酶1)、ser15(ATM、ATR、DNA-PK)、ser20(CHK1、CHK2、JNK、MAPKAP2)、ser33(p38、PIN1)、ser46(HIPK2和DYRK2)、苏氨酸(thr)81(JNK、PIN1)、ser315(Aurora激酶、PIN1、CDK2和GSK-3)和ser392(PKR、CDK9和p38FACT-CK2)3的磷酸化。d.用模拟物、wt或Δ55k病毒感染SAECs。样品在24h.p.i.用介质对照(-泳道)、多柔比星(dox)、MDM2拮抗剂、nutlin或曲古菌素(trichostatinA,TSA)处理。在36h.p.i.收集蛋白裂解物，归一化并通过Western印迹分析p53、MDM2和p21。肌动蛋白作为上样对照。

图3.E1A-13s诱导E4-ORF3，后者在感染腺病毒的细胞中独立于E1B-55k和p53降解而将p53灭活。a.用以下病毒感染SAECs:模拟物；野生型(wt)；带有E4-ORF3(ΔORF3)、E1B-55k(Δ55k)突变或者E4基因缺失(ΔE4)的病毒、带有下述复合突变的病毒：E1B-55k和E1A(Δ55k/E1AΔp300)、E1B-55k和E4-ORF6(Δ55k/ΔORF6)、E1B-55k和E4-ORF2(Δ55k/ΔORF2)、E1B-55k和E4-ORF3(Δ55k/ΔORF3)或者E1B-55k和E1A-13s(Δ55k/Δ13s)(参见补充的图4)。在36h.p.i.收集蛋白裂解物，归一化并通过Western印迹分析p53、MDM2、p21、E1B-55k和E4-ORF3的表达。肌动蛋白作为上样对照。b.用模拟物、Δ55k、Δ55k/ΔORF3或Δ55k/Δ13s病毒感染SAECs。细胞同时共感染对照病毒(Ad-GFP,+泳道)或异位表达E4-ORF3的病毒(Ad-ORF3,+泳道)。在36h.p.i.收集蛋白提取物，归一化并分析p53、MDM2、p21、GFP和E4-ORF3的表达。分析肌动蛋白的表达作为上样对照。c.用模拟物、wt、ΔORF3、Δ55k或Δ55k/ΔORF3病毒感染SAECs。在0、24、36和48h.p.i.收集蛋白裂解物，归一化并通过Western印迹分析p53、MDM2、p21、E1B-55k和E4-ORF3的表达。分析肌动蛋白的表达作为上样对照。d.用模拟物、wt、Δ55k、ΔORF3或Δ55k/ΔORF3病毒感染SAECs。在36h.p.i.收集RNA。利用实时PCR定量p53转录靶的mRNA水平，作图表示为相对于(wrt)模拟物感染细胞的倍数改变；竖线代表标准差。e.缺少内源p53但带有坡那甾酮(ponasterone)A诱导性p53cDNA的H1299-D1细胞用模拟物、wt、Δ55k或Δ55k/ΔORF3病毒感染，并在非诱导性(-ponA)或诱导性(+ponA)条件下分析。细胞还用多柔比星(dox)进行了处理。在48h.p.i.收集蛋白提取物并分析p53、MDM2和p21的病毒。分析肌动蛋白的病毒作为上样对照。

图4.E4-ORF3诱导新的SUV39H1和SUV39H2H3K9me3异染色质形成，并特异性阻止p53结合和接近内源启动子中的DNA靶位点。a.用p53-荧光素酶报告物(p53-luc)、p53结合位点已突变的p53-荧光素酶报告物(p53突变体)、或者对照pGL3-荧光素酶(pGL3-luc)质粒转染(一式三份)U2OS细胞(补充图10)。转染细胞用wt、Δ55k或者Δ55k/ΔORF3病毒感染，并在4h.p.i.加入D-荧光素。每小时读取发光读数，共48小时。将一式三份的平均发光对时间(h.p.i.).作图。b和c.用模拟物、Δ55k或Δ55k/ΔORF3病毒感染U2OS细胞。在36h.p.i.收集RNA、蛋白裂解物和染色质。多柔比星处理12小时作为p53活化的阳性对照。b.通过实时PCR确定p21和MDM2mRNA水平，作图表示为相对于(wrt)模拟物感染的倍数改变(上图)；竖线代表标准差。将蛋白裂解物归一化并分析p53表达；分析肌动蛋白作为上样对照(下方小图)。c.利用p53单克隆抗体进行p53染色质免疫沉淀(ChIPs)。相配的IgG同种型被作为针对特异性的对照。通过半定量PCR分析ChIP样品中p21(5’p53结合位点位于-2.4kb，3’位点位于-1.3kb)和MDM2启动子中的p53DNA靶序列。p21启动子中的-5kb区域不含p53结合序列，被用作阴性对照。左侧显示了输入DNA。d.用模拟物、Δ55k或Δ55k/ΔORF3病毒感染U2OS细胞，并在36h.p.i.固定。通过免疫荧光检测p53(绿色)和组蛋白H3的赖氨酸9的三甲基(H3K9me3,红色)，用Hoechst(白色)将DNA复染。e.用Δ55k病毒感染U2OS细胞，在36h.p.i.固定。通过免疫荧光检测SUV39H1、SUV39H2、SETDB1和G9a的H3K9甲基转移酶(绿色)以及H3K9me3(红色)。用Hoechst(白色)复染DNA。

图5.E4-ORF3形成核骨架，其直接限定异染色质组装，并在p53靶启动子处重新(de novo)诱导H3K9甲基，阻止p53DNA结合。a.用模拟物、Δ55k或Δ55k/ΔORF3病毒感染U2OS细胞。在36h.p.i.收集蛋白裂解物和染色质。将蛋白裂解物归一化，并分析p53、肌动蛋白、组蛋白H3(H3)的水平和组蛋白H3在赖氨酸9的甲基(H3K9me3)。利用H3K9me3和p53的抗体进行染色质免疫沉淀。小鼠和兔IgGs作为针对特异性的对照。通过实时定量PCR分析ChIP样品，并相对于输入DNA进行归一化。将p21和MDM2启动子中p53靶序列上结合的p53和H3K9me3作图，表示为相对于(wrt)模拟物的倍数改变。将IgG对照作图，以便衡量背景并作为p53和H3K9me3ChIPs中靶DNA序列富集度的对照。b和c.共聚焦图像显示的是感染了Δ55k病毒并在36h.p.i.固定的U2OS和小气道上皮细胞(SAECs)。左侧小图显示了细胞用H3K9me3(绿色)、E4-ORF3(红色)和Hoechst(DNA为白色)复染的单个共聚焦切片。右侧小图显示Z堆(z-stack)的中央切片，其中的横线和竖线代表贯穿整个堆(stack)的正交切割，然后在图的底部和右手侧显示为平面投影。d.感染了Δ55k的SAECs细胞,在36h.p.i.时，贯穿细胞核的0.3μm单个共聚焦切片的高分辨率和放大的图(放大系数=3,像素尺寸=40nm)(H3K9me3的免疫荧光为绿色，E4-ORF3为红色)。合并图显示对E4-ORF3核网和相关的异染色质区的放大(套印的小图)。

图6.E4-ORF3在全面转录改变(驱动致癌性细胞性和病毒性复制)的背景下选择性地沉默p53靶。a.用Affymetrix表达阵列分析被模拟物、Δ55k或Δ55k/ΔORF3病毒感染的SAECs在36h.p.i.时的全面基因表达改变。还对nutlin处理的SAECs进行了表达分析作为p53活化的阳性对照。每个条件下各个重复进行两次独立试验。文式图(Venn diagram)显示：在感染了Δ55k/ΔORF3的SAEC相对于感染了模拟物的SAEC(2711个基因)中，以及在感染了Δ55k的SAEC相对于感染了模拟物的SAEC(2178个基因)中，显著差异化表达的基因(log倍数改变(FC)>2或<-2，假发现率(FDR)为0.05)有重叠(1730个基因)。被模拟物、Δ55k和Δ55k/ΔORF3感染的SAEC中1730个重叠基因的每一个的标准化强度值的热点图显示在右侧。b.在Δ55k/ΔORF3相对Δ55k感染的SAECs中有265个被差别上调(log FC>2，FDR为0.05)的显著转录产物。在这265个差别上调基因中，72个基因预期在它们的启动子中含有p53转录因子结合位点(TFBS)；55个基因在应答nutlin时被上调log FC>1.5，但无预期的p53TFBS;62个基因既含有预期的p53TFBS，又在应答nutlin时被上调。还有76个其他被显著上调的基因(灰色)不属于以上任何类别。c.在Δ55k/ΔORF3感染和nutlin处理中差别上调最明显的转录物中的46个的无监督系统聚类。d.在应答癌变和基因毒性胁迫时p53水平和磷酸化的诱导被认为决定了p53的转录活化。E1B-55k结合并降解p53，这对于p53在腺病毒复制中的灭活非常关键。但是，我们揭示还有另外一个腺病毒蛋白E4-ORF3，它通过新的显性表观遗传机制灭活p53，这与p53稳定化和磷酸化无关。E4-ORF3形成新的核骨架，其引导p53靶启动子处的SUV39H1/2H3K9me3抑制性异染色质组装。在不能接近其靶启动子的情况下，p53无法阻止病毒复制。

补充图1(文中又称为图7)。在感染了ΔE1B-55k的人原代乳房上皮细胞或支气管上皮细胞中，p53降解的丢失能够诱导但不能活化p53。图7a:用模拟物、野生型(wt)或ΔE1B-55k(Δ55k)病毒感染原代人乳房上皮细胞(HMEC)，并在感染后(h.p.i.)24和36小时收集。通过Western印迹分析蛋白裂解物中p53、p21和MDM2的表达。分析肌动蛋白作为上样对照。图7b:用模拟物、wt或Δ55k病毒感染原代人支气管上皮细胞(HBEC)，在24h.p.i.收集。通过Western印迹分析蛋白裂解物中p53和p21的表达。

补充图2(文中又称为图8)。在被感染的肿瘤细胞中，E1B-55k的丢失诱导了p53水平，但对转录靶没有诱导。用模拟物、wt或Δ55k病毒感染p53野生型肿瘤细胞系(HCT-116p53+/+,A549)和p53突变体肿瘤细胞系(HCT-116p53-/-,MDA-MB-231和C33A)。多柔比星(dox)处理作为p53活化的阳性对照。在24和36h.p.i.收集蛋白裂解物并分析p53、p21和MDM2的表达。分析肌动蛋白作为上样对照。

补充图3(文中又称为图9)。在ΔE1B-55k感染细胞中，UV辐射未能激活p53的转录靶。用模拟物或者Δ55k病毒感染小气道上皮细胞，然后在24h.p.i.不处理或者用UV(13J)照射。在32h.p.i.分离总RNA。利用实时PCR定量p53的转录靶GADD45A、MDM2、p21和14-3-3．σ的mRNA水平。将相对于(wt)未感染细胞的mRNA水平倍数改变作图，竖线代表三个重复的标准差。

补充图4(文中又称为图10)。腺病毒早期病毒基因的基因组图谱，以及它们的已知细胞目标和功能。

补充图5(文中又称为图11)。Ad-GFP中的E4-ORF3表达能够被Δ55k/ΔORF3感染中的E1A-13s反式激活，但不能被Δ55k/Δ13s感染中的E1A-13s反式激活(图3b示意了病毒基因组相互作用和互补试验)。Ad-GFP是复制缺陷型病毒，其中的CMV启动子驱动了代替所删E1区的GFP的表达(来自Invitrogen的Ad-CMV)。Ad-CMV基因组骨架包括E4转录单位。E4基因(以及其他病毒ORFs)正常情况下在Ad-CMV感染中不表达，因为它们的转录活化需要E1A-13s。但是，当用Δ55k/ΔORF3共感染Ad-GFP时(如图3b所示)，Δ55k/ΔORF3感染中的E1A-13s表达能够反式地部分地活化Ad-GFP E4基因的转录，包括E4-ORF3(左侧小图)。相反，与Δ55k/Δ13s共感染Ad-GFP在任一病毒中都未导致E4-ORF3表达的活化(右侧小图)。

补充图6(文中又称为图12)。ΔE1B-55K感染细胞中的非p53转录靶基因的mRNA水平都相似，与E4-ORF3的表达无关。用模拟物、Δ55k或Δ55k/ΔORF3病毒感染SAECs。在36h.p.i.收集RNA。利用实时PCR来定量管家基因GUSB，以及被病毒感染诱导的p53的mRNA水平。将mRNA水平相对于模拟物感染的倍数改变作图；竖线代表三个重复的标准差。

补充图7(文中又称为图13)。带有坡那甾酮诱导型p53cDNA的H1299(p53无效突变)稳定细胞系(H1299-D1)。H1299-D1细胞是H1299(p53无效突变)稳定细胞系，其中的p53cDNA表达受到坡那甾酮诱导型启动子的调控。以0、1、2.5和5μM加入坡那甾酮A。16小时后收集蛋白裂解物，通过Western印迹分析p53和p21的表达。

补充图8(文中又称为图14)。E4-ORF3不与p53共定位。用模拟物、Δ55k或Δ55k/ΔORF3病毒感染U2OS细胞并在28h.p.i.固定。通过免疫荧光检测p53和E4-ORF3，用Hoechst复染DNA。

补充图9(文中又称为图15)。在有E4-ORF3的情况下，p53有野生型和活性DNA结合结构域蛋白构象。用模拟物、wt、ΔORF3、Δ55k或Δ55k/ΔORF3感染SAECs。多柔比星(dox)处理作为p53活化的阳性对照。用p53构象特异性抗体PAb1620和PAb240从裂解物中免疫沉淀p53。裂解物和免疫沉淀物经Western印迹检测p53。

补充图10(文中又称为图16)。与p53-luc(图4a)相反，对照pGL3-荧光素酶报告基因质粒在野生型、Δ55k和Δ55k/ΔORF3感染中被活化到相似的水平。用p53-荧光素酶报告基因(p53-luc)、p53结合位点被突变的p53-荧光素酶报告基因(p53-突变体)或者对照pGL3-荧光素酶(pGL3-luc)质粒(一式三份地)转染U2OS细胞。转染过的细胞用wt、Δ55k或Δ55k/ΔORF3病毒感染。感染后4小时的适合，添加D-荧光素。每小时读取发光读数，共48小时。将三个重复的平均发光对感染后小时数(h.p.i.)所代表的时间作图。对照pGL3-荧光素酶转染的发光读数如上显示(相同试验中p53-luc数据如图4a所示)。

补充图11(文中又称为图17)。E4-ORF3能够阻止p53结合细胞染色质中的靶启动子。利用p53单克隆抗体，在36h.p.i.对用模拟物、Δ55k或Δ55k/ΔORF3病毒感染的U2OS细胞进行了p53染色质免疫沉淀(ChIP)。多柔比星作为阳性对照。使用相配的IgG同种型作为针对特异性的对照。通过实时定量PCR分析ChIP样品的p21(5’和3’p53结合位点)和MDM2启动子序列，并相对于输入DNA进行归一化。将p53的回收率%和IgGChIPs作图到y轴。IgG对照中的回收率作为背景的衡量尺度。p21启动子的-5kb区域不含有p53结合序列，被作为阴性对照。

补充图12(文中又称为图18)。Δ55k感染中，在细胞核周围诱导出H3K9me3异染色质结构域，而在Δ55k/ΔORF3中未诱导。(图4d中的感染对照)U2OS细胞用模拟物、Δ55k或Δ55k/ΔORF3病毒感染，并在感染后36小时固定。通过免疫荧光检测H3K9三甲基(H3K9me3)、E1A(Δ55k和Δ55k/ΔORF3感染中均表达的腺病毒早期蛋白)和E4-ORF3(白色)。用Hoechst将DNA复染。图像用Zeiss Axioplan2显微镜获取。

补充图13(文中又称为图19)。甲基转移酶SUV39H2与凝聚的细胞DNA或H3K9三甲基在Δ55k感染细胞中特异地共定位。(图4e的对照)U2OS细胞用模拟物、Δ55k或Δ55k/ΔORF3病毒感染并在36h.p.i.固定。图19a.用抗SUV39H2(Abcam)和H3K9三甲基(H3K9me3)的抗体进行免疫荧光。用Hoechst(白色)将DNA染色。图19b.用抗SUV39H2(sc,Santa CruzBiotechnology)的独立二抗进行免疫荧光，与H3K9me3共染色以证明SUV39H2的重新定位。图19c.SUV39H2和H3K9me3免疫荧光的IgG同种型和二抗对照。图像用Leica共聚焦SP2显微镜获取。

补充图14(文中又称为图20)。甲基转移酶SUV39H1与凝聚的细胞DNA和H3K9三甲基在Δ55k感染细胞中特异地共定位。(图4e的对照)U2OS细胞用模拟物、Δ55k或Δ55k/ΔORF3病毒感染并在36h.p.i.固定。图20a.用抗SUV39H1和H3K9三甲基(H3K9me3)的抗体进行免疫荧光。用Hoechst(白色)将DNA染色。图20b.IgG同种型和二抗对照。图20c.为了用内源SUV39H1抗体证实结果，U2OS细胞用带有myc标签的SUV39H1表达构建体转染，用Δ55k病毒感染并在36h.p.i.固定。通过免疫荧光检测带有Myc标签的SUV39H1和H3K9me3，用Hoechst(白色)复染DNA。图像用Leica共聚焦SP2显微镜获取。

补充图15(文中又称为图21)。甲基转移酶G9a不与凝聚的细胞DNA或H3K9三甲基在Δ55k感染细胞中特异地共定位。(图4e的对照)U2OS细胞用模拟物、Δ55k或Δ55k/ΔORF3病毒感染并在36h.p.i.固定。用抗G9a和H3K9三甲基(H3K9me3)的抗体进行免疫荧光。用Hoechst(白色)将DNA染色。图像用Axioplan显微镜获取。

补充图16(文中又称为图22)。甲基转移酶SETDB1不与凝聚的细胞DNA或H3K9三甲基在Δ55k感染细胞中特异地共定位。(图4e的对照)U2OS细胞用模拟物、Δ55k或Δ55k/ΔORF3病毒感染并在36h.p.i.固定。用抗SETDB1和H3K9三甲基(H3K9me3)的抗体进行免疫荧光。用Hoechst(白色)将DNA染色。图像用Nikon A1共聚焦显微镜获取。

补充图17(文中又称为图23)。E4-ORF3在p53靶启动子处诱导H3K9三甲基化，阻止p53DNA结合(造成图5a作图显示的回收率%)。U2OS细胞用模拟物、Δ55k或Δ55k/ΔORF3病毒感染，并在36h.p.i.收集。利用p53(图23a)或H3K9三甲基(H3K9me3)(图23b)抗体，进行染色质免疫沉淀(ChIPs)。使用无免疫性的兔IgG做为阴性对照。对p21(5’和3’p53结合位点)、MDM2、GADD45A和肌动蛋白启动子序列进行实时定量PCR。将全部结果相对于输入DNA进行归一化。p21启动子的-5kb区域是p53结合的阴性对照。

补充图18(文中又称为图24)。E4-ORF3通过阻止p53DNA结合到多重p53靶启动子中的启动子上来灭活p53。感染了模拟物、Δ55k或Δ55k/ΔORF3病毒的U2OS细胞在36h.p.i.收集。为了扩展图5a中的p53靶启动子成员，利用p53抗体或者无免疫性小鼠IgG对照进行p53染色质免疫沉淀(ChIP)。ChIP样品经实时定量PCR分析。对p215’和3’p53结合位点的分析证实ChIP结果如补充图17所示，此外还分析了FAS、PUMA、GADD45A和PIG3启动子，将它们的结果相对于输入DNA进行了归一化。p53ChIP的回收%在y轴作图。IgG对照的回收用于衡量背景。

补充图19(文中又称为图25)。Δ55k感染中，E4-ORF3诱导了p53靶启动子处H3K9三甲基。感染了模拟物、Δ55k或Δ55k/ΔORF3病毒的U2OS细胞在36h.p.i.收集。为了扩展图5a中的p53靶启动子和对照的成员，利用H3K9三甲基(H3K9me3)抗体或者无免疫性小鼠IgG对照进行H3K9me3染色质免疫沉淀(ChIP)。ChIP样品经实时定量PCR分析。对p215’和3’p53结合位点的分析证实了补充图17中的ChIP结果，此外还分析了p53的靶FAS、PUMA和PIG3启动子。POLR2(不是p53靶位点)被用作阴性对照。将它们的结果相对于输入DNA进行了归一化。H3K9me3ChIP的回收%在y轴作图。

补充图20(文中又称为图26)。E4-ORF3与U2OS细胞核中H3K9三甲基异染色质的形成直接相关。(图5b的对照)U2OS细胞用模拟物、Δ55k或Δ55k/ΔORF3病毒感染并在36h.p.i.固定。用抗E4-ORF3和H3K9三甲基(H3K9me3)抗体进行免疫荧光。DNA用Hoechst染色(白色)。用Nikon A1共聚焦显微镜获取图像。

补充图21(文中又称为图27)。E4-ORF3与SAECs细胞核中H3K9三甲基异染色质的形成直接相关。(图5c中获取的高分辨率图像的对照)小气道上皮细胞(SAECs)用模拟物、Δ55k或Δ55k/ΔORF3病毒感染并在36h.p.i.固定。用抗E4-ORF3和H3K9三甲基(H3K9me3)抗体进行免疫荧光。DNA用Hoechst染色(白色)。用Leica共聚焦SP2显微镜获取图像。

补充图22(文中又称为图28)。来自在SAECs中进行的两个独立试验的裂解物，从中收集RNA进行全基因组表达分析。按照说明进行不同批次细胞的两个独立试验(I和II)。用模拟物、野生型(wt)、ΔE1B-55k(Δ55k)或ΔE1B-55k/ΔE4-ORF3(Δ55k/ΔORF3)病毒感染小气道上皮细胞，并在感染后36小时收集以获得裂解物。Nutlin处理12小时作为p53活化的阳性对照。对模拟物、Δ55k、Δ55k/ΔORF3和nutlin样品(每个试验一式两份)收集RNA并纯化，然后标记并与Affymetrix外显子阵列杂交以进行全基因组表达分析。

补充图23(文中又称为图29)。Affymetrix阵列的探针强度分布。与模拟物、ΔE1B-55k(Δ55k)、ΔE1B-55k/ΔE4-ORF3(Δ55k/ΔORF3)和nutlin处理的SAEC样品(每个条件有4个独立的重复)杂交后的Affymetrix外显子阵列芯片的探针强度分布。

补充图24(文中又称为图30)。Δ55k和Δ55k/ΔORF3Affymetrix阵列样品的各个基因强度(表达)值的箱线图和须图。将Δ55k和Δ55k/ΔORF3各自的基因转录物的log强度值在y-轴作图。每个点代表独立的重复。星号代表p53转录靶。

补充图25(文中又称为图31)。在原代SAECs中的ΔE1B-55k/ΔE4-ORF3病毒复制相对于ΔE1B-55k而言被抑制。用模拟物、ΔE1B-55k/ΔE4-ORF3(Δ55k/ΔORF3)、ΔE1B-55k(Δ55k)或wt病毒以感染复数10感染SAECs，并在感染后(h.p.i.)48和72小时收集。按照方法章节中的描述，通过在293/E4细胞中进行病毒复制分析来确定以噬菌斑形成单位(p.f.u.)表示的总病毒产量；竖线代表三份的标准差。

图32.E4-ORF3的高阶寡聚化对于它在灭活p53、MRN和促进病毒复制方面的功能非常重要。(A和D)原代SAEC用模拟物、野生型Ad5(WT)、E4-ORF3、E1B-55K、E1B-55K/E4-ORF3或者E1B-55K/E4-ORF3N82A腺病毒感染。在36h.p.i.收集蛋白裂解物，归一化并对p53、MDM2和p21进行免疫印迹。分析β-肌动蛋白作为上样对照。(B)用指示的病毒感染SAECs，在36h.p.i.固定，并对E4-ORF3、NBS1和DNA免疫染色。(C)与(B)一样，除了免疫染色的是E2A病毒复制结构域。(D)与(A)一样，除了裂解物是针对Ad5衣壳蛋白进行了免疫印迹。

发明详述

定义

“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸和它们的聚合物，以及它们的互补链。该术语涵盖这样的核酸，所述核酸含有已知的核苷酸类似物或者骨架带有修饰的残基或连接；所述核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的；所述核酸与参照核酸有类似的结合性能并且与参照核苷酸的代谢方式类似。这种类似物的例子包括，但不限于硫代磷酸酯、胺基磷酸酯、甲基磷酸酯、手性-甲基磷酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNAs)。

术语“Ad5”和“腺病毒基因组”用于本文是指SEQ ID NO:3中给出的核酸序列。

除非另有说明，特定核酸序列还暗含其保守性修饰的变体(例如简并密码子取代)和互补序列，以及明确指出的序列。具体来说，可以通过产生这样的序列来实现简并密码子取代，所述序列中的一或多个选中(或全部)密码子的第三个位点被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer et al.,NucleicAcid Res.19:5081(1991);Ohtsuka et al.,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985);Rossolini et al.,Mol.Cell.Probes8:91-98(1994))。术语核酸与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸可以互换使用。

特定核酸序列还暗含“剪接变体”。类似地，由核酸编码的特定蛋白暗含由该核酸的剪接变体编码的所有蛋白。“剪接变体”正如这个术语暗示的是基因替代剪接的产物。转录结束后，开始的核酸转录物可以发生剪接，使得不同(替代)核酸剪接产物编码不同的多肽。剪接变体的产生机制可以各不相同，但都包括外显子的替代剪接。由同一核酸经过通读转录产生的替代的多肽也涵盖在这个定义中。剪接反应的任何产物，包括重组形式的剪接产物都包括在这个定义中。Leicher,et al.,J.Biol.Chem.273(52):35095-35101(1998)中讨论了一例钾离子通道剪接变体。

构建含有所需治疗基因编码和调控序列的合适载体可以采用常规的连接和限制性酶切技术，这些技术在本领域已有很好的了解(参见Maniatis et al.,in Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(1982))。可以将分离的质粒、DNA序列或者合成寡核苷酸切割、修饰并按照需要的形式重新连接。

核酸在与另一个核酸序列形成功能性关系时是“可操纵地连接”。例如，编码前体序列或者分泌前导序列的DNA如果能够表达为参与多肽分泌的前体蛋白，则所述DNA是可操纵地连接编码多肽的DNA；启动子或增强子如果能够影响序列的转录，则所述启动子或增强子是可操纵地连接编码序列；或者核糖体结合位点如果定位方式能够协助翻译的进行，则所述核糖体结合位点是可操纵地连接编码序列。通常，“可操纵地连接”意味着被连接在一起的DNA序列距离很近，而且对于分泌前导序列的情况，是连续的和符合读框的。但增强子不需要是连续的。连接是通过在方便的限制酶切位点进行相连完成的。如果不存在这样的位点，可以按照常规做法使用合成寡核苷酸适配子或接头。

在提及两个或更多个核酸或多肽序列的语境中，术语“相同的”或“同一性”百分比是指利用BLAST或BLAST2.0序列比较算法，使用以下描述的缺省参数，或者通过人工比对和目测进行测量(参见例如NCBI网站等)，所述两个或更多个序列或子序列是相同的，或者含有特定百分比的氨基酸残基或核苷酸是相同的(即在比较窗口或者指定区域内按照最大对应性进行比较和对位排列时，特定区域内有大约60%的同一性，优选65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的同一性)。这样的序列即可被认为是“基本相同的”。这个定义还可以指示或者可以应用于测试序列的互补序列。定义还包括含有缺失和/或添加的序列，以及含有取代的序列。正如以下描述的，优选的算法可以计数空位等。优选地，至少大约25个氨基酸或核苷酸长的区域内存在同一性，或者更优选地在50-100个氨基酸或核苷酸的区域内。

对于序列比较，一般将一个序列作为参照序列，将测试序列与它相比。使用序列比较算法时，将测试和参照序列输入计算机，指定子序列坐标，如果需要还可以指定序列算法的程序参数。优选地，可以使用缺省程序参数，或者可以指定替代参数。然后序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对参照序列的序列同一性百分比。

“比较窗口”用于本文包括两个序列被最优化对位排列后，选自多个由20-600，优选大约50-大约200，更通常是大约100-大约150个位点组成的连续位点之一的区段，其中所述序列与具有相同数量连续位点的参照序列进行比较。用于将序列对位排列进行比较的方法是本领域已知的。可以如下实施序列比较的最佳对位排列，例如通过Smith & Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法；通过Needleman & Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源比对算法；通过Pearson&Lipman,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA85:2444(1988)的寻找相似性的方法；通过这些算法的计算机化实施(Wisconsin Genetics Software Package中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI)；或者通过人工比对和目测(参见例如Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.,eds.1995supplement))。

适用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的优选例子是BLAST和BLAST2.0算法，这两个算法分别在Altschul et al.,Nuc.Acids Res.25:3389-3402(1977)和Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中有描述。使用了参数如文中所述的BLAST和BLAST2.0来确定本发明的核酸和蛋白的序列百分比同一性。正如本领域已知的，进行BLAST分析的软件可以通过National Center for Biotechnology Information公开获得。该算法涉及首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字节来鉴定高评分序列对(HSPs)，所述HSPs当与数据库序列中相同长度的字节比对时，或者匹配或者满足某些正数的阈值打分T。T代表相邻字得分阈值(neighborhood word scorethreshold)(Altschul et al.,同前)。这些初始的匹配相邻字作为种子，启动搜索含有它们的更长的HSPs。将匹配字沿着每个序列，在累加比对得分能够增加的情况下尽量远地向两个方向延伸。对于核苷酸序列，利用参数M(一对匹配残基的奖励分;永远>0)和N(错配残基的罚分;永远<0)计算累加得分。对于氨基酸序列，利用打分矩阵来计算累加得分。当累加比对得分从它达到的最大值下降数量X时；由于一或多个得负分的残基比对的累积，累加得分达到零或以下时；或者到达序列的末端时，停止匹配字在每个方向的延伸。BLAST算法参数W、T和X决定算法的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用的缺省参数为字长(W)=11、期望值(E)=10、M=5、N=-4，双链比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用的缺省参数为字长=3、期望值(E)=10、BLOSUM62打分矩阵(参见Henikoff & Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915(1989))比对(B)=50、预期值(E)=10、M=5、N=-4，双链比较。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在文中可以互换使用来指代氨基酸残基的聚合物。这些术语适用这样的氨基酸聚合物，所述氨基酸聚合物中的一或多个氨基酸残基是相应的天然存在氨基酸的人工化学模拟物；也适用天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。

术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及能够按照和天然存在的氨基酸相似的方式发挥作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及后来发生修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸盐和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸有相同的基本化学结构的化合物，即结合在氢原子上的α碳、羧基、氨基和R基团，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这些类似物带有被修饰的R基团(例如正亮氨酸)或者被修饰的肽骨架，但保持了和天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指其结构与氨基酸的一般化学结构不同的化合物，但与天然存在的氨基酸发挥功能的方式类似。

氨基酸在文中可以用它们的众所周知的三字母符号或者IUPAC-IUBBiochemical Nomenclature Commission推荐的单字母符号来表示。类似地，可以用它们的公认单字母代码来指示核苷酸。

“保守性修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列两者。就特定核酸序列而言，保守性修饰的变体是指那些编码相同或基本相同氨基酸序列的核酸，或者对于不编码氨基酸序列的核酸，是指基本相同的序列。由于遗传密码的简并性，有大量功能上相同的核酸可以编码任何给定蛋白。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在密码子限定是丙氨酸的每个位点，可以将密码子改变为上述相应密码子中的任何一个而不会改变被编码的多肽。这样的核酸变异是“沉默变异”，是保守性修饰变体的一种。本文中每个编码多肽的核酸序列还描述了所述核酸的每个可以的沉默变体。本领域技术人员可以认识到核酸中的每个密码子(除了AUG，它通常是唯一的甲硫氨酸的密码子；和TGG，通常是唯一的色氨酸的密码子)都可以被修饰而产生功能相同的分子。相应地，就表达产物而言，每个被描述序列中暗含了多肽编码核酸的每个沉默变体，但对实际的探针序列来说，没有这种含义。

对于氨基酸序列，本领域技术人员可以认识到那些改变、增加或者删除编码序列中的单个氨基酸或较小百分比氨基酸的对核酸、肽、多肽或蛋白序列进行的个别取代、缺失或添加是“保守性修饰变体”，其中所述改变导致氨基酸被化学上相似的氨基酸所取代。给出功能相似氨基酸的保守性取代表格是本领域已知的。这样的保守性修饰变体是本发明的多态性变体、种间同源物和等位基因额外的，而不是排除它们。

以下8个组各自含有相互是保守性取代的氨基酸:1)丙氨酸(A),甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D),谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K);5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V);6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y),Tryptophan(W);7)丝氨酸(S),苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见例如Creighton,Proteins(1984))。

提到例如细胞、病毒、核酸、蛋白或载体时使用的术语“重组”表明这些细胞、病毒、核酸、蛋白或载体被引入了异源核酸或蛋白或者天然核酸或蛋白被改变而被修饰，或者细胞来源于被这样修饰的细胞。因此，重组细胞例如表达天然(非重组的)细胞中没有的基因；或者表达的是天然基因，但是表达异常、表达下降或者根本没有表达。

术语“严紧杂交条件”是指这样的条件，在所述条件下探针与通常存在于复杂的核酸混合物中它的靶子序列杂交，但不和其他序列杂交。严紧条件是序列依赖性的，并且随着环境的不同而不同。较长的序列在较高温度下特异杂交。Tijssen,Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridizationwith Nucleic Probes,“Overview of principles of hybridization and the strategy ofnucleic acid assays”(1993)中可以找到关于核酸杂交的全面指南。通常对于限定的离子强度pH，选择的严紧条件比具体序列的融解温度(T_m)低大约5-10°C。T_m是(一定离子强度、pH和核苷浓度下)与靶序列互补的探针有50%与靶序列平衡杂交的温度(靶序列过量的情况下，在T_m，平衡时有50%的探针被占据)。还可以通过加入去稳定剂，比如甲酰胺来达到严紧条件。对于选择性或特异性杂交，阳性信号是背景的至少两倍，优选是背景杂交的10倍。示范性的严紧杂交条件可以如下:50%甲酰胺、5x SSC和1%SDS，42°C温育，或者5x SSC、1%SDS、于65°C温育，并于65°C在0.2x SSC和0.1%SDS中洗涤。

严紧条件下相互不杂交的核酸如果编码的多肽基本相同，所述核酸仍然是基本相同的。例如核酸拷贝是利用遗传密码所能允许的最大密码子简并性形成的，会发生这种情况。在这种情况中，核酸一般在中等严紧的杂交条件下发生杂交。示范性的“中等严紧杂交条件”包括在37°C下在40%甲酰胺、1M NaCl、1%SDS的缓冲液中杂交和在45°C在1X SSC中洗涤。阳性杂交至少是背景的两倍。本领域技术人员容易理解可以使用替代的杂交和洗涤条件来提供严紧度相似的条件。确定杂交参数的其他指导方针在许多参考文献和例如Current Protocols in Molecular Biology,ed.Ausubel,et al.,John Wiley& Sons中有提供。

对于PCR，约36°C的温度对于低严紧扩增是典型的，虽然根据引物长度，退火温度可以在约32°C和48°C之间。对于高严紧PCR扩增，约62°C的温度是典型的，虽然根据引物长度和特异性，高严紧退火温度可以处于约50°C到约65°C的范围。对高和低严紧扩增的典型循环条件包括90°C-95°C30秒–2分钟的变性阶段，持续30秒-2分钟的退火阶段，和大约72°C1–2分钟的延伸阶段。Innis et al.(1990)PCR Protocols,A Guide to Methods andApplications,Academic Press,Inc.N.Y.)中提供了低和高严紧扩增反应的试验方案和指南。

用于本文，术语“癌症”是指在哺乳动物中发现的所有类型的癌症、肿瘤(neoplasm)或恶性肿瘤，包括白血病、癌(carcinomas)和肉瘤(sarcomas)。示范性的癌症包括脑、乳房、宫颈、结肠、头颈、肝、肾、肺、非小细胞肺、黑素瘤、间皮瘤、卵巢、肉瘤、胃、子宫和髓母细胞瘤的癌症。额外的例子包括何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、原发性脑瘤、癌症、恶性胰岛素瘤、恶性类癌、膀胱癌、恶性前皮肤病损、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食道癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、胰腺内分泌和外分泌的肿瘤以及前列腺癌。

术语“白血病”是泛指造血器官的进展性、恶性疾病，通常特征在于血液和骨髓中白细胞和它们的前体细胞的异常增殖和发育。白血病的临床分类通常基于(1)疾病的持续期和特点-急性或慢性；(2)涉及的细胞类型-骨髓的(髓细胞性)、淋巴的(淋巴性)或者单核细胞型；和(3)血液中异常细胞的增加或未增加-白血病或非白血性(亚白血病性)。P₃₈₈白血病模型是广泛接受的预测体内抗白血病活性的模型。据信，在P₃₈₈检测方法中测试显示阳性的化合物一般在体内会表现出一定水平的抗白血病活性，无论被治疗的白血病类型如何。相应地，本发明包括白血病的治疗方法，优选治疗下述白血病的方法：急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性粒细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性早幼粒细胞白血病、成人T-细胞白血病、非白血性白血病、白细胞不增多性白血病、嗜碱性白血病、母细胞性白血病、牛白血病、慢性髓细胞性白血病、皮肤白血病、胚胎性白血病、嗜酸粒细胞白血病、葛氏(Gross')白血病、毛细胞白血病、成血细胞性白血病、血胚细胞性白血病、组织细胞性白血病、干细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、白血病减少性白血病、淋巴性白血病、淋巴细胞性(lymphoblastic)白血病、淋巴细胞性(lymphocytic)白血病、淋巴球性(lymphogenous)白血病、淋巴样白血病、淋巴肉瘤细胞性白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞白血病、小原粒细胞性白血病、单核细胞白血病、髓性(myeloblastic)白血病、髓细胞性(myelocytic)白血病、骨髓粒细胞性白血病、髓单核细胞性白血病、内格利型(Naegeli)白血病、浆细胞白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞性白血病、早幼粒细胞性白血病、李德尔氏细胞性(Rieder cell)白血病、希林氏(Schilling's)白血病、干细胞性白血病、亚白血性白血病和未分化细胞白血病。

术语“肉瘤”通常所指的肿瘤是由胚胎结缔组织这样的物质组成的，一般包含包埋在纤维或均相物质中的紧密堆积的细胞。可以组合使用抗肿瘤的巯基结合线粒体氧化剂和抗癌剂来治疗的肉瘤包括软骨肉瘤、纤维肉瘤、淋巴肉瘤、黑素肉瘤、粘液肉瘤、骨肉瘤、艾伯内西氏(Abemethy's)肉瘤、脂肉瘤、脂肪肉瘤、软组织腺泡状肉瘤、成釉细胞肉瘤、葡萄状肉瘤、绿色肉瘤、绒毛膜癌、胚胎性肉瘤、Wilms'瘤、子宫内膜肉瘤、间质肉瘤、尤文氏(Ewing's)肉瘤、筋膜肉瘤、纤维母细胞肉瘤、巨细胞肉瘤、粒细胞肉瘤、何杰金氏肉瘤、特发性多发性色素沉着出血性肉瘤(idiopathic multiple pigmentedhemorrhagic sarcoma)、B细胞的免疫母细胞肉瘤、淋巴瘤、T细胞的免疫母细胞肉瘤、詹森(Jensen's)肉瘤、卡波西(Kaposi's)肉瘤、库柏法细胞(Kupffer cell)肉瘤、血管肉瘤、白血病性肉瘤、恶性间叶瘤、骨膜外肉瘤、网状细胞肉瘤、劳氏肉瘤(Rous sarcoma)、浆液囊性肉瘤、外阴滑膜肉瘤和毛细管扩张性肉瘤。

术语“黑素瘤”意味着从皮肤和其他器官的黑色素细胞系统发生的肿瘤。可以组合使用抗肿瘤的巯基结合线粒体氧化剂和抗癌剂来治疗的黑素瘤包括例如，肢端雀斑样痣黑素瘤、无黑素性黑素瘤、良性幼年黑素瘤、克罗德曼(Cloudman's)黑素瘤、S91黑素瘤、哈帕二氏(Harding-Passey)黑素瘤、青少年性黑素瘤、雀斑样痣恶性黑素瘤、恶性黑素瘤、结节性黑素瘤、甲床黑素瘤和浅表扩散性黑素瘤。

术语“癌(carcinoma)”是指由上皮细胞构成的恶性新生长物，易于渗透到周围组织，产生转移物。可以组合使用抗肿瘤的巯基结合线粒体氧化剂和抗癌剂来治疗的示范性癌包括例如腺泡癌、腺泡状癌、腺囊性癌、腺样囊性癌、腺癌、肾上腺皮质癌、肺泡上皮癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌(basal cellcarcinoma)、基底细胞癌(carcinoma basocellulare)、类基底细胞癌、基底鳞状细胞癌、细支气管肺泡癌、细支气管癌、支气管癌、髓样癌、胆管癌、绒膜上皮癌、胶样癌(colloid carcinoma)、粉刺癌、子宫体癌、筛状癌、铠甲状癌、癌疮、柱状细胞癌(cylindrical carcinoma)、柱状细胞癌(cylindrical cellcarcinoma)、导管癌、硬癌(carcinoma durum)、胚胎癌、脑样癌、表皮样癌、腺样上皮细胞癌、外生性癌、溃疡性癌、纤维癌、胶样癌(gelatinifornicarcinoma)、胶状癌(gelatinous carcinoma)、巨大细胞癌、巨细胞癌、腺癌、粒层细胞癌、基底细胞癌(hair-matrix carcinoma)、多血癌、肝细胞癌、许特耳氏细胞(Hurthle cell)癌、胶样癌(hyaline carcinoma)、hypemephroidcarcinoma、幼稚型胚胎性癌、原位癌(carcinoma in situ)、表皮内癌、上皮内癌、克龙派切尔(Krompecher's)癌、库尔契茨基细胞(Kulchitzky-cell)癌、大细胞癌、豆状癌(lenticular carcinoma、carcinoma lenticulare)、脂瘤样癌、淋巴上皮性癌、软癌(carcinoma medullare)、髓样癌(medullary carcinoma)、黑色素癌、髓样癌(carcinoma molle)、粘液癌(mucinous carcinoma、carcinomamuciparum)、粘液细胞癌、粘液表皮样癌、粘液癌(carcinoma mucosum、mucouscarcinoma)、粘液瘤样癌、鼻咽癌、燕麦细胞癌、骨化性癌(carcinoma ossificans、osteoid carcinoma)、乳头状癌、门脉周癌、原位癌(preinvasive carcinoma)、棘细胞癌、脑样癌、肾脏的肾细胞癌、储备细胞癌、肉瘤样癌、施奈德氏(Schneiderian)癌、硬癌(scirrhous carcinoma)、阴囊癌、印戒细胞癌、单纯癌、小细胞癌、马铃薯状癌、球状细胞癌、梭细胞癌、髓样癌(carcinomaspongiosum)、鳞状癌、鳞状细胞癌、绳捆癌(string carcinoma)、血管扩张性癌(carcinoma telangiectaticum、carcinoma telangiectodes)、移行细胞癌、结节性皮癌(carcinoma tuberosum、tuberous carcinoma)、疣状癌和绒毛状癌。

“治疗有效剂量或量”在本文意味着一个能够产生它的给药效应的剂量。确切的剂量和剂型取决于治疗目的，由本领域技术人员利用已知技术确定(参见例如Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(vols.1-3,1992)；Lloyd,The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Remington:The Science and Practice of Pharmacy,20th Edition,Gennaro,Editor(2003)和Pickar,Dosage Calculations(1999))。

术语“可药用盐”或“可药用载体”意味着包括活性化合物的盐，根据本文描述的化合物带有的取代基，所述盐是用相对无毒的酸或碱制备的。本发明的化合物含有相对酸性的功能团时，可以通过在无溶剂或合适的惰性溶剂中用足够量的所需碱与所述化合物的中性形式进行接触获得碱加成盐。可药用碱加成盐的例子包括钠、钾、钙、铝、有机胺或镁盐或者类似的盐。当本发明的化合物含有相对碱性的功能团时，可以通过在无溶剂或合适的惰性溶剂中用足够量的所需酸与所述化合物的中性形式进行接触获得酸加成盐。可药用酸加成盐的例子包括那些由下述无机酸衍生的盐：盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、重碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸或亚磷酸等等，以及由下述相对无毒的有机酸衍生的盐：乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、延胡索酸、乳酸、扁桃酸(mandelic)、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸等等。还包括诸如精氨酸等的氨基酸的盐，和诸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸的有机酸的盐(参见例如Berge et al.,Journal of Pharmaceutical Science66:1-19(1977))。本发明的某些特定化合物既含有碱性功能团也含有酸性功能团，使得化合物能够转化为碱或者酸加成盐。本领域技术人员已知的其他可药用载体也适用于本发明。

I．经过改造的腺病毒

发明一个方面提供了经过改造的腺病毒。所述改造过的腺病毒可以是p53复制受损型腺病毒。p53复制受损型腺病毒在处于表达p53的细胞内时是复制受损的，当处于p53受损的细胞内时不是复制受损的。术语“复制受损的”用于本文意味着与在p53受损细胞中的病毒复制相比，当处于p53表达细胞时病毒复制是减弱的。p53表达细胞是表达正常水平具有正常活性的p53的细胞。

经过改造的腺病毒还可以是p53复制受损腺病毒和/或E4-ORF3受损的。在一些实施方案中，经过改造的腺病毒是p53复制受损的和E4-ORF3受损的。经过改造的腺病毒可以是分离的腺病毒。术语“经过改造的腺病毒”是指含有自然界中没有的基因序列的腺病毒(例如非野生型腺病毒)。在一些实施方案中，经过改造的腺病毒是重组腺病毒。

术语“p53复制受损型”用于本文意味着当感染细胞时，在有正常水平的活性细胞性p53的情况下，腺病毒复制被部分或全部减弱。例如，如果被感染细胞是p53受损的(即被感染细胞不能表达正常水平的功能完全的p53)，p53复制受损型腺病毒的复制可以正常进行。相反，如果细胞表达正常水平的有功能的p53(例如具有正常活性的p53，文中又称为“p53表达细胞”)，p53复制受损型腺病毒的复制被弱化或者阻止。如果不能表达正常水平的p53(例如突变发生在p53基因的调控区(例如启动子))或者表达具有低于正常p53活性的突变p53，细胞可以是p53受损的。在相同类型的健康非疾病细胞中可以发现正常水平的p53和正常的p53活性水平。因此，在一些实施方案中，p53受损细胞包含突变的p53基因。在一些相关实施方案中，p53受损的细胞包含的基因组中p53基因被完全或者部分缺失。p53受损细胞可以是癌症(例如肿瘤)细胞。

术语“E4-ORF3受损的”用于本文意味着腺病毒不能产生正常水平和/或功能完全的E4-ORF3基因产物。例如，如果不能表达正常水平的SEQ IDNO:1中给出的E4-ORF3基因产物(例如突变发生在E4-ORF3基因的调控区(例如启动子))或者表达具有低于正常E4-ORF3基因产物活性的突变E4-ORF3基因产物，病毒可以是E4-ORF3受损的。因此在一些实施方案中，E4-ORF3受损腺病毒包含突变的E4-ORF3基因。在一些相关实施方案中，E4-ORF3受损腺病毒包含的基因组中E4-ORF3基因被完全或者部分缺失。没有其他限制，一个受损E4ORF3蛋白的例子是E4ORF3蛋白，其中SEQ IDNO:1中给出的氨基酸残基82被突变(图32)。

在一些实施方案中，腺病毒还是E1B-55k受损的。术语“E1B-55k受损的”用于本文意味着腺病毒不能产生正常水平的和/或功能完全的SEQ IDNO:2中给出的E1B-55k基因产物。例如，如果不能表达正常水平的E1B-55k基因产物(例如突变发生在E4-ORF3基因的调控区(例如启动子))或者表达具有低于正常E4-ORF3基因产物活性的突变E1B-55k基因产物，病毒可以是E1B-55k受损的。E1B-55k基因产物和E4-ORF3基因产物的正常水平和活性是相同类型的野生型腺病毒(例如未突变腺病毒)能够产生的水平和活性。因此，在一些实施方案中，E1B-55k受损的腺病毒包含突变的E1B-55k基因。在一些相关实施方案中，E1B-55k受损腺病毒包含的基因组中E1B-55k基因被完全或者部分缺失。

有各种确定蛋白(比如p53、E1B-55k基因产物、E4-ORF3基因产物)水平和活性的检验方法可以使用，比如扩增/表达方法、免疫组织化学方法、FISH和脱落抗原法、Southern印迹或者PCR技术。此外，可以利用体外诊断方法来评估蛋白表达和扩增，例如通过给予能够结合待检测蛋白并且带有可检测标记(例如放射性同位素)的分子(比如抗体)，给患者外部扫描来定位标记。因此，测量细胞内蛋白水平的方法通常是已知的，可以用于评测与本文提供的方法和组合物有关的蛋白水平和/或活性。

发明另一方面提供了细胞，其中所述细胞已经感染了如上所述的经过改造的腺病毒。在一些实施方案中，细胞已经被以上描述的经过改造的腺病毒转化。在某些实施方案中，细胞由于摄入、并入或者表达了以上描述的经过改造的腺病毒的遗传物质而发生遗传改变。

在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞，比如人细胞。在一些实施方案中，腺病毒是哺乳动物腺病毒，比如人腺病毒。在一些实施方案中，细胞是两栖动物细胞(例如青蛙细胞)或者爬行动物细胞(例如蛇细胞)。

不受任何具体机制论的限制，病毒E1B-55k和E4-ORF3基因产物被认为能够减轻细胞p53介导的效应，包括应答病毒感染时的细胞凋亡。因此，病毒E1B-55k和E4-ORF3基因产物可以是起到减少细胞中的p53水平、细胞中的p53活性或者参与p53介导事件的蛋白(例如MDM2、FAS、PIG3、TP53INP1、BTG2、LRDD/PIDD、HRH1、RNASE7和JMJD1C的蛋白基因产物)的活性水平的作用。因此，在一些实施方案中，本文提供的经过改造的腺病毒在具有正常p53活性的细胞内不能有效地复制，但能够在具有减少的p53活性的细胞(例如癌细胞)内复制。

本文还提供了编码以上描述的经过改造的腺病毒的核酸。在一些实施方案中，提供了一个编码经过改造的腺病毒的核酸(例如质粒)。在其他实施方案中，提供了复数个编码经过改造的腺病毒的核酸(例如复数个质粒)。

II．癌症治疗方法

发明另一方面提供了治疗癌症的方法。方法包括将有效量(例如治疗有效剂量或者用量)的经过改造的腺病毒(如上所述)或者一或多个编码经过改造的腺病毒的核酸给予有需要的受试对象。

在一些实施方案中，癌症是p53相关癌症。本文描述的“p53相关癌症”是由p53受损癌细胞导致的癌症。因此，在一些实施方案中，本文中需要治疗的癌症可以特征在于p53的表达或者活性降低(例如p53蛋白的表达低于正常或者低水平)或者在于所表达的p53具有低(或者没有)活性或者低于正常的活性。确定癌症是否是p53受损癌细胞的方法是本领域已知的，通常适合与本文提供的方法和组合物联合使用。

在一些实施方案中，癌症是肺癌、皮肤癌或者乳腺癌。在一些实施方案中，需要治疗的癌症是恶化前的乳腺癌。

III．给药方法和制剂

按照已知方法将经过改造的病毒(或者一或多个编码经过改造的腺病毒的核酸)给予人患者，比如以例如大丸剂的静脉内给药，或者通过一段时间内连续输注，通过肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、动脉内、滑液内、鞘内、口、表面、瘤内或者吸入途径。给药可以是局部或者系统性的。

用于给药的组合物通常包含本文描述的试剂(例如经过改造的腺病毒或者一或多个编码经过改造的腺病毒的核酸)，所述试剂溶解在可药用载体，优选水性载体中。有多种水性载体可供使用，例如缓冲盐等。这些溶液是无菌的，通常不含有不需要的物质。这些组合物可以通过常规的众所周知的灭菌技术来灭菌。组合物可以含有为了接近生理条件而需要的可药用辅助性物质，比如pH调节和缓冲剂、毒性调节剂等，例如醋酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中活性成分的浓度可以变化很大，主要根据具体的给药方式和患者的需求，在液体体积、粘度、体重等的基础上选择。

因此，典型的用于静脉内给药的药物组合物会根据试剂而改变。制备可以通过肠胃外给药的组合物的实际方法对本领域技术人员是已知的或者显而易见的，在诸如Remington's Pharmaceutical Science,15th ed.,MackPublishing Company,Easton,Pa.(1980)的出版物中有更详细描述。

根据给药方法，药物组合物可以按照各自单位剂量形式进行给药。例如，适合经口给药的单位剂量形式包括，但不限于粉末、片剂、药丸、胶囊和锭剂。

药物制剂，特别是经过改造的病毒的药物制剂可以通过将具有所需纯度的改造过的腺病毒(或者一或多个编码经过改造的腺病毒的核酸)与任选的可药用载体、赋形剂或者稳定剂进行混合来制备。这类制剂可以是冻干的制剂或者水溶液。可接受的载体、赋形剂或者稳定剂在所用的剂量和浓度对接受者是无毒的。可接受的载体、赋形剂或稳定剂可以是醋酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂(例如抗坏血酸)保存低分子量多肽；蛋白，比如血清白蛋白或者明胶，或者亲水性多聚物，比如聚乙烯吡咯烷酮；和氨基酸，单糖、二糖和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂；和离子型和非离子型表面活性剂(例如聚山梨醇酯)；可成盐的抗衡离子，比如钠；金属复合体(例如Zn蛋白复合体)；和/或非离子型表面活性剂。经过改造的腺病毒(或者一或多个编码经过改造的腺病毒的核酸)可以按照任何合适的感染单位浓度来成剂。

制剂还可以提供其他的活性化合物，包括化疗剂、细胞毒性剂、细胞因子、生长抑制剂和抗激素剂。

组合物可以用于治疗或预防处置的给药。在治疗性应用中，将组合物以“治疗有效量”给予患有疾病(例如癌症)的患者。对这种用途有效的量取决于疾病的严重程度和患者的整体健康状况。根据患者需要并且能够忍受的剂量和频率将组合物进行单次或者多次给药。本发明的“患者”或者“受试对象”包括人和其他动物，特别是哺乳动物。因此，方法适用于人治疗和兽医应用。在优选实施方案中，患者是哺乳动物，优选灵长类，在最优选的实施方案中，患者是人。其他已知的癌症疗法可以与本发明的方法联用。例如，按照发明使用的组合物还可以用于寻靶或者使细胞对其他癌症治疗剂(比如5FU、长春碱、放线菌素D、顺铂、甲氨喋呤等)敏感。

在其他实施方案中，发明的方法与其他癌症疗法、放疗、激素疗法或者化疗一起联用。

联合给药考虑了使用分开的制剂或者单一药物制剂进行的同时给药，和按照任意顺序的连续给药，其中优选有一段时期两种(或者全部)活性剂同时发挥它们的生物活性。

适合口服给药的制剂可以由下述构成：(a)液体溶液，比如悬浮在稀释剂(比如水、盐水或者PEG400)中的有效量包裹的核酸；(b)胶囊、药包或片剂，每个含有预先确定量的活性成分，比如液体、固体、颗粒或明胶；(c)在合适液体中的悬浮物；和(d)合适的乳化剂。片剂形式可以包括乳糖、蔗糖、甘露糖、山梨醇、磷酸钙、玉米淀粉、马铃薯淀粉、微晶纤维素、明胶、胶体二氧化硅、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸和其他赋形剂、着色剂、填充剂、粘合剂、稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂、调味剂、染料、崩解剂和药学上相容的载体中的一或多个。锭剂形式可以包含某个风味(例如蔗糖)的活性成分，以及包含处于惰性基质(如明胶和甘油或者蔗糖和阿拉伯胶、胶等)中的活性成分的锭剂，除了活性成分，还含有本领域已知的载体。

经过改造的腺病毒(或者一或多个编码经过改造的腺病毒的核酸)可以单独或者与其他合适的成分组合制成气溶胶制剂(即它们可以被“喷雾化”)以便经由吸入给药。气溶胶制剂可以被放入压缩的可接受推进剂中，比如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等。

用于直肠给药的合适制剂包括例如栓剂，其由包裹的核酸和栓剂基质构成。合适的栓剂基质包括天然或合成的三甘油酯或链烷烃。此外，还可以使用明胶直肠用胶囊，其由选中的化合物组合与基质(包括例如液体三甘油酯、聚乙二醇和链烷烃)构成。

适合肠胃外(比如例如通过关节内)给药的制剂包括水性和非水性、等渗压无菌注射液，其可以包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使制剂与接受者血液等渗的溶质，以及可以包含悬浮剂、助溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性无菌悬浮液，其中所述肠胃外给药是例如通过关节内(在关节中)、静脉内、肌内、瘤内、皮内、腹膜内和皮下途径。在实施本发明时，可以将组合物通过例如静脉内输注、经口、表面、腹腔内、膀胱内、瘤内或者鞘内给药。肠胃外给药、瘤内给药后静脉内给药是优选的给药方法。化合物制剂可以处于单位剂量或者多剂量密封的容器内，比如安瓿和小管。

注射液和悬浮液可以由无菌粉末、颗粒和前面描述过的类型的片剂制备。用于离体疗法的转导或者感染了腺病毒或者转染了核酸的细胞也可以如上所述通过静脉内或者肠胃外给药。

优选药学制品处于单位剂量形式。在这种形式中，制品被分为含有合适量活性成分的单位剂量。

优选的药学制品递送一或多个活性的经过改造的腺病毒(或者一或多个编码经过改造的腺病毒的核酸)，任选与一或多个化疗剂或者免疫治疗剂在缓释制剂中组合。一般来说，经过改造的腺病毒(或者一或多个编码改造过的腺病毒的核酸)被作为敏化剂给予，所述敏化剂使肿瘤细胞对其他细胞毒癌症疗法(包括化疗、放疗、免疫疗法和激素疗法)的易感性提高。

在处置癌症的治疗用途中，本发明的药学方法中使用的经过改造的腺病毒(或者一或多个编码改造过的腺病毒的核酸)可以按照每天大约0.001mg/kg到大约1000mg/kg的初始剂量给予。可以使用大约0.01mg/kg到大约500mg/kg，或者大约0.1mg/kg到大约200mg/kg，或者大约1mg/kg到大约100mg/kg，或者大约10mg/kg到大约50mg/kg的每日剂量范围。但是剂量可以根据患者的需要、要处理的状况的严重程度和应用的化合物变化。例如，可以考虑特定患者中诊断的癌症阶段来根据经验确定剂量。在本发明的语境中给予患者的剂量应当足够在患者中随时间产生有益的治疗反应。剂量的大小还可以通过特定患者中伴随给予的特定载体或转导细胞类型的任何副作用的存在、属性和程度来确定。确定特定情形的合适剂量是医务人员能力以内的。通常，治疗以比化合物最佳剂量少的较小剂量开始。然后，以小的增加提高剂量直至达到最佳效果。为了方便，如果需要可以将总的每日剂量分开，在一天内分成几份给予。

按照发明使用的药物制品一般是递送给哺乳动物，包括人和非人哺乳动物。使用所述方法处置的非人哺乳动物包括驯养的动物(即猫、犬、鼠、啮齿目和兔形目)和农业动物(牛、马、羊、猪)。

实施例

以下实施例仅用于阐述，而不是限制发明。

迫切需要鉴定新类型的能够确实地除去癌细胞而不伤害正常细胞的药物和治疗方法。对病毒进行改造，从而能够驻扎到肿瘤细胞受体上并选择性地在肿瘤块内复制(溶瘤病毒)有极大的潜力作为溶癌疗法。“溶瘤病毒”的建立可以通过利用癌症突变和腺病毒蛋白之间深厚的功能重叠来实现。在临床试验中，这些药剂的第一个原型已经展现出有前景的效力。不希望受限于任何理论，相信现在可以利用对推动肿瘤和病毒复制的分子机制的临床经验和新观点来开发有强力和改善的治疗性能的新病毒。不幸的是，以前构建这类病毒的方法学未能实现这个目的。相应地，文中提供了能够快速产生和寻靶治疗用病毒的技术。本文提供的是新的基因编码的可诱导性化学适配系统，其能够将感染导靶到多个细胞受体。溶瘤病毒疗法有潜力破坏任何大小的肿瘤块，但需要病毒能够穿越脉管系统，感染从一个癌细胞扩散到另一个。因此，以前的腺病毒载体的摄入对单一细胞受体的依赖限制了它们的治疗潜力。改变病毒衣壳的化学性能和结合从而使感染可以特异地寻靶到任何细胞类型是个极大的突破。这一点通过利用癌症药物雷帕霉素的已知性能将带有FKBP和FRB结构域的异源蛋白二聚体化(例如，表达纤维蛋白-FRB衣壳蛋白的病毒与融合FKBP的重新寻靶配体)。这些病毒在经过雷帕霉素处理时能够经由多个重新寻靶配体感染细胞，这是作为新的癌症疗法的化学和病毒武器的合理和有力组合。并且，这些技术使得能够通过腺病毒感染在任何细胞类型中进行多蛋白复合体和完整途径的组装、递送和共表达。这些技术可以开发特异杀伤p53突变肿瘤和恶化前乳腺癌细胞的“新一代”溶瘤病毒，具有挽救众多癌症患者生命的潜力。

A.在细胞染色质沉默p53活性

p53最初被发现是DNA病毒蛋白SV40Large T抗原的细胞靶分子。但是尽管对p53的研究有30年，还是没有完全了解决定p53转录激活的关键因素。p53在正常细胞中是组成型表达，其活性受到高度调节的p53蛋白降解的限制。p53转录激活是在应答癌基因和DNA损伤信号时被引发的，这两者都能稳定p53。这造成一般的观点认为p53水平的诱导和磷酸化与p53在细胞染色质中靶启动子上的转录活性是同义的。正因如此，p53水平的诱导被解读为p53的活化，并且是多种癌症疗法的原理，包括放射和基因毒性药物、MDM2拮抗剂(比如nutlin)和E1B-55k缺失的溶瘤腺病毒疗法ONYX-015。

腺病毒E1B-55k结合p53的反式激活结构域并将p53导靶到腺病毒感染细胞内的降解。E1B-55k在细胞转化分析中能够有效地抑制p53，被认为对于腺病毒复制中p53灭活很重要。ΔE1B-55k突变病毒dl1520/ONYX-015在感染细胞内诱导高p53水平。在此基础上，在患者中测试了ONYX-015作为p53肿瘤选择性病毒癌症疗法，目前在多个国家已获得批准(现在的名称为Oncorine)。然而，E1B-55k病毒在RNA输出中，而不是p53灭活中的功能的丢失才是ΔE1B-55k肿瘤选择性的主要决定因素。与预期相反，我们发现虽然p53在感染了ΔE1B-55k的原代小气道上皮细胞(SAECs)中积累到高水平，腺病毒感染的生理靶细胞群，p53转录靶比如p21、MDM2、CyclinG、14-3-3σ、PERP、PIG3和GADD45不被诱导(图1a)。不能活化p53转录靶不是p53调节的组织特异性效果，p53在感染ΔE1B-55k的原代乳房上皮细胞和支气管上皮细胞中也更加稳定，但不能诱导p21(补充图1)。在ΔE1B-55k U2OS肿瘤细胞中得出了类似的结论，p53在所述细胞中被诱导在细胞核内达到高水平(图1b)，但与多柔比星处理(图1c和补充图2)相反，未能引发下游转录靶物，比如p21和MDM2的表达。这些数据显示p53降解的丢失导致感染腺病毒的细胞中的高p53水平，但尽管如此，p53转录靶的诱导被抑制到和带有p53肿瘤突变(C33A、MDA-MB-231和HCT-116p53-/-)的细胞系相似的程度(补充图2)。这揭示了我们对腺病毒生物学以及p53活化的理解还存在基本的分歧。

细胞和病毒癌基因(比如Ras和腺病毒E1A)通过引发ARF的表达来活化p53。ARF抑制MDM2导致p53水平的诱导和p53转录靶的活化。ARF在58%的人类癌症，主要是那些保留了野生型p53的癌症中发生丢失，这在以前已经被认为是阻止p53在感染ΔE1B-55k的肿瘤细胞中的活化的关键因素。利用其中ARF通过IPTG得到调节的U2OS稳定细胞系(p53野生型、ARF阴性)，我们显示了在模拟感染细胞中ARF表达稳定了p53并且激活p21的转录。然而，尽管ARF的诱导和基础的p53活性，p21水平在野生型和感染Δ55k的细胞中仍然被抑制到相似的水平(图1d)。而且，在感染ΔE1B-55k的原代SAECs中，内源ARF表达也未能激活p53转录靶(图1a)。因此，即使在腺病毒感染的细胞中表达E1B-55k和ARF，p53被灭活。

DNA损伤信号在激活p53、引发p53磷酸化和蛋白稳定中也起到关键的作用。我们推测单独p53水平的诱导不足以激活ΔE1B-55k感染的细胞中的p53，还需要DNA损伤信号。在临床试验中，ΔE1B-55k突变病毒ONYX-015与基因毒性化疗剂比如5-氟尿嘧啶(5-FU)组合使用。因此，我们测试了DNA损伤信号是否是激活ΔE1B-55k感染细胞中的p53靶所必需的。我们显示了用5-FU进行的处理未能活化ΔE1B-55k感染的U2OS细胞中的p53(图2a)。考虑到许多肿瘤细胞中DNA损伤检查点被突变破坏，我们还分析了原代细胞，结果显示p53转录靶在ΔE1B-55k感染的SAECs中占优势地被抑制，不能被γ照射(图2b)、UV照射(补充图3)或多柔比星(图2d)活化。

应答DNA损伤时的p53活化是由激酶，比如ATM、ATR、DNA-PKcs、CHK1和CHK2介导的，这些酶在关键残基将p53磷酸化。例如，p53在丝氨酸15和20的磷酸化可以移走MDM2，阻止了p53的降解，而其他位点的磷酸化增强了p53在靶启动子结合DNA。因此，DNA损伤未能激活ΔE1B-55k感染细胞中高水平的p53的可以解释是p53磷酸化在病毒感染时被抑制。然而，即使没有内源基因毒性胁迫的诱导，在ΔE1B-55k感染的原代细胞中，p53已经在多个DNA损伤活化的激酶的靶位点被高度磷酸化(图2c)。因此，在没有E1B-55k的情况下，癌基因和DNA损伤信号引发了p53的稳定化和磷酸化，但尽管如此，p53从生物学上说是惰性的，不能活化下游效应分子的转录。

我们接下来检验了在没有E1B-55k的情况下，在腺病毒感染细胞中MDM2是否能够结合并灭活p53。Nutlin是MDM2的小分子拮抗剂，能够抑制MDM2-p53结合和p53降解的诱导。与模拟感染细胞相反，nutlin对MDM2-p53结合的抑制未能进一步稳定p53或者诱导ΔE1B-55k感染的SAECs中的p21水平(图2d)。这些结果与ΔE1B-55k感染的U2OS细胞中ARF的过表达不能活化p53(图1d)是一致的。

综合起来，我们的数据显示p53靶启动子的转录活化在腺病毒感染细胞中被抑制，即使p53被诱导。组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂曲古菌素A(TSA)是一种通用转录活化分子，能够诱导p21(以及多个其他细胞基因)的表达。在模拟物感染的原代细胞中，TSA不依赖p53稳定或磷酸化地诱导p21表达(图2d)。相反，在ΔE1B-55k感染的细胞中，TSA不能诱导p21的转录。我们得出结论，在腺病毒感染的细胞中，无论E1B-55k，p53转录靶主要被抑制而且不能在应答辐射、基因毒性药物、ARF、MDM2拮抗剂或者HDAC抑制剂时被激活。准确地解释这个机制对于理解p53的活化，以及如果操纵它来进行癌症治疗都是重要的。

我们的数据强烈表明有一个以前没有发现的腺病毒蛋白在独立于E1B-55k和p53降解的情况下灭活p53。为了验证这一点，我们使用了遗传学方法，将带有E1B-55k和其他早期病毒基因复合突变的原代细胞感染腺病毒后筛选p53活化(补充图4)。我们发现除了缺失E1B-55k，腺病毒感染细胞中p53的活化需要丢失E1A(E1A-13s)或E4-ORF3的13s剪接形式(图3a)。我们发现在E1B-55k之外，腺病毒编码两个能够灭活p53的病毒蛋白令人惊讶，特别是因为E1A是细胞转化研究中引发p53活化的强力癌基因。在腺病毒感染中，E1A的替代13s剪接形式是反式激活其他早期病毒基因，包括E4-ORF3所必需的(图3a)。因此，我们设想E1A-13s通过诱导E4-ORF3在病毒感染中的表达来灭活p53。与这个假想相符，我们显示与Ad-GFP相反，E4-ORF3的异位表达足够挽救ΔE1B-55k/ΔE4-ORF3和ΔE1B-55k/ΔE1A-13s感染细胞中的p53灭活(图3b)。ΔE1B-55k/ΔE4-ORF3共转染细胞中Ad-GFP对p21的轻微减少是由于E1A-13s对E4-ORF3(反式)的部分活化，这在ΔE1B-55k/ΔE1A-13s共感染中不发生(补充图5)。因此，E1A-13s对E4-ORF3表达的诱导经由独立于E1B-55k的机制灭活了腺病毒感染细胞中的p53。

提议的ΔE1B-55k溶瘤腺病毒疗法(ONYX-015(Oncorine))对p53肿瘤的选择性是基于E1B-55k是腺病毒感染细胞中灭活p53所借助的关键和唯一机制。虽然与野生型病毒相比，ΔE1B-55k感染细胞中可以有某些基础p53活性，这里我们显示了额外缺失E4-ORF3是病毒感染原代细胞时程中诱导p53水平从而激活下游靶的转化所必需的(图3c)。p53水平的诱导是激活p53转录靶所必需的，在ΔE4-ORF3感染中(即p53是E1B-55k降解的靶)没有这种情况。而且，我们显示了E4-ORF3阻止了多个p53转录靶的活化，包括细胞周期阻滞、DNA修复和凋亡基因(图3d)。相对模拟物感染，E4-ORF3抑制某些p53靶(比如p21)的转录，并且阻止其他靶(比如PUMA和MDM2)的诱导。与p53转录靶相反，p53mRNA水平的转录诱导和管家基因GUSB的稳定态mRNA水平不被E4-ORF3影响(补充图6)。利用含有坡那甾酮诱导性p53的p53无效突变稳定细胞系(H1299-D1)(图3e和补充图7)，我们显示了p21和MDM2在ΔE1B-55k/ΔE4-ORF3感染细胞中的诱导在没有E4-ORF3的情况下是p53依赖性的，不是全面转录活化的结果。由于H1299-D1细胞表达p53cDNA，这些试验还证明E4-ORF3不能通过诱导替代的p53剪接形式来灭活p53。我们得出结论，E4-ORF3在灭活p53中具有关键和新的作用，该作用独立于E1B-55k和p53降解。

诸如E1B-55k、SV40LT和HPV E6的DNA肿瘤病毒蛋白通常是经由高亲和力蛋白-蛋白相互作用而灭活p53的。但是，与这个成熟的模式相反，E4-ORF3不与p53共定位(补充图8)。而且，与E1B-55k相反，在来自病毒感染细胞或者以带有表位标签的构建体转染的细胞的裂解物中，E4-ORF3不与p53共同免疫沉淀。这表明E4-ORF3是经由非标准的机制灭活p53。

p53水平的诱导和磷酸化正常情况下推动p53的四聚体化和构象改变，促进在被它调控的基因的启动子发生序列特异性DNA结合，p53在此召集辅助因子从而激活它们的表达。活性相对失活p53DNA结合结构域(DBD)可以通过分别与单克隆抗体PAb1620相对PAb240的免疫沉淀来区分。在ΔE1B-55k和ΔE1B-55k/ΔE4-ORF3感染细胞中，p53被PAb1620选择性地免疫沉淀(补充图9)，显示p53具有活性的DNA结合结构域蛋白构象，能够结合细胞启动子中的DNA靶位点。为了从功能上确定E4-ORF3能否阻止p53DNA结合，我们用p53荧光素酶报告质粒(p53-luc)转染了U2OS细胞，在细胞内p53与共有DNA序列的结合活化了荧光素酶转录。这些试验的进行是通过在病毒感染的48小时过程中实时测量荧光素酶活性。对照pGL3-荧光素酶报告子(非p53靶启动子)在所有病毒感染中被激活到相似水平(补充图10)。在野生型病毒感染细胞中，p53激活的荧光素酶转录在24小时后被抑制(图4a)，预计是因为p53的降解(图1c)。相反，p53-荧光素酶在ΔE1B-55k和ΔE1B-55k/ΔE4-ORF3感染中均被激活(图4a)。荧光素酶活性的诱导需要p53与DNA的结合，因为含有突变p53应答元件的启动子使荧光素酶活性消失。这些试验表明E4-ORF3不与p53竞争结合共有DNA靶序列或者阻止异位报告质粒中启动子的p53转录活化。

E4-ORF3能够阻止p53对内源靶的转录激活，而不能阻止它对相同细胞中异位荧光素酶的转录激活很难统一(图4b)。质粒DNA与细胞染色质中的DNA受到的架构和包装的限制不同。因此，我们进行了p53染色质免疫沉淀(ChIPs)来确定E4-ORF3是否在细胞染色质的环境中特异性地阻止p53DNA结合。在多柔比星处理和ΔE1B-55k/ΔE4-ORF3感染时，p53与p21(5’和3’位点)和MDM2启动子中的靶位点发生DNA结合，p53以此激活p21和MDM2RNAs的转录(图4b-c)。相反，虽然在ΔE1B-55k感染细胞中p53被诱导到相似的水平，我们显示了E4-ORF3阻止了p53与p21和MDM2启动子中靶位点的DNA结合(图4b-c和补充图11)。结果，p53的诱导未能引发ΔE1B-55k感染细胞中下游效应分子的转录。因此，E4-ORF3在细胞染色质的环境下，通过阻止p53与DNA靶位点的特异结合来灭活p53。

我们推理p53DNA结合不仅取决于p53的蛋白构象，还依赖靶启动子在细胞基因组中的可得性。发育调控的基因通过压紧成异染色质而在胚胎发生中被表观遗传地沉默，从而阻止体细胞中转录因子结合的靠近。异染色质具有组蛋白乙酰化丢失和抑制性组蛋白甲基化标记诱导的特性。我们设想E4-ORF3能够通过在内源靶启动子诱导异染色质，阻止接近p53从而灭活p53。与此一致，组蛋白脱乙酰酶抑制剂TSA不能在ΔE1B-55k感染的原代细胞中诱导p21(图2d)。由此，我们推断E4-ORF3灭活p53调节的启动子是经由对组蛋白脱乙酰抑制显性的一个机制，比如组蛋白甲基化。在癌症中，肿瘤抑制基因(比如p16INK4a)的异常表观遗传沉默被组蛋白H3在赖氨酸9(H3K9)的甲基化所抑制。SUV39H1和SUV39H2(它们之间有59%的氨基酸同一性，具有冗余的功能)对H3K9三甲基化(H3K9me3)的诱导还有的一个重要作用是诱导着丝粒异染色质中DNA的压紧和转录抑制特点。无法区别p53在ΔE1B-55k相对ΔE1B-55k/ΔE4-ORF3感染细胞中的定位(图4d)。然而，在ΔE1B-55k感染细胞中p53被灭活，H3K9me3抑制性异染色质的凝缩区域在细胞核周围被诱导(图4d和补充图12)。在四种已知能够催化H3K9三甲基化的甲基转移酶中，我们显示了SUV39H1和SUV39H231，但不是SETDB132或G9a与ΔE1B-55k感染细胞核中形成离体H3K9me3异染色质结构域特异相关(图4e)。SUV39H1/2相关H3K9me3异染色质结构域的形成需要E4-ORF3，在模拟物或者ΔE1B-55k/ΔE4-ORF3感染细胞中不发生(补充图13-16)。

这些数据显示，E4-ORF3诱导新的SUV39H1和SUV39H2H3K9me3异染色质形成，这使得p53能够接近内源靶启动子。为了直接测试这一点，我们进行了p53和H3K9me3ChIPs。E4-ORF3所诱导的抑制性异染色质与总组蛋白H3或H3K9me3的全面上调无关，所述总组蛋白H3或H3K9me3在模拟物、ΔE1B-55k和ΔE1B-55k/ΔE4-ORF3感染裂解物中的水平相似(图5a)。在ΔE1B-55k/ΔE4-ORF3感染细胞中，我们显示当H3K9me3处于IgG水平(图5a和补充图17)时，p53被诱导结合在p21和MDM2启动子位点(与图4c一致)。相反，在ΔE1B-55k感染细胞中，在p21和MDM2启动子中诱导了H3K9me3并阻止p53的结合。在p21启动子中，还在-5kb区诱导了H3K9me3，而不是只限于p53结合位点(补充图17)。因此在表达E4-ORF3的细胞中，p53和H3K9me3之间在p53调节的启动子上有负相关性。ΔE1B-55k感染细胞中被抑制的其他p53靶得到同样的结论，包括GADD45A、FAS、PUMA和PIG3(补充图17-19)。相反，与模拟物相比，在ΔE1B-55k感染细胞中不会诱导在诸如肌动蛋白和POLR2的非p53调节的启动子中的H3K9me3(补充图17和19)。在ΔE1B-55k/ΔE4-ORF3感染的细胞中，这些启动子上的基础H3K9me3被降低，表明E4-ORF3可以在病毒感染中还限制了全面去甲基酶活性。我们得到结论，E4-ORF3通过诱导p53靶启动子处的离体H3K9me3异染色质沉默来灭活p53，由于不能靠近靶位点，p53无力活化下游效应子的转录。

对哺乳动物和癌症中异染色质形成的诱导仍然只有很少的理解。因此，主要问题是E4-ORF3是如何直接参与诱导p53靶启动子处的抑制性H3K9me3异染色质。E4-ORF3不与p53共定位，在细胞核中形成独特的网状结构(补充图8)。我们显示E4-ORF3限定了ΔE1B-55k感染的肿瘤和原代细胞中离体H3K9me3异染色质结构域的形成。在细胞核中的正交切片揭示E4-ORF3多数情况与H3K9me3相邻，表明它作为新的平台通过瞬时或者长距离相互作用催化异染色质形成(图5b-c和补充图20-21)。利用高分辨率共聚焦显微镜，我们显示E4-ORF3形成了连贯性的支架，随着它在细胞核中的织结能够组织并限定离体异染色质的组装(图5d)。这些数据显示E4-ORF3在协调p53靶启动子的H3K9me3异染色质沉默中的直接作用。而且，它们揭示了一个特别的核支架，所述核支架或者是建立在已有的组织细胞DNA的架构上，或者是将异染色质组装靶向到p53靶启动子的新的病毒结构。

这些数据提出了关于E4-ORF3对p53靶物的沉默的特异性和这一机制对细胞转录的整体后果的问题。因此，为了确定E4-ORF3对细胞转录的特异性和整体性生理后果，我们在原代人静止期SAECs上进行了全基因组表达分析(补充图22和23)。这些研究显示E4-ORF3是当静止期SAECs感染病毒时诱发的全面转录变化中的单独的参与者。在Δ55k和Δ55k/ΔORF3相对模拟物感染的SAECs中，共有1730个重叠基因被上调或下调log倍数改变超过2，这些基因的调控方式类似，反映了共同的转录程序(图6a)。我们显示基因表达中的这些整体变化与细胞周期和E2F激活有关，这预期是由于E1A对肿瘤抑制蛋白RB家族的灭活。这些数据与E1A经由p300和PCAF在参与细胞生长、分裂和DNA合成的基因的启动子处诱导活性组蛋白标记组蛋白H3赖氨酸18乙酰基(H3K18ac)的富集一致。因此，E4-ORF3诱导的异染色质沉默，以及它在整个细胞核内形成的支架不影响病毒感染诱导的细胞转录物的全面活化。

为了明确E4-ORF3特异靶向的基因，我们比较了ΔE1B-55k/ΔE4-ORF3对ΔE1B-55k感染的细胞。E4-ORF3在ΔE1B-55k感染细胞中以log倍数改变2或以上阻止了263个基因的转录活化。为了估计这些中有多少可以受到p53的调控，我们采用了两个标准:它们的启动子中存在共有p53DNA结合位点，和是否相同基因在MDM2拮抗剂nutlin处理的细胞中也被上调(图6b)。我们显示265个被差别上调的基因中71%在应答nutlin时被诱导和/或具有预测的p53结合位点。应答ΔE1B-55k/ΔE4-ORF3和nutlin时被上调的领先转录物的热点图包括与生长抑制和细胞凋亡有关的众所周知的p53靶(MDM2、FAS、PIG3、TP53INP1、BTG2、LRDD/PIDD)，以及新发现的靶(HRH1、RNASE7、JMJD1C)(图6c和补充图24)。有76个被上调的基因既没有预期的p53结合位点，应答nutlin时也未被上调。对E4-ORF3调控的转录物进行的途径分析表明除了p53途径，还有显著高的与免疫调节和组织/血管重塑有关的基因。这些数据表明可以作为整体抗病毒转录沉默程序的一部分，E4-ORF3靶向p53启动子，这与ΔE1B-55k/ΔE4-ORF3的高度缺陷性复制一致(补充图25)。

我们的研究结论挑战了一般的假设，即p53诱导和磷酸化等同于p53活性，这一假设正是几种针对p53的癌症疗法的前提。我们的数据揭示p53灭活的一种新的和主要的机制，这种机制通过人类体细胞中p53靶启动子的定向表观遗传沉默发挥作用。我们鉴定到了病毒蛋白E4-ORF3，该蛋白形成新的贯穿细胞核的支架并引导在p53靶启动子处的SUV39H1/2H3K9me3异染色质的组装从而在应答基因毒性和癌基因胁迫时沉默p53活化的转录(图6d)。不寻常的是这个抑制性的细胞核网能够选择性地捕获p53和抗病毒基因，在推动病理性细胞和病毒复制的整体转录变化的背景下进行。

腺病毒E1B-55K靶向p53进行蛋白酶体降解。然而，E4-ORF3通过沉默p53靶启动子独立于E1B-55K灭活p53。因此，要活化腺病毒感染细胞中的p53需要将E1B-55K和E4-ORF3都缺失。申请人的结构和寡聚化研究揭示有活性地折叠形成了E4-ORF3N82A突变蛋白，但它采取了会阻止更高阶寡聚化的闭合构型。因此为了确定是否E4-ORF3的更高阶组装是p53灭活所必需的，我们构建了新的腺病毒，其中的E1B-55K被无效并且表达E4-ORF3N82A替代野生型E4-ORF3。E4-ORF3阻止ΔE1B-55K感染细胞中p53激活p21和MDM2的转录(图32A)。相反，在ΔE1B-55K/E4-ORF3N82A感染的细胞中，E4-ORF3不能进行更高阶寡聚化和灭活p53(图32A)。在不同类型的p53靶分子中得到了类似的结论。因此，E4-ORF3N82A表现为一个完全无效突变。申请人得到结论是E4-ORF3的更高阶寡聚化对灭活p53介导的基因表达非常关键。

腺病毒早期蛋白和肿瘤突变之间有深厚的功能重叠，这一点导致鉴定到许多关键的生长调控机制，包括E2F和p300/CBP组蛋白乙酰转移酶。因此，一个主要问题是E4-ORF3是否反映或昭示了一个还审查着正常细胞或肿瘤发生中p53转录活性的已有机制和核结构。惊人的是E4-ORF3的所有已知细胞靶-PML39、MRE11/RAD50/NBS1(MRN)DNA损伤/修复复合体和Tif1α也被肿瘤突变破坏。一个有趣的猜测是E4-ORF3将几个已知和可以尚待发现的癌症途径突变的抑制效应进行了物理上的整合，这些抑制效应一起在沉默p53活性中具有新型的功能。与利用病毒蛋白发现p53类似，E4-ORF3提供了一个有力的动态探测分子，可以用于确定在人类体细胞中诱导p53靶启动子的离体和定向表观遗传沉默的关键细胞因素。这对于理解高p53水平如何在癌细胞中可以也被灭活以及肿瘤发生中诱导肿瘤抑制基因座的异常表观遗传沉默有重要的含义。最后，我们对E4-ORF3的鉴定改变了p53在腺病毒感染细胞中是如何被灭活的基本概念，这是一个重要的机械洞察，利用它现在可以合理地开发真正的p53肿瘤选择性腺病毒疗法。

Claims (13)

1.p53复制受损和E4-ORF3受损的腺病毒。

2.如权利要求1所述的腺病毒，其中所述腺病毒是分离的。

3.如权利要求1所述的腺病毒，其中所述腺病毒是重组腺病毒。

4.如权利要求1所述的腺病毒，包含被突变的E4-ORF3基因。

5.如权利要求4所述的腺病毒，其中E4-ORF3基因或者其功能部分被缺失。

6.如权利要求1所述的腺病毒，其中所述E4-ORF3受损的腺病毒也是E1B-55k受损的。

7.如权利要求6所述的腺病毒，包含被突变的E1B-55k基因。

8.如权利要求7所述的腺病毒，其中E1B-55k基因或其功能部分被缺失。

9.感染了权利要求1所述的E4-ORF3受损的腺病毒的细胞。

10.癌症治疗方法，所述方法包括将有效量的权利要求1所述腺病毒给予需要的受试对象。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述癌症是p53相关癌症。

12.如权利要求10所述的方法，其中所述癌症是肺癌、皮肤癌或者乳腺癌。

13.如权利要求10所述的方法，其中所述要治疗的癌症是恶化前乳腺癌。

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