JP2018518986A - 腫瘍溶解性hsv1ベクターおよび使用法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、35 U.S.C. §119(e)の下で、2015年5月04日に出願された米国仮特許出願第62/156,447号の恩典を主張するものであり、その内容は全体として参照により本明細書に組み入れられる。
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出され、全体として参照により本明細書に組み入れられる配列表を含む。2016年4月21日に作成された該ASCIIコピーは、043214-084831-PCT_SL.txtと命名され、221,995バイトの大きさである。
本発明は、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス1型 (HSV-1) を用いて患者の脳のがんを処置する組成物および方法に関する。
多くの悪性腫瘍、例えば、悪性神経膠腫、および肺がんなどの再発性全身性固形腫瘍は、従来の治療法に対して本質的に抵抗性であり、重要な治療課題を提示している。悪性神経膠腫は最も多く見られる原発性脳腫瘍であり、年間発生率は100,000人に6.4症例である。これらの神経学的に壊滅的な腫瘍は、原発性脳腫瘍の最も一般的な亜型であり、最も致命的なヒトがんの1つである。侵襲性の最も高いがん徴候である多形性膠芽腫 (GBM) においては、最大限の治療努力にもかかわらず、患者の平均生存期間は14カ月である。最悪性型の脳腫瘍(悪性神経膠腫/多形性膠芽腫、GBM)に対する処置は、長期にわたる管理を提供することができず、手術、放射線照射、および化学療法などの種々の処置にもかかわらず、罹患患者の50%が診断から15カ月以内に死亡する。種々の実験的処置が試行されてきた。これらの難治性腫瘍の多くに対して使用可能な優れた治療選択肢はわずかしかないため、新規でかつ革新的な治療アプローチの探索が重要である。
本明細書において引用される参考文献はすべて、あたかも十分に記述されているかのように、その全体が参照により組み入れられる。本明細書において別途定義されない限り、本出願に関連して使用される科学用語および技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって共通して理解されている意味を有する。本発明が、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコール、および試薬等に限定されず、したがって変動し得ることが、理解されるべきである。一般用語の定義は、Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3rd ed., J. Wiley & Sons New York, NY (2001);March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 5th ed., J. Wiley & Sons New York, NY (2001);Michael Richard Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012);Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (2012);Jon Lorsch (ed.) Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Elsevier, (2013);Frederick M. Ausubel (ed.), Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), John Wiley and Sons, (2014);John E. Coligan (ed.), Current Protocols in Protein Science (CPPS), John Wiley and Sons, Inc., (2005);およびEthan M Shevach, Warren Strobe, (eds.) Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, John Wiley and Sons, Inc., (2003) において見出すことができ、そのそれぞれが、本出願において使用される用語の多くに対する一般的な手引きを当業者に提供する。
公開された結果から、ヘルペスγ34.5遺伝子(あるいはγ134.5遺伝子としても公知である)の少なくとも1つの機能が、ウイルス感染に対する宿主細胞の応答を妨げること、すなわちアポトーシス様応答における宿主タンパク質合成遮断の誘発を妨げることであることが実証された(Chou, J., et al., Science 250:1262-1266 (1990);Chou, J. and Roizman, B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3266-3270 (1992);Chou, J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:10516-10520 (1995))。類似の機能は、病原性ウイルスの間にも広まっている(Cosentino, G. P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9445-9449 (1995);Gale, M., Jr., et al., Mol. Cell Biol. 18:5208-5218 (1998);Katze, M. G., et al., Trends Microbiol. 3:75-78 (1995); Sharp, T. V., et al., Nuc. Acids Res. 21:4483-4490 (1993))。
項目1. (a) γ34.5をコードする遺伝子の両コピーにおける欠失または不活性化変異;および
(b) ネスチンプロモーターの転写制御下へのHSV γ34.5遺伝子の少なくとも1コピーの挿入;および
(c) HSVウイルスタンパク質ICP6をコードする遺伝子における欠失または不活性化変異
を含み、緑色蛍光タンパク質を発現しない、腫瘍選択的腫瘍溶解性ヘルペスウイルスベクター。
項目2. UL39核酸調節配列を含まない、項目1に記載の腫瘍選択的腫瘍溶解性ヘルペスウイルスベクター。
項目3. ICP6の融合タンパク質を含まない、項目1または2に記載の腫瘍選択的腫瘍溶解性ヘルペスウイルスベクター。
項目4. ネスチンプロモーターの転写制御下の前記γ34.5遺伝子の少なくとも1コピーが、リボヌクレオチド還元酵素の大サブユニットICP6をコードするUL39遺伝子に挿入されている、項目1〜3のいずれかに記載の腫瘍選択的腫瘍溶解性ヘルペスウイルスベクター。
項目5. 前記ネスチンプロモーターがSEQ ID NO: 2またはその縮重変種を含む、項目1〜4のいずれかに記載の腫瘍溶解性発現ベクター。
項目6. SEQ ID NO: 1の配列またはその縮重変種を含む、項目1に記載の腫瘍選択的腫瘍溶解性ヘルペスウイルスベクター。
項目7. 項目1〜6のいずれかに記載の腫瘍選択的腫瘍溶解性ヘルペスウイルスベクターの近傍に導入する段階を含む、対象における頭蓋内腫瘍細胞を選択的に死滅させるための方法。
項目8. シクロホスファミド (CPA) を投与する段階をさらに含む、項目7に記載の方法。
項目9. 前記CPAが、前記腫瘍溶解性ヘルペスウイルスベクターの2日前に投与される、項目7または8に記載の方法。
項目10. 前記腫瘍細胞が神経膠芽腫細胞を含む、項目7〜9のいずれかに記載の方法。
項目11. 前記腫瘍細胞ががん幹細胞を含む、項目7〜10のいずれかに記載の方法。
項目12. 前記対象が哺乳動物である、項目7〜11のいずれかに記載の方法。
項目13. 前記対象がヒトである、項目7〜12のいずれかに記載の方法。
項目14. 対象における頭蓋内腫瘍細胞の処置に使用するための腫瘍選択的腫瘍溶解性ヘルペスウイルスベクターであって、
(d) γ34.5をコードする遺伝子の両コピーにおける欠失または不活性化変異;および
(e) ネスチンプロモーターの転写制御下へのHSV γ34.5遺伝子の少なくとも1コピーの挿入;および
(f) HSVウイルスタンパク質ICP6をコードする遺伝子における欠失または不活性化変異
を含み、緑色蛍光タンパク質を発現しない、腫瘍選択的腫瘍溶解性ヘルペスウイルスベクター。
項目15. UL39核酸調節配列を含まない、項目14に記載の腫瘍選択的腫瘍溶解性ヘルペスウイルスベクター。
項目16. ICP6の融合タンパク質を含まない、項目14または15に記載の腫瘍選択的腫瘍溶解性ヘルペスウイルスベクター。
項目17. ネスチンプロモーターの転写制御下の前記γ34.5遺伝子の少なくとも1コピーが、リボヌクレオチド還元酵素の大サブユニットICP6をコードするUL39遺伝子に挿入されている、項目14〜16のいずれかに記載の腫瘍選択的腫瘍溶解性ヘルペスウイルスベクター。
項目18. 前記ネスチンプロモーターがSEQ ID NO: 2またはその縮重変種を含む、項目14〜17のいずれかに記載の腫瘍溶解性発現ベクター。
項目19. SEQ ID NO: 1の配列またはその縮重変種を含む、項目14〜18のいずれかに記載の腫瘍選択的腫瘍溶解性ヘルペスウイルスベクター。
項目20. 前記腫瘍細胞が神経膠芽腫細胞を含む、項目14〜19のいずれかに記載の腫瘍選択的腫瘍溶解性ヘルペスウイルスベクター。
項目21. 前記腫瘍細胞ががん幹細胞を含む、項目14〜20のいずれかに記載の腫瘍選択的腫瘍溶解性ヘルペスウイルスベクター。
項目22. 前記対象が哺乳動物である、項目14〜21のいずれかに記載の腫瘍選択的腫瘍溶解性ヘルペスウイルスベクター。
項目23. 前記対象がヒトである、項目14〜22のいずれかに記載の腫瘍選択的腫瘍溶解性ヘルペスウイルスベクター。
項目24. 前記ベクターがSEQ ID NO: 7を含まない、項目1〜23のいずれかに記載の腫瘍選択的ウイルス。
項目25. 前記ベクターがSEQ ID NO: 8を含む、項目1〜23のいずれかに記載の腫瘍選択的ウイルス。
項目26. 対象における頭蓋内腫瘍細胞を選択的に死滅させるための、項目1〜25のいずれかに記載の腫瘍選択的ウイルスの使用。
項目27. シクロホスファミド (CPA) が前記対象に投与される、項目26に記載の使用。
項目28. 前記CPAが、前記腫瘍溶解性ヘルペスウイルスベクターの2日前に投与される、項目26または27に記載の使用。
項目29. 前記腫瘍細胞が神経膠芽腫細胞を含む、項目26〜28のいずれかに記載の使用。
項目30. 前記腫瘍細胞ががん幹細胞を含む、項目26〜29のいずれかに記載の使用。
項目31. 前記対象が哺乳動物である、項目26〜30のいずれかに記載の使用。
項目32. 前記対象がヒトである、項目26〜31のいずれかに記載の使用。
項目33. 本質的にSEQ ID NO: 1からなる、腫瘍選択的腫瘍溶解性ヘルペスウイルスベクター。
rQNestin34.5v.2は、神経膠腫細胞では複製し、脳または他の組織内の正常細胞では複製しないように設計された、遺伝子操作されたHSV1(F株誘導体)である。HSV1は、主に三叉神経節の感覚ニューロン内に潜伏形態として、ヒト集団において風土的に存在する。このウイルスはおよそ152〜158キロベースであり、エンベロープを有し、直径150 nmである。このウイルスは、すべてではないが大部分の確立されたヒト神経膠腫細胞株、および「幹様」神経膠腫亜集団を濃縮する条件下で増大された、患者から新たに確立された神経膠腫において、感染し複製すると考えられる。HSV1 F株(例えば、OriGene Technologies Inc. Rockville, MD 20850 U.S.Sから市販されているもの)に対して以下の遺伝子改変を行い、rQNestin34.5v.2を作製した。
1- ICP34.5をコードするウイルス遺伝子のコード領域の両方の内因性コピーを大部分除去した。
2- ICP34.5コード領域の1コピーを神経膠腫選択的ネスチンプロモーター/エンハンサー配列の制御下に配置し、ICP34.5ウイルス遺伝子の神経膠腫選択的発現を提供し、ネスチンを発現していない脳細胞に対してネスチンを発現している神経膠腫におけるウイルスのより強力な複製を可能にした。
3- ウイルスのICP6遺伝子座もまた破壊し、ウイルス複製を、p16腫瘍抑制経路シグナル伝達に欠陥のある神経膠腫細胞(神経膠腫の90%超)または有糸分裂細胞に限定した。
細胞の融解および増大。VeroDマスターセルバンクの1本または複数本のバイアルを37℃で融解し、細胞をコニカルチューブに移してプールした。細胞を細胞1.2×107個/mL/チューブで入れたところ、生存回収は細胞約9.2×106個/チューブであった。細胞を完全培地で徐々に希釈し、試料を採取して生存細胞数を得た。細胞を細胞3.0〜5.0×104個/cm2の密度でフラスコにプレーティングした。
3つの一般的な実験セットを実施した。第1に、神経膠腫細胞株および正常ヒト細胞(具体的にはヒトアストロサイト)を用いるインビトロ研究をモデルとして使用して、後者ではなく前者に対するrQNestin34.5の複製および細胞毒性の相対的選択性を示す。第2に、頭蓋内ヒト神経膠腫異種移植片のマウス無胸腺モデルを用いて、rQNestin34.5v.2の単回腫瘍内注射が動物の生存の顕著な延長をもたらすことを示す。C57/B6マウスにおいて増殖した同系マウス神経膠腫ではウイルスの複製が欠如しているために、免疫応答性動物モデルにおける適切な有効性実験は不可能である。最後に、HSV感受性Balb/cマウスの脳内へのこの作用物質の頭蓋内注射を行って、毒性の程度を判定した。
本発明者らは、PCR増幅によってPCR-del-GFP-FRT-Gm-F&R DNA (SEQ ID NO: 8) を作製した。次いで、ET組換え技法を用いてこのPCR産物とfHSVQuik-1 BACベクターの相同組換えを行い、図15の領域模式図の配列 (SEQ ID NO: 7) から図16の模式図の配列 (SEQ ID NO: 8) への置換をもたらした。次に、上記BACベクターを含む大腸菌 (E. coli) にFlp-Tベクターを形質転換して、そのうちの1つが元のfHSVQuik-1 BACベクター中に位置する2つのFRT部位によって囲まれた領域を除去した。結果として得られたこのベクターは、fHSVQuik-2と称される。
ヒトから新たに作製された5種類の神経膠腫幹細胞(脳腫瘍始原細胞‐BITC)(G35、G68、G97、OG02、X12)において、rQNestin34.5v.2 (v2) の複製を解析した。ICP34.5欠失ウイルスであるHSVQ1 (Q1) は、複製を示さないかまたは最小限の複製を示した。F(野生型HSV)は、最も多くの複製を示した。34Cは、非関連のHSV組換えHSVである。本発明者らは無胸腺マウス (nu/nu) を使用し、移植可能なヒト神経膠腫細胞(ヒトU87EGFRまたはGli36dEGFR)をそこで増殖させる。このモデルは、有効性をモニターするために本発明者らおよび他者により広く用いられている。動物脳においてこれらの腫瘍は確実に生じて、3〜4週間以内に動物の死亡を引き起こす。これらの細胞は組織学的にヒト神経膠腫細胞と類似しており、腫瘍は臨床上の腫瘍のように血管に富んでいる。大きな違いは、それらが臨床上の神経膠腫ほどは浸潤性が高くない点である。本発明者らはまた、腫瘍を有するヒトから新たに切り取られ、神経膠腫幹様細胞集団を濃縮するように増殖させた神経膠腫細胞における、有効性を示した(図9)。
神経膠腫に隣接したヒト脳におけるおよび処置後のヒト脳におけるネスチン発現
rQNestin34.5v.2の腫瘍細胞選択性のいくつかのレベルの中で、重要な1つとして、ネスチン転写エレメントは、ヒト細胞を含むネスチン発現細胞に特異的転写調節を提供するために、マウスhsp68プロモーターに融合されたラットネスチン遺伝子エンハンサーの第2イントロン/エンハンサーに由来する、ネスチン-hsp最小エンハンサー/プロモーター配列から構成される。この構築物は、脳内のネスチン発現細胞にウイルスICP34.5遺伝子の選択的発現を提供する。悪性神経膠腫に隣接したヒト脳または悪性神経膠腫の処置後のヒト脳におけるネスチンの有無を、神経膠腫に隣接したヒト脳および処置後のヒト脳におけるネスチンIHCによって確認した。
無胸腺マウスが、有効性および毒性/体内分布研究のために選択された種であるという理由で、これらの脳においてネスチン発現があるかどうかを判定するために、雄および雌の無胸腺マウス(6〜8週齢)の脳内に作用物質のrQNestin34.5v.2.を接種した。しかしながら、マウスの1つの対照群(群1)には、脳内に媒体 (PBS) のみを接種した。このPBS接種の4日後、脳を解析するためマウスをプロトコール通りに安楽死させた。これらのマウスのうちの1匹の脳においてネスチン発現があるかどうかを判定した。図19は、側脳室および第三脳室ならびに水道を裏打ちしている伸長上衣細胞(上衣細胞)におけるネスチン陽性細胞を示す。第四脳室を裏打ちしている細胞においてもネスチン陽性が存在した。群2(CPAの前投与およびその後のPBS媒体の注射)からの動物を用いて同じ実験を行ったところ、同じパターンのネスチン発現が確認された。加えて、針跡周囲のアストロサイトにおいてネスチン発現が見られ、このことからマウスの反応性アストロサイトにおけるネスチンの上方制御が示される。
rQNestin34.5v.2.のウイルス収量を決定した。細胞(2×105個)を6ウェルプレートにプレーティングした。翌日、細胞にrQNestin34.5v.2 (v2)、親のrHSVQ1 (Q1)、または野生型F株(F) をMOI = 0.1で感染させた。感染の1時間後、細胞をグリシン生理食塩水溶液(10 mMグリシン、137 mM NaCl、24.1 mM KCl、0.49 mM MgCl2、0.68 mM CaCl2、pH 3)で、次にPBSで洗浄して、接着していないウイルスを除去し、新たな培地を添加した。細胞を、5% CO2を含む雰囲気中、37℃で3日間インキュベートした。細胞および培地を収集し、ドライアイス/エタノールおよび37℃の水浴を用いて3サイクルの凍結/融解に供した。遠心分離(35000×g、10分、4℃)により細胞残屑をペレット化した後、上清を新たなチューブに移し、力価測定するまで-80℃で貯蔵した。各試料の力価は、ベロ細胞を用いて従来のプラークアッセイ法により決定した。図20は、rQnestin34.5v.2のウイルス収量が、神経膠腫幹様細胞を含む3種類の神経膠腫細胞においてはrQNestin34.5のものと同等であり、HUVEC細胞においてはそれよりも優れていたことを示す。rQNestin34.5v.2.の複製能を複数の細胞株で決定した。図21は、rQNestin34.5v.2の複製が、4種類の確立された神経膠腫細胞株、および幹様条件下で増殖した3種類の初代神経膠腫においては、ICP34.5陰性rHSVQ1のものよりも高かったが、4種類の正常細胞においてはrHSVQ1と類似していたことを示す。F株の複製は、すべてにおいてより高かった。
Claims (23)
- (a) γ34.5をコードする遺伝子の両コピーにおける欠失または不活性化変異;および
(b) ネスチンプロモーターの転写制御下へのHSV γ34.5遺伝子の少なくとも1コピーの挿入;および
(c) HSVウイルスタンパク質ICP6をコードする遺伝子における欠失または不活性化変異
を含み、緑色蛍光タンパク質を発現しない、腫瘍選択的腫瘍溶解性ヘルペスウイルスベクター。 - UL39核酸調節配列を含まない、請求項1に記載の腫瘍選択的腫瘍溶解性ヘルペスウイルスベクター。
- ICP6の融合タンパク質を含まない、請求項1または2に記載の腫瘍選択的腫瘍溶解性ヘルペスウイルスベクター。
- ネスチンプロモーターの転写制御下の前記γ34.5遺伝子の少なくとも1コピーが、リボヌクレオチド還元酵素の大サブユニットICP6をコードするUL39遺伝子に挿入されている、請求項1〜3のいずれか一項に記載の腫瘍選択的腫瘍溶解性ヘルペスウイルスベクター。
- 前記ネスチンプロモーターがSEQ ID NO: 2またはその縮重変種を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性発現ベクター。
- SEQ ID NO: 1の配列またはその縮重変種を含む、請求項1に記載の腫瘍選択的腫瘍溶解性ヘルペスウイルスベクター。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の腫瘍選択的腫瘍溶解性ヘルペスウイルスベクターの近傍に導入する段階を含む、対象における頭蓋内腫瘍細胞を選択的に死滅させるための方法。
- シクロホスファミド (CPA) を投与する段階をさらに含む、請求項7に記載の方法。
- 前記CPAが、前記腫瘍溶解性ヘルペスウイルスベクターの2日前に投与される、請求項7または8に記載の方法。
- 前記腫瘍細胞が神経膠芽腫細胞を含む、請求項7〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記腫瘍細胞ががん幹細胞を含む、請求項7〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が哺乳動物である、請求項7〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象がヒトである、請求項7〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 対象における頭蓋内腫瘍細胞の処置に使用するための腫瘍選択的腫瘍溶解性ヘルペスウイルスベクターであって、
(a) γ34.5をコードする遺伝子の両コピーにおける欠失または不活性化変異;および
(b) ネスチンプロモーターの転写制御下へのHSV γ34.5遺伝子の少なくとも1コピーの挿入;および
(c) HSVウイルスタンパク質ICP6をコードする遺伝子における欠失または不活性化変異
を含み、緑色蛍光タンパク質を発現しない、腫瘍選択的腫瘍溶解性ヘルペスウイルスベクター。 - UL39核酸調節配列を含まない、請求項14に記載の腫瘍選択的腫瘍溶解性ヘルペスウイルスベクター。
- ICP6の融合タンパク質を含まない、請求項14または15に記載の腫瘍選択的腫瘍溶解性ヘルペスウイルスベクター。
- ネスチンプロモーターの転写制御下の前記γ34.5遺伝子の少なくとも1コピーが、リボヌクレオチド還元酵素の大サブユニットICP6をコードするUL39遺伝子に挿入されている、請求項14〜16のいずれか一項に記載の腫瘍選択的腫瘍溶解性ヘルペスウイルスベクター。
- 前記ネスチンプロモーターがSEQ ID NO: 2またはその縮重変種を含む、請求項14〜17のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性発現ベクター。
- SEQ ID NO: 1の配列またはその縮重変種を含む、請求項14〜18のいずれか一項に記載の腫瘍選択的腫瘍溶解性ヘルペスウイルスベクター。
- 前記腫瘍細胞が神経膠芽腫細胞を含む、請求項14〜19のいずれか一項に記載の腫瘍選択的腫瘍溶解性ヘルペスウイルスベクター。
- 前記腫瘍細胞ががん幹細胞を含む、請求項14〜20のいずれか一項に記載の腫瘍選択的腫瘍溶解性ヘルペスウイルスベクター。
- 前記対象が哺乳動物である、請求項14〜21のいずれか一項に記載の腫瘍選択的腫瘍溶解性ヘルペスウイルスベクター。
- 前記対象がヒトである、請求項14〜22のいずれか一項に記載の腫瘍選択的腫瘍溶解性ヘルペスウイルスベクター。
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