JP5070583B2 - ヒトグリオーマ治療に有用なリコンビナントhsv - Google Patents
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Description
(1)Musashi1プロモーターと、
その下流に連結されたHSVのγ34.5遺伝子及びリボヌクレオチドリダクターゼ遺伝子と、
Musashi1プロモーターによる前記遺伝子の転写を終結させるポリA配列と、
前記HSVのγ34.5遺伝子及びリボヌクレオチドリダクターゼ遺伝子が破壊・欠損・置換等により不活性化されてHSVのγ34.5遺伝子産物及びリボヌクレオチドリダクターゼ遺伝子産物を発現する機能を失ったウイルスDNAとを
備えたリコンビナントHSVであって、
Musashi1プロモーターで発現するγ34.5遺伝子転写ユニットを、すでに弱毒化された単純ヘルペスウイルス(HSV)のゲノムのリボヌクレオチドリダクターゼ遺伝子部位にホモロガスリコンビネーションの手法により挿入した組換えHSVであるKeM345である、リコンビナントHSVに関する。
(ホモロガスリコンビネーション)
アンプリコンプラスミドpSRaP/Musashi1:γ34.5(Kanai R et al. Gene Ther; advance online publication, September 15, 2005; doi:10.1038/sj.gt.3302636 /特開2005−73653号公報)を制限酵素XbaIで処理し、断端を平滑末端とした約5Kbの断片を回収し、これを挿入断片(インサート)とした。この挿入断片にはP/Musashi1の下流にγ34.5の全長、BGHpolyA配列が連結されている。次にpKX2βG3(Mineta et al. Nat Med,1995;1:938-943)をNdeI、EcoRVで処理し、断端を平滑末端とした。これに上記挿入断片を挿入し(ligation)、プラスミドpKX−P/Musashi1:γ34.5を得た。プラスミドpKX−P/Musashi1:γ34.5を制限酵素HindIIIで処理し、線状化したものを、G207のウイルスDNAとともにリポフェクション法(Lipofectamine 2000,Invitrogen社製)でVero細胞に共感染 (co-transfection)した。ウイルスDNAの調製はMinetaら(Mineta et al. Nat Med,1995;1:938-943)と同様に行った。約4日後、生じたウイルスを一旦回収してヒト神経芽細胞腫株であるSK−N−SHに感染させ、更に1日後、細胞毒性効果があらわれたところで回収した。これを10cm皿にコンフルエントに育った単層のVero細胞に感染させ、感染後およそ18時間でX−gal入りのアガロースを重層し、さらに1日間生育させた。育ったプラークを光学顕微鏡上で青白セレクションし、白いプラークのみをいくつか回収した後、24ウエル皿に育ったVero細胞に感染させた。生じたウイルスを再度10cm皿にコンフルエントに育った単層のVero細胞に感染させ、これを更に青白セレクションし、白いプラークのみを選別した。同様の作業を繰り返し、計3回行った。なお、青白セレクションでは、G207はLacZが挿入されているため、X−gal染色すると青いプラークを生じるが、想定するリコンビナントウイルスではLacZ遺伝子の部分にインサートが挿入されているため、白いプラークを生じる。
リコンビナントウイルスにインサートが適切に挿入されているか否か、サザンブロットで確認した。用いたプローブは3種あり、pKX2βG3を制限酵素NdeI、EcoRVで処理し得られる約1.9Kbの断片をLacZプローブ、残りの部分をセルフライゲーションさせ、出来たプラスミドを制限酵素HindIII、XbaIで処理し得られる断片をICP6プローブ、P/Musashi1を制限酵素XhoIで処理し得られる2.2Kb断片をP/Musashi1プローブとした。StrainF,hrR3,G207,KeM345のウイルスDNAを制限酵素(XhoI、BamHI)で処理した後、1%アガロースゲル電気泳動しナイロンメンブレイン(Hybond−N+,Amersham社製)にトランスファーし、上記のプローブでサザンブロットをおこなった。プローブのラベリング、シグナルの検出にはECL Random Prime Labelling and Detection Systems, VersionII(Amersham社製)を用いた。その結果、各リコンビナントウイルスにインサートがきちんと挿入されていることが確認できた。(図1)
ウイルス感染の24時間前に、ヒト由来グリオーマ細胞株(U87MG,U87E6,U251,T98G)、ヒト神経芽細胞種株(SK−N−SH)、ヒト非小細胞性肺癌細胞株( A549)及びヒト結腸癌細胞株(HT29細胞 )の各2.0×105個を12ウエル皿に蒔いた。ウイルス感染は、0.01プラーク形成単位(PFU)/細胞のMOIでG207あるいはKeM345を、1%IFBSを補填したPBS(0.3ml)中で30分間行った。また、ウイルス接種に用いたときと同じ手順によりモック感染細胞(mock-infected cells)から調整した抽出物を用いて、コントロールをモック感染させた。生存細胞数は、感染後12時間毎に行ったトリパンブルー排除法により決定した。アッセイは、全て3回ずつ行った。KeM345の細胞毒性の特徴を調べるため、P/Musashi1が効率的に働くヒト由来グリオーマ細胞株(U87MG,U87E6,U251,T98G)、神経芽細胞腫株SK−N−SH及び、P/Musashi1が効率的に働かないその他の細胞株(A549及びHT29)について検査を行った。ウイルス(G207或いはKeM345)感染はMOI=0.01で行った。結果を図2〜5に示す。In vitroでの殺細胞効果はP/Musashi1が効率的に働くヒト由来グリオーマ細胞株(U87MG,U87E6,U251,T98G)、神経芽細胞種株SK−N−SHにおいてG207よりも有意に強いことが確認された(t検定、p<0.01)。また、グリオーマ細胞株では、感染から24時間後には KeM345の細胞変性効果とG207の細胞変性効果との間に統計学的な有意差が認められた(p<0.05、不対t検定)。SK−N−SH においても感染後60時間以降では有意差が認められた。一方、その他の腫瘍細胞株(A549及びHT29)においては、本研究で使用したウイルスの間で細胞変性効果の差異は認められなかった。
6ウエル皿にU87MG,U87E6,U251,T98G,SK−N−SH,A549,およびHT29の各細胞種(5.0×105 )を蒔き、24時間後にウイルス(R3616,G207,KeM345,StrainF)を感染させた。ウイルス感染は0.01MOIにて行い、1%のIFBSを補填した0.5mlのPBS中で30分間行った。感染後24時間でウイルスをウエルから収集し、滴定を行った。プラーク数をカウントし、プラーク形成単位毎ウエル(plaque-forming units per well:PFU/well)を算出し、対数表示(Log PFU/well)した(図6)。実験は全て3回ずつ行った。その結果、ヒトグリオーマ由来細胞株(U87MG,U87E6,U251,T98G)では、KeM345はG207に比較し多くの子孫ウイルスを産出し(p<0.05、不対t検定)およそ100倍の子孫ウイルスを産出していた。SK−N−SHでも同様であった。これに対して、その他の細胞株(A549及びHT29)では産出ウイルス量にG207との間で差はなかった(不対t検定、p<0.01)。
HSV感染細胞は、ウイルス由来の2重鎖RNAへの反応を発端に真核細胞翻訳開始因子2α(eIF−2α)をリン酸化し蛋白合成を停止する方向、ひいてはウイルスの増殖を妨げる方向へ働くが、γ34.5はeIF−2αを脱リン酸化することで蛋白合成を停止させないため、ウイルスの複製を促進するとされる(Chou J, Roizman B. Proc Natl Acad Sci USA,1992; 89:3266-3270.)。そこで我々は、KeM345がP/Musashi1が効率よく機能する細胞種においてのみにγ34.5を発現していることを生化学的に裏付けるため、10cm皿にサブコンフルエントに育ったU87MG,U87E6,A549にウイルス(Strain F,R3616,G207,KeM345)をMOI=0.5で感染させ、感染15時間後に回収したんぱく質を抽出し、ウエスタンブロットをおこなった。SDS−PAGEは1ウエルあたり50μgの蛋白量で行い、抗体は抗eIF2-α抗体(Biosource社製)、リン酸特異的な抗リン酸化eIF2-α抗体(Biosource社製)、コントロールに抗アクチン抗体を用いた。適宜2次抗体を反応させ、ECL detection Kitを用い検出した。その結果、P/Musashi1が効率よく機能するU87MG,U87E6においては、KeM345の感染によりγ34.5が発現し、eIF−2αが脱リン酸化されていることが示唆された(図7)。
(動物実験)
Japan SLC社より購入した、生後6週間の胸腺欠損のBALB/c雌ヌードマウス(nu/nu)を、5匹又は5匹以下のグループにして無菌ケージで飼育し、オートクレーブした食物及び水を自由に利用できるようにした。全ての動物手順はLaboratory Animal Center(慶応義塾大学医学部)により承認された手順に従った。外科的手順に関しては、84%の静菌性生理食塩水 (bacteriostatic saline)、10%ペントバルビタールナトリウム (50mg/ml;Abbott Laboratories社製)及び6%エチルアルコールからなる溶液を、各マウスの腹腔内に0.25ml投与して麻酔をかけた。マウスの生存状態を確認するために毎日巡回した。
50μl中の5.0×106個のU87E6細胞をBALB/c雌ヌードマウスの右脇腹皮下に注入し、皮下腫瘍を誘発した。移植から約12日後、皮下腫瘍の直径が6mmに到達した頃、マウスをランダムに3つのグループに分けた(各グループにおいて、n=6)。マウスは、20μlのウイルス緩衝液に懸濁した、1.0×106PFUのG207(グループII)又は KeM345(グループIII)を用いて、新生物内で処理した。また、コントロールとしてグループIのマウスを、20μlのモック感染抽出物で処理した。腫瘍は、0.1mm以内の外側ノギス測定で測定した。二次元直径測定 (bidemensional diameter measurements)により段階的な腫瘍量を得た。腫瘍の平均成長速度は、aが長軸、bが短軸である、0.5(a×b2)日n/0.5(a×b2)日により決定した。腫瘍の直径が24mmを超えた場合には、その動物を屠殺した。成長速度の統計学的差異については、不対t検定を用いることにより評価した(p<0.01)。その結果、mock及びG207を投与したグループと比較し、KeM345を投与した群では有意に腫瘍の成長速度が抑制されていることが明らかになった(図8)。
BALB/c雌ヌードマウスに麻酔をかけて定位的装置(D. Kopf Instruments 社製)で不動化した後、ブレグマ上に直線的な皮膚切開を行い、頭蓋骨(ブレグマの前方1.0mm,外側2.0mmの部位)に1mmの穴を開けた。2μl中の2.0×105個のU87E6細胞を、5μlのハミルトンシリンジ(Hamilton Company社製)を用いて、ヌードマウスの右前頭葉に定位的に注入した。12日後、マウスをランダムに3つのグループ(n=10)に分けた。5.0×105PFUのG207(グループII)、1.0×106PFUのG207(グループIII)、5.0×105PFUのKeM345(グループIV)、1.0×106PFUのKeM345(グループV)又は、2μlのモック感染抽出物(グループI)を同じ配位で定位的に接種し、生存を継続した。生存率の統計学的差異については、Wilcoxon signed-ranks testをもちいることにより評価した(p<0.01)。その結果、グループI〜IIIと比較し、グループIV、Vは有意にその生存延長効果が見られた。また、Kem345を投与したグループIVとVを比較した場合、用量依存的な効果が確認された(図9)。
dvM345とKeM345との効果を比較検討するため、G207での効果がより弱いU87MG細胞(2.5×105個)をBALB/c雌ヌードマウスの右前頭葉に移植し、10日経過時点でウイルスを腫瘍内に投与した。ウイルスはKeM345、dvM345、G207及びモック感染抽出物(各群n=6)を用い、投与量は、G207ではほとんど効果の出ない5.0×105PFUとした。その結果、KeM345投与群は、dvM345投与群と比較して有意に高い生存延長効果を示した (図10:Wilcoxson test,p<0.01)。
BALB/c雌ヌードマウスにU87E6細胞を移植後17日経過時点でマウスを1.0×106PFUのG207又はKeM345で処理し、かかる処理の5日後に屠殺した。1%PFAを含むPBS中で灌流し固定を行った後、脳を取り除いた。試料をPBS中の4%PFAで、4℃で24時間以上固定した。エタノール、キシレンで処理後パラフィン包埋し、針路の周辺脳のスライド切片(4μm厚)を作成した。脱パラフィン処理後に抗HSV抗体(ラビット抗HSV抗体、1:200の希釈にて使用、BETHYL Laboratories社製)、2次抗体(ビオチン化抗ラビットIgG)にて免疫染色した。その後、ヘマトキシリン溶液で対比染色し、自動化顕微鏡(Nikon社製 エクリプスE1000)による観察を行った。その結果、G207を感染させた細胞と比較し、KeM345を処理した群において、HSVの高い分布が確認された(図11)。
BALB/c雌ヌードマウスにU87E6細胞を移植後、KeM345(5.0×106PFU)をマウスの右大脳半球に注入して28日後に屠殺(2匹)し、脳、脊髄、肺、肝臓、脾臓、腎臓を取り除いた後、DNAzol(Invitrogen社製)を用いてDNAを回収した。回収したDNAを鋳型にして、Sundaresan Pらの方法(J virol 2000; 74: 3832-3841)と同様にHSVのDNAが検出できるか否か検討した。HSVのDNA検出にはチミジンキナーゼ(TK)のプライマーペアを、内部コントロールにはマウスβアクチンのプライマーペア(Morita A et al. Hepatol Res,2003;27:143-150)を用いた。その結果、コントロールであるβアクチンは全ての臓器で発現が確認されたことに対し、チミジンキナーゼは脳特異的な発現が観察された(図12)。
5つの非小細胞性肺癌細胞株(Lu−99、A549、PC−13、PC−14、NCI−H596)、2つの胃癌細胞株(TMK1、MKN74)、2つの結腸癌細胞株(HT29、HCT15/W)、1つの膀胱癌細胞株(KU19−19)、1つの腎細胞癌細胞株(A498)の、計11のヒト由来の癌細胞株におけるMusashi1mRNAの発現についてRT−PCR解析を行った。内在性のコントロールとして、βアクチンを用いた(551bp)。その結果、Musashi1遺伝子の発現は、5つの肺癌細胞のうちの2つ(Lu−99、PC−13)、2つの胃癌細胞株のうちの1つ(MKN74)、2つの結腸癌細胞株うち1つ(HCT15/W)に観察された。対照的に、それ以外の細胞株においては、Musashi1mRNAは検出されなかった(図13)。
Musashi1mRNAの発現が陽性であった肺癌細胞株Lu−99、及び結腸癌細胞株HCT15/W、他方Musashi1mRNAの発現が陰性であった2つの肺癌細胞株A549、NCI−H596、及び結腸癌細胞株HT29について、ウエスタンブロットによる解析を行った。内在性のコントロールとしてはアクチンを用いた。Lu−99とHCT15/Wにおいて、Musashi1タンパク質は分子量約40kDあたりに検出されたが、その他の細胞株では検出されなかった(図14)。
実施例2に記載の方法に準じて、本発明のHSVのヒト由来非小細胞性肺癌細胞株における殺腫瘍細胞効果を検討した。実施例8においてMusashi1mRNAが検出された細胞株Lu−99、PC−13、及び検出されなかったA549、PC−14の4種類のヒト由来非小細胞性肺癌細胞株を対象とした。ウイルス感染は、KeM345、及び、対照としてdvHmsi1:GFP(dvM345のγ34.5をGFPに置換した非複製型ウイルス)及びG207を、ヘルペスウイルス(G207)の力価に基づき0.1MOIでそれぞれ感染させた。P/Musashi1が効果的に機能する細胞株においては、KeM345ウイルス感染後16時間で、コントロールウイルスと比較して統計学的に有意な細胞変異効果を認めた(P<0.05、不対t−検定)(図15、16)。一方、その他の細胞株では、ウイルス間における細胞変異効果の差異は認められなかった(図17、18)。
6ウエル皿にMusashi1陽性非小細胞性肺癌細胞株(Lu−99、PC−13、A549、PC−14)を5.0×105を蒔き、24時間後にウイルス(G207,dvHmsi1:GFP,KeM345)を感染させた。ウイルス感染は0.01MOIにて行い、1%のIFBSを補填した0.5mlのPBS中で30分間行った。感染後4時間毎に滴定を行い、プラーク数をカウントした。プラーク形成単位毎ウエル(plaque-forming units per well:PFU/well)を算出し、対数表示(Log PFU/well)した。P/Musashi1が効果的に機能するLu−99及びPC−13においてはKeM345の子孫ウイルス産生は増加した(図19、20)が、P/Musashi1が効果的に機能しないA549及びPC−14においては、同様の効果は見られなかった(データは示さず)。
実施例5に記載の方法と同様に、5.0×106個のLu−99細胞をBALB/c雌ヌードマウスの右脇腹皮下に注入し、皮下腫瘍を誘発後、マウスをランダムに3つのグループに分けた(各グループにおいて、n=6)。マウスは、1.0×107PFUのG207(グループII)又は KeM345(グループIII)を用いて、新生物内で処理した。また、コントロールとしてグループIのマウスを、モック感染抽出物で処理した。腫瘍の直径が24mmを超えた場合には、その動物を屠殺した。
Claims (2)
- Musashi1プロモーターと、
その下流に連結されたHSVのγ34.5遺伝子及びリボヌクレオチドリダクターゼ遺伝子と、
Musashi1プロモーターによる前記遺伝子の転写を終結させるポリA配列と、
前記HSVのγ34.5遺伝子及びリボヌクレオチドリダクターゼ遺伝子が破壊・欠損・置換等により不活性化されてHSVのγ34.5遺伝子産物及びリボヌクレオチドリダクターゼ遺伝子産物を発現する機能を失ったウイルスDNAとを
備えたリコンビナントHSVであって、
Musashi1プロモーターで発現するγ34.5遺伝子転写ユニットを、すでに弱毒化された単純ヘルペスウイルス(HSV)のゲノムのリボヌクレオチドリダクターゼ遺伝子部位にホモロガスリコンビネーションの手法により挿入した組換えHSVであるKeM345である、リコンビナントHSV。 - 請求項1に記載のリコンビナントHSVを有効成分とすることを特徴とする、ヒトグリオーマに対する治療薬。
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