JP2005073653A - ヒトグリオーマ治療に有用な変異hsvベクター - Google Patents
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Abstract
【課題】 ヒトグリオーマ細胞を特異的にインビボで殺傷する能力を有し、ヒトグリオーマの治療に有用でかつ安全な変異HSVベクター(ウイルスストック)や、その作製に用いられるMusashi1プロモータを利用したアンプリコンベクターや、前記ウイルスストックを有効成分とするヒトグリオーマ治療薬等を提供すること。
【解決手段】 宿主細胞に、(1)Musashi1プロモータとその下流に連結されたHSVのγ34.5遺伝子とポリA配列とHSVoriと、HSVのa倒置反復配列とを備えたアンプリコンベクターと、(2)前記γ34.5遺伝子が不活性化されてγ34.5を発現する機能を失ったヘルパーウイルスとを、ともに感染させることにより、感染細胞内でγ34.5を発現することができるアンプリコンベクター由来のウイルス粒子と、ヘルパーウイルス由来のウイルス粒子とを含むウイルスストックを得る。
【解決手段】 宿主細胞に、(1)Musashi1プロモータとその下流に連結されたHSVのγ34.5遺伝子とポリA配列とHSVoriと、HSVのa倒置反復配列とを備えたアンプリコンベクターと、(2)前記γ34.5遺伝子が不活性化されてγ34.5を発現する機能を失ったヘルパーウイルスとを、ともに感染させることにより、感染細胞内でγ34.5を発現することができるアンプリコンベクター由来のウイルス粒子と、ヘルパーウイルス由来のウイルス粒子とを含むウイルスストックを得る。
Description
本発明は、Musashi1プロモーターを利用したヒトグリオーマ治療に有用な変異HSVベクター、より詳しくはニューロビルレンスファクターと呼ばれるγ34.5などのヒトグリオーマ細胞内でHSVの複製増殖能に関与する遺伝子産物を発現することができる前記アンプリコンベクター由来のウイルス粒子と、前記HSVの複製増殖能に関与する遺伝子産物を発現する機能を失ったヘルパーウイルス由来のウイルス粒子とを含むヒトグリオーマ(グリオーマ)治療に有用な複製欠陥HSVベクター(ウイルスストック)等に関する。
悪性グリオーマ、特に、多型性神経膠芽腫(GBM)は、成人の主要な脳腫瘍の最も一般的で絶望的な形態である(例えば、非特許文献1参照。)。GBMは、周囲の正常な脳組織を広範囲に浸潤する傾向があるため、最近の神経画像処理技術や外科的技術の改善による助けを用いても、それを完全に除去することは実質的に不可能であり、その他の治療の形態を必要とした。しかしながら、診断上の手順、放射線治療、化学療法及び支持療法の大きな進展にも関わらず、これらの新生物(neoplasm)は、従来の治療に対して強い耐性を示す(例えば、非特許文献2,3,4,5参照。)。患者の予後は、過去20年間において低いままであり、患者のほとんどが診断から1年以内に病気に屈する(例えば、非特許文献6,7参照。)。したがって、有効な治療がなく、この病気の予後が著しく低いことから、遺伝子治療等の新たな治療の選択肢が必要となる。
現在まで、非複製ベクター(replication-defective vector)による腫瘍への遺伝子導入(tumor transduction)の高効率性が達成していないため、複製型ウイルスベクター(replication-competent virus vector)は癌治療剤として期待されている(例えば、非特許文献8,9,10参照。)。癌の遺伝子治療における近年の発達は、細胞毒性遺伝子を腫瘍細胞に送達(deliver)するばかりでなく融解性感染を介してそれらを直接破壊する、遺伝子改変して分裂細胞において選択的に複製するように設計された殺腫瘍性ウイルスの使用を中心に展開し(例えば、非特許文献11,12参照。)、少なくとも10種のウイルス種について臨床試験が始まっている(非特許文献13参照。)。分裂細胞において選択的に複製するように設計された殺腫瘍性ウイルスの使用は、新生物内複製(intraneoplastic replication)が、接種した腫瘍塊に抗癌効果の解剖学的広がりの増大や、抗癌遺伝子の送達(delivery)による腫瘍性効果の増強を可能にすることから(例えば、非特許文献14,15参照。)、殺腫瘍活性と安全性の両面で有望視されている。
HSVは2本鎖DNAウイルスで、核内で増殖するDNAウイルスの中で最大長のゲノム(153kb)を有し、84種のオープンリーディングフレームをコードする。ゲノムはL(long)領域とS(short)領域から構成され、各ユニーク配列をその両側に倒置反復配列が挟む形で存在する。ウイルスゲノムの全塩基配列が決定され、ほとんどのウイルス遺伝子の機能は解明されている。そして、このHSVの、分裂細胞において選択的に複製するように設計された殺腫瘍性変異体として、2つのタイプの単一遺伝子が変異したHSV変異体が研究されてきた。1つは、チミジンキナーゼ、リボヌクレオチドリダクターゼ(RR)、ウラシルN−グリコシレート(uracyl N-glycosylate)等の核酸代謝に必要とされるウイルス遺伝子の機能に欠陥を持つウイルス変異体であり、もう1つは、宿主タンパク質合成の遮断の抑制を通して感染細胞のウイルス放出数を著しく増強することによりビルレンスファクターとして機能するγ34.5遺伝子(ICP34.5)の機能に欠陥を持つウイルス変異体である(例えば、非特許文献16,17参照。)。
単一遺伝子が変異したHSV変異体は、相同組み換え等のバックミューテーションによる野生型への復帰変異の危険の他、例えば、チミジンキナーゼの機能欠損変異体におけるガンシクロビルに対する抵抗力の増強、γ34.5の機能欠損変異体における殺腫瘍活性の減少等の問題を有する。そこで、野生型への復帰変異の危険性を減少させるため、多重変異が導入されたHSVが開発された。これらには、γ34.5の欠失変異及びリボヌクレオチドリダクターゼの挿入変異(insertional mutation)の両方の機能が欠損した変異体であるG207及びMGH1を挙げることができる。これら二重変異体は、頭蓋内に直接注入することによりニューロビルレンスの著しい減少を示し、ガンシクロビルに対し感受性を維持し、正常な組織と比較して腫瘍細胞において相対的に選択的な複製を示す。このような二重変異HSV系統は、欠陥γ34.5遺伝子を維持し、それによって正常な組織に対して弱いビルレンスを示す。しかしながら、それらは腫瘍細胞に対して明らかな殺腫瘍効果を示すが、かかる効果は正常なγ34.5遺伝子を有する変異体において観察されるものより少ない。
上記G207は、Martuzaらにより、γ34.5遺伝子における欠失及びICP6遺伝子へのlacZ遺伝子挿入により、単純ヘルペスウイルス1型(HSV−1)の二重変異体として開発された(例えば、非特許文献18,特許文献1参照。)。G207は他のウイルスベクター類よりも治療上の観点において優れている。G207は分裂細胞において複製され、その結果感染細胞は融解して死に至るが、非分裂細胞ではその増殖は顕著に弱まっている。無胸腺症マウスに樹立された腫瘍内にG207を接種すると腫瘍選択的複製によって腫瘍増殖が抑制され、マウスが延命された(例えば、非特許文献19参照。)。また、免疫応答性マウスにおいてはG207を腫瘍内接種することにより腫瘍特異的免疫応答が誘導され、G207を接種しなかった腫瘍の増殖をも抑制する(例えば、非特許文献20参照。)。この場合、G207がインサイチュー癌ワクチンとして機能している。現在まで、脳腫瘍を中心に変異ヘルペスウイルスG207を用いた遺伝子治療が行われ、米国で臨床応用も開始された(例えば、非特許文献9参照。)。この臨床応用において、G207の安全性は証明されているが、これまでに報告された臨床結果は、あまり効果的でないことが報告されている(例えば、非特許文献9,10参照。)。
臨床的に関連するウイルスベクターを構築する際は、安全性及び殺腫瘍の有効性(oncolytic efficacy)の両方が必須である(例えば、非特許文献21,22参照。)。安全性は、変異ウイルスの複製の選択性に直接依存する。有効性は、ウイルスの効率的に腫瘍細胞を感染させ、感染した新生物塊の中で増殖する能力に依存する。G207等の多重変異HSVベクターは、安全性を高め、野生型復帰変異のリスクを減らそうと努力して構築されたが、それらの殺腫瘍の有効性は同時に減少したようである。G207における欠失遺伝子のひとつであるγ34.5遺伝子は、ニューロビルレンスファクター(neurovirulence factor)とも呼ばれており、宿主タンパク質合成の遮断の抑制を通して感染細胞のウイルス放出数を著しく増強する機能を有する(例えば、非特許文献16,23参照。)。γ34.5遺伝子を欠失させることにより、G207は非常に安全性が高くなったが、その治療効果は少々低下したと考えられる。
腫瘍細胞に選択的なHSV複製を与えるいくつかの戦略が知られている。例えば、分裂終了細胞における複製に必要とされるウイルス遺伝子の欠失又は変異(例えば、非特許文献12,14,24参照。)、ウイルスの子孫産生調節の責任を有するウイルス遺伝子の欠失(例えば、非特許文献25,26,27参照。)。必須のウイルス遺伝子の発現を調節するための腫瘍特異的プロモーターの使用(例えば、非特許文献28参照。)、正常な組織よりむしろ腫瘍に対するHSV糖タンパク質の受容体特異性の変化(例えば、非特許文献29参照。)等が知られている。
Musashi1は、本発明者らにより見い出された神経のRNA結合タンパク質であり、神経幹細胞/前駆細胞の進化的によく保存されたマーカーである(例えば、非特許文献30,31,32,33参照。)。それは、固有の(proper)神経細胞及び膠細胞の発達に必須である転写後の遺伝子調節において重要な役割を果たす可能性が高い(例えば、非特許文献30,31,32,33,34参照。)。近年、Musashi1は、複数の腫瘍、特に中枢神経系では悪性グリオーマに発現し(例えば、非特許文献35,36,37参照。)、悪性グリオーマのマーカーとして使用できることが解明された(例えば、非特許文献36,37参照。)。
さらに、マウスのMusashi1プロモーター(P/Musashi1)がヒト胎児脳においても機能することや、P/Musashi1の作動によるGFP発現に基づいて、蛍光標識細胞分取器(FACS)を用いて神経幹細胞の選別ができることが報告されている(例えば、非特許文献38参照。)。
米国特許第5585096号明細書
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本発明の課題は、ヒトグリオーマ細胞を特異的にインビボで殺傷する能力を有し、ヒトグリオーマの治療に有用でかつ安全な変異HSVベクター(ウイルスストック)や、かかるウイルスストックを作製するのに用いられるMusashi1プロモータを利用したアンプリコンベクターや、前記ウイルスストックを有効成分とするヒトグリオーマ治療薬等を提供することにある。
本発明者らは、臨床的に適用可能なHSVベクターを構築することを考慮して、安全性を可能な限り低下させずに、従来の変異体の殺腫瘍の有効性を増強することが必要であると考えた。そこで、腫瘍細胞に選択的なHSV複製を与えるためのいくつかの戦略のうち、必須のウイルス遺伝子の発現を調節するために腫瘍特異的プロモーターを使用することが有望であると考えた。
他方、単純ヘルペスウイルス1型(HSV−1)の変異体G207は、前記のように、γ34.5遺伝子の一部欠失及びUL39遺伝子へのlacZ挿入により、これら遺伝子が不活性化されてγ34.5やリボヌクレオチドリダクターゼを発現する機能が欠失するように設計されている。G207は、インビトロ及びインビボでの研究で効率的な殺腫瘍活性(oncolytic activity)を示すが、正常な組織においては最小の毒性を示し、現在、悪性グリオーマの臨床試験が行なわれている。しかしながら、フェイズI試験の結果によると、G207の安全性については証明されているが、その殺腫瘍活性については有効であるとの結果が得られなかった。ニューロビルレンスファクターをコードするγ34.5遺伝子を欠失させることにより、G207の安全性は非常に高くなったが、HSV1による殺腫瘍活性は著しく減少した。かかるG207の殺腫瘍活性の低下を考慮すると、γ34.5遺伝子が腫瘍細胞にのみ特異的に発現した場合、γ34.5が発現しない場合と比較して、治療効果はより強く増強すると考えた。
本発明者らは、G207の安全性を低下させることなくその治療効果を増強するため、本発明者らにより見い出された神経のRNA結合タンパク質であり、最近ヒト悪性グリオーマに発現し、それらのマーカーとして使用されることが明らかになったMusashi1のプロモーター(P/Musashi1)が神経前駆細胞以外の悪性グリオーマにおいても機能し、特に悪性グリオーマにおけるHSVの複製増殖能に関与するHSV1遺伝子の発現を調節するための腫瘍特異的プロモーターとして使用できるのではないかと考えた。そこで、まず最初に、ヒトグリオーマ細胞株(U87MG、U251、T98G)及びその他のいくつかの癌細胞株(肺癌細胞株A549、胃癌細胞株TMK−1、大腸癌細胞株HT29、膀胱癌細胞株KU19−9及びT24、前立腺癌細胞株DU145)におけるMusashi1のmRNA発現についてRT−PCR分析により調べた。その結果、腫瘍細胞株の中では、Musashi1のmRNAがグリオーマ細胞株及びニューロブラスト細胞株に特異的に発現することを確認した。この結果は、これまでに報告された事例と完全に一致した(Differentiation 68, 141-152, 2001、GLIA 34, 1-7, 2001)。次に、ヒト胎児脳の神経幹細胞において機能することが知られているP/Musashi1の転写活性について調べた(Nat. Biotechnol. 19, 843-850, 2001)。GFPレポーターアッセイにより、ヒトグリオーマ細胞株及びその他のいくつかの腫瘍細胞株におけるP/Musashi1の転写活性について調べた結果、ヒトグリオーマ細胞株の方がその他の癌細胞株と比較して、P/Musashi1の転写活性が著しく高いデータが得られた。この結果から、本発明者らは、P/Musashi1がヒトグリオーマ細胞株で選択的に機能することを確認した。
次に、本発明者らは、HSVの複製増殖能に関与するHSV1遺伝子であるγ34.5遺伝子をP/Musashi1で転写する再ターゲティングが、正常な組織においては減衰したビルレンスを維持しながら、グリオーマにおいては選択的ビルレンスを達成する手段を提供する可能性があると考えた。そこで、γ34.5遺伝子をP/Musashi1で転写制御した複製欠損ウイルスを作製し、この複製欠損ウイルスとヘルパーウイルスとしてのG207とをグリオーマ細胞にコ・トランスフェクションすることによりdvM345をウイルスストックとして得た。そして、このdvM345(ウイルスストック)が、培養において、G207単独の場合と比較して、ヒトグリオーマ細胞株においてより高い細胞変性の有効性を顕著に示すことがわかった。これに対して、その他の癌細胞株においては、dvM345とG207単独との場合の差異は明白ではなかった。また、一段階ウイルス成長解析の結果によると、P/Musashi1が効率的に働くヒトグリオーマ細胞株におけるU87MGにおいては、dvM345のより高い子孫ウイルス(G207)産生能力から、dvM345のより高い殺腫瘍活性が得られるが、P/Musashi1が効率的に作動しない肺癌細胞株A549においては、かかる効果は観察されず、dvM345の高い殺腫瘍活性は腫瘍タイプ特異的であることを確認した。
次いで、ヌードマウスにおける皮下U87MG腫瘍モデル及び脳内U87MG腫瘍モデルの両モデルを用いて、dvM345のインビボでの治療効果について調べた。皮下腫瘍モデルにおいては、dvM345はG207単独の場合と比較して、U87MG腫瘍の成長をより劇的に阻害した。脳内U87MG腫瘍モデルにおいては、5.0×105PFUのウイルスの低投与量で、G207で処理したグループと比較して、dvM345で処理した動物では統計的に有意な生存の増加を確認した。両モデルにおいて、dvM345(ウイルスストック)の腫瘍内直接投与での治療効果が増大することがわかった。最後に、本発明者らは、3匹のマウスを使用して、dvM345の安全性について調べたところ、投与量5.0×106PFUでは副作用を観察することができなかった。
さらに、変異ウイルスの安全性について考慮すると、前記のように、ウイルスの複製の選択性に直接依存する。本発明におけるように、腫瘍特異的プロモータP/Musashi1を使用した場合、主要な問題はプロモータの特異性に直接依存する。原始的な未分化CNS細胞において優先的に発現する神経のRNA結合タンパク質であるMusashi1の性質(Dev. Biol. 176, 230-242, 1996、J. Neurosci. 17, 8300-8312, 1997、Genomics 52, 382-384, 1998、Dev. Neurosci. 22, 139-153, 2000)を考慮すると、そのプロモーターは末端の分化した正常な組織においては機能しないと考えられたが、本発明者らの得た結果から、P/Musashi1は、本発明者らによる文献(Nat. Biotechnol. 19, 843-850, 2001)に最初にその活性を報告した神経前駆細胞以外に、グリオーマ特異的プロモーターと呼ぶことができる。このように、P/Musashi1をdvM345作製に利用し、グリオーマ特異的にγ34.5を発現させた結果、G207の治療効果を、その安全性に障害を与えることなく増強しうることを見い出した。
以上のとおり、dvM345(ウイルスストック)を用いると、G207単独の場合と比較して、インビトロ及びインビボでのより高い殺腫瘍活性を示しながら、安全性上好ましい毒性プロファイルを維持しうることを確認した。本発明は以上の知見に基づいて完成するに至ったものである。
すなわち本発明は、Musashi1プロモータと、その下流に連結されたHSVの複製増殖能に関与する遺伝子と、Musashi1プロモータによる前記遺伝子の転写を終結させるポリA配列と、HSVoriと、HSVのa倒置反復配列とを備えたことを特徴とするアンプリコンベクター(請求項1)や、HSVの複製増殖能に関与する遺伝子が、HSVのγ34.5遺伝子であることを特徴とする請求項1記載のアンプリコンベクター(請求項2)に関する。
また本発明は、宿主細胞に、(1)Musashi1プロモータと、その下流に連結されたHSVの複製増殖能に関与する遺伝子と、Musashi1プロモータによる前記遺伝子の転写を終結させるポリA配列と、HSVoriと、HSVのa倒置反復配列とを備えたアンプリコンベクターと、(2)前記HSVの複製増殖能に関与する遺伝子が破壊・欠損・置換等により不活性化されてHSVの複製増殖能に関与する遺伝子産物を発現する機能を失ったヘルパーウイルスとを、ともに感染させることにより得ることができる、感染細胞内でHSVの複製増殖能に関与する遺伝子産物を発現することができる前記アンプリコンベクター由来のウイルス粒子と、前記HSVの複製増殖能に関与する遺伝子産物を発現する機能を失ったヘルパーウイルス由来のウイルス粒子とを含むことを特徴とするウイルスストック(請求項3)や、感染細胞が、ヒトグリオーマ細胞、又はニューロブラストーマ等の未分化神経上皮腫瘍細胞であることを特徴とする請求項3記載のウイルスストック(請求項4)や、HSVの複製増殖能に関与する遺伝子が、HSVのγ34.5遺伝子であることを特徴とする請求項3又は4記載のウイルスストック(請求項5)や、ヘルパーウイルスが、HSVのγ34.5及びリボヌクレオチドリダクターゼを発現する機能を失ったヘルパーウイルスであることを特徴とする請求項3〜5のいずれか記載のウイルスストック(請求項6)に関する。
さらに本発明は、請求項3〜6のいずれか記載のウイルスストックを有効成分とすることを特徴とするヒトグリオーマ治療薬(請求項7)や、請求項7記載のヒトグリオーマ治療薬を、ヒトグリオーマに直接投与することを特徴とするヒトグリオーマの治療方法(請求項8)に関する。
本発明によると、ヒトグリオーマ細胞を特異的にインビボで殺傷する能力を有し、ヒトグリオーマの治療に有用でかつ安全な変異HSVベクター(ウイルスストック)や、かかるウイルスストックを作製するのに用いられるMusashi1プロモータを利用したアンプリコンベクターや、前記ウイルスストックを有効成分とするヒトグリオーマ治療薬等を提供することができる。本発明のウイルスストックがヒトグリオーマ組織に直接投与された場合、Musashi1プロモータがヒトグリオーマ細胞内でのみ特異的に作動することから、選択的にヒトグリオーマ細胞内で変異HSVが増殖し、グリオーマ細胞が融解して、腫瘍組織の増殖抑制や消滅を図ることができる。
本発明のアンプリコンベクターとしては、Musashi1プロモータ(P/Musashi1)と、その下流に連結されたHSVの複製増殖能に関与する遺伝子と、P/Musashi1による前記遺伝子の転写を終結させるポリA配列と、HSVoriと、HSVのa倒置反復配列とを備えたものであればどのようなものでもよく、また、本発明のウイルスストックとしては、宿主細胞に、(1)P/Musashi1と、その下流に連結されたHSVの複製増殖能に関与する遺伝子と、P/Musashi1による前記遺伝子の転写を終結させるポリA配列と、HSVoriと、HSVのa倒置反復配列とを備えたアンプリコンベクターと、(2)前記HSVの複製増殖能に関与する遺伝子が破壊・欠損・置換等により不活性化されてHSVの複製増殖能に関与する遺伝子産物を発現する機能を失ったヘルパーウイルスとを、ともに感染させることにより得ることができる、感染細胞内でHSVの複製増殖能に関与する遺伝子産物を発現することができる前記アンプリコンベクター由来のウイルス粒子と、前記HSVの複製増殖能に関与する遺伝子産物を発現する機能を失ったヘルパーウイルス由来のウイルス粒子とを含むものであればどのようなものでもよく、上記HSVの複製増殖能に関与する遺伝子としては、HSVのγ34.5遺伝子、リボヌクレオチドリダクターゼ(ICP6)遺伝子、ICP0遺伝子、ICP4遺伝子、ICP27遺伝子等を挙げることができるが、殺腫瘍活性と安全性の両立の点で、HSVのγ34.5遺伝子が好ましく、また、HSVのタイプとしては、HSV1及びHSV2を挙げることができる。
本発明のアンプリコンベクター作製に用いられるP/Musashi1は、文献(Nat. Biotechnol. 19, 843-850, 2001)記載の方法により調製することができる。また、転写を終結させるポリA配列としては、哺乳動物に由来するポリA配列であれば特に制限されるものではなく、例えばラビットβ−グロビン、SV40、BGH等のポリA配列を例示することができる。これらは常法により調製することができる。また、HSVoriとHSVのa倒置反復配列は、文献(Mol Cell Neurosci 2, 320-330, 1991)記載のプラスミドpHCLより調製することができる。本発明のアンプリコンベクターは、P/Musashi1とその下流に連結されるγ34.5遺伝子等のHSVの複製増殖能に関与する遺伝子と、P/Musashi1による前記遺伝子の転写を終結させるポリA配列と、HSVoriと、HSVのa倒置反復配列とから、常法により作製することができる。
本発明のウイルスストックの作製に用いられる上記宿主細胞としては、アンプリコンベクターとヘルパーウイルスとをともに感染させた場合、アンプリコンベクター由来のウイルス粒子と、ヘルパーウイルス由来のウイルス粒子とが混在しているウイルス液を得ることができる細胞であれば制限されず、HSVの宿主となりうる哺乳動物細胞を挙げることができる。また、本発明のウイルスストックにおける感染細胞としては、P/Musashi1が特異的に作動する腫瘍細胞を好適に例示することができ、具体的には、ヒトグリオーマ細胞や、ニューロブラストーマ等の未分化神経上皮腫瘍細胞を挙げることができ、ヒトグリオーマ細胞としては、U87MG、U251、T98G等のヒトグリオーマ細胞株やヒトグリオーマ組織から単離された腫瘍細胞を例示することができる。
本発明のウイルスストックの作製に用いられるHSVの複製増殖能に関与する遺伝子が破壊・欠損・置換等により不活性化されてHSVの複製増殖能に関与する遺伝子産物を発現する機能を失ったヘルパーウイルスとしては、前記アンプリコンベクター作製に用いられたHSVの複製増殖能に関与する遺伝子と同じ遺伝子が不活性化されているHSV変異体であれば特に制限されず、γ34.5遺伝子が不活性化されてHSVの複製増殖能に関与するγ34.5を発現する機能を失ったR3616や1716や、リボヌクレオチドリダクターゼ(ICP6)遺伝子が不活性化されてHSVの複製増殖能に関与するリボヌクレオチドリダクターゼを発現する機能を失ったhrR3や、これらγ34.5及びリボヌクレオチドリダクターゼを発現する機能を失ったG207や、ICP4遺伝子が不活性化されてHSVの複製増殖能を失ったd120等を具体的に例示することができる。これらヘルパーウイルスは、R3616については文献(Science 250, 1262-1266, 1990)、1716については文献(Gene Ther 7, 859-866, 2000)、hrR3については文献(J Virol 62, 196-205, 1988)、G207については文献(Nat. Med. 1, 938-943, 1995、米国特許第5585096号明細書)にそれぞれ記載の方法で調製することができる。
本発明のウイルスストックは、前記アンプリコンベクターと上記ヘルパーウイルスとを前記宿主細胞に感染させることにより、感染細胞内でHSVの複製増殖能に関与する遺伝子産物を発現することができるアンプリコンベクター由来のウイルス粒子と、HSVの複製増殖能に関与する遺伝子産物を発現する機能を失ったヘルパーウイルス由来のウイルス粒子の混在物として得ることができるが、上記ヘルパーウイルス由来のウイルス粒子は、感染させたヘルパーウイルスの子孫ウイルスであり、ヘルパーウイルスと同等物である。また、本発明のウイルスストックの形態としては、液状、その凍結物、その凍結乾燥による粉体、プロファージ状態の宿主細胞の凍結物等を挙げることができる。さらに、本発明のウイルスストックにおけるアンプリコンベクター由来のウイルス粒子とヘルパーウイルス由来のウイルス粒子の混在割合は、ヘルパーウイルスの添加等により適宜変更しうる。
本発明のヒトグリオーマ治療薬は、上記本発明のウイルスストックを有効成分として含有するものであれば特に制限されるものではなく、上記ヒトグリオーマ治療薬には、ヒトグリオーマの他、便宜上ニューロブラストーマ等の未分化神経上皮腫瘍に対する治療薬も含まれる。また、本発明のヒトグリオーマの治療方法としては、上記ヒトグリオーマ治療薬をヒトグリオーマ(便宜上ニューロブラストーマ等の未分化神経上皮腫瘍も含む)に直接投与する方法であれば特に制限されるものではない。本発明のヒトグリオーマ治療薬を医薬品として用いる場合は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、pH緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。また、これら予防若しくは治療剤は、経口的又は非経口的に投与することができる。すなわち通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる他、スプレー剤の型で鼻孔内投与することもできるが、ヒトグリオーマ組織に直接接種することが、即答的な腫瘍融解を誘導しうる点で好ましい。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
[材料と方法]
[材料と方法]
(細胞株)
ヒトグリオーマ細胞株(U87MG、U251及びT98G)、ヒトニューロブラストーマ細胞株SK−N−SH、6種のヒト由来癌細胞株(肺癌(A549)、胃癌(TMK−1)、大腸癌(HT29)、膀胱癌(KU19−9、T24)、前立腺癌(DU145))、ラットニューロブラストーマ細胞株B104及びアフリカミドリザル腎細胞(Vero細胞)を、American Type Culture Collectionより入手した。SK−N−SH、A549、B104及びVero細胞を、10%の熱不活性化ウシ胎児血清(IFBS)を補充したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)で培養した。TMK−1及びHT29を、10%のIFBSを補充したRPMI1640培地で培養した。全ての細胞株は、抗生物質(Sigma社製)を添加した培地で、加湿下5%のCO2、37℃で維持した。0.25%のトリプシン−エチレンジアミン四酢酸溶液(Sigma社製)を用いて、通常は2週間に1度の継代を行なった。
ヒトグリオーマ細胞株(U87MG、U251及びT98G)、ヒトニューロブラストーマ細胞株SK−N−SH、6種のヒト由来癌細胞株(肺癌(A549)、胃癌(TMK−1)、大腸癌(HT29)、膀胱癌(KU19−9、T24)、前立腺癌(DU145))、ラットニューロブラストーマ細胞株B104及びアフリカミドリザル腎細胞(Vero細胞)を、American Type Culture Collectionより入手した。SK−N−SH、A549、B104及びVero細胞を、10%の熱不活性化ウシ胎児血清(IFBS)を補充したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)で培養した。TMK−1及びHT29を、10%のIFBSを補充したRPMI1640培地で培養した。全ての細胞株は、抗生物質(Sigma社製)を添加した培地で、加湿下5%のCO2、37℃で維持した。0.25%のトリプシン−エチレンジアミン四酢酸溶液(Sigma社製)を用いて、通常は2週間に1度の継代を行なった。
(Musashi1のRT−PCR分析)
10種のヒト由来腫瘍細胞株(U87MG、U251、T98G、SK−N−SH、A549、TMK−1、HT29、KU19−9、T24及びDU145)のRNAパネルを用いて、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応法(RT−PCR)増幅を行なうことにより、Musashi1のmRNAの発現を分析した。
10種のヒト由来腫瘍細胞株(U87MG、U251、T98G、SK−N−SH、A549、TMK−1、HT29、KU19−9、T24及びDU145)のRNAパネルを用いて、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応法(RT−PCR)増幅を行なうことにより、Musashi1のmRNAの発現を分析した。
RNA抽出及びRT−PCRは、Toda et al.(GLIA 34, 1-7, 2001)に記載の方法に変更を加えて行なった。つまり、トリゾル(Trizol)試薬(Sigma社製)を用いてグアニジニウムチオシアネート法(guanidinium thiocyanate method)を行なうことにより、全RNAを調製した。全RNAテンプレート(1μg)、オリゴ(dT)アダプタープライマー及びトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素(Takara社製)を40℃でインキュベーションし、RT−PCR反応においてテンプレートとして使用されるcDNA調製物を合成した。その後、94℃の変性温度(1分/サイクル)、60℃のアニーリング温度(1分/サイクル)及び72℃の伸展温度(1分/サイクル)で、35サイクル(Musashi1)又は30サイクル(βアクチン)からなるPCR反応において、イントロンにまたがる(intron-spanning)Musashi1プライマー対(CCGGCTTCGGCCACAGTCTTGGG(フォワード;配列番号1)、GCAGGCAGTAGCGGGTCCGAGTCG(リバース;配列番号2))又はβアクチンプライマー対(GTCGACAACGCTCCGGCATGTGCA(フォワード;配列番号3)、GGATCTTCATGAGGTAGTCAGTCAG(リバース;配列番号4))のいずれかを用いて、合成したcDNAを増幅した。得られた増幅産物を2%のアガロースゲル上で分画し、次に臭化エチジウム染色により視覚化した。βアクチン特異的プライマーを用いたPCRにより、各サンプルのcDNA合成の効率性を測定した。
(Musashi1プロモーターの転写活性)
GFPレポータープラスミドを用いて、ヒトグリオーマ細胞株(U87MG、U251及びT98G)又はその他の腫瘍細胞(A549、HT29、B104及びVero細胞)におけるマウスのMusashi1プロモーター(P/Musashi1)の転写活性を測定した。
GFPレポータープラスミドを用いて、ヒトグリオーマ細胞株(U87MG、U251及びT98G)又はその他の腫瘍細胞(A549、HT29、B104及びVero細胞)におけるマウスのMusashi1プロモーター(P/Musashi1)の転写活性を測定した。
本実施例において、プラスミドpm-msi:GFP(切断(truncated))、pHCMV:GFP、pHmsi:GFP及びpHCMV.SLアンプリコンベクターをGFPレポータープラスミドとして用いた。
pm-msi:GFP(切断)は発明者らが構築し(Nat. Biotechnol. 19, 843-850, 2001)、pHCMV.SLアンプリコンベクターは、Dr. Samuel D. Rabkin(Department of Neurosurgery, Georgetown University Medical Center)より入手し、ネガティブコントロールとして使用した。
pHCMV:GFP(図1)は、以下の通りに構築した。pm-msi:GFP(切断)からSac II(平滑末端化した)/Sal IによりhGFP−SV40ポリ(A)断片を切除し、hGFPがCMVプロモーター下で作動するように、pHCMV.SLのpHIND III(平滑末端化した)/Salの制限部位に挿入した。
pHmsi:GFP(図2)は、以下の通りに構築した。pHCMV.SLをSpe Iで消化し、自己結合(self-ligated)させ、pHCMV.SLのCMVプロモーター配列が欠如するpHSLを生成した。その後、pm-msi:GFP(切断)からSal IによりP/Musashi1−hGFP−SV40ポリ(A)発現カセットを切除し、hGFPがP/Musashi1下で作動するように、pHSLの制限部位のSal Iに挿入した。したがって、pHCMV:GFP及びpHmsi:GFPはともに、hGFPのプロモーター配列以外にも同じ配列を有する(両者は共通して、pHCMV.SLのHSVa及びHSVori配列を有する)。
GFPレポータープラスミドをトランスフェクションする1日前に、1.0×105細胞/mlの密度で、細胞をガラス皿に蒔いた。細胞をリン酸緩衝食塩水(PBS)で洗浄し、培地をOPTI−MEM(GIBCO BRL)に置き換え、Lipofectamine Plus試薬(Life Technologies社製)を用いてトランスフェクションした。トランスフェクションから48時間後、細胞をPBSで2度洗浄し、4%のパラホルムアルデヒド(Nacalai Tesque社製)で固定した。
P/Musashi1の転写活性は、各ウエルの(hGFP)蛍光の強度により測定した。蛍光強度は、FluorImager 595(Molecular Dynamics Japan 社製)を用いて測定し、ImageQuaNT analysis software(Molecular Dynamics Japan)を用いて定量化した。
(pSRA P/Musashi1:ICP34.5アンプリコンプラスミドの構築)
pm-msi:GFP(切断)からHind III/Sac II(平滑末端化した)を用いてP/Musashi1を切除して、Dr. Samuel C. Rabkinより入手したpSRaori4アンプリコンプラスミドの制限部位Hind III/Bgl IIに導入し、pSRaori4:P/Musashi1を生成した。
pm-msi:GFP(切断)からHind III/Sac II(平滑末端化した)を用いてP/Musashi1を切除して、Dr. Samuel C. Rabkinより入手したpSRaori4アンプリコンプラスミドの制限部位Hind III/Bgl IIに導入し、pSRaori4:P/Musashi1を生成した。
全ICP34.5コード配列を含むプラスミドpBGL34.5は、Peter Pechan(Massachusetts General Hospital)より提供された。完全長ICP34.5cDNAをpBGL34.5からNco I(平滑末端化した)−Sac I断片として切除し、Sac I/Pvu IIの制限部位で、事前にBGHポリ(A)配列が取り込まれた、BamH I(平滑末端化した)/Sac Iの制限部位でpKF3(Takara社製)に結合した。得られたγ34.5−BGHポリ(A)配列をSal I/Pvu IIで切除し、pSRaori4:P/Musashi1に取り込み、ICP34.5cDNAのP/Musashi1上流及びBGHポリ(A)配列下流を有するアンプリコンプラスミドpSRaP/Musashi1:ICP34.5(図3)を構築した。
さらに、pSRaP/Musashi1:ICP34.5によるICP34.5の発現の効果を確認するため、Lipofectamine Plus試薬を用いて、pSRaP/Musashi1:ICP34.5をU87MG、A549又はB104にトランスフェクションした。モック(PBS)及びpHmsi:GFPをネガティブコントロールとして使用し、pSRap/Musashi1:ICP34.5の場合と全く同じ方法でトランスフェクションした。トランスフェクションから2日後、G207を低い感染効率で重感染させた。重感染から48時間後、細胞を収集し、得られたウイルスの収率を、他で記載の通り(Science 252, 854-856, 1991)Vero細胞に滴定した。
(P/Musashi1で作動するγ34.5発現HSV−1ヘルパー/欠陥ウイルスベクター、dvM345の生成)
pSRa P/Musashi1:ICP34.5アンプリコンプラスミドを、Lipofectamine Plus試薬を用いてVero細胞にトランスフェクションした。約48時間のインキュベーションの後、培地を除去した。細胞を0.01の感染効率(MOI)でG207により重感染させ、1%のIFBSを含むDMEMで培養した。Kaplitt et al.(Molecular and Cellular Neurosciences 2, 320-330, 1991)に記載の方法に従い、ウイルスストックを作製した。G207ヘルパーウイルスの滴定は、文献(Science 252, 854-856, 1991)記載の通りに、Vero細胞のプラーク形成アッセイを行なうことにより決定した。以下に説明するように、U87MGの細胞培養細胞毒性(cell culture cytotoxicity)及び一段階ウイルス成長(single-step viral growth)に基づき、各ストック中の欠陥ウイルスベクターの割合を推測した。U87MGにおいて最も高い細胞変性の有効性及びウイルス成長を示した最良のストックは、継代4で出現した。このストックを、その後のインビトロ及びインビボ実験に使用した。
pSRa P/Musashi1:ICP34.5アンプリコンプラスミドを、Lipofectamine Plus試薬を用いてVero細胞にトランスフェクションした。約48時間のインキュベーションの後、培地を除去した。細胞を0.01の感染効率(MOI)でG207により重感染させ、1%のIFBSを含むDMEMで培養した。Kaplitt et al.(Molecular and Cellular Neurosciences 2, 320-330, 1991)に記載の方法に従い、ウイルスストックを作製した。G207ヘルパーウイルスの滴定は、文献(Science 252, 854-856, 1991)記載の通りに、Vero細胞のプラーク形成アッセイを行なうことにより決定した。以下に説明するように、U87MGの細胞培養細胞毒性(cell culture cytotoxicity)及び一段階ウイルス成長(single-step viral growth)に基づき、各ストック中の欠陥ウイルスベクターの割合を推測した。U87MGにおいて最も高い細胞変性の有効性及びウイルス成長を示した最良のストックは、継代4で出現した。このストックを、その後のインビトロ及びインビボ実験に使用した。
(細胞培養細胞毒性)
本発明者らは、コントロールとなるウイルスベクターとして、2種のヘルパー/欠陥ウイルスベクターを作製した。すなわち、dvHmsi:GFP及びdvHCRL1である。これらは、dvM345の作製方法と全く同じ方法に従い、ヘルパーウイルスとしてG207の重感染とともに、pHmsi:GFP又はpHCRL1をVero細胞にトランスフェクションすることにより得られた。また、本研究において、本発明者らは、継代4から得られた系統を使用した。
本発明者らは、コントロールとなるウイルスベクターとして、2種のヘルパー/欠陥ウイルスベクターを作製した。すなわち、dvHmsi:GFP及びdvHCRL1である。これらは、dvM345の作製方法と全く同じ方法に従い、ヘルパーウイルスとしてG207の重感染とともに、pHmsi:GFP又はpHCRL1をVero細胞にトランスフェクションすることにより得られた。また、本研究において、本発明者らは、継代4から得られた系統を使用した。
ウイルス感染の24時間前に、U87MG、U251、A549、HT29及びB104細胞(1.0×106)を6ウエル皿に蒔いた。ウイルス感染は、1%のIFBSを補充した0.5mlのPBS中で30分間行なった。
ヘルパーウイルス(G207)力価に基づいた0.02のプラーク形成単位(PFU)/細胞のMOIで、U87MG及びU251細胞にdvM345を感染させ、また、ウイルス接種に用いたときと同じ手順によりモック感染細胞(mock-infected cells)から調製した抽出物を用いて、コントロールをモック感染させた。同様に、G207力価に基づき、0.02MOIで細胞にdvHmsi:GFP又はdvHCRL1を感染させた。グリオーマ細胞株(U87MG及びU251)に関しては、dvHCRL1はコントロールウイルスとしても使用した。生存細胞数は、感染後6時間毎に行なったトリパンブルー排除法により決定した。アッセイは、全て3回ずつ行なった。
A549、HT29及びB104細胞に関しては、0.1のMOIでウイルス感染を行なった。その他の点においては、実験は上記と同様の方法で行なった。
(一段階ウイルス成長)
6ウエル皿のU87MG又はA549のサブコンフルエントな単層を、0.02(U87MG)又は0.1(A549)のMOIで、1%のIFBSを補充した0.5mlのPBS中のdvM345、dvHmsi:GFP又はヘルパーウイルス(G207)単独で感染させた。数値(count)は、ヘルパーウイルス(G207)力価に基づいた。感染後4時間毎にウイルスをウエルから収集し、ヘルパーウイルス(G207)の滴定を行なった。プラーク数をカウントし、プラーク形成単位毎ミリリットル(plaque-forming units per mililiter)(PFU/ml)と表した。実験は、また3回ずつ行なった。
6ウエル皿のU87MG又はA549のサブコンフルエントな単層を、0.02(U87MG)又は0.1(A549)のMOIで、1%のIFBSを補充した0.5mlのPBS中のdvM345、dvHmsi:GFP又はヘルパーウイルス(G207)単独で感染させた。数値(count)は、ヘルパーウイルス(G207)力価に基づいた。感染後4時間毎にウイルスをウエルから収集し、ヘルパーウイルス(G207)の滴定を行なった。プラーク数をカウントし、プラーク形成単位毎ミリリットル(plaque-forming units per mililiter)(PFU/ml)と表した。実験は、また3回ずつ行なった。
(動物実験)
Japan SLC社より購入した、生後6週間の胸腺欠損のBALB/c雌ヌードマウス(nu/nu)を、5匹又は5匹以下のグループにして無菌ケージで飼育し、オートクレーブした(autoclaved)食物及び水を自由に利用できるようにした。全ての動物手順(animal procedure)はLaboratory Animal Center(慶應義塾大学医学部)により承認された。外科的手順に関しては、84%の静菌性生理的食塩水(bacteriostatic saline)、10%のペントバルビタールナトリウム(50mg/ml;Abbott Laboratories社製)及び6%のエチルアルコールからなる溶液を、各マウスの腹腔内に0.25ml投与して麻酔をかけた。マウスの生存状態を確認するために毎日巡回した。
Japan SLC社より購入した、生後6週間の胸腺欠損のBALB/c雌ヌードマウス(nu/nu)を、5匹又は5匹以下のグループにして無菌ケージで飼育し、オートクレーブした(autoclaved)食物及び水を自由に利用できるようにした。全ての動物手順(animal procedure)はLaboratory Animal Center(慶應義塾大学医学部)により承認された。外科的手順に関しては、84%の静菌性生理的食塩水(bacteriostatic saline)、10%のペントバルビタールナトリウム(50mg/ml;Abbott Laboratories社製)及び6%のエチルアルコールからなる溶液を、各マウスの腹腔内に0.25ml投与して麻酔をかけた。マウスの生存状態を確認するために毎日巡回した。
(モデル1:皮下腫瘍モデル及び皮下腫瘍への新生物内接種)
50μl中の5.0×106のU87MG細胞を右脇腹に注入し、皮下腫瘍を誘発した。移植から約10日後、皮下腫瘍の直径が6mmに到達した頃、マウスをランダムに3つのグループに分けた(各グループにおいて、n=6)。
50μl中の5.0×106のU87MG細胞を右脇腹に注入し、皮下腫瘍を誘発した。移植から約10日後、皮下腫瘍の直径が6mmに到達した頃、マウスをランダムに3つのグループに分けた(各グループにおいて、n=6)。
マウスは、20μlのウイルス緩衝液に懸濁した、1.0×106PFUのG207(グループI)又はdvM345(グループII)を用いて、新生物内(intraneoplastically)で処理した。グループIIIのマウスを、20μlのモック感染抽出物で処理した。腫瘍は、0.1mm以内の外側ノギス測定(external caliper measurements)で測定した。二次元直径測定(bidimensional diameter measurements)により段階的な腫瘍量を得て、腫瘍の成長速度は、aが長軸、bが短軸である、0.5(a×b)日n/0.5(a×b)日0により決定した。腫瘍の直径が24mmを越えた場合、その動物を屠殺した。成長速度の統計学的差異については、不対t検定を用いることにより評価した。
(モデル2:脳内腫瘍モデル及びウイルスの接種)
マウスに麻酔をかけて定位的装置(D. Kopf Instruments社製)で不動化した後、ブレグマ上に直線的な皮膚切開を行ない、頭蓋骨に1mmの穴を開けた。3μlの無血清培地中の2.5×105のU87MG細胞を、5μlのハミルトンシリンジ(Hamilton Company社製)を用いて、ヌードマウスの右前頭葉に定位的に注入した。10日後、マウスをランダムに3つのグループに分けた(各グループにおいて、n=6)。5.0×105のG207(グループII)、dvM345(グループIII)又は3μlのモック感染抽出物(グループI)を同じ配位で定位的に接種し、生存を継続した(and survival was followed)。生存率の統計学的差異については、Wilcoxon signed-ranks testを用いることにより評価した。
マウスに麻酔をかけて定位的装置(D. Kopf Instruments社製)で不動化した後、ブレグマ上に直線的な皮膚切開を行ない、頭蓋骨に1mmの穴を開けた。3μlの無血清培地中の2.5×105のU87MG細胞を、5μlのハミルトンシリンジ(Hamilton Company社製)を用いて、ヌードマウスの右前頭葉に定位的に注入した。10日後、マウスをランダムに3つのグループに分けた(各グループにおいて、n=6)。5.0×105のG207(グループII)、dvM345(グループIII)又は3μlのモック感染抽出物(グループI)を同じ配位で定位的に接種し、生存を継続した(and survival was followed)。生存率の統計学的差異については、Wilcoxon signed-ranks testを用いることにより評価した。
病理学的研究のため、移植から17日後にマウスを5.0×105PFUのG207又はdvM345で処理し、かかる処理の5日後に屠殺した。PBS中の1%のPFA及び0.5%グルタルアルデヒド(Nacalai Tesque社製)で灌流を行なった後、脳を取り除いた。試料をPBS中の1%のPFA及び0.5%のグルタルアルデヒドに4℃で24時間固定した。その後、PBS中の5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトピラノシド(X−gal、1mg/ml;Takara社製)、5mMのフェリシアン化カリウム、5mMのフェロシアン化カリウム及び2mMの塩化マグネシウムを含む基質溶液に腫瘍を37℃で6時間入れ、PBSで洗浄し、30%のショ糖を含む冷えたPBSで1晩インキュベーションした。液体窒素中のOCT化合物(Miles社製)の中で凍結させた後、針路(needle tract)の周辺の脳をクリオスタットで薄く切断した。切片をゼラチンでコートしたガラスのスライドに置いた。スライドをPBSで洗浄し、再びX−galで1晩染色し、その後ヘマトキシリン及びエオシン溶液で対比染色を行なった。
dvM345の安全性を確認するため、dvM345の5.0×106PFUを3匹のヌードマウスの右大脳半球に注入し、接種から90日後に屠殺した。脳、肺、肝臓及び腎臓を取り除き、上記の方法と同様に固定及び染色を行なった。
[結果]
[結果]
(悪性グリオーマ細胞におけるMusashi1のmRNA発現)
まず、本発明者らは、10種のヒト由来腫瘍細胞株、すなわち、3種の悪性グリオーマ(U87MG、U251、T98)、1種のニューロブラストーマ(SK−N−SH)、肺癌(A549)、胃癌(TMK−1、MKN74)、大腸癌(HT29、HCT15/W)、膀胱癌(KU19−9、T24)及び前立腺癌(DU145)におけるMusashi1のmRNA発現について、RT−PCR分析により調べた。
まず、本発明者らは、10種のヒト由来腫瘍細胞株、すなわち、3種の悪性グリオーマ(U87MG、U251、T98)、1種のニューロブラストーマ(SK−N−SH)、肺癌(A549)、胃癌(TMK−1、MKN74)、大腸癌(HT29、HCT15/W)、膀胱癌(KU19−9、T24)及び前立腺癌(DU145)におけるMusashi1のmRNA発現について、RT−PCR分析により調べた。
図4に示すように、調べた全ての悪性グリオーマ細胞がMusashi1のmRNAに対し陽性を示した。SK−N−SHも陽性であった。これに対して、今回調べたその他の癌細胞株においては、Musashi1のmRNAは検出されなかった。
(悪性グリオーマ細胞におけるP/Musashi1の転写活性)
腫瘍タイプに特異的な様式(tumor-type specific fashion)においてMusashi1プロモーターが機能するかどうかを調べて確認するため、RT−PCR分析により、Musashi1 mRNAが発現したグリオーマ又はMusashi1 mRNAの発現が検出されなかったA549及びHT29を含むいくつかの腫瘍細胞株におけるGFPレポータープラスミドを用いて、P/Musashi1の転写活性を評価した。P/Musashi1が機能しないB104(データは図示せず)をネガティブコントロールとして使用した。各細胞株において、CMVプロモーターによる蛍光レベル(A)はP/Musashi1によるレベルよりも高かった(B)。しかしながら、細胞株の間の(A)と(B)の割合は、グリオーマ細胞株の方が調べたその他の細胞株と比較して著しく高かった(図5)。
腫瘍タイプに特異的な様式(tumor-type specific fashion)においてMusashi1プロモーターが機能するかどうかを調べて確認するため、RT−PCR分析により、Musashi1 mRNAが発現したグリオーマ又はMusashi1 mRNAの発現が検出されなかったA549及びHT29を含むいくつかの腫瘍細胞株におけるGFPレポータープラスミドを用いて、P/Musashi1の転写活性を評価した。P/Musashi1が機能しないB104(データは図示せず)をネガティブコントロールとして使用した。各細胞株において、CMVプロモーターによる蛍光レベル(A)はP/Musashi1によるレベルよりも高かった(B)。しかしながら、細胞株の間の(A)と(B)の割合は、グリオーマ細胞株の方が調べたその他の細胞株と比較して著しく高かった(図5)。
(培養におけるU87MGのpSRa P/Musashi1:ICP34.5の開存性)
pSRa P/Musashi1:ICP34.5によるICP34.5の発現の効果を調べて確認するため、pSRa P/Musashi1:ICP34.5をU87MG、A549又はB104にトランスフェクションした。モック(PBS)及びpHmsi:GFPをネガティブコントロールとして使用した。トランスフェクションの後、G207を低MOIで重感染させた。2日後、得られたウイルスの収率(G207)をカウントした。pSRa P/Musashi1:ICP34.5をトランスフェクションした細胞と、PBS(モック)をトランスフェクションした細胞とのウイルスの収率の割合を計算した。予想した通り、U87MG(81±3.61)における割合は著しく高く、これに対し、P/Musashi1が効率的に働かないA549(1.13±0.15)及びB104(1.03±0.15)では、ほとんど1.0であった。このことから、U87グリオーマ細胞株において、P/Musashi1がICP34.5を効率的に発現することを確認した。(コントロールプラスミドとしてpHmsi:GFPも使用したところ、その結果はモック(PBS)とほとんど同じであった)。データは、3回の試行の平均及びSDを表す。
pSRa P/Musashi1:ICP34.5によるICP34.5の発現の効果を調べて確認するため、pSRa P/Musashi1:ICP34.5をU87MG、A549又はB104にトランスフェクションした。モック(PBS)及びpHmsi:GFPをネガティブコントロールとして使用した。トランスフェクションの後、G207を低MOIで重感染させた。2日後、得られたウイルスの収率(G207)をカウントした。pSRa P/Musashi1:ICP34.5をトランスフェクションした細胞と、PBS(モック)をトランスフェクションした細胞とのウイルスの収率の割合を計算した。予想した通り、U87MG(81±3.61)における割合は著しく高く、これに対し、P/Musashi1が効率的に働かないA549(1.13±0.15)及びB104(1.03±0.15)では、ほとんど1.0であった。このことから、U87グリオーマ細胞株において、P/Musashi1がICP34.5を効率的に発現することを確認した。(コントロールプラスミドとしてpHmsi:GFPも使用したところ、その結果はモック(PBS)とほとんど同じであった)。データは、3回の試行の平均及びSDを表す。
dvM345の細胞毒性の特徴を調べるため、P/Musashi1が効率的に働くヒト由来グリオーマ細胞株(U87MG及びU251)及び、P/Musashi1が効率的に働かないその他の腫瘍細胞株(A549、HT29及びB104)について検査を行なった。グリオーマ細胞株に関しては、細胞を0.02のMOIで感染させ、dvHmsi:GFP、dvHCRL1又はG207単独をコントロールとして使用した。また、A549、HT29及びB104に関しては、細胞を0.1のMOIで感染させ、dvHmsi:GFP又はG207単独をコントロールとして使用した。感染から18時間後、グリオーマ細胞株においてのみ、dvM345の細胞変性効果とコントロールウイルスの細胞変性効果との間に統計学的な有意差が認められた(p>0.05、不対t検定)(図6A、B)。一方、その他の腫瘍細胞株においては、本研究で使用したウイルスの間で細胞変性効果の差異は認められなかった(図6C、D、E)。
(培養におけるdvM345の成長の特徴)
欠陥ウイルス(dvM345)の存在がヘルパーウイルス(G207)のウイルス収率に影響を与えるかどうかを調べるため、一段階成長分析を行なった。dvHmsiGFP及びヘルパーウイルス(G207)単独をネガティブコントロールとして使用した。その結果、P/Musashi1が効率的に働くU87MGにおいては、早ければ感染から12時間後には、dvM345とコントロールとのウイルス収率(G207)の差が、統計学的に有意であった(p<0.05;不対t検定)(図7A)。また、P/Musashi1が働かないA549においては、差異は認められなかった(図7B)。
欠陥ウイルス(dvM345)の存在がヘルパーウイルス(G207)のウイルス収率に影響を与えるかどうかを調べるため、一段階成長分析を行なった。dvHmsiGFP及びヘルパーウイルス(G207)単独をネガティブコントロールとして使用した。その結果、P/Musashi1が効率的に働くU87MGにおいては、早ければ感染から12時間後には、dvM345とコントロールとのウイルス収率(G207)の差が、統計学的に有意であった(p<0.05;不対t検定)(図7A)。また、P/Musashi1が働かないA549においては、差異は認められなかった(図7B)。
(皮下U87MG腫瘍における新生物内接種)
U87MG細胞株を用いて、BALB/c(nu/nu)マウスの脇腹の皮下組織に異種移植腫瘍を作製した。腫瘍が直径で約6mmに到達したとき、1.0×106PFUのG207(グループII)、dvM345(グループIII)又はモック抽出物(グループI)を脇腹の腫瘍の新生物内に注入した。接種より6日目以降、3つのグループの腫瘍の大きさが分かれた(図8)。コントロール動物(グループI)の腫瘍による負担が大きくなったため(直径で>24mm)、実験を16日目に終了したが、グループIとグループIIとの平均腫瘍成長割合の差は統計学的に有意であった(p<0.0005、不対t検定)。さらに重要なことには、グループIIとグループIIIとの差は、統計学的に有意であった(p<0.0005)。16日目におけるグループIIの腫瘍の成長率は、9.94±1.13(SEM)、グループIIIの成長率は1.42±0.71であり、グループIIIの成長率は21.9±1.37であった。
U87MG細胞株を用いて、BALB/c(nu/nu)マウスの脇腹の皮下組織に異種移植腫瘍を作製した。腫瘍が直径で約6mmに到達したとき、1.0×106PFUのG207(グループII)、dvM345(グループIII)又はモック抽出物(グループI)を脇腹の腫瘍の新生物内に注入した。接種より6日目以降、3つのグループの腫瘍の大きさが分かれた(図8)。コントロール動物(グループI)の腫瘍による負担が大きくなったため(直径で>24mm)、実験を16日目に終了したが、グループIとグループIIとの平均腫瘍成長割合の差は統計学的に有意であった(p<0.0005、不対t検定)。さらに重要なことには、グループIIとグループIIIとの差は、統計学的に有意であった(p<0.0005)。16日目におけるグループIIの腫瘍の成長率は、9.94±1.13(SEM)、グループIIIの成長率は1.42±0.71であり、グループIIIの成長率は21.9±1.37であった。
(dvM345処理後の、U87脳内グリオーマを移植した胸腺欠損マウスの生存)
脳内U87腫瘍モデルを有するヌードマウスを用いた生存研究において、G207(グループII)又はモック抽出物(グループI)で処理したマウスの生存と比較して、dvM345(グループIII)で処理したマウスの生存では統計学的に有意な生存の延長を確認した(図9)。また、dvM345の安全性について調べるため、3匹のマウスで実験を行なった。今回、技術的に得られた最も高い用量(highest dose technically obtained)は、5.0×106PFUであった。全てのマウスが、ウイルスの接種より3ヶ月後まで、顕著な副作用を示さずに生存した。かかるマウスの脳、肺、肝臓及び腎臓の切片は、針路の周辺の瘢痕を除いては、異常を見せなかった。
脳内U87腫瘍モデルを有するヌードマウスを用いた生存研究において、G207(グループII)又はモック抽出物(グループI)で処理したマウスの生存と比較して、dvM345(グループIII)で処理したマウスの生存では統計学的に有意な生存の延長を確認した(図9)。また、dvM345の安全性について調べるため、3匹のマウスで実験を行なった。今回、技術的に得られた最も高い用量(highest dose technically obtained)は、5.0×106PFUであった。全てのマウスが、ウイルスの接種より3ヶ月後まで、顕著な副作用を示さずに生存した。かかるマウスの脳、肺、肝臓及び腎臓の切片は、針路の周辺の瘢痕を除いては、異常を見せなかった。
Claims (8)
- Musashi1プロモータと、その下流に連結されたHSVの複製増殖能に関与する遺伝子と、Musashi1プロモータによる前記遺伝子の転写を終結させるポリA配列と、HSVoriと、HSVのa倒置反復配列とを備えたことを特徴とするアンプリコンベクター。
- HSVの複製増殖能に関与する遺伝子が、HSVのγ34.5遺伝子であることを特徴とする請求項1記載のアンプリコンベクター。
- 宿主細胞に、(1)Musashi1プロモータと、その下流に連結されたHSVの複製増殖能に関与する遺伝子と、Musashi1プロモータによる前記遺伝子の転写を終結させるポリA配列と、HSVoriと、HSVのa倒置反復配列とを備えたアンプリコンベクターと、(2)前記HSVの複製増殖能に関与する遺伝子が破壊・欠損・置換等により不活性化されてHSVの複製増殖能に関与する遺伝子産物を発現する機能を失ったヘルパーウイルスとを、ともに感染させることにより得ることができる、感染細胞内でHSVの複製増殖能に関与する遺伝子産物を発現することができる前記アンプリコンベクター由来のウイルス粒子と、前記HSVの複製増殖能に関与する遺伝子産物を発現する機能を失ったヘルパーウイルス由来のウイルス粒子とを含むことを特徴とするウイルスストック。
- 感染細胞が、ヒトグリオーマ細胞、又はニューロブラストーマ等の未分化神経上皮腫瘍細胞であることを特徴とする請求項3記載のウイルスストック。
- HSVの複製増殖能に関与する遺伝子が、HSVのγ34.5遺伝子であることを特徴とする請求項3又は4記載のウイルスストック。
- ヘルパーウイルスが、HSVのγ34.5及びリボヌクレオチドリダクターゼを発現する機能を失ったヘルパーウイルスであることを特徴とする請求項3〜5のいずれか記載のウイルスストック。
- 請求項3〜6のいずれか記載のウイルスストックを有効成分とすることを特徴とするヒトグリオーマ治療薬。
- 請求項7記載のヒトグリオーマ治療薬を、ヒトグリオーマに直接投与することを特徴とするヒトグリオーマの治療方法。
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