KR102333650B1 - 신규한 인간 상피세포성장인자 융합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

신규한 인간 상피세포성장인자 융합 단백질 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 본 발명은 신규한 인간 상피세포성장인자 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 본 발명의 인간 상피세포성장인자(hEGF) 융합 단백질은, 바실러스 서브틸리스 CH2-유래 키토산아제 시그널 펩타이드; 인간 상피세포성장인자(hEGF); 및 세포투과 펩타이드인 폴리아르기닌로 구성되어 있으며, 이를 이용할 경우, 목적 단백질의 수용성 및 발현율이 향상될 뿐만 아니라, 피부 세포 성장 증가 및 상처 치유 효과와 같은 유용한 효능이 현저하게 증진하였는바, 기능성 화장료 조성물 및 약학 조성물의 유효성분으로서 다양한 산업에 널리 활용될 수 있다.

Description

신규한 인간 상피세포성장인자 융합 단백질 및 이의 용도{Novel Human Epidermal Growth Factor Fusion Protein and Uses Thereof}
본 발명은 신규한 인간 상피세포성장인자 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.
인간의 상피세포 성장인자는 상처 치유 효과가 탁월하여 일반상처, 심한 화상, 욕창, 피부괘양, 하지 정맥성 궤양 등의 치료에 사용되어 왔다. 최근에는 피부세포를 재생시키고 콜라겐의 형성을 촉진한다고 알려져 기능성 화장품 원료로도 사용되고 있다.
이러한 인간 상피세포성장인자의 생산을 위해 많은 연구가 진행되어 왔으나, 정제과정 중 발생하는 여러 문제점들, 특히, 침전 및 빈번한 농축 과정에서 발생하는 회수율 감소 등으로 대량생산 공정에는 적합하지 못한 문제점들이 발생하였다. 이 후, 인간 상피세포성장인자를 암호화하는 유전자를 대장균, 고초균, 효모 등에서 발현시키고자 하는 시도가 보고되었지만, 고초균 및 효모에서의 발현율은 매우 낮았으며, 대장균에서 발현시킬 경우에는 세포 내에서 쉽게 단백질 분해효소에 의해 분해되어 발현율과 수율이 낮은 것으로 확인되었다. 이 후, 순도가 높은 인간 상피세포성장인자를 얻기 위한 과정으로 C18 컬럼을 사용한 고속액체 크로마토그래피(HPLC) 정제 방법 등의 공정단계가 필요하여 가격이 매우 비싸지는 단점을 가지고 있었다.
재조합 단백질의 생산 분야의 궁극적인 목표는 높은 특이성과 함께 우수한 생산 효율을 갖는 재조합 단백질 생산 기술을 개발하는데 있다. 이러한 목표를 달성하기 위하여, 재조합 벡터 및 숙주세포 시스템에 관한 연구가 진행되고 있으며, 일례로서, 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 및 대장균 (E. coli) 등과 같은, 숙주세포에서 목적 단백질을 발현시키기 위한 다양한 발현 벡터들이 개발되어 왔다. 그러나 상기 목적 단백질의 발현에 있어서, 재조합된 단백질이 숙주세포 내에서 불용성 봉입체 (Inclusion body)로 변환되거나 단백질 분해효소에 의해 분해되고, 발현 과정에서 화학 변형 (Chemical modification)에 실패하는 등 상당한 정도의 결함 요인이 여전히 존재하는 실정이다.
이와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위한 방안 중 하나로서, 치료를 위한 약물이나 단백질을 세포 내로 이동시키는데 있어 목적 단백질을 세포막을 거쳐 직접 전달하는 방법을 생각할 수 있다. 그러나, 단백질은 크기나 여러 가지 생화학적 성질 때문에 세포막을 통과하기가 매우 어렵다. 일반적으로 분자량 600달톤 이상의 물질은 세포막을 통과하기가 거의 불가능한 것으로 알려져 있다.
최근에는 거대분자를 세포 안으로 운반시킬 수 있는 운반체 역할을 하는 펩타이드인 세포 투과 펩타이드가 개발됨으로써 이를 이용하여 세포 내로 목적 대상의 전달을 시도하고 있다.
세포 투과 펩타이드(Cell Penetrating Peptides, CPP)는 약 10-30개 정도의 짧은 세포막 투과성 펩타이드로 대부분 단백질-투과 도메인(Protein-Transduction Domain, PTD)이나 막-이동 시퀀스 (Membrane-Translocating Sequence, MTS)로부터 유도되었다. 이러한 이유로 CPP는 PTD 혹은 MTS로 칭하기도 한다. 일반적인 외부 물질의 세포 내 유입 경로와는 달리 CPP는 세포막에 손상을 주지 않으면서도 세포 내로 이동하고, 세포막을 통과하지 못하는 DNA나 분자량이 큰 단백질까지도 세포 내로 전달시킬 수 있는 획기적인 역할을 하는 물질로서 대표적으로 TAT(transacting transcription factor), Pep-1 등이 알려져 있다.
그러나, 모든 단백질이 이러한 펩타이드와 융합 단백질을 이루어 세포 내로 투과될 수 있는 것은 아니다.
2001년, 2004년 그리고 2007년에, Tat 형질도입부위와 결합시킨 단백질이 세포 내로 도입은 되었으나 활성을 나타내지 않는다는 연구결과가 논문으로 발표된 사실이 있다 [Sengoku, T. et al. Experimental Neurology 188(2004) 161-170, Falnes P.O. et al. Biochemistry 2001 Apr 10;40(14):4349-4358, Daniele Peroni et al., Neuroscience letters 421(2007) 110-114 등].
즉, 세포도입이 용이하지 않은 단백질에 단백질수송도메인을 융합시킨다고 해서 융합된 모든 단백질이 세포 내로 도입된 후 원활한 활성을 나타낸다고 단정할 수는 없는 것이다. 또한, 운반체 역할을 하는 특정 펩타이드를 목적단백질에 융합시킬 경우, 목적단백질이 산업적으로 이용이 가능할 만큼 대량으로 발현된다고도 단정할 수 없다. 따라서, 운반체 역할을 하는 특정 펩타이드를 목적단백질에 융합시킬 경우, 발현 여부 및 대량으로 발현되는지 여부를 반드시 확인해 봐야 한다.
지금까지 생명공학 기술에 의해 산업적으로 생산된 국내의 재조합 단백질은 발현 가능한 재조합 단백질들의 생산 공정 개발에 치중되어 있어서 핵심 원천 기술인 발현 시스템 개발은 외국에 비해 상대적으로 모방 또는 개량 수준의 부가기술로서 개발되고 있다. 또한, 상업적으로나 의약적으로 매우 중요한 단백질은 분비 단백질(secretory protein) 및 막 단백질(membrane protein)들로서 대장균 내에서 발현 시 불용성 응집체를 만드는 난발현성 단백질(difficult-to-express proteins)이여서 개발이 지연되고 있다.
따라서, 이를 극복하기 위해서는 다양한 장점을 지니고 있는 대장균 시스템을 활용하면서, 실제 목적 단백질의 발현 효율을 증대시키기 위한 시그널 펩타이드 및 세포 투과 펩타이드를 도입한 발현 시스템을 개발함으로써, 이에 관한 기반기술을 확보하는 것이 중요하다.
이러한 상황 하에서, 본 발명자들은 상술한 문제점들을 해소하고 보다 고수율로 인간 상피세포성장인자(hEGF)를 생산할 수 있는 재조합 단백질 발현 시스템을 구축하고자 예의 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은, 본 발명의 상피세포성장인자(hEGF) 융합 단백질의 생산을 위한 유전자 컨스트럭트(construct)를 이용하는 경우, 본 발명의 hEGF 융합 단백질을 고수율로 수득할 수 있을 뿐만 아니라, 생산된 본 발명의 hEGF 융합 단백질은 상업용 hEGF보다 탁월한 세포 성장 및 상처 치유 효능을 발휘하는 것을 확인하여, 본 발명이 대량 생산 공정에 적합함을 규명함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 일 목적은, 인간 상피세포성장인자(hEGF) 융합 단백질의 생산을 위한 유전자 컨스트럭트(construct)를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은, 인간 상피세포성장인자(hEGF) 융합 단백질을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은, 인간 상피세포성장인자(hEGF) 융합 단백질의 생산을 위한 재조합 발현벡터를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은, 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질전환 재조합 미생물을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은, 인간 상피세포성장인자(hEGF) 단백질의 생산 방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은, 인간 상피세포성장인자(hEGF) 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 질환 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은, 인간 상피세포성장인자(hEGF) 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 식품 조성물을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은, 인간 상피세포성장인자(hEGF) 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로서 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명에서 상에 기재된 특징, 단계, 구조 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 단계, 구조 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의하지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 인간 상피세포성장인자(hEGF) 융합 단백질의 생산을 위한 유전자 컨스트럭트(construct)를 제공하며, 상기 유전자 컨스트럭트는, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) CH2-유래 키토산아제(Chitosanase) 시그널 펩타이드를 코딩하는 유전자; 목적단백질인 인간 상피세포성장인자(hEGF)를 코딩하는 유전자; 세포 투과 펩타이드인 폴리아르기닌(polyarginine)을 코딩하는 유전자; 및 바실러스 서브틸리스 CH2 유래의 베타-글루카네이즈(β-Glucanase)를 코딩하는 유전자를 포함하고; 상기 폴리아르기닌을 코딩하는 유전자와 상기 베타-글루카네이즈를 코딩하는 유전자 사이에 TA 서열을 삽입하여 연결한 것을 특징으로 한다.
본 발명의 유전자 컨스트럭트는 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 임의의 바실러스 서브틸리스 CH2-유래 키토산아제(Chitosanase) 시그널 펩타이드를 코딩하는 유전자; 임의의 인간 상피세포성장인자를 코딩하는 유전자; 임의의 폴리아르기닌(polyarginine)을 코딩하는 유전자; 및 임의의 바실러스 서브틸리스 CH2 유래의 베타-글루카네이즈(β-Glucanase)를 코딩하는 유전자의 염기서열을 포함하여 이용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 유전자 컨스트럭트는 서열번호 6으로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로는, 상기 유전자는 서열번호 6의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 바실러스 서브틸리스 CH2-유래 키토산아제(Chitosanase) 시그널 펩타이드를 코딩하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것이고; 상기 인간 상피세포성장인자를 코딩하는 유전자는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있고, 바람직하게는 대장균 코돈 최적화된 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 것이며; 상기 폴리아르기닌(polyarginine)을 코딩하는 유전자는 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 것이고; 및 바실러스 서브틸리스 CH2 유래의 베타-글루카네이즈(β-Glucanase)를 코딩하는 유전자는 서열번호 5로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로는, 상기 유전자는 서열번호 6의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 "코돈 최적화"는 코딩된 단백질이 유기체에서 보다 효율적으로 발현되도록 특정 유기체에서 우선적으로 사용되는 것으로 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 코돈을 변화시키는 것을 의미한다. 대부분의 아미노산이 "동의어" 또는 "동의" 코돈이라고 하는, 몇몇 코돈에 의해 표시된다는 점에서, 유전자 코드가 축퇴적이지만, 특정 유기체에 의한 코돈 용법은 임의적이지 않고 특정 코돈 트리플렛에 편향적이다. 이러한 코돈 용법 편향성은 소정 유전자, 공통 기능 또는 조상 기원의 유전자, 고도로 발현되는 단백질 대 낮은 복제수 단백질, 및 유기체 게놈의 집합적 단백질 코딩 영역과 관련하여 더 높을 수 있다. 본 발명의 서열번호 3의 염기서열은 인간 유래 상피세포성장인자 단백질 코딩 유전자가 대장균 내에서 발현될 수 있도록 대장균의 코돈에 최적화된 서열이다.
특히, 본 발명의 컨스트럭트 내에 바실러스 서브틸리스 CH2 유래의 베타-글루카네이즈(β-Glucanase)를 코딩하는 유전자를 도입하고, 폴리아르기닌을 코딩하는 유전자와 상기 베타-글루카네이즈를 코딩하는 유전자 사이에 TA 서열을 삽입하여 연결한 경우, 상술한 구성의 도입에 따라 최종 산물인 hEGF 단백질 생산량 및 배양액 내 분비량이 탁월하게 증가하는 것을 최초로 발견하고 입증하였다.
즉, 바실러스 서브틸리스 CH2 유래 키토산아제의 시그널 펩타이드(Signal peptide)를 이용하여 인간 상피세포성장인자와 세포투과펩타이드(Cell Penetrating Peptide)인 폴리아르기닌의 융합 단백질을 대장균의 세포 내막과 외막 사이로 이동시키고 산업적 활용이 바로 가능한 수용성 형태로 과잉생산이 달성되도록 한 것이다.
또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 인간 상피세포성장인자(hEGF) 융합 단백질을 제공한다.
본 발명의 융합 단백질은 바실러스 서브틸리스 CH2-유래 키토산아제 시그널 펩타이드 및 세포투과 펩타이드인 폴리아르기닌이 각각 인간 상피세포성장인자의 N-말단 및 C-말단에 결합되도록 인위적으로 재조합(융합)시킨 hEGF 융합 단백질을 의미하며, 본 명세서에서 "hEGF 단백질" 또는 "융합 단백질" 또는 "재조합 단백질"과 혼용하여 사용된다.
본 발명에서, 본 발명의 hEGF 융합 단백질은 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 신규 단백질로서 증가된 세포 성장 및 상처 치유 효과를 발휘한다.
본 발명에 따른 세포 성장 및 상처 치유 효과가 증가된 hEGF 융합 단백질의 범위는 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 10의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 10으로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 활성"이란 세포 증식, 성장, 생존 증가 및 상처 치유 활성을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 바실러스 서브틸리스 CH2-유래 키토산아제 시그널 펩타이드는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것이고; 상기 인간 상피세포성장인자는 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것이며; 상기 폴리아르기닌은 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질은 바실러스 서브틸리스 CH2-유래 키토산아제 시그널 펩타이드 및 폴리아르기닌이 각각 상기 EGF의 N-말단 및 C-말단에 직접적으로 연결될 수도 있고, 링커를 통해 연결될 수도 있다. 상기 링커는 상기 융합 단백질의 효소활성을 향상시키는 효과를 나타내게 하는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 글라이신, 알라닌, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 리신, 아르기닌산 등의 아미노산을 사용하여 연결시킬 수 있고, 보다 바람직하게는 발린, 루이신, 아스파르트산, 글라이신, 알라닌, 프롤린 등을 여러개 사용하여 연결시킬 수 있으며, 가장 바람직하게는 유전자 조작의 용이성을 고려하여 글라이신, 발린, 루이신, 아스파르트산 등의 아미노산을 1개 내지 5개씩 연결하여 사용할 수 있다.
상기 융합 단백질은 이에 포함되는 각 도메인의 야생형의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 폴리펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 또한, 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 단백질의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 단백질을 포함할 수 있다.
상기 융합 단백질 또는 상기 융합 단백질을 구성하는 폴리펩티드는 당해 분야에 공지된 화학적 펩티드 합성방법으로 제조하거나, 상기 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 PCR (polymerase chain reaction) 에 의해 증폭하거나 공지된 방법으로 합성한 후 발현벡터에 클로닝하여 발현시켜서 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 유전자 컨스트럭트를 포함하는, 인간 상피세포성장인자(hEGF) 융합 단백질의 생산을 위한 재조합 발현벡터 및 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질전환 재조합 미생물인 숙주 세포를 제공한다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 발명에서, 상기 세포 성장 및 상처 치유 효과가 증가된 hEGF 코딩 유전자는 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.
상기 세포 성장 및 상처 치유 효과가 증가된 hEGF 융합단백질을 코딩하는 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli BL21, E. coli Rosetta, E. coli JM109, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내 균과 균주 등이 있다.
또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포는 바람직하게는 대장균일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 E. coli BL21(DE3)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법(Hanahan, D., 1983 J. Mol. Biol. 166, 557-580) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
상기 목적 유전자는 제한효소 부위를 통해 클로닝될 수 있고, 단백질 절단효소 인식부위를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 사용된 경우에는 상기 폴리뉴클레오티드와 틀이 맞도록(in frame) 연결되어, 목적 단백질 분비 후 단백질 절단효소로 절단 시, 원래 형태의 외래단백질이 생산될 수 있도록 할 수 있다.
본 발명의 용어 "작동가능하게 연결(operably linked)"이란, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 상태를 의미한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 발현 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 인간 상피세포성장인자(hEGF) 융합 단백질의 생산 방법을 제공한다:
(a) 바실러스 서브틸리스 CH2-유래 키토산아제(Chitosanase) 시그널 펩타이드를 코딩하는 유전자, 목적단백질인 인간 상피세포성장인자(hEGF)를 코딩하는 유전자, 세포 투과 펩타이드인 폴리아르기닌(polyarginine)을 코딩하는 유전자; 및 바실러스 서브틸리스 CH2 유래의 베타-글루카네이즈(β-Glucanase)를 코딩하는 유전자를 융합한 컨스트럭트(construct)를 포함하는, 재조합 발현벡터를 제조하는 단계로서,
상기 유전자 컨스트럭트는, 상기 폴리아르기닌을 코딩하는 유전자와 상기 바실러스 서브틸리스 CH2 유래의 베타-글루카네이즈를 코딩하는 유전자 사이에 TA 서열을 삽입하여 연결한 것이고;
(b) 상기 (a) 단계의 재조합 발현벡터를 미생물에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 형질전환체를 배양하여 인간 상피세포성장인자(hEGF) 융합 단백질의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계.
또한, 추가적으로, 상기 (c) 단계에서, 상기 인간 상피세포성장인자(hEGF) 융합 단백질의 발현 유도 전 상기 형질전환체를 고농도로 배양 및 배지를 교체하는 단계를 추가적으로 실시함으로써, hEGF 융합 단백질의 생산 수율을 증가시킬 수 있다.
더욱 상세하게는, 시그널 펩타이드와 세포 투과 펩타이드를 목적단백질의 유전자에 연결하고, 전사 과정에서 RNA를 보호하기 위한 용도로 바실러스 서브틸리스 CH2 유래의 베타-글루카네이즈 유전자 및 TA 서열을 도입한 발현벡터를 제조하고, 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하고, 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 단백질의 발현을 유도하고 이를 수득하는 공정을 포함하는 재조합 단백질의 생산 방법으로서, 바실러스 서브틸리스 CH2-유래 키토산아제 시그널 펩타이드를 도입함으로써 재조합 단백질의 배양액 내로의 배출을 향상시키고, 폴리아르기닌을 세포 투과 펩타이드로 사용하여 발현시킴으로써 재조합 단백질의 이동성을 향상시켰다.
본 발명의 용어 "배양"이란, 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 방법을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 형질전환체를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 본 발명의 융합단백질을 발현시켜서 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.
배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 주 탄소원으로 사용하며 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.
또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.
또한, 배양물로부터 상기 융합단백질을 회수하는 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 회수 방법은 생산된 본 발명의 융합단백질을 회수할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 인간 상피세포성장인자(hEGF) 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 질환 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 상기 "예방"이란 상기 약학적 조성물의 투여로 피부 질환을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 또한, 상기 "치료"란 상기 약학적 조성물의 투여로 피부 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 hEGF 융합 단백질은 시판용 hEGF 보다도 더욱 탁월한 세포 성장 및 상처 치유 효과를 발휘한다.
기존 연구를 통하여 상피세포성장인자는 주로 장관 점막, 각막 표피 조직, 폐 표피 조직의 재생 및 분화를 자극함으로써, 표피 증식, 혈관형성 촉진 및 상처치유력 증강, 위산 분비 억제 역할 등을 하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서 제공하는 융합단백질은 상기 EGF가 갖는 효과를 향상시킬 수 있음을 확인하였으므로, 본 발명의 hEGF 융합 단백질은 피부 상처 및 피부 노화(탄력 저하) 뿐만 아니라 EGF 단백질이 종래 사용되었던 질환, 즉, 아토피 피부염, 접촉성 피부염, 각막질환 및 위궤양 등의 예방 또는 치료에 다양하게 응용될 수 있다.
본 발명에 있어서, '피부 질환'이란 상처, 창상, 건선, 아토피 피부염, 접촉성 피부염, 족부궤양, 압박궤양, 구강 점막염 또는 화상을 포함하며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때, 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
이와 같이 제조된 약학적 조성물은 목적하는 바에 따라 비경구 방식 즉, 피하 투여, 근육 투여 또는 국소적용(topical application)할 수 있으며, 용량은 일일 투여량이 0.01ng 내지 10000㎎/㎏의 양을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 투여시간, 투여방법, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 융합 단백질을 포함하는 피부외용제용 약학조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 용어 "피부외용제"란, 유지류, 바셀린, 라놀린, 글리세롤 등의 다양한 기제에 약품을 혼합하여 쉽게 피부에 바를 수 있도록 한 고형, 반고형 또는 액상의 외용약을 의미한다. 외용 제형은 특별히 한정되지 않으나, 파우더, 젤, 연고, 크림, 액체 또는 에어로졸 제형이 바람직하다.
본 발명의 목적상 상기 피부외용제는 본 발명의 융합단백질을 포함하고, 적절한 피부외용제용 담체인 기제를 포함하는 제제로 해석될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명의 조성물은 유효성분으로서 상술한 본 발명의 융합 단백질을 포함하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 인간 상피세포성장인자(hEGF) 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 식품 조성물 또는 기능성 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 hEGF 융합 단백질을 포함하는 조성물이 기능성 식품 조성물 또는 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 hEGF 융합 단백질 뿐만 아니라, 기능성 식품 또는 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물[예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
본 발명의 기능성 식품 또는 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 유효성분 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액 또는 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 유효성분으로서 상술한 본 발명의 융합 단백질을 포함하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 인간 상피세포성장인자(hEGF) 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "피부 상태 개선"이란, 피부의 내재적 요인 또는 외인적인 요인에 의하여 유발되는 피부의 손상을 치료, 경감, 완화시키는 과정 또는 그의 효과 등을 포괄적으로 의미하며, 보다 구체적으로는 본 발명의 융합단백질을 피부에 도포함으로써 유도될 수 있는,피부 노화 억제, 피부 탄력 개선, 피부 재생, 상처 또는 창상 회복, 각막 재생, 피부자극완화 등을 의미한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 화장료 조성물에서, 본 발명의 융합단백질의 함량은 화장료 조성물 총 중량 대비 0.000001 내지 10 중량%로 포함되는 것이 바람직하다.
상기 단백질의 함량이 0.000001 중량% 미만인 경우에는 주름 개선 및 피부 탄력 유지 효과가 미비하며, 10 중량% 이상인 경우에는 함유량 증가에 대한 효과 증대 정도가 미미하며, 제형상의 안전 및 안정성에 문제가 있을 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에는 상기 유효성분 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭과 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.
본 발명의 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 스킨, 스킨 소프트너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 아이 크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 클렌징폼, 클렌징 워터, 클렌징 로션, 클렌징 크림, 바디로션, 바디클렌져, 비누 및 파우더의 화장품 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히, 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로 히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 피부 상태 개선용 화장료 조성물을 포함하는 기능성 화장품을 제공할 수 있다.
본 발명의 용어 "기능성 화장품(cosmedical, cosmeceutical)"이란 화장품에 의약품의 전문적인 치료기능이 도입되어, 일반 화장품과 달리 생리활성적인 효능, 효과가 강조된 전문적인 기능성을 갖는 제품으로서, 피부 주름 개선에 도움을 주는 제품, 피부를 탄력을 증진시키는데 도움을 주는 제품 중에서 보건복지부령이 정하는 화장품을 의미한다.
본 발명의 상기 화장료 조성물에 일반 피부용 화장품의 제조시에 사용되는 적절한 담체를 가하여, 기능성 화장품을 제조할 수 있다. 이때, 사용되는 담체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 유분, 물, 계면 활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 단독으로 또는 적절히 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 기능성 화장품은 피부 세포 성장 촉진 및 상처 치유 효과 등의 피부 상태 개선 효과를 나타내고, 그의 제형은 특별히 제한되는 것은 아니나, 예를 들면, 용액, 유탁액, 현탁액, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 파우더, 스프레이, 계면활성제-함유 클린징, 오일, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 파운데이션, 메이크업베이스, 에센스, 화장수, 폼, 팩, 유연수, 선 스크린 크림, 선오일 등의 제형으로 제조될 수 있고, 바람직하게는 피부외용연고, 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 팩, 에멀젼 또는 오일젤의 제형으로 제조될 수 있는데, 이때, 사용되는 담체는 화장품의 제형에 따라 선택적으로 사용될 수 있다.
예를 들어, 연고, 페이스트, 크림 또는 젤 형태의 화장품을 제조할 경우에는, 담체 성분으로서 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있고; 파우더 또는 스프레이 형태의 화장품을 제조할 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더, 클로로플루오로하드로카본, 프로판/부탄, 디메틸 에테르 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며; 용액 또는 유탁액 형태의 화장품을 제조할 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일, 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있고; 현탁액 형태의 화장품을 제조할 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록시드, 벤토나이트, 아가, 트라칸트 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며; 화장비누 형태의 화장품을 제조할 경우에는, 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 유효성분으로서 상술한 본 발명의 융합 단백질을 포함하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 인간 상피세포성장인자(hEGF) 융합 단백질은, 바실러스 서브틸리스 CH2-유래 키토산아제 시그널 펩타이드; 인간 상피세포성장인자(hEGF); 및 폴리아르기닌이 결합되어, 목적 단백질의 수용성 및 발현율을 향상시키면서, 피부 세포 성장 증가 및 상처 치유 효과와 같은 유용한 효능을 현저하게 증진시키므로, 난치성 만성 피부 궤양과 위궤양 등의 피부질환 치료제뿐만 아니라, 주름 개선과 피부 재생 촉진을 위한 피부 상태 개선 또는 노화 방지용 기능성 화장료 조성물 및 약학 조성물의 유효성분으로서 다양한 산업에 널리 활용될 것이다.
도 1은 SER 및 SER-BSG의 유전자 서열의 구조를 나타낸다.
도 2는 SER;pET11a로부터 생산된 단백질을 확인한 결과이다.
도 3은 SER-BSG;pET11a로부터 생산된 단백질을 확인한 결과이다.
도 4는 시판되는 hEGF(A)와 SER-BSG(B)의 섬유아세포에 대한 세포재생 효과를 나타낸 결과이다.
도 5는 시판되는 hEGF(A)와 SER-BSG(B)의 섬유아세포에 상처치유 효과를 나타낸 결과이다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 인간 상피세포성장인자(hEGF)-폴리아르기닌(polyarginine, polyR) 융합 단백질의 생산을 위한 재조합 발현벡터 및 형질전환 재조합 미생물의 제작
1-1. 인간 상피세포성장인자(hEGF)-폴리아르기닌(polyarginine, polyR) 융합 단백질의 생산을 위한 재조합 발현벡터의 설계
본 발명자들은 hEGF 단백질에, 바실러스 서브틸리스 CH2 유래의 키토산아제 시그널 펩타이드 및 세포 투과 펩타이드(Cell Penetrating Peptide, 단백질 수송 도메인)인 폴리아르기닌(polyarginine)이 융합된, 신규한 hEGF 융합 단백질을 생산하기 위한 컨스트럭트, 재조합 발현벡터 및 형질전환 재조합 미생물을 하기와 같이 제작하였다.
먼저, 도 1에 나타낸 바와 같이, 목적 단백질인 인간 상피세포성장인자(human epidermal growth factor, hEGF)를 코딩하는 유전자에, hEGF 단백질의 이동성을 개선시키기 위한 세포 투과 펩타이드로서 7 개의 연속된 아르기닌(polyarginine)을 코딩하는 유전자와, 전사 과정에서 RNA를 보호하기 위한 바실러스 서브틸리스 CH2 유래의 베타-글루카네이즈를 코딩하는 유전자를 연결시키고; 이 때, 폴리아르기닌을 코딩하는 유전자와 바실러스 서브틸리스 CH2 유래의 베타-글루카네이즈를 코딩하는 유전자 사이에 TA 서열을 추가적으로 삽입하여 hEGF의 종결코돈(TAA)과 베타-글루카네이즈의 개시코돈(ATG)이 중첩되도록 연결한 것이며; hEGF 융합 단백질을 배양액 내로 배출하기 위한 시그널 펩타이드로서 바실러스 서브틸리스 CH2 유래의 키토산아제 시그널 펩타이드가 hEGF 융합 단백질의 N-말단에 연결되도록 바실러스 서브틸리스 CH2 유래의 키토산아제 시그널 펩타이드를 코딩하는 유전자를 연결시킨 컨스트럭트 SER-BSG (서열번호 6)를 설계하였다.
또한, hEGF를 코딩하는 유전자는, 코돈 최적화된 서열을 이용하였고, 서열번호 3로 나타내었다.
본 실시예에 이용된 컨스트럭트 서열과 hEGF 융합 단백질 서열을 표 1에 나열하였다.
보다 구체적으로, 바실러스 서브틸리스 CH2-유래 키토산아제 시그널 펩타이드를 코딩하는 유전자 서열은 서열번호 1; EGF를 코딩하는, 코돈-최적화된 유전자 서열은 서열번호 3; 폴리아르기닌을 코딩하는 유전자 서열은 서열번호 4; 바실러스 서브틸리스 CH2 유래의 베타-글루카네이즈를 코딩하는 유전자는 서열번호 5; 및 시그널 펩타이드-EGF-폴리아르기닌과 베타-글루카네이즈 사이에 TA로 연결된 컨스트럭트(SER-BSG)는 서열번호 6으로 나타내었다.
특히, 상기 폴리아르기닌 유전자의 종결 코돈으로 TAA를 사용하고, 상기 종결 코돈에 TA 서열을 추가함으로써 개시 코돈이 1개 중첩되는 패턴(TAATG)이 생성되도록 설계하였고, 여기에 유전자로부터 전사되는 과정에서 RNA를 보호하기 위해 바실러스 서브틸리스 CH2 유래 베타-글루카네이즈 유전자를 연결하였다. 그 결과, 베타-글루카네이즈 서열이 폴리아르기닌 유전자의 종결 코돈 이후에 위치됨으로써, 시그널 펩타이드-EGF-폴리아르기닌 유전자(SER)로부터 생산되는 단백질에 융합되지 않으며 전사 과정에서 목적 RNA를 보호하는 효과를 발휘하였다.
또한, 서열번호 6 내 바실러스 서브틸리스 CH2-유래 키토산아제 시그널 펩타이드를 코딩하는 유전자 서열은 밑줄; EGF를 코딩하는 유전자 서열은 굵은 글씨체; 폴리아르기닌을 코딩하는 유전자 서열은 이탤릭체; 및 바실러스 서브틸리스 CH2 유래 베타-글루카네이즈를 코딩하는 유전자 서열은 굵은 밑줄로 나타내었다.
또한, 바실러스 서브틸리스 CH2-유래 키토산아제 시그널 펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 7; EGF의 아미노산 서열은 서열번호 8; 폴리아르기닌의 아미노산 서열은 서열번호 9; 및 시그널 펩타이드-EGF-폴리아르기닌의 아미노산 서열은 서열번호 10으로 나타내었다.
또한, 서열번호 10 내 바실러스 서브틸리스 CH2-유래 키토산아제 시그널 펩타이드 서열은 밑줄; EGF 서열은 굵은 글씨체; 및 폴리아르기닌 서열은 이탤릭체로 나타내었다.
서열명 서열
Bacillus subtilis CH2 Chitosanase SP(signal peptide) nucleotide ATGAAAATCAGTATGCAAAAAGCAGCGATCTCATTACTTGTTTTCACTATGTTTTTTACCCTGATGATGAGTGAAACGGTTTTTGCG (서열번호 1)
human EGF nucleotide AATAGTGACTCTGAATGTCCCCTGTCCCACGATGGGTACTGCCTCCATGATGGTGTGTGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTATGCATGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGATGTCAGTACCGAGACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGC (서열번호 2)
codon-optimized human EGF nucleotide AACTCTGATTCAGAGTGTCCTTTGTCACACGACGGGTATTGTTTACACGATGGCGTGTGCATGTATATTGAAGCCCTGGACAAATATGCCTGCAATTGCGTGGTTGGGTATATTGGGGAGCGTTGTCAATATCGTGACCTGAAATGGTGGGAGCTTCGC (서열번호 3)
Polyargininenucleotide CGTCGTCGTCGTCGTCGCCGT (서열번호 4)
Bacillus subtilis CH2
β-Glucanase nucleotide		 GCAGGGACAAAAACGCCAGTAGCCAAGAATGGCCAGCTTAGCATAAAAGGTACACAGCTCGTTAACCGAGACGGTAAAGCGGTACAGCTGAAGGGGATCAGTTCACACGGATTGCAATGGTATGGAGAATATGTCAATAAAGACAGCTTAAAATGGCTGAGAGATGATTGGGGTATCACCGTTTTCCGTGCAGCGATGTATACGGCAGATGGCGGTTATATTGACAACCCGTCCGTGAAAAATAAAGTAAAAGAAGCGGTTGAAGCGGCAAAAGAGCTTGGGATATATGTCATCATTGACTGGCATATCTTAAATGACGGTAATCCAAACCAAAATAAAGAGAAGGCAAAAGAATTCTTCAAGGAAATGTCAAGCCTTTACGGAAACACGCCAAACGTCATTTATGAAATTGCAAACGAACCAAACGGTGATGTGAACTGGAAGCGTGATATTAAACCATATGCGGAAGAAGTGATTTCAGTTATCCGCAAAAATGATCCAGACAACATCATCATTGTCGGAACCGGTACATGGAGCCAGGATGTGAATGATGCTGCCGATGACCAGCTAAAAGATGCAAACGTTATGTACGCACTTCATTTTTATGCCGGCACACACGGCCAATTTTTACGGGATAAAGCAAACTATGCACTCAGCAAAGGAGCACCTATTTTTGTGACAGAGTGGGGAACAAGCGACGCGTCTGGCAATGGCGGTGTATTCCTTGATCAATCGAGGGAATGGCTGAAATATCTCGACAGCAAGACCATCAGCTGGGTGAACTGGAATCTTTCTGATAAGCAGGAATCATCCTCAGCTTTAAAGCCGGGGGCATCTAAAACAGGCGGCTGGCGGTTGTCAGATTTATCTGCTTCAGGAACATTCGTTAGAGAAAACATTCTCGGCACCAAAGATGCGACGAAGGACATTCCTGAAACGCCAGCAAAAGATAAACCCACACAGGAAAACGGTATTTCTGTACAATACAGAGCAGGGGATGGGAGTATGAACAGCAACCAAGTCCGTCCGCAGCTTCAAATAAAAAATAACGGCAATACCACGGTTGATTTAAAAGATGTCACTGCCCGTTACTGGTATAAAGCGAAAAACAAAGGCCAAAACGTTGACTGTGACTACGCGCAGATTGGATGCGGCAATGTGACACACAAGTTTGTGACGTTGCATAAACCAAAGCAAGGTGCAGATACCTATCTGGAACTTGGGTTTAAAAACGGAACGCTGGGACCGGGAGCAAGCACAGGGAATATTCAGCTTCGTCTTCACAATGATGACTGGAGCAATTATGCACAAAGCGGCGATTATTCCTTTTTCAAATCAAATACGTTTAAAACAACGAAAAAAATCACATTATATGATCAAGGAAAACTGATTTGGGGAACAGAACCAAATTAG (서열번호 5)
SER-BSG nucleotide ATGAAAATCAGTATGCAAAAAGCAGCGATCTCATTACTTGTTTTCACTATGTTTTTTACCCTGATGATGAGTGAAACGGTTTTTGCGGCCAACTCTGATTCAGAGTGTCCTTTGTCACACGACGGGTATTGTTTACACGATGGCGTGTGCATGTATATTGAAGCCCTGGACAAATATGCCTGCAATTGCGTGGTTGGGTATATTGGGGAGCGTTGTCAATATCGTGACCTGAAATGGTGGGAGCTTCGC CGTCGTCGTCGTCGTCGCCGTTA ATGGCAGGGACAAAAACGCCAGTAGCCAAGAATGGCCAGCTTAGCATAAAAGGTACACAGCTCGTTAACCGAGACGGTAAAGCGGTACAGCTGAAGGGGATCAGTTCACACGGATTGCAATGGTATGGAGAATATGTCAATAAAGACAGCTTAAAATGGCTGAGAGATGATTGGGGTATCACCGTTTTCCGTGCAGCGATGTATACGGCAGATGGCGGTTATATTGACAACCCGTCCGTGAAAAATAAAGTAAAAGAAGCGGTTGAAGCGGCAAAAGAGCTTGGGATATATGTCATCATTGACTGGCATATCTTAAATGACGGTAATCCAAACCAAAATAAAGAGAAGGCAAAAGAATTCTTCAAGGAAATGTCAAGCCTTTACGGAAACACGCCAAACGTCATTTATGAAATTGCAAACGAACCAAACGGTGATGTGAACTGGAAGCGTGATATTAAACCATATGCGGAAGAAGTGATTTCAGTTATCCGCAAAAATGATCCAGACAACATCATCATTGTCGGAACCGGTACATGGAGCCAGGATGTGAATGATGCTGCCGATGACCAGCTAAAAGATGCAAACGTTATGTACGCACTTCATTTTTATGCCGGCACACACGGCCAATTTTTACGGGATAAAGCAAACTATGCACTCAGCAAAGGAGCACCTATTTTTGTGACAGAGTGGGGAACAAGCGACGCGTCTGGCAATGGCGGTGTATTCCTTGATCAATCGAGGGAATGGCTGAAATATCTCGACAGCAAGACCATCAGCTGGGTGAACTGGAATCTTTCTGATAAGCAGGAATCATCCTCAGCTTTAAAGCCGGGGGCATCTAAAACAGGCGGCTGGCGGTTGTCAGATTTATCTGCTTCAGGAACATTCGTTAGAGAAAACATTCTCGGCACCAAAGATGCGACGAAGGACATTCCTGAAACGCCAGCAAAAGATAAACCCACACAGGAAAACGGTATTTCTGTACAATACAGAGCAGGGGATGGGAGTATGAACAGCAACCAAGTCCGTCCGCAGCTTCAAATAAAAAATAACGGCAATACCACGGTTGATTTAAAAGATGTCACTGCCCGTTACTGGTATAAAGCGAAAAACAAAGGCCAAAACGTTGACTGTGACTACGCGCAGATTGGATGCGGCAATGTGACACACAAGTTTGTGACGTTGCATAAACCAAAGCAAGGTGCAGATACCTATCTGGAACTTGGGTTTAAAAACGGAACGCTGGGACCGGGAGCAAGCACAGGGAATATTCAGCTTCGTCTTCACAATGATGACTGGAGCAATTATGCACAAAGCGGCGATTATTCCTTTTTCAAATCAAATACGTTTAAAACAACGAAAAAAATCACATTATATGATCAAGGAAAACTGATTTGGGGAACAGAACCAAATTAG (서열번호 6)
SP protein MKISMQKAAISLLVFTMFFTLMMSETVFA (서열번호 7)
human EGFprotein NSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELR (서열번호 8)
Polyarginine RRRRRRR (서열번호 9)
hEGF fusionprotein MKISMQKAAISLLVFTMFFTLMMSETVFAANSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELR RRRRRRR (서열번호 10)
1-2. SER-BSG 유전자 증폭 및 클로닝
본 발명자들은 합성된 SER-BSG은 클로닝을 위해 서열번호 11 및 12의 프라이머를 이용해 PCR을 수행하였다. PCR 반응은 증류수 22ul, 5X GXL polymerase buffer 10 ul, dNTP(2.5mM) 4 ul, 서열번호 11의 프라이머(20 pmol/ul) 1ul, 서열번호 12의 프라이머(20 pmol/ul) 1ul, 합성 SER-BSG 1ul, PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(Takara, Korea) 1ul를 혼합하였다. 반응조건은 94℃에서 5분 동안 변성시킨 후, 94℃에서 30초, 40℃에서 30초, 72℃에서 1분 45초를 15회 반복하였고 마지막으로 72℃에서 5분간 반응을 수행하였다. PCR 반응산물은 Gel purification kit(Bioneer, Korea)을 이용해 정제하였다. pET11a 발현벡터는 제한효소 Nde I과 Bam HI을 이용해 절단한 후 동일한 kit을 이용해 정제하였다.
서열명 서열
정방향 프라이머 GAAGGAGATATACATATG (서열번호 11)
역방향 프라이머 TTGTTAGCAGCCGGAT (서열번호 12)
PCR 산물은 EZ-Fusion Cloning Kit(Enzynomics, Korea)을 이용하여 pET11a 발현벡터 안으로 삽입하였으며 이를 E. coli DH5a에 형질전환 시킨 후 plasmid extraction kit(Bioneer, Korea)을 이용하여 재조합 플라스미드(SER-BSG;pET11a)를 확보하였다.
1-3. SER 유전자 증폭 및 클로닝
또한, 본 발명자들은 바실러스 서브틸리스 CH2 유래 베타-글루카네이즈 유전자의 삽입 유무에 따른 융합 단백질의 내막과 외막 사이로의 이동성 비교를 위한 대조군으로서, 베타-글루카네이즈 유전자를 제거한 SER을 제작하기 위해 상기 실시예 1-2로부터 클로닝된 재조합 플라스미드를 주형으로 서열번호 13 및 14를 이용해 PCR을 수행하였다.
PCR 반응은 증류수 32.9ul, 5X GXL polymerase buffer 10 ul, dNTP(2.5mM) 4ul, 서열번호 13의 프라이머(20 pmol/ul) 1ul, 서열번호 14의 프라이머(20 pmol/ul) 1ul, SER-BSG;pET11a 0.1ul, PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 1ul를 혼합하였다. 반응 조건은 94℃에서 5분 동안 변성시킨 후, 94℃에서 30초, 56℃에서 30초, 72℃에서 6분간을 15회 반복하였고 마지막으로 72℃에서 5 분간 반응을 수행하였다.
서열명 서열
정방향 프라이머 p-GGATCCGGCTGCTAACAAAGC(서열번호 13)
역방향 프라이머 p-TTAACGGCGACGACGACGAC (서열번호 14)
p- 는 프라이머의 5' 방향에 인산기가 연결된 것을 의미한다.
PCR 산물은 Gel purification kit(Bioneer, Korea)을 이용해 정제 후 T4 DNA ligase를 이용해 self-ligation을 진행하였다. Ligation 반응은 증류수 6ul, 정제된 PCR 산물 20 ul와 10X T4 DNA ligase buffer 3ul, T4 DNA ligase 1ul를 혼합하여 16℃에서 1 시간 동안 반응시켰으며 이를 E. coli DH5a에 형질전환 시키고 plasmid extraction kit(Bioneer, Korea)을 이용해 재조합 플라스미드(SER;pET11a)를 확보하였다. 하기 표 4의 서열번호 15는, 대조군으로서 pET11a 벡터에 클로닝된 키토산아제 시그널 펩타이드, 인간 상피세포성장인자 및 7개의 아르기닌을 코딩하는 유전자가 융합된 서열, 즉, 베타-글루카네이즈 유전자를 제거한 SER 유전자 컨스트럭트를 나타낸다.
이 유전자로부터 생성되는 아미노산 서열은 서열번호 10과 동일하다.
서열명 서열
SERnucleotide ATGAAAATCAGTATGCAAAAAGCAGCGATCTCATTACTTGTTTTCACTATGTTTTTTACCCTGATGATGAGTGAAACGGTTTTTGCGGCCAACTCTGATTCAGAGTGTCCTTTGTCACACGACGGGTATTGTTTACACGATGGCGTGTGCATGTATATTGAAGCCCTGGACAAATATGCCTGCAATTGCGTGGTTGGGTATATTGGGGAGCGTTGTCAATATCGTGACCTGAAATGGTGGGAGCTTCGCCGTCGTCGTCGTCGTCGCCGTTAA (서열번호 15)
실시예 3. SER;pET11a 및 SER-BSG;pET11a 로부터 재조합 단백질 생산
본 발명자들은 상기 실시예 2에서 클로닝된 SER;pET11a 및 SER-BSG;pET11a를 E. coli BL21(DE3) 내로 형질전환하였고, 이를 앰피실린이 포함된 LB broth 20ml에서 흡광도 600nm에서 0.7~0.8이 되도록 배양 후 발현유도인자인 IPTG를 최종농도 0.01mM이 되도록 첨가하였다. 이를 10℃와 15℃에서 각각 7일과 3일간 진탕배양하였으며, 1ml씩을 1.5ml 튜브에 넣고 10,000 rpm에서 1분간 원심분리하여 세포만을 수집하였다. 수집된 세포에는 다시 3차 증류수를 500ul 첨가하여 초음파분쇄기를 이용해 세포를 파쇄하였으며 4℃, 15,000rpm에서 1시간 동안 원심분리하여 수용성 단백질과 불용성 단백질을 각각 분리하였다. 발현된 단백질의 확인은 12% Bis-Tris gel(ThermoFisher Scientific, Korea)과 MES buffer를 이용해 확인하였다.
그 결과, 도 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, SER;pET11a과 SER-BSG;pET11a에서 만들어진 단백질 모두 상피세포성장인자와 폴리아르기닌이 융합된 단백질을 생산하는 것을 확인할 수 있다.
특히, 도 2에 나타낸 바와 같이, 10℃에서 7일간 발현을 유도한 결과에서는 SER-BSG;pET11a 에서 생성된 융합단백질이 SER;pET11a에서 생산된 융합단백질에 비해 세포내막과 외막 사이로 이동된 단백질이 증가하고 수용성 단백질 또한 증가한 것을 확인할 수 있다.
또한, 도 3에 나타낸 바와 같이, 15℃에서 3일간 발현시킨 결과에서 SER-BSG;pET11a에서 생성된 융합 단백질의 발현양이 증가하였고 10℃에서 발현시킬 때보다 더 많은 수용성 단백질이 생산되었다.
흥미롭게도, SER-BSG로 구성된 컨스트럭트, 즉, 폴리아르기닌과 베타-글루카네이즈 유전자 사이에 TA 서열을 삽입하고 베타-글루카네이즈 유전자를 도입한 컨스트럭트를 이용하여 단백질 발현을 유도한 경우, 그렇지 않은 컨스트럭트인 SER과 비교하여, 최종 산물인 hEGF 단백질 생산량 및 세포내막 및 외막 사이 영역으로 분비량이 현저하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
즉, hEGF에 상피세포성장인자와 폴리아르기닌이 융합된 본 발명의 hEGF 융합 단백질은 바실러스 서브틸리스 CH2의 키토산아제 유래 시그널 펩타이드를 이용해 대장균의 세포 내막과 외막 사이(페리플라즘 영역)로 이동되고 융합 단백질 유전자의 종결코돈에 개시코돈을 중첩(TAATG)하여 바실러스 서브틸리스 유래의 베타-글루카네이즈 서열을 연결시킴으로써 막 이동 효율 및 수용성 단백질의 생산성을 증가시켰다.
따라서, 이를 양질의 인간 상피세포 성장인자(Epidermal Growth Factor, EGF) 융합 단백질을 대량 생산하는 데 유용하게 이용할 수 있다.
이에, 이하 실시예에서는 폴리아르기닌과 베타-글루카네이즈 유전자 사이에 TA 서열을 삽입하고 베타-글루카네이즈 유전자를 도입한 SER-BSG 컨스트럭트를 도입하여 생산된 hEGF 융합 단백질을 이용하여 실시하였다.
실시예 4. 본 발명의 hEGF 융합 단백질의 세포 재생 효과
본 발명자들은 본 발명의 hEGF 융합 단백질의 인간 섬유아세포 (Human Dermal Fibroblast, HDF) 증식에 대한 효과를 평가하고자, MTT 어세이를 이용하여 세포 생존률를 측정하였다.
먼저, HDF 세포의 배양은 10% FBS를 포함하는 DMEM/F12 (3:1) 혼합 배지를 사용하였으며 HDF 세포를 96-well plate에 1x103 cell/well이 되도록 분주하고, 동시에 시료를 0 ng/ul (대조군), 0.1 ng/ul, 1 ng/ul로 각각 처리한 후 1일, 3일 동안 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다. 이때, 실험 비교군으로 시판되고 있는 hEGF (Sigma-Aldrich)를 가지고 동일한 농도 및 조건 하에서 실험을 수행하였다. 배양이 끝난 후 MTT 용액을 첨가하여 4시간 동안 배양한 뒤 배지를 제거하고 여기에 DMSO를 첨가하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
세포 성장률을 다음과 같이 계산하였다:
세포성장률(%)=
Figure 112020118447720-pat00001
X 100.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 hEGF 융합 단백질을 HDF세포에 0.1 ng/ul로 처리한 실험군에서는, 대조군 대비 1일째 2.3%, 3일째 59.4%로 세포성장률이 증가하였고; 1 ng/ul 처리한 실험군에서는 대조군 대비 1일째 7.8%, 3일째 59.2%의 높은 증가율을 나타내었다.
이는, 본 발명의 hEGF 융합 단백질이 비교군인 시판 hEGF에 비하여 탁월하게 증가된 세포 성장 효능을 발휘한다는 것을 입증한다.
실시예 5. 본 발명의 hEGF 융합 단백질의 상처 치유 효과
본 발명자들은 본 발명의 hEGF 융합 단백질의 인간 섬유아세포에 대한 상처 치유 효능을 평가하였다.
먼저, 70 ul의 섬유아세포 (5x105 cells/ml)를 Culture-insert 배양접시 (ibidi)에 접종하고 24시간이 지난 후 culture-insert를 제거하고 SER-BSG를 0 ng/ul (대조군), 0.1 ng/ul, 1 ng/ul의 농도로 처리하였다. 이때, 실험 비교군으로 시판되고 있는 hEGF (Sigma-Aldrich)를 가지고 동일한 농도 및 조건 하에서 실험을 수행하였다. 배양 3, 6, 9, 12, 24 시간의 세포 이미지를 imageJ 프로그램을 이용해 분석하여 상처 치유 효능을 확인하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 hEGF 융합 단백질을 1 ng/ul 처리한 실험군에서 전반적으로 대조군 및 비교군(시판 hEGF)에 비해, 높은 치유 효과를 나타내었다.
이는, 본 발명의 hEGF 융합 단백질이 비교군인 시판 hEGF에 비하여 탁월하게 증가된 상처 치유 효능을 발휘한다는 것을 입증한다.
종합적으로, 본 발명에 따른 hEGF 유전자에 시그널 펩타이드 유전자, 세포 투과 펩타이드 유전자로서 폴리아르기닌 및 베타-글루카네이즈 유전자가 결합되고 폴리아르기닌 유전자와 베타-글루카네이즈 유전자 사이에 TA 서열이 삽입된 컨스트럭트에 의해 생산된 본 발명의 신규한 인간 상피세포성장인자(hEGF) 융합 단백질은, hEGF 융합 단백질을 생산성이 증가되고 세포 내막과 외막사이로 분비시키는 기능이 향상됨으로써 생산능이 개선되어 고수율로 수득할 수 있어 대량 생산에 유용하게 적용할 수 있을 뿐만 아니라, 시판용 hEGF보다 세포 성장 및 상처 치유 효능이 탁월하므로, 기능성 화장료 조성물 및 피부외용제용 약학 조성물의 유효성분으로서 널리 활용될 수 있을 것이다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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gaaatggtgg 240 gagcttcgcc gtcgtcgtcg tcgtcgccgt taa 273

Claims (18)

  1. 인간 상피세포성장인자(hEGF) 융합 단백질의 생산을 위한 유전자 컨스트럭트(construct)로서,
    상기 유전자 컨스트럭트는, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) CH2-유래 키토산아제(Chitosanase) 시그널 펩타이드를 코딩하는 유전자; 목적단백질인 인간 상피세포성장인자(hEGF)를 코딩하는 유전자; 세포 투과 펩타이드인 폴리아르기닌(polyarginine)을 코딩하는 유전자; 및 바실러스 서브틸리스 CH2 유래의 베타-글루카네이즈(β-Glucanase)를 코딩하는 유전자를 포함하고;
    상기 유전자 컨스트럭트는, 상기 폴리아르기닌을 코딩하는 유전자와 상기 베타-글루카네이즈를 코딩하는 유전자 사이에 TA 서열을 삽입하여 연결한 것을 특징으로 하는, 유전자 컨스트럭트(construct).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 바실러스 서브틸리스 CH2-유래 키토산아제 시그널 펩타이드를 코딩하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 유전자 컨스트럭트(construct).
  3. 제1항에 있어서,
    상기 인간 상피세포성장인자를 코딩하는 유전자는 대장균 코돈 최적화된 서열번호 3로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 유전자 컨스트럭트(construct).
  4. 제1항에 있어서,
    상기 세포 투과 펩타이드인 폴리아르기닌(polyarginine)을 코딩하는 유전자는 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 유전자 컨스트럭트(construct).
  5. 제1항에 있어서,
    상기 바실러스 서브틸리스 CH2 유래의 베타-글루카네이즈(β-Glucanase)를 코딩하는 유전자는 서열번호 5로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 유전자 컨스트럭트(construct).
  6. 제1항에 있어서,
    상기 유전자 컨스트럭트는 서열번호 6으로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 유전자 컨스트럭트(construct).
  7. 인간 상피세포성장인자(hEGF) 융합 단백질로서,
    바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) CH2-유래 키토산아제(Chitosanase) 시그널 펩타이드; 인간 상피세포성장인자; 및 세포투과 펩타이드인 폴리아르기닌(polyarginine)이 융합된 것을 특징으로 하는, hEGF 융합 단백질.

  8. 제7항에 있어서,
    상기 바실러스 서브틸리스 CH2-유래 키토산아제(Chitosanase) 시그널 펩타이드는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, hEGF 융합 단백질.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 인간 상피세포성장인자는 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, hEGF 융합 단백질.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 폴리아르기닌은 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, hEGF 융합 단백질.
  11. 제7항에 있어서,
    상기 hEGF 융합 단백질은 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, hEGF 융합 단백질.
  12. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 유전자 컨스트럭트를 포함하는, 인간 상피세포성장인자(hEGF) 융합 단백질의 생산을 위한 재조합 발현벡터.
  13. 제12항의 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질전환 재조합 미생물.
  14. 다음 단계를 포함하는, 인간 상피세포성장인자(hEGF) 융합 단백질의 생산 방법:
    (a) 바실러스 서브틸리스 CH2-유래 키토산아제(Chitosanase) 시그널 펩타이드를 코딩하는 유전자, 목적단백질인 인간 상피세포성장인자(hEGF)를 코딩하는 유전자, 세포 투과 펩타이드인 폴리아르기닌(polyarginine)을 코딩하는 유전자; 및 바실러스 서브틸리스 CH2 유래의 베타-글루카네이즈(β-Glucanase)를 코딩하는 유전자를 융합한 컨스트럭트(construct)를 포함하는, 재조합 발현벡터를 제조하는 단계로서
    상기 유전자 컨스트럭트는, 상기 폴리아르기닌을 코딩하는 유전자와 상기 바실러스 서브틸리스 CH2 유래의 베타-글루카네이즈를 코딩하는 유전자 사이에 TA 서열을 삽입하여 연결한 것이고;
    (b) 상기 (a) 단계의 재조합 발현벡터를 미생물에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계의 형질전환체를 배양하여 인간 상피세포성장인자(hEGF) 융합 단백질의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서, 상기 인간 상피세포성장인자(hEGF) 융합 단백질의 발현 유도 전 상기 형질전환체를 고농도로 배양 및 배지를 교체하는 단계를 추가적으로 실시하는 것을 특징으로 하는, 인간 상피세포성장인자(hEGF) 융합 단백질의 생산 방법.
  16. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항의 인간 상피세포성장인자(hEGF) 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 상처 치유 또는 피부 재생 촉진용 약학적 조성물.
  17. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항의 인간 상피세포성장인자(hEGF) 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 식품 조성물.
  18. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항의 인간 상피세포성장인자(hEGF) 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물.
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