KR102590533B1 - 단백질 전달 서열 융합 시르투인6 생산방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물 및 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 단백질 전달 서열 융합 시르투인6 생산방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물 및 약학 조성물에 관한 것으로, 시르투인6(Sirtuin6, Sirt6)에 다양한 단백질 전달 서열(Protein transduction domain, PTD)를 융합하되 코돈 최적화를 통해 발현량을 증가시킴으로써 고순도 정제 생산이 가능하며, 경제적이고 효율적으로 PTD 융합 Sirt6를 안정적으로 생산할 수 있다. 또한, 이러한 PTD 융합 Sirt6을 함유함으로써, 인간각질형성세포와 인간섬유아세포의 증식 효능, 높은 피부 세포 투과도, 외부자극에 의해 손상된 표피층을 빠르게 회복시키는 효과, 콜라겐 합성 효과를 촉진함에 따라 현저한 피부 상처치유능, 피부장벽 강화능, 피부재생능 또는 항노화능을 발휘하는 화장료 조성물 및 창상 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공할 수 있다.

Description

단백질 전달 서열 융합 시르투인6 생산방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물 및 약학 조성물{Method for producing protein transduction domain-Sirtuin6 and cosmetic composition and pharmaceutical composition containing the same}

본 발명은 단백질 전달 서열 융합 시르투인6 생산방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물 및 약학 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 코돈 최적화된 시르투인6(Sirtuin6, Sirt6)에 단백질 전달 서열(Protein transduction domain, PTD)을 융합하여 PTD 융합 Sirt6의 효율적인 생산 방법과 이를 함유하는 상처치유용, 피부장벽 강화용, 피부재생 또는 항노화용 화장료 조성물 및 창상 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

전 세계적으로 산업화와 인구 노령화 현상이 급속히 진행됨에 따라 건강장수 및 삶의 질적 향상에 대한 사회적 요구가 절실하여 바이오융합기술을 기반으로 고부가가치 항노화 및 다양한 기능성 화장품 시장은 계속 확대되고 있다. 특히 화장품 영역의 개념이 확장되면서 기존의 미용효과에 첨단 의학, 약학, 분자생물학적 개념이 가미된 생리적 활성효능을 가지는 코스메슈티컬(Cosmeceutical, 미용기능(Cosmetic)과 치료기능(Pharmaceutical)의 합성어)이라는 개념으로 발전되었을 뿐만 아니라 미세먼지와 일교차 확대 등 환경변화로 인한 빈번한 피부 트러블이 발생하고, 민감해진 피부를 관리해야 하는 필요성이 증가함에 따라 더마코스메틱(Dermacosmetical) 시장이 동반 성장되어 소비자의 니즈에 부합할 수 있는 생리적 활성과 기전이 규명된 소재 및 제품개발이 요구되고 있다.

따라서 화장품 산업분야에서도 생명공학 관련 첨단기술이 다양한 형태로 도입되었으며 이중, 재조합 단백질 기술은 인간에게 유용한 단백질을 유전공학 기술을 이용하여 미생물 또는 동물세포에서 대량발현시키는 기술이다. 이 기술을 통하여 유용 단백질의 대량생산이 가능하게 되어 의학용으로만 사용되던 많은 기능성 단백질들이 화장품 소재로 사용되기 시작했으며 대표적으로는 인간 상피세포 성장인자(human epidermal growth factor, EGF), 인간 섬유아세포 성장인자(human fibroblast growth factor, FGF) 등이 있다.

특히 대장균(E. coli)은 이러한 유용 단백질을 대량 생산하는데 가장 널리 이용되고 있는 미생물중 하나이다. 그러나 대장균에서 외래 단백질 발현 효율은 단백질의 안정성이나 단백질 접힘 등의 문제로 실험적으로 감지할 수 없을 정도로 발현이 잘되지 않거나 활성이 없는 불용성 응집체(inclusion bodies)로 생산되는 경우가 많이 있어서 산업적 사용이 제한되는 단점도 지니고 있다(Edward, R. L. and J. M. McCoy, Curr. Opin. Biotech. 1995, 6:501-506). 이러한 문제점을 해결하기 위하여 배지조성, 배양조건, 발현유도 조건 최적화에서부터 단백질 접힘을 도와주는 maltose binding protein, glutathione S transferase 및 NusA 등의 융합 파트너, 프로모터(T5, T7, tac, trc 프로모터 등), 전사 조절인자( LacI 및 AraC) 등이 다양하게 조합된 발현시스템 개발이나 코돈 최적화(codon optimization) 개량 등 많은 방법들이 사용되고 있다. 대장균을 숙주로 재조합 단백질을 생산하기 위해 다양한 도구 및 전략 등이 존재함에도 불구하고, 목적 단백질의 성공적인 발현은 항상 담보되지 못하고 있다. 재조합 단백질의 발현량은 생산비용과 직결될만큼 중요한 핵심인자중 하나이기 때문에 가장 효율적인 재조합 단백질의 생산은 감지할 수 있을 정도로 과발현되면서 수용성(solubility)이 높은 형태를 갖도록 하여야 한다.

재조합 단백질은 일반적으로 친수성이고 큰 분자량을 가지고 있어서 이중 지질막 구조로 되어있는 세포막이라는 장벽에 의해 세포 안으로 들어가는 것이 매우 어렵다. 기존에는 분자량이 큰 단백질의 피부 흡수를 증가시키기 위해 레이저나 메조롤러와 같은 물리적 방법이나 계면활성제 및 나노구조체 등의 전달체(Carrier)를 이용하는 생화학적인 방법이 일반적이다. 그러나 이러한 방법은 피부 장벽의 손상 위험이 내재하고 흡수에는 여전한 한계가 남아있으며 별도의 고가 디바이스를 필요로 하는 단점이 있다.

최근에는 거대한 분자를 세포 안으로 운반시킬 수 있는 새로운 대안들이 제시되었는데 그 중 단백질 전달 서열인 PTD(Protein transduction domain)는 DNA, RNA, 펩타이드, 단백질의 전달에 유용한 펩타이드로 5 ~ 30개의 아미노산 서열로 이루어져 있다. PTD는 투과시키고자 하는 생물학적 분자와의 융합이 간단하기 때문에 의약품, 화장품 등에서 각광받고 있다. 최근 의약품과 화장품 소재로 많이 사용되는 인간 상피세포 성장인자(EGF)에도 PTD를 융합시켜 기존 EGF 대비 16배 이상 높은 경피 투과능과 동등 수준의 활성도를 확인한 결과가 보고되었다(J. Soc.Cosmet. Sci. Korea, Vol. 45, No. 2, June 2019, 175-184).

그러나 목적하는 단백질이 PTD와 융합하였을 때 발현량이 줄거나 원치 않는 불용성 형태로 생산되기도 하고, 발현이 나타난다고 해서 융합된 단백질이 모두 세포 내로 투과될 수 있는 것은 아니다. 또한 2001년, 2004년 그리고 2007년에, Tat 형질도입부위와 결합시킨 단백질이 세포 내로 도입은 되었으나 활성을 나타내지 않는다는 연구결과가 논문으로 발표되었다(Sengoku, T. et al. Experimental Neurology 188(2004) 161-170; Falnes P.O. et al. Biochemistry 2001 Apr 10;40(14):4349-4358; Daniele Peroni et al., Neuroscience letters 421(2007) 110-114 등). 즉, 목적 단백질에 단백질 전달 도메인을 융합시킨다고 해서 융합된 모든 단백질이 세포 내로 도입된 후 원활한 활성을 나타낸다고 단정할 수는 없는 것이다.

한편, 시르투인(Sirtuin, Sirt)이라는 단백질은 장수 유전자로, 처음 효모에서 발견되었으며 Sirt의 과발현이 효모의 증식, 노화를 늦춰 수명을 약 30% 증가시킨다는 사실을 밝혀냈다. 이후 효모에만 존재하는 줄 알았던 시르투인이 선충, 초파리, 포유류 일부, 그리고 사람에게서도 확인되었으며 현재 연구를 통해 밝혀진 시르투인 단백질은 Sirt1부터 Sirt7까지 총 7종으로 '탈아세틸화효소'라고도 불린다. Sirt는 스트레스를 받을 때는 번식 대신에 수선에 치중하여 당뇨병, 심장병, 알츠하이머병, 골다공증, 암을 포함한 노화의 주요 질병들에 저항하는 반응을 나타내고, 죽상경화증, 대사장애, 궤양대장염, 관절염, 천식 같은 질병을 악화시키는 만성적인 과잉 염증 반응을 억제하며, 세포의 죽음을 예방하고 세포 발전소인 미토콘드리아의 활력을 높이고 근육소모증, 골다공증, 황반변성도 억제하는 것으로 알려져 있다.

Sirt1은 시르투인 중에 가장 많은 연구가 이루어져 있으며 Sirt1의 발현을 억제한 마우스 모델에서 크로모좀(chromosome) 기형으로 죽는다는 보고가 있어 Sirt1은 스트레스에 저항하여 유전자 안정과 대사작용이 잘 일어나도록 조절하는 기능이 있다. 세포질에서 발견된 Sirt2도 Sirt1과 마찬가지로 DNA 복구, 세포 대사, 노화 조절 등의 복합적인 기능을 한다. Sirt3, 4, 5는 미토콘드리아에 존재하며 에너지를 만들어내는 TCA cycle에 관여, 지방산 산화, 산화적 인산화에 관여하며 종양세포의 대사가 높아지면서 발생하는 독성물의 생성을 억제하는 기능을 한다. Sirt7이 부족한 쥐에서는 심장비대, 심근 염증이 일어난다는 보고가 있어, Sirt7은 세포를 안정화 시키고 염증조절 기능이 있는 것이 알려져 있다.

Sirt6는 mono-ADP-ribosylate인 PARP1을 활성화시켜 산화적 스트레스에 DNA를 보호하고 수리하는 역할을 한다. 또한 Sirt6를 과발현시켜 형질전환한 쥐에 비만을 유도했을 때 triglyceride, low-density lipoprotein 콜레스테롤(LDL 콜레스테롤)을 감소시켜 비만을 막아주는 에너지 대사 조절 기능이 있어 다른 시르투인 단백질과 유사하게 대사조절과 유전자(DNA) 손상복구, 염증, 노화 조절에 관여하는 것으로 알려져 있다. 그러나 Sirt1을 포함한 다른 Sirt 단백질들과 다르게, Sirt6가 결핍된 마우스는 조로증(Premature aging)과 유사한 표현형을 보여준 반면 [Genomic instability and aging-like phenotype in the absence of mammalian SIRT6. Cell 124(2), 315-29, 2006], Sirt6의 과발현이 유도된 마우스는 수명이 약 15-20% 증가함이 확인되었다. 따라서 다른 Sirt들보다 Sirt6에 많은 연구와 관심이 집중되는 이유는 상기의 마우스 실험을 통해 확인된 노화의 표현형을 나타내는 유일한 Sirt이기 때문이다.

따라서 본 발명에서는 재조합 단백질 생산 기술을 통해 Sirt6에 다양한 종류의 PTD를 융합하고 코돈 최적화를 통해 발현량을 증가시켜 고순도 정제 생산하는 방법과, 이를 통해 세포독성이 없고 피부 투과능이 우수한 기능성 조성물을 제공하고자 하였다.

대한민국 등록특허 제10-0553174호(등록일자: 2006.02.10)는, 피부주름 개선용 융합 펩티드 및 그를 함유하는 피부 주름개선용 화장품에 관한 것으로, 사람 SNAP-25의 C-말단에서 유래한 펩티드에 PTD 펩티드(Protein Transduction Domain)가 결합된 융합 펩티드에 대해 기재되어 있다. 대한민국 공개특허 제10-2021-0092126호(공개일자: 2021.07.23)는, 시르투인1 활성화제 및 시르투인1 활성화용 피부 화장료에 관한 것으로, 시르투인1을 활성화시키는 물질로써, 에키나시아 및/또는 바나나의 추출물을 이용함에 대해 기재되어 있다.

본 발명은 코돈 최적화된 시르투인6(Sirtuin6, Sirt6)에 단백질 전달 서열(Protein transduction domain, PTD)을 융합시켜 PTD 융합 Sirt6을 대량으로 생산하고 고순도 정제 생산하는 기술을 개발함으로써, 이를 함유하여 뛰어난 상처치유능, 피부장벽 강화능, 피부재생능 또는 항노화 화장료 조성물 및 창상 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 서열번호 1에 기재된 핵산서열로 암호화된 재조합 시르투인(Sirtuin) 6을 제공한다.

또한, 본 발명은 Tat 펩타이드에 상기 재조합 시르투인 6가 융합되어 제조된 것으로, 서열번호 19에 기재된 핵산서열로 암호화된 재조합 단백질을 제공한다. 또한, 상기 재조합 단백질을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다. 또한, 상기 재조합 단백질을 포함하는 창상 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 PTD5 펩타이드에 상기 재조합 시르투인 6가 융합되어 제조된 것으로, 서열번호 21에 기재된 핵산서열로 암호화된 재조합 단백질을 제공한다. 또한, 상기 재조합 단백질을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다. 또한, 상기 재조합 단백질을 포함하는 창상 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 Antp 펩타이드에 상기 재조합 시르투인 6가 융합되어 제조된 것으로, 서열번호 23에 기재된 핵산서열로 암호화된 재조합 단백질을 제공한다. 또한, 상기 재조합 단백질을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다. 또한, 상기 재조합 단백질을 포함하는 창상 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 상기 화장료 조성물은, 상처치유용, 피부장벽 강화용, 피부재생용 또는 항노화용 중에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

본 발명은 시르투인6(Sirtuin6, Sirt6)에 다양한 단백질 전달 서열(Protein transduction domain, PTD)를 융합하되 코돈 최적화를 통해 발현량을 증가시킴으로써 고순도 정제 생산이 가능하며, 경제적이고 효율적으로 PTD 융합 Sirt6를 안정적으로 생산할 수 있다. 또한, 이러한 PTD 융합 Sirt6을 함유함으로써, 인간각질형성세포와 인간섬유아세포의 증식 효능, 높은 피부 세포 투과도, 외부자극에 의해 손상된 표피층을 빠르게 회복시키는 효과, 콜라겐 합성 효과를 촉진함에 따라 현저한 피부 상처치유능, 피부장벽 강화능, 피부재생능 또는 항노화능을 발휘하는 화장료 조성물 및 창상 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공할 수 있다.

도 1의 (A)는 기존 오리지널 서열 Sirt6와 (B) 코돈최적화된 Sirt6의 DNA 서열비교 결과이다.
도 2의 (A)는 단백질 전달 서열(Protein transduction domain, PTD) 없이 코돈 최적화된 Sirt6의 발현벡터(pET21a-mdSirt6-6H) 지도를 나타낸 것이고, (B)는 PTD로 Tat 펩타이드와 코돈 최적화된 Sirt6가 융합된 발현벡터(pET21a-Tat-mdSirt6-6H) 지도를 나타낸 것이며, (C)는 다양한 PTD 융합 Sirt6 생산을 위한 발현시스템 구축 관련 스케임(scheme)을 나타낸 것이다.
도 3의 (A)는 기존 오리지널 서열 Sirt6와 (B) 코돈최적화된 Sirt6의 발현량과 발현패턴을 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 코돈 최적화된 Sirt6와 다양한 Tat(A), PTD5(B), Antp(C)를 각각 융합시켜 발현량과 발현패턴을 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 표준생산공정을 통해 생산된 코돈 최적화된 (A) Sirt6, (B) Tat-Sirt6, (C) PTD5-Sirt6, (D) Antp-Sirt6의 정제 생산 단계별 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 표준생산공정을 통해 정제 생산된 코돈 최적화된 Sirt6, Tat-Sirt6, PTD5-Sirt6, Antp-Sirt6의 최종 산물의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 Sirt6, Tat-Sirt6, PTD5-Sirt6, Antp-Sirt6의 인간 각질형성세포에서 피부 투과도를 분석(웨스턴 블랏 분석, ELISA 분석)한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 Sirt6, Tat-Sirt6, PTD5-Sirt6, Antp-Sirt6의 인간 섬유아세포에서 피부 투과도를 분석(웨스턴 블랏 분석, ELISA 분석)한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 Tat-Sirt6, PTD5-Sirt6, Antp-Sirt6의 인간 각질형성세포를 이용한 스크래치 상처회복에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 10은 Tat-Sirt6, PTD5-Sirt6, Antp-Sirt6의 인간 섬유아세포를 이용한 스크래치 상처회복에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 11은 Tat-Sirt6, PTD5-Sirt6, Antp-Sirt6의 인간 각질형성세포 증식에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 12는 Tat-Sirt6, PTD5-Sirt6, Antp-Sirt6의 인간 섬유아세포 증식에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 13은 Tat-Sirt6의 세포 생존율을 측정한 그래프이다.
도 14는 Tat-Sirt6의 콜라겐 합성 정도를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 서열번호 1에 기재된 핵산서열로 암호화된 재조합 시르투인(Sirtuin) 6을 제공한다. 상기 시르투인은 시르투인 패밀리 중에서 선택되는 어느 하나 이상을 사용하는 것이 좋으며 바람직하게는 시르투인6, 더욱 바람직하게는 상기 재조합 시르투인6을 사용하는 것이 좋다. 이때, 재조합 시르투인6은 인간 유래인 것이 바람직하며, 인간 유래의 Sirt6를 암호화하는 유전자를 대장균용으로 코돈 최적화하고 이를 이용해 형질전환된 대장균으로부터 분리 및 정제된 것을 사용함으로써, 그 발현량을 증대시킬 수 있다.

본 발명에서는 단백질 전달 서열(Protein transduction domain)로 TAT 펩타이드, Antp(Antennapedia protein) 펩타이드, PTD5 펩타이드 중에서 선택되는 어느 하나이상인 것을 사용하는 것이 좋으나, 당업계에 공지된 것이라면 어느 것에든 제한되지 않는다.

이에 본 발명은 Tat 펩타이드에 상기 재조합 시르투인 6가 융합되어 제조된 것으로, 서열번호 19에 기재된 핵산서열로 암호화된 재조합 단백질을 제공한다. 또한, 본 발명은 PTD5 펩타이드에 상기 재조합 시르투인 6가 융합되어 제조된 것으로, 서열번호 21에 기재된 핵산서열로 암호화된 재조합 단백질을 제공한다. 또한, 본 발명은 Antp 펩타이드에 상기 재조합 시르투인 6가 융합되어 제조된 것으로, 서열번호 23에 기재된 핵산서열로 암호화된 재조합 단백질을 제공한다.

또한, 상기 재조합 단백질 중에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다. 또한, 상기 재조합 단백질 중에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 창상 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 단백질은 단백질의 N-말단, C-말단, 또는 N-말단 및 C-말단에 단백질 전달 서열(PTD)이 결합되어 있는 융합 단백질 형태인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 상기 재조합 단백질을 암호화하는 유전자를 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계 (a); 상기 재조합 벡터를 대장균에 도입하여 대장균을 형질전환시킴으로써 재조합 대장균을 제조하는 단계 (b); 상기 재조합 대장균을 배양한 후, 재조합 대장균 균체 또는 그 배양액으로부터 재조합 단백질을 분리하는 단계 (c);를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질의 생산방법을 제공한다. 이때, 상기 재조합 단백질은 TAT 펩타이드, PTD5 펩타이드, Antp(Antennapedia protein) 펩타이드 중에서 선택되는 어느 하나이상의 단백질 전달 서열(PTD)을 사용하는 것이 좋다. 더욱 바람직하게는 상기 재조합 단백질은 서열번호 19에 기재된 핵산서열로 암호화된 재조합 단백질, 서열번호 21에 기재된 핵산서열로 암호화된 재조합 단백질, 서열번호 23에 기재된 핵산서열로 암호화된 재조합 단백질 중에서 선택되는 어느 하나 이상을 사용하는 것이 좋으며, 당업계에 공지된 것이라면 어느 것에든 제한되지 않는다.

본 명세서에 있어서, "벡터(vector)"는 세포 내로 전달되는 DNA 단편, 핵산 분자 등을 의미하며, 상기 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 제조될 수 있다. 용어 "전달체"와 호환하여 사용될 수 있다. "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 본 발명의 재조합 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 재조합 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 등을 포함할 수 있으며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 상기 프로모터는 바람직하게는 대장균에서 단백질을 발현하는데 사용되는 프로모터일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에 있어서, “작동가능하게 연결된(operably linked)”이란 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 상태를 의미한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 발현 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소등을 사용할 수 있다.

본 발명에서 제공하는 형질전환체는 상기 본 발명에서 제공하는 발현벡터를 숙주에 도입하여 형질전환시켜서 제작되고, 상기 발현벡터에 포함된 폴리뉴클레오티드를 발현시켜서, 본 발명의 재조합 단백질을 생산하는데 사용될 수 있다. 상기 형질전환은 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있는데, 다양한 세포활성을 높은 수준으로 향상시킬 수 있는 효과를 나타내는 본 발명의 재조합 단백질을 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, CaCl₂ 침전법, CaCl₂ 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 사용될 수 있다. 또한, 상기 형질전환제의 제작에 사용되는 숙주 역시 본 발명의 재조합 단백질을 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 대장균(E.coli), 스트렙토마이세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 사카로마이세스 세레비지애, 스키조사카로마이세스 폼베 등의 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류 세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마 세포 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다.

한편, 본 발명에 있어서, 상기 형질전환체는 또한 본 발명에서 제공하는 재조합 단백질을 생산하는 방법에 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서 제공하는 재조합 단백질을 생산하는 방법은 (a) 상기 형질전환체를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및, (b) 상기 배양물로부터 본 발명의 재조합 단백질을 회수하는 단계를 포함할 수 있다.

본 명세서에 있어서, 용어 "배양"이란, 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 방법을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 형질전환체를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 본 발명의 재조합 단백질을 발현시켜서 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.

배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 주 탄소원으로 사용하며 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.

또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.

또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 27℃ 내지 37℃, 바람직하게는 30℃ 내지 35℃이다. 배양은 상기 융합단백질의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 100 시간에서 달성된다.

아울러, 배양물로부터 상기 재조합 단백질을 회수하는 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 회수 방법은 생산된 본 발명의 재조합 단백질을 회수할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용할 수 있다.

한편, 본 발명에 있어서, 상기 재조합 단백질은 전체 화장료 조성물의 중량 대비 0.0001 내지 50중량%로 포함되는 것이 바람직하다. 상기 재조합 단백질의 함량이 전체 화장료 조성물의 중량 대비 0.0001중량% 미만일 경우에는 실질적인 피부개선 효과를 기대하기 어렵고, 50중량% 이상일 경우에는 제형이 불안정해지는 등의 문제가 발생할 수 있다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 상기 화장료 조성물은, 상처치유용, 피부장벽 강화용, 피부재생용 또는 항노화용 중에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

한편, 본 발명의 재조합 단백질은 120 내지 200 nm 크기의 나노좀에 포집된 것이 바람직하다. 본 발명의 단백질 성분은 실온에 장기 방치시 실활되어 안정성이 떨어지는 문제를 가지는데, 이를 나노좀으로 포집시킴으로써 해결할 수 있다. 바람직한 구체예로서, 상기 나노좀은 레시틴을 원료로 사용하여 마이크로플루다이져로 제조할 수 있으며, 본 발명의 성장인자는 각각 또는 함께 레시틴 입자 내에 포집시킬 수 있다. 나노좀의 제조 방법은 공지의 것이라면 어떠한 방법이라도 사용될 수 있다. 상기 나노좀 입자는 120~200 nm인 것이 바람직하며, 100 nm 미만인 경우에는 피부 침투가 매우 빨리 진행되어 피부 부작용이 발생할 수 있고, 200 nm를 초과하는 경우에는 피부 침투가 용이하지 않아 나노좀 구조를 사용하는 효과를 얻을 수 없다. 상기 기능성은 피부 상태의 개선에 기여할 수 있는 것을 말하며, 예를 들어, 상처치유, 피부장벽강화, 피부 주름 개선, 피부 탄력 개선, 피부 재생 및 피부 노화 방지 등이 있을 수 있으나, 여기에 한정되는 것은 아니다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 일 예로, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형 중 선택되는 어느 하나의 기초 화장료 제형; 스킨; 로션; 아이크림; 수딩젤; 연고; 마스크팩용 제형; 바디워시용 제형; 필링젤; 수중유형 및 유중수형 메이크업베이스; 파운데이션; 스킨커버; 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이새도, 치크칼라 및 아이브로우 펜슬류 중 선택되는 어느 하나의 색조화장료 제형; 두피용 제형; 중에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 화장 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제 예컨대 친수성 또는 친유성 활성제, 보존제, 항산화제, 용매, 방향제, 충전제, 차단제, 안료, 흡취제, 염료 등을 함유할 수 있다. 이들 다양한 보조제의 양은 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 양이며, 예컨대 조성물 총 중량에 대해 0.001 내지 30 중량% 이다. 다만, 어떠한 경우라도 보조제 및 그 비율은 본 발명에 따른 화장료 조성물의 바람직한 성질에 악영향을 미치지 않도록 선택될 것이다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 일 예로 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라가칸트 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로탄/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 계면활성제 함유 클렌저인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 계면활성제 함유 클렌저 제형 또는 계면활성제 비함유 클렌저 제형 또는 비누일 경우에는, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 일례로, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 및 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클렌징 제형은 클렌징폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 젤이며, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복하여 사용할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수를 달리할 수 있다.

한편, 본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 창상은 화상, 열상, 표피 창상, 궤양, 외상, 외과적 수술(post-surgical), 출산, 만성적 상처(chronic wound), 피부염(dermatitis)에 의한 손상, 각막 궤양, 각막 상피 박리, 각막염 및 안구건조증으로 인한 손상으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.

한편, 본 발명의 약학 조성물의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태로 제조될 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화 하는 것이 좋다. 구체적인 제형의 예로는 경고제(PLASTERS), 과립제(GRANULES), 로션제(LPTIONS), 리니멘트제(LINIMENTS), 리모나데제(LEMONADES), 방향수제(AROMATIC WATERS), 산제(POWDERS), 시럽제(SYRUPS), 안연고제(OPHTALMIC OINTMENTS), 액제(LIQUIDS AND SOLUTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 엑스제(EXTRACTS), 엘릭실제(ELIXIRS), 연고제(OINTMENTS), 유동엑스제(FLUIDEXTRACTS), 유제(EMULSIONS), 현탁제(SUSPESIONS), 전제(DECOCTIONS), 침제(INFUSIONS), 점안제(OPHTHALMIC SOLUTIONS), 정제(TABLETS), 좌제(SUPPOSITIORIES), 주사제(INJECTIONS), 주정제(SPIRITS), 카타플라스마제(CATAPLSMA), 캅셀제(CAPSULES), 크림제(CREAMS), 트로키제(TROCHES), 틴크제(TINCTURES), 파스타제(PASTES), 환제(PILLS), 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.

또한, 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 투여방법, 복용자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등을 고려하여 결정하는 것이 좋다. 일 예로, 유효성분을 기준으로 하였을 때 1일 0.1 내지 100 ㎎/㎏(체중)으로 1회 이상 투여 가능하다. 다만, 상기의 투여량은 예시하기 위한 일 예에 불과하며, 복용자의 상태와 의사의 처방에 의해 변화될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 더욱 포함할 수 있다. 사용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는 일 예로, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유가 있으며, 이중 1종 이상 사용될 수 있다. 또한, 예방 및 치료제가 약제인 경우 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등이 추가적으로 포함될 수 있다.

한편, 하기 실험에 의하면, 본 발명은 코돈 최적화된 시르투인6(Sirtuin6, Sirt6)에 다양한 단백질 전달 서열(Protein transduction domain, PTD)를 융합하여 PTD-Sirt6을 생산함으로써, 인간각질형성세포와 인간섬유아세포의 증식 효능, 높은 피부 세포 투과도, 외부자극에 의해 손상된 표피층을 빠르게 회복시키는 효과, 콜라겐 합성 효과를 발휘하는 것을 확인하였으며, 이를 통해 뛰어난 기능성 화장품 및 약품의 소재로 이용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

이하, 본 발명에 대해 하기 실시예 및 실험예에서 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 모두 포함한다.

[실시예 1 : 시르투인6(Sirtuin6, Sirt6) 발현벡터와 단백질 전달 서열 융합 시르투인6(PTD-Sirt6) 발현벡터 제조]

본 실시예에서는 시르투인6(Sirtuin6, Sirt6) 발현벡터와 단백질 전달 서열 융합 시르투인6(PDT-Sirt6) 발현벡터를 제조하였다.

1) 시르투인6(Sirtuin6, Sirt6) 발현벡터 제조

대장균에서 재조합 단백질의 생산을 증가시키기 위해 DNA codon을 대장균이 선호하는(많이 사용하는) 코돈으로 바꿔서 발현시스템을 구축하게 되면 대장균에서 재조합 단백질의 생산량이 증가하기 때문에 코돈 최적화를 진행하였다. 이와 같은 코돈 최적화에 따른 Sirt6 단백질 생산량의 차이를 확인하기 위하여, 기존서열의 Sirt6(인간 유래)와 서열번호 1의 유전자 서열(표 1)로 코돈 최적화된 Sirt6의 유전자는 도 1에 보이듯이 다양한 위치에서 서열 차이가 있어 ㈜바이오니아에 각각 합성 의뢰하여 사용하였다. 이를 모형사슬로 PCR (Polymerase Chain Reaction)을 수행하였으며(Bio-Rad, T100 Thermal Cycler, USA), ㈜마크로젠에 의뢰 합성한 프라이머의 염기서열은 표 2에 나타내었다.

단백질	구분	서열정보
Sirt6	코돈최적화(codon-optimization) cDNA	서열번호 1
	아미노산	서열번호 2

Product	Primer	서열정보
OriSirt6	F1-OriSirt6-6H-NdeI :GGAGATATACATATGTCGGTGAATTACGCGGCGGGGC	서열번호 3
	R1-OriSirt6-6H-XhoI :ATGATGATGCTCGAGGCTGGGGACCGCCTTGGCCT	서열번호 4
Sirt6	F2-mdSirt6-6H-XbaI :CCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGTCGGTGAATTATG	서열번호 5
	R2-mdSirt6-6H-XhoI :GTGGTGGTGCTCGAGGCTGGGTACAGCTTTTGCCT	서열번호 6

기존 서열의 Sirt6 발현벡터의 구축을 위하여 N-말단 F1 프라이머는 발현 벡터에 삽입될 수 있도록 NdeI 제한효소 절단부위를, C-말단 R1 프라이머는 XhoI으로 절단될 수 있도록 제한효소 절단부위를 도입하여 C-말단에 히스티딘 태그 6개를 가지는 기존서열의 Sirt6가 발현될 수 있도록 설계하였다. PCR로 얻어진 단편(단편 1 : 1074 bp)은 제한효소 NdeI과 XhoI으로 절단후 아가로스 젤에서 분리하여 pET21a(+) 벡터에 삽입하였다. 상기와 같이 구축된 플라스미드를 'pET21a-OriSirt6-6H'라고 명명하였다. 코돈 최적화된 Sirt6 발현벡터의 구축은 XbaI 제한효소 절단부위를 도입한 N-말단 F2 프라이머와 XhoI으로 절단될 수 있도록 제한효소 절단부위를 도입한 C-말단 R2 프라이머를 이용하여 같은 방법으로 구축하였으며, 구축된 플라스미드는 'pET21a-mdSirt6-6H'라고 명명하였다.

2) 단백질 전달 서열 융합 시르투인6(PTD-Sirt6) 발현벡터 제조

상기에서 코돈 최적화된 Sirt6에 PTD인 Tat, PTD5, Antp를 펩타이드를 각각 융합시켜 발현하고자 하였다. 이를 위해 Tat, PTD5, Antp 각각의 유전자 서열에 코돈 최적화된 Sirt6 유전자 서열을 오버랩 PCR 증폭시켰다.

Tat 펩타이드가 융합된 Sirt6는 표 3의 프라이머를 이용하여 오버랩 PCR을 통해 얻고 이를 pET21a(+)에 삽입하여 발현벡터를 구축하였으며 이를 'pET21a-Tat-mdSirt6-6H'라고 명명하였다. 같은 방법으로 표 4의 프라이머를 이용하여 PTD5 펩타이드가 융합된 Sirt6 발현벡터를, 표 5의 프라이머를 이용하여 Antp 펩타이드가 융합된 Sirt6 발현벡터를 각각 구축하였다. 구축된 발현벡터는 각각 'pET21a-PTD5-mdSirt6-6H', 'pET21a-Antp-mdSirt6-6H'로 명명하였으며 이를 통해 생산되는 단백질 Tat-Sirt6, PTD5-Sirt6, Antp-Sirt6의 유전자 서열 및 아미노산 서열은 아래 표 6과 같다.

Product	Primer	서열정보
Tat-Sirt6	F3-Tat-mdSirt6-XbaI :CGATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAA	서열번호 7
	R3-Tat-mdSirt6 :ATAATTCACCGACATACGGCGACGCTGACG	서열번호 8
	F4-Tat-mdSirt6 :CGTCAGCGTCGCCGTATGTCGGTGAATTAT	서열번호 9
	R4-mdSirt6-6H-XhoI :GTGGTGGTGCTCGAGGCTGGGTACAGCTTT	서열번호 10

Product	Primer	서열정보
PTD5-Sirt6	F5-PTD5-mdSirt6-XbaI :CGATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAA	서열번호 11
	R5-PTD5-mdSirt6 :CGCATAATTCACCGACATGCGTTTCATCAGTTTGCT	서열번호 12
	F6-PTD5-mdSirt6 :AGCAAACTGATGAAACGCATGTCGGTGAATTATGCG	서열번호 13
	R6-mdSirt6-6H-XhoI :GTGGTGGTGCTCGAGGCTGGGTACAGCTTT	서열번호 14

Product	Primer	서열정보
Antp-Sirt6	F7-Antp-mdSirt6-XbaI :CGATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAA	서열번호 15
	R7-Antp-mdSirt6 :CGCCGCATAATTCACCGACATCCATTTCATACGACGGTT	서열번호 16
	F8-Antp-mdSirt6 :CCGTCGTATGAAATGGATGTCGGTGAATTATGCGGCG	서열번호 17
	R8-mdSirt6-6H-XhoI :GTGGTGGTGCTCGAGGCTGGGTACAGCTTT	서열번호 18

단백질	구분		서열정보
Tat-Sirt6	cDNA		서열번호 19
	아미노산		서열번호 20
PTD5-Sirt6	cDNA		서열번호 21
	아미노산		서열번호 22
Antp-Sirt6	cDNA		서열번호 23
	아미노산		서열번호 24

도 2의 (A)는 단백질 전달 서열(Protein transduction domain, PTD) 없이 코돈 최적화된 Sirt6의 발현벡터(pET21a-mdSirt6-6H) 지도를 나타낸 것이고, (B)는 PTD로 Tat 펩타이드와 코돈 최적화된 Sirt6가 융합된 발현벡터(pET21a-Tat-mdSirt6-6H) 지도를 나타낸 것이며, (C)는 다양한 PTD 융합 Sirt6 생산을 위한 발현시스템 구축 관련 스케임(scheme)을 나타낸 것이다. 모든 종류의 벡터는 대장균 Rosetta2(DE3)pLysS에 각각 형질전환하였다(Sambrook, J., Fritsch, E. E., Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring, New York).

[실험예 1: 시르투인6(Sirt6)와 단백질 전달 서열 융합 시르투인6(PTD-Sirt6)의 발현 확인]

본 실험예에서는 시르투인6(Sirt6)와 단백질 전달 서열 융합 시르투인6(PTD-Sirt6)의 발현을 확인하였다.

모든 형질전환체 대장균 Rosetta2(DE3)pLysS들은 앰피실린(ampicillin)이 100 ㎍/mL 들어있는 LB(효모 엑기스 0.5%, 트립톤 1%, NaCl 1%) 고체배지에서 배양하였다. 배양된 균체는 앰피실린(ampicillin)이 100 ㎍/mL 들어있는 LB 액체배지에 접종하여 광학밀도(OD) 0.6까지 배양시킨 후 1 mM 농도의 IPTG (Isopropyl-B-D-thiogalactopyranoside)를 첨가한 다음 4시간 더 배양하여 각각의 단백질들이 발현되도록 하였다. 배양이 끝난 배양액을 5,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 균체를 각각 회수하였다. 발현된 다양한 단백질들의 용해도를 알아보기 위하여 각각의 균체를 초음파 파괴(Branson사 Sonifier 450, 3 KHz, 3 watts, 5 min)하여 용해성 분획과 비용해성 분획으로 나누어 발현을 확인하였다. 분리된 균체는 전체 분획(total fraction), 용해성 분획(soluble fraction), 비용해성 분획(insoluble fraction)으로 나누어 단백질 용해 완충액 (12 mM Tris-Cl, pH6.8, 5% glycerol, 2.88 mM 머캅토에탄올, 0.4% SDS, 0.02% 브로모페놀 블루) 100 ㎕에 녹이고 100℃에서 5분간 가열하여 생성된 용액중 각 20 ㎕씩을 1 mm 두께의 12% 분리 젤 (separating gel; pH 8.8, 가로 20 cm, 세로 10 cm) 위에 5% 저장 젤 (stacking gel; pH 6.8, 가로 10 cm, 세로 12.0 cm)을 덮은 폴리아크릴아마이드 젤에 로딩한 후 100-300 볼트, 25 mA로 1시간 동안 전기영동하고 쿠마시 염색액으로 충분히 염색하고 탈색하였다. 코돈 최적화에 따른 Sirt6 단백질 생산량의 차이를 확인하기 위하여, 기존 서열의 Sirt6 단백질과 코돈 최적화된 Sirt6의 IPTG 유도 후 발현율은 SDS-PAGE의 이미지 덴시토미터(BioRad, Imaging Densitometer GS-800, USA)를 이용하여 정량하였다.

젤 스캐닝 결과, 각각의 발현율은 8.7%와 35.3%로 코돈 최적화에 의해 전체 발현율이 뚜렷하게 증가하는 것을 확인하였다(도 3 (A), (B) lane 2). 특히, 수용성 발현을 위해 IPTG 유도 후 온도를 25℃로 낮추게 되면 발현율은 5.2%와 34.5%로 더욱 확실하게 코돈 최적화에 의해 발현율이 증가되는 것을 확인할 수 있었다(도 3 (A), (B) lane 6). 발현패턴 분석결과, 코돈 최적화된 Sirt6는 IPTG 유도후 37℃에서 배양시 대부분이 비용해성 분획(insoluble fraction)에 존재하여 전체 발현량중 89.6%가 불용성 응집체(inclusion body)로 존재하였다(도 3 (B) lane 3). 하지만 IPTG 유도후 온도를 25℃로 낮추면 비용해성 분획(insoluble fraction)에 69.7%, 용해성 분획(soluble fraction)에 30.3%로 용해성 분획에 존재하는 Sirt6의 양이 증가하는 것을 확인하였다(도 3의 (B), lane 7, 8). 결론적으로, Sirt6 단백질 생산을 위해서 전체 발현량과 발현패턴 분석을 진행한 결과 코돈 최적화된 Sirt6로 형질전환된 대장균을 이용하여 IPTG 유도후 온도를 낮춰 생산하는 것이 가장 효율적임을 확인할 수 있었다.

다음으로 코돈 최적화된 Sirt6에 PTD가 융합된 Tat-Sirt6, PTD5-Sirt6, Antp-Sirt6의 발현율은 각각 34.2%와 33.8%, 31.8%와 27.2%, 30.4%와 31.3%의 높은 발현율을 확인하였다(도 4 (A), (B), (C), lane 2, 6). 발현패턴도 IPTG 유도후 37℃로 온도를 유지하면 많은 부분이 비용해성 분획으로 생산되는 것이 확인되나, IPTG 유도후 온도를 25℃로 낮추면 비용해성 분획에 존재하는 단백질의 양과 용해성 분획에 존재하는 단백질의 양이 Tat-Sirt6의 경우 25.7%와 74.3%, PTD5-Sirt6의 경우 4.3%와 95.7%, Antp-Sirt6의 경우 23.8%와 76.2%로 용해성 분획으로 생산되는 양이 증가하는 것을 확인하였다(도 4 (A), (B), (C), lane 7, 8). 따라서, 다양한 PTD를 활용한 PTD-Sirt6의 생산도 IPTG 유도후 온도를 낮춰 생산하는 것이 효율적임을 재확인하였다.

[실험예 2: 시르투인6(Sirt6)와 단백질 전달 서열 융합 시르투인6(PTD-Sirt6)의 정제]

본 실험예에서는 상기에서 제조한 발현 균주를 발현용 글리세롤 스톡(glycerol stock)으로 제조하고 이를 이용하여 다음과 같이 발현 및 정제하였다.

발현용 글리세롤 스톡을 LB 배양액 30 ml에 1 ml 접종하여 37℃, 200 rpm 조건에서 OD가 약 1.0에 도달할 때까지 배양하였다. 배양액의 OD가 1.0에 도달하면 본 배양액 3 L에 전배양액 30 ml을 접종하여 37℃, 180 rpm 조건에서 OD가 0.6 내지 0.8 가 될 때까지 배양하였다. 발현을 위해 IPTG를 배양액 내 최종 농도가 1 mM이 되도록 처리하여 목적 단백질을 유도한 후, 20℃, 180 rpm 조건에서 하루 동안 배양하였다. 다음날 원심 분리(6,000rpm, 4℃, 10분)하여 배양 균체를 획득하고, 획득한 균체 펠렛 10 g 당 평형화 버퍼(Equilibration buffer, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.2 M NaCl, 10% Glycerol) 100 ml씩 첨가하여 현탁하였다. 완전히 현탁되면 초음파 처리(sonication)를 통해 균체를 파쇄하였다(20분간 sonication 10초/holding 10초 반복, Amplitude 50%, 4℃). 파쇄된 균체액은 원심 분리(15,000rpm, 4℃, 25분)하여 비 파쇄 균체 및 불용성 분획을 제거하고 상등액만 취한 후, 0.45㎛ 필터로 여과하였다. 목적 단백질을 함유하는 여과 용액은 정제를 위해 금속친화성크로마토그래피(Immobilized metal affinity chromatography) 실험을 진행하였다. 단백질 정제를 위한 시스템은 바이오라드사(미국)의 NGC 크로마토그래피 시스템을 사용하고 레진은 퀴아젠사(독일)의 Ni-NTA를, 컬럼은 머크사(독일)의 20 X 250 mm를 사용하였다. 새로운 레진으로 충진한 컬럼을 NGC 크로마토그래피 장치에 연결하고, 펌프를 이용하여 4 ml/min의 유속으로 증류수를 레진 부피의 10배로 충분히 씻어준 후 평형화 버퍼를 레진 부피의 10배 정도를 흘려 레진을 평형화시켰다. 여기에 4.0 ml/min의 유속으로 여과 시료(용해성 분획)를 로딩한 후 컬럼에 결합되지 않은 단백질과 비특이적으로 결합된 단백질 제거를 위해 크로마토그래피 펌프 A에 평형화 버퍼를 연결하고 펌프 B에 용출 버퍼(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.2 M NaCl, 10% Glycerol, 500 mM imidazole)를 각각 연결하여 90 : 10 비율로 레진 부피의 10배 정도로 충분히 세척하였다. 이후 컬럼에 결합된 단백질을 용출하기 위하여 용출 버퍼가 연결된 펌프 B의 비율을 10 ~ 100%로 작동시켜 50 ~ 500 mM 이미다졸(imidazole) 농도구배를 주어 단백질 분획을 회수하였다. 각각의 분획은 12% SDS-PAGE을 통하여 분석하고 깨끗한 부분만을 모았다. 회수된 분획은 SDS-PAGE 분석을 통해 200 mM 이미다졸(imidazole)을 함유하는 용출 버퍼(elution buffer)의 용출(elution) 분획에서 가장 효과적으로 분리되었으며, 그 결과, 약 76 ~ 93%의 정제도를 확보하였다(도 5 (A), (B), (C), (D), lane 3).

일차 정제에서 90% 이하의 순도를 보이는 Sirt6와 Antp-Sirt6는 순도 개선을 위하여 양이온 교환 크로마토그래피(Cation exchange chromatography) 실험을 추가 진행하였다. 단백질 정제를 위한 시스템과 컬럼은 상기와 같은 시스템을 사용하고 레진은 싸이티바사(미국)의 SP sepharose FF를 사용하였다. 새로운 레진으로 충진한 컬럼을 4 ml/min의 유속으로 증류수를 이용하여 충분히 씻어준 후 평형화 버퍼(50 mM Tris-HCl, pH 7.4)를 레진 부피의 10배 정도를 흘려 레진을 평형화시켰다. 다음 IMAC을 이용해 일차 정제한 단백질 용액은 염 제거를 위해 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) 용액을 이용해 투석(dialysis)을 진행한 후 평형화된 컬럼에 로딩하였다. 컬럼에 결합되지 않은 단백질 제거를 위해 크로마토그래피 펌프 A에 평형화 버퍼를 연결하고 펌프 B에 용출 버퍼(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1000 mM NaCl)를 각각 연결하여 펌프 A 100% 비율로 레진 부피의 10배 정도로 충분히 세척하였다. 이후 컬럼에 결합된 단백질을 용출하기 위하여 용출 버퍼가 연결된 펌프 B의 비율을 0 ~ 100%로 작동시켜 0 ~ 1,000 mM 염화나트륨(NaCl) 농도구배를 주어 단백질 분획을 회수하였다. 각각의 분획은 12% SDS-PAGE을 통하여 분석하고 깨끗한 부분만을 모았다. 회수된 분획은 SDS-PAGE 분석을 통해 500 mM 염화나트륨을 함유하는 버퍼의 용출 분획에서 가장 효과적으로 분리되었다. 또한, 일차정제에서 90% 이하의 순도를 보이는 Sirt6와 Antp-Sirt6는 이 과정을 통해 순도 90% 이상의 증가된 정제도를 확보할 수 있었다(도 5 (A), (D), lane 4). 상기 정제 방법으로 수득된 다양한 Sirt6 단백질들은 SDS-PAGE 분석을 통하여 약 43 kDa의 크기로 목적단백질이 잘 정제되었음을 확인하였다. 최종 SDS-PAGE 분석결과는 도 6에 나타내었다.

이와 같이 반복적인 정제를 통해 수립한 표준생산공정을 통해서도 일정한 순도의 단백질 전달 서열 융합 단백질이 높은 순도로 발현 정제됨을 확인하였다. 표준생산공정은 정제 전 샘플처리 프로토콜과 친화성 크로마토그래피와 선택적 양이온 교환 크로마토그래피를 기본으로 한 정제 프로토콜, 및 컬럼으로 용출된 샘플분획의 투석과 초미세 여과 등의 후처리 공정으로 구성되었다.

[실험예 3: 각질형성세포에서 단백질 전달 서열 융합 시르투인6(PTD-Sirt6)의 세포 투과 확인]

본 실험예에서는 각질형성세포(keratinocyte)에서 단백질 전달 서열 융합 시르투인6(PTD-Sirt6)의 세포 투과도를 확인하였다.

사람 유래의 각질형성세포(keratinocyte) 세포주인 HaCaT 세포를 10%의 소태아혈청(fetal bovine serum, JRH Bioscience, Tokyo, Japan), 100 νg/ml의 페니실린 및 100 νg/ml의 스트렙토마이신(모두 GIBCO, Milan, Italy에서 입수)을 첨가한 DMEM 배지(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 배양한 세포를 12 well plate에 2.5 x 10⁵ cells/well의 세포수를 분주한 후 하루 동안 세포를 안정화시켰다. 시료 4종(Sirt6, Tat-Sirt6, PTD5-Sirt6, Antp-Sirt6)을 60분간 처리한 후, 세포는 트립신-EDTA로 처리하고 하베스트(harvest)한 다음 단백질을 추출하여 웨스턴 블랏을 수행하였고 배지에 남아있는 시료의 양은 Human NAD-Dependent Deacetylase Sirtuin-6 (SIRT6/SIR2L6) ELISA 분석을 수행하였다.

1) 웨스턴 블랏 분석

반응이 끝난 세포를 1 x PBS를 이용하여 한번 세척한 후 1 x cell lysis buffer를 100 ㎕씩 첨가하여 세포를 용해시켰다. 30분 동안 반응시킨 후 12,000 rpm, 4^oC에서 15분 동안 원심 분리 후 상층액을 분리하여 12% SDS-PAGE를 수행하였다. 전기영동 후 gel을 PVDF membrane에 전이시킨 후 5% skim milk를 이용하여 상온에서 1 시간 동안 blocking시키고 TTBS 완충액으로 3-5회 세척한 후 1차 항체를 하루 동안 반응시킨 후 TTBS 완충액으로 3-5회 세척한 다음 5% skim milk를 이용하여 2차 항체를 상온에서 2 시간 동안 반응시켰다. TTBS 완충액으로 3-5회 세척한 뒤, membrane을 ECL 용액으로 반응시키고 Chemi Doc machine을 이용하여 밴드를 분석하였다.

2) Human NAD-Dependent Deacetylase Sirtuin-6 (SIRT6/SIR2L6) ELISA 분석

시료 4종(Sirt6, Tat-Sirt6, PTD5-Sirt6, Antp-Sirt6))을 30분간 처리한 후, 12 well plate배지에 남아있는 시료의 양은 Human NAD-Dependent Deacetylase Sirtuin-6 (SIRT6/SIR2L6) ELISA kit (Cusabio Technology 사)를 사용하여 배지에 남아있는 시료의 양을 측정하였다.

① 각 well에 상등액과 표준액을 각각 20 ㎕씩 넣어 37℃에서 2시간 배양하였다.

② 세척없이 비오틴 항체를 100 ㎕를 취하여 각 well에 추가하여 넣은 다음 37℃에서 1시간 배양하였다.

③ 각 well에서 반응액을 제거한 다음 PBS 200 ㎕로 3회 씻었다.

④ HRP-아비딘 용액 100 ㎕를 취하여 각 well에 넣은 다음 37℃에서 1시간 추가 배양하였다.

⑤ 각 well에서 반응액을 제거한 다음 PBS 200 ㎕로 5회 씻었다.

⑥ 빛을 최대한 차단한 상태에서 TMB 기질 90 ㎕를 넣고 상온에서 15분간 반응시키고 Stop Solution 50 ㎕를 추가하고 플레이트를 가볍게 두드려 완전히 혼합한 다음 microplate reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

⑦ Sirt6 표준용액을 통한 1차식 검량선을 그린 뒤 검량선에 흡광도를 대입하여 배지에 남아있는 함량을 계산하였다.

시험은 3회 반복 실시하였으며, 하기 수학식 1을 이용하여 PTD가 없는 Sirt6 시료 처리군 대비 배지에 남아있는 PTD-Sirt6의 양을 구하고 이를 역으로 환산하여 세포 투과율을 나타내었으며 3회 실험의 평균 ± 표준편차로 표시하였다.

PTD가 없는 Sirt6와 다양한 PTD-Sirt6의 세포투과능을 평가하기에 앞서 모든 시료들을 100 νg/ml의 농도로 HaCaT 세포에 처리하고 세포의 상태를 관찰하였다. 시간이 지남에 따라 PTD가 결합되어 있지 않은 시료인 Sirt6의 경우 시료를 처리하지 않은 군 및 PTD-Sirt6 3종 시료를 처리한 군과 비교하여 시료 처리 후 시간이 지남에 따라 세포 사이에서 약간의 침전물이 발생되는 것을 확인하였으나 세포의 사멸은 확인되지 않았다. 따라서 세포에 생육에 영향을 주지 않는 100 νg/ml의 농도로 모든 시료들을 1시간 동안 처리하고 세포로부터 단백질을 회수하여 웨스턴 블랏과 배지를 이용한 ELISA 분석으로 PTD-Sirt6의 투과능을 측정하였다.

그 결과, 도 7(왼쪽)과 같이 웨스턴 블랏을 이용한 세포 내 존재하는 시료 4종의 분석 결과 Tat-Sirt6와 Antp-Sirt6가 PTD5-Sirt6보다 투과율이 높았으며, 반응 1시간 정도에는 PTD의 종류에 따라 세포 투과도의 차이가 확인되었으나 시간이 지남에 따라 PTD5-Sirt6도 세포에 투과되는 것을 확인하였다. 반면, PTD가 없는 대조군 Sirt6 단백질은 시간이 지나도 세포내로 투과되지 않았다. 상기의 결과를 종합해봤을 때, PTD를 붙인 Sirt6 3종 시료의 경우 세포 내로 들어가 세포 사이에서 이물질이 확인되지 않으나 PTD가 붙어 있지 않은 Sirt6 시료의 경우 세포 내로 투과하지 못하고 배지에 존재하다가 시간이 지남에 따라 뭉쳐서 앞서 언급된 침전물이 발생하는 것으로 판단되었다.

한편, ELISA 방법을 이용하여 1시간 처리후 샘플링한 배지에서 PTD-Sirt6의 양을 정량하여 역으로 환산한 투과율을 확인한 결과 도 7(오른쪽)과 같이 Tat-Sirt6가 47.9%로 가장 높은 세포 투과율을 보여주었으며 Antp-Sirt6, PTD5-Sirt6순으로 각각 38.3%, 3.4%으로 투과율이 확인되었다. 시료 처리에 따른 대비검정 (contrast test)을 실시한 결과 PTD-Sirt6 처리군과 Sirt6 처리군을 비교하였을때 통계적으로 유의한 차이 (p<0.01)를 나타내었다.

[실험예 4: 섬유아세포에서 단백질 전달 서열 융합 시르투인6(PTD-Sirt6)의 세포 투과 확인]

본 실험예에서는 섬유아세포에서 단백질 전달 서열 융합 시르투인6(PTD-Sirt6)의 세포 투과도를 확인하였다. 이때, 섬유아세포 세포주인 HDF 세포를 이용한 것을 제외하고는 상기 실험예 3과 실질적으로 동일한 방법으로 세포 투과도를 확인하였다.

인간 섬유아세포에서 PTD 융합 Sirt6 단백질의 세포투과능을 평가하기 위하여 세포독성이 없는 100 ㎍/ml의 농도의 모든 시료를 1시간 동안 처리하고 웨스턴 블랏과 ELISA 분석으로 투과된 단백질 수준을 측정하였다. 웨스턴 블랏 결과(도 8의 왼쪽), Tat-Sirt6가 가장 많은 양이 세포내에서 확인되었으며 다음으로 PTD5-Sirt6, Antp-SIrt6가 거의 유사한 양으로 세포내로 투과된 것을 확인하였다.

한편, ELISA 분석을 이용한 세포 투과 정량분석 결과 Tat-Sirt6가 1시간 동안 39.9%로 가장 높은 세포 투과율을 보여주었으며 다음으로 Antp-Sirt6, PTD5-Sirt6 순으로 각각 31.7%, 29.2%으로 투과율이 확인되었다. PTD가 도입되지 않은 대조군 Sirt6 단백질은 각질형성세포와 마찬가지로 세포내로 투과되지 않음을 확인하였다. 상기의 결과를 통해 Sirt6의 세포투과능이 Tat 펩타이드를 도입한 경우가 Antp 펩타이드, PTD5 펩타이드보다 세포 투과능이 좀 더 효율적임을 확인하였다. 시료 처리에 따른 대비검정 (contrast test)을 실시한 결과 PTD-Sirt6 처리군과 Sirt6처리군을 비교하였을때 통계적으로 유의한 차이 (p<0.01)를 나타내었다.

[실험예 5: 각질형성세포에서 단백질 전달 서열 융합 시르투인6(PTD-Sirt6)의 세포 이동(cell migration) 확인]

본 실험예에서는 각질형성세포(keratinocyte)에서 단백질 전달 서열 융합 시르투인6(PTD-Sirt6)의 세포 이동(cell migration)을 통해 스크래치 상처회복에 미치는 영향을 확인하였다.

HaCaT 세포를 10%의 소태아혈청(fetal bovine serum, JRH Bioscience, Tokyo, Japan), 100 νg/ml의 페니실린 및 100 νg/ml의 스트렙토마이신(모두 GIBCO, Milan, Italy에서 입수)을 첨가한 DMEM 배지(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 배양한 세포를 각 웰당 3.5 X 10⁵이 되도록 12 well plate에 깔고, 하룻밤 동안 세포가 기벽에 붙기를 기다린 다음, PBS로 세포를 한번 세척하고 200 ㎕ 피펫 팁(pipet tip)으로 세포를 긁어 가운데에 수직선 모양의 스크래치(scratch)를 만들어 주었다. 떨어져 나간 세포 잔여물(cell debris)을 제거하기 위해 PBS로 2회 세척하고, 각 시험물질이 포함된 FBS-free DMEM으로 배지를 갈아주었다. 사진 촬영 시 항상 동일한 부분을 찍기 위해 웰 가운데를 미세한 마커로 표시하고 시험 시작(0시간)과 동시에 표시한 부분의 세포 사진을 찍었다. 마찬가지로 24시간 후의 세포 사진도 촬영하였다. 0시간과 24시간 후의 사진을 이미지 분석 프로그램, 멀티 게이지(Multi gauge, Fujifilm, Japan)로 분석하여 단일층 세포 위에 만들어진 스크래치 면적을 측정하였다. 세포 스크래치 면적을 측정한 후 다음의 수학식 2에 따라 스크래치 면적이 채워진 영역을 상처 충진율(wound fill percentage, %)로 나타내었다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.

다양한 PTD가 융합된 Sirt6를 세포독성이 없는 10, 30, 100 νg/ml의 농도로 각질형성세포에 처리한 결과, 시료 3종 모두 10 νg/ml 농도부터 세포 이동(migration)이 증가하여 30 νg/ml 농도에서 최대 migration 증가를 확인하였다. 그 중에서도 Tat-Sirt6과 Antp-Sirt6가 30 νg/ml 농도에서 약 80%의 우수한 각질형성세포 재생 촉진 효과를 나타내었다. 처리 농도에 따른 대비검정 (contrast test)을 실시한 결과 모든 처리농도에서 무처리군과 비교하여 통계적으로 유의한 차이 (p<0.01)를 나타내었다.

[실험예 6: 섬유아세포에서 단백질 전달 서열 융합 시르투인6(PTD-Sirt6)의 세포 이동(cell migration) 확인]

본 실험예에서는 각질형성세포(keratinocyte)에서 단백질 전달 서열 융합 시르투인6(PTD-Sirt6)의 세포 이동(cell migration)을 통해 스크래치 상처회복에 미치는 영향을 확인하였다. 이때, 섬유아세포 세포주인 HDF 세포를 이용한 것을 제외하고는 상기 실험예 5와 실질적으로 동일한 방법으로 PTD-Sirt6를 처리한 세포의 상처 충진율(wound fill percentage, %)을 확인하였다.

그 결과는 도 10과 같았다. 다양한 PTD가 융합된 Sirt6는 24시간 후 무처리군 대비 섬유아세포의 재생을 촉진하였으며 10 νg/ml 농도에서부터 점차 농도 의존적으로 재생 촉진 효과를 나타내었다. 특히 Tat 펩타이드가 도입된 Sirt6는 100 νg/ml농도에서 97%의 가장 높은 상처 충진율을 보여주었으며 다음으로 PTD5-Sirt6, Antp-Sirt6순으로 각각 85.5%, 78.5% 순으로 상처 충진율이 확인되었다. 처리 농도에 따른 대비검정 (contrast test)을 실시한 결과 모든 처리농도에서 무처리군과 비교하여 통계적으로 유의한 차이 (p<0.01)를 나타내었다.

[실험예 7: 단백질 전달 서열 융합 시르투인6(PTD-Sirt6)의 각질형성세포 증식 확인]

본 실험예에서는 단백질 전달 서열 융합 시르투인6(PTD-Sirt6)의 각질형성세포 증식을 확인하였다.

HaCaT 세포를 10%의 소태아혈청(fetal bovine serum, JRH Bioscience, Tokyo, Japan), 100 νg/ml의 페니실린 및 100 νg/ml의 스트렙토마이신(모두 GIBCO, Milan, Italy에서 입수)을 첨가한 DMEM 배지(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 배양한 세포를 웰 당 1 X 10⁴이 되도록 96 well plate에 깔고, 하룻밤 동안 세포가 기벽에 붙기를 기다린 다음, PBS로 세포를 한번 세척하고 0.2% FBS가 함유된 배지로 교환하고 각각 농도별로 시료를 처리하여 37^oC, CO₂ 배양기에서 48시간 동안 반응시켰다. 48시간이 지난 후 5 mg/ml 농도의 MTT 시약을 각 well에 처리하여 2시간 동안 반응시킨 후 상층액을 모두 제거하고 100 ul의 DMSO를 첨가하여 생성된 포마잔(formazan)을 완전히 용해시킨 후 550 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 11과 같이 세포 증식율(%, 최고 증가율 기준)은 같은 농도에서 Tat-Sirt6, Antp-Sirt6, PTD5-Sirt6 순으로 높게 나타나는 것으로 확인하였다. Tat-Sirt6의 경우 10, 30, 100 νg/ml 농도에서 각각 12.9%, 25.5%, 44.1%의 각질형성세포의 증식을 보여주었다. Antp-Sirt6의 경우 10, 30, 100 νg/ml 농도에서 8.8%, 15.3%, 29.9% 각질형성세포의 증식능력을 확인하였으며 PTD5-Sirt6의 경우 10, 30, 100 νg/ml 농도에서 6.2%, 10.3%, 22.6%의 증식능을 확인하였다. 처리 농도에 따른 대비검정 (contrast test)을 실시한 결과 모든 처리농도에서 무처리군과 비교하여 통계적으로 유의한 차이 (p<0.01)를 나타내었다.

[실험예 8: 단백질 전달 서열 융합 시르투인6(PTD-Sirt6)의 섬유아세포 증식 확인]

본 실험예에서는 단백질 전달 서열 융합 시르투인6(PTD-Sirt6)의 섬유아세포 증식을 확인하였다. 이때, 섬유아세포 세포주인 HDF 세포를 이용한 것을 제외하고는 상기 실험예 7과 실질적으로 동일한 방법으로 섬유아세포 증식을 확인하였다.

그 결과, 도 12와 같이 세포 증식율은 각질형성세포와 같은 패턴으로 Tat-Sirt6, Antp-Sirt6, PTD5-Sirt6 순으로 전반적으로 높게 나타나는 것(100 vg/ml에서만 PTD5-Sirt6이 Antp-Sirt6보다 높게 나타남)으로 확인하였다. Tat-Sirt6의 경우 다른 PTD 융합 Sirt6 시료들과 비교하여 더 낮은 농도인 3 νg/ml 농도부터 세포 증식 효과가 확인되었으며 3, 10, 30, 100 νg/ml 농도에서 각각 13.9%, 55.5%, 116.1%, 102.0% 섬유아세포의 증식을 보여주었다. Antp-Sirt6의 경우 10, 30, 100 νg/ml 농도에서 22.8%, 73.1%, 85.4% 섬유아세포의 증식능을, PTD5-Sirt6의 경우 10, 30, 100 νg/ml 농도에서 18.5%, 67.3%, 105.3% 섬유아세포의 증식능을 확인하였다. 처리 농도에 따른 대비검정 (contrast test)을 실시한 결과 모든 처리농도에서 무처리군과 비교하여 통계적으로 유의한 차이 (p<0.01)를 나타내었다.

[실험예 9: 단백질 전달 서열 융합 시르투인6(PTD-Sirt6)의 콜라겐(collagen) 합성 시험]

본 실험예에서는 단백질 전달 서열 융합 시르투인6(PTD-Sirt6)의 콜라겐 합성 시험을 수행하였으며, 이를 위해 가장 좋은 결과를 나타내었던 Tat-Sirt6을 이용하였다.

피부 주름의 발생 원인으로 피부 교원질(콜라겐)의 결핍과 엘라스틴 구조 변형이 꼽히고 있는데 콜라겐과 엘라스틴은 피부 진피를 구성하는 주요 단백질로서 피부 구조와 탄력을 유지하는 역할을 한다. 콜라겐은 피부 노화에 큰 영향을 미치는데 피부 노화는 콜라겐 합성 자체가 감소되어 콜라겐 결핍 또는 결합조직 분해효소인 matrix metalloproteinase Ⅰ(MMP-1, Collagenase)의 발현 증가 등에 의해 나타나는 것으로 알려져 있다. 따라서 monoclonal 항체를 이용하여 Human procollagen I형의 C-말단 peptide (PIP)를 정량하는 Procollagen Type I C-Peptide PIP EIA kit로 세포의 I형 collagen 검출을 하는 ELISA 시험법은 세포의 콜라겐 양을 측정하는데 유용한 검사법이다.

1) 세포배양 및 세포생존율

실험에 사용된 HS68 세포는 ATCC에서 구입하여 사용하였다. DMEM 배지에 10% FBS와 1% Penicillin/streptomycin를 첨가하여 사용하였으며, 37℃, 상대습도 90%, 5% CO₂ incubator 배양하였다. HS68 세포를 96 well plate에 1 x 10⁴ cells/well 의 농도로 분주하고 10% FBS가 함유된 DMEM 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 배지를 제거하고 FBS가 함유되지 않은 DMEM 배지에 시료를 농도별로 첨가하여 24시간 동안 배양하였다. MTT solution (5 mg/ml)을 10 ㎕씩 첨가하고 4시간 동안 추가 배양하였다. 배지를 제거하고 Dimethyl Sulfoxide (DMSO)를 100 νl를 첨가하고 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율은 하기 수학식 3에 따라 계산하였다.

2) 콜라겐 생합성

HS68 세포를 24 well plate에 5 x 10⁴ cells/well 의 농도로 분주한 다음 24시간 배양한 후, 배지를 버리고 PBS로 세척한 다음 FBS가 함유되지 않는 배지에 Tat-Sirt6를 농도별로 첨가하여 24시간 배양하였다. 세포 배양액 내 콜라겐 양은 Procollagen type Ⅰ C-peptide EIA Kit를 사용하여 정량하였다. 측정된 콜라겐 양은 BCA법으로 구한 총 단백질 양으로 보정하여 사용하였고 TGF-β1 10 ng/mlk 양성대조군으로 사용하였다. 실험 결과는 모두 동일한 조건에서 측정한 후 실험 결과를 얻어 사용하였으며 유의성 검증은 독립표본 student t-test로 실시하였다. 실험 결과 p 값이 0.05미만일 때 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판정하여 표기하였다. 콜라겐 합성 실험에 앞서 세포의 생존에 영향을 주지 않는 안전한 농도를 확인하기 위하여 Tat-Sirt6를 HS68 세포에 처리하여 세포의 세포생존율을 측정하였다. 그 결과, Tat-Sirt6의 농도가 250 νg/ml이하의 농도에서는 세포독성이 관찰되지 않았으며 오히려 세포 증식이 일어나는 것을 확인할 수 있었다(도 13).

콜라겐은 사람의 진피층 중 70 ~ 80% 차지하고 있는 주요 성분이며 Type 1은 총 콜라겐의 80% 이상을 차지한다. 이는 세포내에서 프로콜라겐(procollagen)이라는 전구 물질의 형태로 합성된 후 세포외로 분비되어 콜라겐 섬유로 중합하며 이때 endopeptidase에 의해서 프로콜라겐의 N-말단 및 C-말단의 propeptide (PIP)가 유리된다. 도 14를 보면, 양성 대조군으로 사용한 TGF-β1이 10 ng/ml에서 180.28 ng/ml의 콜라겐 합성이 일어나는 것을 확인할 수 있었다. 또한 Tat-Sirt6를 62.5 νg/ml 농도로 세포에 처리하면 PIP의 함량이 177.97 ng/ml, 125 νg/ml 농도로 처리하면 251.15 ng/ml, 250 νg/ml 농도로 처리하면 280.85 ng/ml로 콜라겐 합성량이 농도에 따라 증가함을 알 수 있었다. 처리 농도에 따른 대비검정 (contrast test)을 실시한 결과 모든 처리농도에서 무처리군과 비교하여 통계적으로 유의한 차이 (p<0.01)를 나타내었다.

이상 종합하면, 본 발명은 코돈 최적화된 시르투인6(Sirtuin6, Sirt6)에 다양한 단백질 전달 서열(Protein transduction domain, PTD)를 융합하여 PTD-Sirt6을 생산함으로써, 인간각질형성세포와 인간섬유아세포의 증식 효능, 높은 피부 세포 투과도, 외부자극에 의해 손상된 표피층을 빠르게 회복시키는 효과, 콜라겐 합성 효과를 촉진함에 따라 현저한 피부 상처치유능, 피부장벽 강화능, 피부재생능 또는 항노화능을 발휘하는 화장료 조성물 및 창상 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공할 수 있다.

<110> KEYPROGEN Co., Ltd <120> Method for producing protein transduction domain-Sirtuin6 and cosmetic composition and pharmaceutical composition containing the same <130> YP-22-063 <160> 24 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1068 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon-optimized Sirt6 <400> 1 atgtcggtga attatgcggc ggggttaagt ccgtatgcgg ataagggcaa atgcggactc 60 cctgagattt tcgacccacc agaggaactt gagagaaaag tgtgggaact tgcgaggctg 120 gtttggcagt cttccagtgt ggtgtttcat actggtgccg gtatcagcac agcttctggc 180 atcccggatt ttaggggtcc ccatggagtc tggacgatgg aagaacgagg tttagctccc 240 aagtttgata ccacatttga aagcgcacgg ccaacccaga cccatatggc gctggtgcag 300 ttagaacgcg taggcctgct ccgcttcctt gtaagtcaaa acgtagatgg gcttcatgtg 360 cgctcaggct tcccccgtga taaattggca gaattacacg gaaacatgtt tgtcgaagaa 420 tgtgccaagt gtaaaacgca gtatgttcga gacacagtcg ttggtactat gggtctgaaa 480 gccacgggca ggttgtgtac cgtggctaaa gcacgtggac tgcgagcctg caggggggaa 540 ctgagggata caattttaga ttgggaagat tcactaccag atcgggatct ggcattggct 600 gatgaggcct cacgtaatgc agacctgtcc attacgctgg gtacctcgtt gcagattaga 660 cccagtggga atctgccctt agcgacaaaa cgcagaggag gacgcctcgt tattgttaac 720 ctgcaaccca ccaaacatga tcgccatgct gatctcagga ttcatggcta cgttgacgag 780 gtcatgacca ggcttatgaa acacctgggg ttggagatac cagcctggga cggtccccgt 840 gtcctggaaa gagcgttacc acccctacct cgcccgccta cccctaagct ggaacccaaa 900 gaggaatctc ccactcggat aaatggctct atcccggcag gtccaaaaca agagccttgc 960 gcacagcaca atggctcaga gccagcctca cccaaacgcg aacggcccac tagccctgcc 1020 ccccacagac cacctaaaag ggttaaggca aaagctgtac ccagctga 1068 <210> 2 <211> 355 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> codon-optimized Sirt6 <400> 2 Met Ser Val Asn Tyr Ala Ala Gly Leu Ser Pro Tyr Ala Asp Lys Gly 1 5 10 15 Lys Cys Gly Leu Pro Glu Ile Phe Asp Pro Pro Glu Glu Leu Glu Arg 20 25 30 Lys Val Trp Glu Leu Ala Arg Leu Val Trp Gln Ser Ser Ser Val Val 35 40 45 Phe His Thr Gly Ala Gly Ile Ser Thr Ala Ser Gly Ile Pro Asp Phe 50 55 60 Arg Gly Pro His Gly Val Trp Thr Met Glu Glu Arg Gly Leu Ala Pro 65 70 75 80 Lys Phe Asp Thr Thr Phe Glu Ser Ala Arg Pro Thr Gln Thr His Met 85 90 95 Ala Leu Val Gln Leu Glu Arg Val Gly Leu Leu Arg Phe Leu Val Ser 100 105 110 Gln Asn Val Asp Gly Leu His Val Arg Ser Gly Phe Pro Arg Asp Lys 115 120 125 Leu Ala Glu Leu His Gly Asn Met Phe Val Glu Glu Cys Ala Lys Cys 130 135 140 Lys Thr Gln Tyr Val Arg Asp Thr Val Val Gly Thr Met Gly Leu Lys 145 150 155 160 Ala Thr Gly Arg Leu Cys Thr Val Ala Lys Ala Arg Gly Leu Arg Ala 165 170 175 Cys Arg Gly Glu Leu Arg Asp Thr Ile Leu Asp Trp Glu Asp Ser Leu 180 185 190 Pro Asp Arg Asp Leu Ala Leu Ala Asp Glu Ala Ser Arg Asn Ala Asp 195 200 205 Leu Ser Ile Thr Leu Gly Thr Ser Leu Gln Ile Arg Pro Ser Gly Asn 210 215 220 Leu Pro Leu Ala Thr Lys Arg Arg Gly Gly Arg Leu Val Ile Val Asn 225 230 235 240 Leu Gln Pro Thr Lys His Asp Arg His Ala Asp Leu Arg Ile His Gly 245 250 255 Tyr Val Asp Glu Val Met Thr Arg Leu Met Lys His Leu Gly Leu Glu 260 265 270 Ile Pro Ala Trp Asp Gly Pro Arg Val Leu Glu Arg Ala Leu Pro Pro 275 280 285 Leu Pro Arg Pro Pro Thr Pro Lys Leu Glu Pro Lys Glu Glu Ser Pro 290 295 300 Thr Arg Ile Asn Gly Ser Ile Pro Ala Gly Pro Lys Gln Glu Pro Cys 305 310 315 320 Ala Gln His Asn Gly Ser Glu Pro Ala Ser Pro Lys Arg Glu Arg Pro 325 330 335 Thr Ser Pro Ala Pro His Arg Pro Pro Lys Arg Val Lys Ala Lys Ala 340 345 350 Val Pro Ser 355 <210> 3 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OriSirt6 F1-OriSirt6-6H-NdeI primer <400> 3 ggagatatac atatgtcggt gaattacgcg gcggggc 37 <210> 4 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OriSirt6 R1-OriSirt6-6H-XhoI primer <400> 4 atgatgatgc tcgaggctgg ggaccgcctt ggcct 35 <210> 5 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sirt6 F2-mdSirt6-6H-XbaI primer <400> 5 ccctctagaa ataattttgt ttaactttaa gaaggagata tacatatgtc ggtgaattat 60 g 61 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sirt6 R2-mdSirt6-6H-XhoI primer <400> 6 gtggtggtgc tcgaggctgg gtacagcttt tgcct 35 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tat-Sirt6 F3-Tat-mdSirt6-XbaI primer <400> 7 cgattcccct ctagaaataa ttttgtttaa 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tat-Sirt6 R3-Tat-mdSirt6 primer <400> 8 ataattcacc gacatacggc gacgctgacg 30 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tat-Sirt6 F4-Tat-mdSirt6 primer <400> 9 cgtcagcgtc gccgtatgtc ggtgaattat 30 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tat-Sirt6 R4-Tat-mdSirt6-6H-XhoI primer <400> 10 gtggtggtgc tcgaggctgg gtacagcttt 30 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTD5-Sirt6 F5-PTD5-mdSirt6-XbaI primer <400> 11 cgattcccct ctagaaataa ttttgtttaa 30 <210> 12 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTD5-Sirt6 R5-PTD5-mdSirt6 primer <400> 12 cgcataattc accgacatgc gtttcatcag tttgct 36 <210> 13 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTD5-Sirt6 F6-PTD5-mdSirt6 primer <400> 13 agcaaactga tgaaacgcat gtcggtgaat tatgcg 36 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTD5-Sirt6 R6-mdSirt6-6H-XhoI primer <400> 14 gtggtggtgc tcgaggctgg gtacagcttt 30 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antp-Sirt6 F7-Antp-mdSirt6-XbaI primer <400> 15 cgattcccct ctagaaataa ttttgtttaa 30 <210> 16 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antp-Sirt6 R7-Antp-mdSirt6 primer <400> 16 cgccgcataa ttcaccgaca tccatttcat acgacggtt 39 <210> 17 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antp-Sirt6 F8-Antp-mdSirt6 primer <400> 17 ccgtcgtatg aaatggatgt cggtgaatta tgcggcg 37 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antp-Sirt6 R8-mdSirt6-6H-XhoI primer <400> 18 gtggtggtgc tcgaggctgg gtacagcttt 30 <210> 19 <211> 1101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tat-Sirt6 <400> 19 tatggccgta aaaaacgtcg tcagcgtcgc cgtatgtcgg tgaattatgc ggcggggtta 60 agtccgtatg cggataaggg caaatgcgga ctccctgaga ttttcgaccc accagaggaa 120 cttgagagaa 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acaagagcct tgcgcacagc acaatggctc agagccagcc 1020 tcacccaaac gcgaacggcc cactagccct gccccccaca gaccacctaa aagggttaag 1080 gcaaaagctg tacccagctg a 1101 <210> 20 <211> 366 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tat-Sirt6 <400> 20 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Met Ser Val Asn Tyr 1 5 10 15 Ala Ala Gly Leu Ser Pro Tyr Ala Asp Lys Gly Lys Cys Gly Leu Pro 20 25 30 Glu Ile Phe Asp Pro Pro Glu Glu Leu Glu Arg Lys Val Trp Glu Leu 35 40 45 Ala Arg Leu Val Trp Gln Ser Ser Ser Val Val Phe His Thr Gly Ala 50 55 60 Gly Ile Ser Thr Ala Ser Gly Ile Pro Asp Phe Arg Gly Pro His Gly 65 70 75 80 Val Trp Thr Met Glu Glu Arg Gly Leu Ala Pro Lys Phe Asp Thr Thr 85 90 95 Phe Glu Ser Ala Arg Pro Thr Gln Thr His Met Ala Leu Val Gln Leu 100 105 110 Glu Arg Val Gly Leu Leu Arg Phe Leu Val Ser Gln Asn Val Asp Gly 115 120 125 Leu His Val Arg Ser Gly Phe Pro Arg Asp Lys Leu Ala Glu Leu His 130 135 140 Gly Asn Met Phe Val Glu Glu Cys Ala Lys Cys Lys Thr Gln Tyr Val 145 150 155 160 Arg Asp Thr Val Val Gly Thr Met Gly Leu Lys Ala Thr Gly Arg Leu 165 170 175 Cys Thr Val Ala Lys Ala Arg Gly Leu Arg Ala Cys Arg Gly Glu Leu 180 185 190 Arg Asp Thr Ile Leu Asp Trp Glu Asp Ser Leu Pro Asp Arg Asp Leu 195 200 205 Ala Leu Ala Asp Glu Ala Ser Arg Asn Ala Asp Leu Ser Ile Thr Leu 210 215 220 Gly Thr Ser Leu Gln Ile Arg Pro Ser Gly Asn Leu Pro Leu Ala Thr 225 230 235 240 Lys Arg Arg Gly Gly Arg Leu Val Ile Val Asn Leu Gln Pro Thr Lys 245 250 255 His Asp Arg His Ala Asp Leu Arg Ile His Gly Tyr Val Asp Glu Val 260 265 270 Met Thr Arg Leu Met Lys His Leu Gly Leu Glu Ile Pro Ala Trp Asp 275 280 285 Gly Pro Arg Val Leu Glu Arg Ala Leu Pro Pro Leu Pro Arg Pro Pro 290 295 300 Thr Pro Lys Leu Glu Pro Lys Glu Glu Ser Pro Thr Arg Ile Asn Gly 305 310 315 320 Ser Ile Pro Ala Gly Pro Lys Gln Glu Pro Cys Ala Gln His Asn Gly 325 330 335 Ser Glu Pro Ala Ser Pro Lys Arg Glu Arg Pro Thr Ser Pro Ala Pro 340 345 350 His Arg Pro Pro Lys Arg Val Lys Ala Lys Ala Val Pro Ser 355 360 365 <210> 21 <211> 1104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTD5-Sirt6 <400> 21 cgtcgtcagc gtcgtaccag caaactgatg aaacgcatgt cggtgaatta tgcggcgggg 60 ttaagtccgt atgcggataa gggcaaatgc ggactccctg agattttcga cccaccagag 120 gaacttgaga gaaaagtgtg ggaacttgcg aggctggttt ggcagtcttc cagtgtggtg 180 tttcatactg gtgccggtat cagcacagct tctggcatcc cggattttag gggtccccat 240 ggagtctgga cgatggaaga acgaggttta gctcccaagt ttgataccac atttgaaagc 300 gcacggccaa cccagaccca tatggcgctg gtgcagttag aacgcgtagg cctgctccgc 360 ttccttgtaa gtcaaaacgt agatgggctt catgtgcgct caggcttccc ccgtgataaa 420 ttggcagaat tacacggaaa catgtttgtc gaagaatgtg ccaagtgtaa aacgcagtat 480 gttcgagaca cagtcgttgg tactatgggt ctgaaagcca cgggcaggtt gtgtaccgtg 540 gctaaagcac gtggactgcg agcctgcagg ggggaactga gggatacaat tttagattgg 600 gaagattcac taccagatcg ggatctggca ttggctgatg aggcctcacg taatgcagac 660 ctgtccatta cgctgggtac ctcgttgcag attagaccca gtgggaatct gcccttagcg 720 acaaaacgca gaggaggacg cctcgttatt gttaacctgc aacccaccaa acatgatcgc 780 catgctgatc tcaggattca tggctacgtt gacgaggtca tgaccaggct tatgaaacac 840 ctggggttgg agataccagc ctgggacggt ccccgtgtcc tggaaagagc gttaccaccc 900 ctacctcgcc cgcctacccc taagctggaa cccaaagagg aatctcccac tcggataaat 960 ggctctatcc cggcaggtcc aaaacaagag ccttgcgcac agcacaatgg ctcagagcca 1020 gcctcaccca aacgcgaacg gcccactagc cctgcccccc acagaccacc taaaagggtt 1080 aaggcaaaag ctgtacccag ctga 1104 <210> 22 <211> 367 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PTD5-Sirt6 <400> 22 Arg Arg Gln Arg Arg Thr Ser Lys Leu Met Lys Arg Met Ser Val Asn 1 5 10 15 Tyr Ala Ala Gly Leu Ser Pro Tyr Ala Asp Lys Gly Lys Cys Gly Leu 20 25 30 Pro Glu Ile Phe Asp Pro Pro Glu Glu Leu Glu Arg Lys Val Trp Glu 35 40 45 Leu Ala Arg Leu Val Trp Gln Ser Ser Ser Val Val Phe His Thr Gly 50 55 60 Ala Gly Ile Ser Thr Ala Ser Gly Ile Pro Asp Phe Arg Gly Pro His 65 70 75 80 Gly Val Trp Thr Met Glu Glu Arg Gly Leu Ala Pro Lys Phe Asp Thr 85 90 95 Thr Phe Glu Ser Ala Arg Pro Thr Gln Thr His Met Ala Leu Val Gln 100 105 110 Leu Glu Arg Val Gly Leu Leu Arg Phe Leu Val Ser Gln Asn Val Asp 115 120 125 Gly Leu His Val Arg Ser Gly Phe Pro Arg Asp Lys Leu Ala Glu Leu 130 135 140 His Gly Asn Met Phe Val Glu Glu Cys Ala Lys Cys Lys Thr Gln Tyr 145 150 155 160 Val Arg Asp Thr Val Val Gly Thr Met Gly Leu Lys Ala Thr Gly Arg 165 170 175 Leu Cys Thr Val Ala Lys Ala Arg Gly Leu Arg Ala Cys Arg Gly Glu 180 185 190 Leu Arg Asp Thr Ile Leu Asp Trp Glu Asp Ser Leu Pro Asp Arg Asp 195 200 205 Leu Ala Leu Ala Asp Glu Ala Ser Arg Asn Ala Asp Leu Ser Ile Thr 210 215 220 Leu Gly Thr Ser Leu Gln Ile Arg Pro Ser Gly Asn Leu Pro Leu Ala 225 230 235 240 Thr Lys Arg Arg Gly Gly Arg Leu Val Ile Val Asn Leu Gln Pro Thr 245 250 255 Lys His Asp Arg His Ala Asp Leu Arg Ile His Gly Tyr Val Asp Glu 260 265 270 Val Met Thr Arg Leu Met Lys His Leu Gly Leu Glu Ile Pro Ala Trp 275 280 285 Asp Gly Pro Arg Val Leu Glu Arg Ala Leu Pro Pro Leu Pro Arg Pro 290 295 300 Pro Thr Pro Lys Leu Glu Pro Lys Glu Glu Ser Pro Thr Arg Ile Asn 305 310 315 320 Gly Ser Ile Pro Ala Gly Pro Lys Gln Glu Pro Cys Ala Gln His Asn 325 330 335 Gly Ser Glu Pro Ala Ser Pro Lys Arg Glu Arg Pro Thr Ser Pro Ala 340 345 350 Pro His Arg Pro Pro Lys Arg Val Lys Ala Lys Ala Val Pro Ser 355 360 365 <210> 23 <211> 1110 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antp-Sirt6 <400> 23 cgtcagatta aaatttggtt tcagaaccgt cgtatgaaat ggatgtcggt gaattatgcg 60 gcggggttaa gtccgtatgc ggataagggc aaatgcggac tccctgagat tttcgaccca 120 ccagaggaac ttgagagaaa agtgtgggaa cttgcgaggc tggtttggca gtcttccagt 180 gtggtgtttc atactggtgc cggtatcagc acagcttctg gcatcccgga ttttaggggt 240 ccccatggag tctggacgat ggaagaacga ggtttagctc ccaagtttga taccacattt 300 gaaagcgcac ggccaaccca gacccatatg gcgctggtgc agttagaacg cgtaggcctg 360 ctccgcttcc ttgtaagtca aaacgtagat gggcttcatg tgcgctcagg cttcccccgt 420 gataaattgg cagaattaca cggaaacatg tttgtcgaag aatgtgccaa gtgtaaaacg 480 cagtatgttc gagacacagt cgttggtact atgggtctga aagccacggg caggttgtgt 540 accgtggcta aagcacgtgg actgcgagcc tgcagggggg aactgaggga tacaatttta 600 gattgggaag attcactacc agatcgggat ctggcattgg ctgatgaggc ctcacgtaat 660 gcagacctgt ccattacgct gggtacctcg ttgcagatta gacccagtgg gaatctgccc 720 ttagcgacaa aacgcagagg aggacgcctc gttattgtta acctgcaacc caccaaacat 780 gatcgccatg ctgatctcag gattcatggc tacgttgacg aggtcatgac caggcttatg 840 aaacacctgg ggttggagat accagcctgg gacggtcccc gtgtcctgga aagagcgtta 900 ccacccctac ctcgcccgcc tacccctaag ctggaaccca aagaggaatc tcccactcgg 960 ataaatggct ctatcccggc aggtccaaaa caagagcctt gcgcacagca caatggctca 1020 gagccagcct cacccaaacg cgaacggccc actagccctg ccccccacag accacctaaa 1080 agggttaagg caaaagctgt acccagctga 1110 <210> 24 <211> 369 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antp-Sirt6 <400> 24 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Met Ser 1 5 10 15 Val Asn Tyr Ala Ala Gly Leu Ser Pro Tyr Ala Asp Lys Gly Lys Cys 20 25 30 Gly Leu Pro Glu Ile Phe Asp Pro Pro Glu Glu Leu Glu Arg Lys Val 35 40 45 Trp Glu Leu Ala Arg Leu Val Trp Gln Ser Ser Ser Val Val Phe His 50 55 60 Thr Gly Ala Gly Ile Ser Thr Ala Ser Gly Ile Pro Asp Phe Arg Gly 65 70 75 80 Pro His Gly Val Trp Thr Met Glu Glu Arg Gly Leu Ala Pro Lys Phe 85 90 95 Asp Thr Thr Phe Glu Ser Ala Arg Pro Thr Gln Thr His Met Ala Leu 100 105 110 Val Gln Leu Glu Arg Val Gly Leu Leu Arg Phe Leu Val Ser Gln Asn 115 120 125 Val Asp Gly Leu His Val Arg Ser Gly Phe Pro Arg Asp Lys Leu Ala 130 135 140 Glu Leu His Gly Asn Met Phe Val Glu Glu Cys Ala Lys Cys Lys Thr 145 150 155 160 Gln Tyr Val Arg Asp Thr Val Val Gly Thr Met Gly Leu Lys Ala Thr 165 170 175 Gly Arg Leu Cys Thr Val Ala Lys Ala Arg Gly Leu Arg Ala Cys Arg 180 185 190 Gly Glu Leu Arg Asp Thr Ile Leu Asp Trp Glu Asp Ser Leu Pro Asp 195 200 205 Arg Asp Leu Ala Leu Ala Asp Glu Ala Ser Arg Asn Ala Asp Leu Ser 210 215 220 Ile Thr Leu Gly Thr Ser Leu Gln Ile Arg Pro Ser Gly Asn Leu Pro 225 230 235 240 Leu Ala Thr Lys Arg Arg Gly Gly Arg Leu Val Ile Val Asn Leu Gln 245 250 255 Pro Thr Lys His Asp Arg His Ala Asp Leu Arg Ile His Gly Tyr Val 260 265 270 Asp Glu Val Met Thr Arg Leu Met Lys His Leu Gly Leu Glu Ile Pro 275 280 285 Ala Trp Asp Gly Pro Arg Val Leu Glu Arg Ala Leu Pro Pro Leu Pro 290 295 300 Arg Pro Pro Thr Pro Lys Leu Glu Pro Lys Glu Glu Ser Pro Thr Arg 305 310 315 320 Ile Asn Gly Ser Ile Pro Ala Gly Pro Lys Gln Glu Pro Cys Ala Gln 325 330 335 His Asn Gly Ser Glu Pro Ala Ser Pro Lys Arg Glu Arg Pro Thr Ser 340 345 350 Pro Ala Pro His Arg Pro Pro Lys Arg Val Lys Ala Lys Ala Val Pro 355 360 365 Ser

Claims (11)

1. 삭제
2. Tat 펩타이드의 유전자 서열에 서열번호 1에 기재된 핵산서열로 코돈최적화된 재조합 시르투인(Sirtuin) 6의 유전자 서열을 융합하여 제조된 것으로, 서열번호 7에 기재된 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머, 서열번호 8에 기재된 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머, 서열번호 9에 기재된 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열번호 10에 기재된 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머를 가지는 재조합 발현벡터를 이용하여 생산된, 서열번호 19에 기재된 핵산서열로 암호화된 재조합 단백질.
   
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5. 제2항의 재조합 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
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8. 제5항에 있어서,
   상기 화장료 조성물은,
   상처치유용, 피부장벽 강화용 또는 피부재생용 중에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
9. 제2항의 재조합 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 창상 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
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