KR102127830B1

KR102127830B1 - 세포 투과 펩티드와 결합된 융합 단백질 및 융합 단백질 또는 세포 투과 펩티드와 상피세포성장인자를 유효성분으로 포함하는 조성물

Info

Publication number: KR102127830B1
Application number: KR1020190069003A
Authority: KR
Inventors: 백이용; 신우리; 박시은; 최준섭; 구혜정
Original assignee: (주)에빅스젠
Priority date: 2018-06-14
Filing date: 2019-06-11
Publication date: 2020-06-30
Also published as: CN112399971A; US11547649B2; KR20190141600A; JP2021526383A; EP3808762A4; EP3808762A1; JP7113918B2; US20210251872A1; WO2019240430A1

Abstract

피부 조직 및 세포 투과성 펩티드와 결합된 보툴리눔 독소, 상피세포성장인자 또는 헥사펩티드 융합 단백질, 또는 피부 조직 및 세포 투과성 펩티드와 혼합된 상피세포성장인자 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 상기 융합 단백질 또는 세포 투과성 펩티드와 혼합된 상피세포성장인자는 단독 단백질보다 세포 투과성이 증가되어 있으므로 피부 상태 개선, 주름 개선, 근육 긴장 완화 및 상처 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

세포 투과 펩티드와 결합된 융합 단백질 및 융합 단백질 또는 세포 투과 펩티드와 상피세포성장인자를 유효성분으로 포함하는 조성물{Fusion Protein Conjugated Cell Penetrating Peptide and Composition Comprising the Fusion Protein or Cell Penetrating Peptide and Epidermal Growth Factor}

본 발명은 세포 투과 펩티드와 결합된 융합 단백질, 및 융합 단백질 또는 세포 투과 펩티드와 상피세포성장인자를 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것이다.

피부는 외부의 환경과 항상 접하고 있는 조직으로, 체액 누출 및 감염 방지, 수분 소실을 막는 보호장벽 역할을 한다. 특히 표피의 각질층은 피부에서도 가장 바깥쪽에 존재하면서 피부 밖으로의 수분과 전해질의 소실을 억제함으로써 피부의 건조를 막고, 피부의 정상적인 생화학적 대사를 할 수 있는 환경을 제공한다. 또한, 외부의 물리적 손상과 화학물질로부터 인체를 보호하고, 세균, 곰팡이, 바이러스 등이 피부로 침범하는 것을 방지하는 중요한 역할을 한다. 그러나 나이가 들어감에 따라 각종 오염물질, 강한 자외선, 스트레스 및 영양결핍 등으로 인해 피부 세포들이 손상을 입게 되고, 세포 증식이 제대로 이루어지지 않게 되어 피부에 주름, 탄력 손실 및 각질화 등이 발생한다.

이에 따라 화장품 소재에 신기술을 접목한 고기능성 화장품의 개발이 지속적으로 이루어지고 있다. 또한, 미백, 주름개선, 피부재생과 같은 구체적인 효과를 요구하는 소비자들이 늘어남에 따라, 화장품 산업에서 기능성 화장품의 가치가 더욱 증가하고 있으며, 다양한 소재를 화장품에 융합시키기 위한 연구들이 집중되고 있다.

화장품 원료로 빈번하게 사용되는 분자량 500 Da 이하의 저분자 합성 화합물이나 천연 화합물들은 쉽게 세포 내로 전달되는 것으로 알려져 있으나, 피부 장벽을 구성하는 각질층의 고유 특성으로 인하여 저분자량 물질들의 투과 효율은 낮은 편이다. 분자량 500 Da 이상의 단백질, 펩티드 및 핵산과 같은 거대 분자들은 큰 분자량 때문에 이중 지질막 구조로 되어 있는 세포막 안으로 더욱더 투과하기 어렵다. 이러한 저분자 및 거대 분자들이 세포의 원형질막을 통과하는 효율을 증폭시키기 위한 방법으로서, 최근 관심이 고조되고 있는 것이 피부를 통한 투여 방법(Transdermal drug delivery, TDD)이다. 그러나 피부를 통한 투여 방법의 가장 큰 장벽은 각질층 내의 각질형성세포와 이들 사이의 각질세포간 지질이다. 대부분의 피부에서 생리학적으로 활성을 나타내는 분자(이하, 피부 생리 활성 분자)들은 피부 각질층의 저항성 때문에 경피 투과율이 낮아지게 된다.

이러한 피부 생리 활성 분자의 피부 투과율을 촉진시킬 수 있는 다양한 방법들이 연구되어 왔는데, 최근 세포 투과성 펩티드를 이용한 전달 시스템에 많은 관심이 집중되고 있다. 세포 투과 펩티드(Cell Penetrating Peptides: CPP)는 약 10-60개 정도의 짧은 펩티드로 이루어진 세포막 투과성 펩티드로 대부분 단백질-투과 도메인(protein-transduction domain)이나 막-이동 시퀀스(membrane-translocating sequence)로부터 유도된다. 외부 물질의 일반적인 세포 내 유입 경로와는 달리 CPP는 세포막을 손상시키지 않으면서 세포 내로 이동하고, 세포막을 통과하지 못하는 것으로 알려져 있는 DNA나 단백질까지도 세포 내로 전달시킬 수 있다고 알려져 있다.

본 발명자들은 HIV(human immunodeficiency virus)의 뉴클레오캡시드 단백질(nucleocapsid) 유래 펩티드가 피부 생리 활성 분자의 세포 투과성을 높일 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

1. 대한민국 공개특허 제10-2017-0002475호

본 발명의 목적은 피부 생리 활성 분자인 보툴리눔 독소, 상피세포성장인자 또는 헥사펩티드와 결합된 세포 투과 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 융합 단백질, 또는 피부 생리 활성 분자인 상피세포성장인자 및 세포 투과 펩티드 혼합물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물과 주름 개선, 근육 경직 완화 또는 상처 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 일 양상은

피부 생리 활성 분자; 및

서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 세포 투과 펩티드를 포함하고,

상기 피부 생리 활성 분자는 서열번호 4 내지 6으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 기재되는 폴리펩티드인 것인 융합 단백질을 제공한다.

본 명세서에 사용된 용어, '세포 투과 펩티드(Cell Penetrating Peptides: CPP)'는 약 10개 내지 60개 정도의 짧은 펩티드로 이루어진 세포막 투과성 펩티드로 세포막을 손상시키지 않으면서 세포 내로 이동하고, 세포막을 통과하지 못하는 DNA나 단백질까지 세포 내로 전달할 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어, '융합 단백질(conjugate)'는 세포 투과 펩티드와 생물학적 또는 약제학적으로 활성을 가지는 물질이 화학적 물리적 공유 또는 비공유 결합으로 연결된 물질을 의미한다.

본 발명의 일 구체예에서, 세포 투과 펩티드에 결합되어 융합 단백질이 될 수 있는 '생물학적 또는 약제학적 활성을 갖는 물질'이란 생체 내의 생리현상을 조절할 수 있는 물질을 의미하는 것으로, DNA, RNA, 단백질, 펩타이드, 지방, 탄수화물 및 화합물(chemical compound), 또는 형광표지물질 등을 포함한다. 예를 들어, 단백질로는 피부 생리 활성 분자인 보툴리눔 독소(서열번호 4), 상피세포성장인자(서열번호 5) 또는 헥사펩티드(서열번호 6)를 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 융합 단백질은 서열번호 7 내지 12로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 양상은 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 명세서에 사용된 용어, '폴리뉴클레오티드(polynucleotide)'는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 (deoxyribonucleotide) 또는 리보뉴클레오티드(ribonucleotide)의 중합체이다. RNA 게놈 서열, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 천연의 폴리뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 뿐만아니라, 그 서열에 상보적인(complementary) 서열도 포함한다. 상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열도 포함하다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 변형될 수 있으며, 변형은 뉴클레오티드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 19 내지 24로 이루어진 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 양상은 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 명세서에 사용된 용어, '벡터(vector)'는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예를 들면, CMV, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

상기 재조합 벡터는 상기 폴리뉴클레오티드 서열과 폴리뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된(operatively linked) 프로모터를 포함할 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어, '작동적으로 연결된'은 뉴클레오티드 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 재조합 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET 등), 파지 (예: λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

상기 재조합 벡터는 세포 투과 펩티드와 피부 생리 활성 분자 융합 단백질의 정제를 용이하게 하는 태그(tag) 서열, 예를 들어, 연속된 히스티딘 코돈, 말토우즈 바인딩 단백질 코돈 및 Myc 코돈 등을 포함할 수 있고, 융합 단백질의 가용성(solubility)을 증가시키기 위한 융합파트너(partner) 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한 융합 단백질 발현시 불필요한 부분을 제거하기 위하여 효소에 의해 특이적으로 절단되는 서열, 발현 조절 서열 및 세포 내 전달을 확인하기 위한 마커(marker) 또는 리포터 유전자 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 양상은 상기 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포, 즉, 상기 재조합 벡터에 의해 형질전환된 세포를 제공한다.

상기 재조합 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있다. 원핵세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776 및 E. coli W3110 등이 있다. 진핵세포에 형질전환시키는 경우 숙주세포로, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, SP2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주 등이 이용될 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주세포 내로의 운반은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주세포가 원핵세포인 경우, CaCl₂ 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

상기 형질전환된 숙주세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당해 기술 분야에 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양상은 상기 숙주세포를 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 배양 배지로부터 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 융합 단백질의 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 세포 배양은 대규모 세포 배양일 수 있으며, 세포 배양 방법은 통상적으로 사용되는 세포 배양법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 세포 배양 방법은 이로 한정되는 것은 아니지만, 회분 배양법 (batch culture), 반복 회분 배양법(repeated batch culture), 유가 배양법(fed-batch culture), 반복 유가 배양법(repeated fed-batch culture), 연속 배양법 (continuous culture) 및 관류 배양법(perfusion culture)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 배양 배지로부터 융합 단백질을 회수하는 단계는 당해 기술 분야에 공지된 다양한 분리 및 정제방법을 통해 수행할 수 있다. 통상적으로 세포 조각(cell debris), 배양 불순물 등을 제거하기 위하여 세포 용해물을 원심분리한 후, 침전, 예를 들어, 염석(황산암모늄 침전 및 인산나트륨 침전), 용매 침전(아세톤, 에탄올, 이소프로필 알콜 등을 이용한 단백질 분획 침전) 등을 수행할 수 있고, 투석, 전기영동 및 각종 컬럼 크로마토그래피 등을 수행할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양상은 상기 융합 단백질; 또는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과 펩티드 및 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 피부 개선 용도는 주름 개선, 피부 재생, 피부 탄력 개선, 피부 노화 방지 등의 용도를 포함할 수 있다.

상피세포성장인자(서열번호 5) 및 세포 투과 펩티드, 예를 들어, 서열번호 1(ACP) 또는 서열번호 2(ACP2)의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과 펩티드는 융합 단백질이 아닌 혼합물 형태로 사용되더라도 피부침투 활성이 우수하므로, 융합단백질 형태가 아닌 혼합물 형태로 화장료 조성물로써 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 화장료 조성물은 에멀젼, 크림, 에센스, 스킨, 리포솜, 마이크로캡슐, 복합 입자, 샴푸 및 린스로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형으로 제조될 수 있다. 또한, 상기 융합 단백질, 또는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과 펩티드 및 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드는 피부 각질층을 투과할 수 있으므로 상기 화장료 조성물은 경피성인 것이 가장 바람직하다.

상기 화장료 조성물은 융합 단백질, 또는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과 펩티드 및 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 이외에 추가적으로 항미생물제(antimicrobial), 보습제 및 수화제(hydration agent), 보존제, 유화제, 천연 오일 또는 합성 오일, 용매, 계면활성제, 세정제(detergent), 겔화제(gelling agent), 연화제(emollient), 항산화제, 향료, 충진제, 증점제(thickener), 왁스, 냄새 흡수제, 염료(dyestuff), 착색제, 분말, 점도-조절제(viscosity-controlling agent) 및 물을 포함할 수 있고, 선택적으로, 식물 추출물(botanical extract), 컨디셔닝제(conditioning agent), 흑화제 또는 미백제(darkening or lightening agent), 글리터(glitter), 습윤제(humectant), 미네랄, 폴리페놀, 실리콘 또는 그의 유도체, 일광 차단제(sunblock), 비타민, 및 약용식물(phytomedicinal)을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양상은 상기 융합 단백질; 또는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과 펩티드 및 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 주름 개선, 근육 경직 완화 또는 피부 상처 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 명세서에 사용된 용어, '피부 상처(skin wound)'란 물리적 원인 등에 의하여 피부 조직에 손상이 발생한 상태를 의미하며, 표피, 진피 또는 피하조직의 결손을 포함한다. 피부 상처의 치료는 피부를 손상 이전의 상태로 회복시키는 것을 의미하며, 피부 상처의 경감, 완화 및 증상의 개선을 포함한다.

상피세포성장인자(서열번호 5) 및 세포 투과 펩티드, 예를 들어, 서열번호 1(ACP) 또는 서열번호 2(ACP2)의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과 펩티드는 융합 단백질이 아닌 혼합물 형태로 사용되더라도 피부침투 활성이 우수하므로, 융합단백질 형태가 아닌 혼합물 형태로 주름 개선, 근육 경직 완화 또는 피부 상처 치료용 약학적 조성물로써 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상기 융합 단백질; 또는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과 펩티드 및 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 이외에 필요에 따라 약학적 조성물에 있어서 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.

이러한 약학적으로 허용되는 담체는 약품 제조 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 또한 첨가제로서 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

상기 담체는 본 발명의 약학적 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1 중량% 내지 약 99.99 중량%, 바람직하게는 약 90 중량% 내지 약 99.99 중량%로 포함될 수 있으며, 상기 첨가제는 약 0.1 중량% 내지 약 20 중량%로 포함될 수 있다.

한편, 본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으나, 국소 투여 방식으로 피부에 직접 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엘렉시르제, 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 경고, 도고제, 로션, 연고 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 1일 투여량이 통상 0.001 ~ 150 ㎎/㎏ 체중 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니된다.

피부 조직 및 세포 투과성 펩티드와 결합된 보툴리눔 독소, 상피세포성장인자 또는 헥사펩티드 융합 단백질, 또는 세포 투과성 펩티드 및 상피세포성장인자 혼합물은 단독 단백질보다 피부 조직 및 세포 투과성이 증가되어 있으므로 피부 개선 및 상처 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 보툴리눔 독소(botulinum toxin, BTLC) 및 세포 투과 펩티드-보툴리눔 독소 융합 단백질(activated cell penetrating peptide-botulinum toxin, ACP-BTLC)의 세포막 투과 활성을 HeLa 세포(A), U87-MG 세포(B) 및 PC-12 세포(C)에서 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 ACP2-BTLC의 세포막 투과 활성을 HeLa 세포(A), U87-MG 세포(B) 및 PC-12 세포(C)에서 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 세포 투과 펩티드와 보툴리눔 독소의 결합 유형에 따른 세포막 투과 활성을 HeLa 세포에서 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 BTLC 및 ACP-BTLC의 마우스 피부 조직 투과 효능을 농도 의존적으로 확인한 결과를 나타낸다: 도 4의 A는 His 항체로 염색한 결과이고, B는 Botox 항체로 염색한 결과이다.
도 5는 ACP-BTLC, BTLC-ACP, ACP2-BTLC, ACP1-BTLC 및 BTLC의 SNAP25 절단(cleavage) 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 동일 용량의 BTLC, ACP-BTLC, ACP2-BTLC 및 ACP1-BTLC 발현 벡터를 형질 주입하여 SNAP25 절단(cleavage) 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 ACP-BTLC, BTLC-ACP, ACP2-BTLC, ACP1-BTLC 및 BTLC의 세포막 투과 후 SNAP25 절단(cleavage) 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 FITC-ACP2 및 FITC-ACP2-EGF(epidermal growth factor)의 세포막 투과 활성을 HeLa 세포에서 확인한 결과를 나타낸다.
도 9은 FITC-ACP2-EGF의 마우스 피부 조직 투과 효능을 농도 의존적으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 10는 A431 세포에서 ACP2-EGF의 세포 이동성 증가 효능을 확인한 결과를 나타낸다.
도 11은 FITC-헥사펩티드(hexapeptide) 및 FITC-ACP2-헥사펩티드의 세포막 투과 활성을 HeLa 세포에서 농도 의존적으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 12은 FITC-헥사펩티드 및 FITC-ACP2-헥사펩티드의 마우스 피부 조직 투과 효능을 농도 의존적으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 13은 FITC-EGF 및 FITC-EGF + ACP 펩티드의 세포막 투과 활성을 HeLa 세포에서 확인한 결과를 나타낸다.
도 14는 FITC-EGF 및 FITC-EGF + ACP 펩티드의 마우스 피부 조직 투과 효능을 농도 의존적으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 15는 FITC-EGF, FITC-EGF + ACP 및 FITC-EGF + Transkin 펩티드의 미니피그 피부 조직 투과 효능을 농도 의존적으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 16은 A431 세포에서 ACP + EGF (혼합)의 세포 이동성 증가 효능을 확인한 결과를 나타낸다. A는 ACP와 EGF의 혼합, B는 ACP2와 EGF의 혼합 결과를 나타낸다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 세포 투과 펩티드-보툴리눔 독소 융합 단백질 제작

세포 투과 펩티드는 각각 ACP(activated cell penetrating peptide: 서열번호 1), ACP2(서열번호 2) 및 ACP1(서열번호 3)를 사용하였다.

1-1. ACP-BTLC 발현용 재조합 벡터(recombinant vector) 제작

ACP 유전자 서열(서열번호 13)의 N-말단에 제한효소(New England Biolabs, NEB; 미국)인 NcoI, C-말단에 HindⅢ가 작용할 수 있는 제한효소 인식서열(recognition sequence)을 추가하기 위하여 제한효소 인식서열을 포함하는 프라이머(primer)로 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, 이하 PCR로 기재함)을 수행하였다. PCR에 사용한 프라이머 서열과 PCR 조건을 표 1 및 표 2에 기재하였다.

프라이머	서열번호	서열
Forward (from ACP-NcoI)	25	CCATGGGCCAGCGGGGAAACCAGC
Reverse (from ACP-HindⅢ)	26	AAGCTTGTTAAGTTTGCCTGTCTCTCTGTGC

PCR 반응물		PCR 사이클
dH₂O	37.5 ㎕	95℃	2분
dNTP (10X)	4 ㎕	95℃	1분	30회
F primer (10 μM)	1 ㎕	55℃	30초
R primer (10 μM)	1 ㎕	74℃	4분
ACP 펩티드 유전자	1 ㎕	74℃	5분
DNA Taq polymerase	0.5 ㎕	4℃	무한대
buffer	5 ㎕
total	50 ㎕

이후 pET28a 벡터(Novagen, 미국)를 NcoI 및 HindⅢ 제한효소로 37℃에서 2시간 절단하고, PCR Purification Kit(Qiagen, 미국)로 제조사의 프로토콜에 따라 벡터 단편을 분리하였다. 분리한 pET28a 벡터 단편과 1-1의 PCR 산물을 결합(라이게이션, ligation)시킨 후 PCR Purification Kit로 재조합 벡터를 분리하고, ACP 유전자가 삽입된 재조합 벡터를 pET28a ACP로 명명하였다. pET28a ACP 벡터 제작을 위한 결합 반응 조건을 표 3에 기재하였다.

dH₂O	5.5 ㎕
T4 DNA Ligase buffer (10X)	1 ㎕
ACP DNA (50 ng/㎕)	0.5 ㎕
pET28a 벡터 (50 ng/㎕)	2 ㎕
T4 DNA Ligase (400 units/㎕)	1 ㎕
total	10 ㎕

다음으로, 상기와 동일한 방법으로 보툴리눔 독소(botulinum toxin, 이하 BTLC로 기재함) 유전자(서열번호 16)의 N-말단에 HindⅢ, C-말단에 XhoⅠ이 작용할 수 있는 제한효소 인식서열을 추가하였다. BTLC 유전자 증폭에 사용한 프라이머 서열을 표 4에 기재하였다.

프라이머	서열번호	서열
Forward (from BTLC-HindⅢ)	27	AAGCTTCCGTTCGTTAACAAACAGTTCAACTACAAAGA
Reverse (from BTLC-XhoⅠ)	28	CTCGAGTCATTTGTTGTAGCCTTTGTCCAGGGATTT

pET28a ACP 벡터를 HindⅢ 및 XhoⅠ 제한효소로 절단한 후 PCR Purification Kit를 이용하여 벡터 단편을 분리하였다. 상기 분리한 pET28a ACP 벡터 단편과 BTLC 유전자를 결합시킨 후 PCR purification Kit로 재조한 벡터를 분리하고, ACP-BTLC 유전자가 삽입된 재조합 벡터를 pET28a ACP-BTLC로 명명하였다. pET28a ACP 벡터 단편과 BTLC 유전자의 결합 반응은 pET28a ACP 벡터와 BLTC 유전자를 사용하는 것을 제외하고 표 3와 동일하게 진행하였다. 재조합 단백질 발현 확인을 위한 His 태그(tag)는 ACP-BTLC 단백질의 C-말단에 결합시켰다.

대장균 DH5α에 pET28a ACP-BTLC 벡터를 형질전환시키고, LB 액체배지에서 OD 값이 0.5 내지 0.6이 될 때까지 37℃에서 진탕 배양(shake culture)하였다. 배양이 끝난 후 배양액을 원심분리하여 대장균 펠렛(pellet)을 수거하고, Plasmid extraction miniprep kit(intron, 한국)로 pET28a ACP-BTLC 벡터를 분리하였다. 분리한 pET28a ACP-BTLC 벡터의 농도는 UV 분광광도 방법으로 측정하였다.

1-2. ACP2-BTLC, ACP1-BTLC, BTLC-ACP 발현용 재조합 벡터 제작

ACP2 또는 ACP1과 BTLC의 융합 단백질, C-말단에 ACP가 결합된 BTLC 융합 단백질(BLTC-ACP) 발현용 재조합 벡터를 제작하였다.

ACP2 또는 ACP1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 14 또는 15)의 N-말단에 NdeI, C-말단에 HindⅢ, ACP1 유전자의 N-말단에 HindⅢ, C-말단에 XhoⅠ이 작용할 수 있는 제한효소 인식서열을 추가하기 위하여 표 2의 조건으로 PCR을 수행하였다. PCR에 사용한 프라이머 서열을 표 5에 기재하였다.

프라이머	서열번호	서열
Forward (from ACP2-NdeI)	29	CATATGAAGTGCTTCAATTGCGGAAAGGAG
Reverse (from ACP2-HindⅢ)	30	AAGCTTGCCTTTCTTTCTGGGGGC
Reverse (from ACP1-HindⅢ)	31	AAGCTTCTCTGTGCAGTCCTTCATCTGG
Forward (from ACP-HindⅢ)	32	AAGCTTCAGCGGGGAAAC
Reverse (from ACP-XhoI)	33	CTCGAGTAAGTTTGCCTG

이후 pET28a 벡터를 NdeI과 HindⅢ 또는 HindⅢ와 XhoⅠ로 절단하여 분리하였다. 표 3의 조건으로 분리한 pET28a 벡터 단편과 제한효소 인식 서열을 추가한 ACP2, ACP1 및 ACP 유전자를 각각 결합시킨 후 PCR Purification Kit로 재조합 벡터를 분리하였다. ACP2, ACP1 및 ACP 유전자가 삽입된 재조합 벡터를 각각 pET28a ACP2, pET28a ACP1 및 pET28a ACP(C-말단)로 명명하였다.

다음으로, BTLC 유전자의 N-말단에 HindⅢ, C-말단에 XhoⅠ 또는 N-말단에 NcoⅠ, C-말단에 HindⅢ가 작용할 수 있는 제한효소 인식서열을 추가하기 위하여 표 2와 동일한 조건으로 PCR을 진행하였다. 프라이머는 표 4 및 표 6에 기재한 프라이머를 사용하였다.

프라이머	서열번호	서열
Forward (from BTLC-NcoⅠ)	34	CCATGGGCCCGTTCGTTAACAAACAGTTCAACTACAAAGA
Reverse (from BTLC-HindⅢ)	35	AAGCTTTTTGTTGTAGCCTTTGTCCAGGGATTT

pET28a ACP2, pET28a ACP1 벡터를 HindⅢ 및 XhoⅠ으로 절단하고, pET28a ACP1(C-말단) 벡터는 NcoⅠ과 HindⅢ로 절단하여 벡터 단편을 분리하였다. 분리한 pET28a ACP2, pET28a ACP1 및 pET28a ACP(C-말단) 벡터 단편과 BTLC 유전자를 결합시키고, PCR purification Kit로 재조합 벡터를 분리하였다. ACP2-BTLC, ACP1-BTLC 및 BTLC-ACP 유전자가 삽입된 재조합 벡터를 각각 pET28a ACP2-BTLC, pET28a ACP1-BTLC 및 pET28a BTLC-ACP로 명명하였다. pET28a ACP2, pET28a ACP1 및 pET28a ACP(C-말단) 벡터 단편과 BTLC 유전자의 결합 반응은 벡터 및 BLTC 유전자를 제외하고 표 3와 동일하게 진행하였다. 재조합 단백질 발현 확인을 위한 His 태그는 발현 단백질의 N-말단에 결합시켰다.

1-3. BTLC 발현용 재조합 벡터

BTLC 유전자의 N-말단에 NcoⅠ, C-말단에 XhoⅠ이 작용할 수 있는 제한효소 인식서열을 추가하기 위하여 표 2와 동일한 조건으로 PCR을 진행하였다. 프라이머는 표 6에 기재한 서열번호 34 및 표 7에 기재된 프라이머를 사용하였다.

프라이머	서열번호	서열
Reverse (from BTLC-XhoⅠ)	36	CTCGAGTTTGTTGTAGCCTTTGTCCAGGGATTT

pET28a 벡터를 NcoⅠ 및 XhoⅠ제한효소로 절단한 후 분리하고, 표 3의 조건으로 pET28a 벡터 단편과 BTLC 유전자를 결합시켰다. PCR purification Kit로 재조합 벡터를 분리하고, BTLC 유전자가 삽입된 재조합 벡터를 pET28a BTLC로 명명하였다.

1-4. 세포 투과 펩티드-보툴리눔 독소 융합 단백질의 발현 확인

BL21(DE3)(Thermo Fisher, 미국)에 pET28a ACP-BTLC, pET28a ACP2-BTLC, pET28a ACP1-BTLC, pET28a BTLC-ACP 및 pET28a BTLC 벡터를 각각 형질전환시킨 후 LB(Luria-Bertani) 플레이트에 도말하여 37℃에서 12시간 동안 배양하였다. 12시간 후 형성된 콜로니(colony)를 LB 액체배지에 접종하여 37℃에서 추가로 전배양하였다. 약 12시간 후 OD 값이 0.5 내지 0.6에 도달한 전배양액 250 ㎕를 LB 액체배지 250 ㎖에 접종하고, OD 값이 0.6 내지 0.8이 되도록 37℃에서 3시간 내지 4시간 동안 배양하였다. 배양액의 OD 값이 0.6 내지 0.8이 되었을 때 배양액에 IPTG(Isopropyl β-D-thiogalactoside) 0.25 mM을 첨가하여 16℃에서 18시간 동안 배양하였다. 18시간 후 배양액을 원심분리하여 BL21 펠렛을 수득하고, 수득한 펠렛을 용해 버퍼(20 mM Tris, 300 mM NaCl, 5 mM imidazole 및 pH 8.0)에 현탁시킨 후 초음파 파쇄기로 대장균을 파쇄(amplitude 35%)하였다.

대장균 파쇄물을 원심분리하여 상층액을 회수하고, 0.45 ㎛ 필터를 사용하여 상층액을 튜브에 충전시켰다. 튜브에 충전된 상층액을 Ni-NTA(nitrilotriacetic acid) 레진(resin)이 충진된 컬럼에 넣어 단백질과 레진을 서로 결합시켰다. 레진에 결합하지 않는 외래 단백질을 제거하기 위하여 세척 버퍼(20 mM Tris, 300 mM NaCl, 30 mM imidazole 및 pH 8.0)를 첨가하여 레진을 세척하였다. 이후 이미다졸(imidazole)이 첨가된 버퍼(20 mM Tris, 300 mM NaCl, 400 mM 이미다졸 및 pH 8.0)를 이용한 이동상 기울기(gradient mobile phase)로 단백질을 용출시켰다. 외래 단백질을 추가적으로 제거하고, 이미다졸을 제거하기 위하여 수득한 단백질로 크기 배제 크로마토그래피(Size exclusion chromatography)를 수행하였다. 크로마토그래피에는 세척 버퍼(25 mM HEPES, 100mM NaCl, 2mM DTT 및 pH 7.4)를 사용하였다. 정제한 단백질은 브래드포드 방법(Bradford assay)으로 농도를 측정하였다.

1-5. 동물세포 발현용 재조합 벡터 제작.

1-2에서 제작된 pET28a BTLC, pET28a ACP-BTLC, pET28a ACP1-BTLC 및 pET28a ACP2-BTLC 벡터를 NcoI과 XhoI으로 절단하고, pTriEx 벡터를 동일한 제한효소로 절단하여 분리하였다. 표 3의 조건으로 두 단편을 각각 결합한 후, 각 벡터를 pTriEx BTLC, pTriEx ACP-BTLC, pTriEx ACP1-BTLC 및 pTriEx ACP2-BTLC로 명명하였다.

실시예 2: 세포 투과 펩티드와 보툴리눔 독소 융합 단백질의 특성 확인

2-1. 세포 투과성 확인

HeLa 세포는 10% FBS(fetal bovine serum) 및 100 U/㎖ 페니실린/스트렙토마이신이 추가된 DMEM 배지에서 배양하고, U87-MG 및 PC-12 세포는 10% FBS 및 100 U/㎖ 페니실린/스트렙토마이신이 추가된 RPMI-1640 배지(Hyclone, 미국)에서 배양하였다. 모든 세포는 37℃, 5% CO₂의 가습 항온기에서 배양하였다.

배양한 각각의 세포를 글라스가 들어 있는 12웰 플레이트에 1x10⁵ 세포/웰(well)의 밀도로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 이후, 실시예 1-4에서 정제한 BTLC, ACP-BTLC, ACP1-BTLC 및 ACP2-BTLC를 각각 세포에 3시간 동안 처리한 후 세포를 PBS로 3회 세척하였다. 세척한 세포를 3.7% 포름알데하이드로 20분 동안 고정시키고, 0.2% 트리톤 X-100(Triton X-100)이 포함된 PBS를 처리하여 세포막 투과성을 증가시켰다. 다음으로 세포에 3% BSA를 처리하여 1시간 동안 블로킹(blocking)시키고, His 항체(abcam, ab9108)와 상온에서 2시간 반응시킨 후 PBS로 3회 세척하였다. 세척 후 Alexa 488 및 Alexa 568 2차 항체(Santa Cruz Biotechnology)를 처리하여 상온에서 1시간 동안 반응시키고, PBS로 2회 세척한 후 DAPI(4', 6-diamidino-2-phenylindol)로 10분 동안 염색하였다. 세포가 부착된 글라스를 떼어내어 슬라이드 글라스 위에 올려놓고, 공초점 레이저 주사현미경(confocal laser scanning microscopy; LSM 700, Zeiss, 독일)으로 관찰하였다.

그 결과, 도 1의 A 내지 C에 나타난 바와 같이 BTLC 단독으로는 HeLa, U87-MG 및 PC-12세포를 거의 투과하지 못하지만, ACP-BTLC는 세포 투과성이 현저하게 우수한 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 2의 A 내지 C에 나타난 바와 같이 ACP2-BTLC 또한 모든 세포에서 대조군보다 세포 투과성이 현저히 우수한 것을 알 수 있었다. 도 3에서는 BTLC 단독보다 ACP-BTLC, ACP1-BTLC 및 ACP2-BTLC의 세포 투과성이 우수한 것을 확인할 수 있었다. 도 3에서 비교군으로 사용한 botox는 상업적으로 판매되는 제품인 Onabotulinum toxin A(Allergen, 미국)이다.

2-2. 마우스 피부 조직 투과 여부 확인

6웰 플레이트에 거즈(gauze)를 깔고, RPMI 배지를 3 ㎖씩 넣어 주었다. 무모 마우스(㈜오리엔트 바이오: 대한민국)로부터 분리한 0.5 ㎝ x 0.5 ㎝ 크기의 피부 조직을 거즈 위에 살며시 올려 놓고, 마우스 피부 조직 위에 와트만 페이퍼(Whatman paper)를 올려 놓았다. 이후 BTLC 또는 ACP-BTLC를 농도별로 와트만 페이퍼에 처리하고, 12시간 동안 반응시켰다. 마우스 피부 조직을 4% 파라포름알데히드로 1시간 동안 고정하고, 피부 조직이 가라앉을 때까지 30% 수크로스(sucrose)에 담가 두었다. OCT 컴파운드(OCT compound: Leica, 독일)로 피부 조직을 냉동하고, 냉동 절편기로 피부 조직 절편 슬라이드를 제작하였다. 슬라이드를 His 항체 및 BTLC 항체로 염색하고, DAPI로 10분 동안 염색한 후 공초점 레이저 주사현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 도 4의 A 및 B에 나타난 바와 같이 BTLC를 처리한 경우 피부 조직의 표면에서만 형광 신호가 약하게 관찰되어 피부 조직에 거의 침투하지 못한 것을 알 수 있었다. 반면, ACP1-BTLC를 처리한 경우 피부 조직의 진피층에서까지 형광 신호가 강하게 나타나 피부 조직에 깊숙이 침투한 것을 확인할 수 있었다.

2-3. SNAP25 단백질 절단 여부 확인

SNAP25(Synaptosomal-associated protein 25)는 스내어 복합체(SNARE complex)의 구성요소 중 하나이며, 스내어 복합체는 아세틸콜린 신호 전달에 관여하여 근육을 움직이게 한다. BLTC는 신경 말단의 내부에 유입된 후 SNAP25를 절단함으로써 근육의 움직임을 차단하는 것으로 알려져 있다. 따라서 세포 투과 펩티드-보툴리눔 독소 융합 단백질이 SNAP25를 절단하는지 확인하였다.

SNAP25(Novus biologicals, 미국) 1 ㎍과 BTLC, ACP-BTLC, ACP1-BTLC 및 ACP2-BTLC를 농도별로 1.5 ㎖ 마이크로 튜브에 넣고, 샘플의 최종 부피가 30 ㎕가 되도록 반응 버퍼(50 mM HEPES(pH 7.4), 5 mM DTT 및 250 μM ZACPl₂)를 첨가 하였다. 이후 37℃에서 24시간 동안 반응시키고, SDS 샘플 버퍼(50 mM Tris-HCl(pH 6.8), 2% SDS(sodium dodecylsulfate), 10% 글리세롤, 1% β-mercaptoethanol, 12.5 mM EDTA 및 0.02% bromophenol blue)를 첨가하여 반응을 종결시켰다. SNAP25의 절단(cleavage) 여부는 웨스턴 블롯으로 확인하였다.

확인 결과, 도 5의 A에 나타난 바와 같이 ACP-BTLC 또는 BTLC-ACP에 의하여 SNAP25(28 kDa)가 절단되는 것을 알 수 있었다. 또한, 도 5의 B 및 C에 나타난 바와 같이 ACP2-BTLC, BTLC 및 ACP1-BTLC도 SNAP25를 절단하는 것을 확인할 수 있었다.

2-4. 형질주입 방법을 통한 SNAP25 절단 여부 확인

세포 투과 펩티드-보툴리눔 독소 융합 단백질이 SNAP25를 절단하는지를 형질주입 방법을 통하여 확인하였다.

구체적으로, 2-1과 동일한 방법으로 배양한 PC-12 세포를 6웰 플레이트에 3x10⁵ 세포/웰(well)의 밀도로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 제조사의 프로토콜에 따라 METAFECTENE PRO reagent(Biontex, 독일)를 사용하여 pTriEx BTLC, pTriEx ACP-BTLC, pTriEX ACP1-BTLC 및 pTriEx ACP2-BTLC의 재조합 벡터 DNA 3 ㎍을 각각 상기 세포에 형질주입(transfection)하였다. 이후, 24시간 동안 추가로 배양하였다.

배양한 세포를 PBS로 세척하고, 스크레이퍼(scraper)로 세포를 플레이트에서 분리하였다. 분리한 세포에 RIPA 버퍼(10 mM Tris-Cl(pH 8.0), 1 mM EDTA, 0.5 mM EGTA, 1% Triton X-100, 0.1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 140 mM NaCl 및 1 mM PMSF)를 첨가하여 세포를 용해시키고, 얼음에 20분 동안 방치하였다. 이후 4℃에서 원심분리(14,000 rpm, 20분)하여 세포 잔해를 제거하고, 세포 용해물(cell lysate)인 상등액만 회수하였다. 분리된 세포 용해물의 단백질 농도를 Quick Start^TM Bradford 1x Dye Reagent(Bio-Rad, 미국)로 측정하고, 단백질 20 ㎍을 10% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 분리하였다. 분리된 단백질을 PVDF 막(polyvinylidene difluoride membrane)으로 이동시킨 후, PVDF 막을 5% 탈지 우유(skim milk)로 블로킹(blocking)하였다. PVDF 막을 일차 항체(ACP, His 및 Actin 항체)와 4℃에서 16시간 반응시킨 후 세척하고, 이차 항체를 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, ECL(Pierce^TM ECL Western Blotting Substrate(Thermo Scientific^TM, 미국)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 단백질 밴드를 검출하였다. 단백질 밴드의 검출을 위하여 Amersham^TM Imager 600(GE Healthcare Life Science, 미국)을 사용하였다.

확인 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 BTLC, ACP-BTLC, ACP1-BTLC 및 ACP2-BTLC에 의하여 PC-12 세포에서 발현된 SNAP25(28 kDa)가 절단되는 것을 확인할 수 있었다.

본 실험 결과는 세포 투과 펩티드와 보툴리눔 독소의 융합 단백질이 보툴리눔 독소 자체의 활성을 유지함을 의미한다.

2-5. 세포 투과를 통한 SNAP25 절단 여부 확인

세포 투과 펩티드-보툴리눔 독소 융합 단백질이 세포 투과 후에도 SNAP25의 절단 활성을 유지하는지를 확인하였다.

구체적으로, 2-1과 동일한 방법으로 배양한 PC-12 세포를 6웰 플레이트에 3x10⁵ 세포/웰(well)의 밀도로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 이후, 실시예 1-4에서 정제한 BTLC, ACP-BTLC, BTLC-ACP, ACP1-BTLC 및 ACP2-BTLC를 각각 세포에 24시간 동안 처리한 후 PBS로 세척하였다. 2-4의 방법으로 세포에서 단백질을 회수한 후 농도를 Quick Start^TM Bradford 1x Dye Reagent(Bio-Rad, 미국)로 측정하였다. 단백질 20 ㎍을 10% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 분리하였다. 분리된 단백질을 2-4와 동일한 방법으로 PVDF 막(polyvinylidene difluoride membrane)으로 이동시켜 ECL(Pierce^TM ECL Western Blotting Substrate(Thermo Scientific^TM, 미국)을 사용하여 단백질 밴드를 검출하였다. 단백질 밴드의 검출을 위하여 Amersham^TM Imager 600(GE Healthcare Life Science, 미국)을 사용하였다.

확인 결과, 도 7에 나타난 바와 같이 BTLC, ACP-BTLC, BTLC-ACP, ACP1-BTLC 및 ACP2-BTLC가 PC-12 세포에서 발현된 SNAP25(28kDa)를 절단하는 것을 확인할 수 있었다.

본 실험 결과는 세포 투과 펩티드와 보툴리눔 독소의 융합 단백질이 세포 투과 후에도 보툴리눔 독소 자체의 활성을 유지함을 의미한다.

실시예 3: 세포 투과 펩티드와 상피세포성장인자(epidermal growth factor, EGF) 융합 단백질의 특성 확인

3-1. 상피세포성장인자 합성

상피세포성장인자는 Chempeptide(상하이, 중국)에서 FMOC 고체-상 방법(FMOC solid-phase method)으로 합성하였다. 합성된 펩티드는 C18 분석용 RP 컬럼 (Shiseido capcell pak)을 사용한 역상 고속액체크로마토그래피(reverse-phase HPLC, HPLC-20AP, 일본)로 정제 및 분석하였으며, 질량분석기(SHIMADZU LCMS-2010EV, 일본)를 이용하여 동정하였다.

세포 투과 펩티드로 사용한 ACP2는 상피세포성장인자의 N-말단에 결합하여 사용하였다.

3-2. 세포 투과성 확인

실시예 2-1과 동일한 방법으로 FITC-ACP2 또는 FITC-ACP2-EGF를 농도별로 HeLa 세포에 처리하고, 세포를 고정시킨 후 Cy3 2차 항체와 반응시켰다. HeLa 세포가 부착된 글라스를 떼어내어 슬라이드 글라스 위에 올려 놓고, 공초점 레이저 주사현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이 처리 농도에 비례하여 FITC-ACP2-EGF가 세포막을 투과하여 세포 내로 유입되는 것을 확인할 수 있었다.

3-3. 마우스 피부 조직 투과 여부 확인

실시예 2-2와 동일한 방법으로 마우스 피부 조직에 EGF(대조군) 또는 FITC-ACP2-EGF를 처리한 후 투과 여부를 공초점 레이저 주사현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이 대조군에서는 형광 신호를 확인할 수 없어 EGF 단독 단백질은 피부 조직에 거의 침투하지 못한 것을 알 수 있었다. 반면, FITC-ACP2-EGF를 처리한 경우 농도의존적으로 피부 조직의 진피층에서까지 형광 신호가 강하게 나타나 피부 조직에 깊숙이 침투한 것을 확인할 수 있었다.

3-3. 세포 이동성 증가 여부 확인

A431 세포를 10% FBS 및 100 U/㎖ 페니실린/스트렙토마이신이 추가된 RPMI-1640 배지(Hyclone, 미국)에서 배양하였다. 배양한 A431 세포를 1x10⁵ 세포/웰의 밀도로 글라스가 들어있는 24-웰 플레이트에 분주한 후 24시간 동안 배양하였다. 팁을 사용하여 바닥에 단일층으로 붙어 있는(confluent monolayer) 세포를 긁은 후, 배양배지를 5% FBS 및 100 U/㎖ 페니실린/스트렙토마이신이 함유된 배지로 교체하였다. ACP2-EGF를 각각 1, 5, 10 및 100 nM 농도(11.132, 55.66, 111.32 및 1113.2 ng/㎖)로 처리하고, 양성 대조군(positive control)에는 재조합 인간 EGF(recombinant human EGF)를 50 ng/㎖ 처리하였다. 세포를 18시간 동안 추가로 배양한 후 현미경으로 세포의 이동성을 확인하였다.

확인 결과, 도 10에 나타난 바와 같이 ACP2-EGF를 1 nM(11.132 ng/㎖) 농도로 처리한 경우 양성 대조군(EGF 50 ng/㎖)과 유사한 수준의 세포 이동성이 나타나고, 5 nM(55.66 ng/㎖) 처리한 경우 양성 대조군보다 우수한 세포 이동성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 세포 투과 펩티드와 헥사펩티드 융합 단백질의 특성 확인

4-1. 헥사 펩티드의 합성

헥사 펩티드는 Chempeptide(상하이, 중국)에서 실시예 3-1과 동일한 방법으로 합성하여 분리 및 정제하였다. 세포 투과 펩티드로 사용한 ACP2는 헥사 펩티드의 N-말단에 결합하여 사용하였다.

4-2. 세포 투과성 확인

실시예 2-1과 동일한 방법으로 FITC-헥사펩티드(hexapeptide) 또는 FITC-ACP2-헥사펩티드를 농도별로 HeLa 세포에 처리하고, 세포를 고정시킨 후 Cy3 2차 항체와 반응시켰다. HeLa 세포가 부착된 글라스를 떼어내어 슬라이드 글라스 위에 올려 놓고, 공초점 레이저 주사현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이 FITC-헥사펩티드는 세포를 거의 투과하지 못하지만, FITC-ACP2-헥사펩티드를 처리한 경우 형광 신호가 강하게 나타나는 것을 확인하여 세포 투과성이 현저히 우수한 것을 알 수 있었다.

4-3. 마우스 피부 조직 투과 여부 확인

실시예 2-2와 동일한 방법으로 마우스 피부 조직에 FITC-헥사펩티드 또는 FITC-ACP2-헥사펩티드를 농도별로 처리한 후 투과 여부를 공초점 레이저 주사현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이 FITC-헥사펩티드는 피부 조직의 표면에서만 형광 신호가 약하게 관찰되어 피부 조직에 거의 침투하지 못한 것을 알 수 있었다. 반면, FITC-ACP2-헥사펩티드를 처리한 경우 피부 조직의 진피층에서까지 형광 신호가 강하게 나타나 피부 조직에 깊숙이 침투한 것을 확인할 수 있었다.

실시예 5: 세포 투과 펩티드와 상피세포성장인자 혼합물의 세포 투과 활성 확인

5-1. 세포 투과 펩티드와 상피세포성장인자 혼합물의 HeLa 세포 투과성 확인

HeLa 세포를 10% FBS(fetal bovine serum) 및 100 U/㎖ 페니실린/스트렙토마이신이 추가된 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO₂의 가습 항온기에서 배양하였다. 배양한 세포를 글라스가 들어 있는 12웰 플레이트에 1x10⁵ 세포/웰(well)의 밀도로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 이후, FITC-EGF와 ACP를 상온에서 30분 동안 혼합하고, 세포에 20시간 동안 처리한 후 세포를 PBS로 3회 세척하였다. 세척한 세포를 3.7% 포름알데하이드로 20분 동안 고정시키고, PBS로 2회 세척한 후 DAPI(4', 6-diamidino-2-phenylindol)로 10분 동안 염색하였다. 세포가 부착된 글라스를 떼어내어 슬라이드 글라스 위에 올려놓고, 공초점 레이저 주사현미경(confocal laser scanning microscopy; LSM 700, Zeiss, 독일)으로 관찰하였다.

그 결과, 단독 EGF에서는 세포 투과 활성이 나타나지 않았으나, EGF와 ACP의 혼합물에서는 세포 투과된 EGF를 확인할 수 있었다(도 13).

5-2. 세포 투과 펩티드와 상피세포성장인자 혼합물의 마우스 피부 조직 투과성 확인

6웰 플레이트에 거즈(gauze)를 깔고, RPMI 배지를 3 ㎖씩 넣어 주었다. 무모 마우스(㈜오리엔트 바이오: 대한민국)로부터 분리한 0.5 ㎝ x 0.5 ㎝ 크기의 피부 조직을 거즈 위에 살며시 올려 놓고, 마우스 피부 조직 위에 와트만 페이퍼(Whatman paper)를 올려 놓았다. 이후 FITC-EGF 또는 FITC-EGF와 ACP 혼합물을 농도별로 와트만 페이퍼에 처리하고, 12시간 동안 반응시켰다. 마우스 피부 조직을 4% 파라포름알데히드로 1시간 동안 고정하고, 피부 조직이 가라앉을 때까지 30% 수크로스(sucrose)에 담가 두었다. OCT 컴파운드(OCT compound: Leica, 독일)로 피부 조직을 냉동하고, 냉동 절편기로 피부 조직 절편 슬라이드를 제작하였다. 슬라이드를 DAPI로 10분 동안 염색한 후 공초점 레이저 주사현미경으로 관찰하였다.

그 결과, EGF 단독은 마우스의 피부조직을 투과하지 못하였으나, EGF와 ACP 혼합물에서는 ACP의 농도 의존적으로 EGF가 마우스의 피부조직을 투과한 것을 확인할 수 있었다(도 14).

5-3. 세포 투과 펩티드와 상피세포성장인자 혼합물의 미니피그 피부 조직 투과성 확인

Micropig Franz cell membrane (2.5 cm x 2.5 cm, 400 mm, H426-22, 메디키네틱스)을 각질층이 위로 향하게 하여 Franz cell 공여칸과 수용칸 사이에 고정한 후 수용칸에 생리식염수를 채워주었다. 이후 FITC-EGF, FITC-EGF와 ACP 혼합물, 또는 FITC-EGF와 Transkin 혼합물을 공여칸에 처리한 후 24 시간 동안 32℃에서 반응시켰다. 미니피그 피부 조직을 4% 파라포름알데히드로 1시간 동안 고정하고, 피부 조직이 가라앉을 때까지 30% 수크로스(sucrose)에 담가 두었다. OCT 컴파운드(OCT compound: Leica, 독일)로 피부 조직을 냉동하고, 냉동 절편기로 피부 조직 절편 슬라이드를 제작하였다. 슬라이드를 DAPI로 10분 동안 염색한 후 공초점 레이저 주사현미경으로 관찰하였다.

그 결과, EGF와 ACP 혼합물에서 피부 투과 활성을 확인하였으며, 동일한 농도 (100 ㎍)의 Transkin 혼합물과 비교하였을 때, ACP 혼합물에서는 피부 투과가 확인된 반면, Transkin 에서는 피부 투과가 확인되지 않아, ACP 혼합물이 현저한 피부 투과 효과를 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다(도 15).

5-4. In vitro wound healing assay에서, 세포 투과 펩티드와 상피세포성장인자 혼합물의 세포 이동성 증가 확인

A431 세포를 10% FBS 및 100 U/㎖ 페니실린/스트렙토마이신이 추가된 RPMI-1640 배지(Hyclone, 미국)에서 배양하였다. 배양한 A431 세포를 1x10⁵ 세포/웰의 밀도로 글라스가 들어있는 24-웰 플레이트에 분주한 후 24시간 동안 배양하였다. 팁을 사용하여 바닥에 단일층으로 붙어 있는(confluent monolayer) 세포를 긁은 후, 배양배지를 5% FBS 및 100 U/㎖ 페니실린/스트렙토마이신이 함유된 배지로 교체하였다. EGF 농도를 50ng으로 고정하고, ACP 또는 ACP2의 농도를 각각 5nM, 10nM, 30nM로 하여 EGF와 혼합하여 처리하고, 양성 대조군(positive control)에는 재조합 인간 EGF(recombinant human EGF)를 50 ng/㎖ 처리하였다. 그 후, 세포를 18시간 동안 추가로 배양한 후 현미경으로 세포의 이동성을 확인하였다.

그 결과, 재조합 인간 EGF와 ACP 또는 ACP2를 혼합하였을 때, 양성 대조군(EGF 50 ng/㎖) 대비 현저한 세포 이동성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(도 16).

이제까지 본 발명에 대하여 그 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Avixgen Incorporation <120> Fusion Protein Conjugated Cell Penetrating Peptide and Composition Comprising the Same <130> PN180155-P1 <160> 36 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 56 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACP amino acids <400> 1 Met Gly Gln Arg Gly Asn Phe Arg Asn Gln Arg Lys Thr Val Lys Cys 1 5 10 15 Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His Ile Ala Lys Asn Cys Arg Ala Pro 20 25 30 Arg Lys Lys Gly Cys Trp Arg Cys Gly Arg Glu Gly His Gln Met Lys 35 40 45 Asp Cys Thr Glu Arg Gln Ala Asn 50 55 <210> 2 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACP2 amino acids <400> 2 Met Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His Ile Ala Lys Asn Cys 1 5 10 15 Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly 20 <210> 3 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ACP1 amino acids <400> 3 Met Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His Ile Ala Lys Asn Cys 1 5 10 15 Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly Cys Trp Arg Cys Gly Arg Glu Gly His 20 25 30 Gln Met Lys Asp Cys Thr Glu 35 <210> 4 <211> 447 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Asn Cys Gly Lys Glu Gly His Thr Ala Arg Asn Cys 1 5 10 15 Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly Cys Trp Lys Cys Gly Lys Glu Gly His 20 25 30 Gln Met Lys Asp Cys Thr Glu Glu Glu Met Gln Arg Arg 35 40 45 <210> 13 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACP polynucleotides <400> 13 atgggccagc gcggcaactt tcgcaaccag cgcaaaaccg tgaaatgctt taactgcggc 60 aaagaaggcc atattgcgaa aaactgccgc gcgccgcgca aaaaaggctg ctggcgctgc 120 ggccgcgaag gccatcagat gaaagattgc accgaacgcc aggcgaac 168 <210> 14 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACP2 polynucleotides <400> 14 atgaaatgct ttaactgcgg caaagaaggc catattgcga aaaactgccg cgcgccgcgc 60 aaaaaaggc 69 <210> 15 <211> 117 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACP1 polynucleotides <400> 15 atgaaatgct ttaactgcgg caaagaaggc catattgcga aaaactgccg cgcgccgcgc 60 aaaaaaggct gctggcgctg cggccgcgaa ggccatcaga tgaaagattg caccgaa 117 <210> 16 <211> 1341 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BTLC polynucleotides <400> 16 ccgttcgtta acaaacagtt caactacaaa gacccggtta acggcgttga catcgcttac 60 atcaaaatcc cgaacgctgg ccagatgcag ccggttaaag cattcaagat ccacaacaaa 120 atctgggtaa tcccggaacg tgacaccttc accaacccgg aagaaggcga cctgaacccg 180 ccgccggaag ctaaacaggt tccggtttcc tactacgact ccacctacct gagcaccgac 240 aacgagaagg acaactacct gaaaggcgtt accaaactgt tcgaacgtat ctactccacc 300 gacctgggcc gtatgctgct gacctccatc gttcgtggca tcccgttctg gggcggtagc 360 accatcgaca ccgaactgaa agttatcgac accaactgca tcaacgttat ccagccggac 420 ggctcctacc gttccgaaga actgaacctg gttatcatcg gcccgtccgc tgacatcatc 480 cagttcgaat gcaaatcctt cggccacgaa gttctgaacc tgacccgtaa cggctacggc 540 tccacccagt acatccgttt ctccccggac ttcaccttcg gcttcgaaga atccctggaa 600 gttgacacca acccgctgct gggcgctggc aaattcgcta ccgacccggc tgttaccctg 660 gctcacgaac tgatccacgc tggccaccgt ctgtacggca tcgctatcaa cccgaaccgt 720 gttttcaaag ttaacaccaa cgcttactac gaaatgtccg gcctggaagt ttccttcgaa 780 gaactgcgta ccttcggcgg ccacgacgct aaattcatcg actccctgca ggagaacgaa 840 ttccgtctgt actattacaa caaattcaaa gacatcgctt ccaccctgaa caaagctaaa 900 tccatcgttg gcaccaccgc ttccctgcag tacatgaaga acgttttcaa agagaagtac 960 ctgctgtccg aagacacctc cggcaaattc tccgttgaca aactgaaatt cgacaaactg 1020 tacaagatgc tgaccgaaat ctacaccgaa gacaacttcg ttaaattctt caaagttctg 1080 aaccgtaaaa cctacctgaa cttcgacaaa gctgttttca agatcaacat cgttccgaaa 1140 gttaactaca ccatctacga cggcttcaac ctgcgtaaca ccaacctggc tgctaacttc 1200 aacggccaga acaccgaaat caacaacatg aacttcacca aactgaagaa cttcaccggc 1260 ctgttcgaat tctacaaact gctgtgcgtt cgtggcatca tcacctccaa aaccaaatcc 1320 ctggacaaag gctacaacaa a 1341 <210> 17 <211> 159 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGF polynucleotides <400> 17 aattctgata gcgagtgtcc gctgagtcac gacggttatt gtctgcacga cggcgtttgt 60 atgtacatcg aagcgctgga caaatacgcc tgcaattgcg tagtcggcta tatcggcgaa 120 cgttgtcagt atcgcgacct gaaatggtgg gaactgcgt 159 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hexapeptide polynucleotides <400> 18 gaagaaatgc agcgccgc 18 <210> 19 <211> 1521 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACP-BTLC polynucleotides <400> 19 atgggccagc ggggaaactt caggaaccag agaaaaactg tgaagtgctt caattgcgga 60 aaggagggcc acatcgctaa gaactgccgc gcccccagaa agaaaggctg ctggagatgc 120 ggcagagagg gccaccagat gaaggactgc acagagagac aggcaaactt aacaagcttg 180 ccgttcgtta acaaacagtt caactacaaa gacccggtta acggcgttga catcgcttac 240 atcaaaatcc cgaacgctgg ccagatgcag ccggttaaag cattcaagat ccacaacaaa 300 atctgggtaa tcccggaacg tgacaccttc accaacccgg aagaaggcga cctgaacccg 360 ccgccggaag ctaaacaggt tccggtttcc tactacgact ccacctacct gagcaccgac 420 aacgagaagg acaactacct gaaaggcgtt accaaactgt tcgaacgtat ctactccacc 480 gacctgggcc gtatgctgct gacctccatc gttcgtggca tcccgttctg gggcggtagc 540 accatcgaca ccgaactgaa agttatcgac accaactgca tcaacgttat ccagccggac 600 ggctcctacc gttccgaaga actgaacctg gttatcatcg gcccgtccgc tgacatcatc 660 cagttcgaat gcaaatcctt cggccacgaa gttctgaacc tgacccgtaa cggctacggc 720 tccacccagt acatccgttt ctccccggac ttcaccttcg gcttcgaaga atccctggaa 780 gttgacacca acccgctgct gggcgctggc aaattcgcta ccgacccggc tgttaccctg 840 gctcacgaac tgatccacgc tggccaccgt ctgtacggca tcgctatcaa cccgaaccgt 900 gttttcaaag ttaacaccaa cgcttactac gaaatgtccg gcctggaagt ttccttcgaa 960 gaactgcgta ccttcggcgg ccacgacgct aaattcatcg actccctgca ggagaacgaa 1020 ttccgtctgt actattacaa caaattcaaa gacatcgctt ccaccctgaa caaagctaaa 1080 tccatcgttg gcaccaccgc ttccctgcag tacatgaaga acgttttcaa agagaagtac 1140 ctgctgtccg aagacacctc cggcaaattc tccgttgaca aactgaaatt cgacaaactg 1200 tacaagatgc tgaccgaaat ctacaccgaa gacaacttcg ttaaattctt caaagttctg 1260 aaccgtaaaa cctacctgaa cttcgacaaa gctgttttca agatcaacat cgttccgaaa 1320 gttaactaca ccatctacga cggcttcaac ctgcgtaaca ccaacctggc tgctaacttc 1380 aacggccaga acaccgaaat caacaacatg aacttcacca aactgaagaa cttcaccggc 1440 ctgttcgaat tctacaaact gctgtgcgtt cgtggcatca tcacctccaa aaccaaatcc 1500 ctggacaaag gctacaacaa a 1521 <210> 20 <211> 1416 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACP2-BTLC polynucleotides <400> 20 atgaagtgct tcaattgcgg aaaggagggc cacatcgcta agaactgccg cgcccccaga 60 aagaaaggca agcttccgtt cgttaacaaa cagttcaact acaaagaccc ggttaacggc 120 gttgacatcg cttacatcaa aatcccgaac gctggccaga tgcagccggt taaagcattc 180 aagatccaca acaaaatctg ggtaatcccg gaacgtgaca ccttcaccaa cccggaagaa 240 ggcgacctga acccgccgcc ggaagctaaa caggttccgg tttcctacta cgactccacc 300 tacctgagca ccgacaacga gaaggacaac tacctgaaag gcgttaccaa actgttcgaa 360 cgtatctact ccaccgacct gggccgtatg ctgctgacct ccatcgttcg tggcatcccg 420 ttctggggcg gtagcaccat cgacaccgaa ctgaaagtta tcgacaccaa ctgcatcaac 480 gttatccagc cggacggctc ctaccgttcc gaagaactga acctggttat catcggcccg 540 tccgctgaca tcatccagtt cgaatgcaaa tccttcggcc acgaagttct gaacctgacc 600 cgtaacggct acggctccac ccagtacatc cgtttctccc cggacttcac cttcggcttc 660 gaagaatccc tggaagttga caccaacccg ctgctgggcg ctggcaaatt cgctaccgac 720 ccggctgtta ccctggctca cgaactgatc cacgctggcc accgtctgta cggcatcgct 780 atcaacccga accgtgtttt caaagttaac accaacgctt actacgaaat gtccggcctg 840 gaagtttcct tcgaagaact gcgtaccttc ggcggccacg acgctaaatt catcgactcc 900 ctgcaggaga acgaattccg tctgtactat tacaacaaat tcaaagacat cgcttccacc 960 ctgaacaaag ctaaatccat cgttggcacc accgcttccc tgcagtacat gaagaacgtt 1020 ttcaaagaga agtacctgct gtccgaagac acctccggca aattctccgt tgacaaactg 1080 aaattcgaca aactgtacaa gatgctgacc gaaatctaca ccgaagacaa cttcgttaaa 1140 ttcttcaaag ttctgaaccg taaaacctac ctgaacttcg acaaagctgt tttcaagatc 1200 aacatcgttc cgaaagttaa ctacaccatc tacgacggct tcaacctgcg taacaccaac 1260 ctggctgcta acttcaacgg ccagaacacc gaaatcaaca acatgaactt caccaaactg 1320 aagaacttca ccggcctgtt cgaattctac aaactgctgt gcgttcgtgg catcatcacc 1380 tccaaaacca aatccctgga caaaggctac aacaaa 1416 <210> 21 <211> 1464 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACP1-BTLC polynucleotides <400> 21 atgaagtgct tcaattgcgg aaaggagggc cacatcgcta agaactgccg cgcccccaga 60 aagaaaggct gctggagatg cggcagagag ggccaccaga tgaaggactg cacagagaag 120 cttccgttcg ttaacaaaca gttcaactac aaagacccgg ttaacggcgt tgacatcgct 180 tacatcaaaa tcccgaacgc tggccagatg cagccggtta aagcattcaa gatccacaac 240 aaaatctggg taatcccgga acgtgacacc ttcaccaacc cggaagaagg cgacctgaac 300 ccgccgccgg aagctaaaca ggttccggtt tcctactacg actccaccta cctgagcacc 360 gacaacgaga aggacaacta cctgaaaggc gttaccaaac tgttcgaacg tatctactcc 420 accgacctgg gccgtatgct gctgacctcc atcgttcgtg gcatcccgtt ctggggcggt 480 agcaccatcg acaccgaact gaaagttatc gacaccaact gcatcaacgt tatccagccg 540 gacggctcct accgttccga agaactgaac ctggttatca tcggcccgtc cgctgacatc 600 atccagttcg aatgcaaatc cttcggccac gaagttctga acctgacccg taacggctac 660 ggctccaccc agtacatccg tttctccccg gacttcacct tcggcttcga agaatccctg 720 gaagttgaca ccaacccgct gctgggcgct ggcaaattcg ctaccgaccc ggctgttacc 780 ctggctcacg aactgatcca cgctggccac cgtctgtacg gcatcgctat caacccgaac 840 cgtgttttca aagttaacac caacgcttac tacgaaatgt ccggcctgga agtttccttc 900 gaagaactgc gtaccttcgg cggccacgac gctaaattca tcgactccct gcaggagaac 960 gaattccgtc tgtactatta caacaaattc aaagacatcg cttccaccct gaacaaagct 1020 aaatccatcg ttggcaccac cgcttccctg cagtacatga agaacgtttt caaagagaag 1080 tacctgctgt ccgaagacac ctccggcaaa ttctccgttg acaaactgaa attcgacaaa 1140 ctgtacaaga tgctgaccga aatctacacc gaagacaact tcgttaaatt cttcaaagtt 1200 ctgaaccgta aaacctacct gaacttcgac aaagctgttt tcaagatcaa catcgttccg 1260 aaagttaact acaccatcta cgacggcttc aacctgcgta acaccaacct ggctgctaac 1320 ttcaacggcc agaacaccga aatcaacaac atgaacttca ccaaactgaa gaacttcacc 1380 ggcctgttcg aattctacaa actgctgtgc gttcgtggca tcatcacctc caaaaccaaa 1440 tccctggaca aaggctacaa caaa 1464 <210> 22 <211> 1512 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BTLC-ACP polynucleotides <400> 22 ccgttcgtta acaaacagtt caactacaaa gacccggtta acggcgttga catcgcttac 60 atcaaaatcc cgaacgctgg ccagatgcag ccggttaaag cattcaagat ccacaacaaa 120 atctgggtaa tcccggaacg tgacaccttc accaacccgg aagaaggcga cctgaacccg 180 ccgccggaag ctaaacaggt tccggtttcc tactacgact ccacctacct gagcaccgac 240 aacgagaagg acaactacct gaaaggcgtt accaaactgt tcgaacgtat ctactccacc 300 gacctgggcc gtatgctgct gacctccatc gttcgtggca tcccgttctg gggcggtagc 360 accatcgaca ccgaactgaa agttatcgac accaactgca tcaacgttat ccagccggac 420 ggctcctacc gttccgaaga actgaacctg gttatcatcg gcccgtccgc tgacatcatc 480 cagttcgaat gcaaatcctt cggccacgaa gttctgaacc tgacccgtaa cggctacggc 540 tccacccagt acatccgttt ctccccggac ttcaccttcg gcttcgaaga atccctggaa 600 gttgacacca acccgctgct gggcgctggc aaattcgcta ccgacccggc tgttaccctg 660 gctcacgaac tgatccacgc tggccaccgt ctgtacggca tcgctatcaa cccgaaccgt 720 gttttcaaag ttaacaccaa cgcttactac gaaatgtccg gcctggaagt ttccttcgaa 780 gaactgcgta ccttcggcgg ccacgacgct aaattcatcg actccctgca ggagaacgaa 840 ttccgtctgt actattacaa caaattcaaa gacatcgctt ccaccctgaa caaagctaaa 900 tccatcgttg gcaccaccgc ttccctgcag tacatgaaga acgttttcaa agagaagtac 960 ctgctgtccg aagacacctc cggcaaattc tccgttgaca aactgaaatt cgacaaactg 1020 tacaagatgc tgaccgaaat ctacaccgaa gacaacttcg ttaaattctt caaagttctg 1080 aaccgtaaaa cctacctgaa cttcgacaaa gctgttttca agatcaacat cgttccgaaa 1140 gttaactaca ccatctacga cggcttcaac ctgcgtaaca ccaacctggc tgctaacttc 1200 aacggccaga acaccgaaat caacaacatg aacttcacca aactgaagaa cttcaccggc 1260 ctgttcgaat tctacaaact gctgtgcgtt cgtggcatca tcacctccaa aaccaaatcc 1320 ctggacaaag gctacaacaa aaagcttatg cagcgcggca actttcgcaa ccagcgcaaa 1380 attgtgaaat gctttaactg cggcaaagaa ggccataccg cgcgcaactg ccgcgcgccg 1440 cgcaaaaaag gctgctggaa atgcggcaaa gaaggccatc agatgaaaga ttgcaccgaa 1500 cgccaggcga ac 1512 <210> 23 <211> 228 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACP2-EGF polynucleotides <400> 23 gtgaagtgct tcaattgcgg aaaggagggc cacatcgcta agaactgccg cgcccccaga 60 aagaaaggca attctgatag cgagtgtccg ctgagtcacg acggttattg tctgcacgac 120 ggcgtttgta tgtacatcga agcgctggac aaatacgcct gcaattgcgt agtcggctat 180 atcggcgaac gttgtcagta tcgcgacctg aaatggtggg aactgcgt 228 <210> 24 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACP2-hexapeptide polynucleotides <400> 24 gtgaagtgct tcaattgcgg aaaggagggc cacatcgcta agaactgccg cgcccccaga 60 aagaaaggcg aagaaatgca gcgccgc 87 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucletodies <400> 25 ccatgggcca gcggggaaac cagc 24 <210> 26 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucletodies <400> 26 aagcttgtta agtttgcctg tctctctgtg c 31 <210> 27 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucletodies <400> 27 aagcttccgt tcgttaacaa acagttcaac tacaaaga 38 <210> 28 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucletodies <400> 28 ctcgagtcat ttgttgtagc ctttgtccag ggattt 36 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucletodies <400> 29 catatgaagt gcttcaattg cggaaaggag 30 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucletodies <400> 30 aagcttgcct ttctttctgg gggc 24 <210> 31 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucletodies <400> 31 aagcttctct gtgcagtcct tcatctgg 28 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucletodies <400> 32 aagcttcagc ggggaaac 18 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucletodies <400> 33 ctcgagtaag tttgcctg 18 <210> 34 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucletodies <400> 34 ccatgggccc gttcgttaac aaacagttca actacaaaga 40 <210> 35 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucletodies <400> 35 aagctttttg ttgtagcctt tgtccaggga ttt 33 <210> 36 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucletodies <400> 36 ctcgagtttg ttgtagcctt tgtccaggga ttt 33

Claims

피부 생리 활성 분자; 및
서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과 펩티드를 포함하고,
상기 피부 생리 활성 분자는 서열번호 4 내지 6으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 기재되는 폴리펩티드인 것인 융합 단백질.
제1항의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제2항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
제3항의 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포.
하기 단계를 포함하는 융합 단백질을 생산하는 방법:
⒜ 제4항의 숙주세포를 배양 배지에서 배양하는 단계; 및
⒝ 배양 배지로부터 융합 단백질을 회수하는 단계.
제1항의 융합 단백질; 또는
서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과 펩티드 및 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 혼합물
을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
제6항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 에멀젼, 크림, 에센스, 스킨, 리포솜, 마이크로캡슐, 복합 입자, 샴푸 및 린스로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형인 것인 화장료 조성물.
제1항의 융합 단백질; 또는
서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과 펩티드 및 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 혼합물
을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선, 또는 피부 상처 치료용 약학적 조성물.
제1항의 융합 단백질; 또는
서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 세포 투과 펩티드 및 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 혼합물
을 유효성분으로 포함하는 근경직증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.