JP7113918B2 - 細胞透過ペプチドと結合した融合タンパク質、および融合タンパク質または細胞透過ペプチドと上皮細胞成長因子を有効成分として含む組成物 - Google Patents

細胞透過ペプチドと結合した融合タンパク質、および融合タンパク質または細胞透過ペプチドと上皮細胞成長因子を有効成分として含む組成物 Download PDF

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Description

本発明は、細胞透過ペプチドと結合した融合タンパク質、および融合タンパク質または細胞透過ペプチドと上皮細胞成長因子を有効成分として含む組成物に関する。
皮膚は外部の環境と常に接している組織で、体液漏出および感染防止、水分消失を防ぐ保護障壁の役割を果たす。特に、表皮の角質層は、皮膚においても最も外側に存在しながら皮膚外への水分と電解質の消失を抑制することにより、皮膚の乾燥を防止し、皮膚の正常な生化学的代謝が可能な環境を提供する。また、外部の物理的損傷と化学物質から人体を保護し、細菌、カビ、ウイルスなどの皮膚への侵入を防止する重要な役割を果たす。しかし、年が取るにつれ、各種汚染物質、強い紫外線、ストレスおよび栄養欠乏などによって皮膚細胞が損傷し、細胞増殖がまともに行われなくなって、皮膚にシワ、弾力損失および角質化などが発生する。
これによって、化粧品素材に新技術を組み込んだ高機能性化粧品の開発が行われ続けている。また、美白、シワ改善、皮膚再生のような具体的な効果を求める消費者が増えるにつれ、化粧品産業において機能性化粧品の価値がさらに高まってきており、多様な素材を化粧品に融合させるための研究が集中している。
化粧品原料として頻繁に使用される分子量５００Ｄａ以下の低分子合成化合物や天然化合物は容易に細胞内に伝達されることが知られているが、皮膚障壁を構成する角質層の固有の特性によって低分子量物質の透過効率は低い方である。分子量５００Ｄａ以上のタンパク質、ペプチドおよび核酸のような巨大分子は、分子量が大きいことから、二重脂質膜の構造になっている細胞膜内への透過がなおさら困難である。このような低分子および巨大分子が細胞の原形質膜を通過する効率を増幅させるための方法として、最近関心が高まっているのが、皮膚を通しての投与方法（Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ、ＴＤＤ）である。しかし、皮膚を通しての投与方法の最も大きな障壁は、角質層内の角質形成細胞とこれらの間の角質細胞間脂質である。大部分の皮膚において生理学的に活性を示す分子（以下、皮膚生理活性分子）は、皮膚角質層の抵抗性のため、経皮透過率が低くなる。
このような皮膚生理活性分子の皮膚透過率を促進させる多様な方法が研究されてきたが、最近、細胞透過性ペプチドを用いた伝達システムに多くの関心が集まっている。細胞透過ペプチド（Ｃｅｌｌ Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ＣＰＰ）は約１０－６０個程度の短ペプチドからなる細胞膜透過性ペプチドで、大部分がタンパク質－透過ドメイン（ｐｒｏｔｅｉｎ－ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）や膜－移動シーケンス（ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）から誘導される。外部物質の一般的な細胞内の流入経路とは異なり、ＣＰＰは細胞膜を損傷させることなく細胞内に移動し、細胞膜を通過できないとされているＤＮＡやタンパク質までも細胞内に伝達させることができると知られている。
本発明者らは、ＨＩＶ（ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）のヌクレオカプシドタンパク質（ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ）由来ペプチドが皮膚生理活性分子の細胞透過性を高められることを確認して、本発明を完成した。
本発明の目的は、皮膚生理活性分子であるボツリヌス毒素、上皮細胞成長因子またはヘキサペプチドと結合した細胞透過ペプチドを含む融合タンパク質を提供することである。
本発明の他の目的は、前記融合タンパク質、または皮膚生理活性分子である上皮細胞成長因子および細胞透過ペプチドの混合物を有効成分として含む化粧料組成物と、シワ改善、筋肉硬直緩和または傷治療用薬学的組成物および治療方法とその用途を提供することである。
本発明の一態様は、皮膚生理活性分子；および配列番号１～３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む細胞透過ペプチドを含み、前記皮膚生理活性分子は、配列番号４～６からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列に記載のポリペプチドである融合タンパク質を提供する。
本発明の他の態様は、前記融合タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを提供する。
本発明のさらに他の態様は、前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを提供する。
本発明のさらに他の態様は、前記組換えベクターを含む宿主細胞を提供する。
本発明のさらに他の態様は、下記のステップを含む融合タンパク質を生産する方法を提供する：（ａ）前記宿主細胞を培養培地で培養するステップ；および（ｂ）培養培地から融合タンパク質を回収するステップ。
本発明のさらに他の態様は、前記融合タンパク質；または配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなる細胞透過ペプチド、および配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチドを有効成分として含む皮膚改善用化粧料組成物を提供する。
本発明の一具体例によれば、前記化粧料組成物は、エマルジョン、クリーム、エッセンス、スキン、リポソーム、マイクロカプセル、複合粒子、シャンプーおよびリンスからなる群より選択される剤形であってもよい。
本発明のさらに他の態様は、前記融合タンパク質；または配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなる細胞透過ペプチド、および配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチドを有効成分として含むシワ改善、筋肉緊張緩和または皮膚の傷治療用薬学的組成物を提供する。
本発明のさらに他の態様は、前記組成物を対象体に投与するステップを含むシワ改善、筋肉緊張緩和または皮膚の傷の治療方法を提供する。
本発明のさらに他の態様は、シワ改善、筋肉緊張緩和または皮膚の傷の治療のための薬剤の製造において、前記融合タンパク質；または配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなる細胞透過ペプチド、および配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチドの用途を提供する。
皮膚組織および細胞透過性ペプチドと結合したボツリヌス毒素、上皮細胞成長因子またはヘキサペプチド融合タンパク質、または細胞透過性ペプチドおよび上皮細胞成長因子の混合物は、単独タンパク質よりも皮膚組織および細胞透過性が増加しているので、皮膚改善および傷治療用途に有用に使用可能である。
ボツリヌス毒素（ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｏｘｉｎ、ＢＴＬＣ）および細胞透過ペプチド－ボツリヌス毒素融合タンパク質（ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｏｘｉｎ、ＡＣＰ－ＢＴＬＣ）の細胞膜透過活性をＨｅＬａ細胞（Ａ）、Ｕ８７－ＭＧ細胞（Ｂ）およびＰＣ－１２細胞（Ｃ）で確認した結果を示す。 ＡＣＰ２－ＢＴＬＣの細胞膜透過活性をＨｅＬａ細胞（Ａ）、Ｕ８７－ＭＧ細胞（Ｂ）およびＰＣ－１２細胞（Ｃ）で確認した結果を示す。 細胞透過ペプチドとボツリヌス毒素の結合類型による細胞膜透過活性をＨｅＬａ細胞で確認した結果を示す。 ＢＴＬＣおよびＡＣＰ－ＢＴＬＣのマウス皮膚組織透過効能を濃度依存的に確認した結果を示す：図４のＡはＨｉｓ抗体で染色した結果であり、ＢはＢｏｔｏｘ抗体で染色した結果である。 ＡＣＰ－ＢＴＬＣ、ＢＴＬＣ－ＡＣＰ、ＡＣＰ２－ＢＴＬＣ、ＡＣＰ１－ＢＴＬＣおよびＢＴＬＣのＳＮＡＰ２５切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）の有無を確認した結果を示す。 同一用量のＢＴＬＣ、ＡＣＰ－ＢＴＬＣ、ＡＣＰ２－ＢＴＬＣおよびＡＣＰ１－ＢＴＬＣ発現ベクターを形質注入してＳＮＡＰ２５切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）の有無を確認した結果を示す。 ＡＣＰ－ＢＴＬＣ、ＢＴＬＣ－ＡＣＰ、ＡＣＰ２－ＢＴＬＣ、ＡＣＰ１－ＢＴＬＣおよびＢＴＬＣの細胞膜透過後にＳＮＡＰ２５切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）の有無を確認した結果を示す。 ＦＩＴＣ－ＡＣＰ２およびＦＩＴＣ－ＡＣＰ２－ＥＧＦ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）の細胞膜透過活性をＨｅＬａ細胞で確認した結果を示す。 ＦＩＴＣ－ＡＣＰ２－ＥＧＦのマウス皮膚組織透過効能を濃度依存的に確認した結果を示す。 Ａ４３１細胞におけるＡＣＰ２－ＥＧＦの細胞移動性増加効能を確認した結果を示す。 ＦＩＴＣ－ヘキサペプチド（ｈｅｘａｐｅｐｔｉｄｅ）およびＦＩＴＣ－ＡＣＰ２－ヘキサペプチドの細胞膜透過活性をＨｅＬａ細胞で濃度依存的に確認した結果を示す。 ＦＩＴＣ－ヘキサペプチドおよびＦＩＴＣ－ＡＣＰ２－ヘキサペプチドのマウス皮膚組織透過効能を濃度依存的に確認した結果を示す。 ＦＩＴＣ－ＥＧＦおよびＦＩＴＣ－ＥＧＦ＋ＡＣＰペプチドの細胞膜透過活性をＨｅＬａ細胞で確認した結果を示す。 ＦＩＴＣ－ＥＧＦおよびＦＩＴＣ－ＥＧＦ＋ＡＣＰペプチドのマウス皮膚組織透過効能を濃度依存的に確認した結果を示す。 ＦＩＴＣ－ＥＧＦ、ＦＩＴＣ－ＥＧＦ＋ＡＣＰおよびＦＩＴＣ－ＥＧＦ＋Ｔｒａｎｓｋｉｎペプチドのミニブタ皮膚組織透過効能を濃度依存的に確認した結果を示す。 Ａ４３１細胞におけるＡＣＰ＋ＥＧＦ（混合）の細胞移動性増加効能を確認した結果を示す。ＡはＡＣＰとＥＧＦの混合、ＢはＡＣＰ２とＥＧＦの混合結果を示す。
上記の目的を達成するために、本発明の一態様は、
皮膚生理活性分子；および
配列番号１～３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む細胞透過ペプチドを含み、
前記皮膚生理活性分子は、配列番号４～６からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列に記載のポリペプチドである融合タンパク質を提供する。
本明細書に使われた用語、「細胞透過ペプチド（Ｃｅｌｌ Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ＣＰＰ）」は、約１０個～６０個程度の短いペプチドからなる細胞膜透過性ペプチドで細胞膜を損傷させることなく細胞内に移動し、細胞膜を通過できないＤＮＡやタンパク質まで細胞内に伝達することができる。
本明細書に使われた用語、「融合タンパク質（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」は、細胞透過ペプチドと生物学的または薬剤学的に活性を有する物質が化学的物理的共有または非共有結合で連結された物質を意味する。
本発明の一具体例において、細胞透過ペプチドに結合して融合タンパク質になり得る「生物学的または薬剤学的活性を有する物質」とは、生体内の生理現象を調節できる物質を意味するもので、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、脂肪、炭水化物および化合物（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）、または蛍光標識物質などを含む。例えば、タンパク質としては、皮膚生理活性分子であるボツリヌス毒素（配列番号４）、上皮細胞成長因子（配列番号５）またはヘキサペプチド（配列番号６）を用いることができる。
本発明の一具体例において、前記融合タンパク質は、配列番号７～１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことができる。
本発明の他の態様は、前記融合タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドを提供する。
本明細書に使われた用語、「ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は、単鎖または二重鎖形態で存在するデオキシリボヌクレオチド（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）またはリボヌクレオチド（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）の重合体である。ＲＮＡゲノム配列、ＤＮＡ（ｇＤＮＡおよびｃＤＮＡ）およびこれより転写されるＲＮＡ配列を包括し、特に別の言及がない限り、天然のポリヌクレオチドの類似体を含む。
本発明の一具体例において、前記ポリヌクレオチドは、融合タンパク質をコーディングするヌクレオチド配列だけでなく、その配列に相補的な（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）配列も含む。前記相補的な配列は、完璧に相補的な配列だけではなく、実質的に相補的な配列も含む。また、前記ポリヌクレオチド配列は変形可能であり、変形は、ヌクレオチドの追加、欠失または非保存的置換もしくは保存的置換を含む。
本発明の一具体例において、前記融合タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドは、配列番号１９～２４からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含むことができる。
本発明の他の態様は、前記融合タンパク質をコーディングするポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供する。
本明細書に使われた用語、「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、宿主細胞において目的遺伝子を発現させるための手段を意味する。例えば、プラスミドベクター、コスミドベクターおよびバクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびアデノ－関連ウイルスベクターのようなウイルスベクターを含むことができるが、これに限定しない。前記組換えベクターとして使用可能なベクターは、当業界でたびたび用いられるプラスミド（例えば、ｐＳＣ１０１、ｐＧＶ１１０６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズおよびｐＵＣ１９等）、ファージ（例えば、λｇｔ４λＢ、λ－Ｃｈａｒｏｎ、λΔｚ１およびＭ１３等）またはウイルス（例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０等）を操作して作製できる。
前記組換えベクターは、前記ポリヌクレオチド配列とポリヌクレオチド配列に作動的に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）プロモーターを含むことができる。
本明細書に使われた用語、「作動的に連結された」は、ヌクレオチド発現調節配列（例えば、プロモーター配列）と他のヌクレオチド配列との間の機能的な結合を意味し、これによって、前記調節配列は、前記他のヌクレオチド配列の転写および／または解読を調節する。
一方、本発明に利用可能な組換えベクターは、当業界でたびたび用いられるプラスミド（例：ｐＳＣ１０１、ＣｏｌＥ１、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＨＣ７９、ｐＵＣ１９、ｐＥＴ等）、ファージ（例：λｇｔ４λＢ、λ－Ｃｈａｒｏｎ、λΔｚ１およびＭ１３等）またはウイルス（例：ＳＶ４０等）を操作して作製できる。
前記組換えベクターは、細胞透過ペプチドと皮膚生理活性分子融合タンパク質の精製を容易にするタグ（ｔａｇ）配列、例えば、連続したヒスチジンコドン、マルトースバインディングタンパク質コドンおよびＭｙｃコドンなどを含むことができ、融合タンパク質の可溶性（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）を増加させるための融合パートナー（ｐａｒｔｎｅｒ）などを追加的に含んでもよい。また、融合タンパク質の発現時に不必要な部分を除去するために酵素によって特異的に切断される配列、発現調節配列および細胞内伝達を確認するためのマーカー（ｍａｒｋｅｒ）またはレポーター遺伝子配列を含むことができる。
本発明の他の態様は、前記組換えベクターを含む宿主細胞、すなわち、前記組換えベクターによって形質転換された細胞を提供する。
前記組換えベクターを安定的かつ連続的にクローニングまたは発現させることができる宿主細胞は、当業界で公知のいかなる宿主細胞も利用可能である。原核細胞としては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＲ１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＥ３９２、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ １７７６およびＥ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０などがある。真核細胞に形質転換させる場合、宿主細胞として、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞、植物細胞および動物細胞、例えば、ＳＰ２／０、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）Ｋ１、ＣＨＯ ＤＧ４４、ＰＥＲ．Ｃ６、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ－７、２９３、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、３Ｔ３、ＲＩＮおよびＭＤＣＫ細胞株などが利用可能である。
前記ポリヌクレオチドまたはこれを含む組換えベクターの宿主細胞内への運搬は、当業界で広く知られた運搬方法を用いることができる。前記運搬方法は、例えば、宿主細胞が原核細胞の場合、ＣａＣｌ２方法または電気穿孔方法などを用いることができ、宿主細胞が真核細胞の場合には、微細注入法、カルシウムホスフェート沈殿法、電気穿孔法、リポソーム－媒介形質感染法および遺伝子ボンバードメントなどを用いることができるが、これらに限定しない。
前記形質転換された宿主細胞を選別する方法は、選択標識によって発現する表現型を用いて、当該技術分野で知られた方法によって容易に実施可能である。例えば、前記選択標識が特定の抗生剤耐性遺伝子の場合には、前記抗生剤が含有された培地で形質転換体を培養することにより形質転換体を容易に選別することができる。
本発明のさらに他の態様は、前記宿主細胞を培養培地で培養するステップ；および培養培地から融合タンパク質を回収するステップを含む、融合タンパク質の生産方法を提供する。
本発明の一具体例において、前記細胞培養は、大規模細胞培養であってもよいし、細胞培養方法は、通常使用される細胞培養法を用いることができる。例えば、前記細胞培養方法はこれに限定されるものではないが、回分培養法（ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、反復回分培養法（ｒｅｐｅａｔｅｄ ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、流加培養法（ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、反復流加培養法（ｒｅｐｅａｔｅｄ ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、連続培養法（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅ）および灌流培養法（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ）からなる群より選択されたいずれか１つ以上であってもよい。
本発明の一具体例において、前記培養培地から融合タンパク質を回収するステップは、当該技術分野で公知の多様な分離および精製方法により行うことができる。通常、細胞片（ｃｅｌｌ ｄｅｂｒｉｓ）、培養不純物などを除去するために、細胞溶解物を遠心分離した後、沈殿、例えば、塩析（硫酸アンモニウム沈殿およびリン酸ナトリウム沈殿）、溶媒沈殿（アセトン、エタノール、イソプロピルアルコールなどを用いたタンパク質分画沈殿）などを行うことができ、透析、電気泳動および各種カラムクロマトグラフィーなどを行うことができる。
本発明のさらに他の態様は、前記融合タンパク質；または配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなる細胞透過ペプチド、および配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチドを有効成分として含む皮膚改善用化粧料組成物を提供する。
本発明の一具体例において、前記皮膚改善用途は、シワ改善、皮膚再生、皮膚弾力改善、皮膚老化防止などの用途を含むことができる。
上皮細胞成長因子（配列番号５）および細胞透過ペプチド、例えば、配列番号１（ＡＣＰ）または配列番号２（ＡＣＰ２）のアミノ酸配列からなる細胞透過ペプチドは、融合タンパク質ではない混合物形態で用いられても皮膚浸透活性に優れているので、融合タンパク質形態ではない混合物形態で化粧料組成物として使用可能である。
本発明の一具体例において、前記化粧料組成物は、エマルジョン、クリーム、エッセンス、スキン、リポソーム、マイクロカプセル、複合粒子、シャンプーおよびリンスからなる群より選択される剤形に製造できる。また、前記融合タンパク質、または配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなる細胞透過ペプチド、および配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチドは皮膚角質層を透過可能なため、前記化粧料組成物は、経皮性であることが最も好ましい。
前記化粧料組成物は、融合タンパク質、または配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなる細胞透過ペプチド、および配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチドのほか、追加的に、抗微生物剤（ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ）、保湿剤および水和剤（ｈｙｄｒａｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）、保存剤、乳化剤、天然オイルまたは合成オイル、溶媒、界面活性剤、洗浄剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）、ゲル化剤（ｇｅｌｌｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、軟化剤（ｅｍｏｌｌｉｅｎｔ）、抗酸化剤、香料、充填剤、増粘剤（ｔｈｉｃｋｅｎｅｒ）、ワックス、吸臭剤、染料（ｄｙｅｓｔｕｆｆ）、着色剤、粉末、粘度－調節剤（ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ａｇｅｎｔ）および水を含むことができ、選択的に、植物抽出物（ｂｏｔａｎｉｃａｌ ｅｘｔｒａｃｔ）、コンディショニング剤（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、黒化剤または美白剤（ｄａｒｋｅｎｉｎｇ ｏｒ ｌｉｇｈｔｅｎｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、グリッター（ｇｌｉｔｔｅｒ）、湿潤剤（ｈｕｍｅｃｔａｎｔ）、ミネラル、ポリフェノール、シリコーンまたはその誘導体、日光遮断剤（ｓｕｎｂｌｏｃｋ）、ビタミン、および薬用植物（ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎａｌ）を含むことができる。
本発明のさらに他の態様は、前記融合タンパク質；または配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなる細胞透過ペプチド、および配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチドを有効成分として含むシワ改善、筋肉硬直緩和または皮膚の傷治療用薬学的組成物を提供する。
本明細書に使われた用語、「皮膚の傷（ｓｋｉｎ ｗｏｕｎｄ）」とは、物理的原因などによって皮膚組織に損傷が発生した状態を意味し、表皮、真皮または皮下組織の欠損を含む。皮膚の傷の治療は、皮膚を損傷前の状態に回復させることを意味し、皮膚の傷の軽減、緩和および症状の改善を含む。
上皮細胞成長因子（配列番号５）および細胞透過ペプチド、例えば、配列番号１（ＡＣＰ）または配列番号２（ＡＣＰ２）のアミノ酸配列からなる細胞透過ペプチドは、融合タンパク質ではない混合物形態で用いられても皮膚浸透活性に優れているので、融合タンパク質形態ではない混合物形態でシワ改善、筋肉硬直緩和または皮膚の傷治療用薬学的組成物として使用可能である。
本発明の薬学的組成物は、前記融合タンパク質；または配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなる細胞透過ペプチド、および配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチドのほか、必要に応じて、薬学的組成物において薬学的に許容可能な担体を含むことができる。
このような薬学的に許容される担体は、薬品の製造時に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の薬学的組成物はさらに、添加剤として、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などを追加的に含んでもよい。
前記担体は、本発明の薬学的組成物に、その全重量に対して約１重量％～約９９．９９重量％、好ましくは約９０重量％～約９９．９９重量％含まれ、前記添加剤は、約０．１重量％～約２０重量％含まれる。
一方、本発明の薬学的組成物は、経口または非経口投与されてもよいが、局所投与方式で皮膚に直接投与可能である。
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体および／または賦形剤を用いて製剤化することにより、単位用量形態で製造されるか、または多用量容器内に移入させて製造される。この時、剤形は、溶液、懸濁液または乳化液形態であるか、エリキシル剤、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、硬膏、塗膏剤、ローション、軟膏などを含むことができる。
本発明の薬学的組成物は、１日の投与量が通常０．００１～１５０ｍｇ／ｋｇの体重範囲であり、１回または数回に分けて投与できる。しかし、本発明の薬学的組成物の投与量は、投与経路、患者の年齢、性別、体重、患者の重症度などの様々な関連因子に照らして決定されるものであるので、前記投与量は、いかなる面でも本発明の範囲を制限すると理解されてはならない。
本発明のさらに他の態様は、前記組成物を対象体に投与するステップを含むシワ改善、筋肉緊張緩和または皮膚の傷の治療方法を提供する。
前記対象体は、動物をいい、典型的に本発明の融合タンパク質またはポリペプチドを用いた治療で有益な効果を奏し得る哺乳動物であれば良い。このような対象体の好ましい例として、ヒトのような霊長類が含まれる。また、このような対象体には、シワ改善、筋肉緊張緩和または皮膚の傷の症状を有するか、このような症状を有する危険のある対象体がすべて含まれてもよい。
本発明のさらに他の態様は、シワ改善、筋肉緊張緩和または皮膚の傷の治療のための薬剤の製造において、前記融合タンパク質；または配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなる細胞透過ペプチド、および配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチドの用途を提供する。
以下、一つ以上の具体例を実施例によってより詳しく説明する。しかし、これらの実施例は一つ以上の具体例を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１：細胞透過ペプチド－ボツリヌス毒素融合タンパク質の作製
細胞透過ペプチドは、それぞれＡＣＰ（ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ：配列番号１）、ＡＣＰ２（配列番号２）およびＡＣＰ１（配列番号３）を用いた。
１－１．ＡＣＰ－ＢＴＬＣ発現用組換えベクター（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｅｃｔｏｒ）の作製
ＡＣＰ遺伝子配列（配列番号１３）のＮ－末端に制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＮＥＢ；米国）であるＮｃｏＩ、Ｃ－末端にＨｉｎｄＩＩＩが作用できる制限酵素認識配列（ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を追加するために、制限酵素認識配列を含むプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）で重合酵素連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ、以下、ＰＣＲと記す）を行った。ＰＣＲに用いたプライマー配列とＰＣＲの条件を表１および表２に記載した。
Figure 0007113918000001
Figure 0007113918000002
以後、ｐＥＴ２８ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国）をＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で３７℃で２時間切断し、ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、米国）で製造会社のプロトコルに従ってベクター断片を分離した。分離したｐＥＴ２８ａベクター断片と１－１のＰＣＲ産物を結合（ライゲーション、ｌｉｇａｔｉｏｎ）させた後、ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔで組換えベクターを分離し、ＡＣＰ遺伝子が挿入された組換えベクターをｐＥＴ２８ａ ＡＣＰと名付けた。ｐＥＴ２８ａ ＡＣＰベクターの作製のための結合反応条件を表３に記載した。
Figure 0007113918000003
次に、前記と同様の方法でボツリヌス毒素（ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｏｘｉｎ、以下、ＢＴＬＣと記す）遺伝子（配列番号１６）のＮ－末端にＨｉｎｄＩＩＩ、Ｃ－末端にＸｈｏＩが作用できる制限酵素認識配列を追加した。ＢＴＬＣ遺伝子の増幅に用いたプライマー配列を表４に記載した。
Figure 0007113918000004
ｐＥＴ２８ａ ＡＣＰベクターをＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ制限酵素で切断した後、ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いてベクター断片を分離した。前記分離したｐＥＴ２８ａ ＡＣＰベクター断片とＢＴＬＣ遺伝子を結合させた後、ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔで組換えベクターを分離し、ＡＣＰ－ＢＴＬＣ遺伝子が挿入された組換えベクターをｐＥＴ２８ａ ＡＣＰ－ＢＴＬＣと名付けた。ｐＥＴ２８ａ ＡＣＰベクター断片とＢＴＬＣ遺伝子の結合反応は、ｐＥＴ２８ａ ＡＣＰベクターとＢＴＬＣ遺伝子を用いることを除いて表３と同様に進行させた。組換えタンパク質の発現の確認のためのＨｉｓタグ（ｔａｇ）は、ＡＣＰ－ＢＴＬＣタンパク質のＣ－末端に結合させた。
大膓菌ＤＨ５αにｐＥＴ２８ａ ＡＣＰ－ＢＴＬＣベクターを形質転換させ、ＬＢ液体培地でＯＤ値が０．５～０．６になるまで３７℃で振盪培養（ｓｈａｋｅ ｃｕｌｔｕｒｅ）した。培養が終わった後、培養液を遠心分離して大膓菌ペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を収集し、Ｐｌａｓｍｉｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ｉｎｔｒｏｎ、韓国）でｐＥＴ２８ａ ＡＣＰ－ＢＴＬＣベクターを分離した。分離したｐＥＴ２８ａ ＡＣＰ－ＢＴＬＣベクターの濃度はＵＶ分光光度方法で測定した。
１－２．ＡＣＰ２－ＢＴＬＣ、ＡＣＰ１－ＢＴＬＣ、ＢＴＬＣ－ＡＣＰ発現用組換えベクターの作製
ＡＣＰ２またはＡＣＰ１とＢＴＬＣの融合タンパク質、Ｃ－末端にＡＣＰが結合したＢＴＬＣ融合タンパク質（ＢＴＬＣ－ＡＣＰ）発現用組換えベクターを作製した。
ＡＣＰ２またはＡＣＰ１をコーディングするポリヌクレオチド（配列番号１４または１５）のＮ－末端にＮｄｅＩ、Ｃ－末端にＨｉｎｄＩＩＩ、ＡＣＰ１遺伝子のＮ－末端にＨｉｎｄＩＩＩ、Ｃ－末端にＸｈｏＩが作用できる制限酵素認識配列を追加するために、表２の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲに用いたプライマー配列を表５に記載した。
Figure 0007113918000005
以後、ｐＥＴ２８ａベクターをＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩまたはＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩで切断して分離した。表３の条件で分離したｐＥＴ２８ａベクター断片と制限酵素認識配列を追加したＡＣＰ２、ＡＣＰ１およびＡＣＰ遺伝子をそれぞれ結合させた後、ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔで組換えベクターを分離した。ＡＣＰ２、ＡＣＰ１およびＡＣＰ遺伝子が挿入された組換えベクターをそれぞれｐＥＴ２８ａ ＡＣＰ２、ｐＥＴ２８ａ ＡＣＰ１およびｐＥＴ２８ａ ＡＣＰ（Ｃ－末端）と名付けた。
次に、ＢＴＬＣ遺伝子のＮ－末端にＨｉｎｄＩＩＩ、Ｃ－末端にＸｈｏＩまたはＮ－末端にＮｃｏＩ、Ｃ－末端にＨｉｎｄＩＩＩが作用できる制限酵素認識配列を追加するために、表２と同様の条件でＰＣＲを進行させた。プライマーは表４および表６に記載したプライマーを用いた。
Figure 0007113918000006
ｐＥＴ２８ａ ＡＣＰ２、ｐＥＴ２８ａ ＡＣＰ１ベクターをＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで切断し、ｐＥＴ２８ａ ＡＣＰ１（Ｃ－末端）ベクターはＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断してベクター断片を分離した。分離したｐＥＴ２８ａ ＡＣＰ２、ｐＥＴ２８ａ ＡＣＰ１およびｐＥＴ２８ａ ＡＣＰ（Ｃ－末端）ベクター断片とＢＴＬＣ遺伝子を結合させ、ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔで組換えベクターを分離した。ＡＣＰ２－ＢＴＬＣ、ＡＣＰ１－ＢＴＬＣおよびＢＴＬＣ－ＡＣＰ遺伝子が挿入された組換えベクターをそれぞれｐＥＴ２８ａ ＡＣＰ２－ＢＴＬＣ、ｐＥＴ２８ａ ＡＣＰ１－ＢＴＬＣおよびｐＥＴ２８ａ ＢＴＬＣ－ＡＣＰと名付けた。ｐＥＴ２８ａ ＡＣＰ２、ｐＥＴ２８ａ ＡＣＰ１およびｐＥＴ２８ａ ＡＣＰ（Ｃ－末端）ベクター断片とＢＴＬＣ遺伝子の結合反応は、ベクターおよびＢＴＬＣ遺伝子を除いて表３と同様に進行させた。組換えタンパク質の発現の確認のためのＨｉｓタグは発現タンパク質のＮ－末端に結合させた。
１－３．ＢＴＬＣ発現用組換えベクター
ＢＴＬＣ遺伝子のＮ－末端にＮｃｏＩ、Ｃ－末端にＸｈｏＩが作用できる制限酵素認識配列を追加するために、表２と同様の条件でＰＣＲを進行させた。プライマーは表６に記載の配列番号３４および表７に記載のプライマーを用いた。
Figure 0007113918000007
ｐＥＴ２８ａベクターをＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ制限酵素で切断した後に分離し、表３の条件でｐＥＴ２８ａベクター断片とＢＴＬＣ遺伝子を結合させた。ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔで組換えベクターを分離し、ＢＴＬＣ遺伝子が挿入された組換えベクターをｐＥＴ２８ａ ＢＴＬＣと名付けた。
１－４．細胞透過ペプチド－ボツリヌス毒素融合タンパク質の発現の確認
ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、米国）にｐＥＴ２８ａ ＡＣＰ－ＢＴＬＣ、ｐＥＴ２８ａ ＡＣＰ２－ＢＴＬＣ、ｐＥＴ２８ａ ＡＣＰ１－ＢＴＬＣ、ｐＥＴ２８ａ ＢＴＬＣ－ＡＣＰおよびｐＥＴ２８ａ ＢＴＬＣベクターをそれぞれ形質転換させた後、ＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）プレートに塗抹して、３７℃で１２時間培養した。１２時間後に形成されたコロニー（ｃｏｌｏｎｙ）をＬＢ液体培地に接種して、３７℃で追加的に前培養した。約１２時間後、ＯＤ値が０．５～０．６に到達した前培養液２５０μｌをＬＢ液体培地２５０ｍｌに接種し、ＯＤ値が０．６～０．８となるように３７℃で３時間～４時間培養した。培養液のＯＤ値が０．６～０．８になった時、培養液にＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）０．２５ｍＭを添加して、１６℃で１８時間培養した。１８時間後に培養液を遠心分離してＢＬ２１ペレットを得、得られたペレットを溶解バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅおよびｐＨ８．０）に懸濁させた後、超音波破砕機で大膓菌を破砕（ａｍｐｌｉｔｕｄｅ３５％）した。
大膓菌破砕物を遠心分離して上層液を回収し、０．４５μｍのフィルタを用いて上層液をチューブに充填させた。チューブに充填された上層液をＮｉ－ＮＴＡ（ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）レジン（ｒｅｓｉｎ）が充填されたカラムに入れて、タンパク質とレジンを互いに結合させた。レジンに結合しない外来タンパク質を除去するために、洗浄バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅおよびｐＨ８．０）を添加してレジンを洗浄した。以後、イミダゾール（ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）が添加されたバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、４００ｍＭイミダゾールおよびｐＨ８．０）を用いた移動相勾配（ｇｒａｄｉｅｎｔ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ）でタンパク質を溶出させた。外来タンパク質を追加的に除去し、イミダゾールを除去するために得られたタンパク質でサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を行った。クロマトグラフィーには洗浄バッファー（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴおよびｐＨ７．４）を用いた。精製したタンパク質はブラッドフォード方法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙ）で濃度を測定した。
１－５．動物細胞発現用組換えベクターの作製
１－２で作製されたｐＥＴ２８ａ ＢＴＬＣ、ｐＥＴ２８ａ ＡＣＰ－ＢＴＬＣ、ｐＥＴ２８ａ ＡＣＰ１－ＢＴＬＣおよびｐＥＴ２８ａ ＡＣＰ２－ＢＴＬＣベクターをＮｃｏＩとＸｈｏＩで切断し、ｐＴｒｉＥｘベクターを同一の制限酵素で切断して分離した。表３の条件で２つの断片をそれぞれ結合した後、各ベクターをｐＴｒｉＥｘ ＢＴＬＣ、ｐＴｒｉＥｘ ＡＣＰ－ＢＴＬＣ、ｐＴｒｉＥｘ ＡＣＰ１－ＢＴＬＣおよびｐＴｒｉＥｘ ＡＣＰ２－ＢＴＬＣと名付けた。
実施例２：細胞透過ペプチドとボツリヌス毒素融合タンパク質の特性の確認
２－１．細胞透過性の確認
ＨｅＬａ細胞は１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）および１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンが追加されたＤＭＥＭ培地で培養し、Ｕ８７－ＭＧおよびＰＣ－１２細胞は１０％ＦＢＳおよび１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンが追加されたＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ、米国）で培養した。すべての細胞は３７℃、５％ＣＯ２の加湿恒温器で培養した。
培養したそれぞれの細胞を、ガラス入りの１２ウェルプレートに１×１０５細胞／ウェル（ｗｅｌｌ）の密度で分注して２４時間培養した。以後、実施例１－４で精製したＢＴＬＣ、ＡＣＰ－ＢＴＬＣ、ＡＣＰ１－ＢＴＬＣおよびＡＣＰ２－ＢＴＬＣをそれぞれ細胞に３時間処理した後、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。洗浄した細胞を３．７％ホルムアルデヒドで２０分間固定させ、０．２％トリトンＸ－１００（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）が含まれたＰＢＳを処理して細胞膜透過性を増加させた。次に、細胞に３％ＢＳＡを処理して１時間ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）させ、Ｈｉｓ抗体（ａｂｃａｍ、ａｂ９１０８）と常温で２時間反応させた後、ＰＢＳで３回洗浄した。洗浄後、Ａｌｅｘａ４８８およびＡｌｅｘａ５６８二次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を処理して常温で１時間反応させ、ＰＢＳで２回洗浄した後、ＤＡＰＩ（４’，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌ）で１０分間染色した。細胞の付着したガラスを切り離してスライドガラス上に載せ、共焦点レーザ走査顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ；ＬＳＭ７００、Ｚｅｉｓｓ、ドイツ）で観察した。
その結果、図１のＡ～Ｃに示すように、ＢＴＬＣ単独ではＨｅＬａ、Ｕ８７－ＭＧおよびＰＣ－１２細胞をほとんど透過できないが、ＡＣＰ－ＢＴＬＣは細胞透過性が著しく優れていることを確認することができた。
また、図２のＡ～Ｃに示すように、ＡＣＰ２－ＢＴＬＣも、すべての細胞において対照群より細胞透過性が著しく優れていることが分かった。図３では、ＢＴＬＣ単独よりも、ＡＣＰ－ＢＴＬＣ、ＡＣＰ１－ＢＴＬＣおよびＡＣＰ２－ＢＴＬＣの細胞透過性が優れていることを確認することができた。図３にて比較群として用いたｂｏｔｏｘは、商業的に販売される製品であるＯｎａｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｏｘｉｎ Ａ（Ａｌｌｅｒｇｅｎ、米国）である。
２－２．マウス皮膚組織透過の有無の確認
６ウェルプレートにガーゼ（ｇａｕｚｅ）を敷いて、ＲＰＭＩ培地を３ｍｌずつ入れた。無毛マウス（（株）オリエントバイオ：大韓民国）から分離した０．５ｃｍ×０．５ｃｍサイズの皮膚組織をガーゼ上にそっと載せ、マウス皮膚組織上にワットマン紙（Ｗｈａｔｍａｎ ｐａｐｅｒ）を載せた。以後、ＢＴＬＣまたはＡＣＰ－ＢＴＬＣを濃度ごとにワットマン紙に処理し、１２時間反応させた。マウス皮膚組織を４％パラホルムアルデヒドで１時間固定し、皮膚組織が沈むまで３０％スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）に浸しておいた。ＯＣＴコンパウンド（ＯＣＴ ｃｏｍｐｏｕｎｄ：Ｌｅｉｃａ、ドイツ）で皮膚組織を冷凍し、冷凍切片機で皮膚組織切片スライドを作製した。スライドをＨｉｓ抗体およびＢＴＬＣ抗体で染色し、ＤＡＰＩで１０分間染色した後、共焦点レーザ走査顕微鏡で観察した。
その結果、図４のＡおよびＢに示すように、ＢＴＬＣを処理した場合、皮膚組織の表面でのみ蛍光信号が弱く観察されて皮膚組織にほとんど浸透できないことが分かった。これに対し、ＡＣＰ１－ＢＴＬＣを処理した場合、皮膚組織の真皮層でまで蛍光信号が強く現れて皮膚組織に深く浸透したことを確認することができた。
２－３．ＳＮＡＰ２５タンパク質切断の有無の確認
ＳＮＡＰ２５（Ｓｙｎａｐｔｏｓｏｍａｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ２５）はスネア複合体（ＳＮＡＲＥ ｃｏｍｐｌｅｘ）の構成要素の１つであり、スネア複合体はアセチルコリン信号伝達に関与して筋肉を動かす。ＢＴＬＣは神経末端の内部に流入した後、ＳＮＡＰ２５を切断することにより筋肉の動きを遮断することが知られている。したがって、細胞透過ペプチド－ボツリヌス毒素融合タンパク質がＳＮＡＰ２５を切断するかを確認した。
ＳＮＡＰ２５（Ｎｏｖｕｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、米国）１μｇとＢＴＬＣ、ＡＣＰ－ＢＴＬＣ、ＡＣＰ１－ＢＴＬＣおよびＡＣＰ２－ＢＴＬＣを濃度ごとに１．５ｍｌのマイクロチューブに入れて、サンプルの最終体積が３０μｌとなるように反応バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＤＴＴおよび２５０μＭ ＺＡＣＰｌ２）を添加した。以後、３７℃で２４時間反応させ、ＳＤＳサンプルバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％ＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ）、１０％グリセロール、１％β－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、１２．５ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．０２％ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ ｂｌｕｅ）を添加して反応を終結させた。ＳＮＡＰ２５切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）の有無はウェスタンブロットで確認した。
確認の結果、図５のＡに示すように、ＡＣＰ－ＢＴＬＣまたはＢＴＬＣ－ＡＣＰによってＳＮＡＰ２５（２８ｋＤａ）が切断されることが分かった。また、図５のＢおよびＣに示すように、ＡＣＰ２－ＢＴＬＣ、ＢＴＬＣおよびＡＣＰ１－ＢＴＬＣもＳＮＡＰ２５を切断することを確認することができた。
２－４．形質注入方法によるＳＮＡＰ２５切断の有無の確認
細胞透過ペプチド－ボツリヌス毒素融合タンパク質がＳＮＡＰ２５を切断するかを形質注入方法により確認した。
具体的には、２－１と同様の方法で培養したＰＣ－１２細胞を６ウェルプレートに３×１０５細胞／ウェル（ｗｅｌｌ）の密度で分注して２４時間培養した。培養後、製造会社のプロトコルに従ってＭＥＴＡＦＥＣＴＥＮＥ ＰＲＯ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｂｉｏｎｔｅｘ、ドイツ）を用いて、ｐＴｒｉＥｘ ＢＴＬＣ、ｐＴｒｉＥｘ ＡＣＰ－ＢＴＬＣ、ｐＴｒｉＥＸ ＡＣＰ１－ＢＴＬＣおよびｐＴｒｉＥｘ ＡＣＰ２－ＢＴＬＣの組換えベクターＤＮＡ３μｇをそれぞれ前記細胞に形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。以後、２４時間追加的に培養した。
培養した細胞をＰＢＳで洗浄し、スクレーパ（ｓｃｒａｐｅｒ）で細胞をプレートから分離した。分離した細胞にＲＩＰＡバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＥＧＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．１％ｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、０．１％ＳＤＳ、１４０ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＰＭＳＦ）を添加して細胞を溶解させ、氷に２０分間放置した。以後、４℃で遠心分離（１４，０００ｒｐｍ、２０分）して細胞残骸を除去し、細胞溶解物（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）である上澄液のみ回収した。分離された細胞溶解物のタンパク質の濃度をＱｕｉｃｋ ＳｔａｒｔＴＭ Ｂｒａｄｆｏｒｄ １ｘ Ｄｙｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、米国）で測定し、タンパク質２０μｇを１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ－ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）で分離した。分離されたタンパク質をＰＶＤＦ膜（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）に移動させた後、ＰＶＤＦ膜を５％脱脂乳（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）でブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した。ＰＶＤＦ膜を一次抗体（ＡＣＰ、ＨｉｓおよびＡｃｔｉｎ抗体）と４℃で１６時間反応させた後に洗浄し、二次抗体を常温で１時間反応させた。以後、ＥＣＬ（ＰｉｅｒｃｅＴＭ ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＴＭ、米国）を用いて製造会社のプロトコルに従ってタンパク質バンドを検出した。タンパク質バンドの検出のために、ＡｍｅｒｓｈａｍＴＭ Ｉｍａｇｅｒ６００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、米国）を用いた。
確認の結果、図６に示すように、ＢＴＬＣ、ＡＣＰ－ＢＴＬＣ、ＡＣＰ１－ＢＴＬＣおよびＡＣＰ２－ＢＴＬＣによってＰＣ－１２細胞で発現したＳＮＡＰ２５（２８ｋＤａ）が切断されたことを確認することができた。
本実験の結果は、細胞透過ペプチドとボツリヌス毒素の融合タンパク質がボツリヌス毒素自体の活性を維持することを意味する。
２－５．細胞透過によるＳＮＡＰ２５切断の有無の確認
細胞透過ペプチド－ボツリヌス毒素融合タンパク質が細胞透過後にもＳＮＡＰ２５の切断活性を維持するかを確認した。
具体的には、２－１と同様の方法で培養したＰＣ－１２細胞を６ウェルプレートに３×１０５細胞／ウェル（ｗｅｌｌ）の密度で分注して２４時間培養した。以後、実施例１－４で精製したＢＴＬＣ、ＡＣＰ－ＢＴＬＣ、ＢＴＬＣ－ＡＣＰ、ＡＣＰ１－ＢＴＬＣおよびＡＣＰ２－ＢＴＬＣをそれぞれ細胞に２４時間処理した後、ＰＢＳで洗浄した。２－４の方法で細胞からタンパク質を回収した後、濃度をＱｕｉｃｋ ＳｔａｒｔＴＭ Ｂｒａｄｆｏｒｄ １ｘ Ｄｙｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、米国）で測定した。タンパク質２０μｇを１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ－ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）で分離した。分離されたタンパク質を２－４と同様の方法でＰＶＤＦ膜（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）に移動させて、ＥＣＬ（ＰｉｅｒｃｅＴＭ ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＴＭ、米国）を用いてタンパク質バンドを検出した。タンパク質バンドの検出のために、ＡｍｅｒｓｈａｍＴＭ Ｉｍａｇｅｒ６００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、米国）を用いた。
確認の結果、図７に示すように、ＢＴＬＣ、ＡＣＰ－ＢＴＬＣ、ＢＴＬＣ－ＡＣＰ、ＡＣＰ１－ＢＴＬＣおよびＡＣＰ２－ＢＴＬＣがＰＣ－１２細胞で発現したＳＮＡＰ２５（２８ｋＤａ）を切断することを確認することができた。
本実験の結果は、細胞透過ペプチドとボツリヌス毒素の融合タンパク質が細胞透過後にもボツリヌス毒素自体の活性を維持することを意味する。
実施例３：細胞透過ペプチドと上皮細胞成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＥＧＦ）融合タンパク質の特性の確認
３－１．上皮細胞成長因子の合成
上皮細胞成長因子はＣｈｅｍｐｅｐｔｉｄｅ（上海、中国）でＦＭＯＣ固体－相方法（ＦＭＯＣ ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ ｍｅｔｈｏｄ）で合成した。合成されたペプチドはＣ１８分析用ＲＰカラム（Ｓｈｉｓｅｉｄｏ ｃａｐｃｅｌｌ ｐａｋ）を用いた逆相高速液体クロマトグラフィー（ｒｅｖｅｒｓｅ－ｐｈａｓｅ ＨＰＬＣ、ＨＰＬＣ－２０ＡＰ、日本）で精製および分析し、質量分析器（ＳＨＩＭＡＤＺＵ ＬＣＭＳ－２０１０ＥＶ、日本）を用いて同定した。
細胞透過ペプチドとして用いたＡＣＰ２は上皮細胞成長因子のＮ－末端に結合して用いた。
３－２．細胞透過性の確認
実施例２－１と同様の方法でＦＩＴＣ－ＡＣＰ２またはＦＩＴＣ－ＡＣＰ２－ＥＧＦを濃度ごとにＨｅＬａ細胞に処理し、細胞を固定させた後、Ｃｙ３二次抗体と反応させた。ＨｅＬａ細胞の付着したガラスを切り離してスライドガラス上に載せ、共焦点レーザ走査顕微鏡で観察した。
その結果、図８に示すように、処理濃度に比例してＦＩＴＣ－ＡＣＰ２－ＥＧＦが細胞膜を透過して細胞内に流入することを確認することができた。
３－３．マウス皮膚組織透過の有無の確認
実施例２－２と同様の方法でマウス皮膚組織にＥＧＦ（対照群）またはＦＩＴＣ－ＡＣＰ２－ＥＧＦを処理した後、透過の有無を共焦点レーザ走査顕微鏡で観察した。
その結果、図９に示すように、対照群では蛍光信号を確認できず、ＥＧＦ単独タンパク質は皮膚組織にほとんど浸透できないことが分かった。これに対し、ＦＩＴＣ－ＡＣＰ２－ＥＧＦを処理した場合、濃度依存的に皮膚組織の真皮層でまで蛍光信号が強く現れて皮膚組織に深く浸透したことを確認することができた。
３－４．細胞移動性増加の有無の確認
Ａ４３１細胞を１０％ＦＢＳおよび１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンが追加されたＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ、米国）で培養した。培養したＡ４３１細胞を１×１０５細胞／ウェルの密度でガラス入りの２４－ウェルプレートに分注した後、２４時間培養した。チップを用いて底に単一層として付いている（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）細胞を引っ掻いた後、培養培地を５％ＦＢＳおよび１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンが含有された培地に入れ替えた。ＡＣＰ２－ＥＧＦをそれぞれ１、５、１０および１００ｎＭの濃度（１１．１３２、５５．６６、１１１．３２および１１１３．２ｎｇ／ｍｌ）で処理し、陽性対照群（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）には組換えヒトＥＧＦ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＥＧＦ）を５０ｎｇ／ｍｌ処理した。細胞を１８時間追加的に培養した後、顕微鏡で細胞の移動性を確認した。
確認の結果、図１０に示すように、ＡＣＰ２－ＥＧＦを１ｎＭ（１１．１３２ｎｇ／ｍｌ）の濃度で処理した場合、陽性対照群（ＥＧＦ５０ｎｇ／ｍｌ）と類似水準の細胞移動性が現れ、５ｎＭ（５５．６６ｎｇ／ｍｌ）処理した場合、陽性対照群より優れた細胞移動性を示すことを確認することができた。
実施例４：細胞透過ペプチドとヘキサペプチド融合タンパク質の特性の確認
４－１．ヘキサペプチドの合成
ヘキサペプチドはＣｈｅｍｐｅｐｔｉｄｅ（上海、中国）で実施例３－１と同様の方法で合成して分離および精製した。細胞透過ペプチドとして用いたＡＣＰ２はヘキサペプチドのＮ－末端に結合して用いた。
４－２．細胞透過性の確認
実施例２－１と同様の方法でＦＩＴＣ－ヘキサペプチド（ｈｅｘａｐｅｐｔｉｄｅ）またはＦＩＴＣ－ＡＣＰ２－ヘキサペプチドを濃度ごとにＨｅＬａ細胞に処理し、細胞を固定させた後、Ｃｙ３二次抗体と反応させた。ＨｅＬａ細胞の付着したガラスを切り離してスライドガラス上に載せ、共焦点レーザ走査顕微鏡で観察した。
その結果、図１１に示すように、ＦＩＴＣ－ヘキサペプチドは細胞をほとんど透過できないが、ＦＩＴＣ－ＡＣＰ２－ヘキサペプチドを処理した場合、蛍光信号が強く現れることを確認して細胞透過性が著しく優れていることが分かった。
４－３．マウス皮膚組織透過の有無の確認
実施例２－２と同様の方法でマウス皮膚組織にＦＩＴＣ－ヘキサペプチドまたはＦＩＴＣ－ＡＣＰ２－ヘキサペプチドを濃度ごとに処理した後、透過の有無を共焦点レーザ走査顕微鏡で観察した。
その結果、図１２に示すように、ＦＩＴＣ－ヘキサペプチドは皮膚組織の表面でのみ蛍光信号が弱く観察されて皮膚組織にほとんど浸透できないことが分かった。これに対し、ＦＩＴＣ－ＡＣＰ２－ヘキサペプチドを処理した場合、皮膚組織の真皮層でまで蛍光信号が強く現れて皮膚組織に深く浸透したことを確認することができた。
実施例５：細胞透過ペプチドと上皮細胞成長因子の混合物の細胞透過活性の確認
５－１．細胞透過ペプチドと上皮細胞成長因子の混合物のＨｅＬａ細胞透過性の確認
ＨｅＬａ細胞を１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）および１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンが追加されたＤＭＥＭ培地で３７℃、５％ＣＯ２の加湿恒温器で培養した。培養した細胞をガラス入りの１２ウェルプレートに１×１０５細胞／ウェル（ｗｅｌｌ）の密度で分注して２４時間培養した。以後、ＦＩＴＣ－ＥＧＦとＡＣＰを常温で３０分間混合し、細胞に２０時間処理した後、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。洗浄した細胞を３．７％ホルムアルデヒドで２０分間固定させ、ＰＢＳで２回洗浄した後、ＤＡＰＩ（４’，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌ）で１０分間染色した。細胞の付着したガラスを切り離してスライドガラス上に載せ、共焦点レーザ走査顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ；ＬＳＭ７００、Ｚｅｉｓｓ、ドイツ）で観察した。
その結果、単独ＥＧＦでは細胞透過活性が現れなかったが、ＥＧＦとＡＣＰの混合物では細胞透過されたＥＧＦを確認することができた（図１３）。
５－２．細胞透過ペプチドと上皮細胞成長因子の混合物のマウス皮膚組織の透過性の確認
６ウェルプレートにガーゼ（ｇａｕｚｅ）を敷いて、ＲＰＭＩ培地を３ｍｌずつ入れた。無毛マウス（（株）オリエントバイオ：大韓民国）から分離した０．５ｃｍ×０．５ｃｍサイズの皮膚組織をガーゼ上にそっと載せ、マウス皮膚組織上にワットマン紙（Ｗｈａｔｍａｎ ｐａｐｅｒ）を載せた。以後、ＦＩＴＣ－ＥＧＦまたはＦＩＴＣ－ＥＧＦとＡＣＰ混合物を濃度ごとにワットマン紙に処理し、１２時間反応させた。マウス皮膚組織を４％パラホルムアルデヒドで１時間固定し、皮膚組織が沈むまで３０％スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）に浸しておいた。ＯＣＴコンパウンド（ＯＣＴ ｃｏｍｐｏｕｎｄ：Ｌｅｉｃａ、ドイツ）で皮膚組織を冷凍し、冷凍切片機で皮膚組織切片スライドを作製した。スライドをＤＡＰＩで１０分間染色した後、共焦点レーザ走査顕微鏡で観察した。
その結果、ＥＧＦ単独はマウスの皮膚組織を透過できなかったが、ＥＧＦとＡＣＰの混合物ではＡＣＰの濃度依存的にＥＧＦがマウスの皮膚組織を透過したことを確認することができた（図１４）。
５－３．細胞透過ペプチドと上皮細胞成長因子の混合物のミニブタ皮膚組織の透過性の確認
Ｍｉｃｒｏｐｉｇ Ｆｒａｎｚ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ（２．５ｃｍ×２．５ｃｍ、４００ｍＭ、Ｈ４２６－２２、メディキネティクス）を、角質層を上に向かせてＦｒａｎｚ ｃｅｌｌドナーチャンバとレセプターチャンバとの間に固定した後、レセプターチャンバに生理食塩水を満たした。以後、ＦＩＴＣ－ＥＧＦ、ＦＩＴＣ－ＥＧＦとＡＣＰの混合物、またはＦＩＴＣ－ＥＧＦとＴｒａｎｓｋｉｎの混合物をドナーチャンバに処理した後、２４時間３２℃で反応させた。ミニブタ皮膚組織を４％パラホルムアルデヒドで１時間固定し、皮膚組織が沈むまで３０％スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）に浸しておいた。ＯＣＴコンパウンド（ＯＣＴ ｃｏｍｐｏｕｎｄ：Ｌｅｉｃａ、ドイツ）で皮膚組織を冷凍し、冷凍切片機で皮膚組織切片スライドを作製した。スライドをＤＡＰＩで１０分間染色した後、共焦点レーザ走査顕微鏡で観察した。
その結果、ＥＧＦとＡＣＰの混合物で皮膚透過活性を確認し、同じ濃度（１００μｇ）のＴｒａｎｓｋｉｎ混合物と比較した時、ＡＣＰ混合物では皮膚透過が確認されたのに対し、Ｔｒａｎｓｋｉｎ では皮膚透過が確認されず、ＡＣＰ混合物が著しい皮膚透過効果を示すことを確認することができた（図１５）。
５－４．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ ａｓｓａｙにおける、細胞透過ペプチドと上皮細胞成長因子の混合物の細胞移動性の増加の確認
Ａ４３１細胞を１０％ＦＢＳおよび１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンが追加されたＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ、米国）で培養した。培養したＡ４３１細胞を１×１０５細胞／ウェルの密度でガラス入りの２４－ウェルプレートに分注した後、２４時間培養した。チップを用いて底に単一層として付いている（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）細胞を引っ掻いた後、培養培地を５％ＦＢＳおよび１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンが含有された培地に入れ替えた。ＥＧＦの濃度を５０ｎｇに固定し、ＡＣＰまたはＡＣＰ２の濃度をそれぞれ５ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭにしてＥＧＦと混合して処理し、陽性対照群（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）には組換えヒトＥＧＦ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＥＧＦ）を５０ｎｇ／ｍｌ処理した。その後、細胞を１８時間追加的に培養した後、顕微鏡で細胞の移動性を確認した。
その結果、組換えヒトＥＧＦとＡＣＰまたはＡＣＰ２を混合した時、陽性対照群（ＥＧＦ５０ｎｇ／ｍｌ）対比、著しい細胞移動性を示すことを確認することができた（図１６）。
これまで本発明についてその実施例を中心に説明した。本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明が本発明の本質的な特性を逸脱しない範囲で変形された形態で実現できることを理解するであろう。そのため、開示された実施例は、限定的な観点ではなく説明的な観点で考慮されなければならない。本発明の範囲は、上述した説明ではなく請求の範囲に示されており、それと同等範囲内にあるすべての相違点は本発明に含まれていると解釈されなければならない。

Claims (9)

  1. 皮膚生理活性分子；および
    配列番号１～３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む細胞透過ペプチドを含み、
    前記皮膚生理活性分子は、配列番号４～６からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列に記載のポリペプチドである融合タンパク質。
  2. 請求項１に記載の融合タンパク質をコーディングするポリヌクレオチド。
  3. 請求項２に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
  4. 請求項３に記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
  5. 下記のステップを含む融合タンパク質を生産する方法：
    （ａ）請求項４に記載の宿主細胞を培養培地で培養するステップ；および
    （ｂ）培養培地から融合タンパク質を回収するステップ。
  6. 請求項１に記載の融合タンパク質；または
    配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなる細胞透過ペプチド、および配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチド
    を有効成分として含む皮膚改善用化粧料組成物。
  7. 前記化粧料組成物は、エマルジョン、クリーム、エッセンス、スキン、リポソーム、マイクロカプセル、複合粒子、シャンプーおよびリンスからなる群より選択される剤形である、請求項６に記載の化粧料組成物。
  8. 請求項１に記載の融合タンパク質；または
    配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなる細胞透過ペプチド、および配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチド
    を有効成分として含むシワ改善、筋肉緊張緩和または皮膚の傷治療用薬学的組成物。
  9. シワ改善、筋肉緊張緩和または皮膚の傷の治療のための薬剤の製造における、
    請求項１に記載の融合タンパク質；または
    配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなる細胞透過ペプチド、および配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチドの使用。
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