KR20130027078A - 생체막 투과성 조성물 - Google Patents

생체막 투과성 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20130027078A
KR20130027078A KR1020120093838A KR20120093838A KR20130027078A KR 20130027078 A KR20130027078 A KR 20130027078A KR 1020120093838 A KR1020120093838 A KR 1020120093838A KR 20120093838 A KR20120093838 A KR 20120093838A KR 20130027078 A KR20130027078 A KR 20130027078A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
molecular weight
low molecular
amino acid
growth factor
weight protamine
Prior art date
Application number
KR1020120093838A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101417328B1 (ko
Inventor
장지혜
김재관
박진우
배준호
Original Assignee
(주)아모레퍼시픽
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by (주)아모레퍼시픽 filed Critical (주)아모레퍼시픽
Priority to PCT/KR2012/006868 priority Critical patent/WO2013032210A2/ko
Publication of KR20130027078A publication Critical patent/KR20130027078A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101417328B1 publication Critical patent/KR101417328B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 운반 대상 물질; 및 운반 대상 물질의 한쪽 또는 양쪽 말단에 결합된 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 저분자량 프로타민을 포함하는 생체막 투과성 조성물을 개시한다.

Description

생체막 투과성 조성물{Biomembrane Permeable Composition}
본 발명은 저분자량 프로타민을 포함하는 생체막 투과성 조성물에 관한 것이다.
피부 조직은 표피, 진피 및 피하(hypodermis)로 이루어져 있다. 피부는 나이가 들어감에 따라 그 기능이 급격하게 저하되며 노화가 일어난다. 노화에 따른 피부의 대표적인 변화로 진피 내에 있는 콜라겐 섬유의 감소 및 변형으로 인한 주름 생성과 엘라스틴으로 구성된 탄력 섬유의 변성으로 인한 피부 탄력 감소를 들 수 있다. 이러한 주름 생성 및 피부 탄력 감소를 예방 및 개선하기 위해 피부 내 콜라겐과 엘라스틴의 합성 촉진 및 붕괴 방지를 위한 연구가 진행되고 있다.
최근 이러한 연구의 성과로 제시된 것이 성장 인자 펩티드이다. 피부 노화의 가장 큰 원인으로 젊은 피부에서는 활성화되어 있는 성장 인자(growth factor)의 감소를 들 수 있다. 성장 인자는 피부 속 재생 과정의 스위치 역할을 하므로 피부 속 성장 인자의 감소는 피부 기능 저하를 유발해 피부 내 여러 성분들의 손실과 피부 구조 붕괴를 유발한다. 이에 콜라겐, 엘라스틴, 혹은 이들의 성장 인자 등과 같은 생물학적 활성 물질을 배합한 조성물을 피부에 적용하여 피부 노화를 방지하려는 시도가 있으나, 이들은 피부 도포를 통해 효율적으로 전달될 수 있는 분자량 한계인 400~500 달톤을 훨씬 넘는 분자량을 가지고, 친수성이어서 피부 도포를 통한 흡수율이 높지 않으며, 선택적으로 성장 호르몬 분비를 자극할 수 있는 활성을 유지하기 어렵다는 점 때문에 그 적용이 용이하지 않았다. 따라서 세포 손상 없이 생물학적 활성을 지닌 거대 물질을 생체 내부 및 외부에서 세포 내로 효과적으로 전달하는 방법이 필요하다.
이러한 필요에 대한 연구의 결과로, 세포 투과성을 갖는 펩티드가 고안되었다. 재조합 단백질, 신호 펩티드, 막 횡단 도메인 또는 항 미생물 펩티드와 같은 막-상호작용(membrane-interacting) 단백질 서열로부터 많은 세포 투과성 펩티드들이 고안되었는데, 이러한 세포 투과성 펩티드들 중에서 단백질 전달 도메인(protein transduction domains, PTDs)이라고 불리는 서열을 가지는 펩티드가 생체막을 효과적으로 투과하고, 펩티드 또는 단백질을 세포 내로 효과적으로 전달한다고 알려진 바 있다. 단백질 전달 도메인에 의한 세포 내 전달은 효율적이며, 세포막을 교란시키거나 손상시키지 않고 수행될 수 있다. 게다가 단백질 전달 도메인에 의한 세포막 투과는 수용체 및 전달체에 영향을 받지 않고 수행되기 때문에 생물학적 활성 물질의 세포 내 전달을 위한 보편적 캐리어로서 기능할 수 있다. 그러나 이러한 장점에도 불구하고 단백질 전달 도메인은 첫째, 대부분 매우 전염성이 높은 바이러스성 단백질로부터 유래하기 때문에 독성과 면역 원성을 지니고, 둘째, 단백질 전달 도메인을 합성하고자 하는 경우 비용과 시간이 상당히 소요된다는 2가지 큰 단점이 있다. 따라서 생산 효율 및 안전성을 개선시키고자 무해한 비 바이러스성(non-virulent) 소스로부터 단백질 전달 도메인을 효과적으로 얻어야 한다는 과제가 존재하였다.
이에, 비 바이러스성(non-virulent) 소스로부터 얻은 단백질 전달 도메인이 연구되었으며, 그 대표적인 예로 파지 디스플레이(Phage display)에서 얻은 TD-1과 아프리카 발톱 개구리의 피부에서 얻은 마가이닌(magainin)을 들 수 있다. 이들은 비 바이러스성 소스로부터 얻었기 때문에 독성과 면역 원성에서부터 자유로우며, 물리적인 혼합만으로도 생물학적 활성 물질을 세포 내로 전달할 수 있다는 장점을 가지나, 바이러스성 단백질 전달 도메인 대비 전달 효율이 심각하게 낮다는 단점 또한 가지고 있다.
이러한 문제를 해결하고자, 비 바이러스성 소스로부터 얻은 것이면서도, 생물학적 활성 물질의 전달 효율은 바이러스성 단백질 전달 도메인에 비해 낮지 않은, 저분자량 프로타민(Low Moleculre Weight Protamine, LMWP)으로부터 파생된 무해한 전달 도메인이 개발되었다. 이는 기존의 단백질 전달 도메인에 비해 생산이 용이하고, 확실한 면역 프로파일이 존재하며, FDA에서 인증 받아 헤파린의 중화제로 쓰이는 프로타민에서 수득될 수 있으므로 안전성이 뛰어나다는 점에서 유리하다. 그러나 상기의 저분자량 프로타민 또한 프로타민으로부터 저분자량 프로타민을 얻는 과정 및 세포 내로 전달하고자 하는 생물학적 활성 물질과 화학적으로 연결하는 과정의 생산 효율이 낮고, 그 과정에서 생물학적 활성 물질의 활성이 감소될 수 있으며, 생물학적 활성 물질의 아미노산 배열 중 저분자량 프로타민의 화학적 결합 위치를 정확히 제어할 수 없다는 단점이 있다.
한국특허공개 제10-2011-0013365호(2011.02.09.) 명세서 한국특허공개 제10-2009-0103957호(2009.10.01.) 명세서 미국등록특허 제7,329,638호(2008.02.12.) 명세서 미국등록특허 제6,316,003호(2001.11.13.) 명세서 미국등록특허 제7,148,324호(2006.12.12.) 명세서 미국등록특허 제6,025,140호(2000.02.15.) 명세서 미국등록특허 제6,017,735호(2000.01.25.) 명세서 미국특허공개 제2007-0071677호(2007.03.29.) 명세서
본 발명의 일측면은 운반 대상 물질 및 그의 한쪽 또는 양쪽 말단에 결합된 저분자량 프로타민을 포함하여, 우수한 생체막 투과성으로 인한 극대화된 효능을 가지는 조성물을 제공하고자 한다. 본 발명의 일측면은 운반 대상 물질 및 그의 한쪽 또는 양쪽 말단에 결합된 저분자량 프로타민을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하고자 한다. 본 발명의 또 다른 일측면은 운반 대상 물질 포함하는 조성물을, 운반 대상 물질 본래의 활성은 유지하면서 높은 수율로 제조할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 일측면은 운반 대상 물질; 및 운반 대상 물질의 한쪽 또는 양쪽 말단에 결합하고, 서열 번호 1 및 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열 중 하나 이상과 70% 이상 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 저분자량 프로타민(low molecular weight protamine)을 포함하는 생체막 투과성 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 일측면은 운반 대상 물질; 및 운반 대상 물질의 한쪽 또는 양쪽 말단에 결합하고, 서열 번호 1 및 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열 중 하나 이상과 70% 이상 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 저분자량 프로타민의 융합을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 일측면은 운반 대상 물질 및 운반 대상 물질의 한쪽 또는 양쪽 말단에 결합하고, 서열 번호 1 및 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열 중 하나 이상과 70% 이상 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 저분자량 프로타민(low molecular weight protamine) 융합의 발현 벡터를 제조하는 단계; 상기 단계에서 제조한 발현 벡터를 이용하여 형질 전환 세균을 생산하는 단계; 및 상기 단계에서 생산한 형질 전환 세균을 이용하여 운반 대상 물질과 저분자량 프로타민의 융합을 발현시키는 단계를 포함하는 생체 투과성 조성물 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일측면에 따른 운반 대상 물질은, 생체막 투과성이 우수하여 전달 도메인으로서 기능하는 저분자량 프로타민과 결합되어, 큰 분자량을 가지더라도 본래의 활성을 유지하면서, 생체막, 구체적으로 세포의 외막과 내막, 더 구체적으로 피부 세포의 외막과 내막을 쉽고 안전하게 투과할 수 있다. 나아가 생체 내 흡수가 향상되므로, 체내에서 기능이 극대화될 수 있다. 본 발명의 일측면에 따른 폴리뉴클레오티드는 운반 대상 물질과 그 한쪽 또는 양쪽 말단에 결합된 저분자량 프로타민을 코딩하여, 용이하고 효율적으로 운반 대상 물질과 그 한쪽 또는 양쪽 말단에 결합된 저분자량 프로타민을 대량 생산할 수 있도록 한다.
본 발명의 일측면에 따른 제조 방법은 간편하면서도 높은 수율로 활성이 높은 운반 대상 물질과 그 한쪽 또는 양쪽 말단에 결합된 저분자량 프로타민을 포함하는 조성물을 제조할 수 있으며, 저분자량 프로타민을 운반 대상 물질의 표적 위치에 효과적으로 결합시킬 수 있다.
도 1은 섬유아세포에서의 운반 대상 물질과 저분자량 프로타민 융합의 세포 증식 활성을 다른 시험 물질과 대비한 그래프이다.
도 2는 인공 피부 조직에서의 운반 대상 물질과 저분자량 프로타민 융합의 경피 투과성을 다른 시험 물질과 대비한 그래프이다.
도 3은 헤어리스 마우스 피부 조직에서의 운반 대상 물질과 저분자량 프로타민 융합의 경피 투과성을 다른 시험 물질과 대비한 그래프이다.
도 4는 헤어리스 마우스의 피부 전층 상처 모델에서의 운반 대상 물질과 저분자량 프로타민 융합의 상처 치유 촉진 효능을 다른 시험 물질과 대비한 그래프이다.
도 5는 헤어리스 마우스의 피부 전층 상처 모델에서의 운반 대상 물질과 저분자량 프로타민 융합의 상처 치유 촉진 효능을 다른 시험 물질과 대비한 사진이다.
본 발명자들은 운반 대상 물질이 높은 분자량을 가지더라도, 우수한 생체막 투과성 및 경피 투과성을 부여하여 세포 내로 용이하게 전달시키고자 연구를 거듭한 결과, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일측면은 운반 대상 물질; 및 운반 대상 물질의 한쪽 또는 양쪽 말단에 결합하고, 서열 번호 1 및 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열 중 하나 이상과 70% 이상 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 저분자량 프로타민(low molecular weight protamine)을 포함하는 생체막 투과성 조성물을 제공한다. 운반 대상 물질은 서열 번호 1 및 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열 중 하나 이상과 70% 이상 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 저분자량 프로타민이 운반 대상 물질의 한쪽 또는 양쪽 말단에 결합됨으로써, 생체 투과성이 높아져 생체막 또는 세포막을 용이하게 투과할 수 있다. 이와 같은 우수한 효과는 운반 대상 물질과 저분자량 프로타민 융합에 대한 인공 피부 조직과 동물 피부 조직을 이용한 경피 투과성 평가를 통해 증명되었다. 말단에 저분자량 프로타민이 결합된 운반 대상 물질은 효과적으로 세포 내로 전달될 수 있으므로, 보다 적은 양을 대상에게 적용하는 경우에도 우수한 생체 내 효과를 발휘할 수 있어 극대화된 효능 발휘가 가능하다. 특히 운반 대상 물질이 생체 내에서 약리학적 효과를 발휘하는 물질인 경우 적은 양의 적용으로도 동일한 약리학적 효과를 발휘할 수 있을 뿐만 아니라 다량 적용에 의한 대상의 부작용을 감소시킬 수 있으므로 바람직하다.
본 발명의 일측면에서, 서열 번호 1 및 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열 중 하나 이상과 70% 이상 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 저분자량 프로타민은 운반 대상 물질의 한쪽 또는 양쪽 말단에 유전자 재조합과 같은 분자 생물학적 방법으로 결합될 수 있다. 구체적으로, 운반 대상 물질을 코딩하는 유전자 염기 서열 한쪽 또는 양쪽 말단에 저분자량 프로타민을 코딩하는 유전자 염기 서열을 결합시킨 후, 이 유전자 염기 서열 결합을 발현시켜 운반 대상 물질과 그 말단에 저분자량 프로타민이 결합된 운반 대상 물질과 저분자량 프로타민의 융합을 수득할 수 있다. 본 발명의 일측면에서, 저분자량 프로타민은 운반 대상 물질을 생체 내로 효과적으로 운반하는 역할을 하므로, 운반 대상 물질과 저분자량 프로타민의 융합은 "재조합(recombinant) 운반 대상 물질"로 나타낼 수 있으며, 운반 대상 물질의 본래의 효과를 그대로 유지할 수 있고, 나아가 그 효과를 최대한 발휘할 수 있다.
본 명세서에서, "운반 대상(cargo) 물질"은 저분자량 프로타민과 결합하여 생체막을 투과할 수 있는 물질을 모두 포함하며, 예를 들어 생체막 또는 세포막 투과 효율을 높이길 원하는 물질, 구체적으로 약품, 화장품 또는 건강 식품의 유효 물질, 더 구체적으로 일반적인 경로를 통해서는 생체막 또는 세포막 내로 이동이 용이하지 않은 물질, 보다 더 구체적으로 단백질, DNA 또는 RNA와 같은 생물학적 활성 물질을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, "생물학적 활성 물질"은 체내에서 생물학적 반응을 촉진하거나 변형 등을 함으로써 그에 관여하는 물질을 의미하며, 저분자량 프로타민과 유전자 재조합으로 결합될 수 있는 물질을 포함한다. 상기 "생물학적 반응"은 체내에서 일어나는 각종 생리 반응을 포함한다. 본 발명의 일측면에서, 생물학적 활성 물질은 분자량이 큰 물질일 수 있으며, 구체적으로 1,000 내지 1,000,000, 더 구체적으로 3,000 내지 500,000, 보다 더 구체적으로 5,000 내지 250,000의 분자량을 가질 수 있다.
본 발명의 일측면에서, 운반 대상 물질은 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 핵산, mRNA 및 안티센스 RNA로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 다른 일측면에서, 단백질은 DKK-2(Dickkopf-related protein 2), 아디포카인(adipokine), 트롬보스폰딘(thrombospondin) 및 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(Superoxide dismutase)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 일측면에서, 운반 대상 물질은 성장 인자, 효소, 호르몬, 전사 인자, 독소, 항원 및 항체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함한다.
본 명세서에서, "성장 인자"는 세포 분열, 생장 및 분화를 촉진하는 폴리 펩티드를 총칭하며, 다양한 기능을 가진 다양한 종류의 성장 인자를 모두 포함한다. 본 발명의 일측면에서, 성장 인자는 상피 세포 성장 인자(Epidermal Growth Factor, EGF), 혈소판-유래 성장 인자(Platelet-Derived Growth Factor, PDGF), 혈관 내피 세포 성장 인자(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF), 섬유 아세포 성장 인자(Fibroblast Growth Factor, FGF), 인슐린 유사 성장 인자(Insulin-like Growth Factor, IGF), 신경 성장 인자(Nerve Growth Factor, NGF) 및 TGF-α 또는 TGF-β를 포함하는 형질 전환 성장 인자(Transforming Growth Factor, TGF)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, "효소"는 각종 화학 반응에서 자신은 변하지 않으나 반응을 빠르게 하는 단백질성 물질을 의미한다. "호르몬"은 체액에 의하여 체내의 표적 기관까지 운반되어 그 기관의 활동이나 생리적 과정에 특정한 영향을 미치는 화학 물질을 의미하며, 일반적으로 체내에서 생성된다. "전사 인자"는 특정 유전자의 전사 조절 부위 DNA에 특이적으로 결합하여 그 유전자의 전사를 활성화시키거나 억제하는 전사 조절 단백질을 의미한다. "독소"는 체내에서 유독성을 나타내며 항원성을 가지는 물질을 의미하며, 일반적으로 단백질 등과 같은 고분자 물질이다. "항원"은 생체에 대한 면역 반응을 유도하여 생산된 항체와 반응하는 화합물을 의미한다. "항체"는 항원과 특이적으로 결합하여 항원-항체 반응을 일으키는 화합물을 의미한다.
본 명세서에서, "프로타민(protamine)"은 척추 동물의 정자핵에 존재하는 염기성 단백질의 총칭이며, "저분자량 프로타민(Low Molecule Weight Protamine, LMWP)"은 프로타민을 효소로 소화시켜 얻은 짧은 아미노산 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 본 발명의 일측면에서, 저분자량 프로타민은 10,000 이하, 구체적으로 7,000 이하 또는 100 내지 10,000, 300 내지 7,000의 분자량을 가진 프로타민을 포함한다.
본 발명의 일측면에서, 저분자량 프로타민은 아래 표 1의 서열 번호 1 및 2의 아미노산 서열 중 하나 이상과 70% 이상, 구체적으로 80% 이상, 더 구체적으로 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 일측면에서, 서열 번호 1 및 2의 아미노산 서열 중 하나 이상과 70% 내지 100% 미만의 상동성을 가지는 아미노산 서열은 서열 번호 1 및 2의 아미노산 서열 중 하나 이상의 서열에 치환, 삽입 또는 결실과 같은 임의의 변형이 이루어진 서열 또는 서열 번호 1 및 2의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산 단편의 서열을 포함한다. 본 발명의 또 다른 일측면에서, 저분자량 프로타민은 아래 표 1의 서열 번호 1 및 2의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 명세서에서, "상동성(homology)"은 비교 대상이 되는 서열들 사이의 유사 정도 또는 동일 정도를 의미하며, 물리적 또는 화학적 특성 또는 생물학적 활성의 유사함을 의미할 수 있다.
서열 번호 1 N - Ala Ser Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg - C
서열 번호 2 N - Val Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg - C
본 명세서에서, "생체막"은 세포나 세포 소기관의 겉을 싸고 있는 막, 나아가 체내 기관의 겉을 싸고 있는 막 및 생체의 겉을 싸고 있는 막인 피부를 포함하는 광범위한 개념이다.
본 발명의 일측면에서, 운반 대상 물질; 및 운반 대상 물질의 한쪽 또는 양쪽 말단에 결합하고, 서열 번호 1 및 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열 중 하나 이상과 70% 이상 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 저분자량 프로타민을 포함하는 조성물은 운반 대상 물질의 종류에 따라 피부 탄력성 증가, 피부 주름 개선, 피부 재생, 피부 미백, 기미 감소, 혈관 신생, 모발 성장 촉진, 탈모 방지, 모낭 세포 활성화, 피부 세포 분열 촉진, 엘라스틴 또는 콜라겐 합성 증가, 상처 치유 촉진, 흉터 완화 및 홍반 억제 중 하나 이상의 작용을 할 수 있다.
본 발명의 일측면은 운반 대상 물질; 및 운반 대상 물질의 한쪽 또는 양쪽 말단에 결합하고, 서열 번호 1 및 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열 중 하나 이상과 70% 이상 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 저분자량 프로타민을 포함하는 외용제 조성물, 구체적으로 피부 외용제 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 일측면은 운반 대상 물질; 및 운반 대상 물질의 한쪽 또는 양쪽 말단에 결합하고, 서열 번호 1 및 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열 중 하나 이상과 70% 이상 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 저분자량 프로타민을 포함하는 주사제 조성물을 제공한다. 본 발명의 일측면에 따른 외용제 또는 주사제 조성물은 화장품 조성물 또는 약학 조성물을 포함한다. 본 발명의 일측면에 따른 화장품 조성물 또는 약학 조성물의 효과는 조성물이 포함하는 운반 대상 물질의 종류에 따라 다를 수 있으며, 예를 들어 운반 대상 물질이 상피 세포 성장 인자인 경우 상기 화장품 조성물 또는 약학 조성물은 피부 재생 효과, 피부 주름 개선 또는 피부 노화 억제 효과 등을 가질 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 화장품 조성물은 화장품학 또는 피부 과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 포함할 수 있다. 이는 국소 적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면, 용액, 겔, 파우더, 페이스트, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 유상에 수상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 멀티에멀젼, 현탁액, 마이크로 에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구, 이온형(리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제, 포말(foam) 또는 압축된 추진제를 함유한 에어로졸 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.
화장료 조성물은 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면 활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 더 포함할 수 있다. 상기 보조제는 화장품학 또는 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입된다.
상기 화장료 조성물은 제형이 특별히 한정되지 않으며, 목적하는 바에 따라 제형을 적절히 선택할 수 있다.　예를 들어, 화장수, 로션, 에센스, 크림, 연고, 젤, 팩 및 분무제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 약제학적 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 용액, 현탁액, 크림, 연고, 젤, 점안액, 좌제 등과 같은 다양한 투여 형태로 제형화될 수 있다. 상기 약학 조성물은 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 피하 등으로 투여될 수 있다.
상기 유효 성분의 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 본 발명에 따른 약물의 1일 투여 용량은 투여하고자 하는 대상의 질환 진행 정도, 발병 시기, 연령, 건강 상태, 합병증 등의 다양한 요인에 따라 달라지지만, 성인을 기준으로 할 때 일반적으로는 본 발명에 따른 조성물 1 내지 500mg/kg, 바람직하게는 30 내지 200 mg/kg을 1일 1 내지 2회 분할하여 투여할 수 있으며, 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
본 발명의 일측면은 하나 이상의 유효 성분을 세포 내로 전달하기 위한 전달체로서 서열 번호 1 및 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열 중 하나 이상과 70% 이상 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 저분자량 프로타민을 제공한다.
본 발명의 일측면은 운반 대상 물질; 및 운반 대상 물질의 한쪽 또는 양쪽 말단에 결합하고, 서열 번호 1 및 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열 중 하나 이상과 70% 이상 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 저분자량 프로타민의 융합을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드를 이용하여 운반 대상 물질과 그 한쪽 또는 양쪽 말단에 결합된 저분자량 프로타민을 대량 생산할 수 있다. 예컨대, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주 세포에 넣어 배양함으로써, 운반 대상 물질과 그 한쪽 또는 양쪽 말단에 결합된 저분자량 프로타민을 대량 생산할 수 있다.
본 발명의 일측면은 운반 대상 물질; 및 운반 대상 물질의 한쪽 또는 양쪽 말단에 결합하고, 서열 번호 1 및 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열 중 하나 이상과 70% 이상 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 저분자량 프로타민을 대상에게 적용하는 것을 포함하는 대상의 세포 내로 운반 대상 물질을 전달하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일측면은 운반 대상 물질;과 서열 번호 1 및 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열 중 하나 이상과 70% 이상 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 저분자량 프로타민 융합의 발현 벡터를 제조하는 단계; 상기 단계에서 제조한 발현 벡터를 이용하여 형질 전환 세균을 생산하는 단계; 및 상기 단계에서 생산한 형질 전환 세균을 이용하여 운반 대상 물질과 저분자량 프로타민의 융합을 발현시키는 단계를 포함하는 상기의 운반 대상 물질과 그 한쪽 또는 양쪽 말단에 결합된 저분자량 프로타민을 포함하는 생체 투과성 조성물 제조 방법을 제공한다. 상기 조성물 제조 방법은 간편하면서도 효율적으로 활성이 높은 운반 대상 물질과 저분자량 프로타민의 융합을 포함하는 생체 투과성 조성물을 제조할 수 있으며, 저분자량 프로타민을 운반 대상 물질의 표적 위치에 효과적으로 결합시킬 수 있다.
본 발명의 다른 일측면에 따른 조성물 제조 방법은 상기 운반 대상 물질과 저분자량 프로타민의 융합을 발현시켜 제조하는 단계 이후에 발현시킨 운반 대상 물질과 저분자량 프로타민의 융합을 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이 때, 상기 운반 대상 물질과 저분자량 프로타민의 융합을 코딩하는 염기 서열, 이러한 염기 서열을 삽입하기 위한 클로닝 벡터, 클로닝 기술을 이용하여 제조한 발현 벡터, 이 벡터로 형질 전환시켜 목적하는 운반 대상 물질과 저분자량 프로타민의 융합을 발현시키기 위한 숙주 세포, 벡터를 숙주로 형질 전환시키는 방법, 형질 전환된 숙주 세포로부터 목적하는 운반 대상 물질과 저분자량 프로타민의 융합을 발현시키는 방법 및 발현된 운반 대상 물질과 저분자량 프로타민의 융합으로부터 목적하는 운반 대상 물질과 저분자량 프로타민의 융합을 수득하는 방법 등에 대한 선택 및 전반적인 기술적 사항은 당업자라면 용이하게 인식할 수 있다.
이하, 실시예, 비교예 및 실험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예, 비교예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실시예] 인간 상피 세포 성장 인자와 저분자량 프로타민 융합의 제조
대표적인 생물학적 활성 물질인 인간 상피 세포 성장 인자에 유전자 재조합을 통해 저분자량 프로타민을 결합시켜 인간 상피 세포 성장 인자와 저분자량 프로타민의 융합을 제조하였다.
(1) 발현 벡터 제조
인간 상피 세포 성장 인자(rEGF)에 저분자량 프로타민(LMWP)(표 1의 서열번호 2: Val Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg)를 유전자 재조합을 통해 융합하기 위해 연속적인 PCR과 TOPO 클로닝을 수행하였다. 먼저, 인간 상피 세포 성장 인자 발현용 벡터를 플라스미드 정제(plasmid purification)하고 이를 템플릿(template)으로 삼아, 1차 프라이머로 포워드 프라이머(forward primer)인 5'-GGTCGTAGACGTAGAAATAGTGACTCTGAATGT-3'와 백워드 프라이머(backward primer)인 5'-TTATCAGCGCAGTTCCCACCACTT-3'를 이용하여 PCR함으로써 저분자량 프로타민의 아미노산들 중 5개의 아미노산이 부가된 1차-부분적(partial) 인간 상피 세포 성장 인자-저분자량 프로타민의 cDNA를 확보하였다. 이를 TOPO 벡터에 클로닝하였으며, 이를 다시 플라스미드 정제하고 연속적인 저분자량 프로타민의 잔여 아미노산 부가에 필요한 템플릿으로 활용하였다. 위와 실질적으로 동일한 방법으로 9개의 아미노산이 부가된 2차-부분적 인간 상피 세포 성장 인자-저분자량 프로타민의 cDNA를 확보하였으며, 이를 활용하여 저분자량 프로타민의 14 개 아미노산이 모두 부가된 완성된 인간 상피 세포 성장 인자-저분자량 프로타민의 cDNA를 확보하였다. 최종적으로 수득한 인간 상피 세포 성장 인자-저분자량 프로타민의 cDNA를 발현 벡터에 삽입하기 위하여 포워드 프라이머인 5'-CATATGGTGAGCCGTAGACGTAGACG-3'와 백워드 프라이머인 5'-CTCGAGTCATTAGCGCAGTTCCCACCACTTCAGGTCTCGGT-3'를 이용하여 PCR하였다. 이와 같이 목적 제한 효소 인식 서열들이 부가된 PCR 산물을 TOPO 벡터에 서브 클로닝(subcloning)하였다. 이 TOPO 벡터를 플라스미드 정제하여 Nde I과 Xho I으로 이중 절단(double digestion)하여 동일한 제한 효소들로 절단한 발현 벡터에 클로닝할 수 있는 삽입 DNA(insert DNA) 단편으로 가공하고 클로닝하였다. 발현 벡터를 카나마이신(Kanamycin)이 함유된 배지에서 생육한 후보 콜로니(colony)들에 대한 플라스미드 정제를 수행한 후 DNA 시퀀싱을 통해 인간 상피 세포 성장 인자 말단에 저분자량 프로타민의 14개 아미노산 서열이 정확하게 삽입되었는지를 최종 확인하였다.
(2) 발현 및 제조
상기에서 제조한 발현 벡터(pET-41b(+)-LMWP-EGF)를 E. coli 균주(BL21-DE3)로 형질 전환시킴으로써 발현 균주를 구축하였다. 이렇게 확보된 발현용 글리세롤 스톡(glycerol stock)을 이용하여 아래와 같이 발현 및 정제하였다. 발현용 글리세롤 스톡을 L-브로쓰(LB) 배양액에 접종하여 37℃, 150 rpm 조건에서 광학 밀도(O.D)가 약 1.0에 도달 할 때까지 배양하였다. 이전 배양의 광학 밀도가 1.0에 도달하면 본 배양은 발현용 글리세롤 스톡을 L-브로쓰(LB) 배양액에 접종하여 37℃, 100 rpm 조건에서 광학 밀도가 0.6 내지 0.8 정도가 될 때까지 배양하였다. 발현을 위해 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드 (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, IPTG) 0.5mM로 유도(induction)한 후 25℃, 100 rpm 조건에서 하루 동안 배양하였다. 다음날 원심 분리(6,000 rpm, 4℃, 10분)하여 배양 균체를 획득하고, 획득한 균체 펠렛 1 g당 라이시스 버퍼(Lysis buffer)(sodium phosphate buffer, pH 7.5, 10mM NaCl) 20 ml씩 첨가하여 현탁하였다. 완전히 현탁되면 초음파 처리(sonication)를 통해 균체를 파쇄하였다(10분간 sonication 10초/holding 10초 반복, Amplitude 50%). 파쇄된 균체는 원심 분리(12,000 rpm, 4℃, 10분)하여 비파쇄 균체 및 불용성 분획을 제거하고 상등액만 조심스럽게 취한 후 0.45 ㎛ 시린지(syringe)로 여과하였다. 여과한 인간 상피 세포 성장 인자-저분자량 프로타민을 함유하는 원심 분리 상등액을 Q-셀룰로오스(Q-cellulose)(ion exchange chromatography)가 충진된 컬럼에 넣고 30분간 회전시킨 후 결합되지 않은 샘플을 제거하고, 세척 버퍼 1(washing buffer 1)(sodium phosphate buffer, pH 7.5, 50 mM NaCl)로 10분씩 2회 컬럼을 씻어주었다. 다시 세척 버퍼 2(sodium phosphate buffer, pH 7.5, 200 mM NaCl)로 30분간 1회 컬럼을 씻어주고 용출 버퍼(Elution buffer)(sodium phosphate buffer, pH 7.5, 500 mM NaCl)로 인간 상피 세포 성장 인자-저분자량 프로타민을 컬럼으로부터 용출시킨 뒤 초미세 여과(ultra filtration)(Amicon, cutting membrane 3000Da)로 용적 대비 20배 농축하였다. 농축된 용액을 겔 여과(gel filtration)(Sephadex G-100, Buffer GF (20mM sodium phosphate buffer, pH 7.5, NaCl 500 mM))를 이용하여 인간 상피 세포 성장 인자-저분자량 프로타민 분획만을 회수하였다. 이 분획을 NaCl이 포함되지 않은 버퍼 GF로 희석하여 NaCl 농도를 안정도에 효과적인 150 mM 전후로 조정하였고, SDS-PAGE 분석하여 95% 전후의 정제도를 확보하였다. 정제한 인간 상피 세포 성장 인자-저분자량 프로타민은 동결 건조하여 인간 상피 세포 성장 인자 말단에 저분자량 프로타민이 결합된 최종 인간 상피 세포 성장 인자-저분자량 프로타민을 수득하였다.
[비교예] 인간 상피 세포 성장 인자-저분자량 프로타민 콘쥬게이트의 제조
인간 상피 세포 성장 인자-저분자량 프로타민 콘쥬게이트를 NHS/EDC 커플링 반응으로 합성하였다. 먼저, 1.654x10-8 몰의 인간 상피 세포 성장 인자를 0.5 mL의 MES 버퍼에 녹여 표준 반응 용기에 넣었다. 결합시키려는 저분자량 프로타민 4.962x10-8 몰을 0.1 mL의 MES 버퍼에 녹인 뒤 상기 반응 용기에 넣고, MES 버퍼에 녹인 EDC와 NHS를 인간 상피 세포 성장 인자에 대해 4몰의 비율로 섞어 상온에서 2 내지 3시간 동안 반응시켰다. 상기 반응을 통해 만들어진 인간 상피 세포 성장 인자-저분자량 프로타민 콘쥬게이트를 4℃에서 컷-오프(cut off) 분자량 3,000 달톤 centriprep?으로 원심 분리하여 미반응물을 제거함으로써 정제하였다.
[실험예 1] 인간 상피 세포 성장 인자-저분자량 프로타민의 활성 평가
(1) ELSIA 법을 이용한 활성 평가
실시예 및 비교예의 인간 상피 세포 성장 인자-저분자량 프로타민의 활성을 평가하기 위하여 ELISA 법을 이용하여 정량하였다. PBS에 희석한 최종 농도 4.0 ㎍/㎖의 캡쳐 항체(capture antibody)를 웰 당 100 ㎕씩 로딩(loading)하고 37℃에서 밤새 배양하였다. 다음 날 세척 버퍼로 3번 세척하고 블로킹 버퍼(Blocking Buffer)를 웰 당 200 ㎕씩 로딩한 뒤 다시 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 다시 세척 버퍼로 3번 세척하여 플레이트를 항체로 코팅하였다. 코팅한 플레이트에 농도별로 연속 희석한 일반 인간 상피 세포 성장 인자, 실시예의 재조합 인간 상피 세포 성장 인자-저분자량 프로타민, 비교예의 인간 상피 세포 성장 인자-저분자량 프로타민 콘쥬게이트를 100 ㎕씩 로딩하고 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 세척 버퍼로 3번 세척한 뒤 블로킹 버퍼를 이용하여 탐지 항체(Detection antibody)를 50 ng/mL 농도로 희석한 다음 웰 당 100 ㎕씩 로딩하였다. 37℃에서 2시간 동안 배양하고 세척 버퍼로 3번 세척한 뒤 HRP-연관된 2차 항체(HRP-linked secondary antibody)를 블로킹 버퍼를 이용하여 1 : 200으로 희석하여 웰 당 100 ㎕씩 로딩하고 37℃에서 20분간 차광 배양하였다. 세척 버퍼로 3번 세척하고 기질(Substrate) 용액을 웰 당 100 ㎕씩 로딩하여 색을 관찰하였다. 웰 당 50 ㎕씩 정지액(STOP Solution)을 첨가하여 반응을 멈추게 하고 자외선 450 nm에서 흡광도를 측정함으로써 활성을 측정하였다.
일반 인간 상피 세포 성장 인자와 비교하였을 때, 실시예의 재조합 인간 상피 세포 성장 인자-저분자량 프로타민 활성도는 평균 85% 정도로 오차 범위 내에서 차이가 없었으나, 비교예의 인간 상피 세포 성장 인자-저분자량 프로타민 콘쥬게이트 활성도는 일반 인간 상피 세포 성장 인자 대비 30%로 매우 낮았다. 이를 토대로 유전자 재조합 방법으로 인간 상피 세포 성장 인자 말단에 저분자량 프로타민을 결합시키는 경우 높은 활성을 유지하는 인간 상피 세포 성장 인자-저분자량 프로타민을 제조할 수 있음을 알 수 있다.
(2) 세포 증식을 이용한 활성 평가
실시예 및 비교예의 인간 상피 세포 성장 인자-저분자량 프로타민의 활성을 평가하기 위하여 쥐의 섬유아세포(NIH3T3 cell line)의 증식 활성을 측정하였다.
한 웰 당 100 ㎕ 부피의 DMEM(Dulbecco's modified essential medium)에 상기 세포를 5 x 103 농도로 심고 37℃에서 24시간 동안 배양 한 뒤 배양액 내의 세럼 농도를 0.05%로 낮추어 24 시간 더 배양하였다. 24시간 뒤, 세포에 0(무처치군), 0.1, 1.0 M 농도의 인간 상피 세포 성장 인자(rEGF)와 인간 상피 세포 성장 인자-저분자량 프로타민(rLMWP-EGF)를 처리하여 다시 24시간 동안 배양하여 자극하였다.
WST-1법으로 세포 증식의 활성을 측정하였다. 5 mg/mL 농도로 희석한 WST-1 용액을 세포에 처리하여 2시간 동안 배양하고, 450 nm에서 흡광도를 측정함으로써 활성을 측정하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에서 볼 수 있듯이, 실시예의 재조합 인간 상피 세포 성장 인자-저분자량 프로타민 처리군은 0.1 과 1.0 M 농도에서 무처치군 대비 각각 128%와 143%의 세포 증식 활성도를 나타내어, 무처치군 대비 각각 123%와 146%의 세포 증식 활성도를 나타낸 일반 인간 상피 세포 성장 인자 처리군의 결과와 오차 범위 내에서 차이가 없었다. 즉, 유전자 재조합을 통한 인간 상피 세포 성장 인자로 저분자량 프로타민의 결합이 인간 상피 세포 성장 인자의 활성을 저하시키지 않음을 알 수 있다.
[실험예 2] 경피 투과성 평가
(1) 인공 피부 조직을 이용한 경피 투과성 평가
인공 피부 조직을 이용한 인간 상피 세포 성장 인자의 경피 투과 실험을 통해 피부 세포 내 투과성을 평가하였다. 구체적으로, 6-웰 플레이트에 pH 7.0 내지 7.4의 DMEM 900 ㎕를 넣은 뒤, 인서트(insert)-인공 피부 조직(keraskin)을 넣고 20시간 동안 37℃, 5% CO2 조건에서 전-배양(pre-incubation)하였다. 인서트를 페놀-레드와 FBS가 들어있지 않은 새로운 DMEM에 옮긴 후, 인간 상피 세포 성장 인자(rEGF), 실시예의 재조합 인간 상피 세포 성장 인자-저분자량 프로타민(rLMWP-EGF), 인간 상피 세포 성장 인자-TAT(TAT-EGF), 인간 상피 세포 성장 인자-올리고알기닌(Oligoarginine, R7)(R7-EGF) 및 인간 상피 세포 성장 인자와 저분자량 프로타민(LMWP)의 혼합물(LMWP+EGF) 각각을 최종 농도 2 μM이 되도록 투여하였다. 37℃, 5% CO2 배양 조건에서 0.5시간, 4시간, 24시간 후 각각의 메디아(media)를 취하여 분광 형광계를 이용한 형광 측정법과 ELISA 분석을 통해 각 시험 물질의 인공 피부 조직 투과량을 정량하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었으며, 일반 인간 상피 세포 성장 인자의 인공 피부 조직 투과량을 기준으로 한 각 시험 물질의 인공 피부 조직 투과량 비율을 표 2에 나타내었다.
rEGF rLMWP-EGF TAT-EGF R7-EGF LMWP+EGF
피부 조직 투과량비 1 47 31 5 6.4
상기 결과에서 알 수 있듯이, 실시예의 재조합 인간 상피 세포 성장 인자-저분자량 프로타민의 피부 조직 투과성, 즉 경피 투과성이 가장 우수하였다. 이는 실시예의 재조합 인간 상피 세포 성장 인자-저분자량 프로타민이 종래 경피 투과성을 높이는 효과가 우수하다고 알려진 TAT 단백질 혹은 올리고알기닌(R7)과 결합한 인간 상피 세포 성장 인자보다 경피 투과성이 뛰어남을 보여준다. 즉, 인간 상피 세포 성장 인자와 같은 운반 대상 물질은 그 말단에 본 발명에 따른 저분자량 프로타민이 결합하면 매우 우수한 경피 투과성, 나아가 생체막 투과성 및 피부 세포 투과성을 나타냄을 알 수 있다.
(2) 동물 피부 조직을 이용한 경피 투과성 평가
헤어리스 마우스(hairless mouse) 피부 조직을 이용한 인간 상피 세포 성장 인자의 경피 투과성을 평가하였다. 구체적으로, 헤어리스 마우스(수컷, 7주령)의 등에서 배에 걸친 피부 조직을 분리하여 프란츠 투과 세포(Frant diffusion cell)에 장착하고, 인간 상피 세포 성장 인자, 실시예의 재조합 인간 상피 세포 성장 인자-저분자량 프로타민을 인간 상피 세포 성장 인자를 기준으로 60 ppm 농도로 0.1 mL 처리한 뒤, 각각 1시간, 3시간, 6시간, 9시간, 12시간 및 24시간 후 분광 형광계를 이용한 형광 측정법과 ELISA 분석을 통해 각 시험 물질의 헤어리스 마우스 피부 조직 투과량을 정량하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었으며, 일반 인간 상피 세포 성장 인자의 헤어리스 마우스 피부 조직 투과량을 기준으로 한 각 시험 물질의 헤어리스 마우스 피부 조직 투과량 비율을 표 3에 나타내었다.
rEGF rLMWP-EGF
마우스 피부 조직 투과량비 1 10
상기 결과에서 알 수 있듯이, 실시예의 재조합 인간 상피 세포 성장 인자-저분자량 프로타민의 피부 조직 투과성, 즉 경피 투과성은 일반 인간 상피 세포 성장 인자의 피부 조직 투과성보다 10배 높았다. 즉, 인간 상피 세포 성장 인자와 같은 운반 대상 물질은 본 발명에 따른 저분자량 프로타민이 말단에 결합되면 매우 우수한 경피 투과성, 나아가 생체막 투과성 및 피부 세포 투과성을 나타냄을 알 수 있다.
[실험예 3] 동물 실험을 통한 상처 치유 효능 평가
헤어리스 마우스(hairless mouse)의 피부 전층 상처(full thickness wound) 이용한 인간 상피 세포 성장 인자의 상처 치유 효과를 평가하였다. 구체적으로, 헤어리스 마우스(수컷, 7주령) 각각의 등에 생검 펀치를 이용해 8 mm 지름의 동그란 피부 전층 상처를 만들고 상처 부위를 포비돈-요오드(povidone-iodine) 용액으로 소독하였다. 하루가 지난 뒤부터 10 일간, 하루에 두 번씩 각 상처 부위에 인간 상피 세포 성장 인자(rEGF), 실시예의 재조합 인간 상피 세포 성장 인자-저분자량 프로타민(rLMWP-EGF)를 인간 상피 세포 성장 인자를 기준으로 10 ppm의 농도로 30 L씩 도포하였다. 상처 치유 정도는 각 물질 도포 1일, 4일, 7일 및 10일 후 디지털 카메라와 사진 분석을 통해 상처의 크기를 측정하여 평가하였으며, 그 결과를 도 4(초기 상처 크기 대비% 결과 그래프)와 도 5(사진)에 나타내었다.
상기 결과에서 알 수 있듯이, 실시예의 재조합 인간 상피 세포 성장 인자-저분자량 프로타민을 처리했을 때 상처 치유 효과가 가장 우수하였다. 구체적으로, 초기 상처 크기 대비 4일과 10일째 각각 61±5%와 17±3%의 상처 크기를 나타낸 실시예의 재조합 인간 상피 세포 성장 인자-저분자량 프로타민 처리군은 초기 상처 대비 4일과 10일째 각각 77±6%와 21±5%의 상처 크기를 보인 무처리군(control) 및 초기 상처 대비 4일과 10일 째 각각 72±3%와 20±5%의 상처 크기를 보인 인간 상피 세포 성장 인자 처리군보다 상처 크기가 크게 감소하였다. 즉, 인간 상피 세포 성장 인자와 같은 운반 대상 물질은 본 발명에 따른 저분자량 프로타민이 말단에 결합되면 높은 경피 투과성을 가져 우수한 상처 치유 촉진 효능을 나타냄을 알 수 있다.
아래에 본 발명의 일측면에 따른 조성물의 제형예를 설명하나, 이는 본 발명을 한정하는 것이 아니라 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
[제형예 1] 화장수
아래 표에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 화장수를 제조한다.
배합 성분 함량(중량%)
실시예 0.001
글리세린 3.0
부틸렌글리콜 2.0
프로필렌글리콜 2.0
카르복시비닐폴리머 0.1
피이지-12 노닐페닐에테르 0.2
폴리솔베이트 80 0.4
에탄올 10.0
트리에탄올아민 0.1
방부제, 색소, 향료 적량
정제수 잔량
[제형예 2] 크림
아래 표에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 크림을 제조한다.
배합 성분 함량(중량 %)
실시예 0.001
글리세린 3.0
부틸렌글리콜 3.0
유동파라핀 7.0
베타글루칸 7.0
카보머 0.1
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 3.0
스쿠알란 5.0
세테아릴 글루코사이드 1.5
소르비탄 스테아레이트 0.4
폴리솔베이트 60 1.2
트리에탄올아민 0.1
방부제, 색소, 향료 적량
정제수 잔량
[제형예 3] 연고
아래 표에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 연고를 제조한다.
배합 성분 함량(중량%)
실시예 0.001
글리세린 8.0
부틸렌글리콜 4.0
유동파라핀 15.0
베타글루칸 7.0
카보머 0.1
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 3.0
스쿠알란 1.0
세테아릴 글루코사이드 1.5
소르비탄 스테아레이트 0.4
세테아릴 알코올 1.0
밀납 4.0
방부제, 색소, 향료 적량
정제수 잔량
[제형예 4] 주사제
아래 표에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 주사제를 제조한다.
실시예......................................10 ppm
주사용 멸균 증류수...........................적량
pH 조절제....................................적량
SEQUENCE LISTING <110> Amorepacific Corporation <120> Biomembrane Permeable Composition <130> 447 <160> 6 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Protamine <400> 1 Ala Ser Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Protamine <400> 2 Val Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer <400> 3 ggtcgtagac gtagaaatag tgactctgaa tgt 33 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> backward primer <400> 4 ttatcagcgc agttcccacc actt 24 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer <400> 5 catatggtga gccgtagacg tagacg 26 <210> 6 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> backward primer <400> 6 ctcgagtcat tagcgcagtt cccaccactt caggtctcgg t 41

Claims (12)

  1. 운반 대상 물질; 및
    운반 대상 물질의 한쪽 또는 양쪽 말단에 결합하고, 서열 번호 1 및 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열 중 하나 이상과 70% 이상 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 저분자량 프로타민(low molecular weight protamine)을 포함하는 생체막 투과성 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    저분자량 프로타민은 서열 번호 1 및 서열 번호 2의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    운반 대상 물질은 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 핵산, mRNA 및 안티센스 RNA로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서,
    단백질은 DKK-2(Dickkopf-related protein 2), 아디포카인(adipokine), 트롬보스폰딘(thrombospondin) 및 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(Superoxide dismutase)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    운반 대상 물질은 성장 인자, 효소, 호르몬, 전사 인자, 독소, 항원 및 항체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서,
    성장 인자는 상피 세포 성장 인자(EGF), 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), 혈관 내피 세포 성장 인자(VEGF), 섬유 아세포 성장 인자(FGF), 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 신경 성장 인자(NGF) 및 형질 전환 성장 인자(TGF)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서,
    운반 대상 물질과 저분자량 프로타민은 유전자 재조합으로 결합된 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서,
    조성물은 피부 탄력성 증가, 피부 주름 개선, 피부 재생, 피부 미백, 기미 감소, 혈관 신생, 모발 성장 촉진, 탈모 방지, 모낭 세포 활성화, 피부 세포 분열 촉진, 엘라스틴 또는 콜라겐 합성 증가, 상처 치유 촉진, 흉터 완화 및 홍반 억제 중 하나 이상의 작용을 하는 조성물.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    조성물은 피부 외용제용인 조성물.
  10. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    조성물은 주사제용인 조성물.
  11. 운반 대상 물질; 및 운반 대상 물질의 한쪽 또는 양쪽 말단에 결합하고, 서열 번호 1 및 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열 중 하나 이상과 70% 이상 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 저분자량 프로타민(low molecular weight protamine)의 융합을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  12. 운반 대상 물질;과 서열 번호 1 및 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열 중 하나 이상과 70% 이상 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 저분자량 프로타민(low molecular weight protamine) 융합의 발현 벡터를 제조하는 단계;
    상기 단계에서 제조한 발현 벡터를 이용하여 형질 전환 세균을 생산하는 단계; 및
    상기 단계에서 생산한 형질 전환 세균을 이용하여 운반 대상 물질과 저분자량 프로타민의 융합을 발현시키는 단계를 포함하는 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 조성물 제조 방법.
KR1020120093838A 2011-08-31 2012-08-27 생체막 투과성 조성물 KR101417328B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/KR2012/006868 WO2013032210A2 (ko) 2011-08-31 2012-08-28 생체막 투과성 조성물

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110088171 2011-08-31
KR20110088171 2011-08-31

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20130027078A true KR20130027078A (ko) 2013-03-14
KR101417328B1 KR101417328B1 (ko) 2014-07-08

Family

ID=48178110

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020120093838A KR101417328B1 (ko) 2011-08-31 2012-08-27 생체막 투과성 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101417328B1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180032186A (ko) * 2016-09-19 2018-03-29 주식회사 바이오에프디엔씨 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자를 함유하는 피부 생리활성 피부외용제 조성물
KR20180032187A (ko) * 2016-09-19 2018-03-29 주식회사 바이오에프디엔씨 세포 투과형 혈관내피세포성장인자 융합 단백질을 함유하는 피부 생리활성 피부외용제 조성물

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004081188A2 (en) * 2003-03-10 2004-09-23 The Regents Of The University Of Michigan Non-toxic membrane-translocating peptides

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180032186A (ko) * 2016-09-19 2018-03-29 주식회사 바이오에프디엔씨 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자를 함유하는 피부 생리활성 피부외용제 조성물
KR20180032187A (ko) * 2016-09-19 2018-03-29 주식회사 바이오에프디엔씨 세포 투과형 혈관내피세포성장인자 융합 단백질을 함유하는 피부 생리활성 피부외용제 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
KR101417328B1 (ko) 2014-07-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9114094B2 (en) Method of use and preparation of HSA fusion protein composition for skincare
KR101944388B1 (ko) 피부 투과성 펩티드 및 그 이용방법
CN101711874B (zh) 穿膜肽Tat介导的生长因子在透皮转运中的应用
EP3808762A1 (en) Fusion protein bound to cell-permeable peptide, and composition comprising fusion protein or cell-permeable peptide and epithelial cell growth factor as active ingredients
US9963484B2 (en) Polynucleotide encoding a fusion protein for improving skin conditions
KR20120034927A (ko) 피부투과성 인간 상피세포 성장인자 및 그 생산방법
KR101417328B1 (ko) 생체막 투과성 조성물
KR101813560B1 (ko) 세포투과형 성장인자들의 피부 생리활성 피부외용제 조성물
KR102212415B1 (ko) 피부투과성 펩타이드 및 이를 포함하는 융합단백질
KR101797167B1 (ko) 신규의 프로테인 트랜스덕션 도메인 및 이의 용도
CN114774357A (zh) 多肽在制备促进皮肤创面愈合产品中的应用
KR102114842B1 (ko) 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자를 함유하는 피부 생리활성 피부외용제 조성물
EP3336098B1 (en) Skin permeable peptide and method for using same
KR101626758B1 (ko) 피부 투과성을 갖는 인간 염기성 섬유아세포 성장인자의 개발, 생산 및 화장품 조성물
WO2013032210A2 (ko) 생체막 투과성 조성물
KR100612673B1 (ko) 세포도입성 보톡신 융합단백질
KR101090749B1 (ko) 세포투과성 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 융합단백질의 세포투과도를 증가시키는 들쭉 추출물
KR102622462B1 (ko) 신경세포 투과 촉진 활성의 펩타이드
US11951204B2 (en) Cell-penetrating peptides and composition including the same
KR102114845B1 (ko) 세포 투과형 혈관내피세포성장인자 융합 단백질을 함유하는 피부 생리활성 피부외용제 조성물
KR20020067108A (ko) 수송 도메인, 수송 도메인-화물분자 복합체 및 그 용도
KR102206808B1 (ko) 신규한 세포-투과 펩타이드 및 이를 포함하는 피부 개선용 조성물
KR100612484B1 (ko) 상피세포성장인자-폴리에틸렌글리콜 접합체 및 그 제조방법
KR102252305B1 (ko) 경피 투과 촉진 펩타이드 및 이를 포함하는 융합단백질
KR20220163872A (ko) 화물분자 수송 도메인 rmmr1, 이의 변이체, 이를 포함하는 재조합 화물분자 및 이를 이용한 화물분자 수송 방법

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170628

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180702

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190701

Year of fee payment: 6