KR100612484B1 - 상피세포성장인자-폴리에틸렌글리콜 접합체 및 그 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 상피세포성장인자-폴리에틸렌글리콜 접합체 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 사람으로부터 유래된 상피세포성장인자(EGF, Epidermal Growth Factor)의 특정부위, 즉 리신(Lysine)의 아민기 및/또는 아미노말단의 아민기에 고분자인 폴리에틸렌글리콜(PEG, Polyethylene Glycol)을 공유결합시킨 상피세포성장인자-폴리에틸렌글리콜 접합체 및 그 제조방법에 관한 것이다. 따라서 본 발명에 따른 상피세포성장인자-폴리에틸렌글리콜 접합체는 천연의 상피세포성장인자에 비하여 생체내의 분해정도를 낮출 수 있을 뿐 아니라 생체 외부에서도 열, 산, 알칼리 등의 물리화학적인 인자에 대해 현저히 안정한 효과를 얻을 수 있다.
폴리에틸렌글리콜, 상피세포성장인자, EGF, 페길화반응, Pegylation
Description
도 1은 폴리에틸렌니트로페닐카보네이트가 상피세포성장인자의 표면에 돌출되어 있는 3개의 아민기(Asn(#1), Lys(#28), Lys(#48))와 반응하는 것을 나타내는 반응도 모식도이다.
도 2는 페길화반응(Pegylation)후 완성된 PEG-EGFT/28/48 접합체 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 야생 EGF, PEG-EGFT 및 PEG-EGFT/28/48 접합체의 열안정성에 대하여 비교하여 나타낸 것이다.
도 4는 야생 EGF, PEG-EGFT 및 PEG-EGFT/28/48 접합체의 pH 안정성에 대하여 비교하여 나타낸 것이다.
도 5는 페길화된 상피세포성장인자(PEG-EGFT/28/48 ) 접합체의 전기영동사진이다.도 6은 페길화된 상피세포성장인자(PEG-EGFT/28/48 ) 접합체의 상처치료효과를 나타낸 것이다.
도 7은 야생 EGF, PEG-EGFT 및 PEG-EGFT/28/48 접합체의 생체 내 잔존시간을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 상피세포성장인자-폴리에틸렌글리콜 접합체 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 사람으로부터 유래된 상피세포성장인자(EGF, Epidermal Growth Factor)의 특정부위, 즉 리신(Lysine)의 아민기 및/또는 아미노말단의 아민기에 고분자인 폴리에틸렌글리콜(PEG, Polyethylene Glycol)을 공유결합시킨 상피세포성장인자-폴리에틸렌글리콜 접합체 및 그 제조방법에 관한 것이다.
EGF는 1953년 미국의 코헨(S. Cohen)에 의해서 처음으로 발견되어졌다. 사람에게서 유래된 EGF는 53개의 아미노산으로 구성되어 있고 3개의 이황화물(Disulfide) 결합을 가지는 분자량 6,045 달톤(Dalton, 이하 Da)의 폴리펩타이드(Cohen, S., J. Bio1. Chem.237:1555-1562, 1962; Savage, C.R., J. Bio1. Chem. 247:7612-7621, 1972)로, 포유류의 상피세포와 간엽(Messenchymal) 세포를 포함한 각종 세포들에 대해 유사분열 촉진, 세포성장 촉진 및 위산분비 억제 등의 활성이 있어, 피부 또는 각막의 상처 치료제 또는 위궤양 치료제로 사용할 수 있는 것으로 알려져 있다(참조: 미합중국 특허 제 140998호 Carpenter, Experimental Cell Research,164:1-10, 1986). 현재 이 EGF는 상처치료 및 위벽의 손상시 이를 치료하는 치료제로 쓰이고 있고(참조: 대한민국 특허출원제2000-8116호), 또한 당뇨병 환자에게 발생하기 쉬운 족부궤양의 치료제로 각광을 받고 있다(참조: Kirkegaard, P., et al. Gastroenterology 85:1277-1283, 1983 Konturek, S. J., et al. Gastroenterology 81:438-443, 1981).
그러나, EGF를 실제 상처부위에 적용하였을 때에는 시험관내에서의 우수한 상피세포 분화촉진 기능에 비하여 아주 미미한 상처치유의 심각한 단점이 있어, EGF를 이용한 피부 또는 각막의 상처치료용 외용제의 개발에 어려움을 겪어왔다. 전기한 바와 같이, EGF를 생체에 직접 적용하는 경우에 상처치유 효과를 충분히 나타내지 못하는 이유는 EGF가 생물학적으로 불안정할 뿐 아니라, 물리화학적으로도 불균질하므로 치료효과를 감소시키고 분해산물에 의한 알레르기가 발생되기 때문이다: 즉, EGF는 상온에서 특히, 수분의 존재하에서 매우 불안정하고, 상처부위에서 세포가 DNA를 합성하도록 유도하기 위하여 8 내지 12시간 정도의 잠복기(Lag Time)가 필요한데 반하여, EGF의 반감기는 약 1시간 정도로 매우 짧아서 목적하는 효과를 나타낼 수 없으며, EGF는 순수한 폴리펩타이드이므로 장기간 보관할 경우 실온에서 뿐만 아니라, 심지어 냉장보관 상태에서도 물리화학적 변화가 일어나고, EGF를 피부에 적용하면 상처부위에 존재하는 단백질 분해효소에 의하여 EGF가 변성 분해, 응집 및 침전되는 과정으로 인하여 생물학적 활성을 상실하기 때문이다(참조: Manning et al., Pharmaceutical Res., 6:903-917, 1989).
따라서, EGF를 더욱 효과적으로 용도를 개발하기 위해서는 체내에서의 안정성 외에도 체외에서의 물리화학적 안정성을 향상시켜야 의약부외품 및 크림 등의 화장품에서의 사용이 증가할 것이다. 이러한 물리화학적 안정성을 우리가 원하는 단백질에 부여하는 방법으로서 PEG 고분자를 단백질에 공유결합으로 영구적으로 붙여서 열안정성과 산알칼리하에서의 안정성을 향상시키는 방법이 제한적이나마 근래에 시도되어 왔다(참조: Maria A Longo et. al. J Chem Technol Biotechnol 74:25-32, 1999, P. Christakopoulos et al. :Carbohydrate Research 314: 9599, 1998).
또한, PEG는 HO-(-CH2CH2O-)n-H의 구조를 갖는 고분자화합물로, 친수성이 강하므로 의약품 단백질에 결합시켜 그 용해도를 증가시킬 수 있다. 또한 적절하게 결합시키면 효소활성, 수용체 결합과 같은 주요 생물학적 기능들을 유지하면서 결합된 단백질의 분자량을 증가시키는 것에 의해, 신장여과를 감소시키고 외부항원을 인식하는 세포와 항체로부터 단백질을 보호하며 분해효소에 의한 단백질의 분해도 감소시킬 수 있다. 이와 같이 단백질에 결합 가능한 PEG의 분자량 범위는 대략 1,000∼100,000 Da 으로, PEG 분자량이 1,000 Da 이상일 경우에는 독성이 상당히 낮은 편으로 알려져 있다. PEG의 분자량 범위가1,000∼6,000Da인 것은 전신에 분포하고 신장을 통해 대사되며, 특히 분자량 40,000 Da 이상의 나뭇가지 모양의 PEG는 혈액과 간을 포함한 기관들에 분포되고 대사는 간에서 이루어지는 것으로 알려져 있다.
그러나, PEG와 단백질의 결합에는 이와 같은 장점 외에 결점도 존재한다. 즉, PEG는 대개 결합할 단백질의 하나 또는 그 이상의 자유 리신(Lysine, Lys) 잔기의 아민기에 공유결합을 통해 결합하게 되는데, 이때 단백질의 표면부위 중 단백질의 활성도와 직접적인 관계가 있는 부위가 PEG와 결합할 경우, 그 부위는 더 이상 생물학적 기능을 수행할 수 없게 되어 단백질의 활성도가 감소하게 된다. 또한, PEG와 리신 잔기의 결합은 대개 무작위적으로 일어나게 되므로 결합 위치에 따라 많은 종류의 PEG-단백질 배합체(Conjugate)들이 혼합물로 존재하게 되고, 따라서 원하는 배합체를 순수 분리하는 과정이 복잡하고 어려워지게 된다. EGF에는 2개의 입실론 1차 아민기(Lys28 and Lys48)과 1개의 N-말단의 1차 아민기가 존재하기 때문에, 접합되는 PEG의 수는 EGF 한 분자당 1개에서 3개가 붙는 것이 일반적인 현상이다. EGF에 PEG 유도체를 결합시킨 예로서, 한국과학기술원의 공개특허공보 특2003-0075374호에서는 단백질의 아미노말단의 1차 아민에 특이적으로 반응하는 물질인 메톡시폴리에틸렌글리콜-알데하이드(Methoxypolyethylene Glycol-Aldehyde)를 사용하여 EGF의 아미노말단(N-terminal)에 분자량 약 2,000 내지 약 5,000 Da의 PEG를 결합시키고 있다. 이때, 결합시킨 PEG와 EGF의 비율은 약 1:3인 것으로 기재되어 있다. 결합의 효과는 PEG가 없는 EGF와 비교하여 활성을 상실하지 않았으나, 더욱 반감기가 증가되고 혈장내 체류시간도 연장되었으며, 제거율이 감소되고, 생체내 임상활성이 높아진 것으로 되어 있다. 그러나, 이 PEG-EGF 접합체의 경우 공유결합 형태가 에스테르 결합이기 때문에 열이나 산, 알칼리 그리고 단백질 분해효소에 의한 가수분해 및 체내 잔류기간 등에 있어 여전히 개선의 필요성이 요구되어 왔다.
본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 예의노력한 결과, 사람 유래의 재조합 상피세포성장인자(EGF)의 리신(lysine) 잔기의 아민기 및/또는 아미노말단의 아민기와 메톡시폴리에틸렌글리콜(mPEG)-니트로페닐 카르보네이트(p-nitrophenyl carbonate) 유도체를 반응시켜 공유결합을 통해 상피세포성장인자-폴리에틸렌글리콜 접합체를 제조하였고, 이 접합체가 체내 외에서의 항원유발성(immunogenicity)을 감소시키고, 열이나 산 및 알칼리 등의 물리화학적 인자에 대한 안정성을 증가시킬 뿐만 아니라, 생체내외에서의 잔존시간을 더욱 증가시키므로서 보다 향상된 치료효과를 나타낼 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 주된 목적은 메톡시폴리에틸렌글리콜(Methoxypolyethylene Glycol)과 사람 상피세포성장인자(EGF) 내부의 리신 아민기 및/또는 아미노 말단의 아민기와 공유결합된 상피세포성장인자-폴리에틸렌글리콜 접합체 및 그 제조방법을 제공하는 데에 있다.
이하, 본 발명의 상피세포성장인자-폴리에틸렌글리콜 접합체 및 그 제조방법을 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.
우선, 본 발명은 메톡시폴리에틸렌글리콜(Methoxypolyethylene Glycol)과 사람 상피세포성장인자(EGF) 내부의 리신 아민기 및/또는 아미노 말단의 아민기와 공유결합된 상피세포성장인자-폴리에틸렌글리콜 접합체에 관한 것이다(참조: 도 1 및 도 2). 여기서, 메톡시폴리에틸렌글리콜(Methoxypolyethylene Glycol)은 그 분자량이 500 ∼ 50,000 Da인 것이 바람직하다. 보다 바람직하기로는, 분자량 5,000 ~ 15,000 Da인 것인데, 만일 이들 분자량이 500 Da 미만이면 체내에서 폴리에틸렌글리콜의 분해산물에 의한 독성 문제가 있으며, 반면에 50,000 Da을 초과하면 역시 폴리에틸렌글리콜이 분해가 되지 않고 또한 폴리에틸렌글리콜이 붙은 단백질의 활성을 현격히 떨어뜨리는 문제가 있어 바람직하지 않기 때문이다. 또한, 상기 접합체에서 폴리에틸렌글리콜은 상피세포성장인자의 내부에 있는 리신의 아민기 및/또는 아미노말단의 아민기와 공유결합되어 있다. 이때, 상피세포성장인자의 내부에 있는 리신은 28번째 및 48번째에 위치해 있어, 결국 본 발명은 상피세포성장인자 내부의 28번, 48번 리신의 아민기 및 아미노말단의 아민기 중 어느 하나이상과 공유결합된 접합체인 것이다. 또다른 본 발명의 특징은 이들 공유결합이 종래의 에스테르 결합과는 다른 우레탄 결합이라는 점이다. 즉, 본 발명에 사용된 mPEG-NPC는 가수분해에 강한 우레탄 결합(Urethane bond)으로 상피세포성장인자에 붙어 종래 대한민국 공개특허공보 특2003-0075374호에서 사용한 N-하이드록시 석신이미드 폴리에틸렌글리콜이 상피세포성장인자의 아미노말단과 가수분해에 취약한 에스테르결합(Ester bond)을 하는데 비하여, 보다 향상된 약동학 및 약리학적 성질을 가질 수 있고, 화장품과 같은 체외에서 사용되는 제형상에서 열 등의 물리적 인자에 대한 향상된 안정성을 가질 수 있다. 그 결과, PEG가 EGF에 1개만 에스테르결합을 통해 결합되어 있는 종래 대한민국 공개특허공보 특2003-0075374호의 접합체와는 달리, 본 발명에 따른 접합체는 가수분해에 훨씬 강한 우레탄결합으로 PEG가 EGF에 3개까지 결합할 수 있어 종래의 어떤 접합체보다 훨씬 긴 생체 내의 잔존성과 훨씬 강한 내열성과 내산알칼리성을 가지게 되어 피부위에 바르는 연고제, 화장품의 제형으로 사용할 경우 훨씬 긴 생리활성 잔존시간을 부여할 수 있어 우수한 제품을 만들 수 있는 것이다.
그리고, 본 발명은 하기 반응식 1과 같이 메톡시폴리에틸렌글리콜-파라니트로페닐 카보네이트(Methoxypolyethylene Glycol-para-Nitrophenyl Carbonate)를 상피세포성장인자의 리신 아민기 및/또는 아미노 말단의 아민기에 공유결합시켜 상피세포성장인자-폴리에틸렌글리콜 접합체를 제조하는 방법을 포함한다:
반응식 1
이때, 상기 메톡시폴리에틸렌글리콜-파라니트로페닐 카보네이트(Methoxypolyethylene Glycol-para-Nitrophenyl Carbonate)는 그 분자량이 500∼50,000 Da인 것이 바람직하며, 5,000 ~ 15,000 Da인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 상기 메톡시폴리에틸렌글리콜-파라니트로페닐 카보네이트(mPEG-NPC )는 상피세포성장인자내 아민기와 반응하여 종래의 에스테르결합과는 달리 우레탄결합을 하는데, 이러한 아민기 위치는 상피세포성장인자 내부의 28번, 48번 리신의 아민기 및 아미노말단의 아민기 중 어느 하나이상이다. 이때, EGF와의 배합체 형성에 사용되는 mPEG-NPC 유도체의 양(Amount)은 적어도 EGF와 동일한 당량(Equimolar)으로 가해 주어야 하며, 아미노 말단의 알파-아미노 그룹과의 완전한 반응을 유도하기 위해 과량 첨가(EGF 단백질 1 몰당 PEG 유도체의 몰비가 1 - 10배의 범위)하는 것이 바람직하다. 또한, EGF를 용해하는 용매역할을 하는 완충용액은 인산염 완충용액이며 pH는 7 ∼ 9을 유지하도록 하며, 보다 바 람직한 pH는 8.0 ∼ 8.7이다. 왜냐하면, pH가 7 미만이면 리신의 아민기에 잘 반응을 못하는 문제가 있으며, pH 9를 초과하는 경우 역시 단백질의 활성을 저하시키는 문제가 있어 바람직하지 않기 때문이다. 그리고, EGF와 PEG 유도체의 반응은 4시간 ∼ 24시간 동안 4℃ ∼ 25℃ 실시하는 것이 바람직한데, 만일 반응시간이 4시간 미만이면 PEG의 접합효율에 문제가 있고, 24시간을 초과하면 알칼리 용액에 오래 노출되는데서 기인하는 단백질의 안정성 문제가 있으며, 반응온도가 4℃ 미만이면 반응속도가 너무 느리다는 문제가 있고, 25℃ 초과하면 EGF의 3차구조 유지에 어렵다는 문제가 있기 때문이다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 더욱 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 이들 실시예 및 실험예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예 및 실험예에 의하여 본 발명의 범위가 한정되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 : 분자량이 2,000 Da인 mPEG-NPC 유도체와 재조합 사람 EGF와의 접합체 제조. EGF 유전자를 사람유래 섬유아세포로부터 연쇄중합반응(PCR)으로 분리한 후 T7 프로모터가 들어가 있는 자체의 Plasmid로의 클로닝 이후 해당 대장균 균주로 형질전환시킨후 LB 배지에서 발효시켜 OD값이 0.7에 달하였을 때에 IPTG를 1mM 되게 투여하여 EGF 유전자의 발현을 유도하여 약 18시간가량 발효배지내로 대장균으로부터 EGF가 분비되어 나오도록 방치하였다. 이렇게 하여 얻은 발효액을 약 4,000RPM의 원심분리를 거쳐 균체는 제거하고 EGF가 있는 상등액을 얻은 후 밀리포어(Millipore)의 울트라필트레이션(Ultrafiltration) 시스템을 이용하여 30K 와 3K 포어사이즈(Pore Size)의 멤브레인을 차례대로 여과하여 30K 이상과 3K 이하의 크기의 다른 단백질들을 제거해 낸 EGF가 들은 농축액을 얻었다. 이 농축액을 Q-세파로스(Sepharose) 레진에 결합시킨 후 0에서 1M 사이의 NaCl 농도구배를 걸어주어 EGF를 정제하여 얻었다. 이 EGF를 다시 pH7.4의 20mM 농도의 인산버퍼에 투석을 한 후 동결건조하여 EGF 분말을 얻었다. 동결건조된 EGF 100mg과 선바이오㈜로부터 구입한 분자량이 2,000인 mPEG-NPC 30mg을 도데실황산나트륨(Sodium dodecyl sulfate, SDS) 0.1%가 들어간 인산염 완충용액(50 mM, pH 8.3)에서 25℃에서 10시간 동안 반응시켜 3개의 mPEG-NPC의 PEG가 각기 EGF의 아미노말단(N-Terminal)과 28번째와 48번째에 위치한 리신의 아민기에 우레탄결합으로 붙은 PEG와 EGF의 접합체(이하, PEG-EGFT/28/48 라고 한다)를 제조하였다(참조: 도 1 및 도 2). 접합체(PEG-EGFT/28/48 )의 완성은 도 5에서 보는 바와 같이 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis) 후 실버염색(Silver Staining)으로 확인하였다. PEG-EGFT/28/48 은 분자량 10,000Da의 크기를 가진 반투석막 상에서 빠져나가지 못하므로, 반투석막을 이용하여 반응되지 않은 폴리에틸렌글리콜, 상피세포성장인자를 제거한 후 다시 pH 7.4의 20mM 농도의 인산버퍼에 투석을 하여 주었다.
비교예: 분자량이 2,000 Da인 mPEG-Aldehyde 유도체와 재조합 사람 EGF와의 접합체 제조.
EGF 유전자를 사람유래 섬유아세포로부터 연쇄중합반응(PCR)으로 분리한 후 T7 프로모터가 들어가 있는 자체의 Plasmid로의 클로닝 이후 해당 대장균 균주로 형질전환시킨 후 LB 배지에서 발효시켜 OD값이 0.7에 달하였을 때에 IPTG를 1mM 되게 투여하여 EGF 유전자의 발현을 유도하여 약 18시간가량 발효배지내로 대장균으로부터 EGF가 분비되어 나오도록 방치하였다. 이렇게 하여 얻은 발효액을 약 4,000RPM의 원심분리를 거쳐 균체는 제거하고 EGF가 있는 상등액을 얻은 후 밀리포어(Millipore)의 울트라필트레이션(Ultrafiltration) 시스템을 이용하여 30K 와 3K Pore Size의 멤브레인을 차례대로 여과하여 30K 이상과 3K 이하의 크기의 다른 단백질들을 제거해 낸 EGF가 들은 농축액을 얻었다. 이 농축액을 Q-세파로스(Sepharose) 레진에 결합시킨 후 0에서 1M 사이의 NaCl 농도구배를 걸어주어 EGF를 정제하여 얻었다. 이 EGF를 다시 pH 7.4의 20mM 농도의 인산버퍼에 투석을 한 후 동결건조하여 재조합 사람 EGF 분말을 얻었다.
동결건조된 재조합 사람 EGF 100 mg과 분자량이 2,000 Da인 mPEG-알데하이드(Aldehyde) 30mg을 2.5 mM 시아노수소화붕소나트륨(NaCNBH3)이 포함된 아세테이트 완충용액(50 mM, pH 5.5) 25℃에서 10시간동안 반응시켜 1개의 PEG가 EGF의 아미노말단(N-terminal Amino Acid)에 선택적으로 결합된 공개특허공보 특2003-0075374호에서와 같은 형태인 PEG와 EGF의 접합체(이하 PEG-EGFT라고 한다)를 제조하였다.
PEG-EGFT는 분자량 10,000Da의 크기를 가진 반투석막 상에서 빠져나가지 못하 므로, 반투석막을 이용하여 반응되지 않은 폴리에틸렌글리콜, 상피세포성장인자, NaCNBH3를 분리하여 제거한 후 다시 pH7.4의 20mM 농도의 인산버퍼에 투석을 하여 주었다.
실험예 1: 열안정성 실험
실시예에서 얻은 PEG-EGFT/28/48 을 400 pg/ml의 농도로 하여 50℃에서 5분, 10분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간 경시별로 처리한 각각의 반응물을 아래와 같은 MTT방법을 사용하여 흡광도를 측정한 후 열에 대한 안정성을 비교하였다.
세포배양 플라스크에 2X103 세포수로 혈청배지(DMEM, 10% FBS)에서 2일간 배양하여 무혈청배지로 옮긴 후 하루를 공복(starvation) 시킨 후 상기의 400 pg/ml로 PEG-EGFT/28/48 을 각각 5분, 10분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간 처리해준 시료를 배양액에 첨가한다. 이 상태로 3일을 배양한 후 배양된 세포를 PBS로 세척하여 100㎍의 MTT 용액을 첨가하여 4시간 배양한 후 PBS로 세척한 다음 100㎕의 DMSO와 첨가하여 1시간 배양한 후 570nm에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 도 3에 요약하여 나타내었다.
비교실험예 1: 열안정성 실험
실시예에서와 동일한 방법으로 제조한 사람 유래 재조합 EGF와 비교예에서 얻은 PEG-EGFT를 400 pg/ml의 농도로 하여 50℃에서 5분, 10분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간 경시별로 처리한 각각의 반응물을 아래와 같은 MTT방법을 사용하여 흡광도를 측정한 후 열에 대한 안정성을 비교하였다.
세포배양 플라스크에 2X103 세포수로 혈청배지(DMEM, 10% FBS)에서 2일간 배양하여 무혈청배지로 옮긴 후 하루를 공복(starvation)시킨 후 상기의 400 pg/ml로 EGF와 PEG-EGFT/28/48 을 각각 5분, 10분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간 처리해준 시료를 배양액에 첨가하였다. 이 상태로 3일을 배양한 후 배양된 세포를 PBS로 세척하여 100㎍의 MTT 용액을 첨가하여 4시간 배양한 후 PBS로 세척한 다음 100㎕의 DMSO와 첨가하여 1시간 배양 한 후 570nm에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 도 3에 요약하여 나타내었다.
그 결과, 도 3에서 보는 바와 같이 야생의 EGF는 50℃에서 1시간 이상 보존하면 활성이 40%이하로 급격히 떨어지나, PEG-EGFT 및 PEG-EGFT/28/48 은 50℃에서 2시간 이상 보존하여도 각각 60%, 80% 이상의 활성을 유지함을 볼 수 있어 PEG을 EGF에 접합시켰을 때에 확실히 내열성이 크게 증가되었고, PEG-EGFT/28/48과 같은 페길화된 형태인 상피세포성장인자의 아미노 말단의 아민기와 리신의 아민기에 폴리에틸렌글리콜을 접합 시켰을 경우, 공개특허공보 특2003-0075374호의 PEG-EGFT보다도 열 안정성이 뛰어남을 알 수 있었다.
실험예 2: pH 안정성
3가지 종류의 pH 조건 즉, pH 4.0인 10mM 인산 완충액, pH 7.0인 10mM 인산 완충액, pH12인 10mM 인산 완충액에 300pg의 실시예에서 얻은 PEG-EGFT/28/48
을 각 각 용해시킨 후 1시간가량 방치 후 아래와 같은 MTT방법을 사용하여 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 도 4에 요약하여 나타내어 pH에 대한 안정성을 비교하였다.
세포배양 플라스크에 2X103 세포수로 혈청배지(DMEM, 10% FBS)에서 2일간 배양하여 다시 무혈청배지로 옮긴 후 하루를 공복(starvation)시킨 후 상기의 PEG-EGFT/28/48 시료를 처리하여 3일을 배양하였다. 배양된 세포를 PBS로 세척한 후 100㎕의 DMSO와 100㎍의 MTT 용액을 첨가하여 4시간 배양 한 후 570nm에서 흡광도를 측정하였다.
비교실험예 2: pH 안정성
3가지 종류의 pH 조건 즉, pH 4.0인 10mM 인산 완충액, pH 7.0인 10mM 인산 완충액, pH12인 10mM 인산 완충액에 300pg의 실시예에서와 동일한 방법으로 제조한 사람 유래 재조합 EGF와 비교예에서 얻은 PEG-EGFT 를 각각 용해시킨 후 1시간가량 방치 후 아래와 같은 MTT방법을 사용하여 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 도 4에 요약하여 pH에 대한 안정성을 비교하였다.
세포배양 플라스크에 2X103 세포수로 혈청배지(DMEM, 10% FBS)에서 2일간 배양하여 다시 무혈청배지로 옮긴후 하루를 공복(starvation)시킨 후 상기의 처리를 한 각각의 EGF와 PEG-EGFT/28/48 시료를 처리하여 3일을 배양하였다. 배양된 세포를 PBS로 세척한 후 100㎕의 DMSO와 100㎍의 MTT 용액을 첨가하여 4시간 배양 한 후 570nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 5에서 보는 바와 같이 야생의 EGF는 pH4에서 41%, pH12에서 29%의 세포생존율의 생물학적 활성을 보여주어 중성에서의 90%에 비해 54%, 68%씩 줄어듦을 알 수 있었으나, PEG-EGFT 및 PEG-EGFT/28/48은 중성에서의 79%, 27% 활성에 비해 pH4, pH7에서 각각 57%와 49% 및 24.5%와 25.4%의 활성을 보여주어 각각 38% 및 10% 이상 줄어들지 않음을 알 수 있었다. 따라서,PEG-EGFT/28/48 이 pH가 쉽게 변하기 쉬운 체외의 환경에서 야생의 EGF 보다도 더욱 향상된 내산성, 내알칼리성을 보여주었을 뿐만 아니라, 같은 페길화된 형태인 공개특허공보 특2003-0075374호의 PEG-EGFT 보다도 더욱 우수한 내산 및 내알칼리성을 가지고 있어 체외적용 제형 개발가능성을 보여주었다.
실험예 3: 상처치유효과
쥐의 등부위를 털깍이로 털을 제모한 후에 수술용 1회용 칼로 약 3mm 에서 8mm 사이가 되도록 상처를 내었다. 하루가 지난 후에 실시예에서 얻은 PEG-EGFT/28/48와 대조군으로서 실시예에서와 동일한 방법으로 제조한 사람 유래 재조합 EGF를 각각 1μg 씩 피하주사로 각각의 상처 부위에 주사하였다. 3일 후에 다시 동량의 PEG-EGFT/28/48과 EGF를 먼젓번의 상처 부위에 재도포하였다. 7일 후에 상처 치유효과를 육안으로 식별하여 확인하였는데 결과는 도 6에 표시하였다.
그 결과, 도 6에서 보는 바와 같이 아무런 처리를 안 한 상처부위에 비하여 EGF, PEG-EGFT/28/48 처리를 한 상처부위에서 상처치유효과가 육안으로 확인되었고, 특히 PEG-EGFT/28/48을 처리한 상처부위는 경과시간이 길수록 EGF 처리를 한 상처 부위보다도 현저하게 치료효과가 높은 것이 육안으로 식별이 가능하였다. 이는 PEG-EGFT/28/48이 EGF보다도 실험예 1과 실험예 2에서 보는 바와 같이 체외에서 훨씬 안정하여 장기간에 걸쳐 상처부위에서 작용을 하여 나온 결과로 추정할 수 있다.
실험예 4: 체내에서의 생물학적 안정성
실시예에서 얻은 PEG-EGFT/28/48 및 실시예에서와 동일한 방법으로 제조한 사람 유래 재조합 EGF와 비교예에서 얻은 PEG-EGFT (각각 1.2 ㎍/0.1ml의 농도)를 5주령 된 수컷 생쥐(C3H mice) 정맥에 주사하고, 정해진 시간(5분 ~ 6시간)에 심장에서 혈액을 체취한 뒤, 헤파린(3㎕)이 첨가된 튜브로 옮긴 후, 혈장을 얻기 위해 12,000 rpm에서 원심분리를 하여 상층액을 취하였다. 얻어진 혈장을 102 ~ 105배 사이로 희석하여 면역효소법(ELISA) 측정범위(0.6 ~ 20.7 pM)내에 들어가게 한 후, 혈장에 포함된 EGF, PEG-EGFT, PEG-EGFT/28/48의 양을 측정하였다. 각 시간마다 사용된 쥐의 수는 2 ~ 3마리로 하였고, 그 결과는 도 7에 요약하여 나타내었다.
그 결과, PEG가 접합된 EGF 접합체가 쥐에서 야생형(native form)에 비하여 그 잔존시간이 긴 것으로 나타났으며, 아미노 말단에만 PEG를 에스테르 결합시킨 PEG-EGFT 보다는 아미노 말단과 리신기 2개에 접합한 PEG-EGFT/28/48
이 더 오래 남아있는 것을 보였다. PEG가 접합되어 있지 않은 야생 EGF의 경우 그 반감기가 6.7 분인 것에 반하여, PEG-EGFT 의 경우 15.3분, 그리고 PEG-EGFT/28/48
의 경우 반감기는 27.7분으로 계산되었다. 아미노 말단과 두개의 리신기에 분자량이 2,000인 PEG를 접합한 EGF가 비접합 EGF에 비해 약 4.5배 정도, 그리고 아미노 말단 접합체 보다 약 2배 정도의 지속성 증가를 보여주었다.
이상, 상기 실시예와 실험예를 통하여 명백하게 밝힌 바와 같이, 본 발명의 상피세포성장인자-폴리에틸렌글리콜 접합체는 열안정성의 현격한 증가, 산, 알칼리 등의 수소이온농도의 변화에 대하여 강한 내성을 지닌 새로운 형태의 상피세포성장인자임을 확인할 수 있었으며, 그 결과 창상 치료효과가 보다 우수한 외에도, 화장품 및 의약부외품과 같은 생체외에서의 제형에 사용시 위에 기술된 열, 수소이온농도 등의 외부의 물리화학적인자의 변화에도 불구하고 더욱 향상된 생물학적 활성을 유지할 수 있는 효과가 있다.
Claims (7)
- 메톡시폴리에틸렌글리콜(Methoxypolyethylene Glycol)이,사람 상피세포성장인자(EGF)의 리신 아민기; 아미노 말단의 아민기; 또는 리신 아민기와 아미노 말단의 아민기;와 공유결합된 상피세포성장인자-폴리에틸렌글리콜 접합체.
- 제 1항에 있어서, 상기 메톡시폴리에틸렌글리콜(Methoxypolyethylene Glycol)은 그 분자량이 500∼50,000 Da인 것을 특징으로 하는 상피세포성장인자-폴리에틸렌글리콜 접합체.
- 제 1항에 있어서, 상기 리신은 사람 상피세포성장인자(EGF)내의 28번째 및 48번째인 것을 특징으로 하는 상피세포성장인자-폴리에틸렌글리콜 접합체.
- 제 1항에 있어서, 상기 공유결합은 우레탄(Urethane) 공유결합인 것을 특징으로 하는 상피세포성장인자-폴리에틸렌글리콜 접합체.
- 반응식 1과 같이 메톡시폴리에틸렌글리콜-파라니트로페닐 카보네이트(Methoxypolyethylene Glycol-para-Nitrophenyl Carbonate)를 상피세포성장인자의 리신 아민기; 아미노 말단의 아민기; 또는 리신 아민기와 아미노 말단의 아민기;에 공유결합시키는 공정을 포함하는 상피세포성장인자-폴리에틸렌글리콜 접합체의 제조방법:반응식 1
- 제 5항에 있어서, 상기 메톡시폴리에틸렌글리콜-파라니트로페닐 카보네이트(Methoxypolyethylene Glycol-para-Nitrophenyl Carbonate)는 그 분자량이 500∼50,000 Da인 것을 특징으로 하는 상피세포성장인자-폴리에틸렌글리콜 접합체의 제조방법.
- 제 5항에 있어서, 상기 리신은 사람 상피세포성장인자(EGF)내의 28번째 및 48번째인 것을 특징으로 하는 상피세포성장인자-폴리에틸렌글리콜 접합체의 제조방법.
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