JP4067058B2

JP4067058B2 - Ｐｅｇ化ｈｇｆ

Info

Publication number: JP4067058B2
Application number: JP52746396A
Authority: JP
Inventors: 充夫並木; 直人楠瀬; 憲子秋丸
Original assignee: 中村敏一
Priority date: 1995-03-10
Filing date: 1996-03-07
Publication date: 2008-03-26
Anticipated expiration: 2016-03-07
Also published as: DE69631329D1; WO1996028475A1; DE69631329T2; ATE257844T1; EP0816381B1; US5977310A; EP0816381A1; EP0816381A4

Description

技術分野
本発明は、ＰＥＧ化ＨＧＦ、即ち、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む試剤で修飾されたＨＧＦ（Hepatocyte Growth Factor）に関する。さらに、このＰＥＧ化ＨＧＦを含む肝疾患治療剤、腎疾患治療剤、上皮細胞増殖促進剤、抗癌剤、癌療法副作用軽減剤、肺障害治療剤、胃・十二指腸疾患治療剤、脳神経障害治療剤、血小板増加剤、低蛋白血漿治療剤、創傷治癒剤、造血幹細胞増加剤、育毛促進剤、皮膚化粧剤に関する。
従来の技術
ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）は肝細胞をはじめ多くの上皮細胞の増殖制御のみならず、細胞運動の促進や三次元での組織構築を促す形態形成誘導作用など多用な生物活性を有するユニークなサイトカインであり、マイトゲン、モートゲン、そしてモルフォゲンとして組織器官の形成や再生に中心的な役割を担うことが明かとなってきている。
ＨＧＦは分子量約６９ｋＤのα鎖と約３４ｋＤのβ鎖からなるヘテロダイマー蛋白質であり、全体として８２−８５ｋＤの分子量をもつ。
このＨＧＦは肝細胞のみならず、腎尿細管上皮細胞、皮膚ケラチノサイト、メラノサイト、肺胞II型上皮細胞、胃粘膜上皮細胞、血管内皮細胞、その他の上皮系細胞株などさまざまな細胞に対し増殖促進因子として作用する。
ＨＧＦは多くの正常細胞に対して増殖促進活性を示す一方で、これらの細胞が癌化すると逆に増殖抑制活性を示すことが知られている（Tajima, H.et al., FEBS Lett., 291, 229, 1991）。
また、ＨＧＦは腎尿細管由来の正常上皮細胞であるＭＤＣＫ細胞をはじめ多くの上皮細胞の運動性を、亢進し、培養細胞のコロニーを分散させるモートゲンとして作用する。
さらに、ＨＧＦはＭＤＣＫ細胞の形態形成を誘導することも知られている（Montesano, R. et al., Cell, 67, 901, 1991）。
そのほかにもＨＧＦは、代表的な肝臓毒である四塩化炭素によって引き起こされる培養肝細胞からの可溶性酵素の遊離を著しく抑制する。すなわち、ＨＧＦはin vitroで抗肝炎作用を発揮する。しかもＨＧＦの抗肝炎作用はin vivoでも確認されている（Takehara, T.et al., Biomed.Res., 12, 335, 1991）。
さらにＨＧＦは、腎尿細管由来の上皮細胞のNa-K-ATPase活性を促進する事が知られており腎機能を亢進することが示唆されている（Ishibashi, K. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 182, 960, 1992）。
しかしながら、上記のＨＧＦのようなタンパク質を生体内に投与する際の問題点の一つとして、生体内クリアランスが非常に速いという点と、ヒト型の天然タンパク質以外には抗原性があるという点が挙げられる。
このようなタンパク性医薬品の有する問題点を解決するための有用な手段のひとつとして、ＰＥＧ化試剤によってタンパク質を修飾することにより、生体内クリアランスを遅延させたり、抗原性を低下させることが知られている（Yoshimoto,T. et al., Jpn. J. Cancer Res., 77, 1264, 1986; 日本特開昭56-23587号公報; 日本特開昭61-178926号公報; Abuchowski, A. et al., Cancer Biochem. Biophys., 7, 175, 1984; 日本特開昭62-115280号公報など）。
上述のようにＨＧＦは、様々な生物活性を有しており、その関連物質を医薬として応用する技術の開発が望まれている。特にＨＧＦの肝疾患治療剤、腎疾患治療剤、上皮細胞増殖促進剤、抗癌剤、癌療法副作用軽減剤、肺障害治療剤、胃・十二指腸疾患治療剤、脳神経障害治療剤、血小板増加剤、低蛋白血漿治療剤、創傷治癒剤、造血幹細胞増加剤、育毛促進剤、皮膚化粧剤としての利用は応用価値の高いものと考えられるが、十分な薬効を得るためには数十μg/kg〜数mg/kgのＨＧＦの投与が必要で、生理活性タンパク質としては必要量が多い。このことは予期せぬ副作用の発生及びバイオ製品の製造コストが高くなるという点で不利であった。
すなわち、ＨＧＦは血中における半減期が極めて短い（α相：約２分、β相：約２０分）ことが知られており、医薬品化を考慮した場合、ＨＧＦの生体内でのクリアランスの改善が最大の課題となる。
しかしながら、上記のように肝疾患治療剤、腎疾患治療剤、上皮細胞増殖促進剤、抗癌剤、癌療法副作用軽減剤、肺障害治療剤、胃・十二指腸疾患治療剤、脳神経障害治療剤、血小板増加剤、低蛋白血漿治療剤、創傷治癒剤、造血幹細胞増加剤、育毛促進剤、皮膚化粧剤として有用なＰＥＧ化ＨＧＦを実際の医療に応用するための体内動態の改善や高活性化させるためのアプローチは、従来なし得られていないのが実状である。
従って、本発明の目的は、ＨＧＦの有する生物活性を生体内で持続させることによって投与量を減らし、かつ臓器特異性を高めるために、ＰＥＧ化試剤をＨＧＦと縮合させることにより、医薬品として極めて有用なＰＥＧ化ＨＧＦを提供することにある。
発明の開示
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ＨＧＦをＰＥＧ化することで得られるＰＥＧ化ＨＧＦは、生体内での安定性が改善されて、ＨＧＦ作用を長期にわたって持続させることができ、さらに研究を重ねて本発明を完成するに至った。
本発明は、ＰＥＧ化ＨＧＦに関する。
また、本発明の他の発明は、
リジン及びタンパクのＮ末端アミノ基を修飾するＰＥＧ化試剤で修飾したＨＧＦからなるＰＥＧ化ＨＧＦ；
アミド結合を介してリジン及びタンパクのＮ末端アミノ基を修飾するＰＥＧ化試剤で修飾したＨＧＦからなるＰＥＧ化ＨＧＦ；
下記一般式（１）

（式中、Ｒ¹及びＲ²は同一又は異なる低級アルキル基を、ｐ及びｑは同一又は異なって２０ないし２８０の整数を表し、ｔは０又は任意の正の整数を表す）で示されるＰＥＧ化試剤のカルボキシル基を活性化してＨＧＦと反応させることによって得られるＰＥＧ化ＨＧＦ；
下記一般式（２）

（式中、Ｒ³は低級アルキル基を、ｒは２０ないし２８０の整数を表し、ｓは任意の正の整数を表す）で示されるＰＥＧ化試剤のカルボキシル基を活性化してＨＧＦと反応させることによって得られるＰＥＧ化ＨＧＦ；
上記のＰＥＧ化ＨＧＦの有効量及び必要に応じて担体を含有する肝疾患治療剤、腎疾患治療剤、上皮細胞増殖促進剤、抗癌剤、癌療法副作用軽減剤、肺障害治療剤、胃・十二指腸疾患治療剤、脳神経障害治療剤、血小板増加剤、低蛋白血漿治療剤、創傷治癒剤、造血幹細胞増加剤、育毛促進剤又は皮膚化粧剤；及び
肝疾患治療剤、腎疾患治療剤、上皮細胞増殖促進剤、抗癌剤、癌療法副作用軽減剤、肺障害治療剤、胃・十二指腸疾患治療剤、脳神経障害治療剤、血小板増加剤、低蛋白血漿治療剤、創傷治癒剤、造血幹細胞増加剤、育毛促進剤又は皮膚化粧剤を製造するためのＰＥＧ化ＨＧＦの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＰＥＧ化ＨＧＦの肝細胞増殖活性を示す図である。
図２は、ＰＥＧ化ＨＧＦの血中動態を示す図である。
図３は、ＰＥＧ化ＨＧＦのin vivoにおける蛋白（フィブリノーゲン）産生亢進作用を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
本発明に用いられるＨＧＦとしては、種々の方法で調製されたものを用いることができる。
ＨＧＦの調製方法としては、各種の方法が知られている。例えば、ラット、ウシ、ウマ、ヒツジなどの哺乳動物の肝臓、脾臓、肺臓、骨髄、脳、腎臓、胎盤などの臓器、血小板、白血球等の血液細胞や血漿、血清などから抽出、精製して得ることができる（FEBS Letters, 224, 312, 1987; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 5844, 1989など参照）。
また、ＨＧＦを産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養物（培養上清、培養細胞等）から分離精製してＨＧＦを得ることもできる。あるいは遺伝子工学的手法によりＨＧＦをコードする遺伝子を適切なベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に挿入して形質転換し、この形質転換体の培養上清から目的とする組換えＨＧＦを得ることができる（例えば、Nature, 342, 440, 1989; 日本特開平５−１１１３８３号公報; 日本特開平３−２５５０９６号公報; Biochem. Biophys. Res. Commun., 163, 967, 1989など参照）。
上記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、植物又は動物細胞などを用いることができる。
より具体的には、ＨＧＦを生体組織から抽出精製する方法としては、例えば、ラットに四塩化炭素を腹腔内投与し、肝炎状態にしたラットの肝臓を摘出して粉砕し、Ｓ−セファロース、ヘパリンセファロースなどのゲルカラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣなどの通常の蛋白質精製法にて精製することができる。
また、ＨＧＦのアミノ酸配列をコードする遺伝子を通常の遺伝子工学的な手法により動物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マウスＣ１２７細胞、サルＣＯＳ細胞、Ｓｆ（Spodoptera frugiperda）細胞などに形質転換し、その培養上清より得ることができる。ＨＧＦはヒト由来のものでも、哺乳動物由来のものでも用いることができるが、好ましくはヒト由来のものが良く、更に好ましくは、ヒト由来の組換えＨＧＦ（日本特開平５−１１１３８３号公報）が良い。
かくして得られたＨＧＦはＨＧＦと実質的に同効である限り、そのアミノ酸配列の一部が欠失又は他のアミノ酸に置換されていたり、他のアミノ酸配列が一部挿入されていたり、Ｎ末端及び／又はＣ末端に１又は２以上のアミノ酸が結合していたり、あるいは糖鎖が同様に欠失又は置換されていてもよい。
ＰＥＧ化とはＰＥＧ化試剤でタンパク質を修飾することを表す。
ＰＥＧ化試剤とは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分：
−Ｏ−（ＣＨ₂ＣＨ₂Ｏ）ｎ−
（式中、ｎは２０ないし２８０の整数を表す）
及び、タンパク質との結合部分をもつ試剤を表す。
ＰＥＧ化試剤としては、多種類のものがあるが、例えば、下記の３つの群が挙げられる。
１．リジン及びタンパクのＮ末端アミノ基を修飾するＰＥＧ化試剤
リジン及びタンパクのＮ末端アミノ基を修飾するＰＥＧ化試剤としては、タンパク質との結合部分としてカルボキシル基、誘導されたカルボキシル基、炭酸エステル、ホルミル基等を持つものがあり、例えば、以下の刊行物に記載されたものが挙げられる。
▲１▼アミド結合を介してＨＧＦを修飾する試剤
1)Tetrahedron, 40, 1581（1961）．
2)Anal. Biochem., 131, 25（1983）．
3)Cancer Biochem. Biophys., 7, 175（1984）．
4)Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1487（1987）．
5)FEBS Letters, 223, 361（1987）．
6)日本特開昭61-249388号公報
7)日本特開平1-316400号公報
8)日本特開平4-108827号公報
以下に刊行物に記載のある試薬を例示する。

（式中、Ｒ⁴及びＲ⁵は同一又は異なる低級アルキル基を、ｄ及びｅは同一又は異なって２０ないし２８０の整数を表し、ｉは任意の正の整数を表す）
これらの試剤において、ｉは好ましくは１ないし１０の範囲がよく、さらに好ましくは１ないし４の範囲がよい。
▲２▼ ▲１▼以外の結合を介してＨＧＦを修飾する試剤
1)J. Biol. Chem., 257, 3578（1977）．
2)Chem. Lett., 773（1980）．
3)Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol., 29, 113（1980）．
4)Agr. Biol. Chem., 52, 1575（1988）．
5)J. Biomatter. Sci. Polymer Edn., 2, 61（1991）．
6)日本特開昭61-178926号公報
7)日本特開昭63-10800号公報
以下に刊行物に記載のある試薬を例示する。

（式中、Ｒ⁶及びＲ⁷は同一又は異なる低級アルキル基を、ｕ及びｙは同一又は異なって２０ないし２８０の整数を表す）
２．アスパラギン酸、グルタミン酸及びタンパク質のＣ末端カルボキシル基を修飾するＰＥＧ化試剤
アスパラギン酸、グルタミン酸及びタンパク質のＣ末端カルボキシル基を修飾するＰＥＧ化試剤としては、タンパク質との結合部分としてアミノ基等を持つものがあり、例えば、日本特開昭５６−２３５８７号公報に記載された下記の試剤等が挙げられる。

（式中、Ｒ⁸は低級アルキル基を、ｗは２０ないし２８０の整数を表す）
３．アルギニンのグアニジノ基を修飾するＰＥＧ化試剤
アルギニンのグアニジノ基を修飾するＰＥＧ化試剤とては、ポリペプチド又はタンパク質との結合部分としてフェニルグリオキサール等を持つものがあり、例えば、日本特開平２−１１７９２０号公報、日本特開平３−８８８２２号公報などに記載された下記の試剤等が挙げられる。

（式中、Ｒ⁹及びＲ¹⁰は同一又は異なる低級アルキル基を、ｋ及びｊは同一又は異なって２０ないし２８０の整数を表す）
好ましいＰＥＧ化試剤としてはリジン及びタンパクのＮ末端アミノ基を修飾するＰＥＧ化試剤が挙げられ、さらに好ましくはアミド結合を介してリジン及びタンパクのＮ末端アミノ基を修飾するＰＥＧ化試剤が挙げられる。
ＰＥＧ化試剤は通常の有機化学の分野で用いられる方法によって製造でき、例えば、上記の刊行物に記載の方法で製造できる。
ＰＥＧ化試剤を用いてＰＥＧ化ＨＧＦを調製する方法は、通常の有機化学の分野で用いられる方法によることができ、例えば、上記の刊行物に記載の方法が挙げられる。
１分子中に１つのカルボキシル基を有するＰＥＧ化試剤を用いたＰＥＧ化ＨＧＦの調製方法を、一例として以下に説明する。
本ＰＥＧ化試剤を用いたＰＥＧ化は以下の２段階の反応によって実施できる。
１．ＰＥＧ化試剤のカルボキシル基を活性化してカルボキシル基を活性化体とする段階
カルボキシル基の活性化方法としては活性エステル法、混合酸無水物法等があり、例えば生化学実験講座第一巻，タンパク質の化学IV P236〜242（東京化学同人発刊）、ペプチド合成の基礎と実験（泉屋ら、丸善発刊）に記載されているカルボキシル基の活性化方法より活性化することができる。
具体的には、活性エステルの場合、ｐ−ニトロフェニルエステル、チオフェニルエステル、ｐ−ニトロチオフェニルエステル、１，３，５−トリクロロフェニルエステル、ペンタクロロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、２，４−ジニトロフェニルエステル、シアノメチルエステル、及びＮ−ヒドロキシフタルイミドエステルやＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどのジカルボン酸イミドエステル、またＮ−ヒドロキシピペリジンエステルやＮ−ヒドロキシ５−ノルボルネン−２，３−ジカルボン酸イミドなどのヒドロキシルアミン系活性エステルなどが挙げられる。
これらの活性エステルの調製は、通常のエステルの合成法にしたがって製造でき、例えば、ＰＥＧ化試剤のカルボキシル基と上記の活性エステルに対応するアルコール体とをジシクロヘキシルカルボジイミドや１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド等の縮合剤を用いて−２０℃ないし室温にて１ないし２４時間反応させることによって実施できる。
あるいはＰＥＧ化試剤のカルボキシル基と上記の活性エステルに対応するハロゲン化物とを、トリエチルアミン等の塩基存在下、０℃ないし８０℃にて１ないし７２時間反応させることによっても調製できる。
こうして調製した活性エステルのうち不安定なものは後処理後、直ちに次の縮合反応に用いるが、比較的安定なものは単離することができ、場合によっては低温あるいは室温で長期保存することもできる。
混合酸無水物法の場合には、イソブチルクロロホルメート、エチルクロロホルメート、塩化ピバロイル、塩化イソバレリル及び塩化ジフェニルホスフィル等とＮ−メチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン等の塩基存在下、−２０℃ないし０℃にて１ないし３０分間反応させることによって系内で混合酸無水物を調製する。こうして調製した化合物は単離・精製することなく次の反応に用いる。
２．カルボキシル基を活性化したＰＥＧ化試剤とＨＧＦを反応させる段階
カルボキシル基を活性化したＰＥＧ化試剤とＨＧＦとの反応においては、反応の温度はＨＧＦが失活しない温度であればいずれでも良く、例えば０〜２５℃の範囲が好ましい。
また、その使用量比は、ＨＧＦ１モル当たり５〜１００モルのＰＥＧ化試剤を用いれば良いが、リジン及びタンパク質のＮ末端アミノ基を修飾する際にはＨＧＦ１モル当たり１０〜２５モルのＰＥＧ化試剤を用いるのが特に好ましい。
本発明において用いられる式（１）又は（２）のＰＥＧ化試剤は、ｐＨ５．５以上のいずれのｐＨでも反応させることができるので、反応のｐＨはＨＧＦが失活しないｐＨ５．５以上であればいずれでも良いが、ｐＨ７〜９の範囲が好ましい。
反応に用いる溶媒は、反応を妨害しないものであればいずれでもよく、例えばリン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸水素ナトリウム水溶液、Ｎ−エチルモルホリン−酢酸緩衝液、マレイン酸ナトリウム緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等の緩衝液が挙げられる。
また、ＨＧＦを失活させず、かつ反応に不活性な有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、プロパノール等の低級アルコールやアセトニトリル、ジオキサン、テトラヒドロフラン等を添加してもよい。
反応時間は１〜７２時間で充分である。
反応終了後に、反応液を塩析やゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、限外瀘過、逆相ＨＰＬＣなどの通常の蛋白質の精製法で精製して目的のＰＥＧ化ＨＧＦを得ることができる。
本発明で使用されるＰＥＧ化試剤において、Ｒ¹〜Ｒ¹⁰で表される低級アルキル基とは、直鎖又は分岐鎖の炭素数が１〜６のアルキル基などが挙げられ、たとえば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシルなどが挙げられる。
本発明のＰＥＧ化ＨＧＦは種々の製剤形態（たとえば、液剤、固形剤、カプセル剤など）をとりうるが、一般的には有効成分であるＰＥＧ化ＨＧＦのみ、又はそれと慣用の担体と共に注射剤とされるか、又は慣用の担体と共に経口剤とされる。当該注射剤は常法により調製することができ、例えば、ＰＥＧ化ＨＧＦを適切な溶剤（例えば、滅菌水、緩衝液、生理食塩水など）に溶解した後、フィルター等で濾過して滅菌し、ついで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。注射剤中のＰＥＧ化ＨＧＦ含量としては、通常0.0002〜0.2(W/V%)程度、好ましくは0.001〜0.1(W/V%)程度に調整される。これらの製剤は製剤化の常法に準じて調製することができる。製剤中のＰＥＧ化ＨＧＦの含量は、剤形、適用疾患などに応じて適宜調整することができる。
製剤化に際して、好ましくは安定化剤が添加され、安定化剤としては、例えば、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、マンニトール、グルコース、デキストラン、エチレングリコールなどが挙げられる。さらに、本発明の製剤は製剤化に必要な添加物、例えば、賦形剤、溶解補助剤、酸化防止剤、無痛化剤、等張化剤などを含んでいても良い。溶状製剤とした場合は凍結保存、又は凍結乾燥等により水分を除去して保存するのが望ましい。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水などを加え、再溶解して使用される。
本発明の製剤は、該製剤の形態に応じた適当な投与経路により投与される。例えば、注射剤の形態にして静脈、動脈、皮下、筋肉内等に投与することができる。その投与量は、患者の症状，年齢，体重等に基づいて適宜調整されるが、通常はＰＥＧ化ＨＧＦ中のＨＧＦ含量として0.1μg/kg〜10mg/kgの範囲であり、これを１日１回ないし数回に分けて投与するのが適当である。
産業上の利用可能性
本発明のＰＥＧ化ＨＧＦは、そのタンパク質部分を介してＨＧＦと同様の機序で細胞に作用すると考えられる。そのためＨＧＦとして種々の生物活性を示す。
特に、ＰＥＧ化試剤（１）及び（２）で修飾されたＨＧＦは、対応する非修飾ＨＧＦと比較すると体内動態が改善された化合物であり、かつ非修飾ＨＧＦにくらべて臓器特異的に作用し、かつ低用量でＨＧＦ活性を示す。
すなわち、ＰＥＧ化ＨＧＦは、生体内クリアランスが遅延（即ち持続性が延長）され、長時間有効にその生理活性を示しうる。しかも、本発明のＰＥＧ化ＨＧＦは非修飾ＨＧＦの有する生理活性をそのまま有するものである。従って、本発明のＰＥＧ化ＨＧＦは、肝疾患治療剤、腎疾患治療剤、上皮細胞増殖促進剤、抗癌剤、癌療法副作用軽減剤、肺障害治療剤、胃・十二指腸疾患治療剤、脳神経障害治療剤、血小板増加剤、低蛋白血漿治療剤、創傷治癒剤、造血幹細胞増加剤、育毛促進剤、皮膚化粧剤などとして有用である。
実施例
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例によって制限されるものではない。
なお、以下の実施例において、アミノ酸分析値とは、これら高分子修飾ＨＧＦの酸分解物（６Ｎ塩酸−フェノール，１１０℃，２４時間処理後の分解物）中のアミノ酸分析値を表す。
また、これらＰＥＧ化ＨＧＦのアミノ基修飾率は、トリニトロベンゼンスルホン酸法（Methods in Enzymology, Vol.25, p464（1972）., Academic Press,New Yorkに記載の方法）により未修飾ＨＧＦとの比較を行うことで算出した。
各略号は以下の通りである。
Ａｓｘ：アスパラギン酸又はアスパラギン
Ｇｌｘ：グルタミン酸又はグルタミン
Ｓｅｒ：セリンＧｌｙ：グリシン
Ｈｉｓ：ヒスチジンＡｒｇ：アルギニン
Ｔｈｒ：スレオニンＡｌａ：アラニン
Ｐｒｏ：プロリンＴｙｒ：チロシン
Ｖａｌ：バリンＭｅｔ：メチオニン
Ｉｌｅ：イソロイシンＬｅｕ：ロイシン
Ｐｈｅ：フェニルアラニンＬｙｓ：リジン
実施例１
３，４−ビス−メトキシポリエチレングリコールハイドロ桂皮酸修飾ＨＧＦ
ＨＧＦ３．９０ｍｇを溶解した３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０，０．３Ｍ-ＮａＣｌ）６．９ｍｌに１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ８．２５に調整させた後、３，４−ビス−メトキシポリエチレングリコールハイドロ桂皮酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（平均分子量約１００００）３．１４ｍｇ（アミノ基に対して０．１５ｅｑ．）を加え、室温で１８時間攪拌した。反応液に０．１Ｎ塩酸を加えてｐＨ６．５としたのちセファクリルＳ−２００ＨＲ（２．６cmφ×９０cm）を用いたゲル濾過クロマトグラフィー（溶出液：０．２Ｍ食塩水，流速：１．４ｍｌ／ｍｉｎ，検出波長：２２０ｎｍ）で精製した。目的のフラクションを集め、限外濾過（アミコンＹＭ−５）によって脱塩濃縮し、表題化合物を含む水溶液７５０μｌを得た。（蛋白含量３．７１３ｍｇ／ｍｌ，アミノ基修飾率：１９％）
アミノ酸分析値
Ａｓｘ６３．２（８３），Ｇｌｘ５０．５（５９），
Ｓｅｒ３０．１（３８），Ｇｌｙ５４．０（５７），
Ｈｉｓ２０．２（２２），Ａｒｇ３３．３（４１），
Ｔｈｒ３１．９（３８），Ａｌａ＊２１．０（２１），
Ｐｒｏ３５．０（４４），Ｔｙｒ２４．４（３２），
Ｖａｌ２６．５（３３），Ｍｅｔ１１．４（１５），
Ｉｌｅ３２．１（３７），Ｌｅｕ３５．３（３７），
Ｐｈｅ１６．０（１７），Ｌｙｓ４１．４（４１），
Ｃｙｓ−（４０）
＊基準アミノ酸、（）内は理論値、−は未測定
ＧＰＣ
カラム：ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷ
７．５mmφ×６００mm（東ソー社製）
溶出液：１０ｍＭトリス緩衝液，０．２Ｍ食塩水，０．０５％ＳＤＳ
流速：０．６ml／分
検出波長：２２０ｎｍ
保持時間：１８．５１７分
実施例２
３，４−ビス−メトキシポリエチレングリコールハイドロ桂皮酸修飾ＨＧＦ
ＨＧＦ３．９０ｍｇを溶解した３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０，０．３Ｍ-ＮａＣｌ）６．９ｍｌに１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ８．２５に調整させた後、３，４−ビス−メトキシポリエチレングリコールハイドロ桂皮酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（平均分子量約１００００）６．２９ｍｇ（アミノ基に対して０．３ｅｑ．）を加え、室温で１８時間攪拌した。
反応液に０．１Ｎ塩酸を加えてｐＨ６．５としたのちセファクリルＳ−２００ＨＲ（２．６cmφ×９０cm）を用いたゲル濾過クロマトグラフィー（溶出液：０．２Ｍ食塩水，流速：１．４ｍｌ／ｍｉｎ，検出波長：２２０ｎｍ）で精製した。目的のフラクションを集め、限外濾過（アミコンＹＭ−５）によって脱塩濃縮し、表題化合物を含む水溶液１．００ｍｌを得た。（蛋白含量３．７２２ｍｇ／ｍｌ，アミノ基修飾率：３２％）
アミノ酸分析値
Ａｓｘ６４．４（８３），Ｇｌｘ５２．２（５９），
Ｓｅｒ３０．６（３８），Ｇｌｙ５４．８（５７），
Ｈｉｓ２０．２（２２），Ａｒｇ３３．７（４１），
Ｔｈｒ３２．５（３８），Ａｌａ*２１．０（２１），
Ｐｒｏ３５．４（４４），Ｔｙｒ２５．２（３２），
Ｖａｌ２６．８（３３），Ｍｅｔ１２．５（１５），
Ｉｌｅ３２．８（３７），Ｌｅｕ３５．７（３７），
Ｐｈｅ１６．２（１７），Ｌｙｓ４１．９（４１），
Ｃｙｓ−（４０）
＊基準アミノ酸、（）内は理論値、−は未測定
ＧＰＣ
カラム：ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷ
７．５mmφ×６００mm（東ソー社製）
溶出液：１０ｍＭトリス緩衝液，０．２Ｍ食塩水，０．０５％ＳＤＳ
流速：０．６ml／分
検出波長：２２０ｎｍ
保持時間：１８．１８３分
実施例３
モノメトキシポリエチレングリコールコハク酸修飾ＨＧＦ
ＨＧＦ３．８７ｍｇを溶解した３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０，０．３Ｍ-ＮａＣｌ）６．８５ｍｌに１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ８．２４に調整させた後、モノメトキシポリエチレングリコールコハク酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（平均分子量約５０００）
３．１４ｍｇ（アミノ基に対して０．３ｅｑ．）を加え、室温で１時間攪拌した。
反応液に０．１Ｎ塩酸を加えてｐＨ６．５としたのちセファクリルＳ−２００ＨＲ（２．６cmφ×９０cm）を用いたゲル濾過クロマトグラフィー（溶出液：０．２Ｍ食塩水，流速：１．４ｍｌ／ｍｉｎ，検出波長：２２０ｎｍ）で精製した。目的のフラクションを集め、限外濾過（アミコンＹＭ−５）によって脱塩濃縮し、表題化合物を含む水溶液１．６０ｍｌを得た。（蛋白含量１．８１３ｍｇ／ｍｌ，アミノ基修飾率：３３％）
アミノ酸分析値
Ａｓｘ６２．５（８３），Ｇｌｘ４９．８（５９），
Ｓｅｒ３１．０（３８），Ｇｌｙ５５．１（５７），
Ｈｉｓ１９．４（２２），Ａｒｇ３３．３（４１），
Ｔｈｒ３１．８（３８），Ａｌａ*２１．０（２１），
Ｐｒｏ３５．５（４４），Ｔｙｒ２３．９（３２），
Ｖａｌ２６．９（３３），Ｍｅｔ１３．０（１５），
Ｉｌｅ３１．９（３７），Ｌｅｕ３５．８（３７），
Ｐｈｅ１６．１（１７），Ｌｙｓ４０．９（４１），
Ｃｙｓ−（４０）
＊基準アミノ酸、（）内は理論値、−は未測定
ＧＰＣ
カラム：ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷ
７．５mmφ×６００mm（東ソー社製）
溶出液：１０ｍＭトリス緩衝液，０．２Ｍ食塩水，０．０５％ＳＤＳ
流速：０．６ml／分
検出波長：２２０ｎｍ
保持時間：１８．２２５分
実施例４
実施例１、２及び３の化合物を用いて、肝細胞初代培養法によるＰＥＧ化ＨＧＦのin vitro活性を測定した。なお、肝実質細胞の培養には、日本エスエルシーより購入したWistar系ラット（雄，8-10週令）を用いた。
ラットからの肝実質細胞の分離法及び肝細胞の初代培養法は、中村（初代培養肝細胞実験法学会出版センター発刊1989）の方法に従って行った。分離した肝細胞は、ＦＣＳを５％含んだＷｉｌｌｉａｍｓＥ（ＷＥ）培地を基本とする培地にて２４時間培養後、各サンプルを一定濃度含んだ無血清培地と交換し、２０時間培養した。
培養後5-[¹²⁵I]-Iododeoxyuridine（¹²⁵Ｉ−ＵｄＲ）を各ウェルに約２ｋＢｑ／ｗｅｌｌ程度で一定濃度添加し、４．５時間更に培養を続け細胞に¹²⁵Ｉ−ＵｄＲを取り込ませた。培養終了後、ＰＢＳ（−）にてプレートを洗浄し、１０％トリクロロ酢酸にて細胞を固定した後、１Ｎ水酸化ナトリウムに溶解して細胞に取り込まれたＲＩ量をγカウンターにて測定した。その結果を図１に示す。
本結果を基に、１ｎｇ／ｍｌ，３ｎｇ／ｍｌでの各サンプルのＨＧＦに対する比活性を２ｘ２点法にて計算した。各サンプルのＨＧＦに対する比活性は、実施例１の化合物では０．６０、実施例２の化合物では０．４２、実施例３の化合物では０．５０であった。
実施例５
実施例１及び２の化合物を用いて血中動態の検討を行った。ラットは、日本エスエルシーより購入したwistar系ラット（雄，11週齢）を用いた。
１）ＨＧＦ及びＰＥＧ−ＨＧＦの標識化
Iodogen法にて標識化を行った。標識化直後のサンプルを１０％トリクロロ酢酸にて処理すると、９６％以上のアイソトープが沈澱画分に回収されることから、標識化の確認をした。標識化合物は、−８０℃にて凍結保存した。
２）血中動態測定用の標識化サンプルの調製
各標識化合物に対応したコールドサンプルを、０．２５ｍｇ／ｍｌとなるように２．５ｍｇ／ｍｌＨＳＡ，０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０を含むＰＢＳ（-）に溶解した。上記コールドサンプルに、トリクロロ酢酸沈澱画分として２．２×１０⁷ｃｐｍの、原則として一定アイソトープ量の標識化合物を添加して、血中動態測定用サンプルを調製した。この血中動態測定用サンプル中に添加された標識化合物の蛋白量は、コールドサンプルに対して４％以下であった。標識化サンプルを添加することで、血中動態測定用サンプルのＨＧＦ濃度は、０．２３ｍｇ／ｍｌに希釈された。
３）標識化サンプルのラットへの投与と血液採取
ラットへ、各標識化サンプルを２ｍｌ／ｋｇにて尾静脈より投与した。１群２匹のラットを各サンプルについて２群用い、サンプル投与後、１群では２，５，１０，３０分で、もう１群では１０，２０，３０，４５，６０分で眼窩より経時的に採血した。
４）血清の分離とアイソトープ量の測定
採取した血液より分離した分離血清を１００μｌずつチューブにとり、１０％トリクロロ酢酸を加えて遠心分離し、上清を除いて沈澱画分を得た。この沈澱画分中のアイソトープ量を標識化したＨＧＦ或いはＰＥＧ−ＨＧＦに由来するものとして、γ−カウンターにて測定した。得られたカウントの平均値を基にして、モデルに当てはめて計算される理論血中推移を得た。その結果を図２に示す。
本実験では、投与直後の血中動態から検討し、投与０時間における血中アイソトープ量を計算して、サンプル投与量の同等性を確認した。
図２から血中半減期を求めると、各サンプルの血中半減期（分）は、ＨＧＦが５９．２分、実施例１の化合物が７６．７分、実施例２の化合物が９５．６分であった。このように、ＰＥＧ化ＨＧＦは、生体内での安定性が改善され、ＨＧＦ作用を長期にわたって持続させることができることが明らかになった。
実施例６
３，４−ビス−メトキシポリエチレングリコールハイドロ桂皮酸修飾ＨＧＦ
ＨＧＦ１４８．３ｍｇを溶解した１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５、１Ｍ−ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０）３．１９ｍｌを１１．６４ｍｌの０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．２１、１Ｍ−ＮａＣｌ）で希釈した後、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ８．２１に調整させた後、３，４−ビス−メトキシポリエチレングリコールハイドロ桂皮酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（平均分子量１０，０００）２３９．２ｍｇ（アミノ基に対して０．３ｅｑ．）を加え、室温で１８時間撹拌した。
反応液に０．１Ｎ塩酸を加えてｐＨ６．５としたのち、セファクリルＳ−２００ＨＲ（５．０ｃｍφ×４９ｃｍ）を用いたゲル濾過クロマトグラフィー（溶出液：０．２Ｍ食塩水、流速：１．４ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２２０ｎｍ）で６回に分けて精製した。
目的のフラクションを集め、限外濾過（アミコンＹＭ−５）を繰り返すことによって、表題化合物を含む０．１５ＭＮａＣｌ溶液２１．０ｍｌを得た。（蛋白含量４．７３ｍｇ／ｍｌ、アミノ基修飾率：２９％）
アミノ酸分析値
Ａｓｘ７０．３（８３），Ｇｌｘ５５．９（５９），
Ｓｅｒ３４．０（３８），Ｇｌｙ５６．０（５７），
Ｈｉｓ２３．１（２２），Ａｒｇ４０．７（４１），
Ｔｈｒ３２．１（３８），Ａｌａ*２１．０（２１），
Ｐｒｏ３８．２（４４），Ｔｙｒ２７．７（３２），
Ｖａｌ２６．８（３３），Ｍｅｔ１８．１（１５），
Ｉｌｅ３２．５（３７），Ｌｅｕ３３．９（３７），
Ｐｈｅ１５．４（１７），Ｌｙｓ４２．５（４１），
Ｃｙｓ−（４０）
＊基準アミノ酸、（）内は理論値、−は未測定
ＧＰＣ
カラム：ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷ
７．５ｍｍφ×６００ｍｍ（東ソー社製）
溶出液：１０ｍＭトリス緩衝液、０．２Ｍ食塩水、０．０５％ＳＤＳ
流速：０．６ｍｌ／分
検出波長：２２０ｎｍ
保持時間：１７．９５分
実施例７
実施例６で合成したＰＥＧ化ＨＧＦと未修飾ＨＧＦとのｉｎｖｉｖｏで薬効を比較するため、同じタンパク量のサンプルをラットに投与し、肝臓における蛋白（フィブリノーゲン）産生亢進作用の比較を行った。
正常ラット（Ｆ３４４／Ｎ、雄性、７週令）に、溶媒である１０ｍＭクエン酸緩衝液（０．３ＭＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０含有、ｐＨ５）に溶解した実施例６のＰＥＧ化ＨＧＦ及び未修飾ＨＧＦを０．０５、０．１５、０．５ｍｇ蛋白／ｋｇの用量で、１日２回尾静脈より投与した。１群には５匹のラットを用いた。２日間の投与翌日に、エーテル麻酔下、腹大静脈よりクエン酸処理血液を得、全自動血液凝固測定装置（CA5000 Cysmex）にてフィブリノーゲン量（ｍｇ／ｄｌ）を測定した。
測定結果を図３に示した。
図３の結果をもとに、０．３ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙと１ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの２用量にて２×２点の平行線検定を行い、２剤の効力を比較したところ、ＰＥＧ化ＨＧＦはＨＧＦに比較して８．６倍の効力を示した。

Claims

一般式（１）

（式中、Ｒ¹及びＲ²は同一又は異なる低級アルキル基を、ｐ及びｑは同一又は異なって２０ないし２８０の整数を表し、ｔは０又は任意の正の整数を表す）で示されるＰＥＧ化試剤のカルボキシル基を活性化してＨＧＦと反応させて得られるＰＥＧ化ＨＧＦ。
請求項１に記載のＰＥＧ化ＨＧＦの有効量を含有する肝疾患治療剤、腎疾患治療剤、上皮細胞増殖促進剤、抗癌剤、癌療法副作用軽減剤、肺障害治療剤、胃・十二指腸疾患治療剤、脳神経障害治療剤、血小板増加剤、低蛋白血漿治療剤、創傷治療剤、造血幹細胞増加剤、育毛促進剤又は皮膚化粧剤。