JP3487561B2 - 顆粒球コロニー刺激因子誘導体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、顆粒球コロニー刺激因
子（以下、Ｇ−ＣＳＦという）の誘導体に関する。

【０００２】

【従来の技術】上記Ｇ−ＣＳＦは、分子量が１９０００
±１０００の生理活性物質であり、顆粒球系前駆細胞に
作用して末梢血白血球中の好中球数を特異的かつ用量依
存的に増加させる働きを持つことが知られている。そし
て、Ｇ−ＣＳＦは好中球減少症治療薬として、「骨髄移
植時の好中球増加促進」、「悪性リンパ腫、肺癌、卵巣
癌および神経芽細胞腫における癌化学療法による好中球
減少症」、「先天性および突発性好中球減少症」などの
各適応症について、既に臨床応用されている（癌と化学
療法，Vol.17,P65-71,1990）。

【０００３】上記臨床応用における報告では、Ｇ−ＣＳ
Ｆ２０〜４０μｇを健常人に静脈内投与したときの血清
中のＧ−ＣＳＦ濃度半減期は約１時間、末梢血好中球数
増加持続時間は２４〜４８時間であり、また同様に皮下
投与したときの血清中のＧ−ＣＳＦ濃度半減期は約４時
間、末梢血好中球数増加持続時間は４８〜７２時間であ
った。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記臨
床応用においては、静脈内投与に比べて皮下投与の方は
薬効の持続性が見られるとはいうものの、必ずしも充分
とはいえない。特に上記疾患の治療には数日から数週間
に亘って毎日あるいは隔日ごとにＧ−ＣＳＦを投与する
必要があることから、投与量の低減および投与による苦
痛を軽減するためにも、薬効の持続性を延長するような
Ｇ−ＣＳＦ誘導体の開発が望まれていた。

【０００５】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明は上記Ｇ
−ＣＳＦに比べて末梢血好中球数の増加作用が強く、且
つ血清中のＧ−ＣＳＦ濃度が持続するようなＧ−ＣＳＦ
誘導体を発見することで、上記疾患の治療に対するＧ−
ＣＳＦの投与回数および投与量を減少させることを目的
とする。

【０００６】本発明者らは、両腎動静脈を結さつしたラ
ットにＧ−ＣＳＦの１０μｇ／Ｋｇを静脈内投与したと
ころ、血漿中のＧ−ＣＳＦ濃度半減期が約４．９時間、
平均滞留時間が約５．１時間であることを認めた。これ
は、従来の実験において両腎動静脈を結さつしないラッ
トに対して同様の静脈内投与した場合の血漿中のＧ−Ｃ
ＳＦ濃度半減期が約０．９時間、平均滞留時間が約１．
０時間に比べてＧ−ＣＳＦの血漿中濃度の大幅な延長で
あり、本発明者らは、この結果からＧ−ＣＳＦが生体内
から消失するのに腎臓におけるクリアランス（消失機
構）が大きく関与していることを発見した。

【０００７】本発明者らは、上記の知見に基づきＧ−Ｃ
ＳＦの腎臓におけるクリアランスを低下させることによ
り、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＧ−ＣＳＦの末梢血好中球
数増加作用を増強させ或いは持続させることができると
考え、ポリ（スチレンマレイン酸）を用いてＧ−ＣＳＦ
の誘導体化を試み、調製に成功したことで本発明に至っ
たものである。

【０００８】従来においても、同様の目的でポリエチレ
ングリコールによるＧ−ＣＳＦの誘導体化が提案されて
いる（Cancer Resesrch Vol.51,P3710-3714,1991）。Ｇ
−ＣＳＦの腎臓におけるクリアランスを低下させるには
分子量を約６００００以上にする必要があるが、上記の
方法ではＧ−ＣＳＦ１分子当たり４モル以上のポリエチ
レングリコール（分子量約１００００）を結合させなけ
ればならないために、Ｇ−ＣＳＦの生物活性を大きく低
下させるおそれがあった。この点、本発明に係るポリ
（スチレンマレイン酸）によるＧ−ＣＳＦの誘導体は、
それ自身の分子量は約２１０００と推定されるが、生体
内でアルブミンと可逆的に結合し得ることから血流中で
は分子量が約９００００となり、腎臓でのクリアランス
を受けることなく長時間に亘って体循環血中に留まるこ
とが可能になると考えられる（参考文献，蛋白質・核酸
・酵素，Vol.33,P33-41,1988）。

【０００９】本発明におけるポリ（スチレンマレイン
酸）によるＧ−ＣＳＦの誘導体化は、例えば次の方法で
行うことができる。先ず、ポリ（スチレンマレイン酸）
１９μｇと２−２’−ジチオビス（５−ニトロピリジ
ン）１０ｍｌをジメチルスルホキサイドに溶解させ、室
温で２４時間反応させたのち、これに１０μＭのＧ−Ｃ
ＳＦ溶液１ｍｌを加えて室温で３時間反応させて調製す
る。次いで、上記で調製したＧ−ＣＳＦ−ポリ（スチレ
ンマレイン酸）誘導体（以下、ＳＭ−Ｇ−ＣＳＦとい
う）をゲルろ過で脱塩したのち、さらに未反応のＧ−Ｃ
ＳＦを除くためイオン交換クロマトグラフィを行うこと
で、精製されたＳＭ−Ｇ−ＣＳＦを得ることができる。

【００１０】上記のように誘導体化されたＳＭ−Ｇ−Ｃ
ＳＦにおいて、ポリ（スチレンマレイン酸）は、Ｇ−Ｃ
ＳＦの遊離チオール基にジスルフィド結合によって１：
１のモル比で結合していると推定される。これはポリ
（スチレンマレイン酸）が、２−２’−ジチオビス（５
−ニトロピリジン）を介してジスルフィド結合によりＧ
−ＣＳＦと結合するが、Ｇ−ＣＳＦの構造からジスルフ
ィド結合を構成できる遊離チオール基が１箇所のみであ
るからである。

【００１１】また、Ｇ−ＣＳＦの分子量は１９０００±
１０００であり、これに分子量約１９００のポリ（スチ
レンマレイン酸）が１：１のモル比で結合していること
から、ＳＭ−Ｇ−ＣＳＦの分子量は約２１０００と推測
されるが、ＳＭ−Ｇ−ＣＳＦは、中性条件下において、
スチレン残基を介してアルブミンのワーファリン結合部
位に結合すると推定される。なお、ＳＭ−Ｇ−ＣＳＦと
アルブミンとの結合体分子量はゲルろ過より約９０００
０と計算された。その結果、この結合によってＧ−ＣＳ
Ｆの腎臓におけるクリアランスが小さくなり、長時間に
亘って血中に留まり末梢血白血球数増加作用等が増大す
ることになる。

【００１２】なお、上記Ｇ−ＣＳＦとポリ（スチレンマ
レイン酸）とのモル比は、上述のように必ずしも１：１
である必要はなく、利用されるＧ−ＣＳＦの遊離チオー
ル基の数によって種々のモル比をとり得る。また、上述
では２−２’−ジチオビス（５−ニトロピリジン）を介
してＧ−ＣＳＦにポリ（スチレンマレイン酸）を結合さ
せているが、その他、種々の架橋剤を使用することがで
きる。例えば、２−２’−ジチオビス（５−ニトロピリ
ジン）の代わりにマレイミドを含むα−４−｛〔６−
（Ｎ−マレイミド）ヘキサノイロキシメチル〕クミル｝
ハーフ−ブチルエステリファイド ポリ（スチレン−コ
ーマレイック アシッド）を用いることもできる。

【００１３】本発明に供せられうるＧ−ＣＳＦの例とし
ては、下記のアミノ酸配列で表されるＧ−ＣＳＦ活性を
有するポリペプチド又はこれと糖鎖部を有する糖蛋白質
を挙げることができる。

【００１４】 (Met)n Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu (Val Ser Glu)m Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro （但しｍは０又は１を表し、ｎは０又
は１を表す)さらに、上記アミノ酸配列の一部に別のア
ミノ酸を付加し又は置換して改変したもの、或いはアミ
ノ酸配列の一部を欠損させたもの等のＧ−ＣＳＦ活性を
有するポリペプチド類も本発明の範囲に含まれる。

【００１５】上記のＧ−ＣＳＦは、例えば本出願人が先
に出願した特開昭６１−２２７５２６号のほか遺伝子組
換え技術を利用した製造法、例えば特開昭６２−２３６
４９７号、特開昭６２−２３６４８８号の各明細書に記
載の方法によって製造することができる。また、その他
の方法としてＧ−ＣＳＦ産生細胞と自己増殖能を有する
悪性腫瘍とを細胞融合して得られるハイブリドーマをマ
イトジェンの存在または非存在下で培養することによっ
て得ることもでき、何らその製造法に限定されるもので
はない。したがって、これらの方法で得たＧ−ＣＳＦは
全て本発明に含まれる。

【００１６】得られたＧ−ＣＳＦ含有液は、必要により
公知の手段でさらに精製、濃縮したのち、ミリポアフィ
ルタ等で無菌濾過して凍結保存とするか又は凍結乾燥、
真空乾燥などの手段により水分を除去して保存すること
ができる。

【００１７】一方、本発明に用いられるポリ（スチレン
マレイン酸）は、ラジカル重合反応によって得られるス
チレンと無水マレイン酸との共重合体である。得られた
共重合体の組成比は、反応に使用するスチレンと無水マ
レイン酸の比を変化させてもほぼ１：１となるが、勿論
それ以外の組成比率であっても構わない。また、得られ
た共重合体がスチレンとマレイン酸との完全なホモ重合
体である必要はない。なお、共重合体の平均分子量は上
述した約１９００に限定されず、適宜種々の分子量を取
り得ることができる。

【００１８】本発明に係るＳＭ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体は、
特にこれを有効成分とする白血球減少症治療剤に適用で
きるが、その他の治療剤としても利用され得る。その製
剤化には、その目的に応じて希釈剤、溶解補助剤、等張
化剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、緩衝剤、含硫還
元剤、酸化防止剤を含有してもよい。例えば、含硫還元
剤としては、Ｎ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルホ
モシステイン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエ
タノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトー
ル、チオグリコール酸およびその塩、チオ硫酸ナトリウ
ム、グルタチオン、並びに炭素原子数１〜７のチオアル
カン酸などのスルフヒドリル基を有するものなどを例示
できる。

【００１９】また、酸化防止剤としてはエリソルビン
酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシア
ニソール、α−トコフェロール、Ｌ−アスコルビン酸お
よびその塩、Ｌ−アスコルビン酸パルミテート、Ｌ−ア
スコルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜
硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピ
ル、あるいはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（Ｅ
ＤＴＡ）、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウ
ムの如きキレート剤などを例示できる。

【００２０】あるいはまた賦形剤としては、グリシン、
システイン、スレオニン、シスチン、トリプトファン、
メチオニン、リジン、ヒドロキシリジン、ヒスチジン、
アルギニンなどのアミノ酸を添加してもよい。

【００２１】本発明に係るＳＭ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体を有
効成分とする製剤は、経口、各種注射などの非経口等各
種の投与形式で使用でき、該投与形式に応じた様々な剤
形で実現できる。例えば、投与剤形としては錠剤、丸
剤、カプセル剤、顆粒剤、懸濁液等の経口投与剤、ある
いは静注、筋注、皮下注、皮内注等の溶液、懸濁注射
剤、凍結乾燥剤、あるいは座剤、経鼻剤、膣剤等の経粘
膜投与剤形を典型的なものとして例示できる。また、投
与量は年齢、体重、症状、治療効果、投与方法等により
異なるが、通常は成人一人当たり、１回に０．１〜１０
００μｇの範囲が好ましい。

【００２２】以下、本発明を実施例に基づいて具体的に
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。

【００２３】

【実施例】

実施例１ 腎動静脈結さつラットに遺伝子組換え型Ｇ−ＣＳＦ（以
下ｒＧ−ＣＳＦという）を静脈内投与し、その時の血漿
中のｒＧ−ＣＳＦ濃度を擬手術対照ラットとの比較で調
べた。

【００２４】ＳＤ系雄性ラット（８週齢）（日本クレア
社製）をエーテル麻酔下において背部より切開し、左右
腎臓の動静脈を縫合糸で結さつすることにより腎動静脈
結さつラットを作成した後、大腿動静脈にポリエチレン
チューブ（ＰＥ−３１）でカニュレーションを施した。
次いで、ｒＧ−ＣＳＦ投与液を１０μｇ／Ｋｇの用量で
上記大腿静脈カニューレより投与した。投与後２，５，
１０，２０，３０分毎に、また１，２，４，６，８，２
４時間毎に上記大腿動脈カニューレから２００μｌの血
液を採取し、１５０００ｒｐｍで５分間遠心した後に血
漿を分離した。得られた血漿中のｒＧ−ＣＳＦ濃度をサ
ンドイッチ型ＥＩＡ法（J.Immunol.Method, Vol.118,P1
87-192,1989 ）により測定した。なお、擬手術対照ラッ
トは、ＳＤ系雄性ラット（８週齢）（日本クレア社製）
を背部より切開したのみで、腎動静脈結さつは施さなか
った。

【００２５】また、ｒＧ−ＣＳＦ投与液は、Ｔｗｅｅｎ
２０ ０．１％及びラット血清アルブミン（シグマ社
製）０．１％を含む生理食塩溶液でｒＧ−ＣＳＦ溶液を
希釈し、ｒＧ−ＣＳＦ濃度を４μｇ／ｍｌとして調製し
た。

【００２６】図１は、腎動静脈結さつラットと擬手術対
照ラットの血漿中のｒＧ−ＣＳＦ濃度を示したものであ
る。図１によれば、腎動静脈結さつラットの血漿中のｒ
Ｇ−ＣＳＦ濃度は、擬手術対照ラットに比べてその半減
期が長く、また平均滞留時間も大幅に延長されている。
この結果から、生体内からのｒＧ−ＣＳＦの消失には腎
臓におけるクリアランスが大きく関与していくことがわ
かった。

【００２７】実施例２ 次にポリ（スチレンマレイン酸）によるｒＧ−ＣＳＦ誘
導体（ＳＭ−ｒＧ−ＣＳＦ）の存在を確認するための実
験を行った。

【００２８】ポリ（スチレンマレイン酸）１９μｇと２
−２’−ジチオビス（５−ニトロピリジン）２μｇを１
０ｍｌのジメチルスルホキサイドに溶解させ、室温で２
４時間反応させたのち、これに１０μＭのｒＧ−ＣＳＦ
溶液１ｍｌを加えて室温で３時間反応させて調製した。
次いで、調製したＳＭ−ｒＧ−ＣＳＦをゲルろ過で脱塩
したのち吸光度を測定してＳＭ−ｒＧ−ＣＳＦの存在を
確認した。

【００２９】なお、上記ゲルろ過にはＳｅｐｈａｄｅｘ
Ｇ−２５カラム（１×１５ｃｍ）を用いた。また、溶
出液にはＴｗｅｅｎ２０ ０．１％及び塩化ナトリウム
０．９％を含む０．１Ｍ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
を用い、溶出は１ｍｌ／ｍｉｎの流速で行った。

【００３０】図２は、上記実施例において、溶出液を１
ｍｌづつ分取し、２８０ｎｍにおける吸光度を測定した
ときの結果を示したものである。図２によれば、容量７
ｍｌ付近にＳＭ−ｒＧ−ＣＳＦのピークが検出された。

【００３１】次に、ゲルろ過により精製したＳＭ−ｒＧ
−ＣＳＦをさらにイオン交換クロマトグラフィを行って
精製し、ＳＭ−ｒＧ−ＣＳＦに相当するフラクションを
分取し、Bio-Rad 法でＳＭ−ｒＧ−ＣＳＦの存在を確認
する実験を行った。イオン交換クロマトグラフィにはＤ
ＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂカラム（１．
５×５０ｃｍ）を用いた。Ｔｗｅｅｎ２０ ０．１％、
２０ｍＭ−トリエタノ−ルアミン及び塩化ナトリウム
０．９％を含む０．１Ｍ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
で平衡化させたカラムに試料を添加した後、試料の溶出
は０．３Ｍ−塩化ナトリウムを含む同緩衝液を用いた直
線濃度勾配法により行った。溶出は１ｍｌ／ｍｉｎの流
速で行った。

【００３２】図３は、溶出液を１ｍｌづつ分取し、２８
０ｎｍにおける吸光度を測定したときの結果を示したも
のである。図３によれば、４箇所にそれぞれピークが検
出されたが、ＳＭ−ｒＧ−ＣＳＦのピークは容量８５ｍ
ｌ付近に存在した。因みに、容量５０ｍｌ付近のピーク
はasialo−ｒＧ−ＣＳＦ、容量６０ｍｌ付近のピークは
monoasialo−ｒＧ−ＣＳＦ、容量６７ｍｌ付近のピーク
はdisialo −ｒＧ−ＣＳＦとそれぞれ推定される。

【００３３】上記容量８５ｍｌ付近のピークがＳＭ−ｒ
Ｇ−ＣＳＦであることは以下の方法によって確認した。
即ち、容量８５ｍｌの位置の溶出液を分取後、Ｔｗｅｅ
ｎ２０ ０．０５％及び塩化ナトリウム０．９％を含む
０．１Ｍ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）によって、蛋白
濃度（Bio-Rad 法で測定）が１，１０，１００ｎｇ／ｍ
ｌとなるように希釈した。各希釈液中のＳＭ−ｒＧ−Ｃ
ＳＦ濃度をｒＧ−ＣＳＦ抗体を用いたサンドイッチ型Ｅ
ＩＡ法により測定したところ、Bio-Rad 法で得られた蛋
白濃度に対して７０〜８０％に相当する値を示した。従
って、容量８５ｍｌの位置にある溶出液はｒＧ−ＣＳＦ
に由来する蛋白質を含むことは明らかであり、恐らくポ
リ（スチレンマレイン酸）との結合によってＥＩＡに対
する反応性が低下したＳＭ−ｒＧ−ＣＳＦと考えられ
る。

【００３４】実施例３ ゲルろ過によりＳＭ−ｒＧ−ＣＳＦと牛血清アルブミン
との複合体（以下、ＳＭ−ｒＧ−ＣＳＦ−ＢＳＡ複合体
という）、及びＳＭ−ｒＧ−ＣＳＦの分子量を測定し
た。

【００３５】ｒＧ−ＣＳＦの放射性ヨード標識体（^{12 5}I
-rG-CSF ）は、ラクトパーオキシダーゼ・グルコースオ
キシダーゼ法によって調製し、これをSuperose１２カラ
ムを用いたゲルろ過で精製した。また、ＳＭ−ｒＧ−Ｃ
ＳＦの放射性ヨード標識体（SM-^{1 25}I-rG-CSF）は、^{12 5}I
-rG-CSF を用いて調製した。この実施例ではSM-^{1 25}I-rG
-CSFを用いて行い、Ｔｗｅｅｎ２０ ０．１％を含む
０．１Ｍ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）２００μｌにSM
-^{1 25}I-rG-CSF溶液２００μｌとＢＳＡ溶液４００μｌを
加え、２０℃で３時間反応させてＳＭ−ｒＧ−ＣＳＦ−
ＢＳＡ複合体を調製した。

【００３６】ＳＭ−ｒＧ−ＣＳＦの分子量の算出は、Se
phadex G-50 カラムを用いたゲルろ過により行った。分
子量マーカとして、ブルーデキストラン（分子量２００
００００）、ＢＳＡ（同６８０００）、スーパーオキサ
イドジスムターゼ（ＳＯＤ）（同１６０００）を用い
た。ＳＭ−ｒＧ−ＣＳＦの分子量は各マーカの溶出位置
と、ＳＭ−ｒＧ−ＣＳＦ（放射能）の溶出位置から絶対
検量線法により算出した。

【００３７】図４は、Sephadex G-50 カラムを用いたゲ
ルろ過によるＳＭ−ｒＧ−ＣＳＦの分子量を示したもの
である。図４によれば、試験管番号２０番付近のピーク
がＳＭ−ｒＧ−ＣＳＦ−ＢＳＡ複合体と推定され、分子
量は約９００００と算出された。また、試験管番号４６
番付近のピークがＳＭ−ｒＧ−ＣＳＦと推定され、分子
量は約２１０００と算出された。なお、試験管番号１０
５番付近のピークは遊離ヨードイオンと推定される。

【００３８】実施例４ ラットの摘出腎灌流系を用いて、ｒＧ−ＣＳＦとＳＭ−
ｒＧ−ＣＳＦの腎臓におけるクリアランスの比較実験を
行った。

【００３９】図５はラット摘出腎灌流系の模式図を示し
たものである。この図において、符号１は腎臓、２は腎
動脈カニューレ、３は静脈カニューレ、４は尿管カニュ
ーレ、５はポンプ、６は灌流液である。また、下行大静
脈７，腸管静脈８および下行大動脈９，１０は縫合糸に
よってそれぞれ結さつしてある。なお、ラット摘出腎灌
流系の作製は、（J.Pharma. Sci.,Vol.77,P6-11,1988）
を参考とした。

【００４０】腎動脈カニューレ２からの投与液は、^{12 5}I
-rG-CSF 溶液とSM-^{1 25}I-rG-CSF溶液の二種類である。前
者は、^{12 5}I-rG-CSF 溶液の原液に等容量の０．２％牛血
清アルブミン溶液を加えて１２．８５μＣｉ／ｍｌに調
製し、後者は、Sephadex G-25 カラムを用いたゲルろ過
により精製したもの（０．０７７２μｇ／９．８７μＣ
ｉ／ｍｌ）をそのまま用いた。投与液は、^{12 5}I-rG-CSF
溶液あるいはSM-^{1 25}I-rG-CSF溶液５０μｌに０．２％の
牛血清アルブミン溶液を２０μｌ、所定液（塩化ナトリ
ウム１０８ｇ、塩化カリウム５．５２ｇ、塩化カルシウ
ム４．３９２ｇ、リン酸二水素カリウム２．５３２ｇ、
硫酸マグネシウム−７水塩、４．５８４ｇを蒸留水に溶
かして全量を２６００ｍｌとした）を１０μｌ、２．１
％の炭酸水素ナトリウム溶液１０μｌおよび³H−イヌリ
ン１０μｌを加えて調製した。

【００４１】上記摘出腎灌流系において、腎動脈カニュ
ーレから¹²⁵I-rG-CSF 投与液あるいはSM-¹²⁵I-rG-CSF投
与液を１００μｌ投与した。血液は薬液投与後０〜１，
１〜２，２〜１５分の間隔で静脈カニューレから採取
し、尿は薬液投与後０〜５，５〜１０，１０〜１５分の
間隔で尿管カニューレから採取した。また、腎臓は薬液
投与１５分後に摘出した。

【００４２】上記摘出した腎臓にホモジェネート液（Ｔ
ｗｅｅｎ２０ ０．２％を含む０．１Ｍ−リン酸緩衝
液、ｐＨ７．４）４ｍｌを加え、ポッターホモジェナイ
ザでホモジェネートし、２０％ホモジェネートを調製し
た。次いで、２０％ホモジェネートを試料として、腎ホ
モジェネート中における³H−イヌリンの残存量に対する
腎ホモジェネート中における^{12 5}I-rG-CSF あるいはSM-^1
25I-rG-CSFの残存量、即ち腎分布比率を測定した。

【００４３】図６は、上記ｒＧ−ＣＳＦあるいはＳＭ−
ｒＧ−ＣＳＦの腎分布比率の測定結果を示したものであ
る。一般に、Ｇ−ＣＳＦは糸球体ろ過によって腎臓内に
移行するが、上記結果によれば、ＳＭ−ｒＧ−ＣＳＦは
ポリ（スチレンマレイン酸）による高分子化によって腎
臓内への移行が少なく、ＳＭ−ｒＧ−ＣＳＦの腎臓に対
する分布量がｒＧ−ＣＳＦの約１／１５となっている。
従って、この結果からＳＭ−ｒＧ−ＣＳＦはｒＧ−ＣＳ
Ｆに比べて腎臓におけるクリアランスが小さいことが示
唆される。

【００４４】実施例５ 薬効を確認するために、ラットにＳＭ−ｒＧ−ＣＳＦあ
るいはｒＧ−ＣＳＦを０．５，５，５０μｇ／Ｋｇの用
量でそれぞれ静脈内投与し、その時の末梢血白血球数の
経時的変化を調べた。

【００４５】この実施例で用いる投与液は、ＳＭ−ｒＧ
−ＣＳＦ溶液あるいはｒＧ−ＣＳＦ溶液を投与液溶媒
（Ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％及び塩化ナトリウム０．
９％を含む０．１Ｍ−リン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ
７．４）で１μｇ／１００μｌに希釈したものである。
そして、この投与液をＷｉｓｔａｒ系雄性ラット（約２
００ｇ）の尾静脈より、０．５，５，５０μｇ／Ｋｇの
用量で投与した（各群６匹）。採血は投与前および投与
後６，１２，２４，４８時間毎に行い、尾静脈および背
側中足静脈から採取した血液を採血管に５０μｌ分取し
た。次いで、分取した血液に１ｍｌのLysing reagent
を混合し、撹拌した後１０分間室内で放置し、液が透明
になったのを確認してからミクロセルカウンタ（東亜電
子工業社製）で白血球数を測定した。なお、上記Lysing
reagent とは、塩化アンモニウム８，２６ｇ、エチレ
ンジアミン四酢酸四ナトリウム３７ｍｇ及び炭酸水素カ
リウム１ｇを蒸留水に溶かして１ｌとしたものである
（ｐＨ７．３）。

【００４６】上記測定結果を図７乃至図９に示した。こ
の結果によれば、ＳＭ−ｒＧ−ＣＳＦはｒＧ−ＣＳＦに
比べて約１／１０の投与量で同程度の末梢血白血球数増
加作用を示し、また０．５，５，５０μｇ／Ｋｇのいず
れでもｒＧ−ＣＳＦより末梢血白血球数増加時間の持続
が認められた。

【００４７】

【発明の効果】以上説明したように、本発明に係る顆粒
球コロニー刺激因子誘導体によれば、Ｇ−ＣＳＦをポリ
（スチレンマレイン酸）によって高分子化したことで、
アルブミンとの複合化が可能となり、Ｇ−ＣＳＦの腎臓
におけるクリアランスを小さくすることができた。その
結果、誘導体であるＳＭ−Ｇ−ＣＳＦを投与した場合に
は、Ｇ−ＣＳＦに比べ末梢血白血球数が増加すると共
に、その増加時間の持続を図ることができるといった効
果があることにより、本発明のＳＭ−Ｇ−ＣＳＦは白血
球減少症治療剤として極めて有効である。

【図面の簡単な説明】

【図１】血漿中のｒＧ−ＣＳＦ濃度を示すグラフであ
る。

【図２】ゲルろ過によるＳＭ−ｒＧ−ＣＳＦのピークを
示すグラフである。

【図３】イオン交換クロマトグラフィによるＳＭ−ｒＧ
−ＣＳＦのピークを示すグラフである。

【図４】ゲルろ過によるＳＭ−ｒＧ−ＣＳＦなどの分子
量を示すグラフである。

【図５】ラット摘出腎灌流系の模式図である。

【図６】上記のラット摘出腎灌流系を用いて測定したと
きの腎分布比率を示すグラフである。

【図７】０．５μｇ／Ｋｇ投与したときの末梢血白血球
数の経時的変化を示すグラフである。

【図８】５μｇ／Ｋｇ投与したときの末梢血白血球数の
経時的変化を示すグラフである。

【図９】５０μｇ／Ｋｇ投与したときの末梢血白血球数
の経時的変化を示すグラフである。

【符号の説明】

１ 腎臓 ２ 腎動脈カニューレ ３ 静脈カニューレ ４ 尿管カニューレ ５ ポンプ ６ 灌流液 ７ 下行大静脈 ８ 腸管静脈 ９ 下行大動脈 １０ 下行大動脈

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ０８Ｌ 35/06 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 乾 賢一 京都府京都市左京区高野東開町１−23 東大路高野第三住宅43−205 (72)発明者 堀 了平 京都府京都市右京区嵯峨大覚寺門前井頭 町12−75 (56)参考文献 特開 平２−234692（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−108827（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−75499（ＪＰ，Ａ) 特公 昭60−17206（ＪＰ，Ｂ１) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 14/535 A61K 38/00 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 顆粒球コロニー刺激因子とポリ（スチレ
   ンマレイン酸）との結合体からなる顆粒球コロニー刺激
   因子誘導体。
2. 【請求項２】 顆粒球コロニー刺激因子とポリ（スチレ
   ンマレイン酸）との結合体を有効成分とする白血球減少
   症治療剤。