KR20180032186A

KR20180032186A - 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자를 함유하는 피부 생리활성 피부외용제 조성물

Info

Publication number: KR20180032186A
Application number: KR1020170120414A
Authority: KR
Inventors: 정대현; 김수정; 박진우
Original assignee: 주식회사 바이오에프디엔씨
Priority date: 2016-09-19
Filing date: 2017-09-19
Publication date: 2018-03-29
Also published as: KR102114842B1

Abstract

본 발명은 세포 투과형 섬유아세포성장인자 융합 단백질을 함유하는 피부외용제 조성물에 관한 것으로, 피부 세포에 독성이 없으면서도 상기 단백질에 함유된 바이오 활성소재의 세포 투과능이 우수하여 피부 개선(회복), 항노화 또는 상처 치유에 특히 효과적으로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 상기 세포 투과형 융합 단백질은 1,2-헥산디올(Hexanediol)을 추가로 더 포함함으로써, 콜라겐 생성 촉진에 현저한 시너지 효과를 발휘하여 항 노화 또는 상처 치유에 더욱 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자를 함유하는 피부 생리활성 피부외용제 조성물{Topical Formulation Composed of Cell Permeable basic Fibroblast Growth Factor (LMWP-bFGF) fusion protein with Skin Physiological Activity}

본 발명은 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자 융합 단백질을 함유하는 피부외용제 조성물에 관한 것이다.

급속한 산업화가 진행되고 고령화 현상이 심화 됨에 따라, 이러한 환경변화에 기인한 각종 피부 질환이 증가하고 있어 의료 및 생명공학 업계에서는 피부질환 및 피부재생을 통한 항노화 연구가 활발하게 진행되고 있다.

생명공학 기술개발이 고도화됨에 따라, 화장품 산업분야에도 생명공학 첨단 기술이 도입되었으며, 준 치료제 개념의 코스메슈티컬(Cosmeceuticals, 화장품을 뜻하는 코스메틱과 치료제를 뜻하는 파마슈티컬의 신조 합성어) 개발이 화장품 시장의 새로운 트렌드로 떠오르고 있다. 이에 피부 질환 개선 및 재생, 항노화 기능을 보유한 단백질 소재 개발 필요성이 늘어나고 있으며, 화장품 제조자들은 이러한 필요성에 맞는 차별화된 소개 개발을 통한 시장 확대 전략을 추진하고 있다.

재조합 단백질 기술은 유전공학기술을 이용하여 고등생물에서 유래한 단백질을 미생물 및 동물세포에서 대량 발현시키는 기술이다. 단백질의 기능적 특성에 따라 미생물 및 동물세포에서 생산하는 공정기술이 응용되고 있으며, 이렇게 생산된 단백질은 제약, 화장품, 식품, 분석 및 진단 산업분야에 널리 사용되고 있다. 재조합 단백질 기반의 화장품 신소재의 경우, 주로 트러블성 피부질환을 대상으로 연구개발이 활발하다. 예를 들어, 재조합 단백질은 단백질의 물리적 특성에 기인된 낮은 피부 투과능과 물리적 안정성을 개선할 경우 글로벌 시장을 선도할 수 있는 원료개발 및 상용화가 가능하다.

하지만, 이러한 재조합 단백질들은 일반적으로 친수성이고 거대한 분자들은 세포막이라는 장벽에 의해 세포 안으로 들어가는 것이 매우 어렵다. 세포막은 펩타이드나 단백질, 핵산과 같은 거대 분자가 세포 내로 들어가지 못하게 막으며 세포막 수용체의 의한 엔도사이토시스(Endocytosis)라는 생리적 기작을 통해 세포 내로 들어가더라도 세포의 리소좀(Lysosomal compartment)과 융합되어 결국 분해되므로 이들 거대분자 바이오 활성소재를 세포 외에서 전달하는 데 많은 제약이 따른다.

또한, 성장인자(Growth factor)와 같은 거대분자 바이오 활성성분 역시 친수성이며 분자량이 커서 세포막을 투과하여 피부에 흡수되는데 한계가 있기 때문에 실질적인 활성효과를 기대하기는 어렵다. 이러한 분자량이 큰 단백질의 피부흡수를 증가시키기 위해 통상적으로 레이저나 메조룰러와 같은 물리적으로 피부에 구멍을 내는 방법 또는 계면활성제 및 나노구조체 등의 전달체(Carrier)를 이용하는 방법이 적용되고 있으나, 이러한 방법은 피부 장벽의 손상 위험이 있고 거대분자를 흡수시키기에는 여전히 한계가 있으며 별도의 디바이스 시술이 요구되는 단점이 있다.

이러한 한계를 극복하기 위해 최근 새로운 대안들이 제시 되었는데 그 중 세포 투과형 펩타이드(Cell penetrating peptide, CPP)들은 현재까지 낮은 세포막 투과성 및 빠른 생체 내 반감기로 인해 약물로 사용하기 어려웠던 치료용 단백질 및 유전자와 같은 거대 분자들의 의약학적 이용가치를 높일 수 있어 상기 펩타이드를 이용해 살아있는 세포의 질이나 핵 안으로 바이오 활성소재를 보다 안전하고 효과적으로 전달할 수 있는 방법이 연구되고 있다.

이렇듯 CPP를 이용하여 세포 내 효율적 수송을 위한 다양한 응용이 시도되었으나(특허문헌 0001), 아직까지 세포 투과형 펩타이드와 성장인자들을 결합시켜 화장료 조성물의 핵심소재로 활용하는 연구는 드물었다.

[특허문헌 0001] 대한민국공개특허 제10-2010-0094622호

본 발명의 목적은 세포 독성이 없으면서도 세포 투과능이 우수한 세포 투과형 펩타이드와 성장인자인 섬유아세포성장인자(Fibroblast Growth Factor; FGF)가 융합된 융합 단백질을 포함하는 피부 외용제 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 세포 투과형 펩타이드와 성장인자인 섬유아세포성장인자가 융합된 융합 단백질에 1,2-헥산디올을 더 포함하는 피부 외용제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 인체에 부작용이 없으면서 콜라겐 생성 촉진, 피부 재생 또는 상처 치유의 효과를 갖는 피부 외용제 조성물에 관한 것으로, 세포 투과성이 크게 증가되고, 이로 인해 피부 생리활성이 증대된 융합 단백질인, 세포 투과형 성장인자 융합 단백질을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 세포 투과형 펩타이드에 성장인자가 융합된, 세포 투과형 성장인자 융합 단백지을 포함하는 피부 외용제 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 세포 투과형 펩타이드는 TAT, 페너트라틴(penetratin), Antp(antennapedia protein), 또는 저분자 프로타민(Low molecular weight protamine,LMWP)으로 이루어진 군에서 하나 이상인 것일 수 있고, 바람직하게는 저분자 프로타민(Low molecular weight protamine, LMWP)인 것일 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다. 보다 바람직하게는 상기 저분자 프로타민은 서열번호 1로 표시된 아미노산 서열로 표시된 펩타이드일 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 성장인자는 염기성섬유아세포성장인자(Basic Fibroblast Growth Factor; bFGF), 또는 산성섬유아세포성장인자 (acidic Fibroblast Growth Factor; aFGF)인 것을 특징으로 한다. 보다 바람직하게는 상기 성장인자는 염기성섬유아세포성장인자(bFGF)인 것일 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 세포 투과형 성장인자는, 성장인자의 N-말단, C-말단 또는 N-말단 및 C-말단에 세포 투과형 펩타이드의 아미노산 서열이 결합되어 있는 융합 단백질의 형태인, 세포 투과형 성장인자 융합 단백질인 것을 특징으로 한다.

보다 구체적으로, 본 발명은 세포 투과형 펩타이드에 염기성섬유아세포성장인자(basic Fibroblast Growth factor, bFGF)가 융합된, 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자를 포함하는 피부 외용제 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 1,2-헥산디올(1,2-Hexanediol)을 더 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 콜라겐 생성을 촉진용인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 피부 재생용인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 상기 조성물은 상처 치유용인 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명은 세포막 투과성이 우수하고 생체 친화적인 펩타이드인 PTD(protein transduction domain)을 이용하여 바이오 활성소재 자체의 피부 침투력을 증가시켜 바이오 활성소재의 효과를 극대화 시키고자 하였다.

PTD는 세포막 투과성이 우수하고 생체 친화적인 펩타이드로, PTD에 의한 세포 내 전달의 주요 기전 중 하나는 endocytosis의 한종류인 mavropinocytosis에 의해 이루어진다. PTD가 세포 표면에 부착되면 세포막이 이를 감싸서 macropinosome을 형성하여 세포 속으로 uptake 되고 작용이 끝난 후에는 분해 및 배출되는 것으로 알려져 있다. 이러한 기전을 통한 세포 내 전달은 효율적이며 세포막을 교란시키거나 손상시키지 않고 수행될 수 있다. 또한 PTD에 의한 물질의 세포막 투과는 수용체 및 전달체에 의해 영향을 받지 않기 때문에 생물학적 활성 물질의 세포 내 전달을 위한 전달체(carrier)로 활용 가능하다. PTD는 바이러스성 PTD, 기존 PTD를 본 따 합성한 합성PTD, 생체에서 유래된 비 바이러스성 PTD으로 분류되며, 바이러스성 PTD로는 TAT, YARA 등이 있고, 비바이러스성 PTD로는 LMWP 등이 있다.

그리하여, 본 발명은 세포 투과형 펩타이드에 성장인자가 융합된 단백질인 ("세포 투과형 펩타이드-성장인자 융합 단백질"), 세포 투과형 성장인자 융합 단백질을 포함하는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

보다 구체적으로, 상기 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자는, 염기성섬유아세포성장인자의 N-말단, C-말단 또는 N-말단 및 C-말단에 세포 투과형 펩타이드의 아미노산 서열이 결합되어 있는 융합 단백질의 형태인, 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자일 수 있다.

본 발명에 있어서, "융합 단백질"이란 수송도메인 및 한 개 이상의 목적 단백질 부분을 포함하며, 수송도메인과 목적 단백질의 유전적 융합이나 화학 결합으로 형성된 복합체를 의미한다. 또한, 상기 "유전적 융합"이란 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 유전적 발현을 통해서 형성된 선형, 공유결합으로 이루어진 연결을 의미한다. 따라서, 본 발명의 "세포 투과형 펩타이드-성장인자 융합 단백질"은, 세포 투과형 펩타이드와 성장인자 단백질을 포함하며, 세포 투과형 펩타이드와 성장인자의 유전적 융합이나 화학 결합으로 형성된 공유결합 복합체를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 융합 단백질의 제조는 유전자 재조합 방법으로 세포 투과형 성장인자 융합 단백질을 제조할 수 있다.

본 발명에서 특히 제시하고 있는 유전자 재조합 방법의 경우에는, 성장인자 고유의 생물학적 활성을 유지시킬 수 있고, 성장인자 내 세포 투과형 펩타이드의 결합 위치를 정확히 조절할 수 있으며, 합성에 의해 LMWP를 각 성장인자에 결합시키는 경우 합성 중 성장인자의 활성 감소 가능 및 합성 중간마다 별도의 분리 및 정제 과정이 필요하므로 생산성 및 경제성이 저하될 수 있으나, 유전자 재조합에 의한 결합 시스템은 제조 과정 중 성장인자의 활성이 저하될 우려가 없으며 제조 중간에 별도의 분리 및 정제 과정을 필요로 하지 않는다. 또한, 융합 성장인자 발현 및 정제 시스템 구축 후 대량생산이 가능하여 생산성 또한 우수하다.

본 발명에서 사용되는 유전자 재조합 방법은, 종래 본 기술분야에 사용되고 있는 유전공학적 기술을 활용한 것으로, 세포 투과형 펩타이드와 성장인자를 융합한 후, 발현 벡터에 삽입하여 융합 단백질 형태로 얻을 수 있으며, 여기에 사용될 수 있는 발현 벡터로는, 예컨대, 대장균(E.coli) 발현 벡터인 pBF-01(+), pET21 벡터 등이 가능하나, 종래 이용되는 발현 벡터라면 크게 제한됨이 없이 이용가능 하다.

본 발명에 있어서, 상기 세포 투과형 펩타이드는, 그 종류에 크게 제한됨이 없으나, 바람직하게는, TAT, 페너트라틴(penetratin), Antp(antennapedia protein), 또는 저분자 프로타민(Low molecular weight protamine, LMWP)으로 이루어진 군에서 하나 이상일 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 세포 투과형 펩타이드는 저분자 프로타민(Low molecular weight protamine, LMWP)인 것일 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 LMWP는 프로타민의 일 부분으로써, 일 예시로, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드일 수 있다.

서열번호 1: N VSRRRRRRGGRRRR - C

본 발명에 있어서, 상기 성장인자는, 그 종류에 크게 제한됨이 없으나, 염기성섬유아세포성장인자(bFGF) 또는 산성섬유아세포성장인자(aFGF)일 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 성장인자는 염기성섬유아세포성장인자(bFGF)일 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 세포 투과형 펩타이드-성장인자 융합 단백질의 일 예시로, LMWP-bFGF 융합 단백질일 수 있으며, 일 예시로 서열번호 2의 서열로 구성된 융합단백질 (밑줄 친 서열부분은 상기 'LMWP'를 의미함)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

서열번호 2: N - VSRRRRRRGGRRRR PALPEDGGSGAFPPGHFKDPKRLYCKNGGFFLRIHPDGRVDGVREKSDPHIKLQLQAEERGVVSIKGVCANRYLAMKEDGRLLASKCVTDECFFFERLESNNYNTYRSRKYTSWYVALKRTGQYKLGSKTGPGQKAILFLPMSAKS - C

보다 바람직하게는 상기 세포 투과형 혈관내피세포성장인자는 상기 피부 외용제 조성물 중 0.01 내지 100 ppm 농도로 포함될 수 있다. 0.01 ppm 미만으로 포함되는 경우에는 목적하는 콜라겐 생성 촉진 등의 효과를 충분히 발휘 할 수 없고, 100 ppm 초과로 포함되는 경우에는 목적하는 개체에 독성으로 인한 부작용을 유발할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 1,2-헥산디올(Hexanediol)을 더 포함할 수 있고, 바람직하게는 상기 피부 외용제 조성물 100 중량부 기준으로 0.1 중량부 내지 2.5 중량부를 포함할 수 있다. 0.1 중량부 미만 또는 2.5 중량부 초과로 1,2-헥산디올을 포함하는 경우에는 콜라겐 생성 촉진의 효과를 충분히 발휘할 수 없다.

본 발명에서 사용되는 상기 1,2-헥산디올(Hexanediol)은 화장품 원료, 생활용품 등 인체에 접촉하는 제품의 방부제, 항균 및 보습 역할을 하는 인체에 무해한 필수 원료로, 항균성은 존재하지만 살균력은 가지고 있지 않아 보존제의 보조역할을 수행하는 것으로 알려져 있다.

보다 구체적으로는, 세포 투과형 펩타이드로 비 바이러스성 PTD인 저분자 프로타민(Low molecular weight protamine, LMWP)을 포함하는 피부 재생용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 세포 투과형 성장인자 융합 단백질은 콜라겐 생성 촉진용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에서 상기 콜라겐 생성 촉진용은 섬유아세포의 콜라겐 합성을 촉진하는 것으로, 상기 콜라겐은 세포 외 기질(Matrix)의 주요 구성 성분에 해당하며, 견고한 3중 나선 구조를 갖고 있다. 피부의 진피에 그 포함량이 매우 높아 피부의 기계적 견고성, 결합 조직의 저항력과 조직의 결합력, 세포 접착의 지탱, 세포 분할과 분화의 유도 능력이 존재한다. 본 발명의 목적상 상기 세포 투과형 성장인자 융합 단백질은 콜라겐 생성 촉진으로 인하여 피부에 발생될 수 있는 주름, 탄력 저하 등의 피부 노화를 현저하게 개선할 수 있다.

본 발명에 있어서, 이러한 세포 투과형 성장인자 융합 단백질은 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가지고 있어, 피부 재생용 피부 외용제 조성물, 상처 치유용 피부 외용제 조성물인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따른 세포 투과형 성장인자 융합 단백질은 포유류, 바람직하게는 인간의 몸에 적용되는 다양한 종류의 외용 조성물의 일부를 구성할 수 있다. 이러한 관점에서, 본 발명은 적어도 하나의 세포 투과형 성장인자 융합 단백질을 포함하는 화장료 또는 피부약제 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 본 기술 분야의 당업자에게 공지된 종래 방법으로 제조될 수 있다. 세포 투과형 성장인자 융합 단백질은 종래의 미용상 또는 피부약제학상 허용 가능한 용매, 이를 테면, 에탄올, 프로판올 또는 이소프로판올, 프로필렌 글리콜, 글리세린, 부틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜 또는 이들의 혼합물에 용해될 수 있다. 세포 투과형 성장인자 융합 단백질은 활성 성분의 침투를 향상시키기 위한 미용상 또는 약제학상 전달 시스템 및/또는 서방형 시스템에 미리 혼입될 수 있고, 이러한 시스템의 비제한적인 예로는, 리포좀, 밀리파티클, 마이크로파티클 및 나노파티클뿐만 아니라, 스폰지, 소낭, 미셀, 밀리스피어, 마이크로스피어, 나노스피어, 리포스피어, 밀리캡슐, 마이크로캡슐 및 나노캡슐을 들 수 있다. 마찬가지로, 본 발명의 세포 투과형 성장인자 융합 단백질은 탈크, 벤토나이트, 전분 또는 말토덱스트린 등 고체 유기 고분자나 미네랄 지지체에 흡착될 수도 있다. 이러한 제제는 바른 후(leave on) 씻어내는(rinse-off) 제형을 포함하는 크림, 수중 오일과 실리콘의 에멀젼, 수중 오일의 에멀젼, 수중 실리콘의 에멀젼, 오일과 실리콘 중 물의 에멀젼, 오일 중 물의 에멀젼, 실리콘 중 물의 에멀젼, 오일, 밀크, 밤, 폼, 로션, 젤, 리너먼트(liniments), 세럼, 비누, 연고, 바, 펜슬 또는 스프레이 등 다른 형태의 제형에 이용될 수도 있고, 본 기술 분야에 공지된 기법으로 습윤 와이프(wet wipe), 하이드로겔, 접착성(또는, 비접착성) 패치 또는 페이스 마스크 등 다양한 종류의 고체 보조제에 혼입되거나, 컨실러, 메이크업 파운데이션, 메이크업 리무버 밀크 또는 로션, 아이섀도우, 립스틱 등 다양한 메이크업류 제품에 혼입될 수도 있다. 본 발명에 있어서, 피부 외용제 조성물은 화장료 조성물 또는 약제학적 조성물일 수 있다.

상기 화장료 조성물에 있어서는, 화장품 제제에 있어서 수용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 여기서, "화장품 제제에 있어서 수용 가능한 담체"란 화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉 시 인체가 적응 가능한 이상의 독성, 불안정성 또는 자극성이 없는 것을 말한다.

상기 담체는 본 발명의 피부 외용제 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1 중량 % 내지 약 99.99 중량 %, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 90 중량% 내지 약 99.99 중량 %로 포함될 수 있다. 그러나 상기 비율은 본 발명의 피부 외용제 조성물이 제조되는 후술한 바의 제형에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴, 목 등)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다. 상기 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료로 사용될 수 있는 화합물/조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구현예로써, 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은 상기 세포 투과형 성장인자 융합 단백질이외에 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글키롤, 폴리옥시에틸렌 경화피마자유, 에탄올, 트리에탄올아민 등을 포함할 수 있으며, 방부제, 항료, 착색료, 정제수 등을 필요에 따라 미량 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은, 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 예컨대, 화장수, 에센스, 젤, 에멀젼, 로션, 크림(수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액(무수 및 수계), 무수 생성물(오일 및 글리콜계), 젤, 마스크, 팩, 분말, 또는 젤라틴 등의 피막이 있는 캅셀 (소프트 캅셀, 하드 캅셀) 제형 등의 형태로 제조될 수 있다.

본 발명에 있어서의 피부는 얼굴 뿐만 아니라, 두피, 전신도 포함되는 개념으로, 이러한 두피에 적용될 수 있는 피부 외용제 조성물로써, 샴푸, 린스, 트리트먼트, 발모제 등이 있고, 전신에 적용될 수 있는 바디클렌져 등의 용도로써 다양한 형태로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 세포 투과형 성장인자 융합 단백질을 함유 피부 외용제 조성물의 제조방법은 전술한 제조방법에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 제조방법을 일부 변형시킨 방법으로도 본 발명에 따른 세포 투과형 성장인자 융합 단백질을 함유 피부 외용제 조성물을 제조할 수 있다.

특히, 상기 피부 외용제 조성물은 본 발명에 특별히 개시된 제조방법 이외에도, 통상적으로 알려진 제조방법을 이용하여, 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조될 수 있다.

화장료 조성물로 제조될 경우, 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연화장수가 있다. 또한, 피부과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소적용 또는 전신 적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.

또한, 적합한 화장품의 제형으로는, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 피부 외용제 조성물은 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일,염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고, 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

이러한, 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은 피부 노화 방지, 피부 재생, 상처치유 등 항노화 기능을 할 수 있는 기능성 화장품의 형태를 포함한다.

본 발명에 있어서, 약제학적 조성물의 경우, 하기 실시예에서 제시하는 상처(창상) 치유를 위한 약제학적 조성물로써 기능할 수 있다.

이러한 약제학적 조성물은 유효성분인 세포 투과형 성장인자 융합 단백질외에, "약학적으로 허용 가능한 담체"를 포함할 수 있으며, 이러한 담체는 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제, 감미제, 안정제 및 방부제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 약학 조성물은 첨가제를 더 포함할 수 있다. 상기 첨가제로 향료, 비타민, 및 항산화제가 포함될 수 있다. 상기 담체로 약제학적으로 허용 가능한 담체는 모두 가능하며, 예를 들면, 희석제로는 유당, 덱스트린, 타피오카(tapioca) 녹말, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 스테아린산 마그네슘 또는 탈크, 결합제로는 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필셀룰로오스일 수 있다. 또한, 붕해제로는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산나트륨, 폴라크릴린칼륨, 또는 크로스포비돈, 감미제로는 백당, 과당, 솔비톨, 또는 아스파탐, 안정제로는 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 베타-사이클로덱스트린, 또는 잔탄검, 방부제로는 파라옥시안식향산메틸, 파라옥시안식향산프로필, 또는 솔빈산칼륨일 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 약제학적 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 경구 투여제제, 주사제, 좌제, 경피 투여제제, 및 경비 투여제제의 제형으로 제제화되어 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 제형은 액제, 현탁제, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 또는 엑스제와 같은 경구 투여용 제형일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

본 발명에 따른 세포 투과형 융합 단백질을 포함하는 피부 외용제 조성물은 피부 세포에 독성이 없으면서도 상기 단백질에 함유된 바이오 활성소재의 세포 투과능이 우수하여 피부 개선(회복), 항노화 또는 상처 치유에 특히 효과적으로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 상기 세포 투과형 융합 단백질은 1,2-헥산디올(Hexanediol)을 추가로 더 포함함으로써, 콜라겐 생성 촉진에 현저한 시너지 효과를 발휘하여 항 노화 또는 상처 치유에 더욱 효과적으로 사용될 수 있다.

도 1은 LMWP-bFGF를 제조하여 SDS-PAGE 정제한 결과이다. 도 1-(A)은 affinity chromatography를 활용하여 LMWP-bFGF를 제조한 SDS-PAGF 정제 결과이다(Lane 1: LMWP-bFGF 발현클론의 세포파쇄와 원심분리 후 상등액(전체 단백질), Lane 2: Affinity chromatography에 결합하지 않은 발현클론의 오염 단백질, Lane 3: 60mM imidazole을 함유하는 washing buffer로 세척된 단백질, Lane 4: 100mM imidazole을 함유하는 elution buffer 1로 용출된 단백질, Lane 5: 200mM imidazole을 함유하는 elution buffer 2로 용출된 단백질).
도 1-(B)는 표준생산공정을 통해 생산된 LMWP-bFGF의 SDS-PAGE 정제 결과이다.
도 2는 LMWP-bFGF의 인간피부구성세포에 대한 세포독성 실험(MTT assay) 결과이다. (A)는 인간각질형성세포(HaCaT cell)에 대한 LMWP-bFGF의 MTT assay 결과이며, (B)는 인간피부섬유아세포(CCD-989sk cell)에 대한 LMWP-bFGF의 MTT assay 결과이다.
도 3은 LMWP-bFGF의 농도별 인간피부섬유아세포의 세포증식 생물학적 활성도에 대한 결과이다.
도 4는 LMWP-bFGF의 농도별 인간피부섬유아세포의 세포 생존율 실험 결과이다.
도 5는 LMWP-bFGF의 인간피부섬유아세포 투과도 평가 결과이다(scale bar=20,000nm).
도 6은 LMWP-bFGF의 인공피부막(Skin PAMPA) 투과도 평가 결과이다.
도 7은 LMWP-bFGF의 농도별 인간피부섬유아세포 증식 활성에 의한 피부재생 효능을 실험한 결과이다.
도 8은 500 ng/mL의 LMWP-bFGF 처리 후, 마우스 섬유아세포(NIH 3T3T cell) 증식 활성에 의한 상처회복율을 실험한 결과이다(A:상처회복률, B:상처회복 이미지(검은색영역: NIH 3T3T cell monolayer, 회색영역: scratch 상처영역)).
도 9는 1 ng/mL의 LMWP-bFGF 처리 후, 인간섬유아세포(CCD-986sk cell) 증식 활성에 의한 상처회복율을 실험한 결과이다(A:상처회복률, B:상처회복 이미지(검은색영역: CCD-986sk cell monolayer, 회색영역: scratch 상처영역)).
도 10은 LMWP-bFGF의 콜라겐 생성 촉진 효과 평가 결과이다. 1은 아무것도 처리하지 않은 음성 대조군에 해당하고, 2는 LMWP-bFGF을 10ppm 농도로 단독하여 처리한 군, 3은 LMWP-bFGF 10ppm 및 0.1%의 1,2-Hexanediol 병용 처리군, 및 4는 LMWP-bFGF 10ppm 및 2.5% 1,2-Hexanediol 병용 처리군에 해당한다.
도 11은 도 10에서 나타낸 LMWP-bFGF의 콜라겐 생성 촉진 효과 평가 결과의 수치값을 그래프로 나타낸 것이다.

실시예

실시예 1. 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자(LMWP-bFGF) 융합 단백질의 제조

(1) cDNA 및 발현벡터 제조

저분자 프로타민 융합을 통해 원형의 염기성섬유아세포성장인자 (bFGF)를 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자 (LMWP-bFGF) 융합 단백질로 제조하였다. 저분자 프로타민을 암호화하는 유전자(하기 표 1의 서열번호1)를 섬유아세포성장인자 (bFGF) cDNA의 N-말단부에 융합하고 발현벡터로의 클로닝을 위하여 제한효소 NdeI와 XhoI의 제한부위(restriction sites)를 양 말단에 갖는 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자 (LMWP-bFGF) 융합 단백질의 cDNA를 확보하였다(하기 표 1의 서열번호 2). 이렇게 수득된 삽입 cDNA(insert cDNA)를 발현 벡터에 삽입하였다. 대장균(E.coli) 발현 벡터인 pBF-01(+)를 NdeⅠ와 XhoI으로 이중 절단(double digestion) 처리하여 클로닝 부위를 개방하고, NdeⅠ와 XhoI이 이중 절단한 후 삽입 cDNA(insert cDNA)를 정제하여 발현벡터와 목적 단백질의 삽입 cDNA(insert cDNA)를 라이게이션(ligation)하여 융합하였다. 이렇게 제조된 발현 벡터 pBF-01(+)-LMWP-bFGF 유전자 수준에서 융합한 후, 외래 재조합단백질의 발현에 사용하는 BL21계열의 대장균에 형질전환하여 발현 클론을 제조하였다. 하기 표 1은 세포 투과형 펩타이드(LMWP)와 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자(LMWP-bFGF) 융합 단백질의 아미노산 조성을 나타낸 것이다.

	구분	아미노산 조성
서열번호 1	세포 투과형 펩타이드(LMWP)	N-VSRRRRRRGGRRRR-C
서열번호 2	세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자(LMWP-bFGF) 융합 단백질	N - VSRRRRRRGGRRRR PALPEDGGSGAFPPGHFKDPKRLYCKNGGFFLRIHPDGRVDGVREKSDPHIKLQLQAEERGVVSIKGVCANRYLAMKEDGRLLASKCVTDECFFFERLESNNYNTYRSRKYTSWYVALKRTGQYKLGSKTGPGQKAILFLPMSAKS - C

(2) 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자(LMWP-bFGF) 융합 단백질의 발현, 정제

상기에서 제조한 발현 벡터, pBF-01(+)-LMWP-bFGF를 재조합 단백질 발현용 E.coli 균주로 형질 전환시킴으로써 발현 균주를 구축하였다. 이렇게 확보된 발현 균주를 발현용 글리세롤 스톡(glycerol stock)을 이용하여 다음과 같이 발현 및 정제하였다. 발현용 글리세롤 스톡을 L-broth(LB) 배양액에 1/200 비율로 접종하여 37℃, 150rpm 조건에서 광학 밀도(O.D)가 약 0.8에 도달할 때까지 배양하였다. 배양의 광학 밀도가 0.8에 도달하면 본 배양은 발현용 글리세롤 스톡을 L-broth(LB) 배양액에 1/100 비율로 접종하여 37℃, 100 rpm 조건에서 광학 밀도가 0.6 내지 0.8 가 될 때 까지 배양하였다. 발현을 위해 이소프로-β-D-티오갈락토피라노사이드(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, IPTG)를 배양액 내 최종 농도가 0.5 mM으로 처리하여 목적단백질을 유도(induction)한 후, 25℃, 100rpm 조건에서 하루 동안 배양하였다. 다음날 원심 분리(6,000rpm, 4℃, 10분)하여 배양 균체를 획득하고, 획득한 균체 펠렛 1 g 당 용균버퍼(Lysis buffer, sodium phosphate buffer, pH7.8, 10mM NaCl, 5mM imidazole) 20ml씩 첨가하여 현탁하였다. 완전히 현탁되면 초음파 처리(sonication)을 통해 균체를 파쇄하였다(10분간 sonication 10초/holding 10초 반복, Amplitude 50%, 4℃). 파쇄된 균체액은 원심 분리(12,000 rpm, 4℃, 10분)하여 비파쇄 균체 및 불용성 분획을 제거하고 상등액만 취한 후, 0.45 ㎛ 실린지(syringe)로 여과하였다. 여과한 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자(LMWP-bFGF)를 함유하는 원심 분리 상등액을 동일한 용균 버퍼(Lysis buffer, sodium phosphate buffer, pH 7.8, 10 mM NaCl, 5 mM imidazole)로 미리 평형화 시킨 affinity column에 30분간 회전시켜 레진 결합을 유도한 후, 결합되지 않은 오염 단백질들은 용출로 제거하였다. 세척 버퍼1(washing buffer 1, sodium phosphate buffer, pH7.5, 10 mM NaCl, 60 mM imidazole)로 30분씩 1회, 다시 용출 버퍼 1(Elution buffer 1, sodium phosphate buffer, pH7.5, 10 mM NaCl, 100 mM imidazole)로 30분간 1회 컬럼을 씻어주고 용출 버퍼 2(Elution buffer 2, sodium phosphate buffer, pH7.5, 10 mM NaCl, 200 mM imidazole)로 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자 (LMWP-bFGF)를 컬럼으로부터 용출시킨 뒤 초미세 여과(ultra filtration)(Amicon, cutting membrane 3000Da)로 용적 대비 20배 농축하였다. 농축된 용액을 겔 여과(gel filtration)(Sephadez G-100, Buffer GF(20mM sodium phosphate buffer, pH7.5, NaCl 500mM))을 이용하여 목적단백질인 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자 (LMWP-bFGF) 융합 단백질 분획만을 회수하였다. 회수된 분획은 Affinity chromatograpy에서 분리된 목적단백질 LMWP-bFGF을 cutting kDa이 10kDa인 초미세여과 를 통해 오염 단백질을 추가 정제한 후, 200배 분량의 NaCl이 포함되지 않은 버퍼로 dialysis를 수행하였다. 15% SDS-PAGE 정제도는 200 mM imidazole을 함유하는 용출버퍼(elution buffer)의 용출(elution) 분획에서 가장 효과적으로 분리되었으며, 약 90-95% 의 정제도를 확보하였다(도 1-(A), lane5). 정제 결과, 상기 방법으로 수득된 160개 아미노산으로 구성된 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자(LMWP-bFGF) 융합 단백질은 SDS-PAGE 분석결과 약 18D ka의 크기로 확인되어 목적단백질이 발현 및 정제되었음을 확인하였다. SDS-PAGE 분석결과는 도 1-(A)에 나타내었다.

또한, 반복적인 정제를 통해 수립한 표준생산공정을 통해서도 일정한 순도의 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자 (LMWP-bFGF) 융합 단백질이 높은 순도로 발현 정제됨을 확인하였다(도1-(B)).

표준생산공정은 정제 전 샘플처리 프로토콜과 affinity chromatography를 기본으로 한 정제 프로토콜, 및 컬럼으로 용출(elution)된 샘플분획의 dialysis와 초미세여과 등의 후처리 공정으로 구성되었다.

실시예 2. 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자 (LMWP-bFGF) 융합 단백질의 in vitro 인간피부구성세포 안정성 평가(MMT assay)

실시예 1에서 제조된 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자 (LMWP-bFGF) 융합 단백질의 인간 피부 안전성에 대한 평가를 위하여 인간 피부구성세포들을 이용하여 세포 안전성(safety) 시험을 수행하였다. 인간 피부구성세포로는 인간각질형성세포(keratinocyte)의 세포주인 HaCaT cell과 인간섬유아세포(fibroblast)의 세포주인 CCD-986sk cell을 이용하였다.

HaCaT cell과 CCD-986sk cell을 24well plate에 5 x 10³cells/well과 5 x 10⁴cells/well씩 동일하게 heamacytometer를 이용하여 계수한 후 분주하여 배양하였다. 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 48시간 배양하여 배양용기 표면적의 ~50%만큼 배양되면, 실시예 1에서 제조된 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자 (LMWP-bFGF) 융합 단백질를 배지 내 최종농도가 0.1 ppm~10.0 ppm의 농도가 되도록 처리하여 48시간 더 배양하였다. 배양 후, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT, Sigma M5655, USA) 용액(2.5 mg/mL)을 50 ㎕ 첨가하고 3시간 추가로 배양하였다 그 후, 세포 배양액을 전부 버리고, 200 ㎕의 dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma D2650, USA)를 각 well 당 200 ㎕ 처리하여 교반한 후, 100 ㎕ 씩을 96well로 취하여 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay(ELISA)로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포에 대한 독성 혹은 증식을 촉진하는 정도는 순수한 물을 사용한 대조군의 흡광 강도를 기준으로 백분율로 표시하였다.

그 결과, 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자 (LMWP-bFGF) 융합 단백질은 0.1 ppm~10.0 ppm의 농도에서는 세포 독성이 전혀 관찰되지 않았으며, 처리 농도가 증가할수록 농도에 의존되어 세포 생육이 증대되는 결과를 확인하였다(도 2).

실시예 3. 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자(LMWP-bFGF) 융합 단백질의 생물학적 활성 평가: 피부세포 증식 활성도

피부 구성 인간섬유아세포 (CCD986-sk cell) 배양 시 실시예 1에서 제조한 세포 투과형 염기섬유아세포성장인자(LMWP-bFGF) 융합 단백질과 일반 염기섬유아세포성장인자(bFGF)를 농도별로 처리하여 인간섬유아세포 증식 정도를 평가함으로써 실시예 1에서 제조한 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자(LMWP-bFGF) 융합 단백질의 생물학적 활성을 비교 및 평가하였다.

인간섬유아세포 (human fibroblast cell, CCD-986sk)를 96 well plate에 5x10³cell/well씩 분주하여 10% FBS/DMEM 배지로 24시간 배양한 후 배양액을 제거하고 0.05% FBS가 포함된 DMEM 배양액에서 다시 24시간 배양하였다. 이후, 0.5% FBS가 포함된 DMEM 배지로 단계적으로 희석한 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자(LMWP-bFGF) 융합 단백질및 일반 염기성섬유아세포성장인자(bFGF)를 각 well에 100 ㎕씩 가한 후 다시 24시간 동안 CO₂ incubator에서 배양하였다. 이후, 5 mg/mL 농도의 WST-1(Roche Diagnostics) 용액을 각 well에 10 ㎕씩 처리한 후 37℃에서 4시간 동안 반응시킨 뒤 450 nm에서 흡광도 측정하여 무처치 음성 대조군 대비 인간피부섬유아세포의 증식 정도를 평가하였다. 피부세포 증식 활성에 대한 양성 대조군으로는 유전자 재조합 인간 염기성섬유아세포성장인자(bFGF)를 사용하였다.

그 결과, 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자(LMWP-bFGF) 융합 단백질은 50 ng/mL 농도에서 무처치 음성 대조군 대비 최대 활성을 나타냈으며 인간 피부섬유아세포의 증식이 169% 증가하였다(^***p < 0.001, 무처치 음성대조군 대비) (도 3).

모든 농도에서 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자(LMWP-bFGF) 융합 단백질은 일반 염기섬유아세포성장인자(bFGF) 대비 동등한 피부세포 증식 생물학적 활성을 나타냈다. 이는 세포 투과형 아미노산 서열인 저분자량 프로타민(LMWP)을 기존 성장인자 말단에 연결해도 기존 성장인자의 생물학적 활성이 유지됨을 의미한다(도 3).

실시예 4. 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자(LMWP-bFGF) 융ㅇ합 단백질의 인간피부세포 안전성(독성) 평가

인간섬유아세포 (CCD986-sk cell) 배양 시 실시예 1에서 제조된 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자(LMWP-bFGF) 융합 단백질과 일반 염기섬유아세포성장인자(bFGF)를 농도별로 처리하여 인간섬유아세포의 사멸 정도를 평가함으로써 실시예 1에서 제조된 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자(LMWP-bFGF) 융합 단백질의 피부세포 안전성을 비교, 평가하였다. 피부세포 증식 활성에 대한 양성 대조군으로 유전자 재조합 인간 형질전환성장인자(recombinant human transforming growth factor-beta, rhTGF-β)를 사용하였다.

인간섬유아세포(human fibroblast cell, CCD-986sk cell)를 96 well plate에 5x10³cell/well씩 분주하여 10% FBS/DMEM 배지로 24시간 배양한 후 DMEM 배지로 단계적으로 희석한 인간 형질전환성장인자(rhTGF-β), 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자(LMWP-bFGF) 융합 단백질 및 일반 염기성 섬유아세포성장인자(bFGF)를 각 well에 100 ㎕씩 가한 후 다시 24시간 동안 CO₂ incubator에서 배양하였다. WST-8[2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)- 2H-tetrazolium monosodium salt] 용액을 각 well에 10㎕씩 처리한 후 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 뒤 450 nm에서 흡광도 측정하여 무처치 음성 대조군 대비 인간피부섬유아세포의 세포 사멸 정도를 평가하였다. 피부세포 증식 활성에 대한 양성 대조군은 유전자 재조합 인간 형질전환성장인자(recombinant human transforming growth factor-beta, rhTGF-β)를 사용하였다.

그 결과, 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자(LMWP-bFGF) 융합 단백질은 모든 농도범위에서 무처치 음성대조군 대비 100% 이상의 세포 생존율을 나타냈으며 오히려 500 ng/mL 농도에서는 무처치 음성 대조군 대비 인간피부섬유아세포 증식이 최대 125% 증가하였다(^***p < 0.001, 무처치 음성대조군 대비) (도 4).

또한, 모든 농도에서 세포 투과형 염기성 섬유아세포성장인자(LMWP-bFGF) 융합 단백질은 일반 염기성섬유아세포성장인자(bFGF) 및 형질전환성장인자(rhTGF-β)와 마찬가지로 피부세포에 대한 독성을 나타내지 않았다. 이는 세포 투과형 아미노산 서열인 저분자량 프로타민(LMWP)을 기존 성장인자 말단에 연결해도 추가적인 피부세포독성을 유발하지 않음을 의미한다(도 4).

실시예 5. 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자 (LMWP-bFGF) 융합 단백질의 피부세포 투과도 증진 평가:피부세포 투과 증진 이미지

인간섬유아세포 (CCD986-sk cell)를 이용하여 실시예 1로 제조된 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자(LMWP-bFGF) 융합 단백질의 피부구성 세포의 세포막 투과도를 평가하였다.

Cell Tak sodlution으로 20분 동안 코팅한 10mm coverslip에 인간섬유아세포(human fibroblast cell, CCD-986sk cell)를 각 coverslip에 5x10³ cell씩 분주하여 10% FBS/DMEM 배지로 48시간 배양하였다. Alexa 647(형광물질)로 표지한 섬유아세포성장인자(bFGF), 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자(LMWP-bFGF) 융합 단백질을 DMEM 배지로 희석한 후 각 coverslip에 도포하고 6시간 동안 CO₂ incubator에서 추가 배양하였다. 이후 각 coverslip을 인산염완충액(pH7.4)으로 세척한 후 4% paraformaldehyde 용액으로 5분간 상온에서 고정하였다. 각 coverslip을 인산염완충액(pH7.4)으로 2회 세척한 후, 1㎍/mL 4'6-diamido-2-phenylindole(DAPI; Roche, Basel, Switzerland)로 상온에서 5분간 세포핵을 염색하였다. 형광물질로 표지된 각 성장인자의 섬유아세포 세포막 투과 정도를 형광현미경(Carl Zeiss MicroImaging GmbH, 07740 Jena, Germany)으로 측정하였다.

상기 형광 이미지를 측정한 결과, 일반 염기성섬유아세포성장인자 (bFGF)는 세포질 내에서 거의 측정되지 않은 반면, 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자(LMWP-bFGF) 융합 단백질의 경우 세포질 내에서 무처치 음성 대조군 대비 높은 형광 강도를 나타냈다(도 5).

따라서, 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자(LMWP-bFGF) 융합 단백질은 세포 투과형 아미노산 서열인 저분자량 프로타민(LMWP)이 기존 성장인자 N-말단에 추가로 결합되어 매우 우수한 피부세포 투과도를 나타냄을 알 수 있다(도 5).

실시예 6. 세포 투과형 염기섬유아세포성장인자(LMWP-bFGF) 융합 단백질의 피부 투과능 증진 평가: 인공피부막(Skin PAMPA) 투과도 평가

Skin PAMPA Explorer Test System(Pion Inc., Billerica, MA, USA) 이용하여 인공피부막을 통한 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자(LMWP-bFGF) 융합 단백질의 피부 투과능 정도를 평가하였다.

Skin PAMPA system의 각 well의 top(acceptor) compartment를 200 ㎕의 hydration buffer solution (pH 7.4)으로 overnight hydration 시켰다. Top(donor) plate에 Prisma-HT buffer solution(pH 7.4)를 이용하여 1,000ng/mL 농도로 용해시킨 염기성섬유아세포성장인자(bFGF), 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자(LMWP-bFGF) 융합 단백질 용액을 각 well에 200 ㎕씩 도포하였다. 별도로 acceptor plate(bottom)의 각 well에 200 ㎕의 Prisma-HT buffer solution(pH 7.4)를 넣은 후 top(donor) plate를 결합하고 상온에서 방치하였다. 6, 12, 18 및 24시간째 PAMPA sandwich를 분리하고 donor와 acceptor의 용액을 취해 인공 피부막을 투과한 각 성장인자의 농도를 상기 설정한 HPLC 분석법을 이용하여 정량하고 인공 피부막을 투과한 각 성장인자의 투과도(permeability)를 계산하였다.

모든 시간에서 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자(LMWP-bFGF) 융합 단백질은 일반 염기성섬유아세포성장인자(bFGF) 대비 유의적으로 매우 높은 인공피부막 투과도를 나타냈으며 24시간째 인공 피부막을 통과한 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자(LMWP-bFGF) 융합 단백질의 농도는 염기성섬유아세포성장인자(bFGF) 대비 460% 증가하였다(^***p < 0.001, 염기성섬유아세포성장인자(bFGF) 대비) (도 6).

결과적으로 인공피부막을 통한 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자(LMWP-bFGF) 융합 단백질의 피부 투과도(permeability)는 염기성섬유아세포성장인자(bFGF) 대비 267% 증가하였다 (^###p < 0.001, 염기성섬유아세포성장인자(bFGF) 대비) (도 6). 실시예 7. 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자(LMWP-bFGF) 융합 단백질의 안티-에이징 효능 평가: 섬유아세포 증식 활성에 의한 피부재생 효능

인간섬유아세포 (CCD986-sk cell) 배양 시 실시예 1에서 제조된 세포 투과형 성장인자 융합 단백질을 농도별로 처리하여 인간섬유아세포증식 정도를 평가함으로서 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자(LMWP-bFGF) 융합 단백질의 피부재생 활성을 평가하였다. 피부세포 증식 활성에 대한 양성 대조군으로 유전자 재조합 인간 형질전환성장인자(recombinant human Transforming growth factor-beta, rhTGF-β)를 사용하였다. 인간섬유아세포 (human fibroblast cell, CCD-986sk cell)를 96 well plate에 5x10³ cell/well씩 분주하여 10% FBS/DMEM 배지로 24시간 배양한 후 배양액을 제거하고 0.05% FBS가 포함된 DMEM 배양액에서 다시 24시간 배양하였다. 이후 0.5% FBS가 포함된 DMEM 배지로 단계적으로 희석한 염기성섬유아세포성장인자(bFGF), 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자(LMWP-bFGF) 융합 단백질과 유전자 재조합 인간 형질전환성장인자 (recombinant human transforming growth factor-beta, rhTGF-β)를 각 well에 100 ㎕씩 가한 후 다시 24시간 동안 CO₂ incubator에서 배양함. 이후 5 mg/mL 농도의 WST-1(Roche Diagnostics) 용액을 각 well에 10 ㎕씩 처리한 후 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 뒤 450nm에서 흡광도 측정하고 무처치 음성 대조군 대비 피부섬유아세포의 증식 정도를 평가하였다.

그 결과, 모든 시험농도범위에서 양성대조군인 형질전환성장인자(rhTGF-β)은 무처치 음성 대조군 대비 인간 피부 섬유아세포의 증식이 유의적으로 증가하였으며 (^***p < 0.001, 무처치 음성대조군 대비) 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자(LMWP-bFGF) 융합 단백질 역시 모든 시험 농도 범위에서 무처치 음성대조군 대비 100% 이상의 인간섬유아세포 증식 활성을 나타냈다. 특히, 50 ng/mL 농도에서 무처치 음성 대조군 대비 인간섬유아세포 증식이 최대 124% 증가하였다(^***p < 0.001, 무처치 음성대조군 대비) (도 7).

실시예 8. 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자(LMWP-bFGF) 융합 단백질의 안티-에이징 효능 평가: 섬유아세포 증식 활성에 의한 상처치유 효능

인간 섬유아세포(CCD986-sk cell) 및 마우스 섬유아세포(NIH 3T3 cell)에 스크래치 상처(scratch wound)를 유발한 후 배양액에 실시예 1에서 제조된 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자(LMWP-bFGF) 융합 단백질을 농도별로 처리하여 세포증식 정도를 평가함으로서 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자(LMWP-bFGF) 융합 단백질의 피부세포 증식 활성에 의한 상처치유 효능을 평가하였다. 피부세포 증식 활성에 대한 양성 대조군으로 유전자 재조합 인간 형질전환성장인자(recombinant human Transforming growth factor-beta, rhTGF-β)를 사용하였다.

인간섬유아세포(CCD-986sk cell) 및 마우스 섬유아세포(NIH 3T3 cell)를 96well plate에 3.5x10⁴ cell/well씩 분주하고 10% FBS/DMEM 배지에서 72시간 배양하여 섬유아세포의 monolayer를 형성시켰다. 이후 배양액을 제거하고 wound maker를 이용하여 각 well에 cell-free zone(scratch wound, 회색영역)를 형성시킨 후 각 well을 인산염완충액(pH 7.4) 100 ㎕로 4회 세척하고 serum free DMEM 배양액으로 단계적으로 희석한 염기섬유아세포성장인자(bFGF), 세포 투과형 염기섬유아세포성장인자(LMWP-bFGF) 융합 단백질와 형질전환성장인자(rhTGF- β)를 각 well에 100 ㎕씩 첨가하였다. CO₂ incubator에서 Incucyte Zoom microscope(Essen Bioscience)로 4시간 간격, 72시간 동안 각 well의 상처면적(scratch wound area)의 회복(재생)율을 측정하였다.

마우스 섬유아세포 경우, 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자(LMWP-bFGF) 융합 단백질이 시험 농도 범위에서 무처치 음성대조군 대비 마우스 섬유아세포의 증식 활성으로 상처 회복율이 향상되었다. 특히, 500 ng/mL 농도로 처리 시 72시간째 상처 회복율은 무처치 음성 대조군 대비 최대 120% 증가하였다(^**p < 0.01, 무처치 음성대조군 대비) (도 8).

또한, 인간 섬유아세포의 경우, 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자(LMWP-bFGF) 융합 단백질이 시험 농도 범위에서 무처치 음성대조군 대비 인간 섬유아세포의 증식 활성으로 상처 회복율이 향상되었다. 특히, 1 ng/mL 농도로 처리 시 72시간째 상처 회복율은 무처치 음성 대조군 대비 최대 123% 증가하였다(^**p < 0.01, 무처치 음성대조군 대비) (도 9).

실시예 9. 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자(LMWP-bFGF) 융합 단백질 및 1,2-헥산디올(Hexandiol) 병용 투여의 콜라겐 생성 촉진 효능

인간섬유아세포 (CCD986-sk cell) 배양 시 실시예 1에서 제조된 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자(LMWP-bFGF) 융합 단백질 및 1,2-헥산디올(Hexanediol)을 농도별로 처리하여, 1,2-헥산디올과 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자융합 단백질을 병용하여 투여하였을 때, 콜라겐 생성에 시너지 효과를 평가하였다.

인간섬유아세포(CCD-986sk cell)를 296 well plate에 3.5X10⁴ cells/well 씩 동일하게 heamacytometer를 이용하여 계수한 후 분주하여 배양하였다. 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 48시간 배양하여 배양용기 표면적의 ~50%만큼 배양되면, 실시예 1에서 제조된 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자(LMWP-bFGF) 융합 단백질을 배지 내 최종농도가 10.0 ppm의 농도로 투여하고, 1,2-헥산디올을 총 배지 볼륨 내에서 0.1% 및 2.5%가 되도록 각각 처리하여 48시간 더 배양하였다. 그 뒤, 프로콜라겐 타입 I C-펩티드(Procollagen type I C-peptide; PIP) ELSA 키트를 사용하여, 제조사에서 제시된 실험방법에 의해 콜라겐 생성 정도를 측정하였다.

세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자(LMWP-bFGF) 융합 단백질을 단독으로 처리한 군(2)에서는 약 150% 콜라겐 생성 촉진이 나타나는 반면, 1,2-헥산디올을 추가로 더 처리한 군(3 및 4)에서는 약 180% 및 222%의 콜라겐 생성 촉진 효과를 보였다. 특히, 2.5% 1,2-헥산디올을 더 포함하는 군(4)에서는 세포 투과형 염기섬유아세포성장인자(LMWP-bFGF) 융합 단백질 단독 처리군에 비하여 약 1.5 배 이상 콜라겐 생성 촉진의 현저한 상승 효과를 발휘하였다(도 10 및 도 11).

상기 결과를 통해 본 발명에 따른 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자(LMWP-bFGF) 융합 단백질은 단독으로 처리한 경우에 비하여, 1,2-헥산디올을 추가로 더 포함하는 경우에 콜라겐 생성 촉진에 현저한 시너지 효과가 존재함을 알 수 있다.

<110> BIO-FD&C <120> Topical Formulation Composed of Cell Permeable basic Fibroblast Growth Factor (LMWP-bFGF) fusion protein with Skin Physiological Activity <130> KPA01285 <150> KR 2016-0119263 <151> 2016-09-19 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LMWP <400> 1 Val Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 2 <211> 160 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LMWP-bFGF <400> 2 Val Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Arg Arg Arg Pro Ala 1 5 10 15 Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys 20 25 30 Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile 35 40 45 His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His 50 55 60 Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys 65 70 75 80 Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu 85 90 95 Leu Ala Ser Lys Cys Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu 100 105 110 Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp 115 120 125 Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr 130 135 140 Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 145 150 155 160

Claims

세포 투과형 펩타이드에 염기성섬유아세포성장인자(basic Fibroblast Growth factor, bFGF)가 융합된, 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자 융합 단백질을 포함하는 피부 외용제 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 세포 투과형 펩타이드는 저분자 프로타민(Low molecular weight protamine, LMWP)인 것을 특징으로 하는, 피부 외용제 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자 융합 단백질은 상기 염기성섬유아세포성장인자의 N-말단, C-말단 또는 N-말단 및 C-말단에 세포 투과형 펩타이드의 아미노산 서열이 결합되는 것을 특징으로 하는, 피부 외용제 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 1,2-헥산디올(1,2-Hexanediol)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 피부 외용제 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 세포 투과형 염기성섬유아세포성장인자 융합 단백질은 상기 피부 외용제 조성물 중 0.01 내지 100 ppm 농도로 포함되는 것인, 피부 외용제 조성물.
제 4항에 있어서,
상기 1,2-헥산디올은 상기 피부 외용제 조성물 100 중량부 기준으로 0.1 중량부 내지 2.5 중량부를 포함하는 것인, 피부 외용제 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 콜라겐 생성 촉진용인 것인, 피부 외용제 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 조성물은 피부 재생용인 피부 외용제 조성물.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 상처 치유용인 피부 외용제 조성물.