KR101662990B1 - 히알루론산 합성효소 단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 보습 증진, 주름 개선 및 피부 탄력 증진용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고분자 히알루론산의 합성을 촉진하는 히알루론산 합성효소 (hyaluronic acid synthase) 단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 보습 증진, 주름 개선 및 피부 탄력 증진용 화장료 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 히알루론산 합성효소 단백질은 세포 내에서 고분자의 히알루론산을 합성하도록 촉진하는 효과가 있으며, 세포 내 콜라게나제 발현을 저해하는 효과가 있어, 본 발명의 화장료 조성물은 피부 보습 증진, 주름 개선 및 피부 탄력 증진용의 기능성 화장료 조성물로 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

Description

히알루론산 합성효소 단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 보습 증진, 주름 개선 및 피부 탄력 증진용 화장료 조성물{Cosmetic composition for improving moisturizing, wrinkle and elasticity of skin comprising hyaluronic acid synthase protein as effective component}

본 발명은 히알루론산 합성효소 단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 보습 증진, 주름 개선 및 피부 탄력 증진용 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 표피, 진피, 피하 조직으로 구성되어 있다. 피부는 외부에서 유입되는 균의 침투를 막는 동시에 체내의 수분 유지와 체온 유지에 중요한 역할을 하는 조직이다. 표피는 피부 보호와 체온 조절, 및 수분 유지 기능을 수행하며, 피부 탄력성 및 유연성에 관여하는 세포외 기질(extracellular matrix)로 구성되어 있다. 진피는 피부 노화와 직접적인 관계가 있다. 피부 노화의 주원인은 교원섬유(collagen, 콜라겐)와 탄력섬유(elastin, 엘라스틴) 및 점액 다당체(glycosaminoglycan and mucopolysaccharide)의 변성에 의한 피부의 탄력성 감소와 주름의 증가이다.

히알루론산(hyaluronic acid, HA)은 글루코사민글라이칸(glycosaminoglycan)의 하나이다. 히알루론산은 N-아세틸 글루코사민(N-acetyl glucosamine)과 글루쿠론산(Glucuronic acid)으로 이루어지는데, 세포외 기질에 존재하며 조직의 수분유지, 세포성장인자 및 영양성분의 저장 및 확산에 관여하며, 각질형성세포와 섬유아세포에 의해 합성되는 것으로 알려져 있다. 피부 내 히알루론산의 감소는 피부탄력감소 및 주름증가의 원인으로 알려져 있다.

따라서, 피부 내 히알루론산 함량 유지는 보습 및 피부탄력 유지뿐만 아니라 주름 개선 등의 항노화 피부 미용에 중요한 역할을 한다.

히알루론산은 히알루론산 합성효소(hyaluronic acid synthase, HAS)를 통해 합성되며 합성 과정 중에는 세포외 기질에 축적된다. 히알루론산 합성효소는 히알루론산 합성효소 1(HAS1), 히알루론산 합성효소 2(HAS2) 및 히알루론산 합성효소 3(HAS3)이 알려져 있으며, 이들 중 HAS2와 HAS3는 섬유아세포와 각질형성세포에서 히알루론산 합성에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다.

피부 내 히알루론산의 합성을 촉진하기 위한 다양한 방법들이 공개되어 있다. 한국공개특허 제2006-0078292호에서는 '캄페롤 및 퀘르세틴을 함유하는 히알루론산 생성 촉진용 조성물'을 개시하고 있다. 상기 특허에서는 캄페롤 또는 퀘르세틴을 처리하면 인간 표피 세포주에 존재하는 히알루론산 합성효소 유전자의 발현을 증가시켜 히알루론산의 생성을 촉진시킬 수 있다고 기술하고 있다. 또한, 한국공개특허 제2007-0067364호에서는 '연교 추출물, 오수유 추출물, 천궁 추출물, 곡아 추출물 및 핵도추피 추출물로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 함유하여 히알루론산 합성효소 유전자의 발현을 증가시켜 히알루론산 생성을 촉진시키는 화장료 조성물'을 개시하고 있다. 하지만, 본 발명의 히알루론산 합성효소 단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 보습 증진, 주름 개선 및 피부 탄력 증진용 화장료 조성물에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 기존의 고분자 히알루론산을 피부에 처리시 고분자 히알루론산의 낮은 피부 침투력으로 인해 히알루론산의 효과가 저감되는 문제를 해결하기 위해, 본 발명자들은 히알루론산 합성효소 1, 2 및 3 단백질을 각각의 대장균 코돈 최적화된 히알루론산 합성효소 단백질 코딩 유전자로 형질전환된 대장균에서 합성한 후, 합성된 단백질을 분리·정제하여 각 단백질을 피부 섬유아세포에 처리한 결과, 합성된 단백질이 피부 세포에 침투가 용이하여 세포 내 고분자 히알루론산의 합성을 촉진한다는 것을 확인하였고, 이로 인해 피부 세포 증식 효과가 우수하였으며, 상기 단백질을 유효성분으로 하여 다양한 제형의 화장료 조성물을 제조하여 관능시험을 실시한 결과, 피험자들의 피부 보습 증진 및 주름 개선 효과가 우수함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 고분자 히알루론산의 합성을 촉진하는 히알루론산 합성효소(hyaluronic acid synthase) 단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 보습 증진, 주름 개선 및 피부 탄력 증진용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 히알루론산 합성효소 단백질을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물은 고분자 히알루론산의 낮은 피부 침투력으로 인한 화장료 원료로서의 문제점을 해결할 수 있는 조성물로, 상기 합성효소 단백질이 피부 세포에 침투하여 세포 내에서 고분자의 히알루론산을 합성하도록 촉진하는 효과가 있으며, 세포 내 콜라게나제 발현을 저해하는 효과가 있어, 본 발명의 화장료 조성물은 피부 보습 증진, 주름 개선 및 피부 탄력 증진용의 기능성 화장료 조성물로 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 히알루론산 합성효소를 포함하고 있는 재조합 플라스미드(pET22b::HAS)의 도식이다.
도 2는 15% SDS-폴리아크릴아마이드겔 전기영동법으로 발현 유도 유무에 따른 단백질 발현 차이를 확인한 결과이다. HAS1, 히알루론산 합성효소 1; HAS2, 히알루론산 합성효소 2; HAS3, 히알루론산 합성효소 3; KRX, E. coli KRX; RO2, E. coli Rosetta2 (DE3) pLysS; M, DokDo-MARK; BI, 단백질 발현 유도(induction) 전; Al, 단백질 발현 유도 후; 화살표, 발현된 히알루론산 합성효소 단백질.
도 3은 15% SDS-폴리아크릴아마이드겔 전기영동법으로 니켈-아가로스 컬럼 크로마토그래피를 통해 분리·정제한 히알루론산 합성효소 단백질을 확인한 결과이다. TP: 용해된 단백질.
도 4는 히알루론산 합성효소 단백질 처리에 따른 피부섬유아세포(HDFs)의 세포증식 효과를 크리스탈 바이올렛 염색을 통해 확인한 사진이다.
도 5는 히알루론산 합성효소 3 단백질 처리에 의한 피부섬유아세포 배양액의 고속액체크로마토그래피(HPLC) 분석 결과이다. A)는 시그마사의 히알루론산 제품의 분석 결과이며 B)는 히알루론산 합성효소 3 단백질 무처리 또는 처리 세포 배양액의 분석 결과이다.
도 6은 히알루론산 합성효소 3 단백질 처리에 따른 HaCaT 세포의 세포증식 효과를 확인한 결과이다.
도 7은 히알루론산 합성효소 3 단백질의 세포 이동성에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
도 8은 HaCaT 세포와 히알루론산 합성효소 3 단백질 사이의 접합을 분석한 결과이다.
도 9는 히알루론산 합성효소 3 단백질 처리에 의한 콜라게나제 타입 Ⅰ의 mRNA 발현양 변화를 확인한 결과이다.
도 10은 히알루론산 합성효소 3 단백질을 유효성분으로 포함하고 있는 스킨, 에센스, 로션 및 크림 제형의 화장료 조성물의 안정성을 확인하기 위해, 제조 후 상온 90일 보관한 각각의 화장료 조성물을 피부섬유아세포에 처리하고 크리스탈 바이올렛 염색을 통해 세포 증식 효과를 확인한 결과이다.
도 11은 스킨 화장료 조성물 내 히알루론산 합성효소 3 단백질의 안정성을 확인하기 위해 15% SDS-폴리아크릴아마이드겔 전기영동을 수행한 결과이다.
도 12는 히알루론산 합성효소 3 단백질이 유효성분으로 포함된 스킨 화장료 조성물의 사용전·후 피부 상태를 촬영한 사진이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고분자 히알루론산의 합성을 촉진하는 히알루론산 합성효소 (hyaluronic acid synthase) 단백질을 유효성분으로 포함하는 피부 보습 증진, 주름 개선 및 피부 탄력 증진용 화장료 조성물을 제공한다.

히알루론산 합성효소는 히알루론산을 합성하는 효소 단백질로, 히알루론산은 동물 등의 피부에 많이 존재하는 생체 합성 천연 물질이다. 히알루론산은 인간의 피부에도 존재하며 보습 작용 뿐만 아니라 다양한 생리적 작용을 조절하고 피부는 증발된 수분으로 인한 수분부족 현상으로 피부 탄력 저하, 잔주름이 형성되어 급격한 노화가 진행되므로 히알루론산을 합성하는 히알루론산의 발현 역시 피부의 노화와 관련되어 매우 중요한 인자이다.

고분자 히알루론산은 분자량이 500 kDa 이상, 바람직하게는 500~1,000 kDa의 매우 큰 물질로 분자 크기로 인해 피부 세포에 침투하기가 용이하지 않다. 본 발명에서는 피부 세포에 침투가 용이한 히알루론산 합성효소 단백질을 이용하여 상기 단백질을 피부 세포에 침투시킨 후 세포 내에서 고분자의 히알루론산을 합성함으로써 피부 세포 증식의 현저한 효과를 확인하였다.

본 발명의 상기 화장료 조성물은 피부 보습, 피부 탄력 및 주름과 관련있는 히알루론산을 합성하는 히알루론산 합성효소 단백질을 유효성분으로 포함하여, 세포 내 히알루론산의 합성을 촉진하여 피부 보습 증진, 주름 개선 및 피부 탄력 증진의 효과를 나타낼 수 있는 것이다.

본 발명에 따른 히알루론산 합성효소 단백질의 범위는 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 활성"이란 피부 보습 증진, 피부 주름 개선 및 피부 탄력 증진 활성을 의미한다.

상기 히알루론산 합성효소 단백질은 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 대장균 코돈 최적화된 히알루론산 합성효소 1 단백질 코딩 유전자, 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 대장균 코돈 최적화된 히알루론산 합성효소 2 단백질 코딩 유전자 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 대장균 코돈 최적화된 히알루론산 합성효소 3 단백질 코딩 유전자 중 어느 하나의 유전자를 대장균에 형질전환하여 발현하고 분리 정제하여 얻어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 대장균 코돈 최적화된 히알루론산 합성효소 단백질 코딩 유전자는 서열번호 4 내지 6의 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로는, 상기 유전자는 서열번호 4 내지 6의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

"코돈 최적화"는 코딩된 단백질이 유기체에서 보다 효율적으로 발현되도록 특정 유기체에서 우선적으로 사용되는 것으로 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 코돈을 변화시키는 것을 의미한다. 대부분의 아미노산이 "동의어" 또는 "동의" 코돈이라고 하는, 몇몇 코돈에 의해 표시된다는 점에서, 유전자 코드가 축퇴적이지만, 특정 유기체에 의한 코돈 용법은 임의적이지 않고 특정 코돈 트리플렛에 편향적이다. 이러한 코돈 용법 편향성은 소정 유전자, 공통 기능 또는 조상 기원의 유전자, 고도로 발현되는 단백질 대 낮은 복제수 단백질, 및 유기체 게놈의 집합적 단백질 코딩 영역과 관련하여 더 높을 수 있다. 본 발명의 상기 서열번호 4 내지 6의 염기서열은 각각 히알루론산 합성효소 1 단백질 코딩 유전자, 히알루론산 합성효소 2 단백질 코딩 유전자 및 히알루론산 합성효소 3 단백질 코딩 유전자가 대장균 내에서 발현될 수 있도록 대장균의 코돈에 최적화된 서열이다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 화장료 조성물에서 상기 히알루론산 합성효소 단백질의 함량은 화장료 조성물 총 중량 대비 0.000001 내지 0.1 중량%로 포함되는 것이 바람직하다.

상기 히알루론산 합성효소 단백질의 함량이 0.000001 중량% 미만인 경우에는 피부 보습, 주름 개선 및 피부 탄력 증진 효과가 미비하여, 0.1 중량% 이상인 경우에는 제형상의 안전 및 안정성에 문제가 있을 수 있다. 히알루론산 합성효소 단백질의 농도는 바람직하게는 0.02~2ppm, 더욱 바람직하게는 0.2~2ppm일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 화장료 조성물에는 상기 유효성분 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭과 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명의 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 스킨, 스킨 소프트너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 아이 크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 클렌징폼, 클렌징 워터, 클렌징 로션, 클렌징 크림, 바디로션, 바디클렌져, 비누 및 파우더의 화장품 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로 히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 히알루론산 합성효소 1, 히알루론산 합성효소 2 및 히알루론산 합성효소 3 단백질의 생산을 위한 재조합 발현 벡터 및 형질전환 미생물의 제조

히알루론산 합성효소 1, 히알루론산 합성효소 2 및 히알루론산 합성효소 3 단백질을 코딩하는 최적화된 유전자, 재조합 발현 벡터 및 형질전환 재조합 미생물은 아래의 방법으로 제작하였다.

숙주 미생물 내에서 발현될 있도록 최적화된, 577개의 아미노산으로 이루어진 히알루론산 합성효소 1(서열번호 1)을 코딩하는 유전자(서열번호 4)와, 551개의 아미노산으로 이루어진 히알루론산 합성효소 2(서열번호 2)를 코딩하는 유전자(서열번호 5)와, 552개의 아미노산으로 이루어진 히알루론산 합성효소 3(서열번호 3)을 코딩하는 유전자(서열번호 6) 단편들을 제작하였다.

상기 유전자 단편과 제조합 플라스미드를 동일한 제한효소(5' 말단 NdeI 제한효소, 3' 말단 XhoI 제한효소)로 절단하고 결합시켜(ligation), 도 1에 나타낸 재조합 플라스미드(pET22b::HAS)를 제작하였다. 제조된 재조합 플라스미드(pET22b::HAS)를 E. coli TOP10에 형질전환시켜서, 숙주 미생물로부터 유전자 컨스트럭트를 대량 얻었다. 또한, 제조된 재조합 플라스미드(pET22b::HAS)를 E. coli Rosetta2 (DE3) pLysS(Novagen, 독일)와 E. coli KRX에 각각 형질전환시켜서, 히알루론산 합성효소 1, 히알루론산 합성효소 2 및 히알루론산 합성효소 3 단백질 생산을 위한 재조합 미생물을 제작하였다.

실시예 2. 히알루론산 합성효소 1, 히알루론산 합성효소 2 및 히알루론산 합성효소 3 단백질의 발현 유도 및 분리

실시예 1에서 제조한 E. coli Rosetta2 (DE3) pLysS 균주와 E. coli KRX를 각각 1ℓ LB 배지에 배치 컬쳐시키거나 20ℓ 발효기를 사용하여 OD₆₀₀값이 0.6~0.8이 될 때까지 배양하였다. 이후, 이들을 각각 최종 1mM IPTG 또는 2% 락토오즈를 가하여 각 히알루론산 합성효소 유전자들의 발현을 유도하였다. 그 후 4시간 내지 5시간 더 배양한 후 원심분리를 통해 세포들을 회수하였다. 이 세포들을 완충용액(Phosphate buffered saline, NaCl 8g, KCl 0.2g, Na₂HPO₄ 1.44g, KH₂PO₄/ℓ 0.24g, pH 7.4)에 완전히 현탁시킨 후, 초음파 파쇄기를 사용하여 세포를 파괴하고 세포 내 단백질을 포함하는 용액과 응집체(inclusion body)를 포함하는 용액을 분리하였다.

상기 분리된 용액을 이용하여 15% SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동법으로 발현 유도 유무에 따른 단백질 발현 차이를 확인하였다. 그 결과, 히알루론산 합성효소 1, 2 및 3 모두 1mM IPTG 또는 2% 락토오즈에 의해 단백질 발현이 유도된 것을 확인할 수 있었고(도 2), E. coli KRX 보다 E. coli Rosetta2 (DE3) pLysS에서 발현양이 좋은 것으로 확인되었다.

그 후, 히알루론산 합성효소 1, 히알루론산 합성효소 2 및 히알루론산 합성효소 3 단백질의 분리·정제를 위해, 상기 세포 파쇄물에서 분리한 응집체를 가용화 완충용액(3M 요소(urea), pH 11)으로 가용화한 후 초미세 여과방법(0.45㎛ 정밀여과막과 1K 초미세여과막)을 이용하여 재접힘(refolding) 과정을 수행하였으며, 저장용 완충용액(Phosphate buffered saline)을 사용하여 최종적으로 히알루론산 합성효소 1, 2 및 3 단백질을 분리·정제하였다. 상기 방법과 함께 바인딩용 완충용액(3M 요소, pH 11)으로 활성화시킨 니켈-아가로스 컬럼에 가용화한 응집체를 1-3㎖/분의 속도로 통과시켰다. 이어서 바인딩용 완충용액으로 컬럼을 수 회 세척한 후 50, 100 및 250mM 이미다졸 용액(pH 7.4)을 각각 컬럼에 적용하여 히알루론산 합성효소 1, 2 및 3 단백질을 컬럼에서 1㎖씩 분획, 용출시켜 순수하게 분리·정제하였다. 상기 분획 용액을 각각 시료로 하여 15% SDS-폴리아크릴아마이드겔 전기영동법으로 정제된 히알루론산 합성효소 1, 2 및 3 단백질 함유 분획을 확인하였다.

그 결과, 도 3에 확인되는 것처럼, 약 50~60 kDa 부근에서 히알루론산 합성효소 1, 2 및 3 단백질을 확인할 수 있었다.

상기의 결과를 통해 본 발명의 재조합 플라스미드로 형질전환된 재조합 미생물이 히알루론산 합성효소 1, 2 및 3 단백질을 발현하고 있으며, 응집체로부터 니켈-아가로스 컬럼을 통한 분리방법으로 정제된 히알루론산 합성효소 1, 2 및 3 단백질을 얻을 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 3. 히알루론산 합성효소 1, 히알루론산 합성효소 2 및 히알루론산 합성효소 3 단백질의 활성 측정

실시예 2에서 분리·정제된 히알루론산 합성효소 1 단백질, 히알루론산 합성효소 2 단백질 및 히알루론산 합성효소 3 단백질의 존재가 확인된 분획 시료를 택하여 피부섬유아세포(Human Dermal Fibroblasts, HDFa cell)의 세포 증식 효과를 확인하였다.

히알루론산 합성효소 1, 2 및 3 단백질을 배양한 피부섬유아세포에 0, 0.02, 0.2, 2 및 20 ppm 농도로 각각 처리한 후 37℃에서 3일 동안 세포를 배양하였다. 이후 크리스탈 바이올렛 염색법으로 세포 증식 여부를 확인하였다.

그 결과, 히알루론산 합성효소 3 단백질이 피부섬유아세포에 대한 세포 증식 효과가 가장 높음을 확인하였다. 히알루론산 합성효소 2 단백질은 히알루론산 합성효소 3 단백질보다 세포 증식 효과가 조금 낮게 확인되었으며, 히알루론산 합성효소 1 단백질은 피부섬유아세포에 대한 세포 증식 효과가 미비한 것으로 확인되었다(도 4).

실시예 4. 고속액체크로마토그래피(HPLC)를 이용한 히알루론산의 함량 분석

본 발명에 따른 히알루론산 합성효소의 피부섬유아세포에 대한 히알루론산 합성 효과를 확인하기 위하여, 실시예 3에서 세포 증식 효과가 가장 높았던 히알루론산 합성효소 3(HAS 3) 단백질을 피부섬유아세포에 0.2 ppm 처리한 후, 37℃에서 3일 동안 배양한 후, 배양한 세포배양액을 수집하여 히알루론산 함량을 정성 및 정량분석하였다.

히알루론산 정성 및 정량분석을 위해 고속액체크로마토그래피(Atlantis dc18, 4.6mm X 250mm 컬럼)를 사용하였으며, 이동상 용액으로는 아세토니트릴(acetonitrile) 50mM과 염소산나트륨(sodium perchlorate)을 1:10(v/v)로 혼합된 용액을 사용하였다. 또한 히알루론산 정성분석을 위해 15~1,000 kDa의 히알루론산(Sigma, 미국)을 표준시료로 사용하였다.

분석 결과, 하기 표 1과 같이 고분자의 히알루론산은 보유시간 3분 이후 검출됨을 확인할 수 있었다(도 5A). 또한, 히알루론산 합성효소 3 단백질을 처리하지 않고 배양한 대조군에 비해 히알루론산 합성효소 3 단백질을 처리한 배양액에서 고분자의 히알루론산이 약 1.5배 높게 검출되었다(도 5B).

HPLC 결과

구분	시료	보유시간	면적
표준시료	15~30 kDa	1.567	106.364
		2.067	7.216
	90~110 kDa	1.643	489.696
		2.067	6.028
		3.207	1.96
	150~300 kDa	1.61	122.551
		2.067	9.036
		3.2	2.557
	750~1000 kDa	1.57	91.003
		2.067	15.577
		3.203	3.051
테스트시료	대조군 (HAS3 무처리 배양액)	3.18	475.929
	HAS3 처리 배양액	3.183	684.441

실시예 5. 히알루론산 합성효소 3의 HaCaT 세포 증식 활성 분석

히알루론산 합성효소 3을 HaCaT 세포에 0, 0.02, 0.2, 2 및 20ppm의 농도로 처리하고 37℃에서 3일 동안 세포를 배양하고, PrestoBlue^TM Cell Viability 시약(Invitrogen, 미국)을 사용하여 HaCaT 세포의 증식을 확인하였다.

그 결과, 0.02 내지 20ppm 농도의 히알루론산 합성효소 3 단백질을 처리한 HaCaT 세포는 대조군(히알루론산 합성효소 3 단백질 무처리)에 비해 높은 세포 증식 효과가 확인되었으며, 특히 0.2 내지 2ppm 농도 사이에서 뚜렷한 효과를 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 통해 히알루론산 합성효소 3 단백질은 피부 세포 내에 침투하여 활성을 나타내며, 저농도에서도 탁월한 세포 증식 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다(도 6).

실시예 6. HaCaT 세포의 이동에 미치는 히알루론산 합성효소 3 단백질의 영향 분석

상처 치유(wound healing) 분석을 통해 히알루론산 합성효소 3 단백질이 세포의 이동성에 미치는 영향을 확인하였다. 실험은 HaCaT 세포를 멀티-웰 플레이트에 배양한 후 세포가 배양되고 있는 웰에 스크래치를 주어 갭을 만들고, 그 후 각 웰에 히알루론산 합성효소 3 단백질을 농도별(0 내지 20ppm)로 처리하고, 매 6시간 마다 현미경(올림푸스 CK40, 올림푸스, 일본)을 사용하여 HaCaT 세포의 이동성을 24시간 동안 관찰하여 분석하였다.

그 결과, 0.02 내지 20ppm 농도의 히알루론산 합성효소 3 단백질을 처리한 실험군은 대조군(무처리)에 비해 현저한 세포 이동성을 보여주었으며, 특히 0.02 내지 2ppm 농도에서 그 효과가 뚜렷한 것을 확인할 수 있었다(도 7).

실시예 7. 히알루론산 합성효소 3 단백질의 활성측정을 위한 세포 접합 분석

HaCaT 세포를 96웰 플레이트에 배양하고, 히알루론산 합성효소 3 단백질을 농도별(0 내지 20ppm)로 처리하고, 37℃에서 1일 배양한 후, 시약을 사용하여 HaCaT 세포와 히알루론산 합성효소 3 단백질 사이의 접합 효과를 확인하였다.

그 결과, 0.02 내지 20ppm 농도의 히알루론산 합성효소 3 단백질 처리에 의해 무처리 대조군보다 단백질 처리 실험군에서 HaCaT 세포의 접합효과가 우수하게 나타났으며, 특히 0.02 내지 2ppm 농도에서 효과가 뚜렷한 것을 확인할 수 있었다(도 8). 상기 결과는 히알루론산 합성효소 3 단백질이 피부 세포와의 접합이 매우 용이하며, 이를 통해 세포의 증식을 촉진했음을 유추할 수 있었다.

실시예 8. 히알루론산 합성효소 3 단백질에 의한 콜라게나제 타입 Ⅰ(collagenase type Ⅰ) mRNA 발현 분석

히알루론산 합성효소 3 단백질을 HaCaT 세포에 0.02, 0.2 및 2 ppm의 농도로 처리한 후 37℃에서 3일간 배양하였다. 그 후, 배양 세포에서 세포를 회수하고 trizol 시약(Invitrogen, 미국)을 사용하여 총 RNA를 분리하고 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 주형으로 하여 정방향 프라이머(5'-GGCTCAGTTTGTCCTCACTG-3', 서열번호 7)와 역방향 프라이머(5'-GGTCCACCTTTCATCTTCAT-3', 서열번호 8)를 이용하여 콜라게나제 타입 Ⅰ에 대한 역전사 PCR을 수행하였다. PCR 산물을 1% 아가로스 겔에 로딩하였고, QuantityOne 소프트웨어(Bio-Rad, 미국)를 사용하여 GAPDH 발현양으로 보정하여 각 처리구의 콜라게나제 발현율을 분석하였다.

그 결과, 히알루론산 합성효소 3 단백질(HAS 3) 처리 농도 의존적으로 콜라게나제 타입 Ⅰ의 mRNA 발현 수준이 감소되는 것을 확인할 수 있었다(도 9). 이 결과를 통해 히알루론산 합성효소 3 단백질이 세포 내 콜라게나제 타입 Ⅰ의 mRNA 발현을 저해시켜 단백질 발현을 감소시키고, 감소된 콜라게나제 타입 Ⅰ 단백질의 수준으로 인해 콜라겐 분해가 억제되어 노화방지 효과를 얻을 수 있음을 유추할 수 있었다.

실시예 9. 화장료 조성물의 안정성 확인

히알루론산 합성효소 3 단백질을 유효성분으로 포함하고 있는 스킨(제조예 1), 에센스(제조예 2), 로션(제조예 3) 및 크림(제조예 4) 제형의 화장료 조성물의 안정성을 확인하기 위해, 제조 후 상온에서 90일간 보관한 각각의 화장료 조성물을 피부섬유아세포에 처리하고 37℃에서 3일간 배양한 후, 크리스탈 바이올렛 염색을 통해 세포 증식 효과를 확인하였다.

그 결과, 도 10과 같이 당일 제조 화장료 조성물과 상온 90일 보관 화장료 조성물 처리 세포군에서 세포 증식 효과의 차이가 거의 없는 것으로 확인되었고, 이는 상기 화장료 조성물들의 안정성이 우수하다는 것을 의미하였다.

또한, 히알루론산 합성효소 3 단백질을 함유한 스킨(제조예 1) 조성물을 90일간 실온 보관한 후, 조성물 내 히알루론산 합성효소 3 단백질의 존재여부를 15% SDS-폴리아크릴아마이드겔 전기영동을 통해 확인한 결과, 히알루론산 합성효소 3 단백질은 90일동안 조성물 내 안정된 형태로 존재하고 있음을 확인할 수 있었다(도 11).

실험예 1. 피부의 보습 및 피부 자극 관능시험

히알루론산 합성효소 3 단백질을 유효성분으로 하여 제조예 1, 2, 3 및 4와 비교제조예 1, 2, 3 및 4의 화장료 조성물을 제조하여 관능시험을 실시하였다. 구체적으로는, 피부의 보습 효과 및 피부 자극 관능시험을 위해, 20세 이상 60세 미만의 여성과 남성 총 30명을 대상으로 하여, 안면 왼쪽부분에는 비교제조예(대조군)를, 안면 오른쪽부분에는 제조예(시험군)를 1일 2회 1주간 지속적으로 사용하게 하였다. 동시에 손등 왼쪽과 오른쪽 부분에도 동일한 방법으로 사용하게 하여 실험을 실시하였다.

피부의 보습 효과 평가는, 제조예와 비교제조예의 화장료 조성물을 피부에 도포한후 1 시간 후 잔여감(흡수력 및 촉촉함)을 상대적으로 평가하였다. 피부자극 항목에 대해서도 동일한 방법으로 피부의 가려움, 따가움 및 홍반현상 등에 관하여 관능시험을 실시하였다. 평가는 매우 우수(5점), 우수(4점), 보통(3점), 나쁨(2점), 매우 나쁨(1점)의 오점법 기준에 의거하여 수행하였다.

<제조예 1 및 비교제조예 1>

히알루론산 합성효소 3 단백질을 유효성분으로하고, 하기 표 2에 기재된 성분과 함량으로 스킨을 제조하였다.

스킨 화장료 조성물

성분	제조예1 (중량 %)	비교제조예1 (중량 %)
히알루론산 합성효소 3	0.002	-
아미노산 스탁	0.1	0.1
미네랄 혼합물	0.0007	0.0007
정제수	잔량	잔량

상기 제조예 1 및 비교제조예 1의 스킨에 대하여 피부 보습 효과와 피부 자극 여부를 평가한 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

또한, 제조예 1의 화장료 조성물에 대해 30대~60대의 4명의 피험자에게 1일 2회씩 2주간 사용하게 한 후, 사용 전 및 사용 후의 피부 상태를 사진으로 촬영하여 비교해보았다. 그 결과, 30대에서 60대 모두에서 주름 개선 및 피부 탄력 개선효과를 확인할 수 있었다(도 12).

<제조예 2 및 비교제조예 2>

히알루론산 합성효소 3 단백질을 유효성분으로 하여, 하기 표 4에 기재된 성분과 함량으로 에센스를 제조하였다.

에센스 화장료 조성물

성분	제조예2 (중량 %)	비교제조예2 (중량%)
히알루론산 합성효소 3	0.002	-
아미노산 스탁	0.05	0.05
미네랄 혼합물	0.0007	0.0007
글리세롤	5	5
1,3-부틸렌글리콜	10	10
카보풀 940	0.3	0.3
정제수	잔량	잔량

제조예 2 및 비교제조예 2의 에센스에 대하여 실험예 1에 기재된 방법으로 피부 보습 효과와 피부 자극 여부를 평가하였다. 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

<제조예 3 및 비교제조예 3>

히알루론산 합성효소 3 단백질을 유효성분으로 하여, 하기 표 6에 기재된 성분과 함량으로 로션을 제조하였다.

로션 화장료 조성물

성분	제조예3 (중량%)	비교제조예3 (중량%)
히알루론산 합성효소 3	0.002	-
아미노산 스탁	0.05	0.05
미네랄 혼합물	0.0007	0.0007
글리세롤	3	3
1,3-부틸렌글리콜	10	10
미네랄오일	5	5
세틸알코올	2	2
잔탄검	0.5	0.5
정제수	잔량	잔량

제조예 3 및 비교제조예 3의 로션에 대하여 실험예 1에 기재된 방법으로 피부 보습 효과와 피부 자극 여부를 평가하여 하기 표 7에 나타내었다.

<제조예 4 및 비교제조예 4>

히알루론산 합성효소 3 단백질을 유효성분으로 하여, 하기 표 8에 기재된 성분과 함량으로 크림을 제조하였다.

크림 화장료 조성물

성분	제조예4 (중량%)	비교제조예 (중량%)
히알루론산 합성효소 3	0.002	-
아미노산 스탁	0.05	0.05
미네랄 혼합물	0.0007	0.0007
글리세롤	2	2
미네랄오일	10	10
올리부유화 왁스	3	3
세틸알코올	2	2
정제수	잔량	잔량

제조예 4 및 비교제조예 4의 크림에 대하여 실험예 1에 기재된 방법으로 피부 보습 효과와 피부 자극 여부를 평가하였다. 그 결과는 하기 표 9와 같다.

<110> Nexgen Biotechnologies, Inc. <120> Cosmetic composition for improving moisturizing, wrinkle and elasticity of skin comprising hyaluronic acid synthase protein as effective component <130> PN15464 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 577 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Arg Gln Gln Asp Ala Pro Lys Pro Thr Pro Ala Ala Cys Arg Cys Ser 1 5 10 15 Gly Leu Ala Arg Arg Val Leu Thr Ile Ala Phe Ala Leu Leu Ile Leu 20 25 30 Gly Leu Met Thr Trp Ala Tyr Ala Ala Gly Val Pro Leu Ala Ser Asp 35 40 45 Arg Tyr Gly Leu Leu Ala Phe Gly Leu Tyr Gly Ala Phe Leu Ser Ala 50 55 60 His Leu Val Ala Gln Ser Leu Phe Ala Tyr Leu Glu His Arg Arg Val 65 70 75 80 Ala Ala Ala Ala Arg Gly Pro Leu Asp Ala Ala Thr Ala Arg Ser Val 85 90 95 Ala Leu Thr Ile Ser Ala Tyr Gln Glu Asp Pro Ala Tyr Leu Arg Gln 100 105 110 Cys Leu Ala Ser Ala Arg Ala Leu Leu Tyr Pro Arg Ala Arg Leu Arg 115 120 125 Val Leu Met Val Val Asp Gly Asn Arg Ala Glu Asp Leu Tyr Met Val 130 135 140 Asp Met Phe Arg Glu Val Phe Ala Asp Glu Asp Pro Ala Thr Tyr Val 145 150 155 160 Trp Asp Gly Asn Tyr His Gln Pro Trp Glu Pro Ala Ala Ala Gly Ala 165 170 175 Val Gly Ala Gly Ala Tyr Arg Glu Val Glu Ala Glu Asp Pro Gly Arg 180 185 190 Leu Ala Val Glu Ala Leu Val Arg Thr Arg Arg Cys Val Cys Val Ala 195 200 205 Gln Arg Trp Gly Gly Lys Arg Glu Val Met Tyr Thr Ala Phe Lys Ala 210 215 220 Leu Gly Asp Ser Val Asp Tyr Val Gln Val Cys Asp Ser Asp Thr Arg 225 230 235 240 Leu Asp Pro Met Ala Leu Leu Glu Leu Val Arg Val Leu Asp Glu Asp 245 250 255 Pro Arg Val Gly Ala Val Gly Gly Asp Val Arg Ile Leu Asn Pro Leu 260 265 270 Asp Ser Trp Val Ser Phe Leu Ser Ser Leu Arg Tyr Trp Val Ala Phe 275 280 285 Asn Val Glu Arg Ala Cys Gln Ser Tyr Phe His Cys Val Ser Cys Ile 290 295 300 Ser Gly Pro Leu Gly Leu Tyr Arg Asn Asn Leu Leu Gln Gln Phe Leu 305 310 315 320 Glu Ala Trp Tyr Asn Gln Lys Phe Leu Gly Thr His Cys Thr Phe Gly 325 330 335 Asp Asp Arg His Leu Thr Asn Arg Met Leu Ser Met Gly Tyr Ala Thr 340 345 350 Lys Tyr Thr Ser Arg Ser Arg Cys Tyr Ser Glu Thr Pro Ser Ser Phe 355 360 365 Leu Arg Trp Leu Ser Gln Gln Thr Arg Trp Ser Lys Ser Tyr Phe Arg 370 375 380 Glu Trp Leu Tyr Asn Ala Leu Trp Trp His Arg His His Ala Trp Met 385 390 395 400 Thr Tyr Glu Ala Val Val Ser Gly Leu Phe Pro Phe Phe Val Ala Ala 405 410 415 Thr Val Leu Arg Leu Phe Tyr Ala Gly Arg Pro Trp Ala Leu Leu Trp 420 425 430 Val Leu Leu Cys Val Gln Gly Val Ala Leu Ala Lys Ala Ala Phe Ala 435 440 445 Ala Trp Leu Arg Gly Cys Leu Arg Met Val Leu Leu Ser Leu Tyr Ala 450 455 460 Pro Leu Tyr Met Cys Gly Leu Leu Pro Ala Lys Phe Leu Ala Leu Val 465 470 475 480 Thr Met Asn Gln Ser Gly Trp Gly Thr Ser Gly Arg Arg Lys Leu Ala 485 490 495 Ala Asn Tyr Val Pro Leu Leu Pro Leu Ala Leu Trp Ala Leu Leu Leu 500 505 510 Leu Gly Gly Leu Val Arg Ser Val Ala His Glu Ala Arg Ala Asp Trp 515 520 525 Ser Gly Pro Ser Arg Ala Ala Glu Ala Tyr His Leu Ala Ala Gly Ala 530 535 540 Gly Ala Tyr Val Gly Tyr Trp Val Ala Met Leu Thr Leu Tyr Trp Val 545 550 555 560 Gly Val Arg Arg Leu Cys Arg Arg Arg Thr Gly Gly Tyr Arg Val Gln 565 570 575 Val <210> 2 <211> 551 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 2 His Cys Glu Arg Phe Leu Cys Ile Leu Arg Ile Ile Gly Thr Thr Leu 1 5 10 15 Phe Gly Val Ser Leu Leu Leu Gly Ile Thr Ala Ala Tyr Ile Val Gly 20 25 30 Tyr Gln Phe Ile Gln Thr Asp Asn Tyr Tyr Phe Ser Phe Gly Leu Tyr 35 40 45 Gly Ala Phe Leu Ala Ser His Leu Ile Ile Gln Ser Leu Phe Ala Phe 50 55 60 Leu Glu His Arg Lys Met Lys Lys Ser Leu Glu Thr Pro Ile Lys Leu 65 70 75 80 Asn Lys Thr Val Ala Leu Cys Ile Ala Ala Tyr Gln Glu Asp Pro Asp 85 90 95 Tyr Leu Arg Lys Cys Leu Gln Ser Val Lys Arg Leu Thr Tyr Pro Gly 100 105 110 Ile Lys Val Val Met Val Ile Asp Gly Asn Ser Glu Asp Asp Leu Tyr 115 120 125 Met Met Asp Ile Phe Ser Glu Val Met Gly Arg Asp Lys Ser Ala Thr 130 135 140 Tyr Ile Trp Lys Asn Asn Phe His Glu Lys Gly Pro Gly Glu Thr Asp 145 150 155 160 Glu Ser His Lys Glu Ser Ser Gln His Val Thr Gln Leu Val Leu Ser 165 170 175 Asn Lys Ser Ile Cys Ile Met Gln Lys Trp Gly Gly Lys Arg Glu Val 180 185 190 Met Tyr Thr Ala Phe Arg Ala Leu Gly Arg Ser Val Asp Tyr Val Gln 195 200 205 Val Cys Asp Ser Asp Thr Met Leu Asp Pro Ala Ser Ser Val Glu Met 210 215 220 Val Lys Val Leu Glu Glu Asp Pro Met Val Gly Gly Val Gly Gly Asp 225 230 235 240 Val Gln Ile Leu Asn Lys Tyr Asp Ser Trp Ile Ser Phe Leu Ser Ser 245 250 255 Val Arg Tyr Trp Met Ala Phe Asn Ile Glu Arg Ala Cys Gln Ser Tyr 260 265 270 Phe Gly Cys Val Gln Cys Ile Ser Gly Pro Leu Gly Met Tyr Arg Asn 275 280 285 Ser Leu Leu His Glu Phe Val Glu Asp Trp Tyr Asn Gln Glu Phe Met 290 295 300 Gly Asn Gln Cys Ser Phe Gly Asp Asp Arg His Leu Thr Asn Arg Val 305 310 315 320 Leu Ser Leu Gly Tyr Ala Thr Lys Tyr Thr Ala Arg Ser Lys Cys Leu 325 330 335 Thr Glu Thr Pro Ile Glu Tyr Leu Arg Trp Leu Asn Gln Gln Thr Arg 340 345 350 Trp Ser Lys Ser Tyr Phe Arg Glu Trp Leu Tyr Asn Ala Met Trp Phe 355 360 365 His Lys His His Leu Trp Met Thr Tyr Glu Ala Ile Ile Thr Gly Phe 370 375 380 Phe Pro Phe Phe Leu Ile Ala Thr Val Ile Gln Leu Phe Tyr Arg Gly 385 390 395 400 Lys Ile Trp Asn Ile Leu Leu Phe Leu Leu Thr Val Gln Leu Val Gly 405 410 415 Leu Ile Lys Ser Ser Phe Ala Ser Cys Leu Arg Gly Asn Ile Val Met 420 425 430 Val Phe Met Ser Leu Tyr Ser Val Leu Tyr Met Ser Ser Leu Leu Pro 435 440 445 Ala Lys Met Phe Ala Ile Ala Thr Ile Asn Lys Ala Gly Trp Gly Thr 450 455 460 Ser Gly Arg Lys Thr Ile Val Val Asn Phe Ile Gly Leu Ile Pro Val 465 470 475 480 Ser Val Trp Phe Thr Ile Leu Leu Gly Gly Val Ile Phe Thr Ile Tyr 485 490 495 Lys Glu Ser Lys Arg Pro Phe Ser Glu Ser Lys Gln Thr Val Leu Ile 500 505 510 Val Gly Thr Leu Leu Tyr Ala Cys Tyr Trp Val Met Leu Leu Thr Leu 515 520 525 Tyr Val Val Leu Ile Asn Lys Cys Gly Arg Arg Lys Lys Gly Gln Gln 530 535 540 Tyr Asp Met Val Leu Asp Val 545 550 <210> 3 <211> 552 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 3 Pro Val Gln Leu Thr Thr Ala Leu Arg Val Val Gly Thr Ser Leu Phe 1 5 10 15 Ala Leu Ala Val Leu Gly Gly Ile Leu Ala Ala Tyr Val Thr Gly Tyr 20 25 30 Gln Phe Ile His Thr Glu Lys His Tyr Leu Ser Phe Gly Leu Tyr Gly 35 40 45 Ala Ile Leu Gly Leu His Leu Leu Ile Gln Ser Leu Phe Ala Phe Leu 50 55 60 Glu His Arg Arg Met Arg Arg Ala Gly Gln Ala Leu Lys Leu Pro Ser 65 70 75 80 Pro Arg Arg Gly Ser Val Ala Leu Cys Ile Ala Ala Tyr Gln Glu Asp 85 90 95 Pro Asp Tyr Leu Arg Lys Cys Leu Arg Ser Ala Gln Arg Ile Ser Phe 100 105 110 Pro Asp Leu Lys Val Val Met Val Val Asp Gly Asn Arg Gln Glu Asp 115 120 125 Ala Tyr Met Leu Asp Ile Phe His Glu Val Leu Gly Gly Thr Glu Gln 130 135 140 Ala Gly Phe Phe Val Trp Arg Ser Asn Phe His Glu Ala Gly Glu Gly 145 150 155 160 Glu Thr Glu Ala Ser Leu Gln Glu Gly Met Asp Arg Val Arg Asp Val 165 170 175 Val Arg Ala Ser Thr Phe Ser Cys Ile Met Gln Lys Trp Gly Gly Lys 180 185 190 Arg Glu Val Met Tyr Thr Ala Phe Lys Ala Leu Gly Asp Ser Val Asp 195 200 205 Tyr Ile Gln Val Cys Asp Ser Asp Thr Val Leu Asp Pro Ala Cys Thr 210 215 220 Ile Glu Met Leu Arg Val Leu Glu Glu Asp Pro Gln Val Gly Gly Val 225 230 235 240 Gly Gly Asp Val Gln Ile Leu Asn Lys Tyr Asp Ser Trp Ile Ser Phe 245 250 255 Leu Ser Ser Val Arg Tyr Trp Met Ala Phe Asn Val Glu Arg Ala Cys 260 265 270 Gln Ser Tyr Phe Gly Cys Val Gln Cys Ile Ser Gly Pro Leu Gly Met 275 280 285 Tyr Arg Asn Ser Leu Leu Gln Gln Phe Leu Glu Asp Trp Tyr His Gln 290 295 300 Lys Phe Leu Gly Ser Lys Cys Ser Phe Gly Asp Asp Arg His Leu Thr 305 310 315 320 Asn Arg Val Leu Ser Leu Gly Tyr Arg Thr Lys Tyr Thr Ala Arg Ser 325 330 335 Lys Cys Leu Thr Glu Thr Pro Thr Lys Tyr Leu Arg Trp Leu Asn Gln 340 345 350 Gln Thr Arg Trp Ser Lys Ser Tyr Phe Arg Glu Trp Leu Tyr Asn Ser 355 360 365 Leu Trp Phe His Lys His His Leu Trp Met Thr Tyr Glu Ser Val Val 370 375 380 Thr Gly Phe Phe Pro Phe Phe Leu Ile Ala Thr Val Ile Gln Leu Phe 385 390 395 400 Tyr Arg Gly Arg Ile Trp Asn Ile Leu Leu Phe Leu Leu Thr Val Gln 405 410 415 Leu Val Gly Ile Ile Lys Ala Thr Tyr Ala Cys Phe Leu Arg Gly Asn 420 425 430 Ala Glu Met Ile Phe Met Ser Leu Tyr Ser Leu Leu Tyr Met Ser Ser 435 440 445 Leu Leu Pro Ala Lys Ile Phe Ala Ile Ala Thr Ile Asn Lys Ser Gly 450 455 460 Trp Gly Thr Ser Gly Arg Lys Thr Ile Val Val Asn Phe Ile Gly Leu 465 470 475 480 Ile Pro Val Ser Ile Trp Val Ala Val Leu Leu Gly Gly Leu Ala Tyr 485 490 495 Thr Ala Tyr Cys Gln Asp Leu Phe Ser Glu Thr Glu Leu Ala Phe Leu 500 505 510 Val Ser Gly Ala Ile Leu Tyr Gly Cys Tyr Trp Val Ala Leu Leu Met 515 520 525 Leu Tyr Leu Ala Ile Ile Ala Arg Arg Cys Gly Lys Lys Pro Glu Gln 530 535 540 Tyr Ser Leu Ala Phe Ala Glu Val 545 550 <210> 4 <211> 1731 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hyaluronic acid synthase 1 <400> 4 cgccagcagg atgcgccgaa accgaccccg gcggcgtgcc gctgcagcgg cctggcgcgc 60 cgcgtgctga ccattgcgtt tgcgctgctg attctgggcc tgatgacctg ggcgtatgcg 120 gcgggcgtgc cgctggcgag cgatcgctat ggcctgctgg cgtttggcct gtatggcgcg 180 tttctgagcg cgcatctggt ggcgcagagc ctgtttgcgt atctggaaca tcgccgcgtg 240 gcggcggcgg cgcgcggccc gctggatgcg gcgaccgcgc gcagcgtggc gctgaccatt 300 agcgcgtatc aggaagatcc ggcgtatctg cgccagtgcc tggcgagcgc gcgcgcgctg 360 ctgtatccgc gcgcgcgcct gcgcgtgctg atggtggtgg atggcaaccg cgcggaagat 420 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cgggccgccc gtgggcgctg ctgtgggtgc tgctgtgcgt gcagggcgtg 1320 gcgctggcga aagcggcgtt tgcggcgtgg ctgcgcggct gcctgcgcat ggtgctgctg 1380 agcctgtatg cgccgctgta tatgtgcggc ctgctgccgg cgaaatttct ggcgctggtg 1440 accatgaacc agagcggctg gggcaccagc ggccgccgca aactggcggc gaactatgtg 1500 ccgctgctgc cgctggcgct gtgggcgctg ctgctgctgg gcggcctggt gcgcagcgtg 1560 gcgcatgaag cgcgcgcgga ttggagcggc ccgagccgcg cggcggaagc gtatcatctg 1620 gcggcgggcg cgggcgcgta tgtgggctat tgggtggcga tgctgaccct gtattgggtg 1680 ggcgtgcgcc gcctgtgccg ccgccgcacc ggcggctatc gcgtgcaggt g 1731 <210> 5 <211> 1653 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hyaluronic acid synthase 2 <400> 5 cattgcgaac gctttctgtg cattctgcgc attattggca ccaccctgtt tggcgtgagc 60 ctgctgctgg gcattaccgc ggcgtatatt gtgggctatc agtttattca gaccgataac 120 tattatttta gctttggcct gtatggcgcg tttctggcga gccatctgat tattcagagc 180 ctgtttgcgt ttctggaaca tcgcaaaatg aaaaaaagcc tggaaacccc gattaaactg 240 aacaaaaccg tggcgctgtg cattgcggcg tatcaggaag atccggatta tctgcgcaaa 300 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cagcctgtgg tttcataaac atcatctgtg gatgacctat 1140 gaaagcgtgg tgaccggctt ttttccgttt tttctgattg cgaccgtgat tcagctgttt 1200 tatcgcggcc gcatttggaa cattctgctg tttctgctga ccgtgcagct ggtgggcatt 1260 attaaagcga cctatgcgtg ctttctgcgc ggcaacgcgg aaatgatttt tatgagcctg 1320 tatagcctgc tgtatatgag cagcctgctg ccggcgaaaa tttttgcgat tgcgaccatt 1380 aacaaaagcg gctggggcac cagcggccgc aaaaccattg tggtgaactt tattggcctg 1440 attccggtga gcatttgggt ggcggtgctg ctgggcggcc tggcgtatac cgcgtattgc 1500 caggatctgt ttagcgaaac cgaactggcg tttctggtga gcggcgcgat tctgtatggc 1560 tgctattggg tggcgctgct gatgctgtat ctggcgatta ttgcgcgccg ctgcggcaaa 1620 aaaccggaac agtatagcct ggcgtttgcg gaagtg 1656 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ggctcagttt gtcctcactg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ggtccacctt tcatcttcat 20

Claims (7)

1. 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진, 고분자 히알루론산의 합성을 촉진하고, 콜라게나아제의 발현을 저해하는 히알루론산 합성효소 (hyaluronic acid synthase) 단백질을 유효성분으로 화장료 조성물 총 중량 대비 0.000001 내지 0.1 중량%로 포함하는 피부 보습 증진, 주름 개선 및 피부 탄력 증진용 화장료 조성물.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 히알루론산 합성효소 단백질은 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 대장균 코돈 최적화된 히알루론산 합성효소 3 단백질 코딩 유전자를 대장균에 형질전환하여 발현하고 분리 정제하여 얻어진 것을 특징으로 하는 피부 보습 증진, 주름 개선 및 피부 탄력 증진용 화장료 조성물.
4. 삭제
5. 삭제
6. 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 스킨, 스킨 소프트너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 아이 크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 클렌징폼, 클렌징 워터, 클렌징 로션, 클렌징 크림, 바디로션, 바디클렌져, 비누 및 파우더로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가지는 것을 특징으로 하는 피부 보습 증진, 주름 개선 및 피부 탄력 증진용 화장료 조성물.
7. 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 습윤화제, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 중에서 선택된 하나 이상의 보조제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 보습 증진, 주름 개선 및 피부 탄력 증진용 화장료 조성물.

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