CN108025088A - 溶瘤性hsv1载体及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
对传统疗法耐受的恶性肿瘤代表重大的治疗挑战。本发明的实施方式提供了毒性较小的第二代溶瘤病毒rQNestin34.5v2，该溶瘤病毒在选择性杀伤靶细胞(如肿瘤细胞)上更有效。在本文所呈现的各种实施方式中，本文所述的溶瘤病毒适于治疗胶质母细胞瘤以及其它癌症。
Description
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技术领域
本发明针对使用溶瘤性单纯疱疹病毒1(HSV-1)治疗患者脑部的癌症的方法和组合物。
背景技术
许多恶性肿瘤本身对传统疗法耐受，并代表重大的治疗挑战，例如，恶性胶质瘤(gliomas)和复发性系统性实体瘤(如肺癌)。恶性胶质瘤是最多的原发性脑部肿瘤，年发病率为6.4例/100,000。这些神经毁坏性肿瘤是原发性脑部肿瘤最常见的亚型，并且是最致命的人癌症之一。尽管尽了最大的治疗努力，在最侵袭性的癌症表现-多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)中，患者的中位生存期为14个月。尽管有多种治疗(例如手术、放射和化学疗法)，对脑部肿瘤的大多数恶性类型(恶性胶质瘤/多形性胶质母细胞瘤(GBM))的治疗无法提供持久控制，50％的受折磨的患者在诊断后15个月内死亡。已经尝试和测试了各种实验性处理。由于对许多这些难治性肿瘤而言很少有好的治疗选择可用，探索新颖的和创新的治疗手段是重要的。
实验性疗法的一个领域涉及使用溶瘤(肿瘤杀伤)病毒，所述病毒的感染和在肿瘤细胞中的复制已被工程化为肿瘤选择性的。将复制选择性溶瘤病毒作为用于实体瘤的抗肿瘤剂显示出了很好的前景。对这些病毒在遗传上进行了构建，以使得它们能够在肿瘤细胞内优先复制，同时就其在正常细胞中复制的能力方面对它们至少有所限制。溶瘤病毒的主要抗肿瘤机制是通过直接的细胞病变效应(cytopathic effect)，因为它们增殖并从最初感染的肿瘤细胞扩散至周围的肿瘤细胞，从而实现了更大量的分布和抗癌效果。
溶瘤性单纯疱疹病毒(HSV)最初是为了治疗脑部肿瘤而设计和构建的。随后，发现它们在多种其它人实体瘤中有效，包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌和肝癌。在小鼠和灵长类动物(对HSV极其敏感)中对溶瘤性HSV的安全性进行了广泛测试。已作为胶质瘤特异性治疗剂进行研究的一种溶瘤性HSV-1突变体为rQNestin 34.5(Kambara等，Anoncolytic HSV-1mutant expression ICP34.5under control of a Nestin promoterincreases survival of animals even when symptomatic from a brain tumor，(2005)Cancer Res.65(7)：2832-2839)。
尽管有令人鼓舞的临床前研究，来自早期临床试验的结果表明，溶瘤病毒的当前版本的大多数其本身可能仅具有有限的抗肿瘤活性(尽管是可接受地安全的)。
考虑到可用于某些类型的癌症(包括某些类型的脑癌)的有效治疗选择是有限的，本领域中仍然存在对改良的溶瘤病毒的需求。
发明内容
我们已经生成了改良的溶瘤性rQNestin34.5HSV病毒，将第二代病毒称为rQNestin34.5v.2。通过以下操作制作具有胶质瘤选择性的遗传修饰的HSV1rQNestin34.5v.2：1)将编码病毒蛋白(ICP6)的病毒基因之一移除。没有这个基因，HSV1不得不利用所感染的细胞内的因子来有效地进行生长和复制，我们已经证明此类因子存在于有丝分裂活跃的细胞或在细胞基因(p16)(其在大多数胶质瘤中丢失)中具有缺陷的细胞；以及2)将编码用于在感染细胞中的稳健的病毒生长所需的蛋白(ICP34.5)的病毒基因的两个拷贝移除，并将在nestin启动子(选择性地存在于成人脑的胶质瘤中)的控制之下的一个拷贝重新插入。由于缺少在第一代rQNestin34.5(Kambara等，An oncolytic HSV-1 mutantexpression ICP34.5under control of a Nestin promoter increases survival ofanimals even when symptomatic from a brain tumor，(2005)Cancer Res.65(7)：2832-2839)中存在的ICP6-EGFP融合蛋白，结合了降低的毒性的这两个操作允许这种新的HSV1(命名为rQNestin34.5v.2)在破坏胶质瘤而不是正常的脑细胞方面具有相对选择性。我们已经在培养的细胞和动物模型中证实了这一点。
因此，本文提供了肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体，所述溶瘤性疱疹病毒载体包括：a)编码γ34.5的基因的两个拷贝的缺失或失活突变；b)在nestin启动子的转录控制下的HSV γ34.5基因的至少一个拷贝的插入；以及c)编码HSV病毒蛋白ICP6的基因的缺失或失活突变，其中，所述肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体不表达绿色荧光蛋白。在一个实施方式中，该载体不表达在第一代HSV-1载体rQNestin34.5中存在的ICP6-EGFP融合蛋白。在一个实施方式中，该肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体不包含SEQ ID NO：7。在一个实施方式中，该载体不含有UL39核酸调控序列(启动子元件和增强子元件)。在一个实施方式中，该载体不含有ICP6的融合蛋白。在一个实施方式中，在nestin启动子的转录控制下的γ34.5基因的至少一个拷贝被插入到编码核糖核苷酸还原酶ICP6(infected cell protein6，感染细胞蛋白6)的大亚基的UL39基因中。在一个实施方式中，nestin启动子包含SEQ IDNO：2或其简并变体(degenerate variant)。在一个实施方式中，该肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体包含SEQ ID NO：8。
还提供了包含SEQ ID NO：1序列或其简并变体的肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体。
本发明的另一方面提供了在受试者中选择性杀伤颅内肿瘤细胞的方法，所述方法包括将本发明的肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体引入附近。我们已经确定，一个额外的操作允许rQNestin34.5v.2在被注射的胶质瘤中高度有效。哺乳动物能够通过其初次免疫应答(initial immune response)快速地抵抗脑中的HSV1。脑细胞(如小胶质细胞(microglia))和系统性细胞(如NK细胞和巨噬细胞)可以钝化并有效地确保在正常脑上病毒复制及其不良后果不发生。我们发现，在注射有rQNestin34.5v.2的胶质瘤的环境中也存在此类固有的初始宿主防御，所述固有的初始宿主防御消减了病毒在肿瘤内的生物分布(biodistribution)并限制其治疗效果。在动物模型中，我们发现在rQNestin34.5v.2之前两天给予单剂量的环磷酰胺(一种调节免疫应答的常用药剂)显著地提高了病毒的生物分布、复制和疗效，从而有效地使产生存活效应所需的病毒的剂量减少了两个数量级。
因此，在一个实施方式中，该方法进一步包括给予环磷酰胺(CPA)。在某些实施方式中，将CPA与HSV溶瘤性载体同时给予。在某些实施方式中，在给予HSV-1溶瘤性载体之前数小时、数天或数周给予CPA。在一个实施方式中，在溶瘤性疱疹病毒载体之前两天给予CPA。
在一些实施方式中，肿瘤细胞包括胶质母细胞瘤(glioblastoma)细胞或癌症干细胞。在一些实施方式中，待治疗的受试者为哺乳动物。在某些实施方式中，哺乳动物为人。
还提供了本文所述的本发明的肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体的药物组合物，所述药物组合物用于在受试者中治疗颅内肿瘤细胞。在各种实施方式中，该肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体包含：a)编码γ34.5的基因的两个拷贝的缺失或失活突变；b)在nestin启动子的转录控制下的HSV γ34.5基因的至少一个拷贝的插入；以及c)编码HSV病毒蛋白ICP6的基因的缺失或失活突变，其中，所述肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体不表达绿色荧光蛋白。在一个实施方式中，该载体不表达在第一代HSV-1载体rQNestin34.5中存在的ICP6-EGFP融合蛋白。在一个实施方式中，该肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体不包含SEQ ID NO：7。在一个实施方式中，该载体不含有UL39核酸调控序列(启动子元件和增强子元件)。在一个实施方式中，该载体不含有ICP6的融合蛋白。在一个实施方式中，在nestin启动子的转录控制下的γ34.5基因的至少一个拷贝被插入到编码核糖核苷酸还原酶ICP6(感染细胞蛋白6)的大亚基的UL39基因中。在一个实施方式中，nestin启动子包含SEQ ID NO：2或其简并变体。在一个实施方式中，该肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体包含SEQ ID NO：8。
附图说明
在所参考的附图中对示例性的实施方式进行了说明。本文公开的实施方式和附图旨在被认为是说明性的而不是限制性的。
图1是rQNestin34.5v.2的示意图。HSV毒株F(野生型)、rHsvQ1(UL39-γ34.5双突变体)和rQNestin34.5的示意图谱。所有的毒株都含有典型的HSV-1基因组，所述HSV-1基因组具有两个独特的片段(分别为UL和US)，每个片段的侧翼为反向重复元件(分别为ab和ca)。二倍体γ34.5基因和胸苷激酶(thymidine kinase)基因(tk)的位置显示在顶部的构建体中，表示野生型F毒株HSV。在中间的构建体中，关于rHsvQ1，UL39(ICP6)的编码序列缺失，并且示出了γ134.5内的缺失。这包括了编码区约1000bp的缺失。底部的构建体示出了杂合启动子(nestin增强子和hsp68最小启动子)-γ1 34.5表达盒重组到ICP6丧失的位点，从而生成了新的突变体溶瘤病毒rQNestin34.5v.2。提供了来自rQNestin34.5的HindIII片段的大约大小(来自Kambara等，Cancer Res.，2005)。对rQNestin34.5v.2整体进行测序以确认其一致性(SEQ ID NO：1)。
图2是几种胶质瘤细胞(U87dEGFR、U251、U138和Gli36dEGFR)和新移植的胶质瘤“干细胞样(stem-like)”细胞(GBM 02)和正常人星形胶质细胞(human astrocytes，HA)和内皮细胞(HUVEC)的蛋白质印迹(western blot)，所述几种胶质瘤细胞(U87dEGFR、U251、U138和Gli36dEGFR)和新移植的胶质瘤“干细胞样”细胞(GBM 02)和正常人星形胶质细胞(HA)和内皮细胞(HUVEC)感染有rQNestin34.5v.2或亲代rQNestin34.5(v.1)、对照rQ1病毒、野生型F毒株，或者为未感染的(细胞)。当时，获取裂解物，并进行蛋白质印迹以使总eIF2a和磷酸化的eIF2α(eIF2α-Pser51)可视化。不包括x12(另一个GSC)但显示出与OG02相同的结果。
图3是含有整个HSV1基因组的fHSVQ2-X系列的细菌人工染色体(bacterialartificial chromosome，BAC)的构建示意图，所述HSV1基因组具有内源的HSV1 ICP34.5和ICP6的缺失以及用于转移外源序列的大序列(例如Nestin/hsp68启动子/增强子的序列(由X标记))的插入。
图4是rQNestin34.5 v.2(缺少ICP6GFP的rQNestin34.5)的工程化的示意图。获得了含有HSV1基因组的细菌人工染色体(BAC)(命名为fHSVQuick-2)，所述HSV1基因组缺少HSV1基因γ1 34.5(编码病毒蛋白ICP34.5)的两个拷贝，并且具有关于ICP6的病毒基因的大的缺失(仅剩下一些3′端序列)。然后，通过采用FLP，经由位点特异性重组将具有nestin-启动子增强子元件(位于γ1 34.5转基因的上游)的质粒(pT-Nestin34.5)重组到FRT基因座中。然后，从细菌中纯化BAC多联体(concatenate)(fHSVQ2-Nestin34.5 v.2)，在Cre重组酶的存在下将其电穿孔进哺乳动物的Vero细胞中，以移除内部的抗生素抗性位点、荧光蛋白位点(如DSRed1)、FRT位点以及F质粒的复制起点。病毒基因组将在Vero细胞中进行复制，产生rQNestin34.5 v.2病毒粒子(virions)(参见例如Terada等，Development of a rapidmethod to generate multiple oncolytic HSV vectors and their in vivoevaluation using synergenic mouse tumor models.Gene Ther.13：705-714，2006)。
图5是描述人胶质瘤细胞和正常人星形胶质细胞中病毒产量的图表。在存在rQNestin34.5v.2(v2)、亲代rHSVQ1(Q1)、野生型F毒株(F)以及与本项目无关的另一溶瘤病毒构建体(34C)的情况下，培养正常人星形胶质细胞(HA)和人胶质瘤细胞(U87dEGFR(U87dE)和U251)。然后，在3天后分析病毒产量。
图6是描述各种细胞的细胞存活的图表。将rQNestin34.5v.2添加至一组胶质瘤细胞，U87dEGFR(U87dE)、U87、U251和OG02；以及一组正常细胞，人星形胶质细胞(HA)、人成纤维细胞(Fibro.)、人平滑肌(SM)、人骨骼肌细胞(SkM)和小鼠星形胶质细胞(MA)。然后，在5天后通过Coulter计数器计数法(Coulter counter enumeration)对存活的细胞进行计数。
图7A为示出了随时间(x)的小鼠的存活(v)的图表。将U87dEGFR胶质瘤细胞(2×105)移植到8周龄的无胸腺小鼠的脑中。一周后，将PBS、rHSVQ1、rQNestin34.5v.1和rQNestin34.5v.2(3×105pfu，处于5μl中)注射到相同的位置。然后监测存活。
图7B为示出随时间(x)的小鼠的存活(y)的图表。将U87dEGFR胶质瘤细胞(2×105)移植到8周龄的无胸腺小鼠的脑中。两周后，将PBS、rHSVQ1、rQNestin34.5v.1和rQNestin34.5v.2(3×105pfu，处于5μl中)注射到相同的位置。然后监测存活。
图8为总结迄今使用Balb/c小鼠的所有实验结果的表格。在8周龄小鼠或6月龄小鼠中107pfu的脑内注射被良好地耐受(32/33，在注射后第3天因不明原因有一例死亡)。
图9为示出了rQNestin34.5v.2(v2)的复制的图表，所述复制在来自于人的新产生的5种胶质瘤干细胞(脑肿瘤起始细胞-BTIC)(G35、G68、G97、OG02、X12)中进行分析。HSVQ1(Q1)(ICP34.5缺失病毒)显示出没有复制或最少的复制。F(野生型HSV)显示出最多的复制。34C是不相关的HSV重组体HSV。
图10示出了在用rQNestin34.5v.2或F处理的小鼠中LAT转录本的RT-PCR。将前者以107pfu的剂量进行ic.注射、i.t.注射或i.v.注射。60天后，对6个不同的脑和6个不同的三叉神经节(trigeminal ganglia)进行关于LAT转录本的RT-PCR(35个循环)。反应的阳性对照由用rQNestin34.5v.2感染的胶质瘤细胞构成。将F毒株病毒进行i.c.注射，然后在30天或60天后处死小鼠以检测LAT。
图11示出了用rQNestin34.5v.2或F处理的小鼠中的DNA聚合酶(DNA pol)转录本的PCR。将前者以107pfu的剂量进行i.c.注射、i.t.注射或i.v.注射。60天后，对不同的脑和5个不同的三叉神经节进行关于LAT转录本的PCR(35个循环)。反应的阳性对照由用rQNestin34.5v.2感染的胶质瘤细胞构成。对F毒株病毒进行i.c.注射，然后在30天或60天后处死小鼠以检测DNA聚合酶。
图12A-图12B示出了示意图和图表。图12A为在小鼠中的毒性研究的示意图。图12B为示出了注射rQNestin34.5v.2(v2-1×107)和野生型HSV1 F毒株后的存活率相对于时间的图表。
图13A-图13B示出了示意图和图表。图13为使用CPA在小鼠中的临床前研究的示意图。图13B为示出了注射rQNestin34.5v.2(v2-1x107)和野生型HSV1 F毒株后的存活率相对于时间的图表。在以106pfu(带有虚线的蓝色三角形)、3×106pfu(浅蓝色圆圈/线)或107pfu(蓝色菱形/行)颅内接种rQNestin34.5v.2(v2)之前两天，i.p.给予CPA(300mg/kg)。分子表示实施安乐死的(归因于兽医学毒性标准)或发现死亡的动物，而分母表示所注射的总数。F表示以103pfu(红色叉/线)注射的野生型HSV1 F毒株。PBS表示颅内溶媒(vehicle)注射。该实验在第62天-第63天终止，将所有存活的动物按计划实施安乐死以获取用于毒性/生物分布分析的器官。
图14示出了图13中使用的小鼠注射后随时间的相对体重的图表。
图15示出了通过使用PCR片段(del-GFP-FRT-Gm-F&R)的同源重组，fHSVQuick-1中的缺失区域的示意图。
图16示出了用于同源重组的PCR片段del-GFP-FRT-Gm-F&R的示意图。
图17A-图17D示出了邻近胶质瘤的人脑中的nestin表达。受试者是一名50岁以上、患有MG的男性。作为切除术的一部分，邻近肿瘤的没有大体肿瘤的脑也被切除直至脑室。图17A示出了在高倍显微照片中的几个阳性的星形胶质细胞的GFAP免疫组织化学。图17B示出了在相似区域的nestin的免疫组织化学是相对阴性的。图17C示出了脑室下区(subventricular zone，SVZ)的nestin的免疫组织化学(IHC)(箭头)也是阴性的(低倍)。图17D示出了SVZ的nestinIHC的高倍显微照片(箭头)。
图18A-图18C示出了治疗后的人脑中的nestin的表达。受试者是一名50岁以上、有MG病史的男性，曾经历过手术、放射和化学疗法。该患者由于肿瘤以外的其它原因去世了。尸检后，脑中没有肿瘤。nestinIHC再次显示出，在受试者对其肿瘤进行了治疗的情况下，白质内几乎没有任何阳性的迹象。图18A-低倍；图18B-中倍；图18C-高倍显微照片。
图19A-图19C示出了无胸腺小鼠的脑中的nestin的表达。用溶媒(PBS)接种该无胸腺小鼠的大脑。在第4天，对小鼠实施安乐死然后获取脑。进行nestin IHC。在伸长细胞(tanycytes)(即在侧脑室(左上图，图19A)、第三脑室(右上图，图19B)和水管(左下图，图19C)的室管膜层中的细胞)中可见阳性的nestin IHC。每个图示出了整个脑的低倍显微照片，方框插图示出了高倍显微照片。
图20示出了在HUVEC细胞，以及所建立的U251胶质瘤细胞、U87dEGFR胶质瘤细胞和OG02胶质瘤“干细胞样”细胞中的rQNestin34.5v.2和rQNestin的病毒产量的生物等效性(bioequivalency)。该图示示出了rQNestin34.5v.2的病毒产量在3种胶质瘤细胞中(包括胶质瘤干细胞样细胞)与rQNestin34.5的病毒产量相当，在HUVEC细胞中的病毒产量更优。
图21示出了对以下细胞中rQNestin34.5v.2、对照rHSVQ1和野生型F毒株的产量进行比较的复制分析结果的图示：4种所建立的胶质瘤细胞系(U251、Gli36、T98G和U87dE)；3种胶质瘤干细胞样细胞(G97、OG02、X12)；以及4种正常细胞(HUVEC、骨骼肌细胞-SKM、平滑肌细胞-SM和成纤维细胞)。该图示示出了在4种所建立的胶质瘤细胞系和在干细胞样条件下生长的3种原代胶质瘤中rQNestin34.5v.2的复制高于ICP34.5-阴性rHSVQ1的复制，但是在4种正常细胞中与rHSVQ1类似。F毒株的复制总体上较高。
图22A-图22D示出了rQNestin34.5和rQNestin34.5v.2的细胞毒性。在所有测试的MOI中，针对一组正常细胞和胶质瘤细胞，rQNestin34.5v.2在细胞毒性方面与rQNestin34.5相当。图22A HUVEC；图22B U251；图22CU87ΔEGFR；图22D Gli36ΔEGFR。
具体实施方式
以引用的方式将本文引用的所有参考文献整体并入进行充分阐述。除非本文另有定义，与本申请结合使用的科学术语和技术术语应具有本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义。应当理解的是，本发明不限于本文所述的具体方法学、方案和试剂等，此类方法学、方案和试剂等可以变化。常见术语的定义可见于：Singleton等，Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology第3版，J.Wiley&Sons New York，NY(2001)；March，Advanced Organic Chemistry Reactions，Mechanisms and Structure第5版，J.Wiley&Sons New York，NY(2001)；Michael Richard Green和Joseph Sambrook，MolecularCloning：A Laboratory Manual，第4版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.，USA(2012)；Davis等，Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier Science Publishing，Inc.，New York，USA(2012)；Jon Lorsch(编)，LaboratoryMethods in Enzymology：DNA，Elsevier，(2013)；Frederick M.Ausubel(编)，CurrentProtocols in Molecular Biology(CPMB)，John Wiley and Sons，(2014)；JohnE.Coligan(编)，Current Protocols in Protein Science(CPPS)，John Wiley and Sons，Inc.，(2005)；以及Ethan M Shevach、Warren Strobe(编)Current Protocols inImmunology(CPI)，John E.Coligan，ADA M Kruisbeek，David H Margulies，John Wileyand Sons，Inc.，(2003))；其各自为本领域技术人员提供了本申请中使用的许多术语的通用指导。
本领域技术人员将认识到可用于本发明的实践中、与本文描述的方法和材料类似或等同的许多方法和材料。实际上，本发明并不限于所描述的方法和材料。为了本发明的目的，下面对一些术语进行定义。
在一些实施方式中，用于描述和要求保护本申请的某些实施方式的表示成分的量、特性(例如分子量)、反应条件等的数字应当理解为在一些情况下由术语“约”修饰。因此，在一些实施方式中，在撰写的说明书和所附的权利要求书中提到的数字参数都是近似值，可取决于由具体实施方式所试图获得的期望的特性而改变。在一些实施方式中，数字参数应当根据已报道的有效位(significant digit)的数字并通过应用普通的舍入技术来解释。尽管给出本申请的一些实施方式的宽范围的数字范围和参数是近似值，尽可能精确地报道具体实施例中给出的数值。
本文所用的术语“哺乳动物”是指哺乳动物纲的成员，包括但不限于：人和非人灵长类动物，例如黑猩猩和其它猿类和猴类；农场动物，例如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，例如狗和猫；实验动物，包括啮齿类动物(例如小鼠、大鼠和豚鼠等)。
本文所用的术语“载体”是指用于运载的核酸分子，可将核酸序列插入其中以引入细胞中，在所述细胞中该核酸序列可被复制。核酸序列可为“外源的”，这意味着该序列对于被引入载体的细胞而言是外来的，或者该序列与细胞中的序列同源，但位于通常未发现所述序列的宿主细胞核酸内的位置。载体包括质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(例如YAC)。本领域技术人员能够通过标准的重组技术顺利地构建载体(参见例如，Maniatis等，1988；以及Ausubel等，1994，以引用的方式将两者并入本文)。此外，本文描述的和在附图中演示的技术对于有效的载体构建也具有指导性。
术语“溶瘤性HSV-1载体”是指对应于HSV-1的基因组的至少一部分的遗传工程化的HSV-1病毒，所述病毒能够转导靶细胞、复制并被包装成HSV-1病毒粒子。遗传工程化的病毒包括使病毒成为溶瘤性的核酸的缺失和/或突变和/或插入，从而使得工程化的病毒在肿瘤细胞中复制并通过溶瘤活性杀伤肿瘤细胞。该病毒可为减毒的或未减毒的。该病毒可递送不同于HSV病毒基因组的转基因(transgene)或者该病毒不能递送不同于HSV病毒基因组的转基因。在一个实施方式中，溶瘤性HSV-1载体不表达转基因以及产生对于病毒而言外来的蛋白。
HSV-1是一种人嗜神经病毒(neurotropic virus)，能够感染几乎所有的脊椎动物细胞。天然感染遵循裂解、复制周期，或建立潜伏期(通常在外周神经节中，其中DNA无限期地维持游离状态)。HSV-1含有双链的、线性DNA基因组，长度为153千碱基，由McGeoch完全测序(McGeoch等，J.Gen.Virol.69：1531(1988)；McGeoch等，NucleicAcids Res 14：1727(1986)；McGeoch等，J.Mol.Biol.181：1(1985)；Perry和McGeoch，J.Gen.Virol.69：2831(1988))。DNA复制和病毒体组装发生在感染细胞的核中。在感染晚期，多联病毒DNA被切割成的基因组长度的分子，所述分子被包装成病毒粒子。在CNS中，单纯疱疹病毒跨神经元传播，然后轴突内逆行或顺行运输到核，在核中发生复制。
术语“表达载体”是指含有编码RNA的能够被转录的的核酸的任何类型的遗传构建体。在一些情况中，RNA分子随后被翻译成蛋白、多肽或肽。在其它情况中，这些序列不进行翻译，例如在生产反义分子或核酶中。表达载体可含有多种“控制序列”，所述控制序列是指在特定的宿主细胞中对可操作连接的编码序列的转录和可能的翻译而言所必需的核酸序列。除了管理转录和翻译的控制序列外，载体和表达载体还可包含起到其它作用的核酸序列，在下文中进行描述。
本文所用的术语“启动子”是指直接或间接地调控与其可操作地连接的对应核酸编码序列的转录的核酸序列。启动子可单独发挥作用来调控转录，或者在一些情况中，启动子可与一个以上其它调控序列(例如增强子或沉默子)一起起作用来调控目的基因的转录。启动子包括DNA调控序列，其中，所述调控序列来源于能够结合RNA聚合酶并启动下游(3′-方向)编码序列的转录的基因。启动子通常包括功能为定位RNA合成起始位点的序列。其中最著名的实例是TATA盒，但是在缺乏TATA盒的一些启动子(例如哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和SV40晚期基因的启动子)中，覆盖起始位点的不连续元件本身有助于固定起始的位置。另外的启动子元件调控转录起始的频率。通常而言，这些启动子位于起始位点上游30bp-110bp的区域，不过已经证明了许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。为了使编码序列处于启动子的“控制”下，可将转录读码框的转录起始位点的5′端置于所选的启动子的“下游”(即所选的启动子的3′端)。“上游”启动子激发DNA的转录并促进编码RNA的表达。
启动子元件之间的间隔通常是灵活的，使得当元件颠倒或彼此之间相对移动时，启动子的功能得以保留。依赖于所使用的启动子，各个元件可协同地或独立地起作用以活化转录。本文所述的启动子可与“增强子”结合使用或者可不与“增强子”结合使用，所述“增强子”是指参与核酸序列的转录活化的顺式作用调控序列，例如本文列出的用于基因的增强子、或其部分或其功能等同物。
启动子可为与核酸序列天然相关的启动子，如可通过分离位于编码段和/或外显子上游的5′非编码序列而获得。此类启动子可被称为“内源的”。类似地，增强子可为与核酸序列天然相关的增强子，位于该序列的下游或上游。或者，通过将编码核酸段置于重组启动子或异源启动子的控制下可获得某些优点，重组启动子或异源启动子是指在核酸序列的自然环境中通常不与该核酸序列天然相关的启动子。重组增强子或异源增强子也指在核酸序列的自然环境中通常不与该核酸序列天然相关的增强子。此类启动子或增强子可包括其它基因的启动子或增强子；从任何其它病毒或者原核细胞或真核细胞中分离的启动子或增强子；以及不是“天然存在”的启动子或增强子(即含有不同转录调控区的不同元件和/或含有改变表达的突变)。例如，在重组DNA的构建中最常用的启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)启动子系统、乳糖启动子系统和色氨酸(trp)启动子系统。如本文所证实，在一些实施方式中，nestin启动子用于驱动目的基因的表达。除了通过合成生产启动子和增强子的核酸序列外，还可结合本文公开的组合物使用重组克隆技术和/或核酸扩增技术来生产序列(参见美国专利号4,683,202和美国专利号5,928,906，各自以引用方式并入本文)。此外，在考虑之列的是也可采用指导非核细胞器(例如线粒体、叶绿体等)内的序列的转录和/或表达的调控序列。
“基因”或“编码特定蛋白的序列”是核酸分子，当置于一个或多个适当的调控序列的控制之下时，所述核酸分子在体外或体内转录(在DNA的情况中)和翻译(在RNA的情况中)成多肽。目的基因可包括但不限于：来自真核生物mRNA的cDNA、来自真核生物DNA的基因组DNA序列、以及甚至合成的DNA序列。转录终止序列通常位于基因序列的3′。通常而言，提供多聚腺苷酸化(polyadenylation)信号来终止插入到重组病毒中的基因的转录。
本文所用的术语“多肽”或“蛋白”是指通过肽键以特定的序列连接的氨基酸的聚合物。除非另外具体指明，本文所用的术语“氨基酸”是指氨基酸的D或L立体异构体形式。
术语“转基因”是指编码在其插入的细胞中待表达的多肽或多肽的部分的特定核酸序列。术语“转基因”意在包括：(1)在细胞中不是天然存在的核酸序列(即，异源的核酸序列)；(2)为在其插入的细胞中天然存在的核酸序列的突变形式的核酸序列；(3)用于增加在其插入的细胞中天然存在的相同的(即，同源的)或类似的核酸序列的额外拷贝的核酸序列；或者(4)在其插入的细胞中被诱导表达的沉默的天然存在的核酸序列或同源的核酸序列。“突变体形式”序列或“修饰的核酸”序列或“修饰的核苷酸”序列是指含有不同于野生型或天然存在的序列的一个或多个核苷酸的序列，即突变体核酸序列含有一个或多个核苷酸的替换、缺失和/或插入。在一些情况中，目的基因还可包括编码前导肽或信号序列的序列，从而使得转基因产物可从细胞中分泌。
本文所用的术语“转染”是指哺乳动物细胞摄取外来DNA。当外源的DNA被引入细胞膜内时，细胞被“转染”。本领域已知多种转染技术。参见Michael Richard Green和JosephSambrook，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第4版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，USA(2012)；Davis等，Basic Methods inMolecular Biology，Elsevier Science Publishing，Inc.，New York，USA(2012)；JonLorsch(编)Laboratory Methods in Enzymology：DNA，Elsevier，(2013)；FrederickM.Ausubel(编)，Current Protocols in Molecular Biology(CPMB)，John Wiley andSons，(2014)。此类技术可用于将一个或多个外源DNA部分(如病毒载体和其它核酸分子)引入合适的宿主细胞中。该术语是指遗传物质的稳定和瞬时的摄取。
本文所用的术语“溶瘤活性”是指对肿瘤细胞表现出的体外和/或体内细胞毒作用，而在相同条件下对正常细胞没有任何可察觉的或显著的有害作用。体外条件下的细胞毒作用通过现有技术中已知的各种方法(例如通过用选择性染料对死细胞染色、通过抑制DNA合成、或通过凋亡)进行检测。体内条件下细胞毒作用的检测通过本领域已知的方法进行。
本文所用的，分子的“生物活性”部分是指可执行与大分子类似功能的大分子的部分。仅通过非限制性实例的方式，启动子的生物活性部分是保留了影响基因表达的能力(即使只是略有保留)的启动子的任何部分。同样地，蛋白的生物活性部分是保留了执行全长蛋白的一种或多种生物学功能(例如与另一分子结合、磷酸化等)的能力(即使只是略有保留)的蛋白的任何部分。
考虑到上述的初步描述和定义，下文提供了另外的背景，以提供本文所述的本发明的载体、组合物和方法的发生和发展的来龙去脉。
靶向恶性胶质瘤的当前的突变型HSV-1载体基于两个缺失突变基因：ICP6，UL39基因的产物，HSV-1核糖核苷酸还原酶(RR)的大亚基；以及ICP34.5，34.5基因的产物，同时与神经毒力(neurovirulence)有关的多功能蛋白。尽管缺乏ICP6限制了对于非分裂细胞的病毒复制，但是其允许在具有缺陷的p16肿瘤抑制因子途径的细胞中复制以继续，两种γ234.5基因的缺失抑制HSV-1脑炎。这可能是由于ICP34.5促进Beclin-1的自噬功能(对神经毒力至关重要)。除了这种自噬抑制作用外，ICP34.5还抵消了由病毒感染触发的宿主防御机制。这种机制激活PKR(双链RNA蛋白激酶)，然后PKR使翻译因子eIF2α磷酸化，从而导致对翻译的抑制。ICP34.5直接结合并活化PP1(蛋白磷酸酶1)，所述PP1使eIF2α去磷酸化，从而允许病毒mRNA的翻译得以继续。在多个临床试验中已经证明了将具有突变的γ34.5基因的溶瘤性HSV-1(例如，G207、1716)给予患有胶质瘤的患者是安全的，但是疗效一直是难以捉摸的，这可能是由于它们受限的病毒复制。为了克服这个限制，之前工程化了HSV1，其中，ICP34.5基因处于胶质瘤干细胞的nestin启动子的转录控制之下。在胶质瘤模型中rQNestin34.5表现出增强的疗效。
nestin是胚胎发生(embryogenesis)期间主要在神经干细胞中表达的中间丝(intermediate filament)，并且被认为在胶质瘤中的上调。中枢神经系统(CNS)的多种原发性肿瘤表现出肿瘤和/或内皮细胞内nestin水平升高。这种转录驱动的溶瘤病毒在体外和体内显示出了对CNS肿瘤和神经母细胞瘤(neuroblastoma)肿瘤有效的抗肿瘤疗效。nestin基因序列可在以下中找到：Genebank Gene ID：10763，Chromosome 1-NC_000001.11(156668763..156677397，complement)。
疱疹伽玛(γ)34.5基因
已发表的结果表明，疱疹γ34.5基因(或者称为γ1 34.5基因)的至少一种功能是阻止宿主细胞对病毒感染的应答，即在类凋亡应答(apoptotic-like response)中触发宿主蛋白合成的关闭(Chou，J.等，Science 250：1262-1266(1990)；Chou，J.和Roizman，B.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：3266-3270(1992)；Chou，J.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92：10516-10520(1995))。类似的功能在致病性病毒中是广泛(Cosentino，G.P.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：9445-9449(1995)；Gale，M.，Jr.等，Mol.Cell Biol.18：5208-5218(1998)；Katze，M.G等，Trends Microbiol.3：75-78(1995)；Sharp，T.V.等，Nuc.Acids Res.21：4483-4490(1993))。
尽管对Vero细胞中培养的病毒生长而言，γ34.5是非必要的，它能够使病毒在小鼠的中枢神经系统(CNS)中扩散，而且映射(map)之前参与CNS复制的HSV基因组的区域(Markovitz，N.S.等，J.Virol.71：5560-5569(1997)；Centifanto-Fitzgerald，Y.M.等，J.Esp.Med 155：475-489(1982))。这可能由于γ34.5编码的蛋白抑制了双链RNA依赖性激酶(PKR)。如通常在病毒感染中所见到的，当暴露于双链RNA分子，PKR磷酸化延伸起始因子eIF-2的α亚基，从而导致抑制蛋白合成(Chou，J.等，Science 250：1262-1266(1990)；Chou，J.和Roizman，B.，Proc.Natl.Acad.Sci USA 89：3266-3270(1992)；Chou，J.，等，J.Virol.68：8304-8311(1994))。用不能表达γ34.5的突变体感染神经元起源的细胞导致细胞蛋白合成的关闭，从而导致病毒产生的限制。
总之，在存在γ34.5的情况下，HSV将防止细胞凋亡，因而允许产生子代病毒。在不存在的情况下，细胞死亡，感染的HSV不能生成子代病毒。因此，整个器官的HSV感染/传播被消除。
因此，本发明的nestin启动子/γ34.5的方法允许病毒在能够使用该启动子的细胞中产生，而不会传播感染不能开启该启动子的细胞。
本发明的疱疹病毒突变体包含γ34.5基因的两个拷贝的缺失或失活突变，其中，将在细胞特异性启动子或肿瘤特异性启动子的控制下的γ34.5基因的至少一个拷贝重新引入。
本文所用的术语“缺失”旨在表示从基因(例如γ34.5基因)中去除核酸。
本文所用的术语“失活突变”旨在广义地表示其中使该基因的表达显著降低、或者其中使基因产物无功能、或者使其发挥功能的能力显著降低的基因的突变或改变。
除非另有说明，术语“基因”涵盖编码基因产物的区域以及该基因的调控区域(如启动子或增强子)。
实现此类改变的方法包括：(a)破坏基因产物的表达的任何方法，或(b)使表达的基因无功能的任何方法。破坏基因表达的许多方法是已知的，包括通过插入、缺失和/或碱基变化来改变基因的编码区或其启动子序列(参见Roizman，B.和Jenkins，F.J.，Science229：1208-1214(1985))。
我们已经生成了改良的溶瘤性rQNestin34.5 HSV病毒，将第二代病毒称为rQNestin34.5v.2。通过以下操作制作具有胶质瘤选择性的遗传修饰的HSV1rQNestin34.5v.2：1)将编码病毒蛋白(ICP6)的病毒基因之一移除。没有这个基因，HSV1不得不利用所感染的细胞内的因子来有效地生长和复制，我们已经证明此类因子存在于有丝分裂活跃的细胞或在细胞基因(p16)(其在大多数胶质瘤中丢失)中具有缺陷的细胞；以及2)还将编码用于在感染细胞中的稳健的病毒生长所需的蛋白(ICP34.5)的病毒基因的两个拷贝移除，并将在Nestin启动子(也选择性地存在于成人脑的胶质瘤中)的控制之下的一个拷贝重新插入。因此，这两个操作允许这种新的HSV1(命名为rQNestin34.5v.2)在破坏胶质瘤而不是正常的脑细胞方面具有相对选择性，并且我们已经在培养的细胞和动物模型中证实了这些说法。另外，缺乏第一代rQNestin34.5中存在的ICP6-EGFP融合蛋白(Kambara等，An oncolytic HSV-1mutant expression ICP34.5under control of a Nestin promoterincreases survival of animals even when symptomatic from a brain tumor，(2005)Cancer Res.65(7)：2832-2839)，进一步移除了基因组不稳定性和毒性的来源。
因此，本文提供了肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体，所述溶瘤性疱疹病毒载体包含：a)编码γ34.5的基因的两个拷贝的缺失或失活突变；b)在Nestin启动子的转录控制下的HSV γ34.5基因的至少一个拷贝的插入；以及c)编码HSV病毒蛋白ICP6的基因的缺失或失活突变，其中，所述肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体不表达绿色荧光蛋白(例如，第一代HSV-1载体rQNestin34.5中存在的ICP6-EGFP融合蛋白)。
在某些实施方式中，该载体不含有UL39核酸调控序列(启动子元件和增强子元件)。在某些实施方式中，该载体不含有ICP6的融合蛋白。
在一个实施方式中，将在nestin启动子的转录控制下的γ34.5基因的至少一个拷贝插入到UL39基因(编码核糖核苷酸还原酶ICP6(感染细胞蛋白6)的大亚基)中。在一个实施方式中，nestin启动子包含SEQ ID NO：2或其简并变体。在一个实施方式中，使用包含nestin启动子和热休克蛋白68启动子的元件的杂合启动子(参见Kambara等，An oncolyticHSV-1 mutant expression ICP34.5under control of a Nestin promoter increasessurvival of Animals even when symptomatic from a brain tumor，(2005)CancerRes.65(7)：2832-2839；以及Kawaguchi等，Nestin EGFP transgenic mice，visualizationof the self-renewal and multipotentcy of CNS stem cells Mol.Cell Neurosci.(2001)17：259-273，以引用的方式将它们整体并入)。
在一个实施方式中，该肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体包含SEQ ID NO：1的序列或其简并变体。
本领域技术人员将容易理解，也可使用本文公开的序列的修饰版本，只要它保持类似的生物学活性。仅通过非限制性实例的方式，当设计本文考虑的各种构建体时，可单独使用或联合使用SEQ ID NO：4中所示的nestin第二内含子的序列(增强子)和SEQ ID NO：5中所示的hsp68最小启动子。在一些实施方式中，可将nestin增强子元件可操作地连接至热休克蛋白68(hsp68)最小启动子以驱动γ34.5的表达。在一些实施方式中，可替代的或另外的表达控制序列可被并入溶瘤性表达载体中以启动或影响上述目的核苷酸序列中任一种的表达。仅通过非限制性实例的方式，nestin启动子可并入微小RNA靶序列。miR翻译控制序列的实例包括但不限于：将胶质瘤细胞与正常神经细胞区别开的miR128或miR124。
在各种实施方式中，本发明提供了用于治疗受试者中的瘤性疾病(neoplasticdisease)的方法。在某些实施方式中，所述方法包括给予受试者治疗有效量的具有溶瘤活性的表达载体。在一些实施方式中，癌症为脑癌。仅通过非限制性实例的方式，可治疗的脑癌的类型可包括：胶质母细胞瘤、间变性星形细胞瘤、星形细胞瘤、毛细胞型星形细胞瘤、扩散型内因性脑桥神经胶质瘤(diffuse intrinsic pontine glioma)、少突胶质细胞瘤、间变性少突胶质细胞瘤、混合性少枝星形细胞瘤(mixed oligo-astrocytoma)以及室管膜瘤(pendymoma)。在一些实施方式中，用本发明的方法治疗癌症干细胞。在一些实施方式中，所治疗的受试者是哺乳动物。在某些实施方式中，所治疗的受试者是人。
治疗本文所述的任意瘤性疾病(包括脑癌)的方法可包括将示例性实施方式的化合物作为单一活性试剂给予，或者将示例性实施方式的化合物与另外的治疗方法联合给予，所述治疗方法包括但不限于：基于干细胞的疗法、免疫疗法、放射疗法、使用免疫抑制剂的疗法、化学疗法或抗增殖剂(包括细胞因子)。本发明的治疗方法可与另外的治疗方法平行、在之前或在之后进行。
本文所用的“治疗益处”包括癌细胞数目、癌细胞增殖速率或转移灶(metastasis)方面的任何降低。在一些实施方式中，与正常细胞相比，本文使用的启动子有助于在一种或多种目的癌细胞类型中目的相关基因的选择性表达或者表达增加。
本文所用的术语“可操作地连接(operably linked)”是指将各种核酸分子元件相对于彼此进行排列，以使得这些元件在功能上相连接并且能够彼此相互作用。此类元件可不受限地包括：启动子、增强子、聚腺苷酸化序列、一个或多个内含子和/或外显子、以及待表达的目的基因的编码序列。当可操作地连接时，核酸序列元件可一起起作用来调节彼此的活性，并最终可影响目的基因(包括由上述序列编码的那些基因中的任一种)的表达水平。
本领域技术人员将理解，尽管本文提供了具体的序列，但是在本发明的载体、组合物和方法中使用的核酸分子并不严格地限制于包含如下中所给出的序列的分子：SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7以及SEQ ID NO：8。更准确地说，具体的实施方式涵盖了携带修饰(例如置换、小缺失、插入或倒置)的核酸分子。本发明中包括核酸分子，其核苷酸序列与序列表中的SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7以及SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列具有至少95％的一致性(例如至少96％、97％、98％或99％一致性)。
本发明还包括具有本文公开的核酸(例如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7以及SEQ ID NO：8)的简并变体的核苷酸序列的核酸分子。三个核苷酸的序贯组(即“密码子”)编码一个氨基酸。因为有64个可能的密码子，但只有20种天然氨基酸，大多数氨基酸由多于一个的密码子编码。遗传密码的这种天然的“简并性(degeneracy)”或“冗余(redundancy)”在本领域是众所周知的。因此将理解的是，序列表中所示的核酸序列知识提供了将编码如上所述的多肽的、较大的但有限的核酸序列组内的一个实例。
重要地是，本文所述的实施方式的载体可用于在基因疗法中引入另外的基因。因此，例如，本发明的HSV载体可含有一种以上另外的外源基因或者任何其它的抗肿瘤基因(例如，毒素)，所述外源基因用于表达在调节细胞周期中有效的蛋白(如p53、Rb或核分裂激素(mitosin)或它们的生物活性变体)；或者用于表达在诱导细胞死亡中有效的蛋白(例如条件自杀基因(suicide gene)胸苷激酶(thymidine kinase)，为了有效后者必须与胸苷激酶代谢物联合使用)。
当在药学上使用时，本文所讨论的溶瘤性载体的实施方式可与各种药学上可接受的运载体组合。合适的药学上可接受的运载体是本领域技术人员所熟知的。然后，可将组合物以有效量进行治疗性或预防性给予，以下进行更详细的描述。
本文所用的术语“治疗有效量”旨在表示发挥溶瘤活性的载体的量，所述溶瘤活性引起减弱或抑制肿瘤细胞的增殖，从而导致肿瘤消退。取决于待治疗的病理学或病症，有效量将随着患者及其状态以及本领域技术人员熟知的其它因素而改变。有效量容易被本领域技术人员所确定。在一些实施方式中，治疗性范围为一次引入的103-1012噬斑形成单位。在一些实施方式中，每隔一天至每隔一个月通过瘤内途径、鞘内途径、对流增强(convection-enhanced)途径、静脉内途径或动脉内途径给予上述治疗性范围内的治疗剂量。
尽管在前面的描述中提供了某些给予途径，根据本发明，可适用任何合适的载体给予途径，因此上述给予途径并不意图构成限制。给予途径可包括但不限于：经静脉内、经口服、经口腔、经鼻内、吸入、对粘膜的局部应用或注射(包括瘤内注射、真皮内注射、鞘内注射、脑池内注射、病灶内注射或任何其它类型的注射)。给予可连续地或间歇地进行，将随着待治疗的受试者和病症而变化。本领域技术人员将容易理解，本文所述的各种给予途径将允许本发明的载体或组合物被递送至肿瘤或靶癌细胞之上、之内或与其接近。本领域技术人员也将容易理解，本文所述的各种给予途径将允许本文所述的载体和组合物被递送至待治疗的肿瘤或个体细胞附近的区域。“附近(In the vicinity)”可包括受试者中的任何组织或体液，所述组织或体液足够紧密地接近肿瘤或个体癌细胞，使得向受试者给予的载体或组合物的至少一部分到达其预期的靶标并发挥其治疗效果。
药学上可接受的运载体是本领域中所公知的，包括水性溶液(例如生理缓冲盐水)或其它溶剂或溶媒(例如乙二醇、甘油、植物油(例如橄榄油)或可注射的有机酯)。药学上可接受的运载体可被用来将本发明的组合物在体外给予细胞或体内给予受试者。药学上可接受的运载体可含有生理学上可接受的化合物，所述化合物用来例如稳定组合物或增加试剂吸收的作用。生理学上可接受的化合物可包括例如碳水化合物(如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖)、抗氧化剂(如抗坏血酸或谷胱甘肽)、螯合剂、低分子量蛋白质或其它稳定剂或赋形剂。其它生理学上可接受的化合物包括润湿剂、乳化剂、分散剂或防腐剂(对于防止微生物的生长或作用特别有用)。各种防腐剂是众所周知的，包括例如苯酚和抗坏血酸。本领域的技术人员知道，药学上可接受的运载体(包括生理学上可接受的化合物)的选择取决于例如多肽的给予途径。
本文所述的技术的一些实施方式可根据以下编号的段落中的任一段来限定：
段落1.一种肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体，所述肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体包含：
(a)编码γ34.5的基因的两个拷贝的缺失或失活突变；和
(b)在nestin启动子的转录控制下的HSV γ34.5基因的至少一个拷贝的插入；以及
(c)编码HSV病毒蛋白ICP6的基因的缺失或失活突变，
其中，所述肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体不表达绿色荧光蛋白。
段落2.如段落1所述的肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体，其中，所述载体不含有UL39核酸调控序列。
段落3.如段落1或2所述的肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体，其中，所述载体不含有ICP6的融合蛋白。
段落4.如段落1-3中任一项所述的肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体，其中，将所述在nestin启动子的转录控制下的γ34.5基因的至少一个拷贝插入到UL39基因中，所述UL39基因编码核糖核苷酸还原酶ICP6的大亚基。
段落5.如段落1-4中任一项所述的溶瘤性表达载体，其中，所述nestin启动子包含SEQ ID NO：2或其简并变体。
段落6.如段落1所述的肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体，其中，所述载体包含SEQ ID NO：1的序列或其简并变体。
段落7.用于在受试者中选择性杀伤颅内肿瘤细胞的方法，所述方法包括将段落1-6中任一项所述的肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体导入附近。
段落8.如段落7所述的方法，所述方法进一步包括给予环磷酰胺(CPA)。
段落9.如段落7或8所述的方法，其中，在所述溶瘤性疱疹病毒载体前两天给予所述CPA。
段落10.如段落7-9中任一项所述的方法，其中，所述肿瘤细胞包括胶质母细胞瘤细胞。
段落11.如段落7-10中任一项所述的方法，其中，所述肿瘤细胞包括癌症干细胞。
段落12.如段落7-11中任一项所述的方法，其中，所述受试者为哺乳动物。
段落13.如段落7-12中任一项所述的方法，其中，所述受试者为人。
段落14.用于在受试者中治疗颅内肿瘤细胞的肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体，所述肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体包含：
(d)编码γ34.5的基因的两个拷贝的缺失或失活突变；和
(e)在nestin启动子的转录控制下的HSV γ34.5基因的至少一个拷贝的插入；以及
(f)编码HSV病毒蛋白ICP6的基因的缺失或失活突变，
其中，所述肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体不表达绿色荧光蛋白。
段落15.如段落14所述的肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体，其中，所述载体不含有UL39核酸调控序列。
段落16.如段落14或15所述的肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体，其中，所述载体不含有ICP6的融合蛋白。
段落17.如段落14-16中任一项所述的肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体，其中，将所述在nestin启动子的转录控制下的γ34.5基因的至少一个拷贝插入到UL39基因中，所述UL39基因编码核糖核苷酸还原酶ICP6的大亚基。
段落18.如段落14-17中任一项所述的溶瘤性表达载体，其中，所述nestin启动子包含SEQ ID NO：2或其简并变体。
段落19.如段落14-18中任一项所述的肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体，其中，所述载体包含SEQ ID NO：1的序列或其简并变体。
段落20.如段落14-19中任一项所述的肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体，其中，所述肿瘤细胞包括胶质母细胞瘤细胞。
段落21.如段落14-20中任一项所述的肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体，其中，所述肿瘤细胞包括癌症干细胞。
段落22.如段落14-21中任一项所述的肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体，其中，所述受试者为哺乳动物。
段落23.如段落14-22中任一项所述的肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体，其中，所述受试者为人。
段落24.如段落1-23中任一项所述的肿瘤选择性病毒，其中，所述载体不包括SEQID NO：7。
段落25.如段落1-23中任一项所述的肿瘤选择性病毒，其中，所述载体不包括SEQID NO：8。
段落26.如段落14-18中任一项所述的肿瘤选择性病毒用于在受试者中选择性杀伤颅内肿瘤细胞的用途。
段落27.如段落26所述的用途，其中，将环磷酰胺(CPA)给予所述受试者。
段落28.如段落26或27所述的用途，其中，在所述溶瘤性疱疹病毒载体前两天给予所述CPA。
段落29.如段落26-28中任一项所述的用途，其中，所述肿瘤细胞包括胶质母细胞瘤细胞。
段落30.如段落26-29中任一项所述的用途，其中，所述肿瘤细胞包括癌症干细胞。
段落31.如段落26-30中任一项所述的用途，其中，所述受试者为哺乳动物。
段落32.如段落26-31中任一项所述的用途，其中，所述受试者为人。
段落33.肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体，所述肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体基本上由SEQ ID NO：1组成。
实施例
包括以下实施例来说明本发明的优选实施方式。本领域技术人员应当理解，以下实施例中公开的技术代表发明人发现的在本发明实施中良好地起作用的技术，因此可认为其构成了本发明实施的优选模式。然而，根据本公开，本领域技术人员应当理解，可在不偏离本发明的概念、精神和范围的情况下，对所披露的特定实施方式进行许多改变，且仍然获得相似或类似的结果。更具体地而言，显而易见，化学上相关和生理上相关的某些试剂可替换本文所述的试剂，同时将实现相同或类似的结果。对本领域技术人员来说显而易见的是，所有这些类似的替换和修改被认为落入由所附的权利要求书限定的本发明的精神、范围和概念中。
实施例1 rQNestin34.5v.2的产生
rQNestin34.5v.2是遗传工程化的HSV1(F毒株的衍生物)，被设计为在胶质瘤细胞中复制而不在脑或其它组织中的正常细胞中复制。HSV1主要以在三叉神经节的感觉神经元内的潜伏形式地方性地存在于人群中。该病毒大约为152kb-158千碱基，其被包裹，测量直径为150nm。该病毒将感染如果不是全部也是大多数的建立的人胶质瘤细胞系以及来自患者的新建立的胶质瘤(在富含“干细胞样”胶质瘤亚群的条件下扩大的)并复制。对HSV1 F毒株(例如，可从OriGene Technologies Inc.Rockville，MD 20850 U.S商购获得)进行如下遗传修饰来生成rQNestin34.5v.2：
1-将编码ICP34.5的病毒基因的编码区的2个内源拷贝大部分移除；
2-将ICP34.5编码区的单个拷贝置于胶质瘤选择性的nestin启动子/增强子序列的控制下，提供ICP34.5病毒基因的胶质瘤选择性表达，从而允许相比于不表达nestin的脑细胞，在表达nestin的胶质瘤中更稳健的病毒复制；
3-同时破坏病毒ICP6基因的基因座，从而将病毒复制限制在具有缺陷的p16肿瘤抑制因子途径信号传导的胶质瘤细胞(＞90％的胶质瘤)或有丝分裂细胞中。
rQNestin34.5v.2的示意图示于图1中。在感染的细胞中，病毒DNA仍然是染色体外的。一旦进入肿瘤细胞，病毒将进入裂解周期，通常在12h-18h内导致肿瘤细胞裂解。潜伏只发生在三叉神经的感觉神经元中。
在犹他大学的Huntsman癌症研究所的微阵列核心设施的Illumina GA IIe机器上对rQNestin34.5 v.2的DNA进行下一代测序，序列在SEQ ID NO：1中提供。
nestin-hsp68最小增强子/启动子序列源自于融合在一起的人nestin增强子/启动子和人hsp68启动子，以提供对表达nestin的细胞的特异性转录调控。在rQNestin的环境中ICP34.5的特异性转录调控在下面的一组实验中示出(注意：在感染的细胞中ICP34.5的表达导致翻译因子eIF2α的去磷酸化。因此，我们预期在病毒感染后，在表达nestin的胶质瘤细胞中将观察到去磷酸化的eIF2α，而在不表达nestin的细胞(HUVEC和人星形胶质细胞)应具有高水平的磷酸化eIF2α)。
用rQNestin34.5v.2或另一rQNestin34.5(v.1-表达GFP)感染几种建立的胶质瘤细胞系(U87dEGFR、U251、U138和Gli36dEGFR)、新移植的胶质瘤细胞(在富含胶质瘤“干细胞样”细胞亚群的条件下生长的)(GBM#02)、正常人静脉内皮细胞(HUVEC)以及正常人星形胶质细胞(图2)。另外，还使用了rHSVQ1(rQ1)(ICP34.5缺失突变体)(参见例如，US20020110543和Hirokazu Kambara等，An Oncolytic HSV-1Mutant ExpressingICP34.5under Control of a Nestin Promoter Increases Survival of Animals evenwhen Symptomatic from a Brain Tumor.Cancer Res，2005年4月1日，65；2832)、野生型F毒株病毒以及未感染的细胞。分离细胞裂解物，然后进行关于eIF2α与磷酸化eIF2α的蛋白质印迹。在正常HUVEC细胞和星形胶质细胞中，如所预期的，磷酸化-eIF2α存在于rQNestin34.5、rQNestin34.5v.2和rHSVQ1病毒感染的细胞，这表明它们作为ICP34.5突变体而起作用；而在野生型F毒株感染的细胞中没有观察到磷酸化eIF2α。然而，在所有胶质瘤细胞中，在rQNestin34.5或rQNestin34.5v.2感染的细胞中没有检测到磷酸化eIF2α(与野生型F毒株类似)，而在rHSVQ1感染的细胞中仍然可见磷酸化eIF2α。因此，该数据表明在正常细胞(HUVEC和星形胶质细胞)中，rQNestin34.5v.2作为ICP34.5缺陷型病毒发挥作用，这不同于野生型病毒。然而，在胶质瘤细胞中，rQNestin34.5v.2作为ICP34.5阳性病毒发挥作用(类似于野生型病毒)。从定量上来讲，与对照rHSVQ1病毒相比，感染有rQNestin34.5v.2和亲代rQNestin34.5的胶质瘤细胞中的磷酸化eIF2α的水平明显下降＞2倍。而且，rQNestin34.5v.2和亲代rQNestin34.5感染的胶质瘤细胞中观察的磷酸化eIF2α的水平比相同细胞中未磷酸化的eIF2α蛋白低＞2倍。
在第一系列的步骤中，我们必须修饰fHSVQuik-1，含有具有二倍体ICP34.5基因缺失的F毒株HSV1序列的细菌人工染色体(BAC)。fHSVQ1的产生描述于Terada等中(Terada等，Development of a rapid method to generate multiple oncolytic HSV vectors andtheir in vivo evaluation using synergenic mouse tumor models.Gene Ther.13：705-714，2006)。图3示出了，移除在ICP6启动子的控制下的EGFP的整体序列的fHSVQuik-1的修饰通过以下完成：在移除ICP6启动子-EGFP转录盒的位点进行GmR选择标记的ET克隆，随后进行FLP重组并去删选择标记，从而生成fHSVQuik-2。然后，为了将Nestin/hsp68启动子/增强子-ICP34.5盒转移进fHSVQuik-2中，使用Flp-重组将带有该盒(由X标记)的转移质粒(transfer plasmid)重组到相同的位点，以生成fHsvQ2-X。当X为Nestin/hsp68启动子/增强子-ICP34.5盒时，将其命名为fHSVQ2-nestin34.5(参见图4)。
在细菌中生成fHSVQ2-nestin34.5后，对全部BAC进行纯化，并电穿孔至哺乳动物Vero细胞中，其中，利用Cre-Lox重组移除所有BAC序列(图4)。现在，病毒基因组“自由地”开始它自己的DNA复制过程，从而产生病毒空斑(plaque)，可对所述病毒空斑进行纯化来生成rQNestin34.5v.2。通过Southern印迹(Southern blotting)，所生成的rQNestin34.5v.2被鉴定为具有所期待的遗传同一性(genetic identity)(数据未显示)。然后，将rQNestin34.5v.2的分离株送至Diamyd，Inc.，它们进行了病毒DNA分离，并转染至其认证的Vero来源的主细胞库(MCB)中，随后进行扩大，从而获得用于后续的疗效/毒性实验的rQNestin34.5v.2的最终种子。对该病毒种子储备(Viral Seed Stock，VSS)进行一组验证分析，以使得后续的cGMP程序能够向用于临床试验的载体的大规模制造发展。在经验证的GLP条件下进行VSS测试，包括：无菌(包括抑细菌和抑真菌(B&F)浸渍)，支原体(Mycoplasma)(考虑的点)，内毒素，基于聚合酶链式反应(PCR)的反转录(PBRT)分析，以及用于以下外来试剂的定量PCR(QPCR)测试：猪环状病毒1和猪环状病毒2；腺病毒5型；腺相关病毒1型、腺相关病毒2型、腺相关病毒3型、腺相关病毒4型、腺相关病毒6型、腺相关病毒7型、腺相关病毒8型、腺相关病毒9型、腺相关病毒10型和腺相关病毒11型。该测试组的结果经官方文件证明了对于制造的进步具有适用性。
病毒生产
细胞解冻和扩大。在37℃下将Vero D主细胞库的一个或多个小瓶解冻，将细胞转移到锥形管中并合并。将细胞以1.2×107个细胞/mL/管装入小瓶中，有活力的恢复(viablerecoveries)为～9.2×106个细胞/管。用完全培养基逐渐稀释细胞，取出样品以获得活细胞计数。将细胞以3.0×104-5.0×104个细胞/cm2的密度铺在烧瓶中。
在37℃、7.5％CO2下孵育细胞，并通过相差显微镜定期检查生长和微生物污染的可视证据。当细胞达到80％汇合时，将细胞传代。简而言之，移除完全培养基并加入PBS以漂洗细胞。移除PBS，向烧瓶中添加TryPLE Select以使细胞分离。在37℃下将烧瓶孵育大约3min-5min或者直到细胞分开。将细胞重悬于完全培养基中，合并，计数并以2.0×104-4.0×104个细胞/cm2的密度播种至新的烧瓶中。将细胞扩大到16×10层的Nunc细胞工厂，并在感染前使其达到汇合后1-2天。
用rQNestin34.5v.2载体感染。当细胞达到所需的汇合时，用TryPLESelect处理实例烧瓶并计数以估计细胞的数目。通过解冻所需的适当体积来制备rQNestin34.5v.2主病毒库(Master Virus Bank)载体接种物，以获得MOI＝0.1。通过初始的1.5h吸附期对细胞工厂进行感染，随后在完全培养基中孵育感染的第一天。～24h后，移除培养基，并用等体积的无血清培养基进行置换。将细胞工厂放置在培养箱中，并将温度降至33℃/7.5％CO2。每天监测培养物并可视地检查细胞病变效应的百分比。感染通常持续4天。
粗病毒(Crude Viral)的获取和净化。通过将细胞工厂置于生物安全柜中，并将上清液和细胞碎片合并到无菌袋中来停止感染。通过添加5M NaCl储备溶液将用于收获物(harvest)的氯化钠水平提供至0.45M。然后，用手将收获物混合20-30分钟。然后，将收获物等分到500mL离心管中，通过在1500×g下离心移除细胞碎片。将上清液再合并到无菌袋中。用无菌水预处理Sartopore净化过滤器胶囊(Sartopore clarification filter capsule)后，然后将含有病毒的上清液经由过滤器胶囊泵入另一无菌袋中。在病毒后面泵入无菌水，以回收胶囊中剩余的病毒。将袋子混合，并将滤液在4℃下储存过夜。
第二天，使滤液变暖并通过添加2体积的处于无菌水中的3mM MgCl2将其调整至～2mM MgCl2。将稀释的滤液混合，接着进行Benzonase处理。Benzonase处理通过以下进行：首先将100,000U-200,000U酶稀释到稀释缓冲液中，在35分钟的时期内以5分钟的间隔注入7次连续的添加物，同时持续混合。
阳离子交换柱色谱。BPG100柱装填有SP高性能树脂，用0.5N NaOH进行消毒。消毒后，在加载benzonase处理的病毒前，用洗涤缓冲液(PBS，pH 7.0)、再生缓冲液(stripbuffer)(1M NaCl-PBS，pH 7.0)和洗涤缓冲液平衡柱。在运行过程中监测传导率(conductivity)、UV和pH。
使用管式焊接机将装有Benzonase处理的滤液的处理袋连接至入口，并将病毒加载到柱上。在无菌袋中收集穿透流(flow through)。进行病毒收获步骤，然后用pH 7.0的PBS洗涤，直到UV吸光度返回到基线。使泵停止，将装有0.45M NaCl-PBS(pH 7.0)的处理袋连接到入口处。将出口管线转移到生物安全柜中的无菌容器。将缓冲液泵入柱中，当UV吸光度开始急剧增加时，将柱出口转移至新的无菌容器以收集洗脱的病毒。UV吸光度返回接近基线后停止收集。即为纯化的病毒洗脱级分。接着，将装有再生缓冲液的处理袋连接到入口处。将出口管线的末端转移到无菌瓶中以收集再生级分。泵送缓冲液穿过柱，直到UV吸光度达到峰值并返回接近基线。洗脱液在4℃下储存过夜。
切向流过滤(Tangential Flow Filtration)和最终过滤。切向流过滤系统通过组装管线和筒(cartridge)并通过高压灭菌对系统进行灭菌而制备。将系统转移到生物安全柜中并用无菌的PBS(pH 7.0)进行冲洗。将等体积的无菌的PBS(pH 7.0)和0.45M病毒洗脱级分加入到系统储存器(reservoir)中，并被再循环5min-10min。平衡后，打开渗透物(permeate)收集泵，以～5mL/分钟收集滤液。运行系统直到加载的体积减半。用pH 7.0的PBS稀释储存器中的滞留物(retentate)以使体积加倍，并继续进行再浓缩。重复该过程，同时监测渗透物的传导率。当渗透物的传导率在10％的渗滤缓冲液(PBS，pH7.0)以内时，使产物浓缩至约40mL。回收滞留物，并通过0.45um Millipack过滤单元进行过滤。
最终的制剂和包装。用无菌甘油将最终过滤的病毒原种调整到终体积的10％并充分混合。以每瓶110uL的量将产物手动分装到冷冻管(cryovials)中进行储存。对管进行标记并储存在≤-65℃。
实施例2临床前研究
进行了三组一般性实验。首先，将利用胶质瘤细胞系和正常人细胞(特别是人星形胶质细胞)的体外研究用作模型来说明针对前者而非后者的rQNestin34.5复制和细胞毒性的相对选择性。其次，将颅内人胶质瘤异种移植物的小鼠无胸腺模型用来说明rQNestin34.5v.2的单次瘤内注射导致动物存活的显著延长。由于在C57/B6小鼠中生长的同种同基因(syngeneic)的小鼠胶质瘤中缺乏病毒的复制，免疫活性动物模型中的适合的功效实验是不可能的。最后，在脑部易感HSV的Balb/c小鼠中进行颅内注射试剂以确定毒性的程度。
我们首先确定rQNestin34.5v.2在人胶质瘤细胞和正常人星形胶质细胞中是否有效地复制。前者表达nestin而后者不表达(数据未显示)。图2示出了在rQNestin34.5感染的胶质瘤细胞中ICP34.5的nestin启动子活化导致翻译因子eIF2α的去磷酸化，从而允许感染的细胞中病毒mRNA的有效翻译(类似于野生型F毒株)；而ICP34.5缺失HSV1(如Q1(又名rQ1、rHSVQ1))无法做到这一点。因此，预期在人胶质瘤细胞中rQNestin34.5v.2稳健复制，类似于F毒株；而Q1应该很少复制。图5证实了这一点。相反，在不表达nestin的正常人星形胶质细胞(脑中的主要细胞群，其祖细胞被认为产生胶质瘤)中，rQNestin34.5v.2将不使eIF2α去磷酸，从而导致病毒复制少到没有，这类似于其它的ICP34.5缺失HSV1(如Q1)(图5)。不过野生型F毒株HSV1仍然复制。事实上，如图4所示，相比在人星形胶质细胞中的产量(其中它接近几乎没有获得的病毒)，rQNestin34.5v.2的产量在U87dEGFR中多至少4log单位，在U251中多至少5log单位。然后，我们测试了rQNestin34.5v.2对一组人胶质瘤细胞和正常人细胞的细胞毒性。将rQNestin34.5v.2添加到一组胶质瘤细胞和正常人类细胞以及小鼠细胞中，至MOI为0.1(图6)。5天后，对存活的细胞进行计数。在这一时间点，有＜或＝20％的胶质瘤细胞活着，＞或＝80％的正常细胞活着。因此，这些实验的总和确定了针对人脑胶质瘤与正常细胞的rQNestin34.5v.2复制和毒性的相对选择性。
然后，我们采用在无胸腺小鼠中生长的人胶质瘤的原位模型(orthotopicmodel)。为此，我们利用人U87dEGFR胶质瘤细胞，所述人U87dEGFR胶质瘤细胞通常在脑内接种几天后建立，并通过3-4周导致动物死亡。在第一次实验中，在瘤细胞肿注射后7天接种rQNestin34.5v.2(图7A)，而第二次在14天后注射病毒，同时动物由于肿瘤的生长而出现症状(图7B)。在这两种情况下，以3×105pfu的剂量注射病毒。在二者中，小鼠的存活均显著增加，这表明rQNestin34.5v.2在该小鼠模型中是有效的抗胶质瘤试剂。
最后，我们通过直接脑内接种到Balb/c小鼠(对HSV诱导的脑炎/脑膜炎相对敏感)的脑中来测试rQNestin34.5v.2的相对安全性。
图8中的表1总结了目前为止使用Balb/c小鼠的所有实验结果。在8周龄或6月龄的小鼠中107pfu的脑内注射被良好地耐受(32/33，在注射后第3天因不明原因有一例死亡)。相反，F毒株在注射后6天、6天、7天、8天和12天在5只/动物中引起死亡。以107pfu的剂量鞘内注射、肝内注射和静脉内注射rQNetsin34.5v.2也被良好地耐受，没有死亡，尽管通过这些途径，F毒株也没有引起死亡。
因此，这些实验的总和说明，相对于正常细胞(包括星形胶质细胞)，rQNestin34.5v.2对人胶质瘤细胞是选择性毒性的，这导致在3×105pfu的剂量下胶质瘤动物模型的存活延长，而且以107pfu的剂量的颅内注射，97％的Balb/c小鼠得以存活，而以105pfu的剂量颅内注射野生型F毒株，少于30％的小鼠存活。
克隆移除GFP区域的简要描述
我们通过PCR扩增生成PCR-del-GFP-FRT-Gm-F&R DNA(SEQ ID NO：8)。然后，我们使用ET重组技术将该PCR产物与fHSVQuik-1BAC载体进行同源重组，从而导致图15的区域示意图(SEQ ID NO：7)被置换为图16的示意图(序列SEQ ID NO：8)。然后，我们将Flp-T载体转化至含有上述BAC载体的大肠杆菌(E.coli)中以移除由两个FRT位点(其中一个位于初始的fHSVQuik-1BAC载体中)包围的区域。将所获得的载体称为fHSVQuik-2。
体内复制
在来自人的新产生的5种胶质瘤干细胞(脑肿瘤起始细胞-BTIC)(G35、G68、G97、OG02、X12)中分析rQNestin34.5v.2(v2)的复制。HSVQ1(Q1)(ICP34.5缺失病毒)显示出没有复制或最少的复制。F(野生型HSV)显示出最多的复制。34C是不相关的HSV重组HSV。我们利用了无胸腺小鼠(nu/nu)，其中，可移植的人胶质瘤细胞(人U87EGFR或Gli36dEGFR)得以生长。该模型被我们和其它人广泛用来监测疗效。这些肿瘤在动物的脑中可靠地形成，导致它们在3周-4周内死亡。这些细胞在组织学上类似于人胶质瘤细胞，而且与临床上的肿瘤一样，这些肿瘤是高度血管性的。主要区别在于它们不像临床上的胶质瘤那样具有侵袭性。我们还示出了在从患有肿瘤的人中新切除的并且生长至富含胶质瘤干细胞样细胞群的胶质瘤细胞中的疗效(图9)。
注射的小鼠活了至少60天。此外，在脑内(i.c.)接种、静脉内(i.v.)接种或鞘内(i.t.)接种rQNestin34.5v.2或F(野生型)HSV1毒株后，我们在无胸腺小鼠和Balb/c小鼠中进行了生物分布研究，并通过RT-PCR来检测病毒转录本(LAT)(在病毒生命周期的裂解期和潜伏期均表达)。图10示出了在i.c.途径、i.t.途径或i.v.途径给予107pfu的rQNestin34.5v.2后60天，在Nu/nu小鼠或Balb/c小鼠的脑或三叉神经节中转录本均是不可检测的。相反，在i.c.给予103pfu F毒株之后30天和60天的时间点，在所有测试的脑和三叉神经节样品中均存在一些微弱的条带。
另外，我们对HSV的DNA聚合酶基因进行了PCR。图11示出了在rQNetsin34.5v.2之后在小鼠的脑或三叉神经节中均没有检测到该基因的拷贝，这表明缺乏活跃的病毒复制。相反，在注射F毒株之后，对DNA聚合酶有微弱的检测，这表明有一些低水平的DNA复制，特别是在脑中。
实施例3 nestin转录增强子/启动子的利用
在邻近胶质瘤的人脑中以及经处理后的人脑中的nestin表达。
在rQNestin34.5v.2的肿瘤细胞选择性的几个水平中，具有重要意义的一个，nestin转录元件由nestin-hsp最小增强子/启动子序列构成，所述序列来源于大鼠nestin基因增强子的第二内含子/增强子与小鼠hsp68启动子融合，从而提供对表达nestin的细胞(包括人细胞)的特异性转录调控。该构建体向脑中表达nestin的细胞提供病毒ICP34.5基因的选择性表达。通过在邻近胶质瘤的人脑中和治疗后的人脑中的nestin IHC，证实了在邻近恶性胶质瘤的人脑中或恶性胶质瘤治疗后的人脑中的nestin存在与否。
一名50岁以上的成年男性在俄亥俄州立大学医学中心进行了恶性胶质瘤切除手术。作为切除术的一部分，邻近肿瘤的没有大体肿瘤的脑也被切除直至侧脑室。在俄亥俄州立大学医学中心，就GFAP(图17A)的表达和Nestin(图17B-图17D)的表达，对该脑进行染色。第二名受试者也为50岁以上，并患有恶性胶质瘤(已切除)，然后经历了放射和化学疗法。他由于肿瘤以外的其它原因去世了(图18)。一抗为1∶500稀释的来自Millipore的Nestin。按照常规进行去石蜡(deparaffization)和脱水。用标准的热诱导表位修复方法(heat-induced epitope retrieval methods)暴露抗原。将载玻片浸入Target RetrievalSolution PH9(DAKO)中，进行微波直到溶液沸腾。然后，在较低的功率下进行沸腾15min。将溶液冷却约30min后，在PBS中漂洗载玻片。为了抑制内在的过氧化物酶，将载玻片浸入具有0.3％H2O2的甲醇中15分钟，然后在PBS-T中进行漂洗。在室温下封闭1小时，然后施用针对人Nestin的一抗(Millipore)1∶500在4℃下过夜。然后，施用以1∶500稀释的二抗，接着对载玻片上的切片进行DAPI染色和固定。在尸检时，脑显示出几乎没有Nestin免疫反应性。在脑或脑室下区(SVZ，其中通常存在神经干细胞))内的室管膜/室管膜下(subependyma)的细胞中没有Nestin免疫阳性。因此，该证据表明关于临床试验的目标群(患有MG的成年人)显示在脑白质(其中通常存在MG)中或者在SVZ(其中发现神经干细胞)中几乎没有nestin表达的证据。相反，发表的证据显示MG表现出高水平的广泛nestin免疫反应性。
与脑中nestin表达相关的无胸腺小鼠的研究。
为了确定在无胸腺小鼠的脑中是否存在nestin表达(因为这些小鼠是用于疗效和毒理学/生物分布研究所选择的物种)，将雄性和雌性无胸腺小鼠(6-8周龄)用试剂rQNestin34.5v.2进行脑内接种。而单独用溶媒(PBS)对小鼠的一个对照组(组1)进行脑内接种。在PBS接种后第4天，按照脑部分析的方案对小鼠实施安乐死。确定了这些小鼠中的一只的脑中是否存在nestin表达。图19示出了在侧脑室和第三脑室以及水管的内层的伸长细胞(室管膜细胞)中的nestin阳性细胞。在第四脑室的内层的细胞中也存在nestin阳性。用组2的动物(预先给予CPA随后注射PBS溶媒)进行相同的实验，以确定相同的nestin表达方式。另外，在针道(needle tract)周围的星形胶质细胞中见到了nestin表达，这表明在小鼠的反应性星形胶质细胞中nestin上调。
实施例4 rQNestin34.5v.2的体外表征
对rQNestin34.5v.2的病毒产量进行确定。将细胞(2×105)铺在6孔板中。第二天，用rQNestin34.5v.2(v2)、亲代rHSVQ1(Q1)或野生型F毒株(F)以MOI＝0.1感染细胞。感染后1小时，依次用甘氨酸盐溶液(10mM甘氨酸、137mM NaCl、24.1mM KCl、0.49mM MgCl2、0.68mMCaCl2，pH 3)和PBS洗涤细胞，以移除未附着的病毒，加入新鲜培养基。在37℃下、含有5％CO2的气氛中将细胞孵育3天。收集细胞和培养基，并用干冰/乙醇和37℃水浴进行三次冷冻/解冻循环。通过离心(35000×g，10min，4℃)使细胞碎片沉淀后，将上清液转移到新的管中，并储存在-80℃直到滴定。通过使用Vero细胞的常规空斑分析来确定每个样品的滴度。图20示出了在3种胶质瘤细胞(包括胶质瘤干细胞样细胞)中，rQnestin34.5v.2的病毒产量与rQNestin34.5的病毒产量相等；在HUVEC细胞中，优于rQNestin34.5的病毒产量。对在多个细胞系中的rQNestin34.5v.2复制潜能进行了确定。图21示出了在4种建立的胶质瘤细胞系和3种原代胶质瘤(在干细胞样条件下生长)中，rQNestin34.5v.2的复制高于ICP34.5-阴性rHSVQ1的复制，但在4种正常细胞中，rQNestin34.5v.2的复制与rHSVQ1的复制类似。总体上，F毒株的复制较高。
对rQnestin34.5v.2的细胞毒性进行了确定。将rQNestin34.5v.2添加到以下细胞中：一组胶质瘤细胞，U87ΔEGFR(U87dE)、U87、U251和OG02胶质瘤“干细胞样”细胞；以及一组正常细胞，人星形胶质细胞(HA)、人成纤维细胞(Fibro)、人平滑肌(SM)、人骨骼肌细胞(SkM)和小鼠星形胶质细胞(MA)。将细胞播种到6孔板中的完全培养基(所述完全培养基通过用于正常的原代细胞的制造商的说明书制备，用于原代胶质瘤细胞的BTSC培养基或者用于胶质瘤细胞系的补充有2％FBS的DMEM)中，并使其粘附。细胞制备后数小时，将用于正常细胞的培养基更换为基础培养基。第二天，将病毒以MOI＝0.1添加。将用UV辐射灭活的rQNestin34.5v.2作为空白(mock)对照。感染后1小时，依次用甘氨酸盐溶液(10mM甘氨酸、137mM NaCl、24.1mM KCl、0.49mM MgCl2、0.68mM CaCl2、pH 3)和PBS洗涤细胞以移除未附着的病毒，加入新鲜培养基。在37℃下、含有5％CO2的气氛中对细胞进行孵育。感染后5天，按照用Coulter计数器(Beckman Coulter)计数的存活细胞对细胞毒性进行测量。图22示出了rQnestin34.5v.2和rQnestin34.5的细胞毒性。
计划进行临床试验，所述临床试验将作为剂量递增研究进行。将对临床结果(注射后的总存活(overall survival)、注射后的无进展生存期(progession-free survival))、放射学结果(MRI上可见的肿瘤消退)以及所研究的病毒生物分布的组织分析)进行评价。该试验将以剂量递增的方式进行，以108pfu(1ml体积，多个注射部位)起始。选择这个剂量是因为107pfu看起来在小鼠脑中是安全的。由于小鼠脑重约1克，而人脑重达1500克，这在人中将转换为5×1010的安全剂量。为了进一步确保安全，在人中我们将以几乎少3logs来起始。剂量递增将以半log进行直至1010pfu。
将最大耐受剂量(maximum tolerated dose，MTD)定义为比三分之一的患者具有与给予rQNestin34.5v.2相关的3级或4级的剂量限制性毒性(dose limiting toxicity，DLT)时的剂量水平低一个半-log(half-log)量级的剂量。将在每个剂量水平以半-log增量(increments)递增的方式对同龄组的三名患者进行给药，直至达到剂量限制性毒性(DLT)。如果未达到MTD，则I期剂量将为达到的最高剂量。
DLT将包括：归因于rQNestin34.5v.2的不良事件的通用术语标准v.4.0(CTCAE)中的任何4级毒性或5级毒性，除了CTCAE v4.0的调查分类中的4级淋巴细胞、中性粒细胞、白细胞计数降低之外；归因于rQNestin34.5v.2的CTCAE v4.0的脑炎、脑脊髓炎、脑膜炎感染/侵染分类中的3级毒性；CTCAE v4.0的神经系统疾病分类中的3级毒性，所述毒性与跟治疗前的神经病学状态之间的变化相关，所述变化归因于rQNestin34.5v.2，所述变化如下：共济失调、意识水平下降、脑病、锥体束外障碍、脑积水、颅内出血、白质脑病、脊髓炎(myelitis)、锥体束综合征、嗜睡、中风；CTCAE v4.0的精神障碍分类中的3级毒性，所述毒性与跟治疗前的状态之间的变化相关，所述变化归因于rQNestin34.5v.2，所述变化如下：谵妄(delirium)、幻觉、精神病。
在下一名患者加入研究方案之前，在注射rQNestin34.5v.2后对同龄组各自的第一名患者至少观察10天。如果没有DLT，则第二名患者和第三名患者将以相同的剂量增加。基于CTCAE v.4.0，如果未达到1/3DLT，才使患者进入下一剂量水平。
对方案A(arm A)和方案B(arm B)，DLT和MTD的测定是分开的，因为在前者中大量切除了胶质瘤肿块，而后者中没有，因此可能会在不同剂量导致毒性。
上述所述的多种方法和技术提供了实施本申请的多种方式。当然，应当理解的是，根据本文所述的任何特定的实施方式，不一定能够实现所述的全部目的或优点。因此，例如，本领域技术人员将意识到，可以实现或优化本文所教导的一个优点或一组优点的方式进行所述方法，而不必实现本文所教导或建议的其它目的或优点。本文提到了各种替代。应当理解的是，一些优选实施方式具体包括一个特征、另一特征或几个特征，而另一些具体地排除一个特征、另一特征或几个特征，而还有一些通过包含一个优势特征、另一优势特征或几个优势特征来减少特定特征。
此外，本领域技术人员将意识到来自不同实施方式的各种特征的适用性。类似地，根据本文所述的原理，本领域普通技术人员可以各种组合来应用上面讨论的各种要素、特征和步骤以及各种此类要素、特征或步骤的其它已知等同物。在不同的实施方式中，各种要素、特征和步骤中的一些将被具体包括在内，而另一些则被具体排除在外。
虽然本申请在某些实施方式和实施例的背景下已经被公开了，本领域技术人员将理解的是，超出具体公开的实施方式，本申请的实施方式延伸到其它的替代实施方式和/或用途及其修改和等同物。
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如本文所用的，术语“包含/包括/含有(comprising或comprises)”用于涉及对本发明必要的组合物、方法及其各自的组成部分，并且无论是否必要，都仍然开放以包括未指定的要素。
本文所用的术语“基本上由......组成”涉及给定的实施方式所需的那些要素。该术语允许存在实质上不影响本发明的实施方式的基础和新颖性或起作用的特征的额外要素。
术语“由...组成”涉及本文所述的组合物、方法及其各自的组成部分，排除没有在实施方式的描述中详述的任何要素。
本文描述了本申请的优选实施方式，包括发明人已知的用于实施本申请的最佳实施例。在阅读前面的描述后，那些优选实施方式的改变对本领域的普通技术人员而言将变得显而易见的。可以考虑到，技术人员可适当地采用此类改变，并且可以与本文中具体描述的不同的方式来实施本申请。因此，根据适用法律所允许的，本申请的许多实施方式包括在此所附的权利要求中所引用的主题的所有修改和等同物。此外，除非本文另有说明或者明显与上下文相矛盾，本申请涵盖其所有可能的改变中的上述所述要素的任何组合。
为了所有的目的，以引用的方式将本文引用的所有专利、专利申请、公布的专利申请以及其它材料(例如文章、书籍、申请书、出版物、文献、事物和/或等)整体并入本文，除了与之相关的任何起诉档案历史记录、与本文件不一致或与本文件相冲突的任何文件、或可能对与本文相关的现在的或以后的最宽的权利要求范围具有限制性影响的任何文件。举例来说，就与任何所并入的材料相关的术语的描述、定义和/或使用与本文献相关的术语的描述、定义和/或使用之间存在任何不一致或冲突，应对本文献中的术语的描述、定义和/或使用为准。
序列表
SEQ ID NO：1 rQNestin34.5v.2序列，consensus sequence_BreakPoint_151409
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GGAATGGACAAGAAAGATCACCTCTAGCTCGGTGTTGTGTACAGTTTGTTGTGATTTGTGGGGTTTCGCCAACTCGCACAGTTCTGAATATGGGGGTTAAAGGCTAAAACTTAAGGGCTAAAACTTCTCCCCGCCAAGTTTAGGAGACCCAGGGAGATGCCTGGGGGCGTGTCCGGTGACGTGATCCTCTCCAATCGCGTTACAATGGCAGTGCTGCCTCTGACCTCATGGACTAATTTAGGAACTAGAGGCTCTGTCCCAGCACAGGCTCAAAGTTGCCGGGAGGGGCGGGGTGGGGGGTGGGGGGGACCCCGGCTGCTCAGTTTGGATGTTCCTGGAGCTCGGTACCCGCGATCGCCCCTAGAGGATCTACTAGTCATATGGATAAGCCTGGGAACCTCGTCCAGGTGTCTGCAACCGAGAGTTCTCAGCCTCCAGCAGAGTCCTGGTGGGGAGTGGGGAGATAGGGTCAGCTCCAGCTGAGGTAGCATGTCCTGCCACTGCAGGATCAATCTCTATTGTGACCATTGTCATATAAAAGCCACACAGTCATATACCCACAGATATATACTTAGCCAACCCATATTTGAGACACAGGGAGACCCCACATGCAGATTCCCACAGTCGGAGGCAGGGCCAAATGAATTGCTAACACTTATATCAGACTCCTCAGATCAGTCTCCGCCTCCCCACCCAAGGCCAAGGCCGATGACCTCATCCTCTGGGAGGGAGGCCGATTCTCATGCTAATTATTGCCTTTTGTCCACACTACCATCTGGAGGGCCTAAGAAGGGAGGGCTCCTCAGGGGAAGTGGGAATTCTCAGGCTGTTCCCAGGGGATGGCTCTCTCTCTGCCCCCAGAGCTGGTAACAGACAAAAGCAAATGAATTCAGCTCCCCTTCTCCAAATCCTTTTCAGACCTCAAACGCCAGTGGTTACATTCCTCAGAGCTGCCTGGACCCTTCCCCTCAGAGGACTGACTGGGGCTAAAGCCCTCATCTCAGGATCACAAACTCTTCAGGGATCGGATCTCGGCCCGGGCTAGCACGCGTAAGAGCTCGGTACCTATCGATAGAGAAATGTTCTGGCACCTGCACTTGCACTGGGGACAGCCTATTTTGCTAGTTTGTTTTGTTTCGTTTTGTTTTGATGGAGAGCGTATGTTAGTACTATCGATTCACACAAAAAACCAACACACAGATGTAATGAAAATAAAGATATTTTATTGCGGCGATCCGGAACCCTTAAT(SEQ ID NO：1)
SEQ ID NO：2Nestin启动子
UL39序列核糖核苷酸还原酶亚基1[人疱疹病毒1(Human herpesvius 1)]
Nestin第二内含子序列SEQ ID NO：4
hsp68：热休克蛋白68 SEQ ID NO：5
UL39的基因组序列为NC_001806.1的(nts.86217...90988)(SEQ ID NO：6)
tHSV Quik-1的del-seq(SEQ ID NO：7)
aataaagccactgaaacccgaaacgcgagtgttgtaacgtcctttgggcgggaggaagccacaaaatgca
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acccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccg
ccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaaagcggccgatcc(SEQ ID NO：7)
＞PCR-del-GFP-FRT-Gm-F&R(SEQ ID NO：8)
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tgccattctcaccggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttgacgaggg
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cgaactcacgaccgaaaagatcaagagcagcccgcatggatttgacttggtcagggccgagcctacatgt
gcgaatgatgcccatacttgagccacctaactttgttttagggcgactgccctgctgcgtaacatcgttg
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caccgctgcgttcggtcaaggttctggaccagttgcgtgagcgcatacgctacttgcattacagtttacg
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ttgggcagcagcgaagtcgaggcatttctgtcctggctggcgaacgagcgcaaggtttcggtctccacgc
atcgtcaggcattggcggccttgctgttcttctacggcaaggtgctgtgaccgccgccgggatcactctc
ggcatggacgagctgtacaagtaaagcggccgatcc(SEQ ID NO：8)
Claims (23)
1.一种肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体，所述肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体包含：
(a)编码γ34.5的基因的两个拷贝的缺失或失活突变；和
(b)在Nestin启动子的转录控制下的HSVγ34.5基因的至少一个拷贝的插入；以及
(c)编码HSV病毒蛋白ICP6的基因的缺失或失活突变，
其中，所述肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体不表达绿色荧光蛋白。
2.如权利要求1所述的肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体，其中，所述载体不含有UL39核酸调控序列。
3.如权利要求1或2所述的肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体，其中，所述载体不含有ICP6的融合蛋白。
4.如权利要求1-3中任一项所述的肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体，其中，将所述在nestin启动子的转录控制下的γ34.5基因的至少一个拷贝插入到UL39基因中，所述UL39基因编码核糖核苷酸还原酶ICP6的大亚基。
5.如权利要求1-4中任一项所述的肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体，其中，所述nestin启动子包含SEQ ID NO：2或其简并变体。
6.如权利要求1所述的肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体，其中，所述载体包含SEQ IDNO：1的序列或其简并变体。
7.用于在受试者中选择性杀伤颅内肿瘤细胞的方法，所述方法包括将权利要求1-6中任一项所述的肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体引入附近。
8.如权利要求7所述的方法，所述方法进一步包括给予环磷酰胺(CPA)。
9.如权利要求7-8中任一项所述的方法，其中，在所述溶瘤性疱疹病毒载体前两天给予所述CPA。
10.如权利要求7-9中任一项所述的方法，其中，所述肿瘤细胞包括胶质母细胞瘤细胞。
11.如权利要求7-10中任一项所述的方法，其中，所述肿瘤细胞包括癌症干细胞。
12.如权利要求7-11中任一项所述的方法，其中，所述受试者为哺乳动物。
13.如权利要求7-12中任一项所述的方法，其中，所述受试者为人。
14.用于在受试者中治疗颅内肿瘤细胞的肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体，所述肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体包含：
(a)编码γ34.5的基因的两个拷贝的缺失或失活突变；和
(b)在nestin启动子的转录控制下的HSVγ34.5基因的至少一个拷贝的插入；以及
(c)编码HSV病毒蛋白ICP6的基因的缺失或失活突变，
其中，所述肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体不表达绿色荧光蛋白。
15.如权利要求14所述的肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体，其中，所述载体不含有UL39核酸调控序列。
16.如权利要求14或15所述的肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体，其中，所述载体不含有ICP6的融合蛋白。
17.如权利要求14-16中任一项所述的肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体，其中，将所述在nestin启动子的转录控制下的γ34.5基因的至少一个拷贝插入到UL39基因中，所述UL39基因编码核糖核苷酸还原酶ICP6的大亚基。
18.如权利要求14-17中任一项所述的肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体，其中，所述nestin启动子包含SEQ ID NO：2或其简并变体。
19.如权利要求14-18中任一项所述的肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体，其中，所述载体包含SEQ ID NO：1的序列或其简并变体。
20.如权利要求14-19中任一项所述的肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体，其中，所述肿瘤细胞包括胶质母细胞瘤细胞。
21.如权利要求14-20中任一项所述的肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体，其中，所述肿瘤细胞包括癌症干细胞。
22.如权利要求14-21中任一项所述的肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体，其中，所述受试者为哺乳动物。
23.如权利要求14-22中任一项所述的肿瘤选择性的溶瘤性疱疹病毒载体，其中，所述受试者为人。
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