KR20130101048A - 수포성 구내염 바이러스 - Google Patents

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Abstract

본 출원은 수포성 구내염 바이러스에 관련된 방법 및 물질을 제공한다. 예를 들어, 수포성 구내염 바이러스, VSV 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 수포성 구내염 바이러스의 제조 방법, 및 암 치료를 위해 수포성 구내염 바이러스를 사용하는 방법이 제공된다.

Description

수포성 구내염 바이러스{VESICULAR STOMATITIS VIRUSES}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2010년 9월 2일에 출원된 미국 가출원 제61/379,644호에 대한 우선권을 주장한다. 상기 출원의 내용은 그 전체로 본원에서 참고적으로 인용된다.
연방정부 후원에 의한 연구에 대한 진술
본 발명은 국립보건연구원에 의해 부여된 승인 번호 CA129966 하에 정부 후원에 의해 이루어졌다. 정부당국은 본 발명에 대해 특정의 권리를 가진다.
기술분야
본 출원은 수포성 구내염 바이러스를 제조하고 사용하는데 수반되는 방법 및 물질에 관한 것이다. 예를 들어, 본 출원은 수포성 구내염 바이러스, 핵산 분자, 수포성 구내염 바이러스의 제조 방법, 및 암 치료를 위해 수포성 구내염 바이러스를 사용하는 방법에 관한 것이다.
수포성 구내염 바이러스(VSV)는 라브도비리데(Rhabdoviridae) 과의 멤버이다. VSV 게놈은 5개의 주요 폴리펩티드: 뉴클레오캡시드 (N) 폴리펩티드, 포스포프로테인 (P) 폴리펩티드, 매트릭스 (M) 폴리펩티드, 글리코프로테인 (G) 폴리펩티드, 및 바이러스 폴리머라제 (L) 폴리펩티드를 코딩하는 네거티브 센스 RNA의 단일 분자이다.
본 출원은 수포성 구내염 바이러스에 관련된 방법 및 물질을 제공한다. 예를 들면, 본 출원은 수포성 구내염 바이러스, VSV 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 수포성 구내염 바이러스의 제조 방법, 및 암 치료를 위해 수포성 구내염 바이러스를 사용하는 방법을 제공한다.
본원에 기재된 바와 같이, 수포성 구내염 바이러스는 VSV N 폴리펩티드, VSV P 폴리펩티드, VSV M 폴리펩티드, VSV G 폴리펩티드, VSV L 폴리펩티드, 인터페론(IFN) 폴리펩티드(예를 들면, 인간 IFN-β 폴리펩티드), 및 요오드화나트륨 심포터(symporter)(NIS) 폴리펩티드(예를 들면, 인간 NIS 폴리펩티드)를 코딩하는 핵산 분자를 가지도록 설계될 수 있다. IFN 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 VSV M 폴리펩티드를 코딩하는 핵산과 VSV G 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 사이에 위치할 수 있다. 이러한 배치는 바이러스로 하여금 비암성(non-cancerous) 조직에서 항바이러스성 고유 면역 반응을 활성화시켜 암세포에서 유효 바이러스 복제를 방해함이 없이 잠재적인 바이러스 독성을 경감시키는데 효과적인 양의 IFN 폴리펩티드를 발현하도록 할 수 있다. NIS 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 VSV G 폴리펩티드를 코딩하는 핵산과 VSV L 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 사이에 위치할 수 있다. 이러한 배치는 바이러스로 하여금 (a) 감염된 세포에서 요오드화물(iodide)의 선택적 축적을 허락하여 방사성 동위원소를 이용한 바이러스 분포의 영상분석(imaging) 및 감염된 암세포에 표적화된 방사선요법 둘다를 가능하게 하는데 효과적이면서 (b) 감염된 세포에 대해 독성이도록 하는 그러한 높은 수준이 아닌 양의 NIS 폴리펩티드를 발현하도록 할 수 있다. 수포성 구내염 바이러스의 게놈 내에서 VSV M 폴리펩티드를 코딩하는 핵산과 VSV G 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 사이에 IFN 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 배치 및 VSV G 폴리펩티드를 코딩하는 핵산과 VSV L 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 사이에 NIS 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 배치는, 생존가능하고, 복제 및 확산 능력을 가지며, 기능성 IFN 폴리펩티드를 적절한 수준으로 발현하고, 기능성 NIS 폴리펩티드를 적절한 수준으로 발현하여 영상분석 및 방사선 바이러스요법 둘다를 위한 방사성 요오드화물을 취하는 수포성 구내염 바이러스를 만들어낼 수 있다.
일부 경우에, 본 출원은 RNA 분자를 포함하는 수포성 구내염 바이러스를 특징으로 한다. RNA 분자는 3'에서 5' 방향으로, VSV N 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체(transcript)에 대한 주형인 핵산 서열, VSV P 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, VSV M 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, IFN 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, VSV G 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, NIS 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, 및 VSV L 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열을 포함하거나 또는 실질적으로 이러한 서열들로 구성된다. IFN 폴리펩티드는 인간 IFN 베타 폴리펩티드일 수 있다. NIS 폴리펩티드는 인간 NIS 폴리펩티드일 수 있다. 바이러스는 포유동물 세포에 감염되면 IFN 폴리펩티드를 발현할 수 있다. 바이러스는 포유동물 세포에 감염되면 NIS 폴리펩티드를 발현할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 RNA 분자를 포함하는 수포성 구내염 바이러스를 포함하거나 또는 실질적으로 이러한 바이러스로 구성된 조성물을 특징으로 한다. RNA 분자는 3'에서 5' 방향으로, VSV N 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, VSV P 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, VSV M 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, IFN 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, VSV G 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, NIS 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, 및 VSV L 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열을 포함하거나 또는 실질적으로 이러한 핵산 서열들로 구성된다. IFN 폴리펩티드는 인간 IFN 베타 폴리펩티드일 수 있다. NIS 폴리펩티드는 인간 NIS 폴리펩티드일 수 있다. 바이러스는 포유동물 세포에 감염되면 IFN 폴리펩티드를 발현할 수 있다. 바이러스는 포유동물 세포에 감염되면 NIS 폴리펩티드를 발현할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 3'에서 5' 방향으로, VSV N 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, VSV P 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, VSV M 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, IFN 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, VSV G 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, NIS 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, 및 VSV L 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열을 포함하거나 또는 실질적으로 이러한 핵산 서열들로 구성된 핵산 가닥을 포함하는 핵산 분자를 특징으로 한다. IFN 폴리펩티드는 인간 IFN 베타 폴리펩티드일 수 있다. NIS 폴리펩티드는 인간 NIS 폴리펩티드일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 암 치료 방법을 특징으로 한다. 본 방법은 수포성 구내염 바이러스를 포함하는 조성물을 암세포를 포함한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하거나 또는 실질적으로 이러한 단계로 구성된다. 수포성 구내염 바이러스는 3'에서 5' 방향으로, VSV N 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, VSV P 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, VSV M 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, IFN 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, VSV G 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, NIS 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, 및 VSV L 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열을 포함하거나 또는 실질적으로 이러한 핵산 서열들로 구성된 RNA 분자를 포함하고, 여기서 포유동물에 상기 조성물의 투여는 상기 수포성 구내염 바이러스가 암세포에 감염되어 감염된 암세포를 형성하는 조건하에 이루어지고, 상기 감염된 암세포는 IFN 폴리펩티드 및 NIS 폴리펩티드를 발현하며, 포유동물 내의 암세포 수는 상기 투여 후 감소된다. 포유동물은 인간일 수 있다. IFN 폴리펩티드는 인간 IFN 베타 폴리펩티드일 수 있다. NIS 폴리펩티드는 인간 NIS 폴리펩티드일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 포유동물에서 종양 퇴행(regression)을 유도하는 방법을 특징으로 한다. 본 방법은 수포성 구내염 바이러스를 포함하는 조성물을 종양을 포함한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하거나 또는 실질적으로 이러한 단계로 구성된다. 수포성 구내염 바이러스는 3'에서 5' 방향으로, VSV N 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, VSV P 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, VSV M 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, IFN 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, VSV G 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, NIS 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, 및 VSV L 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열을 포함하거나 또는 실질적으로 이러한 핵산 서열들로 구성된 RNA 분자를 포함하고, 여기서 포유동물에 상기 조성물의 투여는 상기 수포성 구내염 바이러스가 종양의 종양 세포에 감염되어 감염된 종양 세포를 형성하는 조건하에 이루어지고, 상기 감염된 종양 세포는 IFN 폴리펩티드 및 NIS 폴리펩티드를 발현한다. 포유동물은 인간일 수 있다. IFN 폴리펩티드는 인간 IFN 베타 폴리펩티드일 수 있다. NIS 폴리펩티드는 인간 NIS 폴리펩티드일 수 있다.
달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 업계의 통상의 기술을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 비록 본원에 기재된 것과 유사하거나 동일한 방법 및 재료가 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있지만, 적당한 방법 및 재료는 후술된다. 본원에서 언급된 모든 공보, 특허 출원, 특허, 및 기타 참고문헌들은 그 전문이 본원에서 참고적으로 인용된다. 상충되는 경우에, 정의를 포함한 본원 명세서가 우선할 것이다. 부가적으로, 재료, 방법 및 실시예는 단지 설명을 위한 것이며 제한적인 의도가 아니다.
본 발명의 하나 이상의 실시양태에 대한 상세한 설명은 첨부 도면 및 하기의 상세한 설명에서 제공된다. 본 발명의 다른 특성, 목적 및 이점은 상세한 설명 및 도면으로부터, 그리고 청구범위로부터 분명해질 것이다.
도 1의 A는 IFN 폴리펩티드(예를 들면, 인간 또는 마우스 IFNβ 폴리펩티드)를 코딩하는 핵산 및 NIS 폴리펩티드(예를 들면, 인간 NIS 폴리펩티드)를 코딩하는 핵산을 함유한 예시적인 수포성 구내염 바이러스의 게놈 배열에 대한 개략적인 모식도이다. 도 1의 B는 MOI 1.0으로 감염된 BHK 세포를 사용하여 측정된, 녹색 형광 단백질(GFP) 폴리펩티드(VSV-GFP; (●)), VSV-mIFN-NIS (■), 또는 VSV-hIFN-NIS(◆)를 코딩하는 핵산을 함유한 수포성 구내염 바이러스의 바이러스 역가를 작도한 그래프이다. 도 1의 C는 NIS 억제제(+inh.)인 KCLO4의 존재 또는 부재하에 VSV-mIFN-NIS 또는 VSV-hIFN-NIS로 감염된 세포의 방사성 요오드화물 흡수율을 작도한 그래프이다. VSV-GFP가 대조군으로 사용되었다. 도 1의 D는 모의(mock) 감염된 세포 또는 VSV-mIFN-NIS(VmN) 또는 VSV-hIFN-NIS(VhN)로 감염된 세포로부터 ELISA에 의해 측정한 뮤린 또는 인간 IFNβ의 분비 수준을 작도한 막대 그래프를 포함한다. 도 1의 E는 세포를 100 U/mL 뮤린 IFNβ로 12시간 동안 전처리한 다음 VSV-GFP(MOI 1.0)로 감염시켜 평가된, B-16 뮤린 흑색종 세포와 비교한 5TGM1 및 MPC-11 뮤린 골수종 세포의 IFN 반응도를 작도한 막대 그래프를 포함한다. 도 1의 F는 감염 후 48시간째 MTT 분석에 의해 평가된, 생존 세포에 대한 증식 결과를 작도한 그래프(비처리된 세포의 %로서 작도됨)를 포함한다. VSV-mIFN-NIS 또는 VSV-hIFN-NIS로 감염(MOI 1.0) 후 MTT 분석에 의해 12시간 간격으로 세포 생존력(viability)을 측정함으로써 5TGM1 및 MPC-11 종양파괴(oncolysis)를 모니터링하였다.
도 2의 A는 VSV-mIFN-NIS 또는 VSV-mIFN으로 감염된 BHK 세포로부터 48시간에 걸쳐 모니터링된 IFN 폴리펩티드 방출 수준을 작도한 그래프이다. 마우스 IFN 폴리펩티드 발현 수준을 검출하도록 설계된 ELISA를 사용하여 상등액에서 마우스 IFN 폴리펩티드 수준을 측정하였다. 도 2의 B는 주어진 시간(hr)에 VSV-mIFN-NIS 또는 VSV-mIFN으로 감염된 BHK 세포에 의한 I-125 흡수 수준을 작도한 그래프이다.
도 3은 정맥내 투여된 VSV-IFN-NIS의 종양내 확산을 모니터링한 결과를 포함한다. 피하 동계(syngeneic) 5TGM1 골수종양을 가진 6-10 주령의 암컷 C57Bl6/KaLwRij 마우스를 100 μL PBS(대조군) 또는 1x108 TCID50 VSV-mIFN-NIS의 단일 정맥내(IV) 용량으로 처리하였다. (A) 0.5 mCi Tc-99m 투여 후 24시간 간격으로 SPECT-CT 영상분석을 실시하였다. PBS 처리된 마우스(n=2) 및 VSV-mIFN-NIS 처리된 마우스(n=5)에서 종양 특이적 Tc-99m 흡수 정도를 정량하였다. (B) SPECT-CT 영상분석과 방사선자동사진법(autoradiography)에 의한 인접 종양 절편의 보조적 분석에 이어 종양을 수거함으로써 종양내 바이러스 분포를 모니터링하고 IF를 수행하였다. IF는, 24시간째 VSV 항원(적색으로 염색) 및 TUNEL 염색에 의해 사멸을 겪은 세포(녹색으로 염색)를 검출하는데 사용되었다. (C) n=3 종양(72시간째 n=2)으로부터 얻어진 4개 영상으로부터 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 종양내 VSV 및 TUNEL을 정량하고 종양 면적의 백분율로 도시하였다. 처리 후 24시간 및 48시간 사이에 VSV(+) 및 TUNEL(+) 둘 모두에 있어 t-테스트(각각 P=0.0455 및 P=0.0163) 결과 상당한 증가가 있었다.
도 4는 정맥내 전달 후 종양내 바이러스 진입, 확산 및 종양파괴에 대한 결과를 포함한다. (A) 정맥내 VSV-mIFN-NIS 투여 후 (i) 6 시간, (ii) 12 시간, (iii) 18 시간, 및 (iv-vi) 24 시간째에 5TGM1 종양을 수거하고 IF 분석하였으며 (녹색으로 염색된) VSV 감염된 세포와 CD31 염색에 의해 (적색으로 염색된) 종양 혈관을 보여준다. 배율 100x. (B) (i) VSV 감염된 종양 세포(녹색으로 염색) 및 (ii) Hoescht 염색된 핵(청색으로 염색)을 가진 세포사멸을 겪은 TUNEL 양성 세포(녹색으로 염색) 부근에서 온전한 종양 혈관(적색으로 염색)을 보여주는 처리된 종양의 고배율 도면. (C) ImageJ 소프트웨어를 사용하여 6시간 간격으로 수거된 종양으로부터 종양내 병소(focus)(n=8)를 측정하고, 시간에 따른 평균 직경을 작도하였다. t-테스트에 의해 직경 성장의 유의성을 측정하였고, 그래프의 상부를 따라 P 값이 도시되어 있다. 직경을 사용하여 시간에 따른 평균 병소 부피를 측정하였다. (D) VSV-mIFN-NIS 처리 후 48시간째 종양의 영상을 이용하여 감염된 세포의 살아있는 가장자리(viable rim)를 정량하여 세포 사멸 이전에 감염의 각 라운드에서 감염된 ~10 세포의 평균을 수득하였다.
도 5는 바이러스 분포를 모니터링하기 위한 전신 SPECT-CT 영상촬영(상부 좌측), 방사성 동위원소 흡수의 특정 영역을 보여주기 위한 종양 방사선자동사진법(상부 우측), 및 NIS 발현 영역이 종양내 VSV 염색에 상응함을 보여주기 위한 항-VSV 및 DAPI 염색(하부)이 이루어진 동일 마우스로부터 얻어진 종양에 대한 3개 영상 셋트를 포함한다.
도 6은 전신 투여된 VSV-IFN-NIS의 유력한 치료 효능을 입증하는 결과를 포함한다. 피하 5TGM1 종양을 가진 마우스를 PBS, VSV-mIFN-NIS, 또는 VSV-hIFN-NIS의 단일 정맥내 용량으로 처리하였다. (A) 연속 캘리퍼스 측정에 의해 종양 부담(Tumor burden)을 측정하여 시간에 따른 종양 부피를 계산하였다. (B) 종양 반응 정도(반응률)를 종양 진행, 퇴행, 또는 재발을 동반한 퇴행으로 분류하였다. 종양 퇴행이 있는 마우스의 비율에 따른 재발 빈도에 있어 통계적 차이를 피셔의 정확검정(Fischer Exact test)으로 측정하였으며 그 결과 VSV-mIFN-NIS 처리된 마우스에 비해 VSV-hIFN-NIS 처리된 마우스에서 상당히 높은 비율의 종양 재발이 있었다 (P=0.009). (C) 처리 후 최초 5일째 n=2 (PBS 처리) 및 n=3 (VSV-IFN-NIS 처리) 마우스의 혈청에서 VSV 중화 항체의 발생을 측정하고 이를 500 TCID50 VSV의 감염으로부터 보호하는 최소 배수 희석으로써 작도하였다.
도 7은 종양 세포의 면역 매개된 제거가 종양 재발을 방지함을 입증하는 결과를 포함한다. (A) PBS, VSV-mIFN-NIS, 또는 VSV-hIFN-NIS로 정맥내 처리된 피하 5TGM1 종양을 가진 마우스의 혈청에서 ELISA에 의해 측정된 뮤린 IFNβ의 정량화. (B) VSV-mIFN-NIS 처리에 반응하여 완전한 종양 퇴행을 나타내는 마우스 및 투약을 받은적이 없는(나이브) 해당 연령대의(age-matched) 동계 마우스(각각 n=6)에 1x107 5TGM1 세포를 피하 투여하고, 투여 후 21일까지 종양 발생율을 도시하였다. (C) 종양 이식(우측 옆구리에 5x106 피하 5TGM1 세포) 후 1일째 또는 이러한 이식 전 5일째 피하 투여된 단일 용량 VSV-감염된 5TGM1 세포(좌측 옆구리에 이식된 MOI 10의 VSV-mIFN-NIS로 감염된 1x107 5TGM1 세포)의 면역요법 효능. 로그 순위 생존 분석 비교에 따르면 (-5)일 백신처리가 백신처리되지 않은 마우스에 비해 종양 이식 후 마우스의 생존율을 연장시키는 것으로 나타났다 (P=0.0253). (D) 피하 5TGM1 종양을 가진 마우스를 (i) PBS, (ii) VSV-mIFN-NIS, 또는 (iii) CD4+ 또는 CD8+ T 세포를 고갈시키기 위한 항체의 존재 또는 부재하의 VSV-mIFN-NIS의 단일 정맥내 용량으로 처리하였다. 연속 캘리퍼스 측정에 의해 종양 부담을 측정하였다. (E) 도 7의 D에 나타낸 마우스에 대한 종양 반응 정도를 진행, 퇴행, 또는 퇴행 + 재발로 분류하였다. 피셔의 정확검정에 의해 재발율을 비교한 결과 VSV-mIFN-NIS + T-세포 고갈이 VSV-mIFN-NIS 단독 처리에 비해 보다 높은 종양 재발율을 나타내었다 (P=0.0498).
도 8a 및 8b는 종양내 감염 병소의 상세한 면역형광 영상이다. 정맥내 VSV-mIFN-NIS 주입 후 24시간째 5TGM1 종양을 수거하고, OCT에서 동결시킨 다음 절편화하였다. IF를 실시하여 VSV(적색으로 염색), TUNEL 염색에 의한 사멸중인 세포(녹색으로 염색), 및 Hoescht 염색에 의한 종양세포 핵(청색으로 염색)을 검출하였다. VSV 감염된 대략 구형의 개별 종양내 병소는 세포 사멸을 겪는 VSV 감염된 세포의 중앙 영역과, 주변부에서 감염된 세포의 살아있는 가장자리를 포함한다.
도 9는 기능성 NIS 활성이 VSV 감염된 살아있는 세포의 영역에 한정됨을 입증하는 영상을 포함한다. 정맥내 VSV-IFN-NIS 감염 후 48 시간(A) 또는 72 시간(B) 째에 5TGM1 종양을 수거하고 절편화하였다. 인접한 절편에 대해 (i) 방사선자동사진법, (ii) 20x 배율로 도시된 IF, 및 (iii) 100x 배율로 도시된 IF를 시행하여 VSV(적색으로 염색) 및 TUNEL 염색에 의한 사멸중인 세포(녹색으로 염색)를 검출하였다.
도 10은 삽입된 트랜스진을 함유한 수포성 구내염 바이러스의 예시적인 인트라제닉 영역에 대한 모식도이다. 전사시 수반되는 바이러스 개시 및 종결 서열이 트랜스진의 측면에 위치한다. IFN 핵산이 VSV M 및 G 핵산 서열 사이에 조작된 NotI 클로닝 부위 중으로 삽입된다. NIS 핵산이 VSV G 및 L 핵산 서열 사이에 조작된 XhoI 및 NheI 제한 부위 중으로 삽입된다.
본 출원은 수포성 구내염 바이러스에 관련된 방법 및 물질을 제공한다. 예를 들면, 본 출원은 수포성 구내염 바이러스, VSV 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자, 수포성 구내염 바이러스의 제조 방법, 및 암 치료를 위한 수포성 구내염 바이러스의 사용 방법을 제공한다.
본원에 기재된 바와 같이, 수포성 구내염 바이러스는 VSV N 폴리펩티드, VSV P 폴리펩티드, VSV M 폴리펩티드, VSV G 폴리펩티드, VSV L 폴리펩티드, IFN 폴리펩티드, 및 NIS 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 가지도록 설계될 수 있다. 수포성 구내염 바이러스의 관점에서 본원에 기재된 서열이 바이러스 게놈의 포지티브 센스 cDNA를 코딩하는 플라스미드 중으로 도입되어 수포성 구내염 바이러스의 네거티브 센스 게놈의 생성을 허락하는 것으로 인식되어진다. 따라서, 예를 들어 VSV 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열이 그러한 폴리펩티드를 (예를 들면, 직접 번역을 통해) 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 RNA 서열을 지칭할 수 있는 것으로 인식되어진다.
IFN 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 VSV M 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 하류에 위치할 수 있다 (도 1의 A). 예를 들면, IFN 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 VSV M 폴리펩티드를 코딩하는 핵산과 VSV G 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 사이에 위치할 수 있다. 이러한 배치는 바이러스로 하여금 비암성 조직에서 항바이러스성 고유 면역 반응을 활성화시켜 암세포에서 유효 바이러스 복제를 방해함이 없이 잠재적인 바이러스 독성을 경감시키는데 효과적인 양의 IFN 폴리펩티드를 발현하도록 할 수 있다.
IFN 폴리펩티드를 코딩하는 임의의 적절한 핵산이 수포성 구내염 바이러스의 게놈에 삽입될 수 있다. 예를 들면, IFN 베타 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 수포성 구내염 바이러스의 게놈에 삽입될 수 있다. 수포성 구내염 바이러스의 게놈에 삽입될 수 있는 IFN 베타 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 예로는 진뱅크(GenBank)® 수탁 번호 NM_002176.2(GI No. 50593016)에 제시된 핵산 서열의 인간 IFN 베타 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 진뱅크® 수탁 번호 NM_010510.1(GI No. 6754303), C119395.1 (GI No. 111601321), 또는 BC119397.1 (GI No. 111601034)에 제시된 핵산 서열의 마우스 IFN 베타 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 및 진뱅크® 수탁 번호 NM_019127.1 (GI No. 9506800)에 제시된 핵산 서열의 래트 IFN 베타 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
NIS 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 VSV G 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 하류에 위치할 수 있다 (도 1의 A). 예를 들면, NIS 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 VSV G 폴리펩티드를 코딩하는 핵산과 VSV L 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 사이에 위치할 수 있다. 이러한 배치는 바이러스로 하여금 (a) 감염된 세포에서 요오드화물의 선택적 축적을 허락하여 방사성 동위원소를 이용한 바이러스 분포의 영상분석 및 감염된 암세포에 표적화된 방사선요법 둘다를 가능하게 하는데 효과적이면서 (b) 감염된 세포에 대해 독성이도록 하는 그러한 높지 않은 양의 NIS 폴리펩티드를 발현하도록 할 수 있다.
NIS 폴리펩티드를 코딩하는 임의의 적절한 핵산이 수포성 구내염 바이러스의 게놈에 삽입될 수 있다. 예를 들면, 인간 NIS 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 수포성 구내염 바이러스의 게놈에 삽입될 수 있다. 수포성 구내염 바이러스의 게놈에 삽입될 수 있는 NIS 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 예는 진뱅크® 수탁 번호 NM_000453.2(GI No.164663746), BC105049.1(GI No. 85397913), 또는 BC105047.1 (GI No. 85397519)에 제시된 핵산 서열의 인간 NIS 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 진뱅크® 수탁 번호 NM_053248.2(GI No. 162138896), AF380353.1(GI No. 14290144), 또는 AF235001.1(GI No. 12642413)에 제시된 핵산 서열의 마우스 NIS 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 진뱅크® 수탁 번호 XM_524154(GI No. 114676080)에 제시된 핵산 서열의 침팬지 NIS 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 진뱅크® 수탁 번호 XM_541946(GI No. 73986161)에 제시된 핵산 서열의 개 NIS 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 진뱅크® 수탁 번호 XM_581578(GI No. 297466916)에 제시된 핵산 서열의 소 NIS 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 진뱅크® 수탁 번호 NM_214410(GI No. 47523871)에 제시된 핵산 서열의 돼지 NIS 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 및 진뱅크® 수탁 번호 NM_052983 (GI No. 158138504)에 제시된 핵산 서열의 래트 NIS 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
수포성 구내염 바이러스의 게놈에 삽입되는 핵산(예를 들면, NIS 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 및/또는 IFN 폴리펩티드를 코딩하는 핵산)은 바이러스 폴리머라제에 의해 삽입된 핵산 서열의 전사에 필요한 유전자 전사 개시 및 종결 코드를 함유하는 바이러스 인트라제닉 영역이 측면에 위치할 수 있다. 이러한 바이러스 인트라제닉 영역의 예들은 도 10에 제시된 것들을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
VSV N 폴리펩티드, VSV P 폴리펩티드, VSV M 폴리펩티드, VSV G 폴리펩티드, 및 VSV L 폴리펩티드를 코딩하는 본원에서 제공된 수포성 구내염 바이러스의 핵산 서열은 진뱅크® 수탁 번호 NC_001560(GI No. 9627229)에 제시된 VSV 인디애나(Indiana) 균주로부터 유래하거나 VSV 뉴저지(New Jersey) 균주로부터 유래할 수 있다.
일 측면에서, 본 출원은 3'에서 5' 방향으로, VSV N 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, VSV P 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, VSV M 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, IFN 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, VSV G 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, NIS 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, 및 VSV L 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열을 가진 핵산 분자(예를 들면, RNA 분자)를 함유하는 수포성 구내염 바이러스를 제공한다. 이러한 수포성 구내염 바이러스는 세포(예를 들면, 암세포)를 감염시킬 수 있고 감염된 세포에 의해 IFN 폴리펩티드 및 NIS 폴리펩티드의 발현을 지시한다.
핵산(예를 들면, IFN 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 및/또는 NIS 폴리펩티드를 코딩하는 핵산)을 수포성 구내염 바이러스의 게놈 중으로 삽입하기 위해 임의의 적절한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Obuchi et al., J. Virol., 77(16):8843-56 (2003); Goel et al., Blood, 110(7):2342-50 (2007); 및 Kelly et al., J. Virol., 84(3):1550-62 (2010)] 등에 기재된 방법을 사용하여 핵산을 수포성 구내염 바이러스의 게놈 중으로 삽입할 수 있다. 임의의 적절한 방법을 사용하여 본원에 기재된 핵산 분자를 함유하는 수포성 구내염 바이러스를 동정할 수 있다. 이러한 방법에는 PCR 및 핵산 혼성화 기법 예컨대 노던 및 서던 분석이 포함되지만 이에 한정되지 않는다. 일부 경우에, 특정 핵산 분자에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 발현을 검출함으로써 수포성 구내염 바이러스가 그러한 특정 핵산 분자를 함유하는지 여부를 확인하기 위해 면역조직화학 및 생화학 기법이 사용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 VSV N 폴리펩티드, VSV P 폴리펩티드, VSV M 폴리펩티드, IFN 폴리펩티드, VSV G 폴리펩티드, NIS 폴리펩티드, 및 VSV L 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 예를 들면, 본원에서 제공된 핵산 분자는 VSV N 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열, VSV P 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열, VSV M 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열, IFN 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열, VSV G 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열, NIS 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 및 VSV L 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단일 핵산 분자일 수 있다.
본원에서 사용된 "핵산"이란 용어는 RNA(예를 들면, 바이러스 RNA), 및 cDNA, 게놈 DNA, 및 합성(예를 들면, 화학적으로 합성된) DNA를 포함한 DNA 둘다를 포괄한다. 핵산은 이중 가닥이거나 단일 가닥일 수 있다. 단일 가닥 핵산은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥일 수 있다. 부가적으로, 핵산은 원형 또는 선형일 수 있다.
본 출원은 또한 암의 치료 방법(예를 들면, 종양 크기의 감소, 종양 성장 억제, 또는 살아있는 종양세포 수의 감소)을 제공한다. 예를 들면, 본원에서 제공된 수포성 구내염 바이러스는 종양 크기를 감소시키고/시키거나, 암세포 또는 종양 성장을 억제하고/하거나, 포유동물에서 살아있는 암세포의 수를 감소시키기 위해 암을 가진 포유동물에 투여될 수 있다. 본원에서 제공된 수포성 구내염 바이러스는 숙주 세포에서 증식하여 그러한 바이러스의 유효 카피 수를 전형적으로 2배 이상(예를 들면, 5배 내지 10배, 50배 내지 100배, 500배 내지 1,000배, 또는 심지어 5,000배 내지 10,000배) 증가시킬 수 있다. 일부 경우에, 본원에서 제공된 수포성 구내염 바이러스는 표준 세포 배양 배지(예를 들면, 37℃에서 5% CO2 중에서 5-10% 우태혈청이 보충된 DMEM 또는 RPMI-1640)에서 원하는 농도가 얻어질 때까지 확장될 수 있다. 바이러스 역가는 전형적으로 배양액에 세포(예를 들면, BHK-21 세포)를 접종하여 평가된다.
본원에서 제공된 수포성 구내염 바이러스는 예를 들면, 암세포의 그룹(예를 들면, 종양)으로의 직접적인 주입 또는 암세포로의 정맥내 전달에 의해 암환자에 투여될 수 있다. 본원에서 제공된 수포성 구내염 바이러스는 골수종(예를 들면, 다발성 골수종), 흑색종, 신경교종, 림프종, 중피종, 및 폐암, 뇌암, 위암, 결장암, 직장암, 신장암, 전립선암, 난소암, 유방암, 췌장암, 간암, 및 두경부암(이에 한정되지 않음)을 포함한 다양한 유형의 암을 치료하는데 사용될 수 있다.
본원에서 제공된 수포성 구내염 바이러스는 생물학적으로 적합한 용액 또는 약학적으로 허용가능한 전달 비히클에서, 암세포의 그룹으로 직접적으로 투여(예를 들면, 종양내 투여)에 의하거나 전신 투여(예를 들면, 정맥내 투여)에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 적당한 약학 제제는 부분적으로는 용도와 진입 경로, 예를 들면, 경피 또는 주사에 좌우된다. 이러한 제형들은 본 발명의 조성물 또는 제제가 표적 세포(즉, 바이러스가 전달되기를 원하는 세포)에 도달하는 것을 차단하거나 그러한 조성물 또는 제제가 효능을 발휘하는 것을 차단할 수 없어야 한다. 예를 들면, 혈액에 주입되는 약학 조성물은 가용성이어야 한다.
투약량은 환자마다 달라지지만(예를 들면, 종양의 크기에 의존), 임의의 해로운 부작용의 존재와 함께 암세포 성장 감소에 대해 모니터링하면서, 안전한 것으로 입증된 바이러스 농도를 하한으로 설정하고 최대 1012 pfu의 고용량으로 상승시킴으로써 유효 용량을 결정할 수 있다. 치료적 유효 용량은 전형적으로 암세포 수 또는 종양 크기에 있어 10% 이상 감소를 제공한다. 상승 용량 연구를 이용하여 정해진 바이러스 치료를 위한 원하는 효과를 얻을 수 있다(예를 들면, 문헌[Nies and Spielberg, "Principles of Therapeutics," In Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, eds. Hardman, et al., McGraw-Hill, NY, 1996, pp 43-62] 참조).
본원에서 제공된 수포성 구내염 바이러스는 예를 들면, 약 103 pfu 내지 약 1012 pfu (예를 들면, 약 105 pfu 내지 약 1012 pfu, 약 106 pfu 내지 약 1011 pfu, 또는 약 106 pfu 내지 약 1010 pfu) 범위의 용량으로 전달될 수 있다. 치료적 유효 용량은 반복 투약으로 제공될 수 있다. 반복 투약은, 임상적인 증상 또는 종양 크기의 관찰 또는 모니터링 분석에 의해 암세포 그룹 또는 종양이 수축을 멈추었다거나 종양이 여전히 존재하면서 바이러스 활성도가 감소하고 있음을 보이는 경우에 적절하다. 반복 투여 용량은 초기에 사용된 것과 동일한 경로에 의하거나 다른 경로에 의해 투여될 수 있다. 치료적 유효 용량은 몇몇 개별 용량(예를 들면, 수일 또는 수주 간격)으로 전달될 수 있으며, 일 실시양태에서는, 1회 내지 약 12회 투약이 제공된다. 대안으로, 본원에서 제공된 수포성 구내염 바이러스의 치료적 유효 용량은 지속 방출형(sustained release) 제제에 의해 전달될 수 있다. 일부 경우, 본원에서 제공된 수포성 구내염 바이러스는 암세포 내에서 바이러스 복제 및 확산을 촉진하는 약제 또는 바이러스 독성으로부터 비암세포를 보호하는 제제와 함께(병용하여) 전달될 수 있다. 이러한 제제의 예들은 문헌[Alvarez-Breckenridge et al., Chem . Rev., 109(7):3125-40 (2009)] 등에 기재되어 있다.
본원에서 제공된 수포성 구내염 바이러스는 지속 방출을 제공하기 위한 디바이스를 사용하여 투여될 수 있다. 수포성 구내염 바이러스의 지속 방출을 위한 제제는 예를 들면, 중합체형 부형제(예를 들면, 팽윤성 또는 비팽윤성 겔, 또는 콜라겐)을 포함할 수 있다. 중합체성 부형제 내에 치료적 유효 용량의 수포성 구내염 바이러스가 제공될 수 있으며, 여기서 부형제/바이러스 조성물은 암세포 부위(예를 들면, 종양에 근접하거나 종양 내부)에 이식된다. 체액의 작용은 점진적으로 부형제를 용해시키고 소정 시간에 걸쳐 바이러스의 유효 용량을 계속적으로 방출한다. 대안으로, 지속 방출형 디바이스는 활성층과 스페이서층이 교대로 이루어진 연속 층을 포함할 수 있다. 이러한 디바이스의 각각의 활성층은 전형적으로 부형제 내에 내포된 소정 용량의 바이러스를 함유하지만, 각 스페이서층은 오직 부형제만을 함유하거나 저농도의 바이러스(즉, 유효 용량 미만)를 함유한다. 디바이스의 각각의 연속층이 용해됨에 따라, 바이러스의 펄스 용량(pulsed doses)이 전달된다. 스페이서층의 크기/제제는 투약 사이의 시간차를 결정하고 사용되는 치료법에 따라 최적화된다.
본원에서 제공된 수포성 구내염 바이러스는 직접 투여될 수 있다. 예를 들면, 바이러스가 피부를 통해 지각될 수 있는 종양(예를 들면, 유방암 종양)에 직접적으로 주입될 수 있다. 초음파 가이드라인이 또한 이러한 방법에 사용될 수 있다. 대안으로, 바이러스의 직접 투여는 카테터 라인 또는 다른 의료용 접근 디바이스를 통해 달성될 수 있고, 암세포 그룹의 위치를 확인하기 위한 영상분석 시스템과 함께 사용될 수 있다. 이러한 방법에 의해, 의료용 접근 디바이스에 삽입되는 가이드와이어를 사용하여 이식가능한 투입 장치를 전형적으로 암세포 그룹의 부근에 위치시킨다. 본원에서 제공된 유효 용량의 수포성 구내염 바이러스는 개방된 수술 시야에서 가시적으로 확인가능한 암세포 그룹에 직접적으로 투여될 수 있다.
일부 경우, 본원에서 제공된 수포성 구내염 바이러스는 전신으로 전달될 수 있다. 예를 들면, 전신 전달은 정맥내 주사에 의하거나 또는 다투여량의 약제의 투여를 위해 설계된 정맥내 전달 디바이스에 의해 달성될 수 있다. 이러한 디바이스는 날개형 주입 바늘, 말초 정맥 카테터, 중앙선 카테터, 말초 삽입된 중심 카테터, 및 수술적으로 배치된 카테터 또는 포트를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본원에서 제공된 수포성 구내염 바이러스를 사용한 치료법의 과정은 임상 증상에 있어 변화를 평가함으로써 또는 암세포의 수 또는 종양 크기를 직접적으로 모니터링함으로써 모니터링될 수 있다. 고형 종양의 경우, 바이러스 치료의 효과성은 치료 이전 및 이후에 종양의 크기 또는 중량을 측정함으로써 평가될 수 있다. 종양 크기는 직접적으로(예를 들면, 캘리퍼스를 사용하여), 또는 영상분석 기법을 사용하여(예를 들면, X-선, 자기 공명 영상분석, 또는 컴퓨터처리된 X선 사진촬영) 또는 비영상 광학 데이터(예를 들면, 스펙트럼 데이터)의 평가로부터 측정될 수 있다. 암세포(예를 들면, 백혈병 세포) 그룹의 경우, 바이러스 치료의 효과성은 치료 이전 및 이후에 환자의 순환혈액에서 백혈병 세포의 절대적인 수를 측정함으로써 결정될 수 있다. 바이러스 치료의 효과성은 또한 암 특이적 항원의 수준을 모니터링함으로써 평가될 수 있다. 암 특이적 항원은 예를 들면, 암배아 항원(CEA), 췌장 특이적 항원(PSA), 전립선산 인산효소(PAP), CA 125, 알파-페토프로테인(AFP), 탄수화물 항원 15-3, 및 탄수화물 항원 19-4를 포함한다.
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 기재될 것이며, 이는 청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 제약하는 의도는 아니다.
실시예
실시예 1 - IFN 폴리펩티드 및/또는 NIS 폴리펩티드를 발현하는 수포성 구내 염 바이러스를 사용하는 단일 용량 정맥내 바이러스요법은 종양파괴성 종양 부피감소 및 잔존 질환의 면역요법적 근절을 매개한다
마우스 IFN 베타 폴리펩티드를 발현하도록 설계된 수포성 구내염 바이러스(VSV-mIFN) 및 마우스 IFN 베타 폴리펩티드와 인간 NIS 폴리펩티드 둘다를 발현하도록 설계된 수포성 구내염 바이러스(VSV-mIFN-NIS; 도 1의 A)를 문헌[Obuchi et al., J. Virol., 77(16):8843-56 (2003)); Goel et al., Blood, 110(7):2342-50 (2007)); Kelly et al., J. Virol., 84(3):1550-62 (2010); 및 Lawson et al., Proc. Nat'l . Acad . Sci . USA, 92(10):4477-81 (1995) Erratum in: Proc . Nat'l . Acad . Sci . USA, 92(19):9009 (1995)] 등에 기재된 것과 유사한 방법을 사용하여 제조하였다. 마찬가지로, 인간 IFN 베타 폴리펩티드 및 인간 NIS 폴리펩티드를 발현하도록 설계된 수포성 구내염 바이러스(VSV-hIFN-NIS; 도 1의 A)를 제조하였다. 간단히 설명하면, PCR을 이용하여 특정 제한 부위를 갖는 원하는 트랜스진의 핵산 서열을 생성하였다. 트랜스진을 VSV 게놈의 포지티브 가닥을 코딩하는 플라스미드 중으로 특정 삽입 부위에 5'에서 3' 방향으로 삽입시켰다. 변형된 플라스미드를 증식시키고, 필수 T7 폴리머라제를 코딩하는 백시니아 바이러스를 이용한 감염 및 VSV 바이러스 단백질 N, P, 및 L의 형질감염에 의해 감염 바이러스를 회수했다. 그 결과 감염 비리온으로 어셈블리된 네거티브 센스 바이러스 게놈의 생성을 허락하는 요구된 바이러스 폴리펩티드가 제조되었다. 회수된 바이러스를 증폭시키고, 배양액의 적절한 세포주(예를 들면, BHK-21 세포) 상에서 감염 용량을 측정하였다. 이러한 수포성 구내염 바이러스의 제조에 사용된 마우스 IFN 베타 폴리펩티드의 핵산 서열은 진뱅크® 수탁 번호 NM_010510.1(GI No. 6754303)에 제시되어 있다. 이러한 수포성 구내염 바이러스의 제조에 사용된 인간 IFN 베타 폴리펩티드의 핵산 서열은 진뱅크® 수탁 번호 NM_002176.2(GI No. 50593016)에 제시되어 있다. 이러한 수포성 구내염 바이러스의 제조에 사용된 인간 NIS 폴리펩티드의 핵산 서열은 진뱅크® 수탁 번호 NM_000453.2(GI No.164663746)에 제시되어 있다.
인간 NIS 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 VSV G 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 상류에 삽입했을 때, NIS 발현 수준이 너무 높아 세포가 살아남지 못하고 바이러스 증식을 허락할 수 없는 것으로 보이기 때문에 기능성 비리온이 생성되지 않았다. VSV G 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 하류에 NIS 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 삽입은 생성되는 NIS 폴리펩티드의 낮은 수준으로 인해 기능성 NIS-발현 비리온을 생성했으며 이에 따라 효과적인 바이러스 확산을 가능하게할 뿐만 아니라, 감염된 세포에서 기능성 요오드화물 흡수를 위한 충분한 양의 NIS 폴리펩티드가 얻어졌다 (도 2의 B).
VSV M 폴리펩티드를 코딩하는 핵산과 VSV G 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 사이에 IFN 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 삽입은 세포에 감염되어 상당히 증가된 수준의 IFN 폴리펩티드 발현을 유도하는 바이러스를 생성했으며 이는 감염된 세포로부터 얻어진 상등액에서 관찰되었다 (도 2의 A). VSV-IFN-NIS 바이러스는 감염된 세포에서 시험관내에서 효율적으로 복제할 수 있었으며 또한 방사성 요오드화물을 흡수하는 감염된 세포의 능력으로 도시한 바와 같이 높은 수준의 기능성 NIS를 발현한다 (도 2의 B).
2 VSV-IFN-NIS 바이러스의 정제된 스탁(stock)을 BHK(햄스터) 세포에서 적정하고(도 1의 B), 세포 상등액을 수거하여 바이러스로 코딩된 IFNβ의 분비를 확인하였다. VSV-hIFN-NIS 및 VSV-mIFN-NIS로 각각 감염된 BHK 세포의 상등액에서 고농도의 인간 또는 뮤린 IFNβ를 검출하였고 (도 1의 D), 방사성 요오드 흡수 연구에 의해 바이러스 감염된 세포에서 방사성 요오드의 퍼클로레이트 감작성(즉, NIS-매개) 농도를 확인했으며(도 1의 C), 높은 감염비(multiplicity infection) 후 24시간째 최대였다.
VSV-IFN-NIS 바이러스의 생체내 활성을 평가하기 위해, 5TGM1 및 MPC-11 뮤린(murine) 골수종 세포주를 선택했는데 그 이유는 이들 세포주가 면역적격 동계 마우스에서 피하 또는 동위성(orthotopic) 종양을 신뢰성있게 형성하기 때문이다(Lichty et al., Hum . Gene Ther ., 15:821-831 (2004) 및 Turner et al., Human Gene Therapy, 9:1121-1130 (1998)). 두 세포주는 VSV-IFN-NIS 감염에 민감한 것으로 확인되었으며 (도 1의 E), 그 결과 기능성 NIS 발현, IFNβ 방출, 및 후속적인 세포 살해가 가능하다. 정맥내 투여된 VSV-IFN-NIS 바이러스가 종양 혈관으로부터 분출될 수 있고 종양의 실질조직을 통해 확산될 수 있는 지를 확인하기 위해, 피하 5TGM1 또는 MPC-11 종양을 동계 마우스에서 (~5 mm 직경으로) 성장시키고, 108 TCID50 VSV-IFN-NIS 바이러스의 단일 정맥내 용량을 투여했으며, 추적자로서 99mTcO4(반감기 6 시간)를 사용하여 매일 SPECT/CT 영상분석함으로써 바이러스로 코딩된 NIS 발현의 생체분포를 비침윤식으로 모니터링하였다 (도 3의 A). 이러한 추적자 흡수 연구는 바이러스가 종양 혈관으로부터 효율적으로 분출됨을 보여주었고 바이러스가 피하 종양에서 빠르게 확산될 수 있음을 시사한다.
종양 실질조직에서 바이러스가 실제로 복제하고 확산하는지를 확인하기 위해, VSV-IFN-NIS 바이러스 투여 후 24, 48 및 72 시간째 SPECT/CT 영상촬영 직후 선택된 종양을 수거하고 (i) 살아있는 NIS-발현 종양 세포를 검출하기 위한 방사선자동사진법; (ii) VSV 항원을 검출하기 위한 면역형광(IF), 및 (iii) 죽은 세포 또는 죽어가는 세포를 확인하기 위한 TUNEL 염색을 실시하였다. 도 3의 B에 도시된 데이터의 조심스런 분석에 따르면 VSV 감염된 대형의 대략 구형의 구역이 존재했는데 여기서 중앙의 종양 세포는 사멸이 일어났으며 주변부의 종양 세포는 살아남았고(또한 도 8 참조), NIS를 발현하며(도 5), 99mTcO4를 집중시켰다(도 9). IF 및 TUNEL 데이터의 정량 분석은 바이러스 투여 후 24시간 및 48시간 사이에 바이러스 감염되어 사멸되는 세포의 수에 있어 상당한 증가를 보여주었다 (도 3의 C). 감염 후 72시간까지, VSV 감염의 성장 지대가 크게 합체되어 종양의 대규모 파괴가 일어났다(도 3의 B 및 도 8).
바이러스 투여 후 최초 24시간 동안 매우 초기 시점에 바이러스 확산의 동역학 특징을 규명하기 위해 부가적인 실험을 실시하였다 (도 4의 A). IV 바이러스 투여 후 6시간째 수거하여 VSV 및 CD31-양성 혈관 둘다에 대해 염색한 종양 절편에 대한 분석 결과 개별 분산된 VSV 감염 세포들이 종양 혈관에 대부분 근접한 것으로 확인되었다. 12시간까지, 바이러스 감염된 세포의 작은 클러스터가 눈으로 확인가능했으며, 18시간까지 이러한 클러스터가 상당히 성장하여 24시간까지 앞서 기재된 전형적인 외관 - 중앙에서 세포사멸 및 주변부에서 세포생존 - 을 나타내었다. 이중 CD31/VSV 염색된 절편에 대한 분석(도 4의 A, 패널 i-vi)은, VSV 감염된 종양 세포에 의해 완전히 둘러싸인 경우에서 조차, 종양 혈관을 라이닝하는 내피 세포가 VSV 감염으로 인해 죽지않았음을 보여주는데, 이는 도 4의 B에서 고배율로 도시되어 있다. 6, 12, 18, 및 24 시간 시점에 감염상태인 중앙의 평균 직경(직경으로 세포 수로서 측정)을 작도함으로써(도 4의 C), 바이러스가 일정한 속도로 원심으로 확산되어 확장중인 구에서 세포의 각각의 연속층을 감염시키는데 대략 2시간이 소요되는 것으로 나타났다. 따라서, 감염이 진행됨에 따라 각각의 감염상태의 중앙으로 새로운 세포의 증식 속도가 증가했으며, 각 중앙은 바이러스 전달 후 24시간까지 대략 10,000 세포를 함유하는 것으로 추정되었다.
생체내에서 감염부터 감염된 세포의 죽음까지 이르는 대략적인 시간을 확인하기 위해, 종양내 감염의 진전중인 가장자리에서 살아있는 VSV-감염된(즉, TUNEL-음성, VSV-양성) 세포의 가장자리의 평균 직경을 측정한 결과 대략 10 세포였다 (도 4의 D). 따라서, 바이러스는 원심으로 확산되고, 바이러스가 인접 세포상에 통과하는데 대략 2시간이 소요되었지만(도 4의 C), 감염된 세포의 가장자리가 10 세포 직경 정도 진행될 때까지 세포 사멸이 일어나지 않았다 (도 4의 D). 이러한 관찰결과들을 취합하면, 감염된 세포가 사멸하는데 대략 20시간이 소요되는 것으로 결론지어졌다.
바이러스의 효율적인 분출 및 빠른 종양내 확산이 종양 퇴행과 연관되는 지를 확인하기 위해, 피하 5TGM1 종양을 가진 C57KaLwRij 마우스의 부가적인 군을 108 TCID50 VSV-IFN-NIS의 단일 정맥내 용량으로 처리하고 장기간에 걸쳐 매일 건강 상태 체크 및 종양 측정을 실시하였다. VSV-mIFN-NIS 및 VSV-hIFN-NIS 처리된 동물의 대부분에서 종양이 빠르게 퇴화되었다 (도 6의 A). 비록 정식으로 입증된 것은 아니지만 우연한 매우 조기 사멸은 신경독성과 연관이 없고 빠른 종양 용해 증세로 인한 것으로 추정되었다. 흥미롭게도, 바이러스 요법 투여 후 2 내지 3주째, VSV-hIFN-NIS로 감염된 동물 대부분에서 종양 재발이 관찰되었지만, VSV-mIFN-NIS로 감염된 동물에서는 그렇지 않았는데(도 6의 A 및 B), 이는 인간 IFNβ가 아닌 바이러스로 코딩된 마우스 IFNβ가 이러한 동계 면역적격 마우스 모델에서 잔존 질환의 완전한 박멸을 유도하는 메카니즘을 활성화시킬 수 있음을 시사한다. 모든 마우스가 상기 시간까지 항-VSV 항체의 높은 역가를 나타내었기 때문에 재발 종양에 대해 VSV-IFN-NIS의 재처리는 시도되지 않았다 (도 6의 C).
바이러스 처리된 동물에서 혈청 IFNβ 수준의 측정에 따르면 이러한 바이러스로 코딩된 사이토카인이 바이러스 투여 후 초기 시점에 바이러스 감염된 종양 세포에 의해 혈류 중으로 방출되는 것으로 나타났다 (도 7의 A). 인터페론 베타의 항종양 작용은 종양 세포 증식의 직접적인 억제, 자연 살해 세포 활성화, 항신생혈관형성, 및 항종양 T 세포 반응의 증진을 포함한다. 그러나, 시험관내 5TGM1 및 MPC11 골수종 세포의 증식은 고농도 IFNβ에서 조차 악영향을 받지 않았다 (도 1의 F). 또한, 바이러스 처리된 종양의 CD31 또는 CD3 염색된 절편의 분석은 항혈관형성 활성의 억제에 대한 어떠한 증거도 보여주지 않았을 뿐만 아니라 호스트 T 림프구에 의한 종양 침윤에 대한 어떠한 증거도 보여주지 않았다 (도 4의 B). 그러나, 종양이 재발되지 않은 바이러스 처리된 동물은 5TGM1 종양 세포의 재투여(re-challenge)에 내성인 것으로 밝혀졌는데(도 7의 B), 이는 마우스가 5TGM1 특이적 항종양 면역성을 나타내고 있음을 의미한다. 동계 VSV-감염된 골수종 세포가 특이적 항골수종 면역 반응을 유발할 수 있는지를 확인하기 위해, 피하 종양 세포 이식 후 1일째 또는 이러한 이식 전 5일째, 동계 마우스를 107 VSV-감염된 5TGM1 세포의 단일 피하 주사로 면역화시켰다. 종양 성장이 지연되었으며 그 결과 종양 투여 전 5일째 면역화된 마우스에서 생존율에 있어 상당한 개선이 있었는데 (도 7의 C), 이는 VSV-감염된 종양 세포가 적당한 항종양 면역 반응을 유도했음을 의미한다. 그러나, VSV-감염된 종양 세포 백신은 심지어 작은 확립된 종양을 가진 마우스에서 검출가능한 항종양 활성을 나타내지 않았으며, 이는 항종양 면역성이 최소 질환 부담(minimal disease burden)의 관점에서만 효과적임을 시사한다.
VSV-mIFN-NIS 처리된 마우스에서 보다 낮은 종양 재발율이 항종양 T 세포 반응을 증진시키는 바이러스로 코딩된 IFNβ에 기인한 것인지를 확인하기 위해, 항-CD4 및 항-CD8 항체의 칵테일을 사용하여 T-세포를 고갈시켰다. 종양은 T 세포 고갈 상태와 무관하게 정맥내 VSV-mIFN-NIS 요법에 동일하게 잘 반응했지만, 종양 재발율은 T-세포 고갈된 마우스에서 상당히 더 높았다 (도 7의 D 및 E). 이러한 결과는 종양파괴성 부피감소 후 VSV-mIFN-NIS에 의한 잔존 종양 세포의 박멸이 바이러스로 코딩된 마우스 IFNβ에 의해 증폭이 자극되는 종양 특이적 T 세포에 의해 매개되었음을 의미한다.
면역적격 5TGM1 동계 다발성 골수종 마우스 모델(C57Bl/KalwRijHsd)에서 약한 종양파괴 효능을 나타내는 Goel 등의 문헌[Blood, 110(7):2342-50 (2007))]에 기재된 VSV-△51-NIS 바이러스와 비교했을 때, VSV-IFN 및 VSV-IFN-NIS 바이러스는 매우 우수한 복제 동역학을 나타내었다. 또한, VSV-△51-NIS 바이러스와 비교했을 때, VSV-IFN-NIS 바이러스는 시험관내에서 보다 높은 NIS 폴리펩티드 발현을 유도하였다. 생체내 치료요법 연구는 VSV-IFN 및 VSV-IFN-NIS 바이러스 각각의 단일 정맥내 용량이 피하 또는 동위성 5TGM1 골수종양을 가진 면역적격 마우스의 상당히 연장된 생존과 종양 퇴행을 촉진함을 입증해 주었다. VSV-IFN-NIS 바이러스로 처리된 마우스에서 수행된 Tc-99m 영상분석 연구는 종양 특이적 바이러스 NIS 폴리펩티드 발현과 방사성 동위원소 흡수를 나타내었으며 이는 종양내 바이러스 확산과 동시에 증가했다. 나아가, VSV-IFN 및 VSV-IFN-NIS 바이러스 처리 후 신경독성의 징후는 없었다. 이러한 결과는 바이러스 생체분포의 비침윤형 영상분석 및 방사선 바이러스요법 둘다를 위해 방사성 동위원소와 결합될 수 있는 암(예를 들면, 다발성 골수종)의 치료제로서 VSV-IFN-NIS 바이러스가 사용될 수 있음을 보여준다.
본원에서 제공된 결과들은 인간 IFNβ 및 인간 NIS를 코딩하는 수포성 구내염 바이러스가 다발성 골수종의 면역적격 마우스 모델에서 생체내 종양파괴 효능을 나타내는 것을 입증한다. 전신 투여된 바이러스는 종양에서 복제할 수 있고, 기능성 NIS 폴리펩티드의 충분한 수준을 발현시킬 수 있으며, 종양 퇴행을 유도하고 생존율을 개선하기 위한 종양파괴 활성을 유도할 수 있고, VSV △51-NIS 바이러스에 비해 우수한 NIS 발현 및 종양파괴 활성을 나타낼 수 있었다.
세포 배양 및 바이러스
10% 우태혈청(FBS), 100 U/mL 페니실린 및 100 mg/mL 스트렙토마이신이 보충된 배지에서 세포주를 배양하였다. 미국 ATCC(American Type cell culture)에서 입수한 BHK-21 및 MPC-11 세포를 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco Modified eagles medium, DMEM)에서 성장시켰다. 바바툰데 오야조비(Babatunde Oyajobi) 박사(미국 텍사스주 산 안토니오 UT 헬쓰 사이언시즈 센터)로부터 5TGM1 세포를 입수해 이스코베스 변형 둘베코 배지(Iscove's modified Dulbecco medium, IMDM)에서 성장시켰다. R. Vile로부터 B-16 뮤린 흑색종 세포를 입수해 DMEM에서 성장시켰다. 모든 세포주는 마이코플라즈마 오염에 대해 음성으로 조사되었다.
기능성 트랜스진 발현에 필요한 추정 VSV 인터제닉 서열 (TATG(A)7CTAACAG)의 뒤에 위치한 M/G 및 G/L 유전자 교차점(junction)에서 VSV 포지티브 가닥 안티게놈을 함유하는 제한 부위를 pVSV-XN2 플라스미드 중으로 조작처리하였다(Schnell et al., J. Virol., 70:2318-2323 (1996)). 뮤린 IFNβ, 인간 IFNβ, 및 NIS 유전자를 코딩하는 제한 부위가 측면에 위치한 cDNA를 PCR에 의해 생성하였다. 뮤린 또는 인간 IFNβ는 단일 NotI 부위(M/G 교차점)에 도입하였지만, NIS는 XhoI 및 NheI 부위(G/L 교차점) 중으로 삽입하여 VSV-IFN-NIS 플라스미드를 제조하였다. 문헌[Whelan et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 92:8388-8392 (1995)] 등에 기재된 방법을 사용하여 VSV-IFN-NIS 바이러스를 구출하였다. 이후 바이러스를 BHK-21 세포에서 증폭시키고, 세포 상등액의 여과에 의해 정제했으며, 10% w/v 수크로스를 통한 원심분리에 의해 펠렛화하였다. 연속 희석된 바이러스 스탁을 사용하여 감염 후 BHK-21 세포에서 바이러스 역가를 측정하여 스피어만 앤 카버 방정식(Spearman and Karber equation)을 사용하여 조직 배양 감염 용량(TCID50)을 결정하였다.
시험관내 바이러스 특징규명
BHK-21 세포의 감염(37℃에서 1 시간, MOI 1.0)에 이어 상등액에서 바이러스 역가를 측정하였다. 시험관내 방사성 요오드화물 흡수를 측정하기 위해, 방사능 표지된 NaI (1x105 cpm에서 I125) +/- 100 μM 칼륨 퍼클로레이트(KClO4)의 존재하에 10 mM HEPES (N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산, pH 7.3)를 갖는 한스 완충된 염용액(HBSS)에서 세포를 인큐베이트시켰다. 감염된 세포의 상등액에서 IFNβ 분비를, 뮤린 또는 인간 IFNβ(PBL Interferonsource)에 대한 효소-결합된 면역 흡착제 분석(ELISA)을 사용하여 측정하였다. IFN 반응성을 비교하기 위해, 세포를 100 U/mL 뮤린 IFNβ와 12시간 동안 미리 인큐베이트시킨 후 VSV-GFP로 감염시켰다. 생존 세포의 증식을 MTT 분석(ATCC)으로 평가하였다. 마찬가지로, VSV-IFN-NIS(MOI 1.0)에 의한 5TGM1 및 MPC-11의 살해를 감염 후 특정 시점에서 비처리된 세포의 백분율로서 표시되는 MTT 분석으로 모니터링하였다.
생체내 연구
5x106 5TGM1 또는 MPC-11 뮤린 골수종 세포를 6-10 주령의 동계 암컷 C57Bl6/KaLwRij 마우스(Harlan, 네덜란드) 또는 Balb/c 마우스(Taconic) 각각의 우측 옆구리에 피하 이식하였다. 연속 캘리퍼스 측정에 의해 종양 부담을 측정하였다. 마우스의 꼬리 정맥에 1x108/0.1 mL VSV-IFN-NIS의 단일 정맥내 용량 또는 동일 부피의 PBS를 주사하였다. 0.5 mCi Tc-99m의 복강내(IP) 투여 후 SPECT-CT 영상분석을 실시하고 문헌[Penheiter et al., AJR Am . J. Roentgenol., 195:341-349 (2010)] 등에 기재된 바와 같이 정량하였다.
고해상 종양 분석
24시간 간격으로 수거된 종양을, 절편화를 위해 OCT에서 동결시켰다. 방사선자동사진법 및 면역형광(IF)을 통해, (i) Mayo Clinic의 바이러스 벡터 제조 실험실에서 인하우스로 제조된 다클론 토끼 항-VSV에 이어 Alexa-표지된 항-토끼 IgG 이차 항체(Invitrogen, Molecular Probes)를 사용하여 VSV 항원에 대해, (ii) TUNEL 염색(DeadEndTM Fluorometric TUNEL kit, Promega)에 의한 세포 사멸에 대해, 그리고 (iii) Hoescht 33342 (Invitrogen)를 이용하여 세포 핵에 대해 종양 절편을 분석하였다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 n=3 VSV-mIFN-NIS 처리된 종양(처리 후 72시간째 n=2 종양 제외)으로부터 얻어진 4개의 랜덤 영상에 대해 영상 정량화를 실시하여 종양 영역의 백분율로서 VSV 또는 TUNEL(+) 영역을 얻었다. 6시간 간격으로 수거된 종양의 IF 분석은 래트 항-마우스 CD31 항체(BD Pharmingen)를 사용하여 VSV 항원 및 종양 혈관을 검출하였다. 2 종양으로부터 7-8 병소(foci)를 측정하고 직경을 평균 종양세포 크기(50 개개 세포의 직경 측정에 기초)로 나누어 세포 수로 표시된 병소 직경을 구함으로써 종양내 병소 크기를 정량화하였다. 대략적으로 구형인 병소의 부피를 식, v=4/3(π*r3)에 의해 개산하였다. 마찬가지로, 살아있는 VSV-감염된 세포의 가장자리의 평균 폭을 VSV-IFN-NIS 투여 후 48시간째 수거된 n=3 종양의 IF 영상으로부터 정량화하였다.
면역적격 마우스에서 면역 연구
항바이러스 항체의 생성을 측정하기 위해, 열에 의해 불활성화된 혈청의 연속 2-배 희석물을 500 TCTID50 VSV-GFP와 미리 인큐베이트시키고, 추후에 BHK-21 세포를 감염시키는데 사용하였다. VSV 유도된 CPE를 허락하는 최소 혈청 희석을 작도하였다. 혈청에서 생체내 IFNβ 분비를 ELISA로 측정하였다. 동계 마우스의 좌측 옆구리에 1x107 VSV-mIFN-NIS 감염된 세포(MOI 10.0)를 피하 주사함으로써 5TGM1 백신처리를 실시하였다. C57Bl6/KaLwRij 마우스에서 주 3회 항-CD4 및 항-CD8 항체(각각 50 ㎍)의 복강내 투여에 이어 매주 유지 용량에 의해 T-세포 고갈 연구를 실시하였다.
통계적 방법
데이터의 가시적 디스플레이를 사용하여 정상으로부터 이상치(outlier) 또는 실질적인 이탈을 평가하고, 기재된 t-테스트를 활용하였다. 모든 경우에, 복수 비교를 위해 조정되지 않은 2-테일(tail) P-값을 제공하였다. 생존율 차이의 비교는 카플란 마이어(Kaplan meier) 생존 곡선으로부터 로그 순위 시험을 사용하여 실시하였다. 동물 연구에서 종양 재발율을 비교하기 위해, 작은 시료 크기로 인해 피셔의 정확검정을 활용하였다.
다른 실시양태들
본 발명은 상세한 설명을 통해 기술되고 있으며, 상기 상세한 설명은 설명적인 의도이고 첨부된 청구범위에서 정의된 본 발명의 범위를 제한하지 않는 것으로 이해해야 한다. 다른 측면, 이점 및 변형도 하기 청구범위의 범주 내에 속한다.

Claims (21)

  1. RNA 분자를 포함하는 수포성 구내염 바이러스로서, 상기 RNA 분자가 3'에서 5' 방향으로, VSV N 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, VSV P 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, VSV M 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, IFN 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, VSV G 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, NIS 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, 및 VSV L 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열을 포함하는 것인 수포성 구내염 바이러스.
  2. 제1항에 있어서, 상기 IFN 폴리펩티드는 인간 IFN 베타 폴리펩티드인 바이러스.
  3. 제1항에 있어서, 상기 NIS 폴리펩티드는 인간 NIS 폴리펩티드인 바이러스.
  4. 제1항에 있어서, 상기 바이러스는 포유동물 세포에 감염되면 상기 IFN 폴리펩티드를 발현하는 것인 바이러스.
  5. 제1항에 있어서, 상기 바이러스는 포유동물 세포에 감염되면 상기 NIS 폴리펩티드를 발현하는 것인 바이러스.
  6. RNA 분자를 포함하는 수포성 구내염 바이러스를 포함하는 조성물로서, 상기 RNA 분자가 3'에서 5' 방향으로, VSV N 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, VSV P 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, VSV M 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, IFN 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, VSV G 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, NIS 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, 및 VSV L 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 IFN 폴리펩티드는 인간 IFN 베타 폴리펩티드인 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 NIS 폴리펩티드는 인간 NIS 폴리펩티드인 조성물.
  9. 제6항에 있어서, 상기 바이러스는 포유동물 세포에 감염되면 상기 IFN 폴리펩티드를 발현하는 것인 조성물.
  10. 제6항에 있어서, 상기 바이러스는 포유동물 세포에 감염되면 상기 NIS 폴리펩티드를 발현하는 것인 조성물.
  11. 3'에서 5' 방향으로, VSV N 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, VSV P 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, VSV M 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, IFN 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, VSV G 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, NIS 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, 및 VSV L 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열을 포함하는 핵산 가닥을 포함하는 핵산 분자.
  12. 제11항에 있어서, 상기 IFN 폴리펩티드는 인간 IFN 베타 폴리펩티드인 핵산 분자.
  13. 제11항에 있어서, 상기 NIS 폴리펩티드는 인간 NIS 폴리펩티드인 핵산 분자.
  14. 수포성 구내염 바이러스를 포함하는 조성물을 암세포를 포함한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법으로서, 상기 수포성 구내염 바이러스가 3'에서 5' 방향으로, VSV N 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, VSV P 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, VSV M 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, IFN 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, VSV G 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, NIS 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, 및 VSV L 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열을 포함하는 RNA 분자를 포함하고, 상기 포유동물에 상기 조성물의 투여는 상기 수포성 구내염 바이러스가 상기 암세포에 감염되어 감염된 암세포를 형성하는 조건하에 이루어지고, 상기 감염된 암세포는 상기 IFN 폴리펩티드 및 상기 NIS 폴리펩티드를 발현하고, 상기 포유동물 내의 암세포 수가 상기 투여 후 감소되는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 포유동물은 인간인 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 IFN 폴리펩티드는 인간 IFN 베타 폴리펩티드인 방법.
  17. 제14항에 있어서, 상기 NIS 폴리펩티드는 인간 NIS 폴리펩티드인 방법.
  18. 수포성 구내염 바이러스를 포함하는 조성물을 종양을 포함한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 종양 퇴행을 유도하는 방법으로서, 상기 수포성 구내염 바이러스가 3'에서 5' 방향으로, VSV N 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, VSV P 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, VSV M 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, IFN 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, VSV G 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, NIS 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열, 및 VSV L 폴리펩티드를 코딩하는 포지티브 센스 전사체에 대한 주형인 핵산 서열을 포함하는 RNA 분자를 포함하고, 상기 포유동물에 상기 조성물의 투여는 상기 수포성 구내염 바이러스가 상기 종양의 종양 세포에 감염되어 감염된 종양 세포를 형성하는 조건하에 이루어지고, 상기 감염된 종양 세포는 상기 IFN 폴리펩티드 및 상기 NIS 폴리펩티드를 발현하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 포유동물은 인간인 방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 IFN 폴리펩티드는 인간 IFN 베타 폴리펩티드인 방법.
  21. 제18항에 있어서, 상기 NIS 폴리펩티드는 인간 NIS 폴리펩티드인 방법.
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