EP0787199A1 - Adenovirus depourvus de particules contaminantes viables, preparation et utilisations - Google Patents

Adenovirus depourvus de particules contaminantes viables, preparation et utilisations

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EP0787199A1
EP0787199A1 EP95936609A EP95936609A EP0787199A1 EP 0787199 A1 EP0787199 A1 EP 0787199A1 EP 95936609 A EP95936609 A EP 95936609A EP 95936609 A EP95936609 A EP 95936609A EP 0787199 A1 EP0787199 A1 EP 0787199A1
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EP
European Patent Office
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region
plasmid
genome
fragment
recombinant adenovirus
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP95936609A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Patrice Yeh
Michel Perricaudet
Cécile Orsini
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aventis Pharma SA
Original Assignee
Rhone Poulenc Rorer SA
Aventis Pharma SA
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Filing date
Publication date
Application filed by Rhone Poulenc Rorer SA, Aventis Pharma SA filed Critical Rhone Poulenc Rorer SA
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor

Definitions

  • the present invention relates to new viral vectors, their preparation and their use in gene therapy. It also relates to pharmaceutical compositions containing said viral vectors. More particularly, the present invention relates to recombinant adenoviruses as vectors for gene therapy.
  • Gene therapy consists of correcting a deficiency or an anomaly (mutation, aberrant expression, etc.) by introducing genetic information into the affected cell or organ.
  • This genetic information can be introduced either in vitro into a cell extracted from the organ, the modified cell then being reintroduced into the organism, or directly in vivo into the appropriate tissue.
  • different techniques exist, among which various transfection techniques involving complexes of DNA and DEAE-dextran (Pagano et al., J. Virol.
  • adenoviruses have certain properties of interest for use in gene therapy. In particular, they have a fairly broad host spectrum, are capable of infecting quiescent cells, do not integrate into the genome of the infected cell, and have not been associated to date with significant pathologies in man. Adenoviruses have thus been used to transfer genes of interest into the muscle (Ragot et al., Nature 361 (1993) 647), the liver (Jaffe et al., Nature genetics 1 (1992) 372), the nervous system (Akli et al. Nature genetics 3 (1993) 224), etc.
  • Adenoviruses are linear double-stranded DNA viruses approximately 36 kb in size. Their genome includes in particular a repeated reverse sequence (ITR) at each end, an encapsidation sequence (Psi), early genes and genes late (Cf figure 1).
  • the main early genes are contained in the E1, E2, E3 and E4 regions. Among these, the genes contained in the El region (El a and Elb in particular) are necessary for viral replication.
  • the E4 and L5 regions for example, are involved in viral propagation.
  • the main late genes are contained in regions L1 to L5.
  • the genome of the Ad5 adenovirus has been fully sequenced and is accessible on the database (see in particular Genebank M73260). Likewise, parts or even the entire genome of adenoviruses of different serotypes (Ad2, Ad7, Adl2, etc.) have also been sequenced.
  • adenoviruses Given the properties of the adenoviruses mentioned above, these have already been used for gene transfer in vivo. To this end, different vectors derived from adenoviruses have been prepared, incorporating different genes ( ⁇ -gal, OTC, ⁇ -
  • the adenovirus was modified so as to render it incapable of replication in the infected cell.
  • the constructions described in the prior art are adenoviruses deleted from the El regions (El a and / or Elb) and possibly E3 into which the heterologous DNA sequences are inserted (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Gosh-Choudhury et al.
  • line 293 a complementation line in which a part of the adenovirus genome has been integrated. More specifically, line 293 contains the left end (approximately 11-12%) of the genome of the adenovirus serotype 5 (Ad5), comprising the left ITR, the packaging region and the El region, including El a, Elb and part of the region coding for the protein pIX.
  • This line is capable of trans-complementing recombinant adenoviruses defective for the E1 region, that is to say devoid of all or part of the E1 region, necessary for replication.
  • the recombinant El- adenoviruses can be prepared in 293 cells due to the good trans ⁇ complementation of the El region contained in this line.
  • Contamination with replicating particles is a major drawback. Indeed, the presence of such particles in therapeutic compositions would induce in vivo viral propagation and uncontrolled dissemination, with risks of inflammatory reaction, recombination, etc. Contaminated batches cannot therefore be used in human therapy.
  • the present invention overcomes these drawbacks.
  • the present invention indeed describes new constructions allowing the production of defective recombinant adenoviruses devoid of any contamination by replicative particles.
  • the present invention also describes a method for the production of these recombinant adenoviruses. It thus provides new defective recombinant vectors derived from adenoviruses, which are particularly suitable for use in gene therapy, in particular for the transfer and expression of genes in vivo.
  • the present invention more particularly resides in the construction of defective recombinant adenoviruses comprising an adenovirus genome whose genetic organization is modified and whose possible recombination with the genome of the production line leads to the generation of non-replicative viral particles. and / or non-viable.
  • the Applicant has now shown that it is possible to modify the genomic organization of the adenovirus to avoid the production of replicative particles during the production of stocks.
  • a first object of the present invention therefore relates to a recombinant adenovirus comprising an adenovirus genome (i) whose E1 region is inactivated,
  • the term “genetic or genomic organization” means the arrangement of the various genes or functional regions present in the genome of the wild adenovirus, as represented in FIG. 1.
  • a modified genetic or genomic organization therefore corresponds to a genome in which certain genes or regions are not in their original position.
  • certain genes or certain regions can be moved from the genome and inserted into another site. It is also possible to insert a given gene or region at a particular site, and to delete or inactivate the region of origin (by mutation, deletion, insertion, etc.)
  • non-viable viral particle designates, within the meaning of the invention, an adenovirus incapable of replicating its DNA and / or of propagating autonomously in infected cells.
  • a non-viable viral particle therefore has an adenovirus genome lacking at least the sequences necessary for its replication and / or its propagation in the infected cell. These regions can either be eliminated (in whole or in part), or made non-functional, or substituted by other sequences.
  • the sequences necessary for replication and / or propagation are for example the E1 region, the E4 region or the L5 region. More particularly, with regard to the E4 region, the important genes are the ORF3 and ORF6 genes.
  • the Applicant has more particularly shown that it is possible to displace a function essential for viral replication or propagation without affecting the properties of adenovirus as a vector for gene therapy, namely its high power of infection of cells, in particular human, and its ability to efficiently transfer a gene of interest into said cells.
  • the present invention relates to recombinant adenoviruses, a region essential for viral replication and / or propagation is present in a genomic position other than its original position.
  • this region is located at or near another genomic region rendered non-functional.
  • the vectors of the invention are particularly advantageous since they allow the incorporation of large genes of interest and that they can be produced at high titers, without production of contaminating replicative viral particle.
  • the E1 region or any other region can be inactivated or made non-functional by various techniques known to those skilled in the art, and in particular by deletion, substitution, deletion, and / or addition of one or more several bases.
  • Such modifications can be obtained in vitro (on isolated DNA) or in situ, for example, using genetic engineering techniques, or alternatively by treatment with mutagenic agents.
  • the said genetic modification (s) may be located in a coding part of the region, or outside of a coding region, and for example in the regions responsible for the expression and / or transcriptional regulation of said genes. Inactivation can therefore manifest itself by the production of inactive proteins due to structural or conformational modifications, by the absence of production, by the production of proteins having an impaired activity, or by the production of natural proteins at an attenuated level. or according to a desired regulation mode.
  • physical agents such as energy radiation (X-rays, ⁇ rays, ultra violet rays, etc.
  • chemical agents capable of reacting with different functional groups of the bases of DNA and for example alkylating agents [ethylmethane sulfonate (EMS), N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, N-nitroquinoline-1-oxide (NQO)], bialkylating agents, intercalating agents,
  • Genetic modifications can also be obtained by gene disruption, for example according to the protocol initially described by Rothstein [Meth. Enzymol. 1PJ . (1983) 202]. In this case, all or part of the coding sequence is preferably disturbed to allow replacement, by homologous recombination, of the genomic sequence with a non-functional or mutant sequence.
  • the region concerned is inactivated by mutation and / or deletion of one or more bases. Even more preferably, it is inactivated by total or partial deletion.
  • deletion is understood to mean any deletion of all or part of the gene considered. It may especially be all or part of the coding region of said gene, and / or all or part of the region promoting the transcription of said gene. Removal can be accomplished by digestion using enzymes appropriate restriction, then ligation, according to conventional molecular biology techniques, as illustrated in the examples.
  • the inactivation of the genes is carried out in such a way that it affects only the gene considered and not the other viral genes, in particular the neighboring genes. Furthermore, certain alterations such as point mutations being by nature capable of being corrected or attenuated by cellular mechanisms, it is particularly preferred that the inactivation is perfectly segregationally stable and / or non-reversible.
  • the region essential for viral viability is preferably located at or near the site of deletion. It is however possible to use other insertion sites, such as for example restriction sites already present in the wild genome. In this regard, it is nevertheless preferred that the insertion be carried out at least near the deletion site, that is to say outside the deletion site, but sufficiently ready so that it cannot occur. recombination events in the interval between the deletion site and the insertion site. Preferably, the distance between the deletion site and the insertion site should not exceed 50 bp.
  • the region essential for viral replication and / or propagation is displaced to be included at the level of the inactivated E1 region and / or of the E3 region.
  • the E1 region is inactivated by deletion of a PvuII-BglII fragment going from nucleotide 454 to nucleotide 3328, on the sequence of the adenovirus Ad5. This sequence is accessible in the literature and also on the database (see in particular Genebank n ° M73260).
  • the E1 region is inactivated by deletion of a HinfII-Sau3A fragment going from nucleotide 382 to nucleotide 3446.
  • the region essential for replication and / or viral propagation according to the present invention is advantageously chosen from all or part of the E4 region and / or of the pIX-IVa2 region and / or of the L5 region, etc.
  • the essential region consists of all or a functional part of the E4 region and it is inserted at or near the El deletion site.
  • the E4 region essential for viral propagation, is inserted in a position other than its original position, so that this region is absent in any construction which would result from recombination with the genome of the production line (cf. FIG. 3).
  • the present invention therefore also relates to a recombinant adenovirus whose genome is characterized by the presence of inactivated El and E4 regions, and in that all or a functional part of the E4 region is inserted at or near the El region .
  • Such an adenoviral vector preferably comprises two ITRs, an encapsidation region, a deletion in the E1 region at the level of which all or a functional part of E4 is inserted, and an E4 region of inactivated origin.
  • the E4 region is involved in the regulation of late gene expression, in the stability of late nuclear RNA, in the quenching of expression of host cell proteins and in the efficiency of DNA replication viral. Mutants lacking E4 are unable to spread. E4 thus constitutes an essential region for viral replication and / or propagation.
  • This E4 region consists of 7 open reading phases, designated ORF1, ORF2, ORF3, ORF4, ORF3 / 4, ORF6 and ORF6 / 7 ( Figure 4).
  • ORF3 and ORF6 are the two genes essential for viral spread. Each of these genes is capable of inducing viral spread.
  • inactivation of the E4 region involves inactivation of ORF3 and ORF6.
  • the entire E4 region is inserted at or near the El deletion site. It may in particular be a Maell-Mscl fragment corresponding to nucleotides 35835-32720.
  • E4 only a functional part of E4, that is to say sufficient to allow viral propagation, is inserted.
  • This part includes at least one functional ORF3 or ORF6 gene.
  • the functional part of E4 consists essentially of ORF3 or ORF6.
  • these coding phases can be isolated from the E4 region in the form of PvuII-AluI and BglII-PvuII fragments respectively, corresponding to nucleotides 34801-34329 and 341 15-33126 respectively.
  • the E4 region or the functional part of this region also comprises a transcription promoter region II can be the promoter of the E4 region or any other functional promoter, such as the viral promoters (El a, SV40, LTR -RSV, etc), eukaryotes or mammal
  • the promoter used is the promoter of the E4 region
  • the functional part of E4 inserted at the level of El does not necessarily correspond to the part of E4 deleted in the original position.
  • the initial region can be inactivated by point mutation (without deletion) and a region Functional E4 inserted at El level
  • the initial E4 region can be entirely deleted and only a functional part inserted at El level
  • the inactivation of the E4 region implies, within the meaning of the invention, the functional inactivation of at least the ORF3 and ORF6 regions. These regions of origin can be inactivated by any technique known to those skilled in the art. In particular, all of the methods given above can be applied to the inactivation of ORF3 and ORF6 or any additional region of E4. For example, the deletion of the E4 region of the virus Ad2 dl808 or of the viruses Ad5 dll004, Ad5 dll007, Ad5 dllQl l or Ad5 dll014 can be used in the context of the invention (cf. example 3)
  • adenoviruses can be obtained for example by co-transfection in a line for producing a first plasmid carrying the left part of the genome of the virus which it is desired to produce (having a deletion in the El region at or near which at least one functional part of E4 is inserted) and a viral genomic DNA fragment bringing the right part of the virus genome (having an inactivated E4 region) After recombination, the viruses produced are amplified and isolated
  • These adenoviruses can also be obtained by permutation of the ends of the genome, comprising the ITRs plus the contiguous region
  • the invention also relates to a recombinant adenovirus characterized in that its genome has an inactivated E1 region and in that the left end, comprising the ITR and the packaging region, and the right end, comprising the ITR and all or a functional part of the E4 region, are permuted More particularly, the left end comprising the left ITR and the packaging region is contained in the first 382
  • the right end comprising '' ITR right and all or a functional part of the E4 region, including the promoter of the E4 region is contained in the last 3215 nucleotides of the genome of the adenovirus Ad5 (for example from the Mscl site at position 32720).
  • Ad5 for example from the Mscl site at position 32720.
  • the genome of the recombinant adenovirus thus obtained is particularly advantageous - since the essential region E4 displaced to the left is maintained in its natural environment and therefore in conditions of optimal activity for a high-titer infectious cycle. In addition, this region now precedes the region whose presence in the genome of production line 293 was at the origin of the appearance of viable particles.
  • the essential region consists of the region coding for the proteins pIX and IVa2 and it is inserted at the level of the E3 region, possibly as a replacement for deleted sequences (cf. FIG. 6). More particularly, the region coding for the proteins pIX and IVa2 is included in a BglII-NruI fragment corresponding to nucleotides 3328 to 6316 on the sequence of the wild-type Ad5 adenovirus.
  • the possible recombination of the recombinant adenovirus with the region of the adenovirus integrated into the production line only generates viral particles which are not viable because they are deleted from the main late genes essential for viability.
  • two essential regions of the genome of the edenovirus are displaced from their original positions. More preferably, these essential regions are represented by the region coding for the protein pIX and the region coding for all or only a functional part of the E4 region. According to a preferred mode, they will be displaced at the level of the E1 region, replacing deleted sequences and retaining or not the orientation of their reading frame.
  • the region coding for the protein pIX is displaced in the deleted region E1, to the right of the left ITR which has become, right end of the recombinant virus.
  • the region coding for the protein pIX is also placed there in reverse reading.
  • the region essential of E4 it is represented there by the genes ORF3-ORF6 / 7, under the control of the promoter E4, and is also inserted there at the level of the deletion site of E 1, between the region coding for the protein pIX and the region coding for the IVa2 protein whose position has not been affected; in the case of the specific construction of FIG. 8, the two regions coding respectively for the pIX protein and the IVa2 protein have distinct polyadenylation sites.
  • Such a construction is particularly advantageous in terms of reliability and safety. Indeed, any parasitic recombination between 2 viral molecules of this type, at the level of the E4 region for example, will lead to a recombinant virus deprived of its encapsidation sequence. Likewise, a recombination between such a viral molecule with the complementary region of dudit adenovirus, integrated into a production cell line, will only generate viral particles deleted from their main late genes, essential for their viability.
  • the recombinant adenoviruses according to the invention advantageously comprise the ITR sequences and a region allowing the encapsidation.
  • the inverted repeat sequences constitute the origin of replication of adenoviruses. They are located at the 3 ′ and 5 ′ ends of the viral genome (cf. FIG. 1), from which they can be easily isolated according to the conventional techniques of molecular biology known to those skilled in the art.
  • the nucleotide sequence of the ITR sequences of human adenoviruses (in particular the Ad2 and Ad5 serotypes) is described in the literature, as well as canine adenoviruses (in particular CAV1 and CAV2).
  • the left ITR sequence corresponds to the region comprising nucleotides 1 to 103 of the genome.
  • the packaging sequence (also called Psi sequence) is necessary for the packaging of the viral genome. This region must therefore be present to allow the preparation of defective recombinant adenoviruses according to the invention.
  • the packaging sequence is located in the genome of wild adenoviruses, between the left ITR and the E1 gene (see FIG. 1). In the adenoviruses of the invention, it can be located next to the left ITR as well as the right ITR (cf. FIG. 5). It can be isolated or artificially synthesized by conventional molecular biology techniques.
  • nucleotide sequence of the packaging sequence of human adenoviruses (in particular of the serotypes Ad2 and Ad5) is described in the literature, thus than canine adenoviruses (notably CAV1 and CAV2).
  • Ad5 adenovirus for example, a functional encapsidation sequence is between nucleotides 194 and 358 of the genome.
  • the adenoviruses according to the invention may have other alterations in their genome.
  • other regions can be deleted to increase the capacity of the virus and reduce these side effects linked to gene & viral expression.
  • all or part of the E3 region in particular can be deleted.
  • Recombinant adenoviruses according to the invention have properties which are particularly attractive for use in gene therapy. These vectors indeed combine very high infection, safety and gene transfer properties.
  • the recombinant adenoviruses of the invention also comprise a heterologous nucleic acid sequence whose transfer and / or expression in a cell, an organ or an organism is sought.
  • the heterologous DNA sequence may include one or more therapeutic genes.
  • the therapeutic genes which can thus be transferred are any gene whose transcription and possibly translation into the target cell generate products having a therapeutic effect.
  • the protein product thus coded can be a protein, a peptide, an amino acid, etc.
  • This protein product can be homologous with respect to the target cell (that is to say a product which is normally expressed in the target cell when the latter presents no pathology).
  • the expression of a protein makes it possible for example to compensate for an insufficient expression in the cell or the expression of an inactive or weakly active protein due to a modification, or else to overexpress said protein.
  • the therapeutic gene can also code for a mutant of a cellular protein, having increased stability, modified activity, etc.
  • the protein product can also be heterologous towards the target cell.
  • an expressed protein can for example supplement or provide a deficient activity in the cell allowing it to fight against a pathology.
  • therapeutic products within the meaning of the present invention, there may be mentioned more particularly enzymes, blood derivatives, hormones, lymphokines: interleukins, interferons, TNF, etc.
  • FR 9203120 growth factors, neurotransmitters or their precursors or synthetic enzymes, trophic factors: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, etc; apolipoproteins: ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc (FR 93 05125), dystrophin or a minidystrophin (FR 9111947), tumor suppressor genes: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc (FR 93 04745) , the genes coding for factors involved in coagulation: Factors VII, VIII, IX, etc., the suicide genes: Thymidine kinase, cytosine desaminase, etc; or all or part of a natural or artificial immunoglobulin (Fab, ScFv, etc.), etc.
  • trophic factors BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF
  • the therapeutic gene can also be an antisense gene or sequence, the expression of which in the target cell makes it possible to control the expression of genes or the transcription of cellular mRNAs.
  • Such sequences can, for example, be transcribed, in the target cell, into RNAs complementary to cellular mRNAs and thus block their translation into protein, according to the technique described in patent EP 140 308.
  • the therapeutic gene may also be a gene coding for an antigenic peptide capable of generating an immune response in humans.
  • the invention therefore makes it possible to produce vaccines making it possible to immunize humans, in particular against microorganisms or viruses.
  • These may in particular be antigenic peptides specific for the epstein barr virus, the HIV virus, the hepatitis B virus (EP 185 573), the pseudo-rabies virus, or even specific for tumors (EP 259 212).
  • the heterologous nucleic acid sequence also comprises a promoter region for functional transcription in the infected cell, as well as a region located 3 ′ of the gene of interest, and which specifies a transcriptional end signal and a site for polyadenylation. All of these elements constitute the expression cassette.
  • the promoter region it may be a promoter region naturally responsible for the expression of the gene considered when it is capable of functioning in the infected cell. They can also be regions of different origin (responsible for the expression of other proteins, or even synthetic).
  • they may be gene promoter sequences eukaryotic or viral. For example, they may be promoter sequences originating from the genome of the cell which it is desired to infect.
  • heterologous nucleic acid sequences may also comprise, in particular upstream of the therapeutic gene, a signal sequence directing the therapeutic product synthesized in the secretory pathways of the target cell. This signal sequence may be the natural signal sequence of the therapeutic product, but it may also be any other functional signal sequence, or an artificial signal sequence.
  • the therapeutic gene expression cassette can be inserted at different sites in the genome of the recombinant adenovirus according to the invention. It can first of all be inserted at the level of the El deletion. In this case, it is located next to (in 5 ′ or 3 ′) the region or the functional part of E4. It can also be inserted at the E3 region, in addition to or in substitution for sequences. It can also be located in the inactivated E4 region
  • the vectors of the invention also have a functional E3 gene under the control of a heterologous promoter. More preferably, the vectors have a part of the E3 gene allowing the expression of the protein gpl9K. This protein in fact makes it possible to prevent the adenovirus vector from undergoing an immune reaction which (i) limits its action and (ii) could have undesirable side effects.
  • the recombinant adenoviruses according to the invention can be of various origins. There are in fact different serotypes of adenoviruses, the structure and properties of which vary somewhat, but which have a comparable genetic organization. Therefore, the teachings described in the present application can be easily reproduced by a person skilled in the art for any type of adenovirus. ⁇ More particularly, the adenoviruses of the invention can be of human, animal, or mixed (human and animal) origin.
  • adenoviruses of human origin it is preferred to use those classified in group C. More preferably, among the various serotypes of human adenovirus 5, it is preferred to use, within the framework of the present invention, adenoviruses of type 2 or 5 (Ad 2 or Ad 5).
  • the adenoviruses of the invention can also be of animal origin, or contain sequences derived from adenoviruses of animal origin.
  • the Applicant has indeed shown that adenoviruses of animal origin are capable of infecting human cells with great efficiency, and that they are unable to propagate in the human cells in which they have been tested (cf. request FR 93 05954).
  • the Applicant has also shown that adenoviruses of animal origin are in no way trans-complemented by adenoviruses of human origin, which eliminates any risk of recombination and of propagation in vivo, in
  • adenoviruses or adenovirus regions of animal origin is therefore particularly advantageous since the risks inherent in the use of viruses as vectors in gene therapy are even lower.
  • the adenoviruses of animal origin which can be used in the context of the present invention can be of canine, bovine, mutine origin (example: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, avian or still simian (example: after-sales service). More particularly, among the avian adenoviruses, mention may be made of serotypes 1 to 10 accessible to ATCC, such as for example the strains Phelps (ATCC VR-432), Fontes (ATCC VR-280), P7-A (ATCC VR- 827), IBH-2A (ATCC VR-828), J2-A
  • ATCC VR-829 25 (ATCC VR-829), T8-A (ATCC VR-830), Kl 1 (ATCC VR-921) or the strains referenced ATCC VR-831 to 835.
  • the various known serotypes can be used , and in particular those available at ATCC (types 1 to 8) under the references ATCC VR-313, 314, 639-642, 768 and 769. Mention may also be made of the urine adenoviruses FL (ATCC VR-550) and E20308 ( ATCC VR-
  • adenoviruses or regions of adenovirus of origin canine, and in particular all the strains of the CAV2 adenoviruses (Manhattan or A26 / 61 strain (ATCC VR-800) for example).
  • Canine adenoviruses have been the subject of numerous structural studies. Thus, complete restriction maps of the CAV1 and CAV2 adenoviruses have been described in the prior art (Spibey et al., J. Gen. Virol. 70 (1989) 165), and the Ela, E3 genes as well as the ITR sequences were cloned and sequenced (see in particular Spibey et al., Virus Res. 14 (1989) 241; Linné, Virus Res. 23 (1992) 11-19, WO 91/1 1525).
  • the defective recombinant adenoviruses according to the invention can be prepared in different ways.
  • a first method consists in transfecting the DNA of the recombinant virus
  • a second approach consists in co-transfecting into a suitable cell line the DNA of the defective recombinant virus prepared in vitro and the DNA of one or more viruses or helper plasmids.
  • it is not necessary to have a competent cell line capable of complementing all the defective functions of the recombinant adenovirus. Part of these functions is in fact complemented by the helper virus or viruses. This or these helper viruses are themselves defective.
  • the preparation of defective recombinant adenoviruses of the invention according to this method is also illustrated in the examples.
  • the present application also describes the construction of plasmids carrying the modified left part of the genome of the Ad5 adenovirus (plasmids of the pCOl-E4 series for example). These plasmids are particularly useful for the construction of recombinant adenoviruses as vectors for gene therapy.
  • the plasmids pCOl-E4 carry the left region of the adenovirus genome, from the left ITR to nucleotide 6316, with a deletion of the region between nucleotides 382-3446, corresponding to the El locus, at the level from which is inserted all or a functional part of E4.
  • Plasmids pC01-E4 can be used to prepare the defective recombinant adenovirus by cotransfection with DNA, preferably of viral origin, corresponding to the right part of the genome of the adenovirus having an inactivated E4 region, in a competent cell line.
  • Ad2 dl808 which is deleted from the E4 region (Weinberg et al., J. Virol. 57 (1986) 833),
  • the invention also relates to a process for the preparation of recombinant adenoviruses devoid of replicating particles according to which a competent cell line is co-transfected with - a first DNA comprising the left part of the genome of said adenovirus, having a deletion in the El region at or near which at least one functional part of the E4 region is inserted, and
  • a second DNA comprising at least the right part of the genome of said adenovirus, having an inactivated E4 region, and a part of adenovirus common with the first DNA, and the adenoviruses are recovered by homologous recombination between said
  • the human embryonic kidney line 293 (Graham et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59). As indicated previously, this line contains in particular, integrated into its genome, the left part of the genome of the human adenovirus Ad5 (12%).
  • the first DNA is chosen from plasmids of the pCOl-E4 type.
  • the first or second DNA used in the method of the invention further carries a heterologous DNA sequence of interest.
  • the plasmids pCOl-E4 thus allow the construction of recombinant adenoviruses carrying a deletion in the E1 region going from nucleotide 382 to nucleotide 3446, at the level of which all or a functional part of E4 is inserted, possibly as well as a therapeutic gene.
  • the present invention also relates to any pharmaceutical composition comprising one or more defective recombinant adenoviruses as described previously.
  • the pharmaceutical compositions of the invention can be formulated for topical, oral, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular, transdermal, etc. administration.
  • the pharmaceutical composition contains pharmaceutically acceptable vehicles for an injectable formulation.
  • pharmaceutically acceptable vehicles for an injectable formulation can be in particular saline solutions (monosodium phosphate, disodium, sodium chloride, potassium, calcium or magnesium, etc., or mixtures of such salts), sterile, isotonic, or dry compositions, in particular lyophilized, which, by addition, as appropriate, of sterilized water or physiological saline, allow the constitution of injectable solutes.
  • the doses of virus used for the injection can be adapted according to various parameters, and in particular according to the mode of administration used, the pathology concerned, the gene to be expressed, or even the duration of the treatment sought.
  • the recombinant adenoviruses according to the invention are formulated and administered in the form of doses of between 10 4 and 10 14 pfu, and preferably 10 6 to 10 10 pfu.
  • the term pfu (“plaque forming unit”) corresponds to the infectious power of a virus solution, and is determined by infection of an appropriate cell culture, and measures, generally after 15 days, the number of plaques of infected cells. The techniques for determining the pfu titer of a viral solution are well documented in the literature.
  • the adenoviruses of the invention can be used for the treatment or prevention of many pathologies, including genetic diseases (dystrophy, cystic fibrosis, etc.), neurodegenerative diseases (alzheimer, parkinson, ALS , etc.), cancers, pathologies linked to coagulation disorders or dyslipoproteinemias, pathologies linked to viral infections (hepatitis, AIDS, etc.), etc.
  • genetic diseases distrophy, cystic fibrosis, etc.
  • neurodegenerative diseases alzheimer, parkinson, ALS , etc.
  • cancers pathologies linked to coagulation disorders or dyslipoproteinemias
  • pathologies linked to viral infections hepatitis, AIDS, etc.
  • Figure 2 Recombination events between the adenovirus and the 293 line.
  • Figure 3 Representation of a type of vector of the invention, and of its recombination with the line 293.
  • Figure 5 Representation of an adenovirus of the invention with permuted ends.
  • E4 + denotes a functional E4 region
  • ⁇ E4 denotes a non-functional E4 region
  • ⁇ denotes an encapsidation sequence.
  • the expression cassette for the gene of interest is not shown but can be inserted as indicated in the text.
  • Figure 6 Representation of a type of vector of the invention (pIX-IVa2)
  • pIX + IVa2 contains at least one functional IVa2 region.
  • ⁇ El ⁇ pIX designates a deletion of the adenovirus sequences between the region ⁇ and the end of the region coding for the protein 140kD (position 5200) of the region E2. This deletion also includes the IVa2 region and concerns the sequence present in the chromosome of line 293 downstream of the E & b region.
  • Figure 7 Restriction map of the HindIII fragment contained in the plasmid pCOl.
  • Figure 8 Representation of the expression plasmids pPY40 and pPY6
  • Figure 9 Representation of the plasmid pGY10
  • Figure 10 Representation of the plasmid pCOl- (ORF6 + ORF7)
  • Figure 1 1 Representation of the plasmids pPY78 and pPY77
  • Figure 12 Representation of plasmids pPY15 and pJYl
  • Figure 13 Representation of a type of virus according to the invention
  • Figure 14 Representation of the plasmids pXL2675 and pXL2757
  • Figure 15 Representation of the restriction maps of plasmids pPY66, pPY82 and pPY75
  • Figures 16 (A): Schematic representation of homologous recombination between the HincP / Ad5 replicon and the plasmid pPY66 and (B).
  • Figure 17 Protocol for generating the HincP / Ad5 viral genome [delE4 (Y + ITR)] via homologous recombination of the two replicons pPY82 and HincP / Ad5 [delE4-
  • Figure 18 Representation of HincP / Ad5 [ITRYdelEl (SacB + SpecR) delE4 (Y + ITR)] and
  • the DNA fragments can be separated according to their size by electrophoresis in agarose or acrylamide gels, extracted with phenol or with a phenol / chloroform mixture, precipitated with ethanol and then incubated in the presence of DNA ligase phage T4 (Biolabs) according to the supplier's recommendations
  • the filling of the prominent 5 'ends can be carried out by the Klenow fragment of E coli DNA Polymerase I (Biolabs) according to the supplier's specifications
  • Destruction of the 3' ends prominent is carried out in the presence of DNA Polymerase from phage T4 (Biolabs) used according to the manufacturer's recommendations
  • Destruction of the prominent 5 ′ ends is carried out by a gentle treatment with nuclease S 1
  • Mutagenesis directed in vitro by synthetic oligodeoxynucleotides can be carried out according to the method developed by Taylor et al [Nucleic Acids Res 1_3 (1985) 8749-8764] using the kit distributed by Amersham
  • the enzymatic amplification of DNA fragments by the technique called PCR can be performed using a "DNA thermal cycler "(Perkin Elmer Cetus) according to the manufacturer's specifications
  • Verification of the nucleotide sequences can be carried out by the method developed by Sanger et al [Proc. Natl Acad Sci USA, 74 (1977) 5463-5467] using the kit distributed by Amersham
  • the EcoRI-Xbal fragment corresponding to the left end of the genome of the Ad5 adenovirus was first cloned between the EcoRI and Xbal sites of the vector pIC19H. This generates the plasmid pCA.
  • the plasmid pCA was then cut by Hinfl, its prominent 5 'ends were filled with the klenow fragment of DNA polymerase I from E. coli, then it was cut by EcoRI.
  • the fragment thus generated of the plasmid pCA which contains the left end of the genome of the adenovirus Ad5 was then cloned between the EcoRI and Smal sites of the vector pIC20H (Marsh et al., Gene 32 (1984) 481).
  • the plasmid pCB was then cut with EcoRI, its prominent 5 'ends were filled in with the klenow fragment of DNA polymerase I from E. coli, then it was cut with BamHI.
  • the fragment thus generated of the plasmid pCB which contains the left end of the genome of the adenovirus Ad5 was then cloned between the NruI and BglII sites of the vector pIC20H. This generates the plasmid pCE, an interesting characteristic of which is that it has the first 382 base pairs of the adenovirus Ad5 followed by a cloning multisite.
  • the Sau3A (3346) - SstI (3645) fragment and the SstI (3645) - Narl (5519) fragment of the Ad5 adenovirus genome were first ligated and cloned between the ClaI and BamHI sites of the vector pIC20H, this which generates the plasmid pPY53.
  • the Sall-Taql fragment of the plasmid pPY53 prepared from a dam- context, containing the part of the genome of the adenovirus Ad5 between the Sau3A (3346) and Taql (5207) sites was then cloned between the SalI and ClaI of the vector pIC20H, which generates the plasmid pCA '.
  • the Narl (5519) - NruI (6316) fragment of the genome of the Ad5 adenovirus prepared from a dam context and the Sall-Narl fragment of the plasmid pCC were then ligated and cloned between the SalI and NruI sites of the vector. pIC20R. This generates the plasmid pCD '.
  • This example describes the construction of plasmids of the pCOl-E4 type, that is to say of plasmids obtained by incorporating all or a functional part of the E4 region of an adenovirus in the plasmid pCOl (Example 1).
  • the plasmid pPY2 corresponds to the cloning of the Avr2-Sall fragment (approximately 1.3 kb including the promoter / LTR of the MMTV virus) of the plasmid pMSG (Pharmacia) between the Xbal and Sali sites of the plasmid pIC20H prepared from an E. coli context dam +.
  • the plasmid pPY4 is derived from the plasmid pPY2 by deletion of a fragment of 35 bp after cleavage with BamHI and Bgl2 then religation.
  • the plasmid pPY5 corresponds to the cloning of the Taql-Bgl2 fragment (position 35576- 32490) including the E4 region of Ad5 between the ClaI and BamHI sites of the plasmid pIC20H.
  • the entire E4 region of Ad5 is therefore now bordered by EcoRV and Sphl sites originating from the cloning multisite. Partial digestion of the plasmid pPY5 with EcoRV and then digestion with Sphl makes it possible to purify an EcoRV-Sphl fragment of approximately 3.1 kb including the entire E4 region of Ad5.
  • the plasmid pPY6 * is identical to the plasmid pPY6 with the exception of the Xbal site which was destroyed after cutting by filling with the Klenow fragment of DNA polymerase from E coli (Biolabs), then religation.
  • the plasmid pPY6 * therefore contains the entire E4 region (from the Taql site at position 35576 and up to position 32490 located approximately 300 bp after the polyadenylation site) expressed under the control of the LTR promoter of the RSV virus.
  • the plasmid pFG144 [FL Graham et al. EMBO J. (1989) 8 2077-2085] contains in particular a Sau3A fragment of 1162 bp including the right end of the Ad5 genome from position 34773 This fragment is then cloned into the BamHI site of the plasmid pIC20H which generates the plasmid pGY9 in which the Sau3A fragment is now included in a BamHI-EcoRI fragment of 1184 bp due to the orientation of the fragment relative to the vector This fragment is then purified by electroelution, cut by Avril, then subjected to partial hydrolysis by the enzyme Maell.
  • One of the restriction products corresponds to the Maell (35835) -AvrII (35463) fragment which includes the promoter of the E4 region of AdS and up to the limit of the right ITR.
  • This 372 bp fragmen is then purified by electroelution and ligated in the presence of the AvrII-SalI fragment of the plasmid pPY6 * between the ClaI and SalI sites of the plasmid pCOI which generates the plasmid pGYlO (FIG. 9) which is of the pCOI-E4 type ( Figure 7).
  • the plasmid pPY6 is the source of an Xhol-Sall fragment of approximately 4.5 kb corresponding to the LTR expression cassette MMTV / E4.
  • the cloning of this cassette at the SalI site of the plasmid pCOl generates the plasmid pCOl-MMTV / E4 (2 possible orientations of the E4 region with respect to the ITR and of the sequence ⁇ ) which is of the pCOl-E4 type.
  • Cloning of the Xbal fragment (approximately 1 kb) of the plasmid pGRE5.1 included an expression cassette composed of a minimal promoter highly inducible to glucocorticoids and of a polyadenylation signal [Mader and White Proc. Natl. Acad. Sci. (1993) 90 5603-5607],
  • the cloning of this fragment between the Xbal sites of the plasmid pIC20H prepared from a dam context generates the plasmid pPY21 in which the 5 binding sites for the glucocorticoid receptor are now located at immediate proximity to the Bgl2 site from the cloning multisite.
  • the plasmid pPY21 is the source of a Bgl2-EcoRI fragment of approximately 0.8 kb corresponding to the minimal promoter highly inducible to glucocorticoids. The cloning of this fragment between the Bgl2 and EcoRI sites of the plasmid pIC20H generates the plasmid pPY26.
  • the plasmid pPY5 is the source of an EcoRV-Hind3 fragment of approximately 0.65 kb which includes the Taql-Hind3 fragment from positions 35576 to 34930 on the genome of the Ad5.
  • the cloning of this fragment between the EcoRV and Hind3 sites of the plasmid pIC20R generates the plasmid pPY24 in which an EcoRI site is now located close to the Taql site (position 35576).
  • This plasmid is the source of an EcoRI -Sphl fragment of approximately 3.1 kb which comprises the entire E4 region of Ad5 at positions- 5576 to 32490.
  • the expression cassette pGRE5 / E4 of the plasmid pPY40 is available in the form of a Bgl2-SalI fragment of approximately 3.9 kb, the cloning of which between the BamHI and SalI sites of the plasmid pCOl generates the plasmid pCOl-pGRE5 / E4 which is pCOl-E4 type ( Figure 7).
  • 35835 to 35464 is purified by electroelution after partial hydrolysis by Mae2 and total hydrolysis by Avr2. This fragment is then hydrolyzed by Taql and the Mae2-Taql fragment (positions 35835 to 35576) is cloned in the presence of the ClaI-SalI fragment (1.65 kb) originating from the plasmid pGY47 'between the ClaI and SalI sites of the plasmid pCOl.
  • One of the reaction products corresponds to the plasmid pCOl- (ORF6 + ORF7) ( Figure 10) which is of the pCOl-E4 type.
  • the sequence located between the stop codon of ORF7 and the Bgl2 site (up to position 32490 which includes the polyadenylation site of E4) is deleted and replaced by a heterologous polyadenylation site.
  • the Fragment Xbal -Sali (about 0.25 kb) corresponding to the signal SV40 virus late polyadenylation is isolated from the plasmid pGL3 and cloned between the corresponding sites of the plasmid pIC20H prepared from a dam + context, which generates the plasmid pPY76.
  • This plasmid is the source of a Kpnl-Sall fragment ( about 0.7 kb including the sequences between positions 33598 to 32891), the cloning of which between the corresponding sites of the plasmid pC ⁇ l- (ORF6 + ORF7) generates the plasmid pPY78 ( Figure 11) which is of the pCOl-E4 type.
  • This plasmid is the source of a Kpnl-Sall fragment (approximately 0.5 kb including the sequences between positions 33598 to 33126) whose cloning between the corresponding sites of the plasmid pCOl- (ORF6 + ORF7) generates the plasmid pCOl- (ORF ⁇ ) which is of the pCOl-E4 type.
  • ORF3 sequence only A plasmid of the pC01-E4 type in which only the ORF3 reading phase of the E4 region is also present can be constructed in an analogous manner. Indeed, it is known that the mere expression of ORF3 is sufficient to complement viruses deleted for the E4 region.
  • the Bgl2-Xbal fragment (approximately 1.65 kb) of the plasmid pPY6 includes the sequence of Ad5 between positions 34115 and 32490 (ORF6 + ORF7 from the E4 region). The cloning of this fragment between the Bgl2 and Xbal sites of the plasmid pIC20H generates the plasmid pPY13.
  • This plasmid now includes the E4 subregion (ORF6 + ORF7) of Ad5 in an Xhol-Sphl fragment of approximately 1.65 kb. The cloning of this fragment between the SalI and Sphl sites of the plasmid pPY4 generates the plasmid pPY15 (FIG.
  • the Bgl2-SalI fragment of the plasmid pPY13 (approximately 1.65 kb) includes the E4 subregion (ORF6 + ORF7) of Ad5.
  • the cloning of this fragment between the BamHI and SalI sites of the plasmid pIC20H generates the plasmid pPY45 in which the subregion (ORF6 + ORF7) is now included in an EcoRl-Sphl fragment of about 1.65 kb.
  • the cloning of this fragment between the EcoRI and Sphl sites of the plasmid pPY26 generates the plasmid pJYl (FIG.
  • This example describes the construction of recombinant adenoviruses carrying a deletion in the E1 region going from nucleotide 382 to nucleotide 3446, an inactivated E4 region, and all or a functional part of E4 inserted in the E1 deletion.
  • Plasmids of the pCOI-E4 type can for example be cotransfected in 293 cells in the presence of a genome viral carrying a modification / deletion in the E4 region so that this region is nonfunctional (mutation in ORF3 and ORF6 at least). Such viruses are therefore not viable in a line which does not functionally transcomplement the E4 region. viruses can be previously propagated in the line W162 [Weinberg and Ketner Proc. Natl. Acad. Sci. (1983) 80: 5383-5386], or in one of the lines 293 E4 + described in patent FR.
  • viruses include the Ad2dl808 [Challberg and Ketner Virology (1981) 1_14: 196-209], Ad5dll004, Ad5dll007, or Ad5dll014 [Bridge and Ketner J. Virol. (1989) 63: 631-638] viruses, or again Ad5dll011 [Bridge et al. Virology (1993) 193: 794-801] etc.
  • viruses are therefore characterized by the presence of the left ITR and a functional packaging sequence (sequence ⁇ , nucleotide 1-382 for example), followed by a functional E4 region (whole or at least ORF3 or ORF6) expressed from a functional promoter and for example the original promoter of the E4 region [included in the Taql (35576) - MaeII (35835) J fragment, or an inducible promoter, followed by the region located downstream from the Sau3A site located at position 3446 of the Ad5 genome, and continuing up to the right ITR and therefore including the deletion of the E4 function present in the starting E4 "virus (FIG. 13).
  • E1" E4 + viruses characterized by an E4 deletion on the right of the genome originating from the virus Ad5dll01 1 can be propagated in line 293 at titers greater than 10 ⁇ PFU / ml.
  • the Bcll-Avr2 fragment (approximately 0.5 kb) originating from the plasmid pFG144 corresponds to the right end of the AdS genome from the Avr2 site at position 35464.
  • the cloning of this fragment between the sites Xbal and BamHI of the plasmid pIC19H prepared from an E. coli dam context generates the plasmid pPY23.
  • This plasmid is the source of a Sall-Hae3 fragment of approximately 320 bp including the right end of the Ad5 genome up to the Hae3 site at position 35617.
  • the cloning of this fragment between the Xhol and EcoRV sites of plasmid pIC20H generates the plasmid pPY29.
  • the Bgl2-Smal fragment corresponding to the Ad5 genome between positions 32490 and 33093 is then cloned between the BamHI and Smal sites of the plasmid pPY29 which generates the plasmid pPY64.
  • This plasmid is the source of an Xbal-Hind3 fragment, the cloning of which between the corresponding sites of the multi-cloning site of the plasmid pXL2675 (FIG. 14) generates the plasmid pPY65.
  • Plasmid pXL2675 (2513 bp) is a ColEl-type replicon (included in the BsAl-Pvu2 fragment of approximately 1.15 kb and originating from the commercial plasmid pBKS +) having a gene conferring resistance to kanamycin (originating from Tn5, plasmid Pharmacia pUCKXXX ) at E. -coli and a multisite of synthetic cloning.
  • Plasmid pXL2757 ( Figure 14) is the source of a Smal -EcoRV fragment of approximately 4 kb containing the sacB gene of B. subtilis and a gene conferring resistance to spectinomycin in E. coli.
  • the cassette (SacB + SpecR) of this fragment cloned into the SmaI site of the plasmid pPY65 generates the plasmid pPY66 ( Figure 15).
  • the plasmid pPY66 can be used to introduce the cassette (SacB + SpecR) by homologous recombination with a viral genome derived from Ad5 and included in a functional replicon in E. coli polA.
  • the technology described in patent application FR 95 016323, is based on the use of certain properties of replication in E. coli. Indeed, the replicons of the HincP incompatibility class (and for example RK2) replicate in the absence of the enzyme coded by the polA gene. Conversely, replicons of the ColEl type (plasmids of the pUC, pIC, pBR, etc.) need this enzyme to replicate.
  • the Ad5 genome derived from the plasmid pFG144 was first cloned on the plasmid RK2 (of the HincP class) and then introduced by electroporation into a strain of E. coli mutated in the polA gene.
  • the Xbal fragment which contains the ColEl replicon (pBR) included in place of the E3 region in the plasmid pFG144 was then deleted from the genome (Patent Application FR 95 016323). This generates the strain of E. coli called E. coli polA / Ad5.
  • An important point is that the adenoviral genome present in this strain is bordered by Pacl sites on either side of the ITRs and that such genomes are infectious after transfection into 293 cells.
  • the introduction of the cassette (SacB + SpecR) by homologous recombination in E. coli polA / Ad5 is carried out as follows: a) The plasmid pPY66 is first introduced by electroporation in E. coli polA / Ad5. Selection in the presence of spectinomycin and kanamycin is carried out. The resistant clones then correspond to the formation of a cointegrate between the HincP / Ad5 replicon and the plasmid pPY66. In almost all cases, the plasmid pPY66 was inserted by a homologous recombination event between the two types of replicon.
  • a clone corresponding to the result of a recombination at the E4 region between positions 32490 to 33093 (603 bp) is then isolated (FIG. 16 A).
  • This bacterial clone has a "direct repetition" of the sequences (A and B) on either side of the cassette (SacB + SpecR): 603 bp on the one hand and 320 bp (right end of the genome) on the other hand.
  • the presence of such sequences is a source of instability and gives rise to rare homologous recombination events on either side of the cassette (SacB + SpecR).
  • the Sall-Smal fragment originating from the plasmid pPY6 * and corresponding to the genome of Ad5 of positions 32490 to 33093 is first cloned between the corresponding sites of the plasmid pCO7 which generates the plasmid pPY81
  • the plasmid pCO7 obtained after total restriction of the plasmid pCOl by Pstl and religation, therefore contains the left end of l ⁇ d5 up to position 382, the multi-cloning site of plasmid pCOl, followed by the sequence of Ad5 from positions 3446 up to the Pstl site located at position 3788.
  • the plasmid pPY81 is the source of an H3-Xbal fragment of about 1.4 kb, the cloning of which between the corresponding sites of the plasmid pXL2675 generates the plasmid pPY82, a restriction map of which is given in Figure 15. 4.2. 2 Construction of the viral genome in E. coli
  • the introduction of the sequence ⁇ in the immediate vicinity of the right ITR is also done by homologous recombination after introduction of the plasmid pPY82 by electroporation in E. coli generates the viral genome HincP / Ad5 [delE4 ( ⁇ + ITR)]
  • the event of replicon fusion is first selected in the presence of kanamycin.
  • a clone corresponding to a homologous recombination event between sequences 32490 and 33093 common to the two replicons is then isolated ( Figure 16B).
  • the ejection event of the ColEl replicon (originating from the plasmid pXL2675) is then amplified by lifting the selection with kanamycin for a sufficient number of generations.
  • Glucose as carbon source is then replaced by sucrose and the bacterial clones are isolated for which the event of ejection of the ColEl replicon occurred by homologous recombination at the ITR level which generates the HincP viral genome. / Ad5 [delE4 ( ⁇ + ITR)] ( Figure 16B). A clone corresponding to this event is then isolated: E. coli polA / Ad5 [delE4 ( ⁇ + ITR)].
  • the Hind3-EcoRV fragment (approximately 0.4 kb) of the plasmid pCOl includes the left end of the viral genome up to position 382.
  • the cloning of this fragment between the corresponding sites of the plasmid pXL2675 generates the plasmid pPY83.
  • the plasmid pCOlDSal is obtained after digestion of the plasmid pCOlDS (prepared in a dam + context) with the enzyme Xbal, treatment with the Klenow fragment of DNA polymerase I of E. coli, then religature.
  • This plasmid is the source of a BamHI -Nsil fragment of approximately 1 kb which includes the sequences of Ad5 at positions 3446 to 4419 (Nsil site).
  • the cloning of this fragment between the BamHI and Pst1 sites of the plasmid pIC20R generates the plasmid pPY86 wherein the sequences between the positions 3446 to 4419 ⁇ are now included in a BamHI-Bgl2 fragment cloning of this fragment into the BamHI site of the plasmid pPY83 generates the plasmid pPY87.
  • the SmaI -EcoRV fragment corresponding to the cassette (SacB + SpecR) of the plasmid pXL2757 is then cloned into the EcoRV site of the plasmid pPY87, which generates the plasmid pPY88 (FIG. 17).
  • This plasmid is used to replace, according to a procedure analogous to the procedure described in FIG. 16 A, the left part of the HincP / Ad5 genome [delE4 ( ⁇ + ITR)] by the corresponding part coming from the plasmid pPY88, which generates the viral genome noted
  • HincP / Ad5 [ITR ⁇ delEl (SacB + SpecR) delE4 ( ⁇ + ITR)] whose structure is given in Figure 18. 5.2. Deletion of the ⁇ sequence and introduction of a functional E4 region.
  • the right end of the adenovirus genome was amplified by PCR with the oligonucleotides 5'-
  • the PCR amplification therefore generates a fragment of 418 bp corresponding to the right end of the AdS and into which a Pacl site and then an EcoRI site were introduced immediately upstream of the ITR, while a Pstl site is found located in the immediate vicinity of position 35517.
  • the cloning of this fragment between the EcoRI and Pst1 sites of the plasmid pUC19 generates the plasmid pXL2624 (see patent application FR.95 016323).
  • the EcoRI -Taql fragment of the plasmid pXL2624 corresponding to the right end of the viral genome from the Taql site at position 35576 is cloned between the EcoRI and ClaI sites of the plasmid pGY47 ', which generates the plasmid pPY89.
  • This plasmid is the source of an EcoRI -Sali fragment of approximately 2 kb including the right end of the viral genome up to position 35576, then the E4 sub-region (ORF6 + ORF7) of positions 341 to 32490.
  • the Kpnl-Sstl fragment (approximately 0.95 kb) of the plasmid pPY78 corresponds to the C-terminal part of the E4 region between positions 32891 to 33598, immediately followed by the "late polyadenylation signal of the SV40 virus.
  • the cloning of this fragment between the corresponding sites of the plasmid pPY89 generates the plasmid pPY90
  • This plasmid is the source of an EcoRI -Sali fragment of approximately 2 kb including the right end of the viral genome up to position 35576, then the E4 sub-region (ORF6 + ORF7) of positions 34115 to 32891.
  • the plasmids pGY50 'or pPY90' are used to replace, according to a procedure analogous to the procedure described in FIG. 16B, the left part of the HincP / Ad5 genome [ITR ⁇ delEl (SacB + SpecR) [delE4 ( ⁇ + ITR)] by the corresponding part from said plasmids.
  • the plasmid pPY32 is described in patent application Fr. 94 04590 (04/18/94).
  • This plasmid is the source of a Bgl2-Hind3 fragment of approximately 0.65 kb corresponding to the right end of the Ad5 genome from the Bgl2 site (position 32490) and deleted between the Mae2 sites (position 3281 1) up to 'at the Hae3 site (position 35617).
  • the cloning of this fragment between the BamHI and Hind3 sites of the plasmid pXL2675 generates the plasmid pPY70, a restriction map of which is given in Figure 19.
  • This plasmid can be used to introduce the corresponding E4 deletion by homologous recombination, for example in E. coli polA / Ad5 [delE4 (SacB + SpecR)].
  • the plasmid pGY12 corresponds to the cloning of the BssH2-Mscl fragment (positions 33249-32720) between the BssH2 and EcoRV sites of the commercial plasmid pSL1180 ( Figure 20).
  • the cloning of EcoRI -Taq 1 fragments from the plasmid pXL2624 (this fragment corresponds to the right end of the Ad5 genome up to the Taql site at position 35576) and Taql-BssH2 (positions 35576 to 33249) between the EcoRI sites and BssH2 of the plasmid pGY12 generates the plasmid pGY13.
  • This plasmid is therefore the source of an EcoRI -Hpal fragment (approximately 3.25 kb) including the right end of the Ad5 genome up to position 32720.
  • the cloning of this fragment between the EcoRI and Smal sites of the plasmid pIC20H generates the plasmid pGY14 ( Figure 20).
  • This plasmid is the source of an EcoRI -BspH1 fragment corresponding to the right end of the Ad5 genome up to position 34700.
  • the Sphl-Taql fragment located between positions 31224 to 33055 on the Ad5 genome is purified from the plasmid pMC2 and then cloned between the Sphl and ClaI sites of the plasmid pIC20H, which generates the plasmid pYJ5.
  • this plasmid is the source of a Bgl2-Xbal fragment which includes the viral genome sequence located between positions 32490 to 33055. This Bgl2-Xbal fragment is then cloned with the Avr2 fragment.
  • This plasmid can be used to introduce the corresponding E4 deletion by homologous recombination, for example in E. coli polA Ad5 [delE4 (SacB + SpecR)].
  • the plasmid pMC2DSmal is obtained after total digestion of the plasmid pMC2 with Smal then religation.
  • This plasmid is the source of a Bgl2-Hind3 fragment of approximately 1.2 kb including the entire right end of the Ad5 genome from position 32490 and deleted in the E4 region between positions 33093 and 35356.
  • the cloning of this fragment between the BamHI and Hind3 sites of the plasmid pXL2675 generates the plasmid pPY72, a restriction map of which is given in Figure 19.
  • This plasmid can be used to introduce the corresponding E4 deletion by homologous recombination, for example in E. coli polA / Ad5 [delE4 (SacB + SpecR)].
  • Smal-Smal deletion (33093-35356)
  • the BamHI -EcoRI fragment of the plasmid pGY9 (approximately 1.2 kb) includes the right end of the Ad5 genome from the Sau3A site at position 34773.
  • This restriction fragment is purified by electroelution, cut by SmaI, then subjected to a partial hydrolysis by the enzyme Mae2.
  • One of the restriction products corresponds to the Maell (35835) -SmaI (35356) fragment.
  • the cloning of this fragment between the SmaI and ClaI sites of the plasmid pPY82 generates the plasmid pPY75 ( Figure 15).
  • This plasmid can be used to introduce the corresponding E4 deletion by homologous recombination, for example in E. coli polA / Ad5 [delE4 (SacB + specR) ( ⁇ + ITR)].
  • the Taql fragment of the plasmid pPY82 which includes positions 32490 (SalI site of the cloning multisite) at 33055 is cloned into the ClaI site of the plasmid pIC20H which generates the plasmid pICTaq in which the Xhol site of the multisite is positioned in the immediate vicinity of the position 32490.
  • the plasmid pICTaq is the source of an Xhol-Smal fragment including positions 32490 to 33055, the cloning between the SalI and Smal sites of the plasmid pPY75 generates the plasmid pPY91 ( Figure 21).
  • Hpa2-Smal deletion (32980-35356)
  • the Sall-Hpa2 fragment of the plasmid pPY82 which includes positions 32490 to 32980 is cloned between the SalI and ClaI sites of the plasmid pIC20H which generates the plasmid pPY93.
  • This plasmid is the source of a Sali -EcoRV fragment including positions 32490 to 32980, the cloning of which between the Sali and. Smal of the plasmid pPY75 generates the plasmid pPY94 ( Figure 21).
  • the Sau3A fragment of the plasmid pPY82 which includes positions 32490 to 32891 is cloned into the BamHI site of the plasmid pIC20H which generates the plasmid pICSau in which the SalI site of the multisite is positioned in the immediate vicinity of position 32490.
  • the plasmid pICSau is the source of a SalI -Smal fragment including positions 32490 to 32891, the cloning of which between the corresponding sites of the plasmid pPY75 generates the plasmid pPY92 (FIG. 21).
  • Example 7 Protocol for transfection of the 293 cells by the recombinant genomes constructed in E. Coli according to Examples 4 and 5.
  • the construction of the plasmids described according to examples 4 and 5, or of analogous plasmids which, for example, are characterized by different E4 deletions, or by modified functional E4 regions, or for example corresponding to the introduction of an expression cassette of a given therapeutic gene ect ..., are used to generate the recombinant viral genomes by homologous recombination in E. coli polA After verification by restriction, a bacterial clone is then isolated and its plasmid content is extracted and purified.
  • the DNA is then subjected to a total digestion with the enzyme Pacl and transfected into the 293 cells.
  • This DNA is infectious (virus E1-E4 +) and a cytopathic effect (CPE) appears after approximately 2 weeks.
  • the CPE is then gradually amplified in cells 293 and a viral stock is prepared (cf. Patent Application FR 016323).
  • the plasmid pIC-pIX-pA was constructed by cloning of the EcoRV-Eagl fragment of pCR2-pIX and of the Eagl-BamHI fragment of the plasmid pCI (Promega) containing the SV40 polyA in the plasmid pIC20R digested with EcoRV and BamHI.
  • the plasmid pCR2-IVa2 was constructed by cloning into the plasmid PCR2 (Invitrogen) of the product of amplification by PCR of the plasmid pCOl with the oligonucleotides 5'-AAGCTTATTGCCATCATTATGGAC-3 '(SEQ ID No. 6) and 5'- ACTAGTTATTTAGGGGTTTTGCGC-3' (SEQ ID No. 7).
  • the plasmid pIC-IVa2-pA was constructed by cloning of the Hind3-Spel fragment of pCR2-IVa2 and of the Xbal -Sphl fragment of the plasmid pCDNA3 (Invitrogen) containing the signal for polyadenylation of the bovine growth hormone gene, in the plasmid pIC20R digested with Hind3 and Sphl.
  • the BstXl-Sall fragment of the plasmid pIC-IVa2-pA was then cloned between the BstXl-Sall sites of the plasmid pCOl, thus creating the plasmid pCOl-_pIX.
  • the plasmid pCOl-pIX was constructed by introducing the ClaI cassette of pIC-pIX-pA into the ClaI site of pCOl-_pIX, so that the gene coding for pIX is oriented in the same direction as that coding for IVa2, unlike its orientation in the adenoviral genome
  • the plasmid pCOl-pIX therefore contains the ITR- ⁇ sequences of Ad5, a cassette for expression of the virus pIX (promoter and pIX gene followed by the SV40 polyA) oriented in the opposite direction from its natural orientation to the within Ad5, followed by sequences of IVa2 whose polyA has been replaced by that of bovine growth hormone
  • the recombinant virus was constructed "in a conventional manner" by cotransfection in cells 293 of the plasmid pCOl-pIX linearized with Xhol and by the viral DNA of the AdRS VBGal virus digested by Cla 1
  • NAME RHONE POULENC RORER S.A.

Abstract

La présente invention concerne de nouveaux vecteurs viraux dérivés des adénovirus, leur préparation et leur utilisation en thérapie génique. Elle concerne préférentiellement des adénovirus recombinants comprenant un génome d'adénovirus (i) dont la région E1 est inactivée, (ii) dont l'organisation génomique est modifiée et (iii) dont la recombinaison éventuelle avec le génome de la lignée de production conduit à la génération de particules virales non-viables.

Description

ADENOVIRUS DEPOURVUS DE PARTICULES CONTAMINANTES VIABLES.
PREPARATION ET UTILISATIONS
La présente invention concerne de nouveaux vecteurs viraux, leur préparation et leur utilisation en thérapie génique. Elle concerne également les compositions pharmaceutiques contenant lesdits vecteurs viraux. Plus particulièrement, la présente invention concerne des adenovirus recombinants comme vecteurs pour la thérapie génique.
La thérapie génique consiste à corriger une déficience ou une anomalie (mutation, expression aberrante, etc) par introduction d'une information génétique dans la cellule ou l'organe affecté. Cette information génétique peut être introduite soit in vitro dans une cellule extraite de l'organe, la cellule modifiée étant alors réintroduite dans l'organisme, soit directement in vivo dans le tissu approprié. Dans ce second cas, différentes techniques existent, parmi lesquelles des techniques diverses de transfection impliquant des complexes d'ADN et de DEAE-dextran (Pagano et al., J.Virol. 1 (1967) 891), d'ADN et de protéines nucléaires (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), d'ADN et de lipides (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), l'emploi de liposomes (Fraley et al., J.Biol.Chem. 255 (1980) 10431), etc. Plus récemment, l'emploi de virus comme vecteurs pour le transfert de gènes est apparu comme une alternative prometteuse à ces techniques physiques de transfection. A cet égard, différents virus ont été testés pour leur capacité à infecter certaines populations cellulaires. En particulier, les rétrovirus (RSV, HMS, MMS, etc), le virus HSV, les virus adéno-associés, et les adenovirus.
Parmi ces virus, les adenovirus présentent certaines propriétés intéressantes pour une utilisation en thérapie génique. Notamment, ils ont un spectre d'hôte assez large, sont capables d'infecter des cellules quiescentes, ne s'intègrent pas au génome de la cellule infectée, et n'ont pas été associés à ce jour à des pathologies importantes chez l'homme. Les adenovirus ont ainsi été utilisés pour transférer des gènes d'intérêt dans le muscle (Ragot et al., Nature 361 (1993) 647), le foie (Jaffe et al., Nature genetics 1 (1992) 372), le système nerveux (Akli et al.. Nature genetics 3 ( 1993) 224), etc.
Les adenovirus sont des virus à ADN double brin linéaire d'une taille de 36 kb environ. Leur génome comprend notamment une séquence inversée répétée (ITR) à chaque extrémité, une séquence d'encapsidation (Psi), des gènes précoces et des gènes tardifs (Cf figure 1 ). Les principaux gènes précoces sont contenus dans les régions El, E2, E3 et E4. Parmi ceux-ci, les gènes contenus dans la région El (El a et Elb notamment) sont nécessaires à la réplication virale. Les régions E4 et L5 par exemple sont elles impliquées dans la propagation virale. Les principaux gènes tardifs sont contenus dans les régions Ll à L5. Les génome de l'adénovirus Ad5 a été entièrement séquence et est accessible sur base de données (voir notamment Genebank M73260). De même des parties, voire la totalité du génome d'adénovirus de sérotypes différents (Ad2, Ad7, Adl2, etc) ont également été séquencées.
Compte tenu des propriétés des adenovirus mentionnées ci-dessus, ceux-ci ont déjà été utilisés pour le transfert de gènes in vivo. A cet effet, différents vecteurs dérivés des adenovirus ont été préparés, incorporant différents gènes (β-gal, OTC, α-
1AT, cytokines, etc). Dans chacune de ces constructions, l'adénovirus a été modifié de manière à le rendre incapable de réplication dans la cellule infectée. Ainsi, les constructions décrites dans l'art antérieur sont des adenovirus délétés des régions El (El a et/ou Elb) et éventuellement E3 au niveau desquelles sont insérées les séquences d'ADN hétérologue (Levrero et al., Gène 101 (1991) 195; Gosh-Choudhury et al..
Gène 50 (1986) 161). D'autres constructions comportent une délétion au niveau de la région El et d'une partie non essentielle de la région E4 (WO94/ 12649). Néanmoins, les vecteurs décrits dans l'art antérieur présentent certains inconvénients qui limitent leur exploitation en thérapie génique. En particulier, les lots de virus recombinants du type de ceux décrits dans l'art antérieur peuvent être contaminés par des particules réplicatives, notamment de type sauvage.
Actuellement, les vecteurs dérivés des adenovirus sont en effet produits dans une lignée de complémentation (lignée 293) dans laquelle une partie du génome de l'adénovirus a été intégrée. Plus précisément, la lignée 293 contient l'extrémité gauche (environ 11-12%) du génome de l'adénovirus sérotype 5 (Ad5), comprenant l'ITR gauche, la région d'encapsidation et la région El, incluant El a, Elb et une partie de la région codant pour la protéine pIX. Cette lignée est capable de trans-complémenter des adenovirus recombinants défectifs pour la région El, c'est-à-dire dépourvus de tout ou partie de la région El, nécessaire à la réplication. En effet, les adenovirus recombinants El- peuvent être préparés dans les cellules 293 du fait de la bonne trans¬ complémentation de la région El contenue dans cette lignée. Néanmoins, il existe des zones d'homologie entre la région de l'adénovirus intégrée dans le génome de la lignée et l'ADN du virus recombinant que l'on souhaite produire. De ce fait, au cours de la production, différents événements de recombinaison peuvent se produire, générant des particules virales réplicatives, notamment des adenovirus de type E1+. Comme indiqué sur la figure 2, il peut s'agir d'un événement simple de recombinaison suivi d'une cassure du chromosome (figure 2A), ou d'une double recombinaison (figure 2B). Ces deux types de modification conduisent à remplacer la partie gauche de l'ADN recombinant, dépourvue d'une région El fonctionnelle, par la partie correspondante présente dans le génome de la cellule, qui porte une copie fonctionnelle de la région El . Par ailleurs, compte tenu des titres élevés de vecteur recombinant produits par la lignée 293 (supérieur à Î O'^ la probabilité que ces événements de recombinaison aient lieu est élevée. De fait, il a été constaté que de nombreux lots de vecteurs adénoviraux recombinants défectifs étaient contaminés par des particules virales réplicatives
La contamination par des particules réplicatives constitue un inconvénient important. En effet, la présence de telles particules dans des compositions thérapeutiques induirait in vivo une propagation virale et une dissémination incontrôlée, avec des risques de réaction inflammatoire, de recombinaison, etc. Les lots contaminés ne peuvent donc être utilisés en thérapie humaine.
La présente invention permet de remédier à ces inconvénients. La présente invention décrit en effet de nouvelles constructions permettant la production d'adénovirus recombinants défectifs dépourvus de toute contamination par des particules réplicatives. La présente invention décrit également une méthode pour la production des ces adenovirus recombinants. Elle fournit ainsi de nouveaux vecteurs recombinants défectifs dérivés des adenovirus, particulièrement appropriés pour un usage en thérapie génique, notamment pour le transfert et l'expression de gènes in vivo.
La présente invention réside plus particulièrement dans la construction d'adénovirus recombinants défectifs comprenant un génome d'adénovirus dont l'organisation génétique est modifiée et dont la recombinaison éventuelle avec le génome de la lignée de production conduit à la génération de particules virales non- réplicatives et/ou non-viables. La demanderesse a maintenant montré qu'il est possible de modifier l'organisation génomique de l'adénovirus pour éviter la production de particules réplicatives lors de la production des stocks. Un premier objet de la présente invention concerne donc un adenovirus recombinant comprenant un génome d'adénovirus (i) dont la région El est inactivée,
(ii) dont l'organisation génomique est modifiée et (iii) dont la recombinaison éventuelle avec le génome de la lignée de production conduit à la génération de particules virales non-viables.
Au sens de la présente invention, on entend par organisation génétique ou génomique l'agencement des différents gènes ou régions fonctionnelles présents dans le génome de l'adénovirus sauvage, tel que représenté sur la figure 1. Une organisation génétique ou génomique modifiée correspond donc à un génome dans lequel certains gènes ou certaines régions ne sont pas à leur position d'origine. Ainsi, certains gènes ou certaines régions peuvent être déplacées du génome et insérées en un autre site. Il est également possible d'insérer en un site particulier un gène ou une région donnés, et de supprimer ou d'inactiver la région d'origine (par mutation, délétion, insertion, etc)
Le terme particule virale non-viable désigne au sens de l'invention un adenovirus incapable de répliquer son ADN et/ou de se propager de façon autonome dans les cellules infectées. Une particule virale non-viable possède donc un génome d'adénovirus dépourvu au moins de séquences nécessaires à sa réplication et/ou sa propagation dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues non-fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences. Les séquences nécessaires à la réplication et/ou la propagation sont par exemple la région El, la région E4 ou la région L5. Plus particulièrement, s'agissant de la région E4, les gènes importants sont les gènes ORF3 et ORF6.
La demanderesse a plus particulièrement montré qu'il est possible de déplacer une fonction essentielle à la réplication ou à la propagation virale sans affecter les propriétés de l'adénovirus comme vecteur de thérapie génique, à savoir son haut pouvoir d'infection des cellules, notamment humaines, et sa capacité à transférer efficacement une gène d'intérêt dans lesdites cellules. Ainsi, dans un mode préféré, la présente invention a pour objet des adenovirus recombinants dont une région essentielle à la réplication et/ou à la propagation virale est présente dans une position génomique autre que sa position d'origine. Avantageusement, cette région se situe au niveau ou à proximité d'une autre région génomique rendue non fonctionnelle.
Les vecteurs de l'invention sont particulièrement avantageux puisqu'ils permettent l'incorporation de gènes d'intérêt de grande taille et qu'ils peuvent être produits à des titres élevés, sans production de particule virale réplicative contaminante.
Dans les vecteurs de l'invention, la région El ou tout autre région peut être inactivée ou rendue non fonctionnelle par différentes techniques connues de l'homme du métier, et notamment par suppression, substitution, délétion, et/ou addition d'une ou plusieurs bases. De telles modifications peuvent être obtenues in vitro (sur de l'ADN isolé) ou in situ, par exemple, au moyen des techniques du génie génétique, ou encore par traitement au moyen d'agents mutagènes. La ou lesdites modifications génétiques peuvent être localisées dans une partie codante de la région, ou en dehors d'une région codante, et par exemple dans les régions responsables de l'expression et/ou de la régulation transcriptionelle desdits gènes. L'inactivation peut donc se manifester par la production de protéines inactives en raison de modifications structurales ou conformationelles, par l'absence de production, par la production de protéines ayant une activité altérée, ou encore par la production de protéines naturelles à un niveau atténué ou selon un mode de régulation désiré.
Parmi les agents mutagènes utilisables pour l'inactivation, on peut citer par exemple les agents physiques tels que les rayonnements énergétiques (rayons X, γ, ultra violet, etc.), ou les agents chimiques capables de réagir avec différents groupements fonctionnels des bases de l'ADN, et par exemple les agents alkylants [éthylméthane sulfonate (EMS), N-méthyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, N- nitroquinoléine- 1 -oxyde (NQO)], les agents bialkylants, les agents intercalants, etc.
Les modifications génétiques peuvent également être obtenues par disruption génique, par exemple selon le protocole initialement décrit par Rothstein [Meth. Enzymol. 1PJ. (1983) 202]. Dans ce cas, tout ou partie de la séquence codante est préférentiellement perturbée pour permettre le remplacement, par recombinaison homologue, de la séquence génomique par une séquence non fonctionnelle ou mutante.
Préférentiellement, dans les adenovirus de l'invention, la région concernée est inactivée par mutation et/ou délétion d'une ou de plusieurs bases. Encore plus préférentiellement, elle est inactivée par délétion totale ou partielle.
Plus particulièrement, on entend par délétion toute suppression de tout ou partie du gène considéré. Il peut s'agir notamment de tout ou partie de la région codante dudit gène, et/ou de tout ou partie de la région promotrice de la transcription dudit gène. La suppression peut être effectuée par digestion au moyen d'enzymes de restriction appropriées, puis ligature, selon les techniques classiques de biologie moléculaire, ainsi qu'illustré dans les exemples.
De manière particulièrement préférée, l'inactivation des gènes est réalisée de telle sorte qu'elle n'affecte que le gène considéré et pas les autres gènes viraux, notamment les gènes voisins. Par ailleurs, certaines altérations telles que des mutations ponctuelles étant par nature capables d'être corrigées ou atténuées par des mécanismes cellulaires, il est particulièrement préféré que l'inactivation soit parfaitement stable ségrégationellement et/ou non-réversible.
Dans le cas d'inactivation par délétion totale ou partielle, la région essentielle à la viabilité virale se situe préférentiellement au niveau ou à proximité du site de délétion. Il est cependant possible d'utiliser d'autres sites d'insertion, comme par exemple des sites de restriction déjà présents dans le génome sauvage. A cet égard, on préfère néanmoins que l'insertion soit réalisée au moins à proximité du site de délétion, c'est-à-dire en dehors du site de délétion, mais suffisamment prêt pour qu'il ne puisse pas se produire d'événements de recombinaison dans l'intervalle séparant le site de délétion et le site d'insertion. De préférence, la distance entre le site de délétion et le site d'insertion ne devrait pas excéder 50 pb.
Dans un mode préféré de la présente invention, la région essentielle à la réplication et/ou à la propagation virale est déplacée pour être incluse au niveau de la région El inactivée et/ou de la région E3.
Selon un mode particulièrement avantageux, dans les adenovirus recombinants de la présente invention, la région El est inactivée par délétion d'un fragment PvuII-BglII allant du nucléotide 454 au nucléotide 3328, sur la séquence de l'adénovirus Ad5. Cette séquence est accessible dans la littérature et également sur base de données (voir notamment Genebank n° M73260). Dans un autre mode de réalisation préféré, la région El est inactivée par délétion d'un fragment HinfII-Sau3A allant du nucléotide 382 au nucléotide 3446.
La région essentielle à la réplication et/ou à la propagation virale selon la présente invention est avantageusement choisie parmi tout ou partie de la région E4 et/ou de la région pIX-IVa2 et/ou de la région L5, etc Dans un mode tout particulièrement préféré de la présente invention, la région essentielle est constituée de tout ou une partie fonctionnelle de la région E4 et elle est insérée au niveau ou à proximité du site de délétion de El Selon ce mode de réalisation, la région E4, essentielle à la propagation virale, est insérée dans un position autre que sa position d'origine, de sorte que cette région soit absente dans toute construction qui résulterait de la recombinaison avec le génome de la lignée de production (Cf figure 3). La présente invention a donc également pour objet un adenovirus recombinant dont le génome est caractérisé par la présence de régions El et E4 inactivées, et en ce que tout ou une partie fonctionnelle de la région E4 est insérée au niveau ou à proximité de la région El .
Un tel vecteur adénoviral comprend préférentiellement deux ITR, une région d'encapsidation, une délétion dans la région El au niveau de laquelle est insérée tout ou une partie fonctionnelle de E4, et une région E4 d'origine inactivée.
La région E4 est impliquée dans la régulation de l'expression des gènes tardifs, dans la stabilité des ARN nucléaires tardifs, dans l'extinction de l'expression des protéines de la cellule hôte et dans l'efficacité de la réplication de l'ADN viral. Des mutants dépourvus de E4 sont incapables de se propager. E4 constitue ainsi une région essentielle à la réplication et/ou propagation virale. Cette région E4 est constituée de 7 phases ouvertes de lecture, désignées ORF1, ORF2, ORF3, ORF4, ORF3/4, ORF6 et ORF6/7 (figure 4). Parmi celles-ci, ORF3 et ORF6 sont les deux gènes essentiels à la propagation virale. Chacun de ces gènes est capable d'induire la propagation virale. En revanche, l'inactivation de la région E4 implique l'inactivation de ORF3 et ORF6.
Dans un mode particulier, dans les vecteurs de l'invention, la totalité de la région E4 est insérée au niveau ou à proximité du site de délétion El . Il peut s'agir en particulier d'un fragment Maell-Mscl correspondant aux nucléotides 35835-32720.
Dans un autre mode particulier, seule une partie fonctionnelle de E4, c'est-à- dire suffisante pour permettre la propagation virale, est insérée. Cette partie comprend au moins un gène ORF3 ou ORF6 fonctionnel. Préférentiellement, la partie fonctionnelle de E4 est constituée essentiellement de ORF3 ou ORF6. A titre d'exemple, ces phases codantes peuvent être isolées de la région E4 sous forme de fragments PvuII-AluI et BglII-PvuII respectivement, correspondant aux nucléotides 34801-34329 et 341 15-33126 respectivement. Avantageusement, la région E4 ou la partie fonctionnelle de cette région comprend également un région promotrice de la transcription II peut s'agir du promoteur de la région E4 ou de tout autre promoteur fonctionnel, tel que les promoteurs viraux (El a, SV40, LTR-RSV, etc), eucaryotes ou mammifère Préférentiellement, le promoteur utilisé est le promoteur de la région E4
Comme indiqué ci-avant, la partie fonctionnelle de E4 insérée au niveau de El ne correspond pas nécessairement à la partie de E4 délétée dans la position d'origine Ainsi, la région initiale peut être inactivée par mutation ponctuelle (sans délétion) et une région E4 fonctionnelle insérée au niveau de El De même, la région E4 initiale peut être entièrement délétée et seulement une partie fonctionnelle insérée au niveau de El
L'inactivation de la région E4 implique au sens de l'invention l'inactivation fonctionnelle au moins des régions ORF3 et ORF6 Ces régions d'origine peuvent être inactivées par toute technique connue de l'homme du métier En particulier, toutes les méthodes données ci-avant peuvent être appliquées à l'inactivation de ORF3 et ORF6 ou toute région supplémentaire de E4 A titre d'exemple, la délétion de la région E4 du virus Ad2 dl808 ou des virus Ad5 dll004, Ad5 dll007, Ad5 dllQl l ou Ad5 dll014 peuvent être utilisées dans le cadre de l'invention (Cf exemple 3 )
Ces adenovirus peuvent être obtenus par exemple par co-transfection dans une lignée de production d'un premier plasmide portant la partie gauche du génome du virus que l'on souhaite produire (possédant une délétion dans la région El au niveau ou à proximité de laquelle est insérée au moins une partie fonctionnelle de E4) et un fragment d'ADN génomique viral apportant la partie droite du génome du virus (possédant une région E4 inactivée) Après recombinaison, les virus produits sont amplifiés et isolés Ces adenovirus peuvent aussi être obtenus par permutation des extrémités du génome, comprenant les ITR plus la région contigue A cet égard, l'invention a également pour objet un adenovirus recombinant caractérisé en ce que son génome possède une région El inactivée et en ce que l'extrémité gauche, comprenant l'ITR et la région d'encapsidation, et l'extrémité droite, comprenant l'ITR et tout ou une partie fonctionnelle de la région E4, sont permutées Plus particulièrement, l'extrémité gauche comprenant l'ITR gauche et la région d'encapsidation est contenue dans les 382 premiers nucléotides du génome de l'adénovirus Ad5 (par exemple jusqu'au site Hinfl) De même, l'extrémité droite comprenant l'ITR droite et tout ou une partie fonctionnelle de la région E4, y compris le promoteur de la région E4, est contenue dans les 3215 derniers nucléotides du génome de l'adénovirus Ad5 (par exemple à partir du site Mscl en position 32720). Les techniques de l'homme du métier permettent de construire un virus recombinant selon l'invention dans lequel l'ITR droite et tout ou partie de la région E4 sont maintenant situées à la gauche du virus, suivies de la région 3446-32720 du génome de l'adénovirus Ad5, puis de la séquence d'encapsidation et de l'ITR gauche qui devient maintenant l'extrémité droite du virus recombinant (Cf figure 5). Le génome de l'adénovirus recombinant ainsi obtenu est particulièrement avantageux- puisque la région essentielle E4 déplacée à gauche est maintenue dans son environnement naturel et donc dans des conditions d'activité optimales pour un cycle infectieux à haut titre. De plus, cette région précède maintenant la région dont la présence dans le génome de la lignée de production 293 était à l'origine de l'apparition de particules viables.
Dans un autre mode tout particulièrement préféré de la présente invention, la région essentielle est constituée de la région codant pour les protéines pIX et IVa2 et elle est insérée au niveau de la région E3, éventuellement en remplacement de séquences délétées (Cf figure 6). Plus particulièrement, la région codant pour les protéines pIX et IVa2 est comprise dans un fragment BglII-NruI correspondant aux nucléotides 3328 à 6316 sur la séquence de l'adénovirus Ad5 sauvage. Dans ce mode de réalisation, la recombinaison éventuelle de l'adénovirus recombinant avec la région de l'adénovirus intégrée dans la lignée de production ne génère que des particules virales non-viables car délétées des principaux gènes tardifs essentiels à la viabilité.
Selon un mode de réalisation particulier del'invention, deux régions essentielles du génome de l'édénovirus sont déplacées de leurs positions d'origine. Plus préférentiellement, ces régions essentielles sont représentées par la région codant pour la protéine pIX et la région codant pour tout ou seulement une partie fonctionnelle de la région E4. Selon un mode préféré, elles seront déplacées au niveau de la région El, en remplacement de séquence délétées et en conservant ou non l'orientation de leur cadre de lecture.
A titre illustratif de ce type de construction on peut plus particulièrement se rapporter à la construction représentée en figure 8. Dans cette construction, la région codant pour la protéine pIX est déplacée dans la région El délétée, à droite de l'ITR gauche devenu, extrémité droite du virus recombinant. La région codant pour la protéine pIX y est en outre placée en lecture inverse. En ce qui concerne la région essentielle de E4, elle y est représentée par les gènes ORF3-ORF6/7, sous contrôle du promoteur E4, et y est insérée également au niveau du site de délétion de E 1 , entre la région codant pour la protéine pIX et la région codant pour la protéine IVa2 dont la position n'a pas été affectée; dans le cas de la construction spécifique de la figure 8,les deux régions codant respectivement pour la protéine pIX et la protéine IVa2 possèdent des sites de polyadénylation distincts.
Une telle construction est Darticulièrement avantageuse sur le plan de la fiabilité et innocuité. En effet, toute recombinaison parasitaire entre 2 molécules virales de ce type, au niveau de la région E4 par exemple, conduira à un virus recombinant démuni de sa séquence d'encapsidation. De même, une recombinaison entre une telle molécule virale avec la région complémentaire ddudit adenovirus, intégrée dans une lignée cellulaire de production, ne générera que des particules virales délétées de leurs principaux gènes tardifs, essentiels à leur viabilité.
Comme indiqué précédemment, les adenovirus recombinants selon l'invention comprennent avantageusement les séquences ITR et une région permettant l'encapsidation.
Les séquences inversées répétées (ITR) constituent l'origine de réplication des adenovirus. Elles sont localisées aux extrémités 3' et 5' du génome viral (Cf figure 1), d'où elles peuvent être isolées aisément selon les techniques classiques de biologie moléculaire connues de l'homme du métier. La séquence nucléotidique des séquences ITR des adenovirus humains (en particulier des sérotypes Ad2 et Ad5) est décrite dans la littérature, ainsi que des adenovirus canins (notamment CAV1 et CAV2). Concernant l'adénovirus Ad5 par exemple, la séquence ITR gauche correspond à la région comprenant les nucléotides 1 à 103 du génome.
La séquence d'encapsidation (également désignée séquence Psi) est nécessaire à l'encapsidation du génome viral. Cette région doit donc être présente pour permettre la préparation d'adénovirus recombinants défectifs selon l'invention. La séquence d'encapsidation est localisée dans le génome des adenovirus sauvages, entre l'ITR gauche et le gène El (Cf figure 1). Dans les adenovirus de l'invention, elle peut être localisée a coté de l'ITR gauche comme de l'ITR droite (cf figure 5). Elle peut être isolée ou synthétisée artificiellement par les techniques classiques de biologie moléculaire. La séquence nucléotidiques de la séquence d'encapsidation des adenovirus humains (en particulier des sérotypes Ad2 et Ad5) est décrite dans la littérature, ainsi que des adenovirus canins (notamment CAV1 et CAV2). Concernant l'adénovirus Ad5 par exemple, une séquence d'encapsidation fonctionnelle est comprise entre les nucléotides 194 et 358 du génome.
Par ailleurs, les adenovirus selon l'invention peuvent posséder d'autres altérations au niveau de leur génome. En particulier, d'autres région peuvent être délétées pour augmenter la capacité du virus et réduire ces effets secondaires liés à l'expression de gène& viraux. Ainsi, tout ou partie de la région E3 notamment peut être délétée.
Des adenovirus recombinants selon l'invention possèdent des propriétés particulièrement attractives pour une utilisation en thérapie génique. Ces vecteurs combinent en effet des propriétés d'infection, de sécurité et de capacité de transfert de gènes très élevées.
Avantageusement, les adenovirus recombinants de l'invention comportent en outre une séquence d'acides nucléiques hétérologue dont le transfert et/ou l'expression dans une cellule, un organe ou un organisme est recherché.
En particulier, la séquence d'ADN hétérologue peut comporter un ou plusieurs gènes thérapeutiques. Les gènes thérapeutiques qui peuvent ainsi être transférés sont tout gène dont la transcription et éventuellement la traduction dans la cellule cible génèrent des produits ayant un effet thérapeutique.
Il peut s'agir en particulier de gènes codant pour des produits protéiques ayant un effet thérapeutique. Le produit protéique ainsi codé peut être une protéine, un peptide,.un acide aminé, etc. Ce produit protéique peut être homologue vis-à-vis de la cellule cible (c'est-à-dire un produit qui est normalement exprimé dans la cellule cible lorsque celle-ci ne présente aucune pathologie). Dans ce cas, l'expression d'une protéine permet par exemple de pallier une expression insuffisante dans la cellule ou l'expression d'une protéine inactive ou faiblement active en raison d'une modification, ou encore de surexprimer ladite protéine. Le gène thérapeutique peut aussi coder pour un mutant d'une protéine cellulaire, ayant une stabilité accrue, une activité modifiée, etc. Le produit protéique peut également être hétérologue vis-à-vis de la cellule cible. Dans ce cas, une protéine exprimée peut par exemple compléter ou apporter une activité déficiente dans la cellule lui permettant de lutter contre une pathologie. Parmi les produits thérapeutiques au sens de la présente invention, on peut citer plus particulièrement les enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les lymphokines : interleukines, interférons, TNF, etc (FR 9203120), les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques : BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, etc; les apolipoprotéines : ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc (FR 93 05125), la dystrophine ou une minidystrophine (FR 9111947), les gènes suppresseurs de tumeurs : p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc (FR 93 04745), les gènes codant pour .des facteurs impliqués dans la coagulation : Facteurs VII, VIII, IX, etc, les gènes suicides : Thymidine kinase, cytosine desaminase, etc; ou encore tout ou partie d'une immunoglobuline naturelle ou artificielle (Fab, ScFv, etc), etc.
Le gène thérapeutique peut également être un gène ou une séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent par exemple être transcrites, dans la cellule cible, en ARN complémentaires d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308.
Le gène thérapeutique peut peut aussi être un gène codant pour un peptide antigénique, capable de générer chez l'homme une réponse immunitaire. Dans ce mode particulier de mise en oeuvre, l'invention permet donc la réalisation de vaccins permettant d'immuniser l'homme, notamment contre des microorganismes ou des virus. Il peut s'agir notamment de peptides antigéniques spécifiques du virus d'epstein barr, du virus HIV, du virus de l'hépatite B (EP 185 573), du virus de la pseudo-rage, ou encore spécifiques de tumeurs (EP 259 212).
Généralement, la séquence d'acides nucléiques hétérologue comprend également une région promotrice de la transcription fonctionnelle dans la cellule infectée, ainsi qu'une région située en 3' du gène d'intérêt, et qui spécifie un signal de fin transcriptionnelle et un site de polyadénylation. L'ensemble de ces éléments constitue la cassette d'expression. Concernant la région promotrice, il peut s'agir d'une région promotrice naturellement responsable de l'expression du gène considéré lorsque celle-ci est susceptible de fonctionner dans la cellule infectée. Il peut également s'agir de régions d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, y compris l'adénovirus utilisé. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs des gènes El A, MLP, CMV, RSV, etc. En outre, ces régions promotrices peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, ou permettant une expression tissu-spécifique ou majoritaire. Par ailleurs, lorsque l'acide nucléique hétérologue ne comporte pas de séquences promotrices, il peut être inséré dans le génome du virus défectif en aval d'une telle séquence. Par ailleurs, la séquence d'acides nucléiques hétérologue peut également comporter, en particulier en amont du gène thérapeutique, une séquence signal dirigeant le produit thérapeutique synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle du produit thérapeutique, mais il peut également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle.
La cassette d'expression du gène thérapeutique peut être insérée en différents sites du génome de l'adénovirus recombinant selon l'invention. Elle peut tout d'abord être insérée au niveau de la délétion El. Dans ce cas, elle est localisée à coté (en 5' ou en 3') de la région ou de la partie fonctionnelle de E4. Elle peut également être insérée au niveau de la région E3, en addition ou en substitution de séquences. Elle peut également être localisée au niveau de la région E4 inactivée
Toujours dans un mode particulièrement avantageux, les vecteurs de l'invention possèdent en outre un gène E3 fonctionnel sous contrôle d'un promoteur hétérologue. Plus préférentiellement, les vecteurs possèdent une partie du gène E3 permettant l'expression de la protéine gpl9K. Cette protéine permet en effet d'éviter que le vecteur adenovirus fasse l'objet d'une réaction immunitaire qui (i) limiterait son action et (ii) pourrait avoir des effets secondaires indésirables.
Les adenovirus recombinants selon l'invention peuvent être d'origines diverses. Il existe en effet différents sérotypes d'adénovirus, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, mais qui présentent une organisation génétique comparable. De ce fait, les enseignements décrits dans la présente demande peuvent être aisément reproduits par l'homme du métier pour tout type d'adénovirus. ^ Plus particulièrement, les adenovirus de l'invention peuvent être d'origine humaine, animale, ou mixte (humaine et animale).
Concernant les adenovirus d'origine humaine, on préfère utiliser ceux classés dans le groupe C. Plus préférentiellement, parmi les différents sérotypes d'adénovirus 5 humain, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adenovirus de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5).
Comme indiqué plus haut, les adenovirus de l'invention peuvent également être d'origine animale, ou comporter des séquences issues d'adénovirus d'origine animale. La demanderesse a en effet montré que les adenovirus d'origine animale sont l() capables d'infecter avec une grande efficacité les cellules humaines, et qu'ils sont incapables de se propager dans les cellules humaines dans lesquelles ils ont été testés (Cf demande FR 93 05954). La demanderesse a également montré que les adenovirus d'origine animale ne sont nullement trans-complémentés par des adenovirus d'origine humaine, ce qui élimine tout risque de recombinaison et de propagation in vivo, en
15 présence d'un adenovirus humain, pouvant conduire à la formation d'une particule infectieuse. L'utilisation d'adénovirus ou de régions d'adénovirus d'origine animale est donc particulièrement avantageuse puisque les risques inhérents à l'utilisation de virus comme vecteurs en thérapie génique sont encore plus faibles.
Les adenovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente 0 invention peuvent être d'origine canine, bovine, mutine, (exemple : Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple : SAV). Plus particulièrement, parmi les adenovirus aviaires, on peut citer les sérotypes 1 à 10 accessibles à l'ATCC, comme par exemple les souches Phelps (ATCC VR-432), Fontes (ATCC VR-280), P7-A (ATCC VR-827), IBH-2A (ATCC VR-828), J2-A
25 (ATCC VR-829), T8-A (ATCC VR-830), K-l l (ATCC VR-921) ou encore les souches référencées ATCC VR-831 à 835. Parmi les adenovirus bovins, on peut utiliser les différents sérotypes connus, et notamment ceux disponibles à l'ATCC (types 1 à 8) sous les références ATCC VR-313, 314, 639-642, 768 et 769. On peut également citer les adenovirus urins FL (ATCC VR-550) et E20308 (ATCC VR-
30 528), l'adénovirus ovin type 5 (ATCC VR-1343), ou type 6 (ATCC VR-1340); l'adénovirus porcin 5359), ou les adenovirus simiens tels que notamment les adenovirus référencée à l'ATCC sous les numéros VR-591-594, 941-943, 195-203, etc.
De préférence, parmi les différents adenovirus d'origine animale, on utilise
35 dans le cadre de l'invention des adenovirus ou des régions d'adénovirus d'origine canine, et notamment toutes les souches des adenovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. Les adenovirus canins ont fait l'objet de nombreuses études structurales. Ainsi, des cartes de restriction complètes des adenovirus CAV1 et CAV2 ont été décrites dans l'art antérieur (Spibey et al., J. Gen. Virol. 70 (1989) 165), et les gènes Ela, E3 ainsi que les séquences ITR ont été clones et séquences (voir notamment Spibey et al., Virus Res. 14 (1989) 241; Linné, Virus Res. 23 (1992) 1 19, WO 91/1 1525).
Les adenovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être prépares de différentes façons. Une première méthode consiste à transfecter l'ADN du virus recombinant
(défectif) préparé in vitro dans une lignée cellulaire compétente, c'est-à-dire portant en trans toutes les fonctions nécessaires à la complémentation du virus défectif. Ces fonctions sont préférentiellement intégrées dans le génome de la cellule, ce qui réduit les risques de recombinaison, et confère une stabilité accrue à la lignée cellulaire. Dans le cas d'adénovirus dans lesquels seule la région El est déficiente, la lignée préférée est la lignée 293.
Une seconde approche consiste à co-transfecter dans une lignée cellulaire apppropriée l'ADN du virus recombinant défectif préparé in vitro et l'ADN d'un ou de plusieurs virus ou plasmide helper. Selon cette méthode, il n'est pas nécessaire de disposer d'une lignée cellulaire compétente capable de complémenter toutes les fonctions défectives de l'adénovirus recombinant. Une partie de ces fonctions est en effet complémentée par le ou les virus helper. Ce ou ces virus helper sont eux-mêmes défectifs. La préparation d'adénovirus recombinants défectifs de l'invention selon cette méthode est également illustrée dans les exemples.
A cet égard, la présente demande décrit également la construction de plasmides portant la partie gauche modifiée du génome de l'adénovirus Ad5 (plasmides de la série pCOl-E4 par exemple). Ces plasmides sont particulièrement utiles pour la construction d'adénovirus recombinants en tant que vecteurs de thérapie génique. Ainsi, les plasmides pCOl-E4 portent la région gauche du génome de l'adénovirus, depuis l'ITR gauche jusqu'au nucléotide 6316, avec une délétion de la région comprise entre les nucléotides 382-3446, correspondant au locus El, au niveau de laquelle est insérée tout ou une partie fonctionnelle de E4. Les plasmides pCOl-E4 contiennent par ailleurs un multisite de clonage permettant l'incorporation d'une séquence d'acides nucléiques hétérologue d'intérêt. Les plasmides pC01-E4 peuvent être utilisés pour préparer l'adénovirus recombinant défectif par cotransfection avec un ADN, préférentiellement d'origine virale, correspondant à la partie droite du génome de l'adénovirus possédant une région E4 inactivée, dans une lignée cellulaire compétente.
En ce qui concerne ce dernier, il peut être issu du génome d'un virus défectif tel que Ad2 dl808 qui est délété de la région E4 (Weinberg et al., J. Virol. 57 (1986) 833),
Ad5 dll004; Ad5 dll007, Ad5 dllOl 1 ou Ad5 dll014, etc (Cf exemples). A cet égard, l'invention concerne également un procédé de préparation d'adénovirus recombinants dépourvus de particules réplicatives selon lequel on co-transfecte une lignée cellulaire compétente avec - un premier ADN comprenant la partie gauche du génome dudit adenovirus, possédant une délétion dans la région El au niveau ou à proximité de laquelle est insérée au moins une partie fonctionnelle de la région E4, et
- un second ADN comprenant au moins la partie droite du génome dudit adenovirus, possédant une région E4 inactivée, et une partie d'adénovirus commune avec le premier ADN, et on récupère les adenovirus produits par recombinaison homologue entre lesdits
ADN.
Parmi les lignées cellulaires utilisables, on peut citer notamment la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59). Comme indiqué précédemment, cette lignée contient notamment, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome de l'adénovirus humain Ad5 (12 %). Avantageusement, dans le procédé de l'invention, le premier ADN est choisi parmi les plasmides de type pCOl- E4. Par ailleurs, pour préparer un adenovirus recombinant comprenant un gène thérapeutique, le premier ou le second ADN mis en oeuvre dans le procédé de l'invention porte en outre une séquence d'ADN hétérologue d'intérêt.
Ensuite, les virus recombinants qui se sont multipliés sont récupérés, purifiés et amplifiés selon les techniques classiques de la virologie. Les plasmides pCOl-E4 permettent ainsi la construction d'adénovirus recombinants portant une délétion dans la région El allant du nucléotide 382 au nucléotide 3446, au niveau de laquelle tout ou une partie fonctionnelle de E4 est insérée, aisni éventuellement qu'un gène thérapeutique.
La présente invention concerne également toute composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs adenovirus recombinants défectifs tels que décrits précédemment. Les compositions pharmaceutiques de l'invention peuvent être formulées en vue d'une administration par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc.
Préférentiellement, la composition pharmaceutique contient des véhicules pharmaceutiquement acceptables pour une formulation injectable. Il peut s'agir en particulier de solutions salines (phosphate monosodique, disodique, chlorure de sodium, potassium, calcium ou magnésium, etc, ou des mélanges de tels sels), stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables.
Les doses de virus utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les adenovirus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu, et de préférence 106 à 1010 pfu. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 15 jours, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature.
Selon la séquence d'ADN hétérologue insérée, les adenovirus de l'invention peuvent être utilisés pour le traitement ou la prévention de nombreuses pathologies, incluant les maladies génétiques (dystrophie, fibrose cystique, etc), les maladies neurodégénératives (alzheimer, parkinson, ALS, etc), les cancers, les pathologies liées aux désordres de la coagulation ou aux dyslipoprotéinémies, les pathologies liées aux infections virales (hépatites, SIDA, etc), etc.
La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Légende des figures Figure 1 : Organisation génétique de l'adénovirus Ad5. La séquence complète de l'Ad5 est disponible sur base de données et permet à l'homme du métier de sélectionner ou de créer tout site de restriction, et ainsi d'isoler toute région du génome.
Figure 2 : Evénements de recombinaison entre l'adénovirus et la lignée 293. Figure 3 : Représentation d'un type de vecteurs de l'invention, et de sa recombinaison avec la lignée 293.
Figure 4 : Organisation de la région E4
Figure 5 : Représentation d'un adenovirus de l'invention aux extrémités permutées.
E4+ désigne une région E4 fonctionnelle, ΔE4 désigne une région E4 non- fonctionnelle, ψ désigne une séquence d'encapsidation. La cassette d'expression du gène d'intérêt n'est pas représentée mais peut être insérée comme indisué dans le texte.
Figure 6 : Représentation d'un type de vecteurs de l'invention (pIX-IVa2) pIX+IVa2 contient au moins une région IVa2 fonctionnelle. ΔElΔpIX désigne une délétion des séquences de l'adénovirus comprise entre la région Ψ et la fin de la région codant pour la protéine 140kD (position 5200) de la région E2. Cette délétion inclue également la région IVa2 et concerne la séquence présente dans le chromosome de la lignée 293 en aval de la région E&b.
Figure 7 : Carte de restriction du fragment HindIII contenu dans le plasmide pCOl.
Figure 8: Représentation des plasmides d'expression pPY40 et pPY6 Figure 9: Représentation du plasmide pGYlO
Figure 10: Représentation du plasmide pCOl-(ORF6+ORF7)
Figure 1 1 : Représentation des plasmides pPY78 et pPY77
Figure 12: Représentation des plasmides pPY15 et pJYl
Figure 13: Représentation d'un type de virus selon l'invention Figure 14; Représentation des plasmides pXL2675 et pXL2757
Figure 15: Représentation des cartes de restriction des plasmides pPY66, pPY82 et pPY75
Figures 16: (A): Représentation schématique d'une recombinaison homologue entre le réplicon HincP/Ad5 et le plasmide pPY66 et (B) . Figure 17: Protocole pour générer le génome viral HincP/ Ad5[delE4(Y+ITR)] via recombinaison homologue des deux réplicons pPY82 et HincP/ Ad5[delE4-
(SacB+SpecR)].
Figure 18: Représentation de HincP/ Ad5[ITRYdelEl(SacB+SpecR)delE4(Y+ITR)] et
HincP/Ad5[ITRYdelEl(ORF6 +ORF7)delE4(Y+ITR)] Figure 19: Cartes de restriction des plasmides pPY70, pPY71 et pPY72 Figure 20 Cartes de restriction des plasmides pGY12, pGY14 et pMC2 Figure 21 Cartes de restriction des plasmides pPY91, pPY94 et pPY92 Figure 22 Protocole de préparation de virus défectifs selon l'invention
Techniques générales de biologie moléculaire Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions préparatives d'ADN plasmidique, la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la purification de fragments d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénol-chloroforme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'isopropanol, la transformation dans Escherichia coli, etc sont bien connues de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la littérature [Maniatis T et al , "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spπng Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N Y , 1982, Ausubel F M et al (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987] Les plasmides de type pBR322, pUC et les phages de la série Ml 3 sont d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories) Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénol/chloroforme, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recommandations du fournisseur Le remplissage des extrémités 5' proéminentes peut être effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E coli (Biolabs) selon les spécifications du fournisseur La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recommandations du fabricant La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase S 1
La mutagénèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al [Nucleic Acids Res 1_3 (1985) 8749-8764] en utilisant le kit distribué par Amersham L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR [Polymérase-catalyzed Çhain Reaction, Saiki R K et al , Science 230 (1985) 1350-1354, Mullis K B et Faloona F A , Meth Enzym 155 (1987) 335-350] peut être effectuée en utilisant un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécifications du fabricant La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al [Proc. Natl Acad Sci USA, 74 (1977) 5463-5467] en utilisant le kit distribué par Amersham Exemple 1 - Construction du plasmide pCOl (figure 7)
A - Construction du plasmide pCE
Le fragment EcoRI-Xbal correspondant à l'extrémité gauche du génome de l'adénovirus Ad5 a d'abord été clone entre les sites EcoRl et Xbal du vecteur pIC19H. Ceci génère le plasmide pCA. Le plasmide pCA a ensuite été coupé par Hinfl, ses extrémintés 5' proéminentes ont été remplies par le fragment de klenow de l'ADN polymérase I de E.coli, puis il a été coupé par EcoRI. Le fragment ainsi généré du plasmide pCA qui contient l'extrémité gauche du génome de l'adénovirus Ad5 a ensuite été clone entre les sites EcoRI et Smal du vecteur pIC20H (Marsh et al., Gène 32 (1984) 481). Ceci génère le plasmide pCB. Le plasmide pCB a ensuite été coupé par EcoRI, ses extrémintés 5' proéminentes ont été remplies par le fragment de klenow de l'ADN polymérase I de E.coli, puis il a été coupé par BamHI. Le fragment ainsi généré du plasmide pCB qui contient l'extrémité gauche du génome de l'adénovirus Ad5 a ensuite été clone entre les sites NruI et BglII du vecteur pIC20H. Ceci génère le plasmide pCE dont une caractéristique intéressante est qu'il possède les 382 premières paires de bases de l'adénovirus Ad5 suivies d'un multisite de clonage.
B - Construction du plasmide pCD'
Le fragment Sau3A (3346) - SstI (3645) et le fragment SstI (3645) - Narl (5519) du génome de l'adénovirus Ad5 ont tout d'abord été ligaturés et clones entre les sites Clal et BamHI du vecteur pIC20H, ce qui génère le plasmide pPY53. Le fragment Sall-Taql du plasmide pPY53 préparé à partir d'un contexte dam-, contenant la partie du génome de l'adénovirus Ad5 comprise entre les sites Sau3A (3346) et Taql (5207) a ensuite été clone entre les sites Sali et Clal du vecteur pIC20H, ce qui génère le plasmide pCA'. Le fragment Taql (5207) - Narl (5519) du génome de l'adénovirus Ad5 préparé à partir d'un contexte dam- et le fragment Sall-Taql du plasmide pCA' ont ensuite été ligaturés et clones entre les sites Sali et Narl du vecteur pIC20H. Ceci génère le plasmide pCC. Le fragment Narl (5519) - NruI (6316) du génome de l'adénovirus Ad5 préparé à partir d'un contexte dam- et le fragment Sall-Narl du plasmide pCC ont ensuite été ligaturés et clones entre les sites Sali et NruI du vecteur pIC20R. Ceci génère le plasmide pCD'.
C - Construction du plasmide pCOl
Une digestion partielle par Xhol puis une digestion complète par Sali du plasmide pCD' génère un fragment de restriction qui contient la séquence de l'adénovirus Ad5, du site Sau3A (3446) au site NruI (6316). Ce fragment a été clone dans le site Sali du plasmide pCE. Ceci génère le plasmide pCOl (figure 7), qui contient la partie gauche de l'adénovirus Ad5 jusqu'au site Hinfl (382), un multisite de clonage et le fragment Sau3A (3446) - NruI (6316) de l'adénovirus Ad5.
Exemple 2 - Construction des plasmides de type DCO1-E4 (figure 7)
Cet exemple décrit la construction de plasmides de type pCOl-E4, c'est-à- dire de plasmides obtenus par incorporation de tout ou une partie fonctionnelle de la région E4 d'un adenovirus dans le plasmide pCOl (exemple 1).
2.1. Clonage de la région E4 dans son intégralité
2.1 1 Exprimée à partir du promoteur originel de la région E4
- Le plasmide pPY2 correspond au clonage du fragment Avr2-Sall (environ 1.3 kb incluant le promoteur/LTR du virus MMTV) du plasmide pMSG (Pharmacia) entre les sites Xbal et Sali du plasmide pIC20H préparé à partir d'un contexte E. coli dam+. - Le plasmide pPY4 dérive du plasmide pPY2 par délétion d'un fragment de 35 pb après coupure par BamHI et Bgl2 puis religature.
- Le plasmide pPY5 correspond au clonage du fragment Taql-Bgl2 (position 35576- 32490) incluant la région E4 de l'Ad5 entre les sites Clal et BamHI du plasmide pIC20H. Dans ce plasmide, la totalité de la région E4 de l'Ad5 est donc maintenant bordée par des sites EcoRV et Sphl provenant du multisite de clonage. La digestion partielle du plasmide pPY5 par EcoRV puis une digestion par Sphl permet de purifier un fragment EcoRV-Sphl d'environ 3.1 kb incluant la totalité de la région E4 de l'Ad5.
- Le clonage de ce fragment EcoRV-Sphl entre les site Smal et Sphl du plasmide pPY4 génère le plasmide pPY6 (Figure 8).
- Le plasmide pPY6* est identique au plasmide pPY6 à l'exception du site Xbal qui a été détruit après coupure par remplissage à l'aide du fragment Klenow de la DNA polymérase d'E coli (Biolabs), puis religature. Le plasmide pPY6* contient donc la totalité de la région E4 (du site Taql en position 35576 et jusqu'à la position 32490 localisée approximativement 300 pb après le site de polyadénylation) exprimée sous contrôle du promoteur LTR du virus RSV.
Le plasmide pFG144 [F.L. Graham et al. EMBO J. (1989) 8 2077-2085] contient notamment un fragment Sau3A de 1162 pb incluant l'extrémité droite du génome de l'Ad5 à partir de la position 34773 Ce fragment est alors clone dans le site BamHI du plasmide pIC20H ce qui génère le plasmide pGY9 dans lequel le fragment Sau3A est maintenant inclus dans un fragment BamHI-EcoRI de 1184 pb du fait de l'orientation du fragment relativement au vecteur Ce fragment est alors purifié par electroélution, coupé par Avril, puis soumis à une hydrolyse partielle par l'enzyme Maell. Un des produits de restriction corresponds au fragment Maell (35835)-AvrII (35463) qui inclusele promoteur de la région E4 de l'AdS et jusqu'à la limite de l'ITR droite. Ce fragmen de 372 pb est alors purifié par electroélution et ligaturé en présence du fragment AvrII-SalI du plasmide pPY6* entre les sites Clal et Sali du plasmide pCOI ce qui génère le plasmide pGYlO (Figure 9) qui est du type pCOI-E4 (Figure 7).
2.1 2. Exprimée à partir d'un promoteur hétérologue
i) Expression à partir du LTR du virus MMTV
Le plasmide pPY6 est la source d'un fragment Xhol-Sall d'environ 4.5 kb correspondant à la cassette d'expression LTR MMTV/E4. Le clonage de cette cassette au site Sali du plasmide pCOl génère le plasmide pCOl-MMTV/E4 (2 orientations possibles de la région E4 vis à vis de l'ITR et de la séquence Ψ) qui est du type pCOl-E4.
ii) Expression à partir du promoteur pGRE5
Le clonage du fragment Xbal (environ 1 kb) du plasmide pGRE5.1 inclus une cassette d'expression composée d'un promoteur minimal hautement inductible aux glucocorticoides et d'un signal de polyadénylation [Mader and White Proc. Natl. Acad. Sci. (1993) 90 5603-5607], Le clonage de ce fragment entre les sites Xbal du plasmide pIC20H préparé à partir d'un contexte dam- génère le plasmide pPY21 dans lequel les 5 sites de liaison pour le récepteur aux glucocorticoides sont maintenant localisés à proximité immédiate du site Bgl2 provenant du multisite de clonage. Le plasmide pPY21 est la source d'un fragment Bgl2-EcoRl d'environ 0.8 kb correspondant au promoteur minimal hautement inductible aux glucocorticoides. Le clonage de ce fragment entre les sites Bgl2 et EcoRI du plasmide pIC20H génère le plasmide pPY26.
Le plasmide pPY5 est la source d'un fragment EcoRV-Hind3 d'environ 0.65 kb qui inclus le fragment Taql-Hind3 des positions 35576 à 34930 sur le génome de l'Ad5. Le clonage de ce fragment entre les sites EcoRV et Hind3 du plasmide pIC20R génère le plasmide pPY24 dans lequel un site EcoRI est maintenant localisé à proximité du site Taql (position 35576). Le clonage des fragments EcoRI -Hind3 (0.65 kb) du plasmide pPY24 et du fragment Hind3-Sphl (environ 2.4 kb incluant l'ADN de l'Ad5 entre les positions 34930 et 32490) du plasmide pPY5, entre les sites EcoRI et Sphl du plasmide pIC20H génère le plasmide pPY37. Ce plasmide est la source d'un fragment EcoRI -Sphl d'environ 3.1 kb qui comporte la totalité de la région E4 de l'Ad5 des positions- 5576 à 32490. Le clonage-de ce fragment entre- e.v sites EcoRI et Sphl du plasmide pPY26 génère le plasmide d'expression pPY40 (Figure 8) dans lequel la région E4 est exprimée à partir du promoteur pGRE5. Dans ce plasmide le 1er site donneur d'épissage de la région.E4 est conservé. La cassette d'expression pGRE5/E4 du plasmide pPY40 est disponible sous la forme d'un fragment Bgl2-Sall d'environ 3.9 kb dont le clonage entre les sites BamHI et Sali du plasmide pCOl génère le plasmide pCOl-pGRE5/E4 qui est du type pCOl-E4 (Figure 7).
2.2. Clonage d'une sous-région E4 fonctionnelle.
2.2.1. Exprimée à partir du promoteur originel de la région E4
i) Séquence ORF6+ORF7 minimale Le plasmide pGY47' correspondant au clonage du fragment Bgl2-Sall (qui inclus la région E4 de l'Ad5 des positions 341 15 à 32490, soit la totalité des phases de lecture ORF6 et ORF7 de la région E4) du plasmide pPY6 entre les sites correspondants du plasmide pIC20R. Dans le plasmide pGY47', la région ORF6+ORF7 de la région E4 est maintenant incluse dans un fragment Clal -Sali d'environ 1.65 kb. Le fragment Mae2-Avr2 correspondant à la séquence de l'Ad5 des positions
35835 à 35464 est purifié par electroélution après hydrolyse partielle par Mae2 et hydrolyse totale par Avr2. Ce fragment est alors hydrolyse par Taql et le fragment Mae2-Taql (positions 35835 à 35576) est clone en présence du fragment Clal-Sall (1.65 kb) provenant du plasmide pGY47' entre les sites Clal et Sali du plasmide pCOl . Un des produits de la réaction correspond au plasmide pCOl-(ORF6+ORF7) (Figure 10) qui est du type pCOl-E4.
Dans une autre exemplification particulièrement intéressante, la séquence située entre le codon stop de ORF7 et le site Bgl2 (jusqu'à la position 32490 ce qui inclus le site de polyadénylation de E4) est délétée et remplacée par un site de polyadénylation hétérologue. Ainsi, le Fragment Xbal -Sali (environ 0.25 kb) correspondant au signal de polyadénylation "tardif du virus SV40 est isolé à partir du plasmide pGL3 et clone entre les sites correspondants du plasmide pIC20H préparé à partir d'un contexte dam+, ce qui génère le plasmide pPY76. Le clonage des fragments Kpnl-BssH2 (positions 33598 à 33249 sur le génome de l'Ad5) et BssH2-Sau3A (positions 33249 à 32891) entre les sites Kpnl et BamHI du plasmide pPY76 génère le plasmide pPY77 (Figure 11). Ce plasmide est la source d'un fragment Kpnl-Sall (environ 0.7 kb incluant les séquences comprises entre les positions 33598 à 32891) dont le clonage entre les sites correspondants du plasmide pCθl-(ORF6+ORF7) génère le plasmide pPY78 (Figure 11) qui est du type pCOl-E4.
ii) Séquence ORF6 uniquement
Le clonage des fragments Kpnl-BssH2 (positions 33598 à 33249 sur le génome de l'Ad5) et BssH2-Pvu2 (positions 33249 à 33126) entre les sites Kpnl et S al du plasmide pPY76 génère le plasmide pPY79. Ce plasmide est la source d'un fragment Kpnl-Sall (environ 0.5 kb incluant les séquences comprises entre les positions 33598 à 33126) dont le clonage entre les sites correspondants du plasmide pCOl- (ORF6+ORF7) génère le plasmide pCOl-(ORFό) qui est du type pCOl-E4.
iii) Séquence ORF3 uniquement Un plasmide du type pC01-E4 dans lequel seule la phase de lecture ORF3 de la région E4 est présente peut également être construit de façon analogue. En effet, il est connu que la seule expression de ORF3 est suffisante pour complémenter des virus délétés pour la région E4.
2.2.2. Exprimée à partir d'un promoteur hétérologue
i) Expression à partir du LTR du virus MMTV
Le fragment Bgl2-Xbal (environ 1.65 kb) du plasmide pPY6 inclus la séquence de l'Ad5 entre les positions 34115 et 32490 (ORF6+ORF7 de la région E4). Le clonage de ce fragment entre les sites Bgl2 et Xbal du plasmide pIC20H génère le plasmide pPY13. Ce plasmide comporte maintenant la sous-région E4 (ORF6+ORF7) de l'Ad5 dans un fragment Xhol-Sphl d'environ 1.65 kb. Le clonage de ce fragment entre les sites Sali et Sphl du plasmide pPY4 génère le plasmide pPY15 (Figure 12) qui comporte un fragment Xhol-Sall d'environ 3.1 kb et correspondant à une cassette d'expression de (ORF6+ORF7) de la région E4 de l'Ad5 sous contrôle du promoteur LTR du virus MMTV. Le clonage de ce fragment au site Sali du plasmide pCOl génère le plasmide pCOl-MMTV/(ORF6+ORF7) qui est du type pCOl-E4.
ii) Expression à partir du promoteur pGRE5 Le fragment Bgl2-Sall du plasmide pPY13 (environ 1.65 kb) inclus la sous-région E4 (ORF6+ORF7) de l'Ad5. Le clonage de ce fragment entre les sites BamHI et Sali du plasmide pIC20H génère le plasmide pPY45 dans lequel la sous-région (ORF6+ORF7) est maintenant incluse dans un fragment-EcoRl-Sphl d'environ 1.65 kb. Le clonage de ce fragment entre les sites EcoRI et Sphl du plasmide pPY26 génère le plasmide pJYl (Figure 12) qui inclus une cassette d'expression de la sous-région (ORF6+ORF7) exprimée à partir du promoteur pGRE5 sous la forme d'un fragment Bgl2-Sall d'environ 2.5 kb. Le clonage de ce fragment Bgl2-Sall entre les sites BamHI et Sali du plasmide pCOl génère le plasmide pCOl-pGRE5/(ORF6+ORF7) qui est du type pCOl-E4 (Figure 7).
Exemple 3 - Construction des adenovirus recombinants dérivés des plasmides de type PCO1-E4
Cet exemple décrit la construction d'adénovirus recombinants portant une délétion dans la région El allant du nucléotide 382 au nucléotide 3446, une région E4 inactivée, et tout ou une partie fonctionnelle de E4 insérée dans la délétion El .
Les techniques de l'homme de l'art permettent de construire et de propager des adenovirus recombinants E1"E4+ dans la lignée 293. Les plasmides du type pCOI-E4 peuvent être par exemple cotransfectés dans les cellules 293 en présence d'un génome viral portant une modification/déletion dans la région E4 de sorte que cette région soit non fonctionnelle (mutation dans ORF3 et ORF6 au moins). De tels virus sont donc non viables dans une lignée qui ne transcomplémente pas fonctionnellement la région E4. Par contre ces virus peuvent être préalablement propagés dans la lignée W162 [Weinberg and Ketner Proc. Natl. Acad. Sci. (1983) 80: 5383-5386], ou dans une des lignées 293 E4+ décrites dans le brevet FR. 94 04590 (18.04.1994). De tels virus incluent les virus Ad2dl808 [Challberg and Ketner Virology (1981) 1_14: 196-209], Ad5dll004, Ad5dll007, ou Ad5dll014 [Bridge and Ketner J. Virol. (1989) 63: 631- 638], ou encore Ad5dll011 [Bridge et al. Virology (1993) 193: 794-801] etc., Ainsi la cotransfection des plasmides de type pCOI-E4 linéarisés par l'enzyme Xmnl et l'ADN génomique viral des virus portant une région E4 non fonctionnelle et restreint par l'enzyme Clal génère les virus correspondants après recombinaison homologue entre les deux ADN dans la lignée 293. Ces virus se caractérisent donc par la présence de l'ITR gauche et d'une séquence d'encapsidation fonctionnelle (séquence Ψ, nucléotide 1-382 par exemple), suivie d'une région E4 fonctionnelle (entière ou au moins ORF3 ou ORF6) exprimée à partir d'un promoteur fonctionnel et par exemple le promoteur originel de la région E4 [inclus dans le fragment Taql(35576)- MaeII(35835)J, ou un promoteur inductible, suivie de la région située en aval du site Sau3A localisé à la position 3446 du génome de l'Ad5, et se poursuivant jusqu'à l'ITR droite et donc incluant la délétion de la fonction E4 présente dans le virus E4" de départ (Figure 13). Par exemple, des virus E1"E4+ caractérisés par une délétion E4 à droite du génome provenant du virus Ad5dll01 1 peuvent être propagés dans la lignée 293 à des titres supérieurs à 10^ PFU/ml.
Exemple 4 . Introduction de la séquence w à droite du génome viral
4.1. Introduction d'une cassette (SacB+specR) dans la région E4
4.1.1 Construction du plasmide pPY66 Le fragment Bcll-Avr2 (environ 0.5 kb) provenant du plasmide pFG144 correspond à l'extrémité droite du génome de l'AdS à partir du site Avr2 en position 35464. Le clonage de ce fragment entre les sites Xbal et BamHI du plasmide pIC19H préparé à partir d'un contexte E. coli dam- génère le plasmide pPY23. Ce plasmide est la source d'un fragment Sall-Hae3 d'environ 320 pb incluant l'extrémité droite du génome de l'Ad5 jusqu'au site Hae3 à la position 35617. Le clonage de ce fragment entre les sites Xhol et EcoRV du plasmide pIC20H génère le plasmide pPY29.
Le fragment Bgl2-Smal correspondant au génome de l'Ad5 entre les positions 32490 et 33093 est alors clone entre les sites BamHI et Smal du plasmide pPY29 ce qui génère le plasmide pPY64. Ce plasmide est la source d'un fragment Xbal-Hind3 dont le clonage entre les sites correspondants du multi-site de clonage du plasmide pXL2675 (Figure 14) génère le plasmide pPY65. Le plasmide pXL2675 (2513 pb) est un réplicon de type ColEl (inclus dans le fragment BsAl- Pvu2 d'environ 1.15 kb et provenant du plasmide commercial pBKS+) possédant un gène conférant la résistance à la kanamycine (provenant de Tn5, plasmide Pharmacia pUCKXXX) chez E. -coli et un multisite de clonage synthétique. Le plasmide pXL2757 (Figure 14) est la source d'un fragment Smal -EcoRV d'environ 4 kb contenant le gène sacB de B. subtilis et un gène conférant la résistance à la spectinomycine chez E. coli. La cassette (SacB+SpecR) de ce fragment clonée dans le site Smal du plasmide pPY65 génère le plasmide pPY66 (Figure 15).
4.1.2 Construction du génome viral chez E. coli Le plasmide pPY66 est utilisable pour introduire la cassette (SacB+SpecR) par recombinaison homologue avec un génome viral dérivé de l'Ad5 et inclus dans un réplicon fonctionnel chez E. coli polA. La technologie, décrite dans la demande de Brevet FR 95 016323, repose sur l'utilisation de certaines propriétés de la réplication chez E. coli. En effet, les réplicons de la classe d'incompatibilité HincP (et par exemple RK2) se répliquent en l'absence de l'enzyme codée par le gène polA. A l'inverse, les réplicons de type ColEl (plasmides de type pUC, pIC, pBR ...) ont besoin de cette enzyme pour se répliquer. Sur la base de cette observation, le génome de l'Ad5 dérivé du plasmide pFG144 à d'abord été clone sur le plasmide RK2 (de la classe HincP) puis introduit par électroporation dans une souche d'E. coli mutée dans le gène polA. Le fragment Xbal qui comporte le réplicon ColEl (pBR) inclus à la place de la région E3 dans le plasmide pFG144 a alors été délété du génome (demande de Brevet FR 95 016323). Ceci génère la souche d'E. coli appelée E. coli polA/Ad5. Un point important est que le génome adénoviral présent dans cette souche est bordé de sites Pacl de part et d'autre des ITR et que de tels génomes sont infectueux après transfection dans les cellules 293.
L'introduction de la cassette (SacB+SpecR) par recombinaison homologue chez E. coli polA/Ad5 s'effectue de la façon suivante: a) Le plasmide pPY66 est d'abord introduit par électroporation chez E. coli polA/Ad5. Une sélection en présence de spectinomycine et de kanamycine est effectuée. Les clones résistants correspondent alors à la formation d'un cointégrat entre le réplicon HincP/ Ad5 et le plasmide pPY66. Dans la quasi-totalité des cas, il y a eu insertion du plasmide pPY66 par un événement de recombinaison homologue entre les deux types de réplicons. Un clone correspondant au résultat d'une recombinaison au niveau de la région E4 entre les positions 32490 à 33093 (603 pb) est alors isolé (Figure 16 A). b) Ce clone bactérien possède une "répétition en sens direct" des séquences (A et B) de part et d'autre de la cassette (SacB+SpecR): 603 pb d'une part et 320 pb (extrémité droite du génome) d'autre part. La présence de telles séquences est une source d'instabilité et donne lieu à de rares événements de recombinaison homologue de part et d'autre de la cassette (SacB+SpecR). Ces événements de recombinaison homologues aboutissent à l'éjection du réplicon colEl et donc à la perte du marqueur de résistance à la kanamycine Les événement de recombinaison les plus nombreux ont lieu au niveau de la séquence de 603 pb et ne sont pas intéressant car ils régénèrent la situation de départ, c-a-d. un génome adénoviral ayant une région E4 non modifiée et ayant perdus leur caractère de résistance à la spectinomycine car ils ne possèdent plus la cassette (SacB+SpecR). Ils sont donc sensibles à cet antibiotique et sont-de plus capables de pousser en présence de sucrose comme source de carbone. A l'inverse, un événement de recombinaison homologue au niveau des 320 pb à l'extrémité droite du génome (séquence B) aboutit à la perte de la région E4 initialement présente, et à son remplacement par la cassette (SacB+SpecR) (Figure 16A). Ceci génère des clones d'E. coli appelé E. coli polA/Ad5[delE4(SacB+SpecR)]. De tels clones sont résistants à la spectinomycine et sont incapables de pousser en présence de sucrose comme unique source de carbone. Un clone d'E. coli possédant un tel génome modifié à l'extrémité droite est isolé du fait de son phénotype "kanamycine sensible", spectinomycine résistant, et sensibilité au sucrose.
4.2. Introduction de la séquence Ψ à droite du génome viral 4.2.1 Construction du plasmide pPY82
Le fragment Sall-Smal provenant du plasmide pPY6* et correspondant au génome de l'Ad5 des positions 32490 à 33093 est d'abord clone entre les sites correspondants du plasmide pCO7 ce qui génère le plasmide pPY81 Le plasmide pCO7, obtenu après restriction totale du plasmide pCOl par Pstl et religature, contient donc l'extrémité gauche de lΑd5 jusqu'à la position 382, le multi-site de clonage du plasmide pCOl, suivi de la séquence de l'Ad5 des positions 3446 jusqu'au site Pstl localisé à la position 3788. Le plasmide pPY81 est la source d'un fragment H3-Xbal d'environ 1.4 kb dont le clonage entre les sites correspondants du plasmide pXL2675 génère le plasmide pPY82 dont une carte de restriction est donnée à la Figure 15. 4.2.2 Construction du génome viral chez E. coli
L'introduction de la séquence Ψ à proximité immédiate de l'ITR droite se fait également par recombinaison homologue après introduction du plasmide pPY82 par électroporation chez E. coli génère le génome viral HincP/ Ad5[delE4(Ψ+ITR)] L'événement de fusion des réplicons est d'abord sélectionnée en présence de kanamycine. Un clone correspondant à un événement de recombinaison homologue entre les séquences 32490 et 33093 communes aux deux réplicons est alors isolé (Figure 16B). L'événement d'éjection du réplicon ColEl (provenant du plasmide pXL2675) est alors amplifié en levant la sélection à la kanamycine pendant un nombre suffisant de générations. Le glucose comme source de carbone est alors remplacé par du sucrose et on isole ainsi les clones bactériens pour lesquels l'événement d'éjection du réplicon ColEl s'est effectué par recombinaison homologue au niveau de l'ITR ce qui génère le génome viral HincP/ Ad5[delE4(Ψ+ITR)] (Figure 16B). Un clone correspondant à cet événement est alors isolé: E. coli polA/Ad5[delE4(Ψ+ITR)].
Exemple 5 - Mise au point d'une construction utile pour obtenir un virus dont le génome présente une délétion de la séquence Ψ à gauche
5.1. Introduction d'une cassette (SacB+SpecR) à gauche du génome viral
Le fragment Hind3-EcoRV (environ 0.4 kb) du plasmide pCOl inclus l'extrémité gauche du génome viral jusqu'à la position 382. Le clonage de ce fragment entre les sites correspondants du plasmide pXL2675 génère le plasmide pPY83. Le plasmide pCOlDSal est obtenu après digestion du plasmide pCOl (préparé dans un contexte dam+) par l'enzyme Xbal, traitement par le fragment Klenow de l'ADN polymérase I d'E. coli, puis religature. Ce plasmide est la source d'un fragment BamHI -Nsil d'environ 1 kb qui inclus les séquences de l'Ad5 des positions 3446 à 4419 (site Nsil ) Le clonage de ce fragment entre les sites BamHI et Pstl du plasmide pIC20R génère le plasmide pPY86 dans lequel les séquences comprises entre les positions 3446 à 4419 sont ^maintenant incluses dans un fragment BamHl-Bgl2 Le clonage de ce fragment au site BamHI du plasmide pPY83 génère le plasmide pPY87. Le fragment Smal -EcoRV correspondant à la cassette (SacB+SpecR) du plasmide pXL2757 est alors clone dans le site EcoRV du plasmide pPY87, ce qui génère le plasmide pPY88 (Figure 17). Ce plasmide est utilisé pour remplacer, selon une procédure analogue à la procédure décrite à la Figure 16 A, la partie gauche du génome HincP/Ad5[delE4(Ψ+ITR)] par la partie correspondante provenant du plasmide pPY88, ce qui génère le génome viral noté
HincP/Ad5[ITRΨdelEl(SacB+SpecR)delE4(Ψ+ITR)] dont la structure est donnée à la Figure 18. 5.2. Délétion de la séquence Ψ et introduction d'une région E4 fonctionnelle .
5.2.1. Construction du plasmide pGY50'
L'extrémité droite du génome de l'adénovirus a été amplifiée par PCR avec les oligonucléotides 5'-
CGGCGGGAATTCTTAATTAACATCATCAATAATATACCTTATTTTGG-3' (SEQ ID N°2) (les sites EcoRI et Pacl sont soulignés) et 5'- CACCACÇIGÇAGGGCAGCCATAACAGTCAGCCTTACC-3'(SEQ ID N°3) (le site Pstl est souligné) en utilisant le plasmide pY23 comme substrat (ce plasmide contient l'extrémité droite du génome adénoviral jusqu'au site Avr2 localisé à la position 35464). L'amplification PCR génère donc un fragment de 418 pb correspondant à l'extrémité droite de l'AdS et dans lequel un site Pacl puis un site EcoRI ont été introduits immédiatement en amont de l'ITR, alors qu'un site Pstl se trouve localisé à proximité immédiate de la position 35517. Le clonage de ce fragment entre les sites EcoRI et Pstl du plasmide pUC19 génère le plasmide pXL2624 (Cf. demande de Brevet FR.95 016323).
Le fragment EcoRI -Taql du plasmide pXL2624 correspondant à l'extrémité droite du génome viral à partir du site Taql en position 35576 est clone entre les sites EcoRI et Clal du plasmide pGY47', ce qui génère le plasmide pPY89. Ce plasmide est la source d'un fragment EcoRI -Sali d'environ 2 kb incluant l'extrémité droite du génome viral jusqu'à la position 35576, puis la sous région E4 (ORF6+ORF7) des positions 341 15 à à 32490. Le clonage des fragments EcoRI -Sali du plasmide pPY89 et Sali -Nsil (incluant le génome de l'Ad5 des positions 3446 à 4419) du plasmide pCOl entre les sites EcoRI et Pstl du plasmide pXL2675 génère le plasmide pGY50' (Figure 17).
5.2.2. Construction du plasmide pPY90'
Le fragment Kpnl-Sstl (environ 0.95 kb) du plasmide pPY78 correspond à la partie C-terminale de la région E4 comprise entre les positions 32891 à 33598, immédiatement suivie du signal de polyadénylation "tardif du virus SV40. Le clonage de ce fragment entre les sites correspondants du plasmide pPY89 génère le plasmide pPY90. Ce plasmide est la source d'un fragment EcoRI -Sali d'environ 2 kb incluant l'extrémité droite du génome viral jusqu'à la position 35576, puis la sous région E4 (ORF6+ORF7) des positions 34115 à 32891. Le clonage des fragments EcoRI -Sali du plasmide pPY90 et Sali -Nsil (incluant le génome de l'Ad5 des positions 3446 à 4419) du plasmide pCOl entre les sites EcoRI et Pstl du plasmide pXL2675 génère le plasmide pGY90' (Figure 17).
5.2.3. Introduction d'une région E4 fonctionnelle à l'extrémité gauche
Les plasmide pGY50' ou pPY90' sont utilisés pour remplacer, selon une procédure analogue à la procédure décrite à la Figure 16B, la partie gauche du génome HincP/Ad5[ITRΨdelEl(SacB+SpecR)[delE4(Ψ+ITR)] par la partie correspondante provenant desdits plasmides. Par exemple, l'utilisation du plasmide pPY90' génère le génome viral noté HincP/Ad5[ITRDΨdelEl(ORF6+ORF7)[delE4(Ψ+ITR)] dont la structure est donnée à la Figure 18.
Exemple 6 - Mise au point d'une construction utile pour obtenir un virus dont le génome présente de nouvelles délétions E4 à droite 6.1. En l'absence de la séquence Ψ
6.1.1. Délétion Mae2-Hae3 (3281 1-35617)
Le plasmide pPY32 est décrit dans la demande de brevet Fr. 94 04590 (18.04.94). Ce plasmide est la source d'un fragment Bgl2-Hind3 d'environ 0.65 kb correspondant à l'extrémité droite du génome de l'Ad5 à partir du site Bgl2 (position 32490) et délété entre les sites Mae2 (position 3281 1) jusqu'au site Hae3 (position 35617). Le clonage de ce fragment entre les sites BamHI et Hind3 du plasmide pXL2675 génère le plasmide pPY70, dont une carte de restriction est donnée à la Figure 19. Ce plasmide est utilisable pour introduire la délétion E4 correspondante par recombinaison homologue, par exemple chez E. coli polA/Ad5[delE4(SacB+SpecR)].
6.1.2. Délétion Taql-Ayr2 (33055-35464)
Le plasmide pGY12 corresponds au clonage du fragment BssH2-Mscl (positions 33249-32720) entre les sites BssH2 et EcoRV du plasmide commercial pSL1180 (Figure 20). Le clonage des fragments EcoRI -Taq l du plasmide pXL2624 (ce fragment corresponds à l'extrémité droite du génome de l'Ad5 jusqu'au site Taql en position 35576) et Taql-BssH2 (positions 35576 à 33249) entre les sites EcoRI et BssH2 du plasmide pGY12 génère le plasmide pGY13. Ce plasmide est donc la source d'un fragment EcoRI -Hpal (environ 3.25 kb) incluant l'extrémité droite du génome de l'Ad5 jusqu'à la position 32720. Le clonage de ce fragment entre les sites EcoRI et Smal du plasmide pIC20H génère le plasmide pGY14 (Figure 20). Ce plasmide est la source d'un fragment EcoRI -BspHl correspondant l'extrémité droite du génome de l'Ad5 jusqu'à la position 34700. Le clonage de ce fragment avec le fragment BspHl-Xbal du génome de l'Ad5 (positions 33750 à 30470) entre les sites Xbal et EcoRI du plasmide pIC20H préparé à partir d'un contexte dam+ génère le plasmide pMC2 (Figure 20).
Le fragment Sphl-Taql localisé entre les positions 31224 à 33055 sur le génome de l'Ad5 est purifié à partir du plasmide pMC2 puis clone entre les sites Sphl et Clal du plasmide pIC20H, ce qui génère le plasmide pYJ5. Après transfert dans un contexte E. coli dam-, ce plasmide est la source d'un fragment Bgl2-Xbal qui inclus la séquence du génome viral situé entre les positions 32490 à 33055. Ce fragment Bgl2- Xbal est alors clone avec le fragment Avr2-Xhol provenant du plasmide pMC2 et incluant l'extrémité droite du génome viral à partir du site Avr2 localisé à la position 35464, entre les sites BamHI et Xhol du plasmide pXL2675, ce qui génère le plasmide pPY71, (Figure 19). Ce plasmide est utilisable pour introduire la délétion E4 correspondante par recombinaison homologue, par exemple chez E. coli polA Ad5[delE4(SacB+SpecR)].
6.1.3. Délétion Smal-Smal (33093-35356)
Le plasmide pMC2DSmal est obtenu après digestion totale du plasmide pMC2 par Smal puis religature. Ce plasmide est la source d'un fragment Bgl2-Hind3 d'environ 1.2 kb incluant la totalité de l'extrémité droite du génome de l'Ad5 à partir de la position 32490 et délété dans la région E4 entre les positions 33093 et 35356. Le clonage de ce fragment entre les sites BamHI et Hind3 du plasmide pXL2675 génère le plasmide pPY72 dont une carte de restriction est donnée à la Figure 19. Ce plasmide est utilisable pour introduire la délétion E4 correspondante par recombinaison homologue, par exemple chez E. coli polA/Ad5[delE4(SacB+SpecR)].
6.2. En présence de la séquence Ψ
6.2.1. Délétion Smal-Smal (33093-35356) Le fragment BamHI -EcoRI du plasmide pGY9 (environ 1.2 kb) inclus l'extrémité droite du génome de l'Ad5 à partir du site Sau3A en position 34773. Ce fragment de restriction est purifié par electroélution, coupé par Smal, puis soumis à une hydrolyse partielle par l'enzyme Mae2. Un des produits de restriction corresponds au fragment Maell (35835)-SmaI (35356). Le clonage de ce fragment entre les sites Smal et Clal du plasmide pPY82 génère le plasmide pPY75 (Figure 15). Ce plasmide est utilisable pour introduire la délétion E4 correspondante par recombinaison homologue, par exemple chez E. coli polA/Ad5[delE4(SacB+specR)(Ψ+ITR)].
6.2.2. Délétion Taαl -Smal (33055-35356)
Le fragment Taql du plasmide pPY82 qui inclus les positions 32490 (site Sali du multisite de clonage) à 33055 est clone dans le site Clal du plasmide pIC20H ce qui génère le plasmide pICTaq dans lequel le site Xhol du multisite est positionné à proximité immédiate de la position 32490. Le plasmide pICTaq est la source d'un fragment Xhol-Smal incluant les positions 32490 à 33055 dont le clonage entre les sites Sali et Smal du plasmide pPY75 génère le plasmide pPY91 (Figure 21).
6.2.3. Délétion Hpa2-Smal (32980-35356) Le fragment Sall-Hpa2 du plasmide pPY82 qui inclus les positions 32490 à 32980 est clone entre les sites Sali et Clal du plasmide pIC20H ce qui génère le plasmide pPY93. Ce plasmide est la source d'un fragment Sali -EcoRV incluant les positions 32490 à 32980 dont le clonage entre les sites Sali et. Smal du plasmide pPY75 génère le plasmide pPY94 (Figure 21).
6.2.1. Délétion Sau3A-Smal (32891-35356)
Le fragment Sau3A du plasmide pPY82 qui inclus les positions 32490 à 32891 est clone dans le site BamHI du plasmide pIC20H ce qui génère le plasmide pICSau dans lequel le site Sali du multisite est positionné à proximité immédiate de la position 32490. Le plasmide pICSau est la source d'un fragment Sali -Smal incluant les positions 32490 à 32891 dont le clonage entre les sites correspondants du plasmide pPY75 génère le plasmide pPY92 (Figure 21).
Exemple 7 - Protocole de transfection des cellules 293 par les génomes recombinants construits chez E. Coli selon les exemples 4 et 5. La construction des plasmides décrits selon les exemples 4 et 5, ou de plasmides analogues qui par exemple sont caractérisés par des délétions E4 différentes, ou par des régions E4 fonctionnelles modifiées, ou par exemple correspondant à l'introduction d'une cassette d'expression d'un gène thérapeutique donné ect..., sont utilisés pour générer les génomes viraux recombinants par recombinaison homologue chez E. coli polA Après vérification par restriction, un clone bactérien est alors isolé et son contenu plasmidique est extrait et purifié. L'ADN est alors soumis à une digestion totale par l'enzyme Pacl et transfecté dans les cellules 293. Cet ADN est infectueux (virus E1-E4+) et un effet cytopathique (CPE) apparait après environ 2 semaines. Le CPE est alors progressivement amplifié dans les cellules 293 et un stock viral est préparé (cf. Demande de Brevet FR 016323).
Exemple 8 - Construction pour préparer un virus dont le génome présente un déplacement de la région pIX
8. 1. Construction du plasmide pCOl-pIX
II est utile de modifier l'orientation des séquences codant pour la pIX virale au sein du génome, de telle sorte qu'une recombinaison entre le génome cellulaire et les ADN viraux ne génère pas une particule réplicative, mais un virus ne contenant que ses ITR, les régions El A et El B et la séquence codant pour la pIX. Un tel virus est défectif et beaucoup plus petit que l' Adenovirus recombinant, ce qui permet facilement de le séparer par centrifugation sur chlorure de césium lors de la préparation des stocks viraux (Figure 22). Le plasmide pCR2-pIX a été construit par clonage dans le plasmide PCR2
(Invitrogen) du produit d'amplification par PCR du plasmide pCOl avec les oligonucléotides 5*-GATATCTGAAGATACAGATTGAG-3'(SEQ ID N°4) et 5*- CGGCCGTTAAACCGCATTGGGAG-3'(SEQ ID N°5).
Le plasmide pIC-pIX-pA a été construit par clonage du fragment EcoRV-Eagl de pCR2-pIX et du fragment Eagl-BamHl du plasmide pCI (Promega) contenant le polyA de SV40 dans le plasmide pIC20R digéré par EcoRV et BamHI .
Le plasmide pCR2-IVa2 a été construit par clonage dans le plasmide PCR2 (Invitrogen) du produit d'amplification par PCR du plasmide pCOl avec les oligonucléotides 5'-AAGCTTATTGCCATCATTATGGAC-3'(SEQ ID N°6) et 5'- ACTAGTTATTTAGGGGTTTTGCGC-3'(SEQ ID N°7).
Le plasmide pIC-IVa2-pA a été construit par clonage du fragment Hind3-Spel de pCR2-IVa2 et du fragment Xbal -Sphl du plasmide pCDNA3 (Invitrogen) contenant le signal de polyadénylation du gène de l'hormone de croissance bovine, dans le plasmide pIC20R digéré par Hind3 et Sphl. Le fragment BstXl-Sall du plasmide pIC-IVa2-pA a ensuite été clone entre les sites BstXl-Sall du plasmide pCOl, créant ainsi le plasmide pCOl-_pIX. Le plasmide pCOl-pIX a été construit par introduction de la cassette Clal de pIC-pIX-pA dans le site Clal de pCOl-_pIX, de telle sorte que le gène codant pour la pIX soit orienté dans le même sens que celui codant pour la IVa2, contrairement à son orientation dans le génome adénoviral
Le plasmide pCOl-pIX contient donc les séquences ITR-Ψ de l'Ad5, une cassette d'expression de la pIX du virus (promoteur et gène de la pIX suivis du polyA de SV40) orientée dans le sens inverse de son orientation naturelle au sein de l'Ad5, suivis des séquences de la IVa2 dont le polyA a été remplacé par celui de l'hormone de croissance bovine
8. 2. Construction du virus Le virus recombinant a été construit "de façon classique" par cotransfection dans les cellules 293 du plasmide pCOl-pIX linéarisé par Xhol et par l'ADN viral du virus AdRS VBGal digéré par Cla 1
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: RHONE POULENC RORER S.A.
(B) RUE: 20, Avenue Raymond Aron
(C) VILLE: ANTONY (E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92165
(G) TELEPHONE: 40.91.69.22
(H) TELECOPIE: (1) 40.91.72.96 (ii) TITRE DE L' INVENTION: ADENOVIRUS DEPOURVUS DE PARTICULES CONTAMINANTES VIABLES, PREPARATION ET UTILISATIONS.
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 7 (iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 22paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: AGATCCTCTA GCTAGAGTCG AC 22
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 57 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: CGGCGGGAAT TCTTAATTAA CATCATCAAT AATATACCTT ATTTTGG 57
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: paires de bases
(B) TYPE: 37 nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
CACCACCTGC AGGGCAGCCA TAACAGTCAG CCTTACC 37
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 23 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
GATATCTGAA GATACAGATT GAG 23
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 23 paires de bases (B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
CGGCCGTTAA ACCGCATTGG GAG 23
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
AAGCTTATTG CCATCATTAT GGAC 24
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 24paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
ACTAGTTATT TAGGGGTTTT GCGC 24

Claims

REVENDICATIONS
1. Adenovirus recombinant caractérisé en ce qu'il comprend un génome d'adénovirus dont la région El est inactivée, dont l'organisation génomique est modifiée et dont la recombinaison éventuelle avec le génome de la lignée de production conduit à la génération de particules virales non-viables.
2. Adenovirus recombinant selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'au moins une région essentielle à sa réplication et/ou à sa propagation est présente dans une position génomique autre que sa position d'origine.
3. Adenovirus recombinant selon la revendication 2 caractérisé en ce que la région essentielle se situe à proximité ou au niveau d'une autre région génomique non fonctionnelle.
4. Adenovirus recombinant selon la revendication 3 caractérisé en ce que la région génomique non fonctionnelle est une région inactivée par mutation et/ou délétion d'une ou de plusieurs bases.
5. Adenovirus recombinant selon la revendication 3 ou 4 caractérisé en ce que la région non fonctionnelle est inactivée par délétion partielle ou totale.
6. Adenovirus recombinant selon l'une des revendications 2 à 5 caractérisé en ce que la région non fonctionnelle est représentée par la région El inactivée et/ou la région E3.
7. Adenovirus recombinant selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que la région El est inactivée par délétion d'un fragment PvuII-BglII allant du nucléotide 454 au nucléotide 3328 ou d'un fragment HinfII-Sau3A allant du nucléotide 382 au nucléotide 3446.
8. Adenovirus recombinant selon l'une des revendications 2 à 7 caractérisé en ce que la région essentielle à la réplication et/ou la viabilité virale est choisie parmi tout ou partie de la région E4 et/ou de la région pIX-IVa2, et/ou de la région pIX et/ou de la région L5
9. Adenovirus selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que son organisation génomique est telle que la région E4 est positionnée, en tout ou partie, au niveau ou à proximité du site de délétion de la région El
10. Adenovirus recombinant selon la revendication 9 caractérisé en ce que la région E4 est représentée par le fragment Maell-Mscl correspondant aux nucléotides
35835-32720.
1 1 Adenovirus recombinant selon la revendication 9 caractérisé en ce que la région E4 est représentée par au moins la phase codante ORF3.
12. Adenovirus recombinant selon la revendication 7 ou 8 caractérisé en ce que la région E4 est représentée par au moins la phase codante ORF6.
13. Adenovirus recombinant selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que son organisation génomique est telle que l'ensemble de la région codant pour les protéines pIX et IVa2 est positionnée au niveau de la région E3, éventuellement en remplacement de séquences délétées.
14. Adenovirus recombinant selon la revendication 13 caractérisé en ce que la région codant pour pIX-IVa2 est constituée d'un fragment BglII-NruI comprenant les nucléotides 3328 à 6316 sur la séquence de l'adénovirus Ad5.
15. Adenovirus recombinant selon la revendication 1 caractérisé en ce que la lignée de production est la lignée 293.
16. Adenovirus recombinant caractérisé en ce que son génome possède des régions El et E4 inactivées et en ce que tout ou une partie fonctionnelle de la région E4 est présente au niveau ou à proximité de la région El inactivée.
17. Adenovirus recombinant caractérisé en ce que son organisation génomique est telle que l'ensemble de la région codant pour la protéine pIX et tout ou seulement une partie fonctionnelle de la région E4 sont déplacées de leur position d'origine.
18. Adenovirus selon la revendication 17 caractérisée en ce que les deux régions sont déplacées au niveau de la région El en remplacement de séquences délétées
19. Adenovirus selon la revendication 17 ou 18 caractérisé en ce que le cadre de lecture corrrespondant au domaine codant pour la protéine pIX y est placé en lecture inversée.
20. Adenovirus selon les revendications 17, 18, et 19 caractérisé en ce que l'extrémité gauche, comportant l'ITR et la région d'encapsidation, et l'extrémité droite, comportant l'ITR, sont permutées.
21. Adenovirus recombinant caractérisé en ce que son génome possède une région El inactivée et en ce que l'extrémité gauche, comportant l'ITR et la région d'encapsidation, et l'extrémité droite, comportant l'ITR et tout ou une partie fonctionnelle de la région E4, sont permutées.
22. Adenovirus recombinant selon les revendications 20 ou 21 caractérisé en ce que l'extrémité gauche est contenue dans les 382 premiers nucléotides du génome de l'Ad5 et l'extrémité droite est contenue dans les 3215 derniers nucléotides du génome de l'Ad5.
23. Adenovirus recombinant caractérisé en ce que son génome possède des régions El et L5 inactivées et en ce que tout ou une partie fonctionnelle de la région L5 est présente au niveau ou à proximité de la région El inactivée.
24. Adenovirus recombinant selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce qu'il comprend les ITR et une région d'encapsidation.
25. Adenovirus recombinant selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce qu'il comporte une séquence d'acides nucléiques hétérologue.
26. Adenovirus recombinant selon la revendication 25 caractérisé en ce que la séquence d'acides nucléiques hétérologue comprend un ou plusieurs gènes thérapeutiques.
27. Adenovirus recombinant selon la revendication 25 ou 26 caractérisé en ce que la séquence d'acides nucléiques hétérologue est présente au niveau des région E 1 , E3 ou E4, en supplément ou en remplacement de séquences délétées.
28. Adenovirus selon l'une des revendication précédentes caractérisé en ce que le génome d'adénovirus est d'origine humaine, animale, ou mixte.
29. Adenovirus selon la revendication 28 caractérisé en ce que les adenovirus d'origine humaine sont choisis parmi ceux classés dans le groupe C, de préférence parmi les adenovirus de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5)
30. Adenovirus selon la revendication 28 caractérisé en ce que les adenovirus d'origine animale sont choisis parmi les adenovirus d'origine canine, bovine, murine, ovine, porcine, aviaire et simienne.
31. Composition pharmaceutique comprenant au moins un adenovirus recombinant défectif selon l'une des revendications 1 à30.
32. Composition pharmaceutique selon la revendication 31 comprenant un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable
33. Plasmides pCOl-E4 comprenant la partie gauche du génome de l'adénovirus Ad5, depuis l'ITR gauche jusqu'au nucléotide 6316, avec une délétion de la région comprise entre les nucléotides 382-3446 correspondant au gène El, au niveau de laquelle est inséré tout ou une partie fonctionnelle de E4.
34. Procédé de préparation d'adénovirus recombinants dépourvus de particules réplicatives caractérisé en ce que l'on co-transfecte une lignée cellulaire compétente avec - un premier ADN comprenant la partie gauche du génome dudit adenovirus, possédant une délétion dans la région El au niveau ou à proximité de laquelle est insérée au moins une partie fonctionnelle de la région E4, et
- un second ADN comprenant au moins la partie droite du génome dudit adenovirus, possédant une région E4 inactivée, et une partie commune à celle du premier ADN, et on récupère les adenovirus produits par recombinaison.
35. Procédé selon la revendication 34 caractérisé en ce que la lignée cellulaire est la lignée 293.
36. Procédé selon la revendication 34 caractérisé en ce que le premier ADN est choisi parmi les plasmides de type pC01-E4.
37. Procédé selon l'une des revendications 34 à 36 caractérisé en ce que le premier ou le second ADN porte en outre une séquence d'ADN hétérologue d'intérêt
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