CZ20001791A3 - Metody snížení výskytu homologních rekombinací, adenovirové vektory a buňky obsahující degektní adenovirus - Google Patents
Metody snížení výskytu homologních rekombinací, adenovirové vektory a buňky obsahující degektní adenovirus Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20001791A3 CZ20001791A3 CZ20001791A CZ20001791A CZ20001791A3 CZ 20001791 A3 CZ20001791 A3 CZ 20001791A3 CZ 20001791 A CZ20001791 A CZ 20001791A CZ 20001791 A CZ20001791 A CZ 20001791A CZ 20001791 A3 CZ20001791 A3 CZ 20001791A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- sequence
- adenovirus
- region
- genome
- defective
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 47
- 230000002950 deficient Effects 0.000 title claims abstract description 46
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 title claims description 72
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 title claims description 41
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 title claims description 41
- 239000013598 vector Substances 0.000 title description 27
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 71
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 66
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 66
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 61
- 101150032643 IVa2 gene Proteins 0.000 claims description 37
- 101150088856 pix gene Proteins 0.000 claims description 24
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 10
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 10
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 10
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 10
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 claims description 8
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 7
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 claims description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 4
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 claims 2
- 108010056962 Adenovirus E4 Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 108700026758 Adenovirus hexon capsid Proteins 0.000 claims 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 40
- 230000006798 recombination Effects 0.000 abstract description 40
- 238000005215 recombination Methods 0.000 abstract description 38
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 abstract description 22
- 239000002245 particle Substances 0.000 abstract description 11
- 230000010076 replication Effects 0.000 abstract description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 61
- 101150057615 Syn gene Proteins 0.000 description 36
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 32
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 20
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 18
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 18
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 16
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 12
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 12
- BYXHQQCXAJARLQ-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ala-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O BYXHQQCXAJARLQ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 11
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 10
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 10
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 10
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 9
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 8
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 8
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 6
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- DCVYRWFAMZFSDA-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ser-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DCVYRWFAMZFSDA-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- JBVSSSZFNTXJDX-YTLHQDLWSA-N Ala-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)N JBVSSSZFNTXJDX-YTLHQDLWSA-N 0.000 description 3
- JBGSZRYCXBPWGX-BQBZGAKWSA-N Ala-Arg-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CCCN=C(N)N JBGSZRYCXBPWGX-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- FXKNPWNXPQZLES-ZLUOBGJFSA-N Ala-Asn-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FXKNPWNXPQZLES-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 3
- MMGCRPZQZWTZTA-IHRRRGAJSA-N Arg-His-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N MMGCRPZQZWTZTA-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- AUIJUTGLPVHIRT-FXQIFTODSA-N Arg-Ser-Cys Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)CN=C(N)N AUIJUTGLPVHIRT-FXQIFTODSA-N 0.000 description 3
- SJUXYGVRSGTPMC-IMJSIDKUSA-N Asn-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O SJUXYGVRSGTPMC-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- BQSLGJHIAGOZCD-CIUDSAMLSA-N Leu-Ala-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BQSLGJHIAGOZCD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- PVMPDMIKUVNOBD-CIUDSAMLSA-N Leu-Asp-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O PVMPDMIKUVNOBD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- ZFNLIDNJUWNIJL-WDCWCFNPSA-N Leu-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O ZFNLIDNJUWNIJL-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 3
- PDQDCFBVYXEFSD-SRVKXCTJSA-N Leu-Leu-Asp Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O PDQDCFBVYXEFSD-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- LXKNSJLSGPNHSK-KKUMJFAQSA-N Leu-Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N LXKNSJLSGPNHSK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 3
- ZJZNLRVCZWUONM-JXUBOQSCSA-N Leu-Thr-Ala Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZJZNLRVCZWUONM-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 3
- ZDJQVSIPFLMNOX-RHYQMDGZSA-N Leu-Thr-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N ZDJQVSIPFLMNOX-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 3
- LRALLISKBZNSKN-BQBZGAKWSA-N Met-Gly-Ser Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O LRALLISKBZNSKN-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- YCCUXNNKXDGMAM-KKUMJFAQSA-N Phe-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YCCUXNNKXDGMAM-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 3
- ZUGXSSFMTXKHJS-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ala-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZUGXSSFMTXKHJS-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 3
- FIXILCYTSAUERA-FXQIFTODSA-N Ser-Ala-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O FIXILCYTSAUERA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 3
- QVOGDCQNGLBNCR-FXQIFTODSA-N Ser-Arg-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O QVOGDCQNGLBNCR-FXQIFTODSA-N 0.000 description 3
- BKZYBLLIBOBOOW-GHCJXIJMSA-N Ser-Ile-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O BKZYBLLIBOBOOW-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 3
- OLKICIBQRVSQMA-SRVKXCTJSA-N Ser-Ser-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O OLKICIBQRVSQMA-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- KRPKYGOFYUNIGM-XVSYOHENSA-N Thr-Asp-Phe Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)N)O KRPKYGOFYUNIGM-XVSYOHENSA-N 0.000 description 3
- IMDMLDSVUSMAEJ-HJGDQZAQSA-N Thr-Leu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O IMDMLDSVUSMAEJ-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 3
- BBPCSGKKPJUYRB-UVOCVTCTSA-N Thr-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BBPCSGKKPJUYRB-UVOCVTCTSA-N 0.000 description 3
- CXUFDWZBHKUGKK-CABZTGNLSA-N Trp-Ala-Gly Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O)=CNC2=C1 CXUFDWZBHKUGKK-CABZTGNLSA-N 0.000 description 3
- KOVXHANYYYMBRF-IRIUXVKKSA-N Tyr-Glu-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N)O KOVXHANYYYMBRF-IRIUXVKKSA-N 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 108010069495 cysteinyltyrosine Proteins 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- YYSWCHMLFJLLBJ-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ala-Ser Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YYSWCHMLFJLLBJ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- LWUWMHIOBPTZBA-DCAQKATOSA-N Ala-Arg-Lys Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O LWUWMHIOBPTZBA-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- VNYMOTCMNHJGTG-JBDRJPRFSA-N Ala-Ile-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VNYMOTCMNHJGTG-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 2
- NCQMBSJGJMYKCK-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NCQMBSJGJMYKCK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- MTDDMSUUXNQMKK-BPNCWPANSA-N Ala-Tyr-Arg Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N MTDDMSUUXNQMKK-BPNCWPANSA-N 0.000 description 2
- 101100165660 Alternaria brassicicola bsc6 gene Proteins 0.000 description 2
- -1 ApoAIV Proteins 0.000 description 2
- XMGVWQWEWWULNS-BPUTZDHNSA-N Arg-Trp-Ser Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N XMGVWQWEWWULNS-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 2
- ZLGKHJHFYSRUBH-FXQIFTODSA-N Asp-Arg-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O ZLGKHJHFYSRUBH-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- CELPEWWLSXMVPH-CIUDSAMLSA-N Asp-Asp-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CELPEWWLSXMVPH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- 101100499295 Bacillus subtilis (strain 168) disA gene Proteins 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 2
- 101150005585 E3 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 2
- HIAHVKLTHNOENC-HGNGGELXSA-N His-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HIAHVKLTHNOENC-HGNGGELXSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- AREBLHSMLMRICD-PYJNHQTQSA-N Ile-His-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N AREBLHSMLMRICD-PYJNHQTQSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HQUXQAMSWFIRET-AVGNSLFASA-N Leu-Glu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN HQUXQAMSWFIRET-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- FZDOBWIKRQORAC-ULQDDVLXSA-N Met-Tyr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CCSC)N FZDOBWIKRQORAC-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 101150007210 ORF6 gene Proteins 0.000 description 2
- CSYVXYQDIVCQNU-QWRGUYRKSA-N Phe-Asp-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O CSYVXYQDIVCQNU-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- 101100226894 Phomopsis amygdali PaGT gene Proteins 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- HRNQLKCLPVKZNE-CIUDSAMLSA-N Ser-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O HRNQLKCLPVKZNE-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- SFTZWNJFZYOLBD-ZDLURKLDSA-N Ser-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CO SFTZWNJFZYOLBD-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 2
- CICQXRWZNVXFCU-SRVKXCTJSA-N Ser-His-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O CICQXRWZNVXFCU-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 2
- XVNZSJIKGJLQLH-RCWTZXSCSA-N Thr-Arg-Met Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)N)O XVNZSJIKGJLQLH-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 2
- HXMJXDNSFVNSEH-IHPCNDPISA-N Trp-Cys-Tyr Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC3=CC=C(C=C3)O)C(=O)O)N HXMJXDNSFVNSEH-IHPCNDPISA-N 0.000 description 2
- FGJWNBBFAUHBEP-IHPCNDPISA-N Tyr-Asp-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC3=CC=C(C=C3)O)N FGJWNBBFAUHBEP-IHPCNDPISA-N 0.000 description 2
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 2
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 2
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 108700004029 pol Genes Proteins 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 2
- 108010027345 wheylin-1 peptide Proteins 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- AWZKCUCQJNTBAD-SRVKXCTJSA-N Ala-Leu-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN AWZKCUCQJNTBAD-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- ALZVPLKYDKJKQU-XVKPBYJWSA-N Ala-Tyr Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 ALZVPLKYDKJKQU-XVKPBYJWSA-N 0.000 description 1
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000013918 Apolipoproteins E Human genes 0.000 description 1
- 108010025628 Apolipoproteins E Proteins 0.000 description 1
- KMSHNDWHPWXPEC-BQBZGAKWSA-N Arg-Asp-Gly Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O KMSHNDWHPWXPEC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- JQFZHHSQMKZLRU-IUCAKERBSA-N Arg-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N JQFZHHSQMKZLRU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- SONUFGRSSMFHFN-IMJSIDKUSA-N Asn-Ser Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SONUFGRSSMFHFN-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- VBKIFHUVGLOJKT-FKZODXBYSA-N Asn-Thr Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O VBKIFHUVGLOJKT-FKZODXBYSA-N 0.000 description 1
- HTOZUYZQPICRAP-BPUTZDHNSA-N Asp-Arg-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N HTOZUYZQPICRAP-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 1
- FRYULLIZUDQONW-IMJSIDKUSA-N Asp-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FRYULLIZUDQONW-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- PYXXJFRXIYAESU-PCBIJLKTSA-N Asp-Ile-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O PYXXJFRXIYAESU-PCBIJLKTSA-N 0.000 description 1
- ZARXTZFGQZBYFO-JQWIXIFHSA-N Asp-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)N)C(O)=O)=CNC2=C1 ZARXTZFGQZBYFO-JQWIXIFHSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 102100038909 Caveolin-2 Human genes 0.000 description 1
- 208000037088 Chromosome Breakage Diseases 0.000 description 1
- 108010005939 Ciliary Neurotrophic Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100031614 Ciliary neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 108010080611 Cytosine Deaminase Proteins 0.000 description 1
- 102000000311 Cytosine Deaminase Human genes 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- 108010069091 Dystrophin Proteins 0.000 description 1
- 102000001039 Dystrophin Human genes 0.000 description 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000004038 Glia Maturation Factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000495 Glia Maturation Factor Proteins 0.000 description 1
- ITYRYNUZHPNCIK-GUBZILKMSA-N Glu-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ITYRYNUZHPNCIK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- YBAFDPFAUTYYRW-YUMQZZPRSA-N Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- VMKCPNBBPGGQBJ-GUBZILKMSA-N Glu-Leu-Asn Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N VMKCPNBBPGGQBJ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- YKBUCXNNBYZYAY-MNXVOIDGSA-N Glu-Lys-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O YKBUCXNNBYZYAY-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 1
- 102100033366 Glutathione hydrolase 1 proenzyme Human genes 0.000 description 1
- 101710205562 Glutathione hydrolase 1 proenzyme Proteins 0.000 description 1
- DKEXFJVMVGETOO-LURJTMIESA-N Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN DKEXFJVMVGETOO-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- YSDLIYZLOTZZNP-UWVGGRQHSA-N Gly-Leu-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CN YSDLIYZLOTZZNP-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 1
- BXOLYFJYQQRQDJ-MXAVVETBSA-N His-Leu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N BXOLYFJYQQRQDJ-MXAVVETBSA-N 0.000 description 1
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 1
- 101000740981 Homo sapiens Caveolin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 1
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 1
- 241000701096 Human adenovirus 7 Species 0.000 description 1
- 101100294463 Human adenovirus E serotype 4 L2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- LQSBBHNVAVNZSX-GHCJXIJMSA-N Ile-Ala-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N LQSBBHNVAVNZSX-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- KBAPKNDWAGVGTH-IGISWZIWSA-N Ile-Ile-Tyr Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KBAPKNDWAGVGTH-IGISWZIWSA-N 0.000 description 1
- MUFXDFWAJSPHIQ-XDTLVQLUSA-N Ile-Tyr Chemical compound CC[C@H](C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CC=C(O)C=C1 MUFXDFWAJSPHIQ-XDTLVQLUSA-N 0.000 description 1
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- MLTRLIITQPXHBJ-BQBZGAKWSA-N Leu-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O MLTRLIITQPXHBJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- IGUOAYLTQJLPPD-DCAQKATOSA-N Leu-Asn-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N IGUOAYLTQJLPPD-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- XWOBNBRUDDUEEY-UWVGGRQHSA-N Leu-His Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 XWOBNBRUDDUEEY-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- OZTZJMUZVAVJGY-BZSNNMDCSA-N Leu-Tyr-His Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N OZTZJMUZVAVJGY-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- UWKNTTJNVSYXPC-CIUDSAMLSA-N Lys-Ala-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN UWKNTTJNVSYXPC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- GQFDWEDHOQRNLC-QWRGUYRKSA-N Lys-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN GQFDWEDHOQRNLC-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001055320 Myxine glutinosa Insulin-like growth factor Proteins 0.000 description 1
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AUEJLPRZGVVDNU-UHFFFAOYSA-N N-L-tyrosyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 AUEJLPRZGVVDNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 101100065105 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) egt-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000742 Neurotrophin 3 Proteins 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 101100379247 Salmo trutta apoa1 gene Proteins 0.000 description 1
- NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- OCWWJBZQXGYQCA-DCAQKATOSA-N Ser-Lys-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O OCWWJBZQXGYQCA-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- LDEBVRIURYMKQS-WISUUJSJSA-N Ser-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO LDEBVRIURYMKQS-WISUUJSJSA-N 0.000 description 1
- DYEGLQRVMBWQLD-IXOXFDKPSA-N Ser-Thr-Phe Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N)O DYEGLQRVMBWQLD-IXOXFDKPSA-N 0.000 description 1
- SNXUIBACCONSOH-BWBBJGPYSA-N Ser-Thr-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SNXUIBACCONSOH-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 1
- 241000580858 Simian-Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 102100032889 Sortilin Human genes 0.000 description 1
- 101000870438 Streptococcus gordonii UDP-N-acetylglucosamine-peptide N-acetylglucosaminyltransferase stabilizing protein GtfB Proteins 0.000 description 1
- 101100038645 Streptomyces griseus rppA gene Proteins 0.000 description 1
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 108700025695 Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- JLNMFGCJODTXDH-WEDXCCLWSA-N Thr-Lys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(O)=O JLNMFGCJODTXDH-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- QYDKSNXSBXZPFK-ZJDVBMNYSA-N Thr-Thr-Arg Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O QYDKSNXSBXZPFK-ZJDVBMNYSA-N 0.000 description 1
- LVRFMARKDGGZMX-IZPVPAKOSA-N Thr-Tyr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LVRFMARKDGGZMX-IZPVPAKOSA-N 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- SMDQRGAERNMJJF-JQWIXIFHSA-N Trp-Cys Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O)=CNC2=C1 SMDQRGAERNMJJF-JQWIXIFHSA-N 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- ZNFPUOSTMUMUDR-JRQIVUDYSA-N Tyr-Asn-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O ZNFPUOSTMUMUDR-JRQIVUDYSA-N 0.000 description 1
- MVFQLSPDMMFCMW-KKUMJFAQSA-N Tyr-Leu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O MVFQLSPDMMFCMW-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 101000645119 Vibrio campbellii (strain ATCC BAA-1116 / BB120) Nucleotide-binding protein VIBHAR_03667 Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108010070783 alanyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 1
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 1
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000024321 chromosome segregation Effects 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 229940102223 injectable solution Drugs 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 108010044374 isoleucyl-tyrosine Proteins 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009452 underexpressoin Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Description
Metody snížení výskytu homologních rekortibinací, adenovirové vektory a buňky obsahující defektní adenovirus
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká způsobu snížení výskytu událostí homologní rekombinace mezi nukleovými kyselinami. Týká se také použití těchto metod ve způsobech pro přípravu nukleových kyselin jako jsou plazmidy nebo virové vektory. Předkládaný vynález se také týká nových virových konstruktů.
Dosavadní stav techniky
Rekombinace mezi nukleovými kyselinami je v molekulární biologii dobře známý jev. 'Rekombinace je molekulární mechanismus, kterým vznikají nové kombinace genetického materiálu, což přispívá k Darwinovské evoluci tím, že poskytuje zdroj materiálu pro přírodní výběr. Genetická rekombinace, která vyžaduje silnou sekvenční homologii mezi zúčastněnými nukleovými kyselinami se obecně označuje jako homologní rekombinace.' V průběhu homologní rekombinace dojde k výměně genetické informace mezi dvěma úseky nukleové kyseliny, přičemž tato výměna může být reciproká (pak jde o tzv. crossing-over) nebo nereciproká (pak jde o tzv. konverzi).
V průběhu meioze je homologní rekombinace zodpovědná za změny v uspořádání genetické informace a hraje důležitou roli ve správně segregaci chromozómů. V průběhu mitózy se homologní rekombinace podílí na reparacích DNA. V jejím důsledku může dojít ke změnám uspořádání genomu jako jsou např. delece a duplikace, jestliže se účastní dispergované • · • ··· homologní úseky, nebo také kontrakce nebo expanze, pokud zahrnuje tandemově opakované sekvence (tandemové repetice).
Mechanismus, který probíhají homologní rekombinace, byl z části objeven. Tak např. v bakteriích homologní rekombinace začíná krokem, který zahrnuje j ednořetěz.cový konec (Holliday 1964, Meselson 1975) . Naproti tomu v eukaryotických organismech většina dosavadních výsledků předpokládá mechanismus dvouřetězcového zlomu (DSB, „double-strand break, Szostak et al., 1983). DSB se vyskytuje na počátku dvou hlavních mechanismů homologní rekombinace, a sice. konzervativního, podle kterého všechny nukleové kyseliny účastnící se v rekombinaci jsou přítomné v rekombinačních produktech (Szostak et al.), a druhého nekonzervativního, při kterém dojde ke ztrátě některých sekvencí·. V somatických, buňkách savců se většina událostí homologních rekombinaci formou DSB odehrává nekonzervativním způsobem (Lin et al., 1990, Jeong-Yu, 1992).
S neustálým rozvojem biotechnologií dochází ke stále většímu využívání DNA: pro produkci rekombinantních proteinů, k vytváření transgenních zvířat, pro genovou terapii a pod. V těchto různých oblastech může nekontrolovaná rekombinační událost představovat v některých případech značnou nevýhodu. '
Tak např. v případě produkce rekombinantních proteinů, rekombinace (rekombinační události) v expresním plazmidu mohou (intramolekulární rekombinace) mohou vést k vystřižení expresní kazety pro transgen a tím ke ztrátě exprese. Rekombinace může být také počátkem vystřižení expresní kazety, která je stabilně integrována v genomu hostitelských' produkčních buněk a tak indukovat ztrátu stability.
Jiným příkladem nepříznivých účinků spojených s výskytem událostí homologní rekombinace je výskyt homologní rekombinace v průběhu konstrukce a přípravy vektorů, zvláště virových vektorů. Virové vektory (adenoviry, retroviry, adeno-asociované viry, herpetické viry atd.) představují zvláště účinné prostředky pro přenos nukleových kyselin do buněk in vitro, ex vivo nebo in vivo. Pro konstrukci defektních virových vektorů se úseky, které jsou nezbytné pro replikaci viru divokého typu, obecně řečeno, odstraní z genomu a nahradí se požadovanou nukleovou kyselinou. Aby bylo možné pak tyto viry produkovat a amplifikovat, je třeba komplementovat (tzv. v trans) odstraněné funkce (buďto v plazmidu nebo ve formě, která je integrována v genomu produkčních buněk, nebo tzv. pomocným virem - helperem) . Avšak v některých případech dochází k výskytu událostí homologní rekombinace i mezi defektním virovým genomem a komplementující funkcí, čímž se mohou rekonstituovat replikující se virové částice. Takže vektory· získané z adenovirů se obecně množí v komplementačních buněčných liniích (např. linie 293 nebo linie s. ní příbuzně), do nichž byla integrována část virového genomu. Konkrétně linie 293 obsahuje levou část (asi 11 až 12 %) genomu .adenovirů sérotypu 5 (Ad5) , která obsahuje levý úsek ITR, enkapsidační úsek a' úsek El včetně Ela Elb a část úseku kódujícího proteiny pIX a IVa2. Tato linie je schopná komplementovat v trans rekombinantní adenoviry, které jsou defektní v úseku El, tj. postrádají celý nebo část úseku El, který je nezbytný pro replikaci. Avšak' existují úseky homologie mezi úsekem adenovirů, který je integrován do genomu buněčné linie a DNA rekombinantního viru, jehož produkce je požadována. Z tohoto důvodu může docházet k různým rekombinačním událostem v průběhu produkce viru, čímž vznikají replikující se virové částice, zejména adenoviry typu E1+. Jak ukazuje obr. 1, může jít o jednoduchou rekombinační událost, po které následuje zlom chromozómu (obr. 1A) nebo dvojitou rekombinaci (obr. 1B) . Tyto dva typy modifikace vedou k nahrazení levé části rekombinantní DNA, která postrádá funkční úsek El, odpovídajícím úsekem, který je přítomen v buněčném genomu a který nese funkční kopii úseku El. Avšak vzhledem • ···· 44 4444 ·· ··
4 · · · · · · · · • 4 4 · 4 4444 4 44 4 4 4·4 4 4·· 4 · · · 4 4 4 · · · ·
444 444 44 444 44 44 k vysokému titru rekombinantních vektorů produkovaných linií 293, pravděpodobnost výskytu takovýchto rekombinantních událostí je velmi vysoká. Skutečně bylo zjištěno, že mnoho várek defektních rekombinantních adenovirových vektorů je kontaminováno replikujícími se·virovými'částicemi.
Přítomnost replikujících se virových částic představuje značnou nevýhodu při aplikacích přenosu genů in vitro nebo in vivo (značné riziko množení viru a jeho nekontrolovaného rozšíření).
Stejná problematika existuje při vytváření defektních retrovirů. Konstrukce defektních retrovirů se provádí obecně tak, že se odstraní virové kódující úseky (geny gag, pol a env), které jsou nahrazeny- v trans produkční buněčnou linií. Zde opět existují pro, některé popsané linie překrývající se , úseky mezi genomem defektních retrovirů a komplementujícími funkcemi (tj . geny) nesenými produkčními buňkami. Zejména se to -týká buněk PA317, Psi2 a dalších. Tudíž v těchto úsecích může docházet k událostem homologní rekombinace, čímž mohou vznikat replikující se virové částice.
Předkládaný vynález se týká způsobu snížení frekvence rekombinací mezi dvěma danými nukleovými kyselinami a tím minimalizace dopadu této události na biologické procesy.
Konkrétněji se předkládaný vynález týká způsobu snížení frekvence homologních rekombinací mezi dvěma danými nukleovými kyselinami nebo dvěma úseky nukleových kyselin.
V dosavadním stavu techniky byly ke snížení výskytu homologní rekombinace užity různé způsoby založené na shodném principu: nahradit nebo odstranit úseky- homologie. Určité plazmidy, které dovolují expresi požadovaných genů, nesou úseky, které jsou homologní s genomem hostitelské buňky. Může to být zejména promotorový úsek, markerový gen nebo replikační počátek. Aby se snížilo riziko rekombinace, bylo navrženo nahradit tyto úseky jinými, které nejsou homologní
• · (např. tedy jiným promotorem a pod.). Navíc bylo navrženo, aby se omezilo riziko rekombinace v průběhu produkce virových vektorů, odstranit takové sekvence, které jsou homologní mezi komplementujícími geny a defektním virovým genomem.
Patentová přihláška WO 97/00326 popisuje buněčnou linii pro · produkci adenovirů, označenou PER, která obsahuje omezenou část adenovirového genomu nesoucí úsek El. V této linii jsou okrajové sekvence, které jsou homologní s genomem defektního viru, omezeny, což snižuje možné riziko homologní rekombinace mezi těmito úseky. Podobně v patentové· přihlášce WO 95/11934 je popsána konstrukce,, rekombinantního adenovirů nesoucího deleci úseku El, která zasahuje až do části genu pIX. V takovém případě to již není komplementuj ící úsek, který je modifikován, ale delece je nesena defektním genomem viru a je rozšířena. Výsledkem je také snížení rizika výskytu rekombinace, i když úseky homologie zůstávají.
Avšak zatímco tyto způsoby umožnily snížit riziko homologní rekombinace mezi buněčnými a virovým genomem, a tím riziko, že vzniknou várky viru, který je kontaminován replikujícími se virovými částicemi, neumožňují eliminovat toto riziko úplně a/nebo vyžadují konstrukci a ověření nových buněčných linií, což je velmi pracné. A navíc nahrazení úseků jinými není vždy dostatečné, zejména pokud jde o účinnost.
• ·· · • ··
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález popisuje nový -způsob snížení inter- a intramolekulárnlch homologních rekombinací. Vynález také popisuje použití těchto způsobů k produkci defektních virů, které nejsou ' kontaminovány replikujícími se virovými částicemi. Vynález dále popisuje nové virové konstrukty, které mohou být amplifikovány v již existujících buněčných liniích, které jsou z hlediska titru nejúčinnější, .a přitom se značně sníženým rizikem vzniku replikujících se virových částic.
Počáteční důležitý krok homologní rekombinace je vzájemné rozpoznání mezi dvěma nukleovými kyselinami (intermolekulární rekombinace) nebo mezi dvěma úseky téže molekuly- (intramolekulární rekombinace). Tento krok je výsledkem přímé interakce mezi dvěma homolognimi úseky.
Homologní rekombinace mezi dvěma nukleovými kyselinami je založena na existenci sekvenční . identity nebo silné sekvenční homologie mezi dvěma úseky těchto nukleových kyselin a obecně je závislá na dvou faktorech: míře homologie a délce homologniho úseku (tj. homologních úseků nesených nukleovou kyselinou nebo dvěma nukleovými kyselinami). Navíc frekvence výskytu homologní rekombinace je ovlivněna některými specifickými úseky nukleových kyselin. Bylo pozorováno, že některé úseky jsou schopny rekombinace s vyšší frekvencí než průměrnou. Bylo zjištěno, že tyto lokalizované variace ve frekvenci mohou být způsobeny specifickými sekvencemi jako jsou C.HI místa -v E. colí nebo M26 místa v S. pombe (Gangloff et al., 1994).
Na rozdíl od strategie využité ve způsobech dle dosavadního stavu techniky, způsoby podle předkládaného vynálezu nejsou založeny . na deleci (odstranění) úseků homologie v partnerských molekulách nukleové kyseliny. Způsob podle vynálezu je založen originálním způsobem na modifikaci •··· ·· · · · 4 • · * · • · · · · · · · sekvence alespoň jedné ze dvou. partnerských nukleových kyselin potenciálně rekombinujících, a to takové, aby se snížila homologie, která mezi těmito nukleovými kyselinami existuje. '
První předmět předkládaného vynálezu se týká způsobu redukce frekvence intra- nebo intermolekulární homologní rekombinace mezi nukleovými kyselinami, který spočívá v tom, že je sekvence alespoň jedné z rekombinujících partnerských nukleových kyselin degenerována takovým způsobem, že je snížena homologie s druhým partnerem.
V popisu předkládaného vynálezu termín snížení (redukce) frekvence, homologních rekombinací mezi nukleovými kyselinami znamená jakékoliv snížení této frekvence vzhledem k frekvenci pozorované s odpovídajícími nemodifikovanými nukleovými kyselinami. Tato redukce se dá snadno měřit konvenčními testy, které jsou odborníkovi známy (zejména testem markér rescue nebo testem generace replikujících se virových částic) . Výhodně termín „snížení nebo redukce znamená významné snížení ve frekvenci homologní rekombinace, výhodně alespoň řádu jedné logaritmické jednotky.
Intermolekulární homologní rekombinace znamená homologní rekombinací, ke které dochází mezi dvěma různými nukleovými kyselinami ' (nebo mezi dvěma úseky dvou odlišných nukleových kyselin). Intramolekulární homologní rekombinace znamená homologní rekombinací mezi dvěma úseky jedné a téže nukleové kyseliny. Partnerské nukleové kyseliny v homologní rekombianci mohou být extrachrómzomální nukleové kyseliny, chromozomální nukleové kyseliny nebo kombinace obou těchto možnosti (tj. chromozomální a extrachromozomální nukleová kyselina). Extrachrómzomální nukleové kyseliny jsou plazmidy, vektory, epizorný, virové genomy a pod.
Způsob podle předkládaného vynálezu je zvláště vhodný k redukci frekvence intermolekulární homologní rekombinace ·· ·ΦΦ· * ···· • · · · · · · · · · φ Φ·Φ φ .φ ·ΦΦ · · φ · • · · · · ······ φ φ φ · φ · · φ φ φφφ ··· Φ· ΦΦ· φφ φφ mezi chromozomální nukleovou kyselinou a extrachromozomální nukleovcu kyselinou.
Způsob podle vynálezu obecně obsahuje následující kroky:
I) identifikaci úseku (úseků) zodpovědných za homologní rekombinaci,
II) modifikaci tohoto úseku (nebo úseků),
III) ověření sekvence,
IV) syntézu modifikované sekvence (nazvané syngen)' a
V) náhradu původní sekvence syngenem.
I) Identifikace useku zodpovědného za homologní rekombinaci mezi.nukleovými kyselinami
Identifikace úseku (úseků) zodpovědného za homologní rekombinaci mezi nukleovými kyselinami se provede známými metodami. Konkrétně, jakmile je pozorována rekombinac.e, zkoumají se sekvencováním úseky za ni zodpovědné, tj. vyšetří se homologní úseky (intermolekulární) nebo (intramolekulární). Když účastnící se rekombinace, obsahující celou nebo čás' užijí pro následující krok ' mezi nukleovými kyselinami uvnitř nukleové kyseliny jsou identifikovány sekvence je definován příslušný .úsek, těchto sekvencí, které se pak
I, čili modifikaci.
II) Modifikace sekvencí
Obecně se má za to, že homologie musí být velmi vysoká v dostatečně dlouhém úseku,, aby docházelo k rekombinačním událostem s dostatečnou frekvencí. Zejména údaje z odborné literatury předpokládají, že úsek úplné homologie velikosti 200 bp je nutný pro výskyt těchto rekombinančních událostí. A skutečně, i když k rekombinacím může docházet i s kratšími úseky, jejich frekvence je mnohem nižší a nepravidelná. Kromě toho, u takových úseků, kde je homologie snížena o 19 % se jeví frekvence rekombinace snížena faktorem 1000 (Waldman a Liskay, 1987). • · · · ····
99 · 9 9 9 9 9 9 9
9·9 9 · ··· 9 · · 9
999 9 999 99 9 · 9 9 · 9 · · 9
999 999 9« 999 99 99
Sekvence mohou být modifikovány různými způsoby. Pokud se týká kódující sekvence, lze vnášet modifikace založené na degeneraci genetického kódu. Tímto způsobem se naruší sekvence a tedy sníží homologie, ale expresní produkt zůůstane shodný.
Předkládaný vynález tudíž spočívá zejména v modifikaci sekvence takovým způsobem, aby se zabránilo párování mezi dvěma homologními úseky. Modifikace umožňuje snížit délku a míru homologie mezi dvěma požadovanými úseky.
Výhodně je ve způsobu podle vynálezu sekvence nukleové kyseliny degenerována v úseku, který se účastní homologní rekombinace, a sice v poměru 1 pár baží na každých alespoň 20 párů baží. Ještě výhodněji v poměru 1 pár baží na každých alespoň 10 párů baží.
Ve zvláště výhodném provedení vynálezu je sekvence degenrována ve všech pozicích, kde je to možné.
Degenerovanost sekvence- podle předkládaného vynálezu se výhodně vytváří jako funkce využití kodonů v buňce nebo organismu, kde se má- požadovaná nukleová kyselina užít. V případě virového vektoru, který je produkován v lidské buněnčné linii, je zvláště výhodné degenerovat sekvenci tím, že se upřednostní kodony využívané lidskými buňkami, je-li· takový výběr možný (viz příklady).
Navíc mohou být vneseny do sekvence nukleové kyseliny další modifikace. Tak v nekódujícím úseku je možné' zmenšit velikost některých prvků (expresní regulační sekvence, promotory) nebo modifikovat tyto prvky nebo určité prvky nahradit heterolognímí úseky.
Podle zvláště výhodného provedení vynálezu je možné, pokud zóna homologie zasahuje několik genů, zmenšit zónu homologie, a sice na jedné straně degenerací sekvencí jednoho nebo několika genů, a na druhé straně modifikací genomové polohy určitých genů přítomných v zóně homologie, tj . uspořádat tyto geny v adenovirovém vektoru a v genomu jinak-, • 9·9· 99 99*9 99 99 •• 9 999 9999
999 9 9 999 9 9 9 9
99 9 9 999 99 9 • 9 99 9 9999
999 999 99 999 99 99 než je původní uspořádání. Sekvence genu, jejichž genomová pozice je modifikována, může být také degenerována. Výhodně je degnerována pouze sekvence genů, které nejsou přemístěny.
III) Verifikace sekvence
Verifikace sekvence se provádí metodou zpracování dar, která umožňuje detekovat přítomnost regulačních prvků, sekundárních struktur atd., které jsou náchylné k inteferenci s aktivitou syngenu. Další podrobnosti viz příklady.
IV) Syntéza syngenu
Syngen může být syntetizován jakýmkoliv způsobem odborníkovi známým, zejména pomocí zařízení pro syntézu nukleových kyselin (syntetizátoru) . ' · .
V) Náhrada původní sekvence -syngenem
Syngen jakmile je syntetizován, se vnese do nukleové kyseliny jako' náhrada za původní sekvenci. Tento krok je také možné provést konvenčními způsoby molekulární biologie, které jsou odborníkovi dobře známy.
Jedna z aplikací způsobu podle -předkládaného vynálezu spočívá v tom, že se připraví vektory,1 zejména virové vektory, zbavené replikačně-kompetentních virových částic (RCV). Z tohoto hledika se způsob podle vynálezu týká zejména snížení frekvence homologních rekombinací mezi chromozomální nukleovou kyselinou, která kóduje komplementující funkce pro defektní virus a extrachromozomální nukleovou kyselinou obsahující genom uvedeného defektního viru.
Virus je výhodně adenovirus, retrovirus, adenoasociovaný virus (AAV) nebo alternativně herpetický virus. Ještě výhodněji je to adenovirus.
Jedno výhodné provedení předkládaného vynálezu spočívá ve způsobu snížení frekvence homologních rekombinací mezi
| • • 4 * | • t»t 44 4444 * 4 4 4 444 4 · <44 • · 4 4 4 4 | 44 44 » 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 | ||
| • 444 | 4 4*4 4*4 44 444 | 4 4 4 4 4 4 44 | ||
| 11 | ||||
| chromozomální | nuklěovou | kyselinou | obsahující | úsek El |
| adenovirového | genomu, | spolu s | lemuj ící | sekvencí, |
a extrachromozomální nuklěovou kyselinou obsahující genom adenoviru, který je defektní v úseku El.
Výhodně v tomto konkrétním způsobu degenerovaná sekvence podle předkládaného vynálezu obsahuje gen pIX z genomu adenoviru, který je defektní v úseku El. Ještě výhiodněji degenerovaná sekvence obsahuje geny pIX a IVa2 z genomu adenoviru.
V jiném provedení vynálezu degenerovaná sekvence obsahuje gen pIX genomu adenoviru a sekvence IVa2 je přemístěna ze svého původního lokusu do úseku E4.
Způsob podle vynálezu je zvláště vhodný pro přípravu rekombinantních adenovirů, které jsou defektní v úseku El,, v buněčné linii 293 nebo v buněčné linii z ní odvozené.
Jak bylo uvedeno výše, buněčná linie 293 obsahuje ve svém . genomu levou část adenovirového genomu, obsahující zejména úsek El a lemující („flanking”) sekvence lokalizované po směru transkripce („downstream)od úseku El, které nesou zejména gen pIX a část genu IVa2. Je to právě tento úsek lemující sekvence, kde dochází k homologní rekombinaci, která vede ke vzniku replikačně kompetentních adenovirů (RCA). V popisu předkládaného vynálezu termín „odvozená buněčná linie” znamená buněčnou linii, která nese úsek El adenoviru a lemující úsek, vhodný k tomu, aby došlo k rekombinaci s defektním virem. Může to být kratší úsek, než jaký je přítomen v buňkách linie 293 (omezený např. jen na úsek pIX), nebo delší úsek. Odvozená linie může být taková linie, která byla získána z buněk linie 293 . vnesením dalších komplementujících sekvencí (jako je E4).
V tomto směru se předkládaný vynález také týká způsobu přípravy defektních rekombinantních adenovirů tím, že se vnese, do buněky linie 293 nebo odvozené linie, genom • · · · • · • · · · uvedeného defektního rekombinantního adenoviru, přičemž uvedený genom nese:
- deleci v úseku El,
- degenerovanost v genu pIX a/nebo genu IVa2.
Předkládaný vynález se ' dále týká jakéhokliv virového vektoru, jehož genom obsahuje alespoň jeden úsek, jehož sekvence je degenerovaná. Může to být zejména retrovirus (nesoucí degenerované sekvence genů gag, pol a/nebo env), AAV (nesoucí degenerované sekvence genů rep a/nebo cap) a také adenovirus.
Výhodně je to adenovirus, jehož genom nese degenerovaný gen pIX. Výhodně degenerovaná sekvence genu pIX je sekvence id. č. 1 nebo sekvence id. č. 4. Výhodněji adenovirus nese modifikací genomové polohy genu IVa2. Tento gen je výhodně umístěn v úseku E4.
V jiném provedení vynálezu jde o adenovirus, jehož geny pIX a IVa2 jsou degenerované. Výhodně je přirozená sekvence genu pIX nahrazena sekvencí id. č. 1 nebo sekvencí id. č. 4 a degenerovaná sekvence genu IVa2 je sekvence id. č. 2 nebo sekvence i. č. 5.. Výhodně je přirozená sekvence genů pIX a IVa2 nahrazena sekvencí id. č. 3.
V jiném provedení vynálezu jde o adenovirus, jehož geny pIX a IVa2 jsou degenerované a který navíc obsahuje modifikace promotorové sekvence genu pIX a/nebo náhradu polydenylační sekvence těchto genů. Výhodně je to adenovirus obsahující sekvenci id. č. 8.
Kromě toho adenovirus výhodně nese alespoň jednu de.leci úseku El. Výhodněji adenovirus je defektní alespoň v celém nebo části úseku El a E3. Může to být také rekombinantní adenovirus, který je částečné nebo úplně defektní v úseku El nebo E4, případně také v úseku E3. Navíc to může být adenovirus různých sérotypů. Pokud jde o adenoviry lidského původu, je třeba uvést zejména adenoviry klasifikované jako skupina C.
• · · · ··· • · · · ·· · ·· · ·· ·· » · · · · · • · ··· · · · ► · · · · · · <
► · · · · · I «· · · · ·· ··
13.
Z různých sérotypů jsou ještě výhodnější podle předkládaného vynálezu adenoviry typu 2 nebo 5 (Ad2 nebo Ad5) . Z adenovirů pocházejících z různých zvířat jsou podle předkládaného vynálezu výhodné adenoviry ,psího původu, zejméma všechny kmeny adenovirů CAV2 (kmen Manhattan nebo A26/61 (ATCC VR-800). Jiné adenoviry zvířecího původu jsou uvedeny v patentové přihlášce WO 94/26914, ketrá je zde zahrnuta formou odkazu. Strategie pro konstrukci adenovirů, a také místa, která lze užít pro vnesení požadovaných genů do těchto vektorů, byla již podrobně popsána ve stavu techniky, zejména v patentových dokumenetch WO 95/02697,. WO 96/10083, WO 96/13596 nebo WO 96/22373.
Podle zvláště výhodného provedení předkládaného vynálezu je v rekombinantnlch adenovirech úsek El inaktivován delecí fragmentu PvuII-BglII zahrnujícího úsek od nukleotidu- 454 do nukleotidu 3328 v sekvenci adenovirů Ad5. Tato sekvence byla publikována ' v odborné literatuře a je dostupná ' také v databázi (konkrétně Genebank č. M73260). V jiném výhodném provedení je úsek El inaktivován delecí fragmentu . HinflISau3A, který zahrnuje úsek od nukleotidu 382 do. nukleotidu 3446.
Výhodně rekombinantní adenovirus podle předkládaného vynálezu obsahuje' navíc heterologní sekvence nukleových kyselin, jejichž přenos a/nebo exprese v buňkách, orgánch nebo organismech je požadována.
Heterologní sekvence DNA může zejména obsahovat jeden nebo několik terapeutických genů a/nebo jeden nebo několik genů kódujících antigenní peptidy.
Terapeutické geny, které lze takto přenášet, jsou geny, jejichž transkripce a případně i translace v cílové buňce vytváří produkt, který má terapeutický účinek.
Mohou to být zejména geny kódující proteinové produkty, které mají terapeutický účinek. Takže proteinový produkt takto kódovaný může být protein, peptid, aminokyselina apod.
• • 9 9 · • · · 9
9 9 9 • 9 99
Tento proteinový produkt je homologní vzhledem k cílové buňce (tj. je to produkt, který je normálně exprimován v cílové buňce,-pokud tato buňka není v patologickém stavu). V takovém případě exprese proteinu . umožňuje např. nahradit nedostatečnou expresi v buňce nebo nahradit expresi proteinu, který je inaktivní nebo slabě aktivní z důvodů modifikace, a nebo alternativně dovoluje nadměrně exprimovat uvedený protein. terapeutické geny mohou také kódovat mutontní buněčný protein, který má zvětšenou stabilitu, modifikovanou aktivitu a pod. Proteinový produkt může také heterologní vzhledem k cílové buňce. V takovém případě může exprimovaný protein např. komplementovat (doplňovat) nebo poskytovat aktivitu, která je v buňce nedostatečná, což umožní buňce bojovat proti patologickému stavu.
'Jako příklady terapeutických produktů vhodných podle vynálezu lze zmínit zejména enzymy, krevní driváty, hormony, lymfokiny: interleukiny, inteferony, TNF atd. (viz FR
9203120), růstové faktory, nervové přenašeče nebo jejich prekurzory nebo syntetické enzymy, trofické faktory: BDNF, GMF, VEGF, aFGF, bFGF, NT3, NT5 a pod., ApoAI, ApoAIV, ApoE atd (viz FR 93 05125), myodistrofin (FR 9111947),
CNTF, NGF, IGF, apolipoproteiny,: dystrofin nebo tumorové atd. (viz supreseorove geny:
p5'3, Rb, RaplA, DCC, k-rev,
FR 93 04745), geny kódující faktory účastnící se koagulace: faktory VII, VIII, IX atd., geny kódující protein GAX-, tzv. „samovražedné geny, thymidinkinázu, cytosindeaminázu atd., geny kódující jednořetězcové (scFv) protilátky.
Terapeutické geny mohou být také geny nebo „anti-sense sekvence (sekvence s orientací proti smyslu transkripce), jejichž exprese v hostitelské buňce umožní kontrolovat expresi genů nebo transkripci různých druhů buněčných mRNA. Takové sekvence se např. mohou transkribovat v hostitelské buňce do RNA, která je komplemetární k buněčné mRNA a tak • · · · • · • ·
mohou blokovat jejich translaci, do proteinu, způsobem popsaným v evropském patentu EP 140 308.
Jak bylo již uvedeno výše, heterologni sekvence DNA mohou také obsahovat jeden nebo několik genů kódujících antigenní peptid, který je· schopen vyvolávat imunitní reakci u člověka. V tomto konkrétním provedení vynález dovoluje produkci vakcín, které umožňují imunizovat člověka, zejména proti mikroorganismům nebo virům. Mohou to být zejména antigenní peptidy specifické pro virus Epstein-Barrové, HIV, virus hepatitidy B (viz EP 185 573), virus pseudorabies a nebo alternativně mohou být specifické pro nádory (EP 259 212) .
' Obecně hetrologní sekvence nukleové kyseliny obsahují také promotorový úsek pro funkční transkripci v infikované cílové buňce. Může to. být promotorový úsek, který je v přirozených podmínkách zodpovědný za expresi, genu, za předpokladu, že tento úsek je schopen funkce v infikované buňce. Mohou to být také úseky různého původu (které jsou zodpovědné za expresi jiných proteinů nebo dokonce syntetické). Zejména to jsou promotorové sekvence pocházející z eukarytických nebo virových genů. Např. to mohou být promotorové sekvence pocházející z genomu buňky, která má být infikována. ’ Podobně 'to mohou- být promotorové sekvence pocházející z genomu virů, včetně užitých adenovirú. Jako příklady lze uvést promotory genů z E1A, MLP, CMV, RSV apod..
Kromě toho tyto promotorové úseky mohou být modifikovány připojením sekvencí pro aktivaci nebe regulaci, nebo které doolují tkáňově-specifickou nebo tkáňově-převládající expresi. Navíc pokud heterologni nukleová kyselina neobsahuje promotorové sekvence, může být vložena do genomu defektního viru po směru transkripce („downstream) od takové sekvence.
Navíc heterologni sekvence nukleové kyseliny může obsahovat, zejména proti směru transkripce („upstream) od terapeutického genu, signální sekvenci, která nasměruje
0 0 0 · 0 0 0 0 4 • 0 ♦ · ••0 0 0000
0 0 0 «
04 syntetizovaný terapeutický produkt do sekretorické dráhy cílové buňky. Tato signální sekvence, je buďto přirozená signální sekvence terapeutického produktu,, ale také to může být jakákoliv jiná funkční signální sekvence nebo umělá signální sekvence.
Ve zvláště výhodném provedení vektory podle předkládaného vynálezu ještě navíc obsahují funkční gen E3 pod kontrolou heterologního promotoru. Výhodněji vektory obsahují úsek genu E3, který umožňuje expresi genu gpl9K.
aby se
Tento protein ve skutečnosti zabraňuje tomu, adenovirový vektor stal předmětem imunitní reakce, která by i) omezila jeho účinky a ii) mohla mít škodlivé vedlejší účinky.
Tyto rekombinantní vektory se mohou užít k přenosu nukleových kyselin do buněk in vitro, ex vivo nebo in vivo.
Předkládaný vynález se také. týká jakéhokoliv farmaceutického přípravku obsahujícího jeden .nebo několik rekombinantních adenovirů podle vynálezu. Farmaceutické přípravky podle vynálezu ,mohou být formulovány z hlediska způsobu podávání pro podávání topické, perorální, parenterální, intranazální, intravenózní, intramuskulární, subkutánní, intraokulární, transdermální a pod.
Výhodně farmaceutické přípravky podle vynálezu obsahují farmaceuticky přijatelná vehikula vhodná pro injekční přípravky. Příkladem jsou zejména izotonické, sterilní solné roztoky (dihydrogenfosforečnan a hydrogenfosforečnan sodný, chlord sodný, chlorid .draselný, chlorid hořečnatý a pod. nebo směsi těchto solí) nebo jde výhodně o suché přípravky, zejména lyofilizované, které po přidání sterilní vody nebo fyziologického roztoku, v závislosti na případu, umožní vytvořit injikovatelný roztok.
Dávky viru použité pro injekci se upraví v závislosti na mnoha parametrech, zejména v závislosti na způsobu podávání, patologickém stavu, genu, který má být exprimoVán nebo • · · · • · · · • ·
• · alternativně v závislosti na požadované délce léčení. Obecně je rekombinantní adenovirus podle předkládaného vynálezu formulován a podáván v dávkách 10 až 101 pfu/ml a výhodně 10 až 10 pfu/ml. Termín „pfu (tj. „plaque forming unit, jednotka tvořící plak) odpovídá, infekčnosti (infekční síle) roztoku viru a stanovuje se infikováním odpovídající buněčné kultury a pak . měřením, obecně po 5 dnech, . počtu plaků infikovaných buněk. Způsoby stanovení pfu titru virového roztoku jsou popsány v odborné literatuře a jsou odborníkovi známy.
Předkládaný vynález bude dále podrobněji popsán a vysvětlen v následujících příkladech, které jsou však pouze ilustrativní a vynález nijak neomezují, a připojených obrázcích.
Popis obrázků
Obr. 1: Rekombinanční události mezi adnenovirem a buňkou linie 293.
Obr, 2: Schéma struktury syngenu.
Obr. 3: Restrikční mapa plazmidu pJJ105.
Obr. 4: Restrikční mapa plazmidu pJJHO.
Obr. 5: Restrikční mapa plazmidu pJJ206.
Obr. 6: Konstrukce defektního viru nesoucího syngen jako náhradu za původní úsek.
Obr. 7: Struktura a restrikční mapa oligonukleotidů Oligosyngen I a Oligosyngen II.
• · · 9 • 99
9 99
9 9
9 9
9 9
9
9 9 9
Obr. 8: Přirozená nukleotidová sekvence a degenerovaná sekvence genu pIX (sekvence id. č. 1) a odpovídající aminokyselinová sekvence.
Obr. 9: Přirozená nukleotidová sekvence a degenerovaná sekvence genu IVa2 (sekvence id. č. 2) a odpovídající aminokyselinová sekvence.
Obr. 10: Nukleotidová sekvence syngenu č. 1' (sekvence id. č. 3) .
Obr. 11: Schematické znázornění homologií mezi genomem buňky 293 a rekombinantními vektory Ad5. Vektor Ad5p53 má souvislý úsek sekvenční homologie 893 nukleotidů' s genomem buněk 293 „downstream od úseku El. Vnesení bodových mutací sníží maximální délku úseku souvislé homologie na 92 nukleotidů v případě syngenu č. 1 (AVI. 7 #1 CMV p53) a' 29 nukleotidů v případě syngenu č. 2 ( AV 1.7 #2 CMV lacZ).
Obr. 12: RCA detekce vektorů ad5p53 a AV 1.7 #1 CMV p53 po 7 po sobě následujících amplifikacích v buňkách linie 293.
Obecné metody molekulární biologie použité ve vynálezu
Metody běžně užívané v molekulární biologii jako je preparativní extrakce plazmidové DNA, centrifugace plazmidové DNA v gradientu chloridu česného, elektroforéza na agarovém nebo polyakrylamidovém gelu, purifikace fragmentů DNA elektroelucí, extrakce proteinů fenolem nebo fenol/chloroformem, precipitace DNA v solném médiu etanolem nebo isopropanolem, transformace bakteriálních buněk E. coli atd. -jsou odborníkovi dobře známy a jsou podrobně popsány
• · ·· ·· * t » · • · · » • · · · • · · · • · · · v odborné literatuře (Maniatis, T. et al. „Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982, Ausubel, F.M. et al. (eds.), „Current Frotocols in Molecular Biology, John Wiley · and Sons, New York, 1987).
Plazmidy pIC-20R (Invitrogen) a pBS (Stratagen) pocházejí z komerčního zdroje.
Pro účely ligace byly fragmenty DNA separovány na základě jejich velikosti elektroforézou na agarózovém nebo polyakrylamidovém gelu, extrahovány fenolem nebo směsí fenol/chloroform, precipitovány etanolem a pak inkubovány v přítomnosti DNA ligázy z fágu T4 (Biolabs) podle doporučení výrobce.
Zaplnění přečnívajících 5'-konců bylo' provedeno Klenowovým fragmentem DNA polymerázv I z E. coli (Biolabs) podle doporučení výrobce. Odstranění přečnívajících 3'-konců bylo provedeno v přítomnosti DNA polymerázy fága T4 (Bolabs) podle- doporučení výrobce. Odstranění přečnívajících 5'-konců bylo provedeno řízeným ošetřením nukleázou Sl.
Místně-cílená mutageneze in vitro syntetickými oligonukleotidy se prováděla způsobem, který vyvinuli Taylor et al. (Nucleic Acids Res. 13, 1985, 8749-8764) pomocí soupravy od firmy Amersham.
Enzymatická amplifikace fragmentů DNA tzv. technikou PCR .(polymerázovou řetězovou reakcí, viz Saiki, R.K. et al·., Science 230, 1985, 1350-13564, Mullis, K.B., Faloona, F.A., Meth. Enzym. 155, 1987, 335-350) se prováděla pomocí teplotního cyklovače firmy Perkin Elmer Cetus podle instrukcí výrobce.
Verifikace nukleotidové sekvence se prováděla metodou podle Sangera et al. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74, 1977, 5463-5467) užitím supravy od firmy Amersham. .
• ·· •4 4444
444 «4 • 4 4 « ► 4 4 I » 4 4 « » 4 4«
44
Buněčné linie použití ve vynálezu
Byla užita linie 293 lidských embryonálních · ledvin (Graham et al., J. Gen. Virol. 36, 1977, 59) . Buňky této linie obsahují zejména levou část genomu lidského- adenoviru Ad5 (12 i) integrovanou do svého genomu.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Homologní rekombinace adenoviru
První pozorování, že genom adenoviru podléhá genetické rekombinací, bylo popsáno již před více než 25 lety ((Williams a Ustacelibi, 1971). Avšak mechanismus těchto rekombinačních událostí je dosud relativně neznámý. Bylo navrhováno, že rekombinace a replikace mohou být těsně spojeny, a jisté údaje podporují takový model rekombinace, kdy replikace vede ke vzniku specifického substrátu, který je nutný pro častý výskyt rekombinačních událostí, který je pozorován při infekci ·adenovirem. Jedna z důležitých otázek, na kterou je třeba znát odpověď buněčné proteiny podílejí na meziproduktů a na jejich přetvoření ve výsledné produkty rekombinace. Z tohoto hlediska zatím nebylo prokázáno, že by se některý z testovaných virových genů Elb, E4, Ela a E3 (Epstein 1991, Weinberg et al., 1986, Young 1995) podílel na rekombinačních událostech. Podobně nebylo prokázáno, že by se rekombinace účastnily buněčné proteiny. Nakonec byly navrženy dva modely rekombinace virového genomu, oba předpovídající vznik heteroduplexů' (Ahern et al., 1991, Young, 1995).
je, jestli se virové nebo vytváření rekombinačních • ···· 44 4444 ·4 '44 ··· 444 4*··
4 4 4 4 4444 4 44 4 • · · 4 4 4 4 4 44 · • * 44 4 4444 ••4 444 44 444 ·4 44
Úseky , zodpovědné za homologní rekombinaci mezi defektním genomem a buněčnou linií byly lokalizovány zejména v genech pIX a IVa2 adenovirového genomu. Struktura tohoto úseku, jak je přítomen v defektním genomu, je znázorněna na obr. 2.
Byly provedeny modifikace sekvence adenovirového genomu, která se účastní rekombinace s buněčným genomem. Konkrétněji řečeno, přirozená sekvence genů pIX a IVa2 byla modifikována vnesením „umlčených mutací, které umožnily snížit míru homologie s přirozenou sekvencí, a niž by došlo, k ovlivnění struktury expresních produktů těchto genů.
Získaná sekvence, nazvaná syngen, byla užita k nahrazení odpovídající přirozené sekvence adenoviru při konstrukci defektního vektoru.
1. Identifikace úseků zodpovědných za rekombinaci
Mapovací' studie ukázaly, že úsek adenovirového genomu přítomný v genomu buněk 293 odpovídá levé části adenovirového genomu a představuje přibližně 12 % tohoto genomu, tj . asi 4300 bp (Aiello et al., 1979, Spector et al., 1983) . Původcem byly provedeny další mapovací experimenty pomocí -PCR a bylo ukázáno, že pozice 4420 je také přítomna v genomu buněk 293. Pozice 4420 byla vybrána pro následující experimenty jako pravá hranice zóny homologie a tudíž pravá hranice syngenu. 'Z technických. důvodů při ' klonování modifikovaný fragment zasahuje až do pozice 4445, kam bylo vneseno klonovací místo.
Levý konec syngenu byl vybrán tak, že leží uvnitř regulačního prvku pro expresi genu pIX, konkrétně v poloze -56 genu pIX. Skutečně bylo (ukázáno, že promotor genu pIX může být redukován na úsek velikosti 56 nukleotidů. Aktivita tohoto úseku, který obsahuje vazebné místo SPI a TATA box je srovnatelná s aktivitou fragmentu s 250 nukleotidy (Babiss et al., 1991, Matsu et al., 1989).
9999 ·· 9 999 • ··· 9 9 999 • 9 9 9 9 • 9 · «
999 999 99 999 • 9 9 ·
9 9 9
9 9 9
9 9 ·
9«
Zóna homologie tak byla stanovena v rozsahu od pozice 3520 do pozice 4445 genomu defektního viru (viz obr. 2) .
2. Příprava modifikovaných sekvencí
Tabulka využití , kodonů v genomu adenoviru Ad5 byla připravena původcem a byla využita ke stanovení optimálního využití kodonů pro expresi virových proteinů, tato tabulka byla získána kombinací údajů získaných analýzou 10 proteinů z adenoviru: pIX, hexon, plil, PVII, 52-55k, pPol, pTP, DBP, 23K a 19k (viz tabulka). Získané výsledky pak byly porovnány s tabulkou získanou analýzou 1952 genů přítomných v databázi Genebank· pomocí programu GCG.
Pořadí preferencí užití kodonů pak bylo stanoveno pro využití k modifikaci sekvence kodonů genů pIX a IVa2:
- Když kodon užitý v přirozené sekvenci není preferovaný kodon,-je užit v syngenu.
- Když· kodon, užitý v přirozené sekvenci je preferovaný kodon, je to pak druhý preferovaný kodon, který je užit.'
- V'jistých případech, např. pro vnesení restrikčních míst, užije se třetí preferovaný kodon, zejména tehdy, je-li frekvence jeho užití dostatečně blízká frekvenci užití druhého preferovaného kodonů.
V následující tabulce je ukázána frekvence využití kodonů u člověka a v adenoviru (ADV5) a pořadí preferencí u člověka (sloupec A) a pořadí preferencí adenoviru (sloupec B) a výsledný výběr pro syntézu syngenu (sloupec C).
*·9· • 9 9 • 999
9
9
9* 999·
9 9
999
99
9 · ·
9 9 ·
9 9 9
9 9 9
99
Tabulka 1: Frekvence užití kodonů
| AD V 5 | Člověk | A | H | C | |||||
| F | TTT | Phe | 2.3 | 54.2% | 1.5 | 43.0% | 1 | 2 | - |
| F | TTC | 1.9 | 45.8% | 2.1 | 57.0% | 2 | 1 | - | |
| L | TTA | Leu | 0.1 | 1.4% | 0.6 | ' 6.0% | 6 | 6 | 6 |
| L | TTG | 1.2 | 14.2% | 1.1 | 12.0% | 4 | 4 | 4 | |
| L | CTT | Leu | 1.3 | 15.6% | 1.1 | 12.0% | 3 | 3 | 3 |
| L | CTC | 1.7 | 20.5% | 1.9 | 20.0% | 2 | 2 | 2 | |
| L | CTA | 1.1 | 12.6% | 0.6 | •7.0% | 5 | 5 | 5 | |
| L | CTG | 3 | 35.6% | 4 | 43.0% | 1 | 1 | 1 | |
| I | ATT | Tle | 1.3 | 34.6% | 1.5 | 35.0% | 2 | 2 | 2 |
| I | ATC | 1.6 | 43.9% | 2.3 | 52.0% | 1 | 1 | 1 | |
| I | ATA | 0.8 | 21.6% | 0.7 | 14.0%, | 3 | 3 | 3 | |
| M | ATG | Met | 2.6 | 100.0% | 2.2 | 100.0% | |||
| V | GTT | Val | 0.8 | 13.1% | 1 | 17.0% | 3 | 3 | 3 |
| v | GTC | 1.4 | 22.2% | 1.5 | 25.0% | 2 | 2 | 2 | |
| v | GTA | 0.3 | 12.5% | 0.6 | 10.0% | 4 | 4 | ' 4 | |
| v | GTG | 3.3 | 52.5% | 2.9 | 48.0% | 1 | 1 | 1 | |
| Ύ | TAT | Tyr | 0.8 | 21.6% | 1.2 | 41.7% | 2 | 2 | 2 |
9999 •99 999 • ··· 9 9 999
9 9 9 9 • 9 9 9 ••9 999 99 999 •9 9999 • 9 99 • 9 9 9
9 9 9
9 9 9
9 9 9
9«
| Y | TAC | 3 | 78.4% | 1.7 | 58.3% | 1 | 1 | 1 | |
| * | ΤΑΑ | end | 0.1 | 23.8% | |||||
| ★ | TAG | 0.1 | 16.7% | ||||||
| Η | CAT | His | 0.5 | 21.3% | 1.4 | 59.3% | 2 | 1 | - |
| Η | CAC | 1.7 | 78.7% | 1 | 40.7% | 1 | 2 | - | |
| Q | CAA | Gin | 1.1 | 27.4% , | 1.2 | 26.7% | 2 | 2 | 2 |
| Q | CAG | 3 | 72.6% | 3.3 | 73.3% | 1 | 1 | 1 | |
| Ν | ΑΑΤ | Asn | 1.2 | 24.5% | 1.6 | 43.5% | 2 | 2 | 2 |
| Ν | AAC | 3.6 | 75.5% | 2.1 | 56.5% | 1 | 1 | 1 | |
| Κ | ΑΑΑ | Lys | 1.4 | 35.2% | 2.2 | 39.8% | 2 | 2 | 2 |
| κ | AAG - | 2.5 | 64.8% | 3.4 | . 60.2% | 1 | 1 | 1 | |
| D | GAT | Asp | 1.6 | 29.2% | 2.1 | 44.2% | 2 | 2 | 2 |
| D | GAC | 3.9 | 70.8% | 2.7 | 55.8% | 1 | 1. ' | 1 | |
| Ε | GAA | Glu | 2.4 | 37.0% | 2.3 | 41.5% | 2 | 2 | 2 |
| Ε | GAG | 4.1. | 63.0% | 3.9 | 58.5% | 1 | 1 | 1 | |
| S | TCT | Ser | 0.8 | 11.7% | 1.4 | 18.0% | 4 | 3 | 3 |
| S | TCC | 1.7 | 25.9% | 1.7 | 23.2% | 2 | 2 | 2 | |
| S | TCA | 0.6 | 9.6% | 1.1 | 14.7% | 5 | 4 | 4 | |
| S | TCG | 0.9 | 13.6% | 0.4 | 5.9% | 3 | 6 | 5 | |
| Ρ | CCT | Pro | 1.2 | 18.4% | 1.8 | 29.0% | 4 | 2 | 2 |
| Ρ | CCC | 2.7 | 39.9% | 2.1 | 33.0% | 1 | 1 | 1 | |
| Ρ | CCA | 1.3 | 18.7% | 1.7 | 27.0% | 3 | 3 | 3 |
··«· • · · • ··· • · • ♦ ··· ··· •t ···· • · · • · ··· • · • · ·· ··· ·· »· • · * · • · * · • · · · · • · · · ·· ··
| P | CCG | 1.5 | 23.0% | 0.1 | 11.0% | 2 | 4 | 4 | |
| T | ACT | Thr | 1.1 | 17.7% | 1.3 | 23.0% | 2 | 3 | 2 |
| T | ACC | 3.3 | 55.0% | 2.2 | 38.0% | 1 | . 1 | 1 | |
| T | ACA | 0.8 | 12.8% | 1.5 | 27.0% | 4 | 2 | 4 | |
| T | ACG | 0.9 | 14.5% | 0.1 | 12.0% | 3 | 4 | 3 | |
| A | GCT | Ala | 1.2 | 13.7% | 2 | 28.0% | 3 | 2 | 2 |
| A | GCC | 4 | 45.7% | 2.8 | 40.0% | 1 | 1 | 1 | |
| A | GCA | 1.1 | 12.6% | 1.6 | 22.0% | 4 | 3 | 3 | |
| A | GCG | 2.4 | 27.9% | 0.7 | 10.0% | 2 | 4 | 4 | |
| C | Cys | TGT | 0.3 | 21.5% | 1 | 41.8% | 2 | 2 | 2 |
| C | TGC | 1.1 | 78.5% | 1.4 | 58.2% | 1 | 1 | 1 | |
| * . | end | TGA | 0.3 | 61.9% | |||||
| W | Trp | TGG | 1.3 | 100.0% | 1.5 | 100.0% | |||
| R | Arg | CGT | 0.8- | 10.4% | 0.5 | 9.3% | 3 | 6 | 6 |
| R | CGC | 4.1· | 52.4% | 1.1 | 19.4% | 1 | 3 | 1 | |
| R | CGA | 0.6 | 7.0% | 0.6 | 10.0% | 5 | 5 | 5 | |
| R | CGG | 1.1 | 13.9% | 1 | 18.6% | 2 | 4 | 2 | |
| S | Ser | AGT | 0.4 | 6.6% | 1 | 13.6% | 6 | 5 | 6 |
| S | AGC | 2.1 | 32.6% | 1.9 | 24.7% | 1 | 1 | 1 | |
| R | Arg | AGA | 0.5 | 6.2% | 1.2 | 21.0% | 6 | 2 | 4 |
| R | AGG | 0.8 | 10.2% | 1.2 | 21.7% | 4 | 1 | . 3 |
♦ 444 44 ‘4444 44 44 • 444 4 444 •44 · · 444 4 4 4 4
444 4 444 44 4 * *4 4 4 4 ·· ··· 4« ··· 44 44
| G | Gly GGT | 1 | 17.7% | 1.4 | 18.3% | 4 | 4 | 4 . |
| G | GGG | 2.4 | 41.3% | 2.5 | 33.2% | 1 | 1 | 1 |
| G | GGA | 1.3 | 21.5% | 1.9 | 25.7% | 2 | 2 | 2 |
| G | GGG | 1.1 | 19.4% | ' 1.7 | 22.8% | 3 | 3 | 3 |
Do prvního příkladu specifického syngenu (syngen č. 1) byly vneseny následující modifikace:
- V promotoru pIX: sekvence byla redukována jak nejvíce to bylo možné: zbylý fragment obsahoval pouze 56 nukleotidů místo 135 nukleotidů původního vektoru. Další modifikaci lze provést vnesením modifikace 9 nukleotidů umístěných mezi vazebným místem SPI a TATA boxem.
- V genu pIX: všechny pozice, kde to bylo možné, byly degenerovány, a sice podle pravidel uvedených výše, aniž by došlo ke změně výsledné aminokyselinové sekvence (sekvence i. č. 1) . Srovnám! přirozené sekvence a degenerované sekvence, stejně jako srovnání struktury expresního produktu těchto sekvencí, jsou uvedeny na obr. 8. Při použití jiné strategie je pouze 1 pozice z 10 degenerována, při použití ještě další strategie pouze jedna pozice z 20 je degenerována.
. - Ve vmezeřeném úseku mezi pIX a IVa2: sekvence tohoto úseku velikosti 59 nukleotidů nebyl v tomto příkladu modifikována.
V genu IVa2: kódující sekvence genu IVa2 byla degenerována podle pravidel uvedených výše, každá 20. bp, aniž by byla modifikována aminokyselinová sekvence (sekvence
i. č. 2). Přirozená sekvence a degenerované sekvence, stejně jako srovnání struktury expresního produktu těchto sekvencí, jsou uvedeny na obr. 9. Při použití jiné strategie je pouze 1. pozice z 10 degenerována, aniž by ještě došlo k modifikaci aminokyselinové sekvence.
·**·
9«
I «
• 999 • · ·
9 999
9 9 9
9 9
999 •9 9999
99
9 9 9
9 9 9
9 9 9 9
9 9 9
99
Struktura syngenu č. 1 je schematicky popsána na obr. 2. Sekvence syngenu č. 1 je znázorněna na obr. 10 a je zde uvedena jako sekvence id. č.,3.
Dalším příkladem syngenu je zde uvedený syngen č. 2, ve kterém:
Sekvence promotoru genu pIX 1 byla nahrazena modifikovanou sekvencí uvedenou zde jako sekvence id. č. 6.
Sekvence genu pIX byla nahrazena sekvencí podle sekvence id. č. 4 bez modifikace aminokyselinové sekvence.
- Sekvence IVa2 byla nahrazena sekvencí podle sekvence id. č. 5 bez modifikace aminokyselinové sekvence.
- Polyadenylační úsek byl nahrazen úsekem, který nese stejné funkce v adenoviru typu 7 (Ad7), adenoviru subskupiny
B, který byl užit jako vektor pro.přenos genů (Abrahamsen et al., 1997, J. Virol. 71, 8946-3951). Tato sekvence je zde uvedena jako sekvence i. č. 7. '
Celá modifikovaná sekvence; nazvaná syngen č. 2 je zde uvedena jako sekvence i. č. 8.
3. Verifikace sekvence syngenů
Základní charakteristiky přirozené a syngenní sekvence byly ověřeny analýzou zpracování dat. Cílem této verifikace bylo vyšetřit možnou přítomnost specifických struktur v syngenu, a sice zejména:
donorových nebo akceptorových sestřihových míst (programy SpliceView a/nebo' SpliceNet)
- polyadenylačnícn míst (program HcpolyA)
- potenciálních míst pro vazbu transkripčních faktorů (program Transfac) úseků schopných vytvářet . specifickou sekundární strukturu jako jsou např. přímé repetice, vlásenky (program Sigscan, BNL) včetně odpovídajících RNA (skládání RNA)
- konsenzních míst jako jsou CHI nebo M26.
···· ··« • ··
•.
• · · · · • · · · ··· ··· • · · * • · · · · ·
·. · · · ·
Když byly takové sekvence identifikovány, odpovídající baze byly případně nahrazeny podle strategie definované v bodu 2 výše.
4. Kbnstrukce defektních virů nesoucích syngen č. 1 jako náhradu za odpovídající přirozený úsek
1. Výchozí materiál: ·
- Syngen č. 1 (sekvence id. č. 3)
- 01igonukleo.tidy Syngen I a Syngen II odpovídající 5'konci a 3'-konci, v uvedeném pořadí, syngenu č. 1 uvedené na obr. 7
- Plazmid pJJlOS (viz obr. 3)
- Plazmid pJJHO (viz obr. 4)
- Plazmid pIC-20R (Invitrogen)
- Plazmid pSyngen: syngen klonovaný do pBS (Stratagene).
2. Konstrukce defektního virového genomu
Strategie konstrukce je znázorněna na obr. 6.
Plazmid pJJHO byl naštěpen Xbal a výsledné fragmenty velikosti 4,8 a 5,0 kb byly ligovány tak, že vytvořily plazmid pJJ201. Plazmid pJJ201 byl pak štěpen BstEII a Xmal, doplněny konce a byl- ligován, čímž vznikl plazmid pJJ202. Místa BstEII a Xmal zůstala zachována.
PCR amplifikační produkt odpovídající fragmentu 1. genu IVa2 (Egtl pro IVa2, obr. 6) byl’ vytvořen pomocí oligonukleotidú Syngen I a Syngen II a plazmidu pJJ105 jako templátu.
Sekvence oligonukleotidu Syngen I (sekvence i. č. 9): AACTGCCAGGCCGGCCACTA.GTCGCGATGTTCCCAGCCATATCCC
Sekvence oligonukleotidu Syngen II (sekvence i. č. 10): CCGCTCGAGGTGACCGCTAGCCATTATGGACGAATGC
Amplifikovaný fragment byl vložen do míst aSmal vektoru pIC-20R a vytvořil se tak pJJ203. Souvislý fragment genu IVa2 »*«· ·· • · · · φφφ φ φφφφ • · φ φ φ • φ φ φ φφφ φφ φφφ z plazmidu pJJ105 (fragment 2, označený Fgt2 IVa2 na obr. 6) byl vystřižen pomocí Nsil/BstEII a pak vložen do odpovídajících míst pJJ203, čímž vznikl pJJ204. Syngen byl pak naštěpen Fsel/Nrul (obr. 6) a vložen mezi 'odpovídající místa v pJJ204 a tak vznikl pJJ205.
Úplný fragment (syngen č. l-Fgtl+2 IVa2) v pJJ205 byl štěpen Sse8387I/BstEII a vložen do odpovídajících míst v pJJ202 a vznikl tak pJJ206 (obr. 5) .
Tento fragment pak byl využit k přípravě prokaryotického plazmidu, který obsahuje modifikovaný adenovirový genom (defektní v El a případně v E3) obsahující syngen č. 1, a sice způsobem podle Crouzět et al. (Proč.·' Nati. Acad. Sci. USA 94, 1414-1419, 1997) . Získaný plazmid byl pak transfekován do buněk linie 293,. aby produkoval odpovídající virus.
Byl proveden experiment ke srovnání kapacity výskytu RCA (replikačně kompetentních adenovirú) v průběhu množení viru v buňkách 293 u dvou virů, AVI.7 č.l CMVp53 a Ad5CMVp53.
Vektor (AVI.7 č.l CMVp53) vybavený sekvencí id. č. 3 (syngen č. 1) a expresní kazetou p53 (CMV-p53-polyASV40) byl zkonstruován podle publikace Crouzet et al. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94, 1414-1419, 1997).
Ad5CMVp53 obsahuje úsek pIX-IVa2 z Ad5 (nemodifikovaný). Expresní kazeta p53 je isogenní pro oba viry. Oba viry, AVI.7 č.l CMVp53 a Ad5CMVp53, mají podobnou produktivitu v buňkách 293. 2x5 plaků bylo amplifikováno během 7 po sobě jdoucích pasáží. Po ukončení této amplifikace bylo 2x5 vzorků ze 7. pasáže analyzováno testem na detekci RCA. Testovací experimenty byly provedeny ve třech opakováních. Výsledky jsou uvedeny na obr. 12.
Test pro detekci RCA je kvantitativní způsob, který umožňuje spočítat plaky, jejichž počet odpovídá počtu RCA v dávce testovaného vzorku. Daná dávka viru ve vzorku (obvykle 3 x 1O10 vp) se užije k infekci buněčného „trávníku φ · ·· · · φ φφφ φ »· · · · · · · · · « «t« · φ φφφ · · · · • «φφφ ······ • φ φ · · · · · · • φ φ φ φ φ φ φ φφφ φφ φφ buněk, které nemají komplementaci v trans (tj. které neexprimují El, v daném případě byly užity buňky A549) na který se nanese vrstva ' agaru. Po . 14 dnech se pozoruje vytváření plakú v „trávníku, pokud počáteční infekční dávka obsahovala RCA.
Výsledky testu na detekci RCA ve třech opakováních byly: 0 RCA pro AVI. 7 #1 CMVp53 a 6 RCA pro Ad5CMVp53. Tento výsledek byl statisticky významný, pokud se užila statistická srovnávací metoda zahrnující podmíněnou pravděpodobnost pozorování.. Statisticky významné zlepšení bylo pozorováno u,vektoru AVI.7 #1 CMVp53, ve smyslu snížení výskytu RCA v průběhu množení viru v buňkách 293 u tohoto viru ve srovnání s konvenčním virem. Tyto výsledky ukázaly, že přítomnost syngenu neovlivnila titry produkovaného viru a že várky viru obsahujícího syngen č. 1 byly bez kontaminací RCA.
‘5. Funkčnost defektních virů nesoucích syngen č. 2 jako náhradu za odpovídající přirozený úsek
Obdobně byl konstruován podobný vektor se syngenem č. 2 vybavený ještě expresní kazetou lacZ (CMV-LacZ): AVI.7 #2
CMVlacZ. Produktivita tohoto vektoru byla srovnána s vektorem nesoucím kazetu LacZ (RSV LacZ), jehož úseky . pIX a IVa2 nebyly modifikovány · (sekvence divokého typu Ad5) : AVI.ORSVlacZ. Produktivita těchto dvou vektorů AVI.7 #2
CMVlacZ a AVI.ORSVlacZ byla paralelně testována na buňkách 293. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce.
| AVI.7 #2 CMVlacZ | AVI.ORSVlacZ | |
| títr zásob, roztoku 1 (vp/ml) | 1, 12 x 10^ | 1,5 x 10” |
| titr zásob, roztoku 2 (vp/ml) | 1,52 x 10” | 1,-82 x 10k |
| produktivita (vp/buňka) testovaná na roztoku 2 | 10133 | 12133 |
| produktivita (tdu/buňka) testovaná na roztoků 2 | 203 | 207 |
| • · · · · • * · • · · · • · » • · | ·· · · · · · ♦ ·« • · · · · · · • · ··· · · · · • · ·«· ♦ * · • · · · · · · • · ··· »· · · | |
| 31 | ||
| \ | Tyto výsledky ukazují, že syngen č. více redukovanou než syngen č. 1 a | 2 mající homologii obsahující, kromě |
| umlčených mutací v genu pIX a IVa2, | také modifikace |
nekódujících úseků (tj. promotoru genu pIX a překrývajících se polyadenylačních sekvencí pIX a IVa2), pokud je vložen jako náhrada za sekvence divokého typu do adenoviru typu 5 se ukazuje jako životaschopný a poskytující vysokou produktivitu.
6.. Konstrukce defektních virů, kde je pouze přirozená sekvence genu pIX nahrazena degenerovanou sekvencí id. č. 1 a část homologního úseku, která odpovídá genu IVa2, je přesunuta do úseku E4
V jiném provedení vynálezu byla pouze sekvence genu pIX nahrazena degenerovanou sekvencí id. č. 1 . a část homologního úseku, která odpovídá genu IVa2, byla přesunuta do úseku E4. Klonování genu IVa2 bylo popsáno v patentové přihlášce. WO 96/10088, která je zde zahrnuta formou odkazu.
Nejdříve byl zkonstruován plazmid pIEll, který obsahuje 3 úseky uvedené níže klonované do plazmidu colEl, který nese geny KanR a SacB:
PCR produkt amplifikovaný z Ad5 pomocí oligonukleotidových primerů:
5'-atcgatčgATAACAGTCAGCCTTACC-3' a
5'-agctgaattcCATCATCAATAATATACC-3', přičemž tento produkt obsahuje pravý úsek I'TR a promotor
| E4 | až | po ATG z | orfl, ale | ne | včetně | (nukleotidy | 35525 až |
| 35937) | cDNA genu | IVa2, která | je | popsána | v patentové | přihlášce | |
| WO | 9610088 - fragment | XcmI-EcoRV | z | Ad5, který obsahuje | sekvence |
potřebné pro sestřih orf6 E4 a kódující sekvence orf6 až po místo EcoRV. • · · · · · ··· · ···· · · · · · » · · · • » · » · · · · » · · • · · · · · · · ' · ······ .·· ··· ·· ·· cDNA IVa2 v plazmidu pIEll předchází nadbytečný ATG. Toto místo bylo zrušeno v plazmidu pIEll místně-cílenou mutagenezí pomocí soupravy „Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit firmy Clontech. Byl tak vytvořen plazmid pIE12, kde bylo toto ATG místo odstraněno.
Plazmid pIE12c odvozený z plazmidu pIE12 obsahuje genom adenoviru 5 modifikovaný následujícím způsobem: gen IVa2 byl přesunut ze svého přirozeného lokusu do úseku E4, nahradily se orfl až orf4 z E4 ve prospěch IVa2 cDNA, odstranil se E3, vložila se kazeta RSV-lacZ místo El. Plazmid pIE12c byl získán rekombinací plazmidu pXL2788pGal- popsaného v patentové přihlášce WO 96/10088 pomocí techniky popsané v Crouzet et al. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94, 1414-1419, 1997, které jsou zahrnuty formou odkazu).
Po enzymatickém štěpení PacI byl plazmid pIE12c transfekován do buněk 293 a získaný virus byl namnožen. Byl pozorován restrikční profil viru AdIE12, který byl očekáván..
Analýzy provedené na várkách produkovaného viru ukázaly, že přítomnost degenerované sekvence genu pIX na místě přirozené sekvence a přesun genu IVa2 do úseku E4 neovlivnily titry produkovaného viru a že várky viru neobsahovaly, kontaminace RCA, když byly testovány v podmínkách popsaných v předchozím příkladu.’
Seznam citované literatury
Ahern et al. (1991) PNAS 88: 105
Aiello et al. (1979) Virol. 94: 460
Babiss and Valeš (1991) J. Virol. 65: 598 »
44 4 4
44 » 4 4 k · 4 « k 4 4 ' fc 4 4 1 » 4 · 1 ·· 44
Epstein (1991) J. Virol. 65: 4475
Gangloff et al. (1994) Experientia 50: 261
Holliday (1964) Ger.et. Res. 5: 282-304
Jeong~Yu and Carroll (1992) Mol. Cell. Biol, 12(1) : 112-9
Lin et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10(1): 103-12
Matsui·(1989) Mol. Cell. Biol. 9: 4265
Meselson M., Radding C. (1975) Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 80: 358-361
Spector (1983) Virol. 130: 533
Szostak et al. (1983) Cell 33: 25-35
Waldman and Liskay (1987) PNAS 84 (15) 5340-4
Weinberg (1986) J. Virol. 57: 833
Williams and Ustacelibi (1971) J. Gen. Virol. 13: 345
Young (1995) Current Topics in Microbiol. And Immunol. 199: 89
SEZNAM SEKVENCÍ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 424 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1..424 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:
| ATG Met 1 | TCC ACG | AAT TCC Asn Ser 5 | TTT GAC GGC TCC ATC GTC TCC AGC TAC. CTG ACC | 4S | ||||||||||||
| Ser | Thr | Phe Asp | Qiy | Ser | Tle 10 | Val | Ser | Ser | Tyr Leu Thr 15 | |||||||
| ACC | CGG | ATG | CCT | CCC | TGG | . GCT | CCC | GTC | CGC | CAA | AAC | GTC | ATG | GGA | AGC | 9.5 |
| Thr | Arg | Met | Pro | Pro | Trp | Ala | Gly | Val | Arg | Gin | Asn | Val | Met | Gly | Ser | |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||||
| TCC | ATC | GAC | GGC | AGG | CCT | GTG | CTC | CCT | GCC | AAT | AGC | ACC | ACT | CTG | ACT | 1 44 |
| Ser | Ile | Asp | Gly | Arg | Pro | Val | Leu | Pro | Ala | Asn | Ser | Thr | Thr | Leu | Thr | |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
| TAT | GAA | ACT | GTC | AGC | GGC | ACC | CCA | CTG | GAA | ACC | GCC | GCA | AGC | GCT | GCA | 192 |
| Tyr | Glu | Thr | Val | Šer | Gly | Thr | Pro | Leu | Glu | Thr | Ala | Ala | Ser | Ala | Ala | |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||||
| GCC | AGC | GCT | GCC | GCC | GCT | ACT | GCT | CGG | GGC | ATC | GTC | ACC | GAT | TTC | GCC | 240 |
| Ala | Ser | Ala | Ala | Ala | Ala | Thr | Ala | Arg | Gly | Ile | Val | Thr | Asp | Phe | Ala | |
| 65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||||||
| TTT | CTC | TCC | CCT | CTG· | GCC | TCC | AGC | GCT | GCC | AGC | CGC | AGC | TCT | GCT | CGG | 288 |
| Phe | Leu | Ser | Pro | Leu | Ala | Ser | Ser | Ala | Ala | Ser | Arg | Ser | Ser | Ala | Arg | |
| 85 | 90 | 95 | ||||||||||||||
| GAC | GAT | AAA | CTG | ACC | GCC | CTG | CTG | GCT | CAG | CTG | GAC | AGC | CTG | ACT, | AGG | 336 |
| Asp | Asp | Lys | Leu | Thr | Ala | Leu | Leu | Ala | Gin | Leu | Asp | Ser | Leu | Thr | Arg | |
| 100 | 105 | no | ||||||||||||||
| GAG | CTG | AAC | GTG | GTG | AGC | CAA | CAA | CTC | CTG | GAC | CTC | CGG | CAA | CAA | GTG | 384 |
| Glu | Leu | Asr. | Val | Val | Ser | GÍn | Gin | Leu | Leu | Asp | Leu | Arg | Gin | Gin | Val | |
| 115 | 120 | 125 | ||||||||||||||
| AGC | GCT | CTC | AAA | GCC | TCT | AGC | CCA | CCT | AAC | GCC | GTT | TAA | A | 424 | ||
| Ser | Ala | Leu | Lys | Ala | Ser | Ser- | Pro | Pro | Asn | Ala | Val | * |
130 135 140 • 999 (2) INFORMACE FRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
| ii) | (A) DÉLKA: 357 párů bázi · (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA:jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární TYP MOLEKULY: cDNA |
| ííí; | i HYPOTETICKÁ: ne |
| iv) | OPAČNÁ ORIENTACE: ne |
| ix) | ZNAKY: |
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1..354 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:
| ATC | GCG | AAC | CTA | AAA | ATA | CAG TCC | AAG | ATG | CAT | CTG | ATA | TCC | CCA | CGT | 43 |
| Ile | Ala | Asn | Leu | Lys | Zla | Gin Ser | lys | Met | His | Leu | Ile | Ser | Pro | Arg | |
| 1 | 5 | 1 0 | 15 | ||||||||||||
| ATG | CAC | CCC | TCC | CAG | CTT | AAC CGC | TTC | GTA | AAC | ACT | TAC | ACC | AAG | GGA | 96 |
| Met | His | Pro | Ser | Gin | Leu | Asn Arg | Phe | Val | Asn | Thr | Tyr | Thr | Lys | Gly | |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| CTG | CCC | CTG | GCA | ATC | AGC | CTG CTA | CTG | AAA | GAC | ATT | TTC | AGG | CAC | CAC | 144 |
| Leu | Pro | Leu | Ala | Ile | Ser | Leu Leu | Leu | Lys | Asp | Ile | ?he | Arg | His | His | |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| GCC | CAG | CGG | TCC | TGC | TAC | GAC TGG | ATT | ATC | TAC | AAC | ACC | ACT | CCG | CAG | 192 |
| Ala | Gin | Arg | Ser | Cys | Tyr | Asp Trp | Ile | Tle | Tyr | Asn | Thr | Thr | Pro | Gin | |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| CAT | GAA | GCT | CTC | CAG | TGG | TGC TAC | CTC | CAT | CCC | AGA | GAC | GGG | CTT | ATG | 240 |
| His | Glu | Ala | Leu | Gin | Trp | Cys Tyr | Leu | His | Pro | Arg | Asp | Gly | Leu | Met | |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| CCT | ATG, | ΤΑΓ | CTG | AAC | ATC | CAG AGC | CAC | CTT | TAC | CAC | GTC | CTC | GAA | AAA | 288 |
| Pro | Meť | Tyr | Leu | Asn | Ile | Gin Ser | His | Leu | Tyr | His | Val | Leu | Glu | Lys | |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| ATA | CAC | AGG | ACC | CTG | AAC | GAC CGA | GAC | CGC | TGG | TCT | CGG | GCC | TAC | CGC | 336 |
| Ile | His | Arg | Thr | Leu | Asn | Asp Arg | Asp | Arg | Trp | Ser | Arg | Ala | Tyr | Arg | |
| 100 | 105 | 110 |
| CGG | AAA | ACC | CCT | AAA |
| Arg | Lys 115 | Thr | Pro | Lys |
357 • · · · • · · · · · · · ··· · · ··· * · · ♦ • · · · · ί» · «· · ♦ · · · ♦ · · ·
6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:
(i) CHARAKTERISTIKA, SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 941 párů baží .
(B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA:jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (ix) ZNAKY: .
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon .
(B) POZICE: 1..941 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:
| GGCCGGCCGT· | CGACTGTGTG | GGCGTGGCTT | AAGGGTGGGA | AAGAATATAT | AAGGTGGGGG | 50 |
| TCTTATGTAG | TTTTGTATCT | GTTTTGCAGC | AGCCGCCGCC | GCCATGTCCA | CGAATTCCTT | 120 |
| TGACGGCTCC | ATCGTCTCCA | GCTACCTGAC | CACCCGGATG | CCTCCCTGGG | CTGGCG-CCG | 180 |
| CCAAAACGTC | ATGGGAAGCT | CCATCGACGG | CAGGCCTGTG | CTCCCTGCCA | ATAGCACCAC | 240 |
| TCTGACiTAr | GAAACTGTCA | GCGGCACCCC | ACTGGAAACC | GCCGCAAGCG | CTGCAGCCAG | 300 |
| CGCTGCCGCC | GCTACTGCTC | GGGGCATCGT | CACCGATTTC | GCCTTTCTCT | CCCCTCTGGC | 360 |
| CTCČAGCGCT | GCCACCCCCA | GCTCTGCTCG | GGACGATAAA | CTGACCGCCC | TGCTGGCTCA | 420 |
| GCTGGACAGC | CTGACTAGGG | AGCTGAACGT | GGTGAGCCAA | CAACTCCTGG | ACCTCCGGCA | 480 |
| ACAAGTGAGC | GCTCTCAAAG | CCTCTAGCCC | ACCTAACGCC | CTTTAAAACA | TAAATAAAAA | 540 |
| ACCAGACTCT | GTTTGGATTT | GGATCAAGCA | AGTGTCTTGC | TGICTTTATT | TAGGAGTTTT | 600 |
| CCGCGCGCGG | TAGGCCCGAG | ACCAGCGGTC | TCGGTCGTTC | AGGGTCCTGT | GTATTTTTTC | 660 |
| GAGGACGTGG | TAAAGGTGGC | TCTGGATGTT | CAGATACATA | GGCATAAGCC | CGTCTCTGGG | 720 |
| ATGGAGGTAG | CACCACTGGA | GAGCTTCATG | CTGCGGAGTG | GTGTTGTAGA | TAATCCAGTC | 780 |
| GTAGCAGGAC | CGCTGGGCGT | GGTGCCTGAA | aatgtctttc | AGTAGCAGCG | TGATTGCCAG | 840 |
| GGGCAGTCCC | TTGGTGTAAG | TGTTTACGAA | GCCGTTAAGC | TGGGA.GGGG j? | GCATACGTGG | 900 |
| GGATATGAGA | TGCATCTTGG | ACTCTATTTT | TAGCTTCGCG | A | 941 |
• · · · • · · · «·· · · · 9 9 9 9 • · ·· · ···· 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 • · · · 9 9 9 9 9
999999 99 9 99 99 99 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 423 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA:jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ií) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (ív) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1..423 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:
| ATG AGC ACG | AAT Asn | TCG TTT GAC | GGA AGC ATC GTC AGC TCA TAC TTG ACC | 43 | ||||||||||||
| Met 1 | Ser | Thr | Ser 5 | Phe Asp | Gly | Ser | Ile io | Val | Ser | Ser | Tyr | Leu 15 | Thr | |||
| ACG | CGC | ATG | CCT | CCC | TGC | GCC | GGG | GTG | CGC | CAG | AAT | GTC | ATG | GGC | TCC | 96 |
| Thr | Arg | Met | Pro | Pro | Trp | Ala | Gly | Val | Arg | Gin | Asn | Val | Met | Gly | Ser | |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||||
| AGC | ATT | GÁC | GGT | CGC | CCT | GTC | CTG | CCT | GCA | AAC | TCT | ACC | ACT | TTG | ACC | 144 |
| Ser | Ile | Asp | Glv | Arg | Pro | Val | Leu | Pro | Ala | Asn | Ser | Thr | Thr | Leu | Thr | |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
| TAC | GAA | ACC | GTG | TCT | GGC | ACG | CCG | TTG | GAA | ACT | GCA | GCA | TCC | GCC | GCC | 192 |
| Tyr | Glu | Thr | Val | Ser | Gly | Thr | Pro | Leu | Glu | Thr | Ala. | Ala | Ser | Ala | Ala | |
| • 50 | 55 | 60 | ||||||||||||||
| GCT | AGC | GCC | GCT | GCA | GCT | ACC | GCC | CGC | GGC | ATC | GTG | ACT | GAT | *2? | GCT | 240 |
| Ala | Ser | Ala | Ala | Ala | Ala | Thr | Ala | Arg | Gly | Zle | Val | Thr | Asp | Phe | Ala | |
| 65 | 70 | 75 | 30 | |||||||||||||
| TTT | CTG | AGC | CCG | CTT | GCC | AGC | AGT | GCA | GCC | TCC | CGT | TCA | GCC | CGC | 2S8 | |
| Phe | Leu | Ser | Pro | Leu | Ala | Ser | Ser | Ala | Ala | Ser | Arg | Ser | Ser | Ala | Arg | |
| 35 | 90 | 95 | ||||||||||||||
| GAT | GAC | AAA | TTG | ACG | GCT | CTT | CTG | GCT | CAG | CTG | GAT | TCT | TTG | ACT | CGG | 336 |
| Asp | Asp | Lys | Leu | Thr | Ala | Leu | Leu | Ala | Gin | Leu | Asp | Ser | Leu | Thr | Arg | |
| 100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
| GAA | CTT | AAC | GTC | GTT | TCT | CAG | CAA | CTG | TTG | GAC | CTG | CGC | CAG | CAA | GTT | 384 |
| Glu | Leu | Asn | Val | Val | Ser | Gin | Gin | Leu | Leu | Asp | Leu | Arg | Gin | Gin | Val |
115 120 125
| GCC | CTC | AAG | GCT | TCT | TCC | CCT | CCC | AAT | GCC | GTT |
| Ala | Leu | Lys | Ala | Ser | Ser | Pro | Pro | Asn | Ala | Val |
| 130 | 135 | 140 |
423 • · · · « ·4 « · ··· (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 141 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (Xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:
| Met 1 | Ser | Thr | Asr. | Ser 5 | Phe | ASp | Gly | Ser | Ile 10 | val | .Ser | Ser | Tyr | Leu 15 | Thr |
| Thr | Arg | Met | Pro | Pro | Trp | Ala | Gly | Val | Arg | Gin | Asn | Val | Met | Gly | Ser. |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Ser | Ile | Asp | Gly | Arg | Pro | Val | Leu | Pro | Ala | Asn | Ser | Thr | Thr | Leu | Thr |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Tyr | Glu | Thr | Val | Ser | Gly | Thr | Pro | Leu | Glu | Thr | Ala | Ala | Ser | Ala | Ala |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Ala | Ser | Ala | Ala | Ala | Ala | Thr | Ala | Arg | Gly | Ile | Val | Thr | Asp | Phe | Ala |
| 65 | 70 | 75 | v | 80 | |||||||||||
| Phe | Leu | Ser | Pro | Leu | Ala | Ser | Ser | Ala | Ala | Ser | Arg | Ser | Ser | Ala | Arg |
| 35 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Asp | Asp | tys | Leu | Thr | Ala | Leu | Leu | Ala | Gin | Leu | Asp | Ser | Leu | Thr | Arg |
| 1 00 | 105 | no | |||||||||||||
| Glu' | Leu | Asn | Val | Val | Ser | Gin | Gin | Leu | Leu | Asp | Leu | Arg | Gin | Gin | Val |
| Π5 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Ser | Ala | Leu | Lvs | Ala | Ser | Ser | Pro | Pro | Asn | Ala | Val | * |
130 135 140
| 0 • * | • · · · • | 0 0 0 | 0 | 0 0 0 0 0 ' | 0 | 0 0 0 | • * 0 | 0 |
| • | • 00 | 0 | 0 | 0 0 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| • | • · | 0 | 0 | 0 | 0 0 | 0 | 0 | 0 |
| • | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0 0 | 0 0 0 | 0 0 | 0 · |
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 270 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA:jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (ix) ZNAKY: .
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1..270 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:
| ACC AAG GGC CTG CCC | CTC GCA ATC AGC TTG CCA CCC AAA GAC ACC | Phe | 40 | |||||||||||||
| Thr 1 | Lys | Gly | Leu Pro 5 | Leu Ala | Cle Ser | Leu 10 | Leů | Leu | Lys | Asp | Tle 1S | |||||
| AGG | CAT | CAC | GCC | CAG | CGC | TCC | TGT | TAC | GAC | TG.G | ATC | ATC | TAC | AAT | ACC | 95 |
| Arg | His | His | Ala 20 | Gin | Arg | Ser | Cys | Tyr 25 | Asp | Trp | Tle | Ile | Tyr 30 | Asn | Thr | |
| ACC | CCG | CAG | CAT | GAA | GCC | CTC | r·» z UAJ | TGG | TGC | TAC | CTG | CAC | CCC | AGA | GAC | 144 |
| Thr | Pro | Gin | His | Glu | Ala | Leu | Gin | Trp | Cys | Tyr | Leu | Kis | Pro | Arg | Asp | |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
| GGG | CTG | ATG | CCC | ATG | TAT | CTG | AAT | ATC | CAG | AGT | CAC | CTT | TAT | CAC | GTC | 192 |
| Gly | Leu | Mat | Pro | Met | Tyr | Leu | Asn | lis | Gin | Ser | His | Leu | Tyr | KiS | Val | |
| 50 | . 52 | 60 | ||||||||||||||
| CTG | GAA | AAA | ATA | CAT | AGG | ACC | CTC | AAC | GAC | CGA | GAT | CGC | TGG | TCC | CGG | 240 |
| Leu 65 | Glu | Lys | Ile | His | Arg 70 | Thr | Leu | Asn | Asp | Arg 75 | Asp | Arg | Trp | Ser | Arg 80 | |
| GCC | TAT | CGC | GCG | CGC | AAA | ACC | CCT | AAA | TAA | 270 | ||||||
| Ala | Tyr | Ar g | Ala | Arg | Lys | Thr | Pro | Lys | * |
···· ·· ···· ·· · • 9 99 • * • · • 9 9
9 999
9 9
9 9
999
9 · 9
9 9 9
9 9 9
9 9 9
9 9 9 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 90 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (Xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:
| Thr | Lys | Gly | Leu | Pro | Leu | Ala | Ile | Ser | Leu | Leu | Leu | Lys | Asp | Ile | Phe |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Arg | His | His | Ala | Gin | Arg | Ser | Cys | Tyr | Asp | Trp | Ile | Ile | Tyr | Asn | Thr |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Thr | Pro | Gin | Krs | Glu | Ala | Leu | Gin | Trp | Cys | Ty σ’ | Leu | His | Pro | Arg. | Asp |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Gly | Leu | Met | Pro | Met | Tyr | Leu | Asn | Ile | Gin | Ser | Kis | Leu | Tyr | His | Val |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Leu | Glu | Lys | Ile | His | Arg | Thr | Leu | Asn | Asp | Arg | Asp | Arg | Trp | Ser | Arg |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Ala | Tyr | Arg | Ala | Arg | Lys | Thr | Pro | Lys | w | ||||||
| 85 | 90 |
• · 9 9 * 9 9 9
9 9 9
9 9 9
9 9 9 ·· 99 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 103 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA:jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: (B) POZICE: 1..103 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:
GGCCGGCCGT CGACTGTGGG GGCGTGGCAT AAGGGTGGGA AAGAATATAT AAGGTCGGGG 60 TCTCATCTAG TCTTGTATCT GATTTGCAGT AGCCGCCGCC ACC *' 03 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 52 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA:jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne .
(iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: (B) POZICE: 1..52 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:
AGATCTCAAA TCAATAAATA AAGAAATACT TGTTATAAAA ACAAATGAAT GT ··· ···
·· · ··· • · ·· ··· (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 847 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA:jednoduché • (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: (B) POZICE: 1..847 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S-IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:
CCCCGGCCGT CGACTGTGTG GGCGTGGCAT AAGGGTGGGA AAGAATATAT AAGGTCGGGG 60
TCTCATCTAG TCTTGTATCT GATTTGCAG? AGCCCCCGCC ACCATGAGCA CGAATTCGTT 120
TGACGGAAGC ATCGTCAGCT CATACTTCAC CACGCGCATG CCTCCCTGGG CCGGGGTGCG 180
CCAGAATGTC ATGGGCTCCA GCATTGACGG TCGCCCTGTC CTGCCTGCÁA ACTCTACCAC 240
TTTCACCTAC GAAACCGTGT CTGGCACGCC GTTGGAAACT GCAGCATCCG CCGCCGCTAG 300
CGCCGCTGCA GCTACCGCCC GCGGGATCGT GACTGATTTT GCTTTTCTGA GCCCGCTTGC 360
CAGCAGTGCA GCCTCCCGTT CAŤCTGCCCG CGATGACAAA TTGACGGCTC TTCTGGCTCA 420
GCTGGATTCT ŤTGACTCGGG AACTTAACGT CGTTTCTCAG CAACTGTTGG ACCTGCGCCA 480
GCAAGTTTCT CCCCTCAAGG CTTCTTCCCC TCCCAATGCC GTTTAAAGAT CTCAAATCAA 540
TAAATAAAGA AATACTTGTT ATAAAAACAA ATGAATGTTT ATTTAGGGGT TTTGCGCGCG 600
CGATAGGCCC GGGACCAGCG ATCTCGGTCG TTGAGGGTCC TATGTATTTT TTCCAGGACG. 660
TGATAAAGGT GACTCTGGAT ATTCAGATAC ATGGGCATCA GCCCGTCTCT GGGGTGCAGG 720
TAGCACCACT GCACGGCTTC ATGCTGCGGG GTGGTATTGT AGATGATCCA GTCGTAACAG 780 GAGCGCTGGG CGTGATGCCT AAAAATGTCT TTGAGTAGCA AGCTGATTGC GAGGGGCAGG 840
CCCTTCG
847 ···· • 4 4444 • 44 444 4 4 4 4
444 4 4 444 4 4 4 4
4 4 4 4 4 4··«· • 4 4 4 4 4 4 ·· (2) INFORMACE PRO .SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČíŠLEM 9:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 44 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA:jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne ' (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: (B) POZICE: 1..44 (Xl) POPIS· SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:
AACTGCAGGCCGGCCACTAGTCGCGATGTTCCCAGCCATATCCC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 37 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina
- (C) TYP VLÁKNA:jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ : (B) POZICE: 1..37 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:
CCGCTCGAGGTGACCGCTAGCCATTATGGACGAATGC
Claims (4)
1. Způsob ' snížení intermolekulárních homologních chromozomální nukleovou kyselinou kódující funkce defektního adenoviru a extrachromozomální nukleovou kyselinou obsahující genom defektního adenoviru vyz.načuj ící se tím, že sekvence alespoň jedné z partnerských 'rekombinujících modifikována takovým způsobem, druhým partnerem (partnery).
že je snížena homologie s
2. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že sekvence je kódující sekvence a je degenerovaná.
3. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že sekvence je degenerovaná v poměru alespoň 1 pár baží z každých 20 párů baží, výhodně v poměru alespoň 1 pár baží z každých 10 párů baží.
. 4. Způsob podle nároku 1 vyznačující 'se tím, že sekvence je degenerovaná ve všech možných pozicích.
5. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že degenerace je vytvořena jako funkce využití kodonů v komplementující buňce.
6. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že chromozomální nukleová kyselina úsek El adenovirového genomu, spolu s lemujícím úsekem, a extrachromozomální nukleová kyselina obsahuje genom adenoviru, který je defektní v úseku El.
BBBB • Β BBBB
ΒΒ ΒΒ • Β « ΒΒΒ BBBB
ΒΒΒ* · Β ··« Β Β Β Β • Β * Β Β Β · Β · · Β
Β ΒΒΒ Β Β · Β ·
ΒΒΒ ΒΒΒ ΒΒ ΒΒΒ ·· ΒΒ
7. Způsob podle nároku 6 vyznačující se tím, že sekvence genomu adenoviru, který je defektní v úseku El, je degenerovaná v genu pIX.
8. Způsob podle nároku 7 vyznačující se tím, že sekvence genomu adenoviru, který je defektní v úseku El, je navíc degenerovaná v genu IVa2.
9. Způsob přípravy defektních rekombinantních adenovirů
10. Defektní rekombinantní adenovirus, jehož . genom obsahuje alespoň jeden úsek, jehož sekvence je modifikována takovým způsobem, že je snížena frekvence intermolekulárních homologních rekombinací s ohromozornálni nukleovou kyselinou kódující jeho komplementující funkce, přičemž tato sekvence je modifikována takovým způsobem, že je snížena homologie s druhým partnerem (partnery).
11. Adenovirus podle nároku 10, ve kterém je modifikován kódující úsek a degenerovaný úsek obsahuje gen pIX.
12. Adenovirus podle nároku 11, kde degenerovaná sekvence obsahující gen pIX je sekvence id. č. 1.
13. Adenovirus podle nároku 11 nebo 12, ve kterém je navíc gen lVa2 přítomen v genomové pozici odlišné od původní pozice.
4444
44 ···· 44 ·»
44 · 4 · 4 4 4 4 4 4 • 444 4 · 444 4 <4 4
4 444 4 444 44 4
4 4 44 4.4 44 4
444 444 44 444 44 44
který obsahuje deleci úseku El.
18. Adenovirus podle nároku 11 nebo 12, kde degenerovaná sekvence genu pIX je sekvence id. č. 1.
19. Buňka obsahující defektní adenovirus, ve které sekvence buněčné' chromozomální nukieové · kyseliny, která kóduje komplementující funkce defektního adenoviru, nebo sekvence extrachromozomální nukieové kyseliny, která obsahuje genom adenoviru, je modifikována takovým způsobem, že je snížena homologie mezi oběma nukleovými kyselinami.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9714383A FR2774699B1 (fr) | 1997-11-17 | 1997-11-17 | Methode de reduction des evenements de recombinaison homologue |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20001791A3 true CZ20001791A3 (cs) | 2000-08-16 |
| CZ299797B6 CZ299797B6 (cs) | 2008-11-26 |
Family
ID=9513447
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20001791A CZ299797B6 (cs) | 1997-11-17 | 1998-11-17 | Metody snížení výskytu homologních rekombinací, adenovirové vektory a bunky obsahující defektní adenovirus |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6410298B1 (cs) |
| EP (1) | EP1032695B1 (cs) |
| JP (1) | JP4376454B2 (cs) |
| KR (2) | KR100796060B1 (cs) |
| CN (1) | CN1201013C (cs) |
| AT (1) | ATE393234T1 (cs) |
| AU (1) | AU759531B2 (cs) |
| BR (1) | BR9814210A (cs) |
| CA (1) | CA2309315C (cs) |
| CZ (1) | CZ299797B6 (cs) |
| DE (1) | DE69839403T2 (cs) |
| FR (1) | FR2774699B1 (cs) |
| HU (1) | HU226018B1 (cs) |
| IL (2) | IL135983A0 (cs) |
| NO (1) | NO329784B1 (cs) |
| PL (1) | PL196606B1 (cs) |
| WO (1) | WO1999025861A2 (cs) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2799472B1 (fr) * | 1999-10-07 | 2004-07-16 | Aventis Pharma Sa | Preparation d'adenovirus recombinants et de banques adenovirales |
| US7653769B2 (en) * | 2006-12-14 | 2010-01-26 | International Business Machines Corporation | Management of devices connected to infiniband ports |
| US6821775B1 (en) * | 2000-02-11 | 2004-11-23 | Genvec, Inc. | Viral vector encoding pigment epithelium-derived factor |
| US6591543B2 (en) * | 2000-04-14 | 2003-07-15 | Kenneth P. Sabine | Top water lure with highly active propeller |
| KR20010064682A (ko) * | 2000-07-01 | 2001-07-11 | 김재호 | Ｅ1ｂ가 감쇠된 아데노바이러스를 이용한 ｃｄ／5－ｆｃ및 ｈｓｖ－1 ｔｋ／ｇｃｖ의 이중 자멸 유전자 시스템 |
| DE10045687B4 (de) * | 2000-09-15 | 2006-07-06 | MICROMUN Privates Institut für Mikrobiologische Forschung GmbH Biotechnikum Greifswald | Expressionskassetten und Adenovirusvektoren |
| US20030087438A1 (en) * | 2001-11-02 | 2003-05-08 | Genvec, Inc. | E1-revertant-free adenoviral composition |
| US20030158112A1 (en) | 2002-02-15 | 2003-08-21 | Johns Hopkins University School Of Medicine | Selective induction of apoptosis to treat ocular disease |
| CA2507036A1 (en) * | 2002-12-02 | 2004-06-17 | Genvec, Inc. | Materials and methods for treating ocular-related disorders |
| CA2559436A1 (en) * | 2004-03-12 | 2005-09-29 | Genvec, Inc. | Materials for treating vascular leakage in the eye |
| US20060188481A1 (en) * | 2005-02-22 | 2006-08-24 | Saitama Medical School | Methods for prophylactically or therapeutically treating an animal for an ocular-related disorder |
| TW200840869A (en) * | 2007-01-30 | 2008-10-16 | Transgene Sa | Papillomavirus vaccine |
| ES2416361T3 (es) * | 2007-05-15 | 2013-07-31 | Transgene Sa | Vectores para la expresión de múltiples genes |
| HUE029744T2 (en) | 2007-07-26 | 2017-04-28 | Uniqure Ip Bv | Baculovirus vectors containing different codon sequences with repeated coding sequences |
| AU2009317517B2 (en) * | 2008-11-21 | 2014-12-04 | Bavarian Nordic A/S | Vector comprising multiple homologous nucleotide sequences |
| EP2389443B1 (en) | 2009-01-23 | 2018-11-14 | Roger Williams Hospital | Retroviral vectors encoding multiple highly homologous non-viral polypeptides and the use of same |
| WO2012021730A2 (en) * | 2010-08-11 | 2012-02-16 | Genvec, Inc. | Respiratory syncytial virus (rsv) vaccine |
| EP2784155B1 (en) * | 2011-11-24 | 2018-06-13 | Viromed Co. Ltd. | Adenovirus producing novel cell line and the use thereof |
| US9014637B1 (en) * | 2013-09-27 | 2015-04-21 | Intel Corporation | Dynamic switching frequency control of an on-chip or integrated voltage regulator |
| CN108203706B (zh) * | 2017-11-30 | 2021-03-26 | 陕西师范大学 | 一种用于提高高容量腺病毒包装效率的辅助腺病毒 |
| CN112877358B (zh) * | 2021-02-07 | 2023-02-03 | 上海市第一人民医院 | 一种基于5型腺病毒序列的重组质粒及应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2726285B1 (fr) * | 1994-10-28 | 1996-11-29 | Centre Nat Rech Scient | Adenovirus depourvus de particules contaminantes viables, preparation et utilisation |
| ES2300105T3 (es) * | 1995-03-24 | 2008-06-01 | Genzyme Corporation | Vectores adenoviricos para terapia genica. |
| US5994128A (en) * | 1995-06-15 | 1999-11-30 | Introgene B.V. | Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy |
-
1997
- 1997-11-17 FR FR9714383A patent/FR2774699B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-11-17 EP EP98955679A patent/EP1032695B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1998-11-17 US US09/530,378 patent/US6410298B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-11-17 KR KR1020007005333A patent/KR100796060B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-11-17 HU HU0101827A patent/HU226018B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1998-11-17 KR KR1020077020673A patent/KR20070103483A/ko not_active Application Discontinuation
- 1998-11-17 CA CA2309315A patent/CA2309315C/fr not_active Expired - Fee Related
- 1998-11-17 AT AT98955679T patent/ATE393234T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-11-17 CN CNB98810749XA patent/CN1201013C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-11-17 IL IL13598398A patent/IL135983A0/xx active IP Right Grant
- 1998-11-17 WO PCT/FR1998/002453 patent/WO1999025861A2/fr active IP Right Grant
- 1998-11-17 CZ CZ20001791A patent/CZ299797B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-11-17 DE DE69839403T patent/DE69839403T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-11-17 JP JP2000521224A patent/JP4376454B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-11-17 BR BR9814210-0A patent/BR9814210A/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-11-17 PL PL340601A patent/PL196606B1/pl unknown
-
2000
- 2000-05-03 AU AU31294/00A patent/AU759531B2/en not_active Ceased
- 2000-05-04 IL IL135983A patent/IL135983A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-05-15 NO NO20002504A patent/NO329784B1/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2003504004A (ja) | 2003-02-04 |
| KR100796060B1 (ko) | 2008-01-21 |
| KR20010032146A (ko) | 2001-04-16 |
| NO20002504L (no) | 2000-05-15 |
| DE69839403T2 (de) | 2009-05-28 |
| HU226018B1 (en) | 2008-03-28 |
| EP1032695B1 (fr) | 2008-04-23 |
| WO1999025861A3 (fr) | 1999-07-01 |
| CZ299797B6 (cs) | 2008-11-26 |
| HUP0101827A3 (en) | 2003-08-28 |
| CN1201013C (zh) | 2005-05-11 |
| CN1278302A (zh) | 2000-12-27 |
| JP4376454B2 (ja) | 2009-12-02 |
| PL196606B1 (pl) | 2008-01-31 |
| NO329784B1 (no) | 2010-12-20 |
| KR20070103483A (ko) | 2007-10-23 |
| PL340601A1 (en) | 2001-02-12 |
| FR2774699A1 (fr) | 1999-08-13 |
| AU3129400A (en) | 2000-12-14 |
| WO1999025861A2 (fr) | 1999-05-27 |
| HUP0101827A2 (hu) | 2001-09-28 |
| FR2774699B1 (fr) | 2003-10-03 |
| BR9814210A (pt) | 2000-10-03 |
| US6410298B1 (en) | 2002-06-25 |
| AU759531B2 (en) | 2003-04-17 |
| EP1032695A2 (fr) | 2000-09-06 |
| DE69839403D1 (de) | 2008-06-05 |
| ATE393234T1 (de) | 2008-05-15 |
| IL135983A (en) | 2008-11-26 |
| CA2309315C (fr) | 2011-06-14 |
| IL135983A0 (en) | 2001-05-20 |
| CA2309315A1 (fr) | 1999-05-27 |
| NO20002504D0 (no) | 2000-05-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ20001791A3 (cs) | Metody snížení výskytu homologních rekombinací, adenovirové vektory a buňky obsahující degektní adenovirus | |
| KR100403708B1 (ko) | 재조합아데노-수반바이러스(aav)제조방법및이의용도 | |
| FI118538B (fi) | Menetelmä geeniterapiassa käytettävien adenoviraalisten eläinperäisten vektoreiden valmistamiseksi | |
| RU2219241C2 (ru) | Дефектный рекомбинантный аденовирусный вектор (варианты) | |
| JP3842818B2 (ja) | 組換えアデノウイルスゲノムの製造方法 | |
| JPH10507922A (ja) | 生存汚染粒子を持たないアデノウィルス、その製造および使用 | |
| JPH11507835A (ja) | 組換えアデノウイルス、ａａｖを作製するためのその使用、相補的細胞系、及び、該アデノウイルスを含む医薬組成物 | |
| JP3827163B2 (ja) | 遺伝子治療用のアデノウイルスベクター | |
| JPH10506018A (ja) | 不活化ＩＶａ２遺伝子を有する欠陥組換えアデノウィルス | |
| US7264818B2 (en) | BAV packaging regions and E1 transcriptional control regions | |
| US7687615B2 (en) | PAV regions for encapsidation and E1 transcriptional control | |
| MXPA00004646A (en) | Adenovirus vectors and method for reducing homologous recombination phenomena | |
| JP2023520610A (ja) | 真核細胞におけるｄｎａ断片の維持、手法、および使用 | |
| AU3926599A (en) | Preparation of recombinant adenovirus carrying a rep gene of adeno-associated virus |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20141117 |