JPH11507241A

JPH11507241A - 組換え鶏痘ウイルスおよびその使用

Info

Publication number: JPH11507241A
Application number: JP9502321A
Authority: JP
Inventors: コークラン、マーク・ディー; ジュンカー、デイビッド・イー; シンガー、フィリップ・エー
Original assignee: シントロ・コーポレーション
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-04
Publication date: 1999-06-29
Also published as: AU729518B2; EP0832197A4; AU6481996A; EP0832197A1; WO1996040880A1; CA2223591A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、鶏痘ウイルスゲノムＤＮＡに挿入された外来ＤＮＡ配列を具備する組換え鶏痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡ配列は前記鶏痘ウイルスゲノムＤＮＡの日必須領域内に挿入されており、且つ鶏痘ウイルスに感染したホスト細胞中で発現することができる組換え鶏痘ウイルスを提供する。更に、本発明はホモロジーベクター、ワクチンおよび免疫感作の方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】組換え鶏痘ウイルスおよびその使用本出願では、いくつかの刊行物が括弧に入れたアラビア数字によって引用される。これらの文献の全引用は請求の範囲の直前の明細書の最後に見い出すことができる。本発明が関係する技術水準を十分に記載するために、これらの刊行物の全内容を出典明示により本出願に取り入れる。〔発明の背景〕本発明は、ニューカッスル病ウイルスおよび鶏痘ウイルスに対して家禽を保護するための生ワクチンで有用な組換え鶏痘ウイルスに関する。ＤＮＡを単離し、この単離したＤＮＡを細菌プラスミドにクローン化する能力は、ウイルスワクチンを作成するのに利用できるアプローチを大いに拡大してきた。本発明を作成するのに使用する方法は、挿入、欠失および単一または複数塩基の変化によってクローン化ＤＮＡ配列を修飾することを含む。次いで、修飾されたＤＮＡをウイルスゲノムに挿入し、次いで、得られたウイルスをワクチンで使用して、宿主動物で免疫応答を誘導し、該動物を病気から保護することができる。鶏痘ウイルス（ＦＲＰ）は、ウイルスのポックスウイルス科のメンバーである。この分類には２つの亜科があり、それらはウイルスの宿主範囲（脊椎動物または無脊椎動物）に基づいて区別される。脊椎動物ポックスウイルスの中には、６つの属にウイルスを分類するのに助けになるグループ特異的抗原に対して血清学的交差反応性であり、ＦＲＰは、一義的には鳥類に感染する７つのさらなるポックスウイルスと共にアビポックスウイルスに入れられてきた。一般に、ポックスウイルスは動物ウイルスのうち最大であって、光学顕微鏡で見ることができる。電子顕微鏡下では、該ウイルスはビスケット様または卵形の外観をとる。ポックスウイルスの主たる化学的成分は蛋白質（９０重量％）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）（３％）および脂質（５％）であるが、ＦＲＰにおいては、脂質成分は乾燥重量の１／３である。可溶化ビリオンのポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）は、構造ポリペプチドを含むウイルスと会合した１００を超える蛋白質、メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）の翻訳に関連する酵素、ＲＮＡ合成に関与する酵素、およびＤＮＡ複製に関連する酵素があることを示す。ポックスウイルスのゲノムは、個々のウイルスに応じて、塩基組成（３２％Ｇ＋Ｃないし６４％Ｇ＋Ｃ）および長さ（ＦＰＶでは１４０キロ塩基対［ｋｂ］ないし２８０ｋｂ）が変化する二本鎖ＤＮＡよりなる。ワクシニアウイルス（ＶＶ）ゲノムの完全なヌクレオチド配列は最近決定されており、必須遺伝子のほとんどは、ゲノムの高度に保存された中央領域内にあり、他方、非必須機能はＤＮＡの末端近くにマップされるようである。ポックスウイルスは、感染細胞の細胞質空間内で複製するその特性の点でユニークであり、ＶＶの場合には、成熟ウイルス粒子は集合領域から細胞の周辺に移動し、そこで、さらなる膜の被包が起こる。ＦＰＶに関しては、組み立てられたウイルス粒子は、ウイルスを溶解活性から保護し得る細胞封入体の形態のウイルスを包む濃厚なウイルス由来の蛋白質マトリックスと結合状態となる。具体的ポックスウイルスおよび株（異なる成熟ＶＶ株の１％ないし３０％）に応じて、種々のレベルの成熟ウイルスが細胞外で見い出されるが、大部分のウイルス集団は増殖サイクルの最後において細胞と結合したままである。鶏痘は世界を通じて独特であるが、その宿主範囲が鳥類に限られているゆえに、それは公衆の健康に有害なものとは考えられていない。全てのニワトリは該ウイルスに感染し得るのであり、該鳥の成長速度が低下する結果となり、卵の生産は一時的に減少する。通常、ＦＰＶの伝播は負傷した皮膚の物理的接触を介して起こるが、該ウイルスは節足動物媒介体を介して伝播するとの報告もある。４ないし１０日の潜伏期の後、該病気は以下のような方法で典型的には発現される：羽にない領域における皮膚病変、鼻通路の病変、および口の病変。通常のＦＰＶ感染は、通常は、３ないし４週間続き、しかる後、該鳥は該病気に対して一生続く免疫性が付与される。現在、慣用的に得られるＦＰＶワクチンは、ニワトリおよびシチメンチョウに対する保護を供するために、商業的環境で使用されつつある。典型的には、ワクチンウイルスは、増殖および／または毒性特性が改変された株を選択する細胞培養における系列的継代によって弱毒化される。修飾された生ワクチンは、ニワトリ胚繊維芽細胞におけるイン・ビトロ増殖によって、あるいはニワトリ胚の漿尿膜上での増殖によって調製される。該ワクチンウイルスは鳥類に皮下投与される。本発明は、特異的ワクチン抗原を家禽に送達するためのベクターとしてのＦＰＶの使用に関する。生ウイルスを抗原の送達系として用いるアイデア（搬送）は、最初の生ウイルスワクチンの導入に関連して長い歴史を有する。送達された抗原は外来性のものではなかったが、ワクチン中の生ウイルスによって自然に発現された。現代的センスにおいて、外来性抗原を送達するのにウイルスを使用するのは、組換えＤＮＡ研究と共に明白となった。ワクシニアウイルスはベクターであり、病理を引き起こす他の病気からの種々の抗原は外来性抗原であり、ワクチンは遺伝子操作によって創製された。該概念はこれらの開示で明らかとなったが、明らかでなかったのは、何が最良の候補ウイルスベクターをつくるのか、および何が最良の外来性遺伝子または送達すべき遺伝子を構成するのかに関するより現実的な疑問に対する回答であった。これらの疑問に答えるには、病原性の詳細、複製または増殖の部位、誘導される免疫応答の種類、注目するウイルスおよび外来性遺伝子（ＧＯＩ）についての発現レベル、遺伝子操作に対するその適当性、取締当局により許可されるその確率等が構成における全ての因子である。先行技術は利用性のこれらの疑問を教示しない。組換えポックスウイルスを創製する現在好ましい方法は、ポックスウイルスプロモーター、続いて注目する遺伝子よりなる少なくとも１つのカセットを含有する細菌起源のプラスミドを使用する。該カセット（類）には、相同組換えによってウイルスゲノムの対応する相同非必須領域領域に注目する遺伝子を向けるポックスウイルスゲノムＤＮＡが直ぐに隣接している。細胞をまず野生型ウイルスで感染させ、しかる後短時間で、プラスミドＤＮＡを感染細胞に導入する。ポックスウイルスはそれ自体のＲＮＡポリメラーゼおよび転写装置を有しているので、注目する遺伝子はポックスウイルス起源のプロモーターによって調節される必要がある。ウイルスの感染サイクルに対する遺伝子発現のその一時的調節に基づい分類される３つの特徴的ポックスウイルスプロモーターがある：初期、中期および後期発現。各プロモーターのタイプは、長さが〜３０ｂｐであって、各プロモータータイプに特異的な典型的コンセンサス配列によって同定できる。ワクシニアウイルスでは、いくつかのウイルス遺伝子は、ウイルスが使用できて、感染サイクルを通じて下流遺伝子を連続的に発現する縦列初期／後期プロモーターによって調製される。ポックスウイルスがゲノムの種々の部分にＤＮＡの非必須領域を含有すること、およびこれらの領域の修飾がウイルスを弱毒化し、それからワクチンを得ることができる非病原性株とするか、あるいはウイルスの混合集団を生じるゲノムの不安定性を生起することは一般に認められている。ウイルスの弱毒化の程度はワクチンとしてのウイルスの利用性にとって重要である。ウイルスのあまりもの弱毒化を引き起こす挿入または欠失あるいはウイルスのあまりもの弱毒化または遺伝子不安定性を引き起こす遺伝子欠失は、適切な免疫応答を誘導できないワクチンとしてしまう。欠失／挿入のいくつかの例はポックスウイルスで知られているが、適切な立体配置は容易には明らかとならない。かくして、これまで、注目する外来遺伝子からの遺伝子発現は、５つの異なるポックスウイルス：ワクシニア、カナリア痘、ブタ痘、アライグマ痘および鶏痘で得られている。ワクシニアウイルスは古典的に研究されたポックスウイルスであって、注目する外来性遺伝子を搬送するのに広範に使用されておりそれは米国特許第４,６０３,１１２号および第４,７２２,８４８号の主題である。アライグマ痘(Espositoら，1988)およびカナリア痘(Taylorら，1991)は狂犬病ウイルスからの抗原を発現させるのに用いられてきた。より最近では、ＦＰＶは注目する多数の異なる外来性遺伝子を搬送するのに用いられ、特許出願（ＥＰＡ 0 294 416 、ＰＣＴＷＯ 89/93429、ＰＣＴＷＯ 89/12684、ＰＣＴＷＯ 91/02072、ＰＣＴＷＯ 89/03879、ＰＣＴ等）の主題である。しかしながら、これらの刊行物は、本発明の搬送される抗原の立体配置、ＦＰＶ挿入部位、またはプロモーター配列および配置を教示するものではない。ＦＰＶのゲノムへの挿入に対して標的化された注目外来遺伝子は注目するいずれかの病原性生物から得ることができる。典型的には、注目する遺伝子は、家禽産業に対して経済的インパクトを有する家禽に病気を引き起こす病原体から得られるであろう。遺伝子は現存ワクチンがある生物から得ることができ、搬送技術の新規利点のため、ＦＰＶ由来ワクチンが優れているであろう。また、遺伝子は、現在ワクチンがないが、病気の制御の必要がある病原体から得ることもできる。典型的には、注目する遺伝子は病原体の免疫原性ポリペプチドをコードし、表面蛋白質、分泌蛋白質および構造蛋白質を表す。本発明におけるＦＰＶ搬送のための標的である１つの重要な鳥類病原体は感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴ）である。ＩＬＴはヘルペスウイルス科のメンバーであって、この病原体は、呼吸器系衰弱、息切れおよび血液滲出物の痰によって特徴つけられるニワトリの急性病を引き起こす。ウイルス複製は呼吸器気管の細胞に限られており、ここに、気管では、感染は組織糜爛および出血を生起させる。ニワトリでは、病巣形成の程度を低下させるのに、または臨床的徴候を減少させるのに効果的な薬物はない。細胞継代によって誘導されたＩＬＴウイルスの種々の修飾形態での鳥類のワクチン接種および／または投与の退屈な養生法は罹患ニワトリで許容される保護を与えてきた。現行のＩＬＴワクチンの弱毒化の程度のため、保護を供するのに十分であるが、群れで病気を引き起こすには十分ではない、ウイルスの正しいレベルが維持されていることを確実とするように注意を払わなければならない。ＦＰＶ搬送アプローチのためのさらなる標的はニューカスル病であり、これはニューカスル病ウイルス（ＮＤＶ）（パラミキソウイルス科の一本鎖ＲＮＡウイルス）によって引き起こされる感染性で、高度に接触感染性かつ消耗性の病気である。ＮＤＶの種々の病原型（短潜伏期性、亜病原性、長潜伏期性）は、病気のひどさ、特異性および徴候に関して異なるが、ほとんどの型は呼吸器系および神経系に感染するようである。ＮＤＶは主としてニワトリ、シチメンチョウおよび他の鳥類種に感染する。歴史的には、ワクチン接種を用いて病気を防止してきたが、母親抗体干渉、鳥類の寿命および投与経路のため、生産者は免疫化プロトコルを特異的ニーズに適合させる必要がある。家禽のマレク病は、末梢神経系ならびに他の内蔵組織および器官を主として冒す家禽の病気を生じるリンパ増殖性腫瘍である。マレク病は世界中の家禽生産国に存在し、ＦＰＶ−ベースの搬送ワクチンのための本発明によって記載されるさらなる標的である。マレク病の病因は、マレク病ウイルス（ＭＤＶ）と呼ばれてきた細胞会合ガンマヘルペスウイルスである。３つのクラスのウイルスが、マレク病に対してニワトリを保護する慣用的ワクチンとして開発されてきた：弱毒化血清タイプ１ＭＤＶ、シチメンチョウのヘルペスウイルス（ＨＶＴ）およびＭＤＶの天然に無毒の血清タイプ２単離体。これらのウイルスで得られる保護は、主として、病気の腫瘍形成性態様に向けられる。かかる慣用的にワクチン接種された群れにおける過剰のマレク病喪失の出現は、種々のワクチンタイプの混合物を形成する必要性に導いた。かかる多価ワクチンは病気制御で一般的には効果的であるもののワクチン療法を複雑化する。〔発明の概要〕本発明は、鶏痘ウイルスゲノムＤＮＡに挿入された外来性ＤＮＡ配列よりなり、ここに、該外来性ＤＮＡ配列が鶏痘ウイルスゲノムＤＮＡの非必須領域内に挿入され、鶏痘ウイルス感染宿主細胞で発現され得る組換え鶏痘ウイルスを提供する。本発明は、さらに、相同ベクター、ワクチンおよび免疫化の方法を提供する。〔図面の簡単な説明〕図１Ａ−１Ｃ：相同ベクター５０２−２６.２２中のＳｆｉＩ断片インサートの詳細な記載。ダイアグラムはカセット中で組み立てたＤＮＡ断片の向きを示す。各断片の起源は材料および方法セクションに記載する。各断片間の接合部およびマーカー遺伝子の末端に位置する配列を示し、これは接合部Ａ（配列番号：１５）、接合部Ｂ（配列番号：１６）、接合部Ｃ（配列番号：１７）、および接合部Ｄ（配列番号１８）を含む。各断片を生成させるのに用いた制限部位は適当な接合部に示す。ＮＤＶＦおよびＨＮ遺伝子の位置を示す。丸括弧（）中の数字はアミノ酸をいい、角括弧［］中の制限部位は構築の間に破壊された部位の跡を示す。図２Ａ−２Ｄ：鶏痘ウイルス−Ｓ−ＦＰＶ−０９９およびＳ−ＦＰＶ−１０１および相同ベクター７５１−０７.Ｄ１におけるＤＮＡ挿入の詳細な記載。プラスミド７５１− ０７.Ｄ１中で組み立てられたＤＮＡ断片の向きを示すダイアグラム。各断片の起源は表に示す。断片間の各接合部に位置する配列も示す。図２Ａ−２Ｄは断片間の結合部Ａ（配列番号：）、（配列番号：）、Ｃ（配列番号：）、Ｄ（配列番号：）およびＥ（配列番号：）に位置する配列ならびに接合部に位置する配列を示す。各断片を生じさせるのに用いた制限部位ならびに断片を連結するのに用いた合成リンカー配列は各接合部につき記載する。いくつかの遺伝子暗号領域および制御要素の位置も与える。以下の２つの約束を用いる：丸括弧（）中の数字はアミノ酸を指し、角括弧［］中の制限部位は構築の間に破壊された部位の跡を示す。以下の省略を用いる：鶏痘ウイルス（ＦＰＶ）、ニワトリ・インターフェロン（ｃＩＦＮ）、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）(E．coli)、痘合成後期プロモーター２初期プロモーター２（ＬＰ２ＥＰ２）、痘合成後期プロモーター１（ＬＰ１）、塩基対（ＢＰ）、ポリメラーゼ鎖反応(ＰＣＲ)。図３Ａ−３Ｄ：鶏痘ウイルスＳ−ＦＰＶ−１００および相同ベクター７５１−５６.Ｃ１におけるＤＮＡの詳細な記載。プラスミド７５１−５６.Ｃ１中で組み立てたＤＮＡ断片の向きを示すダイアグラム。各断片の起源は表に示す。断片間の各結合部に位置する配列も示す。図３Ａ−３Ｄは断片間の結合部Ａ(配列番号：)、(配列番号：)、Ｃ(配列番号：)、Ｄ（配列番号：）およびＥ（配列番号：）に位置する配列ならびに接合部に位置する配列を示す。各断片を生じさせるのに用いた制限部位ならびに断片を連結するのに用いた合成リンカー配列は各接合部につき記載する。いくつかの遺伝子暗号領域および制御要素の位置も与える。以下の２つの約束を用いる：丸括弧（）中の数字はアミノ酸を指し、角括弧［］中の制限部位は構築の間に破壊された部位の跡を示す。以下の省略を用いる：鶏痘ウイルス(ＦＰＶ)、ニワトリ骨髄単球成長因子 (ｃＭＧＦ)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)(E.coli)、痘合成後期プロモーター２初期プロモーター２(ＬＰ２ＥＰ２)、痘合成後期プロモーター１(ＬＰ１)、塩基対(ＢＰ)、ポリメラーゼ鎖反応(ＰＣＲ)。〔発明の詳細な説明〕本発明は、鶏痘ウイルスゲノムＤＮＡに挿入された外来性ＤＮＡ配列よりなり、ここに、該外来性ＤＮＡ配列が鶏痘ウイルスゲノムＤＮＡの２.８ｋＢＥｃｏＲＩ断片内に挿入され、鶏痘ウイルス感染宿主細胞で発現され得る組換え鶏痘ウイルスを提供する。１つの具体例において、外来性ＤＮＡ配列は、鶏痘ウイルスゲノムＤＮＡのほぼ２.８ｋＢＥｃｏＲＩ断片内のＳｎａＢＩ制限エンドヌクレアーゼ部位内に挿入される。本発明は、鶏痘ウイルスゲノムＤＮＡに挿入された外来性ＤＮＡ配列よりなり、ここに、該外来性ＤＮＡ配列が鶏痘ウイルスゲノムＤＮＡの３.５ｋＢＥｃｏＲＩ断片内に挿入され、鶏痘ウイルス感染宿主細胞で発現され得る組換え鶏痘ウイルスを提供する。組換え鶏痘ウイルスの１つの具体例において、外来性ＤＮＡ配列は、鶏痘ウイルスゲノムＤＮＡのほぼ３.５ｋＢＥｃｏＲＩ断片内のＨｐａＩ制限エンドヌクレアーゼ部位内に挿入される。本発明は、鶏痘ウイルスゲノムＤＮＡに挿入された外来性ＤＮＡ配列よりなり、ここに、該外来性ＤＮＡ配列が鶏痘ウイルスゲノムＤＮＡの４.２ｋＢＥｃｏＲＩ断片内に挿入され、鶏痘ウイルス感染宿主細胞で発現され得る組換え鶏痘ウイルスを提供する。組換え鶏痘ウイルスの１つの具体例において、外来性ＤＮＡ配列は、鶏痘ウイルスゲノムＤＮＡのほぼ４.２ｋＢＥｃｏＲＩ断片内のＭｌｕＩ制限エンドヌクレアーゼ部位内に挿入される。本発明は、鶏痘ウイルスゲノムＤＮＡに挿入された外来性ＤＮＡ配列よりなり、ここに、該外来性ＤＮＡ配列が鶏痘ウイルスゲノムＤＮＡの非必須領域内に挿入され、鶏痘ウイルス感染宿主細胞で発現され得る組換え鶏痘ウイルスを提供する。１つの具体例において、本発明は、外来性ＤＮＡ配列が、鶏痘ウイルスゲノムＤＮＡの非必須領域内のオープンリーディングフレームに挿入された組換え鶏痘ウイルスを提供する。本発明目的では、「複製できる組換え鶏痘ウイルス」は、当業者によく知られた組換え方法、例えば、材料および方法中の組換えＦＰＶを生成させるための相同組換え手法に記載された方法によって生成し、欠失した組換え鶏痘ウイルスの複製に必須の遺伝子を有していなかった生きた鶏痘ウイルスである。本発明は、さらに、ポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡ配列または外来性ＲＮＡを提供する。好ましくは、ポリペプチドは動物において抗原性である。好ましくは、この抗原性ポリペプチドは、動物を刺激して抗体を生産させる、ペプチド結合によって連結された１０個を超えるアミノ酸の線状ポリマーである。本発明は、さらに、検出可能なマーカーであるポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡを含有する複製可能な組換え鶏痘ウイルスを提供する。好ましくは、検出可能マーカーはポリペプチドイーヘ・コリβ−ガラクトシダーゼまたはイー・コリベータ−グルクロニダーゼである。組換え鶏痘ウイルスの１つの具体例において、外来性ＤＮＡ配列はサイトカインをコードする。もう１つの具体例において、サイトカインはラワトリ骨髄単球成長因子（ｃＭＧＦ）またはラワトリ・インターフェロン（ｃＩＦＮ）である。サイトカインは、限定されるものではないが、トランスフォーミング成長因子ベータ、表皮細胞成長因子ファミリー、繊維芽細胞成長因子、肝細胞成長因子、インスリン−様成長因子、血管内皮細胞成長因子、インターロイキン１、ＩＬ−受容体アンタゴニスト、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、ＩＬ−６可溶性受容体、インターロイキン−７、インターロイキン-８、インターロイキン−９、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、インターロイキン−１２、インターロイキン−１３、アンジオゲニン、ケモカイン、コロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポエチン、インターフェロン、インターフェロンガンマ、ｃ−キットリガンド、白血病阻害性因子、オンコスタチンＭ、プレイオトロフィン、分泌性白血球プロテアーゼ阻害剤、幹細胞因子、腫瘍壊死因子、および可溶性ＴＮＦ受容体を含む。これらのサイトカインはヒト、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ブタまたは鳥類からのものである。本発明は、さらにニューカッスル病ウイルス血球凝集素（ＮＤＶＨＮ）、またはニューカッスル病ウイルス融合（ＮＤＶＦ）を含む組換え鶏痘ウイルスを提供する。ヒト・ヘルペスウイルスに由来するヒト病原体の抗原性ポリペプチドは、限定されるものではないが、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス表面およびコア抗原、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、単純疱疹ウイルス−１、ヒト単純疱疹ウイルス−２、ヒト・サイトメガロウイルス、エプスタイン−バールウイルス、帯状水泡ウイルス、ヒト・ヘルペスウイルス−６、ヒト・ヘルペスウイルス−７、ヒト・インフルエンザ、麻疹ウイルス、ハンターンウイルス、肺炎ウイルス、ライノウイルス、ポリオウイルス、ヒト呼吸器系シンシチウムウイルス、レトロウイルス、ヒトＴ−細胞白血病ウイルス、狂犬病ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、マラリア(プラスモジウム・ファルシパルム(Plasmodium falciparum))、ボルデテラ．ペルトゥスシス(Bordetella pertus sis)、ジフテリア、リケッチア・プロワゼッキィー(Rickettsia prowazekii)、ボレリア・ベルフドルフェリ(Borrelia berdorferi)、破傷風トキソイド、悪性腫瘍抗原を含む。ウマ病原体の抗原性ポリペプチドはウマ・インフルエンザウイルスまたはウマ・ヘルペスウイルスに由来し得る。１つの好ましい具体例において、抗原性ポリペプチドはウマ・ノイラミニダーゼまたは血球凝集素である。かかる抗原性ポリペプチドの例はウマ・インフルエンザＡ型／アラスカ(Alaska)９１ノイラミニダーゼ、ウマ・インフルエンザＡ型／プラーグ(Prague)５６ノイラミニダーゼ、ウマ・インフルエンザＡ型／マイアミ(Maiami)６３ノイラミニダーゼ、ウマ・インフルエンザＡ型／ケンタッキー(Kentucky)８１ノイラミニダーゼ、ウマ・インフルエンザＡ型／ケンタッキー(Kentucky)９２ノイラミニダーゼ、ウマ・ヘルペスウイルス１型糖蛋白質Ｂ、ウマ・ヘルペスウイルス１型糖蛋白質Ｄ、ストレプトコッカス・エキィ(Streptococcus equi)、ウマ感染性貧血ウイルス、ウマ脳炎ウイルス、ウマ・ライノウイルスおよびウマ・ロタウイルスを含む。本発明は、さらに、限定されるものではないが：ブタ・コレラウイルスｇＥ１、ブタ・コレラウイルスｇＥ２、ブタ・インフルエンザウイルス血球凝集素、ノイラミニダーゼ、マトリックスおよび核蛋白質、偽狂犬病ウイルスｇＢ、ｇＣおよびｇＤ、ならびにＰＲＲＳウイルスＯＲＦ７を含む抗原性ポリペプチドを提供する。例えば、感染性ウシ鼻気管炎ウイルスｇＥ、ウシ呼吸器系シンシチウムウイルスに由来する抗原性ポリペプチドはウシ呼吸器系シンシチウムウイルス付着蛋白質(ＢＲＳＶＧ)、ウシ呼吸器系シンシチウムウイルスヌクレオキャプシド蛋白質 (ＢＲＳＶＮ)、ウシ・パラインフルエンザウイルス３型融合蛋白質、およびウシ・パラインフルエンザウイルス３型血球凝集素ノイラミニダーゼである。本発明は、外来性ＤＮＡ配列が：ネコ免疫不全ウイルスｇａｇ、ネコ免疫不全ウイルスｅｎｖ、感染性喉頭気管炎ウイルス糖蛋白質Ｂ、感染性喉頭気管炎ウイルスｇＩ、感染性喉頭気管炎ウイルスｇＤ、感染性ウシ鼻気管炎ウイルス糖蛋白質Ｇ、感染性ウシ鼻気管炎ウイルス糖蛋白質Ｅ、偽狂犬病ウイルス糖蛋白質５０、偽狂犬病ウイルスＩＩ糖蛋白質Ｂ、偽狂犬病ウイルスＩＩＩ糖蛋白質Ｃ、偽狂犬病ウイルス糖蛋白質Ｅ、偽狂犬病ウイルス糖蛋白質Ｈ、マレク病ウイルス糖蛋白質Ａ、マレク病ウイルス糖蛋白質Ｂ、マレク病ウイルス糖蛋白質Ｄ、ニューカッスル病ウイルス血球凝集素またはノイラミニダーゼ、ニューカッスル病ウイルス融合、感染性嚢病ウイルスＶＰ２、感染性嚢病ウイルスＶＰ４、感染性嚢病ウイルスポリプロテイン、感染性気管支炎ウイルススパイク、感染性気管支炎ウイルスマトリックス、およびニワトリ貧血ウイルスよりなる群に由来するまたは由来し得る抗原性ポリペプチドをコードする組換え鶏痘ウイルスを提供する。本発明は、外来性ＤＮＡ配列がプロモーターの制御下にある組換え鶏痘ウイルスを提供する。１の具体例において、外来性ＤＮＡ配列は内因性上流ポックスウイルスプロモーターの制御下にある。もう１つの具体例において、外来性ＤＮＡ配列は異種上流プロモーターの制御下にある。もう１つの具体例において、プロモーターは：合成痘ウイルスプロモーター、痘合成後期プロモーター１、痘合成後期プロモーター２初期プロモーター２、痘Ｏ１Ｌプロモーター、痘１４Ｌプロモーター、痘１３Ｌプロモーター、痘１２Ｌプロモーター、痘１１Ｌプロモーター、痘Ｅ１０Ｒプロモーター、ＨＣＭＶ即時型初期、ＢＨＶ−１.１ＶＰＢ、マレク病ウイルス糖蛋白質Ａ、マレク病ウイルス糖蛋白質Ｂ、マレク病ウイルス糖蛋白質Ｄ、喉頭気管炎ウイルス糖蛋白質Ｉ、感染性喉頭気管炎ウイルス糖蛋白質Ｂ、および感染性喉頭気管炎ウイルスｇＤよりなる群から選択される。また、本発明は、Ｓ−ＦＰＶ−０９７と命名される組換え鶏痘ウイルスを提供する。Ｓ−ＦＰＶ−０９７は特許手続目的の微生物の国際的寄託に関するブダペスト条約に従い、１９９４年２月２５日に、米国メリーランド州２０８５２、ロックビル、パークローン・ドライブ１２３０１のアメリカン・タイプ・カルシャー・コレクションの特許培養寄託所に、ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ２４４６の下に寄託した。また、本発明は、免疫化有効量のＳ−ＦＰＶ−０９７と命名される組換えウイルスおよび適当な担体よりなるワクチンを提供する。該ワクチンは、生ウイルスが現在好ましいものの、不活化または生鶏痘ウイルスＳ−ＦＰＶ−０９７を含有できる。また、本発明は、鶏痘ウイルス、ニューカッスル病ウイルスおよび感染性喉頭気管炎ウイルスによって引き起こされる病気に対して動物、特に家禽を免疫化する方法を提供する。この方法は、免疫化有効量の本発明のワクチンを動物に投与することよりなる。該ワクチンは、当業者によく知られた方法のいずれかによって、例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内または皮内注射によって投与することができる。別法として、該ワクチンは鼻孔内、経口または眼内投与することもできる。また、本発明は、Ｓ−ＦＰＶ−０９５と命名された組換え鶏痘ウイルスを提供する。また、本発明は、免疫化有効量のＳ−ＦＰＶ−０９５と命名される組換えウイルスおよび適当な担体よりなるワクチンを提供する。該ワクチンは、生ウイルスが現在好ましいものの、不活化または生鶏痘ウイルスＳ−ＦＰＶ−０９５を含有できる。また、本発明は、鶏痘ウイルス、ニューカッスル病ウイルスおよび感染性喉頭気管炎ウイルスによって引き起こされる病気に対して動物、特に家禽を免疫化する方法を提供する。この方法は、免疫化有効量の本発明のワクチンを動物に投与することよりなる。該ワクチンは、当業者によく知られた方法のいずれかによって、例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内または皮内注射によって投与することができる。別法として、該ワクチンは鼻孔内、経口または眼内投与することもできる。また、本発明は、Ｓ−ＦＰＶ−０７４と命名された組換え鶏痘ウイルスを提供する。また、本発明は、免疫化有効量のＳ−ＦＰＶ−０７４と命名される組換えウイルスおよび適当な担体よりなるワクチンを提供する。該ワクチンは、生ウイルスが現在好ましいものの、不活化または生鶏痘ウイルスＳ−ＦＰＶ−０７４を含有できる。また、本発明は、鶏痘ウイルスおよびニューカッスル病ウイルスによって引き起こされる病気に対して動物、特に家禽を免疫化する方法を提供する。この方法は、免疫化有効量の本発明のワクチンを動物に投与することよりなる。該ワクチンは、当業者によく知られた方法のいずれかによって、例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内または皮内注射によって投与することができる。別法として、該ワクチンは鼻孔内、経口または眼内投与することもできる。また、本発明は、Ｓ−ＦＰＶ−０８１と命名された組換え鶏痘ウイルスを提供する。また、本発明は、免疫化有効量のＳ−ＦＰＶ−０８１と命名される組換えウイルスおよび適当な担体よりなるワクチンを提供する。該ワクチンは、生ウイルスが現在好ましいものの、不活化または生鶏痘ウイルスＳ−ＦＰＶ−０８１を含有できる。また、本発明は、鶏痘ウイルスおよびマレク病ウイルスによって引き起こされる病気に対して動物、特に家禽を免疫化する方法を提供する。この方法は、免疫化有効量の本発明のワクチンを動物に投与することよりなる。該ワクチンは、当業者によく知られた方法のいずれかによって、例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内または皮内注射によって投与することができる。別法として、該ワクチンは鼻孔内、経口または眼内投与することもできる。また、本発明は、Ｓ−ＦＰＶ−０８５と命名された組換え鶏痘ウイルスを提供する。また、本発明は、免疫化有効量のＳ−ＦＰＶ−０８５と命名される組換えウイルスおよび適当な担体よりなるワクチンを提供する。該ワクチンは、生ウイルスが現在好ましいものの、不活化または生鶏痘ウイルスＳ−ＦＰＶ−０８５を含有できる。また、本発明は、鶏痘ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、感染性喉頭気管炎ウイルスおよびマレク病ウイルスによって引き起こされる病気に対して動物、特に家禽を免疫化する方法を提供する。この方法は、免疫化有効量の本発明のワクチンを動物に投与することよりなる。該ワクチンは、当業者によく知られた方法のいずれかによって、例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内または皮内注射によって投与することができる。別法として、該ワクチンは鼻孔内、経口または眼内投与することもできる。また、本発明は、Ｓ−ＦＰＶ−０８２、Ｓ−ＦＰＶ−０８３、Ｓ−ＦＰＶ−０９９、Ｓ−ＦＰＶ−１００、およびＳ−ＦＰＶ−１０１と命名する組換え鶏痘ウイルスを提供する。本発明の組換え鶏痘ウイルスワクチンで使用する適当な担体は当該分野でよく知られたものであり、蛋白質、糖等を含む。かかる適当な担体の１つの例は、安定化された加水分解蛋白質、ラクトース等のごとき１種以上の安定化剤を含有する生理学的にバランスのとれた培養基である。本発明の組換えウイルスの「免疫化有効量」は１０²−１０⁹ＰＦＵ／用量の範囲内の量である。好ましくは、免疫化有効量は生ウイルスワクチンについては約１０³−１０⁵ＰＦＵ／用量である。好ましくは、生ワクチンは組織培養流体を採取し、安定化された加水分解蛋白質のごとき安定化剤を添加することによって生成される。〔材料および方法〕鶏痘ウイルスストック試料の調製鶏痘ウイルス試料は、ＨＡＭのＦ１０培地および２ｍＭグルタミンおよび抗体を含有する培地１９９（Ｆ１０／１９９）の１：１混合物（ＣＥＦ陰性培地という）中、０.０１ＰＦＵ／細胞の感染の多重度にて、ニワトル胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）細胞を感染させることによって調製した。感染に先立って、細胞単層をＣＥＦ陰性培地で１回洗浄して、胎児ウシ血清を除去した。最初の接種物に含有されたＦＰＶ（１０ｃｍプレートにつき０.５ｍｌ；Ｔ１７５ｃｍフラスコにつき１０ｍｌ）を２時間細胞単層に吸収させ、半時間毎に再分配させた。この期間の後、完全なＣＥＦ培地（ＣＥＦ陰性培地＋２％胎児ウシ血清）の添加によって元の接種物を適当な最終容量とした。プレートを５％ＣＯ₂中、３７℃にて、細胞障害効果が完了するまでインキュベートした。培地および細胞を収穫し、−７０ ℃で再度凍結し、解凍し、１.０ｍｌバイアルに分配し、−７０℃で凍結させた。ウイルス力価は、典型的には、１０⁸および１０⁷ＰＦＵ／ｍｌの範囲である。ＦＰＶＤＮＡの調製鶏痘ウイルスＤＮＡ単離のために、Ｔ１７５ｃｍ²フラスコ中のＣＥＦ細胞の密集単層を０.１の多重度で感染させ、細胞が１００％細胞障害効果を示すまで４−６日間インキュベートした。培地に掻き取り、臨床遠心管中で３０００ｒｐｍにて５分間遠心することによって感染細胞を収穫した。培地をデカントし、細胞ペレットを穏やかに１.０ｍｌＰＢＳ（Ｔ１７５当たり）に再懸濁し、２回の連続的凍結−解凍（−７０℃ないし３７℃）に付した。最後の解凍の後、（氷上の）細胞を、２回３０秒間音波処理し、間に４５秒間冷却した。４℃にてＨＢ４ローター中、３０００ｒｐｍにて５分間遠心(Sorvall RC-5B Superspeed Cent rifuge)することによって細胞夾雑物を除去した。上清に存在するＦＰＶビリオンを、ＳＳ３４ローター（Sorvall）中、４℃、１５,０００ｒｐｍにて２０分間遠心することによってペレット化し、１０ｍＭトリス（ｐＨ７.５）に再懸濁した。次いで、この画分を３６％スクロースグラジエント（１０ｍＭトリス、ｐＨ７.５にてｗ／ｖ）を重ね、ＳＷ４１ローター中、４℃、１８,０００ｒｐｍにて６０分間遠心した(Backman L8-70M Ultracentrifuge)。ビリオンペレットを１０ｍＭトリス、ｐＨ７.５の１.０ｍｌに再懸濁し、氷上で３０秒間音波処理した。この画分を２０％ないし５０％の連続的スクロースグラジエントに重ね、ＳＷ４１ローター中、４℃、１６,０００ｒｐｍにて６０分間遠心した。グラジエントを約３／４だけ下って位置するＦＰＶビリオンバンドを収穫し、２０％スクロースで希釈し、ＳＷ４１ローター中、４℃、１８.０００ｒｐｍでの６０分間の遠心によってペレット化した。次いで、得られたペレットを１０ｍＭトリスｐＨ７.５で１回洗浄して、痕跡量のスクロースを除去し、最後に１０ｍＭトリスｐＨ７.５に再懸濁した。次いで、溶解(６０℃で４時間)、続いて各々２０ｍＭ、０.５％および０.５ｍｆ／ｍｌの最終濃度までのＥＤＴＡ、ＳＤＳ、およびプロテイナーゼＫの添加によって、ＦＰＶＤＮＡを精製ビリオンから抽出した。消化の後、３回のフェノール −クロロホルム（１：１）抽出を行い、２容量の無水エタノールの添加によって試料を沈殿させ、−２０℃で３０分間インキュベートした。次いで、試料をエッペンドルフミニ遠心管中にて全速にて５分間遠心した。上清をデカントし、ペレットを風乾し、４℃で０.０１ＭトリスｐＨ７.５、１ｍＭＥＤＴＡに再水和させた。分子生物学技術制限エンドフクレアーゼ、ゲル電気泳動、ゲルからのＤＮＡの抽出、連結、キナーゼでのリン酸化、ホスファターゼでの処理、細菌培養の増殖、ＤＮＡでの細菌の形質転換、および他の分子生物学的方法のごとき手法を含めた細菌およびＤＮＡの操作の技術は、Maniatisら(1982)およびSambrook(1989)によって記載されている。特記しない限り、これらはわずかに変形して使用した。ＤＮＡ配列決定ＢＲＬ Sequenase キットおよび³⁵Ｓ−ｄＡＴＰ（ＮＥＮ）を用いて、配列決定を行った。ｄＧＴＰミックスおよびｄＩＴＰミックス双方を用いる反応を行って、圧縮の領域を明らかとした。別法として、圧縮領域をホルムアミドゲルで分解した。鋳型は二本鎖プラスミドサブクローンまたは一本鎖Ｍ１３サブクローンであり、プライマーはベクターが配列決定すべきインサートの丁度外側となるように、あるいは予め配列を得るようにした。得られた配列を組み立て、Dnastar ソフトウェアを用いて比較した。操作および得られた配列の比較はCoral ソフトウェアからのSuperclone and Superseプログラムで行った。合成ポックスウイルスプロモーターの構築のための戦略組換え鶏痘ベクターでは、合成痘プロモーターは、外来性遺伝子発現の強度およびタイミングを制御する能力を含めたいくつかの利点を供する。本発明者らは、ワクシニアウイルスで規定されたプロモーターに基づいて(Bertholetら，1986 ，DavidsonおよびMoss，1989a，およびDavidsonおよびMoss，1989b)、４種のプロモーターカセットＥＰ１(配列番号：８)、ＬＰ１(配列番号：９)、ＥＰ２(配列番号：１０)、およびＬｐ２（配列番号：１１）を設計することを選択した。いずれかの順序または組合せにてカセットを組み合わせるのに使用できる制限部位が直ぐに隣接するワクシニアで規定されたＤＮＡを含有するように各カセットを設計した。また、イニシエーターメチオニンは、インフレーム融合をＥｃｏＲＩまたはＢａｍＨＩ部位でなすことができるように各カセットに設計した。また、全ての３つのリーディングフレームおよび初期転写終止シグナル(Earlら，199 0)における翻訳停止コドンの組をインフレーム融合部位の下流に設計した。各カセットをコードするＤＮＡを標準的な技術に従って合成し、適当な相同ベクターにクローン化した。ｃＤＮＡクローニング手法ｃＤＮＡクローニングとは、技術水準に従って、ＲＮＡ分子をＤＮＡ分子に変換するのに使用する方法をいう。出願人らの方法は(GublerおよびHoffman，1983 )に記載されている。Bethesda Research Laboratories(Gaithesburg,1983)は、出願人らが使用した手法に非常に似たｃＤＮＡクローニングキットを設計し、これは、出願人らの結果を再現するのに使用できる試薬およびブロトコルの組を含有する。ウイルスｍＲＮＡ種をクローニングするには、ウイルスによる感染に感受性の宿主細胞系を細胞当たり５−１０のプラーク形成単位で感染させた。細胞障害効果が明らかな場合、全破壊の前を除き、培地を取り出し、細胞を１０ｍｌの溶解緩衝液（４Ｍチオシアン酸グアニジン、０.１％消泡剤Ａ、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７.０、０.５％Ｎ−ラウロイルサルコシン、０.１Ｍベータメルカプトエタノール）中で溶解させた。細胞溶解物を滅菌Dounceホモゲナイザーに注ぎ、溶液が均一となるまで８−１０回氷上でホモゲナイズした。ＲＮＡ精製では、８ｍｌの細胞溶解物を穏やかにBeckman SW41遠心管中の３.５ｍｌのＣｓＣｌ溶液（５.７ＭＣｓＣｌ、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７.０）に重ねた。試料をBeckman SW41ローター中、２０℃、３６０００ｒｐｍにて１８時間遠心した。試験管を氷上に載せ、試験管からの上清を吸引によって注意深く除去して、乱されていないＲＮＡペレットを得た。ペレットを４００μｌガラス蒸留水に再懸濁させ、２.６ｍｌのグアニジン溶液（７.５Ｍグアニジン−ＨＣｌ、２５ｍＮ４クエン酸ナトリウム、ｐＨ７.０、５ｍＭジチオスレイトール）を添加した。次いで、０.３７容量の１Ｍ酢酸を添加し、続いて０.７５容量の冷エタノールを添加し、試料を−２０℃に１８時間置いてＲＮＡを沈殿させた。ＳＳ３４ローターにて、４℃、１００００ｒｐｍにて１０分間、Sorvall遠心管中の遠心によって沈殿を収集した。ペレットを１.０ｍｌ蒸留水に溶解させ、１３０００ｒｐｍで再遠心し、上清を貯蔵した。ＲＮＡを０.５ｍｌ蒸留水で該ペレットからさらに２回前記したごくとに再抽出し、上清をプールした。０.１容量の２Ｍ酢酸ナトリウム溶液、続いて２容量の冷エタノールを試料に添加し、試料を−２０℃に１８時間置いた。沈殿したＲＮＡをＳＳ３４ローター中、４℃、１０００ｒｐｍで１０分間の遠心によって収集した。ペレットを１ｍｌの蒸留水に溶解させ、Ａ２６０／２８０における吸光度により濃度を測定した。ＲＮＡを−７０℃で保存した。ポリアデニル化テール（ポリ−Ａ）を含有するｍＲＮＡをオリゴ−ｄＴセルロース(Pharmacia #27 5543-0)を用いて選択した。３ｍｇの全ＲＮＡを沸騰し、冷却し、結合緩衝液（０.１ＭトリスｐＨ７.５、０.５ＮＬｉＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡｐＨ８.０、０.１％ドデシル硫酸リチウム）にての、１００ｍｇオリゴ -ｄＴセルロースカラムに適用した。保持されたポリ−Ａ₊ＲＮＡを溶出カラム（５ｍＭトリスｐＨ７.５、１ｍＭＥＤＴＡｐＨ８.０、０.１％ドデシル硫酸ナトリウム）でカラムから溶出させた。このｍＲＮＡを結合緩衝液にてのオリゴ -ｄＴカラムに再度適用し、溶出緩衝液で再度溶出させた。試料を２００ｍＭ酢酸ナトリウムおよび２容量の冷エタノールで−２０℃で１８時間沈殿させた。ＲＮＡを５０μｌ蒸留水に再懸濁させた。１０μｇのポリ−Ａ＋ＲＮＡを２２℃にて６分間、２０ｍＭ水酸化メチル水銀中で変性させた。β−メルカプトエタノールを７５ｍＭに添加し、試料を２２℃ で５分間インキュベートした。０.２５ｍｌ中の第１ストランドｃＤＮＡ合成のための反応溶液は１μｇオリゴ−ｄＴプライマー(Ｐ−Ｌ Bio-chemicals)または１μｇ合成プライマー、２８ユニット胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤(Bethesda Research Labs #5518SA)、１００ｍＭトリスｐＨ８.３、１４０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ・、０.８ｍＭｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ(Pharmacia)、１００マイクロキュリー３２Ｐ−標識ｄＣＴＰ(New England Nuclear #NEG-013H)、および１８０ユニットＡＭＶ逆転写酵素 (Molecular Genetics Resources #MG 101)を含有した。反応を４２℃で９０分間インキュベートし、次いで、２０ｍＭＥＤＴＡｐＨ８.０で停止させた。試料を等容量のフェノール／クロロホルム（１：１）で抽出し、２Ｍ酢酸アンモニウムおよび２容量の冷エタノールで−２０℃にて３時間沈殿させた。沈殿および遠心の後、ペレットを１００μｌ蒸留水に溶解させた。試料を、緩衝液（１００ｍＭトリスｐＨ７.５、１ｍＭＥＤＴＡｐＨ８.０、１００ｍＭＮａＣｌ）にて、１５ｍｌのＧ−１００ Sephadex カラム(Pharmacia)に負荷した。溶出したＤＮＡ画分の先導端をプールし、容量が約１００μになるまで凍結乾燥によってＤＮＡを濃縮し、次いで、ＤＮＡを酢酸アンモニウム＋エタノールで前記のごとくに沈殿させた。全部の第１ストランド試料を第２ストランド反応で用い、これは、５０μｌの全容量中の５０μｇ／ｍｌｄＮＴＰ、５.４ユニットＤＮＡポリメラーゼＩ(Bo erhinger Mannheim #642-711)、および１００ユニット／ｍｌイー・コリＤＮＡリカゼーゼ(New England Biolabs #205)を用いた以外は、GuberおよびHoffman(1 983)方法に従った。第２ストランドの合成の後、ｃＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出し、沈殿させた。ＤＮＡを１０μｌの蒸留水に再懸濁させ、２２℃で１μｇのＲＮａｓｅＡで１０分間処理し、４０ｍＭトリス−酢酸緩衝液ｐＨ６. ８５にて１％アガロースゲル（Sigma Type IIアガロース）を通す電気泳動に付した。ゲルを臭化エチジウムで染色し、予期されたサイズ範囲のＤＮＡをゲルから切り出し、８ｍＭトリス−酢酸ｐＨ６.８５で電気溶出させた。電気溶出したＤＮＡを約１００μｌまで凍結乾燥し、酢酸アンモニウムおよびエタノールで前記したごとくに沈殿させた。ＤＮＡを２０μｌの水に再懸濁させた。オリゴ−ｄＣテールをＤＮＡに負荷してクローニングを容易とした。反応は、５０μｌ中のＤＮＡ、１００ｍＭカコジル酸カリウムｐＨ７.２、０.２ｍＭジチオスレイトール、２ｍＭＣａＣｌ₂、８０μモルｄＣＴＰ、および２５ユニットターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(Molecular Genetic R esources #S1001)を含有した。３７℃での３０分後、反応を１０ｍＭＥＤＴＡで終止させ、試料をフェノール／クロロホルム抽出し、前記したごとくに沈殿させた。２００μｌの０.０１ＭトリスｐＨ７.５、０.１ＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡｐＨ８.０中のオリゴ−ｄＧテール(Bethesda Research Labs #5355 SA/SB) を含有する２００ｎｇプラスミドベクターｐＢＲ３２２に、ｄＣ−テールを付したＤＮＡ試料を６５℃で２分間、次いで５７℃で２時間アニールした。新鮮な受容能のあるイー・コリＤＨ −１細胞を調製し、２０の２００μｌアリコットの細胞にてのアニールしたｃＤＮＡ試料の半分を用い、Hanahan(1983)によって記載されているごとくに形質転換した。形質転換した細胞をＬ−ブロス寒天プレート＋１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン上で平板培養した。Ａｍｐｓｃｒｅｅｎ＼(Bethesda Research Labs #5537 UA)を用い、アンピシリン遺伝子へのインサートの存在につき、コロニーをスクリーニングし、陽性コロニーを分析のために拾った。組換えＲＰＶを創製するための相同組換え手法この方法はＦＰＶＤＮＡおよびプラスミド相同ベクターＤＮＡの間の相同組換えに頼るものであり、これは、ＦＰＶＤＮＡおよびトランスフェクトしたプラスミド相同ベクターを共に含有する組織培養細胞中で起こる。相同組換えを起こらせるためには、ＣＥＦ細胞の単層を０.０１ＰＦＵ／細胞の感染多重度にて、Ｓ−ＰＦＶ−００１（Agri-Bio Corporation，Gainsville，GeorgiaからＢｌｏ−Ｐｏｘ^TMとして入手できる温和な鶏痘ワクチン株）で感染させて、複製ＦＰＶ（すなわち、ＤＮＡ合成）を細胞に導入する。次いで、「感染−トランスフェクション手法」に従って、プラスミド相同ベクターＤＮＡをこれらの細胞にトランスフェクトする。感染−トランスフェクション手法６ｃｍプレート中のＣＥＦ細胞（約８０％密集）を、ＣＥＦ陰性培地中の０. ０１ＰＦＶ／細胞の感染多重度にて、Ｓ−ＰＦＶ−００１で感染させ、湿潤５％ＣＯ₂インキュベーター中、３７℃で５時間インキュベートした。使用するトランスフェクション手法は実質的にはLipofection ^TMReagent(BRL)で推奨されるものである。略言すると、各６ｃｍプレートにつき、１５マクイログラムのプラスミドＤＮＡを水で１００マクイロリットルまで希釈した。別途、５０マクイログラムのLipofection ^TMReagentを水で１００マイクロリットルまで希釈した。１００マイクロリットルの希釈Lipofection^TMReagentを、ポリスチレン製の５ｍｌのスナップキャップ試験管に含有された希釈プラスミドＤＮＡに滴下し、温和に混合した。次いで、混合物を室温で１５−２０分間インキュベートした。この間に、ウイルス接種物６ｃｍプレートから取り出し、細胞単層をＣＥＦ陰性培地で１回洗浄した。３ｍｌのＣＥＦ陰性培地をプラスミドＤＮＡ／リポフェクション混合物に添加し、内容物を細胞単層上にピペットで載せた。湿潤５％ＣＯ₂インキュベーター中の３７℃での一晩のインキュベーション（約１６時間）の後、培地を取り出し、５ｍｌのＣＥＦ完全培地で置き換えた。ウイルスからの細胞障害効果が８０−１００％となるまで、細胞を５％ＣＯ₂中、３７℃で３−７日間インキュベートした。ウイルスをウイルスストックの調製ために前記したごとくに収穫した。このストックをトランスフェクションストックといい、引き続いて、「組換えＦＰＶを精製するためのプラークハイブリダイゼーション手法」によって組換えウイルスにつきスクリーニングした。組換えＦＰＶを精製するためのプラークハイブリダイゼーション手法ＣＥＦ細胞単層を感染／トランスフェクションウイルスストックの種々の希釈物で感染させ、栄養アガロース培地（等容量の１.２％−１.４％アガロースおよび２×Ｍ１９９）を重ね、６−７日間インキュベートしてプラークの発育を起こさせた。アガロース重層およびプレートを同一の３つの非対称ドット（Indiaインク）で印をして、ニトロセルロース（ＮＣ）膜（細胞単層）およびアガロース単層を位置付ける助けとした。アガロース重層を１０ｃｍ皿の蓋に移し、４℃で保存した。予め湿潤化した（ＰＢＳ）ＮＣ膜をＣＥＦ単層に重ね、圧力をかけて単層をＮＣ膜に移した。次いで、ＮＣ膜上に含有された細胞を、該膜を１.５ｍｌの１.５ＭＮａＣｌおよび０.５ＭＮａＯＨ中に５分間入れることによって溶解させた。膜を１.５ｍｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５.２）に５分間入れた。溶解させた細胞からのＤＮＡを、８０℃で１時間加熱することによってＮＣ膜に結合させた。この期間の後、膜を、６×ＳＳＣ、３％脱脂乳、０.５％ＳＤＳ、サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）を含有する溶液とプレハイブリダイズさせ、６５℃で１時間インキュベートした。放射性標識プローブＤＮＡ（アルファ・・Ｐ−ｄＣＴＰ）を添加し、６５℃で一晩インキュベートした(１２時間)。ハイブリダイゼーション後、ＮＣ膜を２×ＳＳＣで２回（各々３０分）６５℃で洗浄し、続いて０.５×ＳＳＣで６５℃にてさらに２回洗浄した。ＮＣ膜を乾燥し、Ｘ−線フィルム(Kodak X-OMAT，AR)に−７０℃で１２時間暴露した。パスツールピペットを用い、オートラジオグラムで観察された陽性シグナルに対応するプラークをアガロース重層から拾い、１ｍｌのＣＥＦ培地に再懸濁し、−７０℃で保存した。典型的には、５−６ラウンドのプラーク精製が組換えウイルスの純度を確認するのに要した。黒色プラークアッセイを用いる組換えＦＰＶにおける外来性遺伝子発現のためのスクリーニング組換え鶏痘ウイルスによって発現された外来性抗原の発現を分析するために、ＣＥＦ細胞の単層を組換えＦＰＶで感染させ、栄養アガロース培地を重ね、３７ ℃にて６−７日間インキュベートしてプラークを発生させた。アガロース重層を皿から取り出し、細胞を室温にて１００％メタノールで１０分間固定し、風乾した。一次抗体をＰＢＳで適当な濃度まで希釈し、室温で２時間細胞単層上でインキュベートした。室温にてＰＢＳで３回洗浄することによって未結合抗体を除去した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体をＰＢＳで希釈し、室温にて細胞単層上で２時間インキュベートした。次いで、室温にて細胞をＰＢＳで３回洗浄することによって、未結合二次抗体を除去した。新たに調製した基質溶液（１００μｇ／ｍｌＰＢＳ中４−クロロ−１−ナフトール、０.００３％Ｈ₂Ｏ₂）と共に細胞を室温で１５−３０分間インキュベートした。正しい抗原を発現するプラークは黒色に染色される。酵素マーカー遺伝子を発現する組換えＦＰＶのためのスクリーニングイー・コリβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）またはβ−グルクロニダーゼ（ｕｉｄＡ）マーカー遺伝子が組換えウイルスに取り込まれると、組換体を含有するプラークを単純なアッセイによって可視化した。プラークアッセイの間に、酵素基質はアガロース重層に取り込まれた(３００μｇ／ｍｌ)。ｌａｃＺマーカー遺伝子については、青色プラーク用の基質Bluogal^TM(ハロゲン化インドリル−β −Ｄ−ガラクトシダーゼ、Bethesda Research Labs)を、または赤色プラーク用のＣＰＲＧ（クロロフェノールレッドガラクトピラノシド、Boehringer Mannhei m)を用いた。ｕｉｄＡマーカー遺伝子については、基質Ｘ−ＧｌｕｃｕｒｏＣｈｘ(５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸シクロヘクシルアンモニウム塩、Biosynth AG)を用いた。活性なマーカー酵素を発現するプラークは赤色または青色に変わった。次いで、プラークを新鮮な細胞上に拾い、さらなるプラーク単離によって精製した。コンカナバリンＡで刺激されたニワトリ脾臓細胞から単離されたＲＮＡニワトリ脾臓を３週齢ＳＰＡＦＡＳ孵化ニワトリから切開し、洗浄し、シリンジ／ニードルにより破壊して細胞を放出させた。支質および夾雑物を沈降させた後、細胞をペレット化し、ＰＢＳで２回洗浄した。細胞ペレットを低張溶解緩衝液で処理して、赤血球細胞を溶解させ、脾臓細胞を回収し、ＰＢＳで２回洗浄した。脾臓細胞を５％ＰＢＳおよび５μｇ／ｍｌコンカナバリンＡを含有するＲＰＭＩに５×１０⁶細胞／ｍｌで再懸濁させ、３９ｏで４８時間インキュベートした。イソチオシアン酸グアニジン溶解試薬およびPromega RNA単離キット(Promega Corporation，Madison，WI)からのプロトコルを用いて全ＲＮＡから細胞を単離した。適当なアンチセンスプライマーおよびＡＭＶ逆転写酵素(Promega Corporation，Madison，WI)を含有する各第１ストランド反応で、４μｇの全 technologies，Inc．Bethesda，MD)を用い、逆転写酵素反応により、ｃＤＮＡ合成を同一試験管中で行った。相同ベクター４５１−７９.９５ＮＤＶＨＮ遺伝子をＦＰＶに挿入する目的でプラスミド４５１−７９.９５を構築した。ｌａｃＺマーカー遺伝子、続いてＮＤＶＨＮ遺伝子をカセットとして、ユニークＳｆｉＩ部位にて相同ベクター４４３−８８.１４に挿入した。該カセットは、示した合成ＤＮＡ配列を持つ以下の源からの制限断片を連結することによって、標準的なＤＮＡ技術(Maniatisら，1982およびSambrook，1989)を利用して構築することができる。第１断片は合成後期プロモーターＬＰＩ（配列番号：９）である。第２断片はイー・コリｌａｃＺの暗号領域を含有し、プラスミドｐＪＦ７５１(Ferrariら，1985)に由来する。プロモーターおよびｌａｃＺ遺伝子は、合成プロモーターに由来する４アミノ酸、続いてのｌａｃＺ遺伝子のアミノ酸１０ないし１０２４よりなるハイブリッド蛋白質を発現するように融合させることに注意されたい。第３断片は合成後期プロモーターＬＰ１のもう１つのコピーである。第４断片はＮＤＶＨＮ遺伝子の暗号領域を含有し、全長ＨＮｃＤＮＡクローンに由来する。プロモーターおよびＨＮ遺伝子は、合成プロモーターに由来する４アミノ酸およびＨＮ遺伝子のアミノ酸２ないし５７７よりなるハイブリッド蛋白質を発現するように融合させることに注意されたい。両遺伝子は、親相同ベクター中のＯＲＦ１遺伝子に対して反対転写向きである。相同ベクター４８９−２１.１ＮＤＶＨＮ遺伝子をＦＰＶに挿入する目的でプラスミド４８９−２１.１を構築した。ＮＤＶＨＮ遺伝子をカセットとして、ユニークＳｆｉＩ部位にて相同ベクター４４３−８８.８に挿入した。該カセットは、示した合成ＤＮＡ配列を持つ以下の源からの制限断片を連結することによって、標準的な組換えＤＮＡ技術(Maniatisら，1982およびSambrook，1989)を利用して構築することができる。第１断片は合成初期／後期プロモーターＥＰ１ＬＰ２（配列番号：８／配列番号：１１）である。第２断片はＮＤＶＨＮ遺伝子の暗号領域を含有し、全長ＨＮｃＤＮＡクローンに由来した。プロモーターおよびＨＮ遺伝子は、合成プロモーターに由来する４アミノ酸、続いてのＨＮ遺伝子のアミノ酸２ないし５７７よりなるハイブリッド蛋白質を発現するように融合させることに注意されたい。ＨＮ遺伝子は、親相同ベクター中のＯＲＦ遺伝子に対して反対転写向きである。相同ベクター５０２−２６.２２ＮＤＶＨＮ遺伝子およびＦ遺伝子をＦＰＶに挿入する目的でプラスミド５０２−２６.２２を構築した。ＮＤＶＨＮおよびＦ遺伝子を、ＳｆｉＩ断片（配列番号：１２）としてユニークＳｆｉＩ部位にて相同ベクター４４３−８８.８に挿入した。ＮＤＶＨＮおよびF遺伝子は、親相同ベクターと同一の転写向きに挿入した。ＳｆｉＩの詳細な記載は図１Ａ−１Ｃに示す。挿入されたＳｆｉＩ断片は、図１Ａ−１Ｃに示した合成ＤＮＡ配列を持つ以下の源からの制限断片を連結することによって、標準的な組換えＤＮＡ技術(Maniatisら，1982およびSam brook，1989)を利用して構築することができる。断片１は全長ＮＤＶＨＮｃＤＮＡクローン（Ｂ１株）のほぼ１８１１塩基対ＡｖａＩＩないしＮａｅＩ制限断片である。断片２は全長ＮＤＶＦｃＤＮＡ（Ｂ１株）のほぼ１８１２塩基対ＢａｍＨＩないしＰｓｔＩ制限断片である。断片３はプラスミドｐＢｒ３２２のほぼ２３５塩基対ＰｓｔＩおよびＳｃａＩ制限断片である。相同ベクター５０２−２７.５ＮＤＶＦ遺伝子をＦＰＶに挿入する目的でプラスミド５０２−２７.５を構築した。ＬａｃＺマーカー遺伝子、続いてのＮＤＶＦ遺伝子をカセっトとしてユニークＳｆｉＩ部位にて相同ベクター４４３−８８.１４に挿入した。カセットは、示した合成ＤＮＡ配列を持つ以下の源からの制限断片を連結することによって、標準的な組換えＤＮＡ技術(Maniatisら，1982およびSambrook，1989)を利用して構築することができる。第１断片は合成後期プロモーターＬｐ１（配列番号：９）である。第２断片はイー・コリＬａｃＺの暗号領域を含有し、プラスミドｐＪＦ７５１(Ferrariら，1985)に由来する。プロモーターおよびＬａｃＺ遺伝子は、合成プロモーターに由来する４アミノ酸、続いてのＬａｃＺ遺伝子のアミノ酸１０ないし１０２４よりなるハイブリッド蛋白質を発現するように融合させることに注意されたい。第３断片は、合成初期／後期プロモーターＥＰ１ＬＰ２（配列番号：８／配列番号：１１）である。第４断片はＮＤＶＦ遺伝子の暗号領域を含有し、全長ＦｃＤＮＡクローンに由来する。プロモーターおよびＦ遺伝子は、合成プロモーターに由来する４アミノ酸、続いてのＦ遺伝子５’非翻訳領域、続いてのＦ遺伝子のアミノ酸１ないし５４４よりなるハイブリッド蛋白質を発現するように融合させることに注意されたい。両遺伝子は親相同ベクター中のＯＲＦに対して反対転写向きである。相同ベクター５８６−３６.６感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴ）ｇＢおよびｇＤ遺伝子をＦＰＶに挿入する目的でプラスミド５８６−３６.６を構築した。イー・コリβ−グルクロニダーゼｕｉｄＡマーカー遺伝子、それに先行するＩＬＴｇＢおよびｇＤ遺伝子をカセっトとしてユニークＳｆｉＩ部位にて相同ベクター４５１−０８.２２に挿入した。カセットは、示した合成ＤＮＡ配列を持つ以下の源からの制限断片を連結することによって、標準的な組換えＤＮＡ技術(Maniatisら，1982およびSambr ook，1989)を利用して構築することができる。第１断片は合成初期／後期プロモーターＥＰ１ＬＰ２（配列番号：８／配列番号：１１）である。第２断片はＩＬＴｇＢの暗号領域を含有し、ほぼ３０００塩基対ＩＬＴウイルスゲノムＥｃｏＲＩ断片に由来する。第２断片はＩＬＴｇＢの暗号領域を含有し、ほぼ３０００塩基対ＩＬＴウイルスゲノムＥｃｏＲＩ断片に由来する。プロモーターおよびｇＢ遺伝子は、ｇＢ遺伝子の完全な暗号領域（アミノ酸１−８８３）を発現するように融合されることに注意されたし。第３断片は合成初期／後期プロモーターＥＰ１ＬＰ２（配列番号：８／配列番号：１１）である。第４断片はＩＬＴｇＤ遺伝子（配列番号：１９）の暗号領域を含有し、ＩＬＴＫｏｎＩゲノム制限断片＃８（１０.６ＫＢ）のほぼ２０６０塩基対ＥｃｏＲＩないしＢｃｌＩ制限サブ断片に由来した。プロモーターおよびｇＤ遺伝子は、合成プロモーターに由来する３アミノ酸、続いてのｇＤ遺伝子のアミノ酸３ないし４３４よりなるハイブリッド蛋白質を発現するように融合させることに注意されたい。第５断片は、合成後期プロモーターＬＰＩ（配列番号：９）である。最後の断片はイー・コリｕｉｄＡの暗号領域を含有し、プラスミドｐＲＡＨ２６０(Clonetech)に由来する。プロモーターおよびｕｉｄＡ遺伝子は、合成プロモーターに由来する３アミノ酸、続いてのｕｉｄＡ遺伝子のアミノ酸１ないし６０２よりなるハイブリッド蛋白質を発現するように融合させることに注意されたい。全ての３つの遺伝子は親相同ベクター中のＯＲＦ１に対して反対転写向きである。相同ベクター６０８−１０.３マレク病ウイルス（ＭＤＶ）ｇＤおよびｇＢ遺伝子をＦＰＶに挿入する目的でプラスミド６０８−１０.３を構築した。ＬａｃＺマーカー遺伝子、それに先行するＭＤＶｇＤおよびｇＢ遺伝子をカセットとしてユニークＳｆｉＩ部位にて相同ベクター４４３−８８.１４に挿入した。カセットは、示した合成ＤＮＡ配列を持つ以下の源からの制限断片を連結することによって、標準的な組換えＤＮＡ技術(Maniatisら，1982およびSambrook，1989)を利用して構築することができる。第１断片は合成後期／初期プロモーターＬＰ２ＥＰ２（配列番号：１１／配列番号：１０）である。第２断片はＭＤＶｇＤの暗号領域を含有し、ＭＤＶＢｇＩＩＩ４.２ＫＢゲノム制限断片(Rossら，1991)のほぼ２１７７塩基対ＮｃｏＩないしＳａＩＩサブ断片に由来する。プロモーターおよびｇＤは、合成プロモーターに由来する３アミノ酸、続いてのｇＤ遺伝子のアミノ酸３ないし４０３よりなるハイブリッド蛋白質を発現するように融合することに注意されたい。第３断片は合成初期／後期プロモーターＥＰ１ＬＰ２（配列番号：８／配列番号：１１）である。第４断片はＭＤＶｇＢ遺伝子の暗号領域を含有し、ほぼ３８９８塩基対ＳａｌＩないしＥｃｏＲＩゲノムＭＤＶ断片(Rossら，1989)に由来した。プロモーターおよびｇＢ遺伝子は、合成プロモーターに由来する３アミノ酸、続いてのｇＢ遺伝子のアミノ酸３ないし８６５よりなるハイブリッド蛋白質を発現するように融合させることに注意されたい。第５断片は、合成後期プロモーターＬＰ１（配列番号：９）である。第６断片はイー・コリＬａｃＺの暗号領域を含有し、プラスミドｐＪＦ７５１(Ferrariら，1985)に由来する。プロモーターおよびＬａｃＺ遺伝子は、合成プロモーターに由来する４アミノ酸、続いてのＬａｃＺ遺伝子のアミノ酸１０ないし１０２４よりなるハイブリッド蛋白質を発現するように融合させることに注意されたい。全ての３つの遺伝子は親相同ベクター中のＯＲＦ１に対して反対の転写向きである。相同ベクター５３８−５１.２７感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）マサチューセッツスパイク蛋白質（ＭａｓｓＳｐｉｋｅ）およびマサチューセッツマトリックス蛋白質（ＭａｓｓＭａｔｒｉｘ）をＦＰＶに挿入する目的でプラスミド５３８−５１.２７を構築した。ＬａｃＺマーカー遺伝子ならびにＭａｓｓＳｐｉｋｅおよびＭａｓｓＭａｔｒｉｘ）についての遺伝子をカセットとしてユニークＳｆｉＩ部位にて相同ベクター４４３−８８.１４に挿入した。挿入したＳｆｉＩ断片は、以下の源からの制限断片を連結することによって、標準的な組換えＤＮＡ技術(Maniatisら，1982およびSambrook，1989)を利用して構築する。第１断片は合成初期／後期プロモーターＥＰ１ＬＰ２（配列番号：８／配列番号：１１）である。第２断片はＩＢＶＭａｓｓＳｐｉｋｅ遺伝子の暗号領域を含有し(アミノ酸３−１１６２)、ほぼ３５００塩基対ＢｓｍＩないしＰｖｕＩＩＢＶｃＤＮＡ断片に由来する。第３断片は合成初期／後期プロモーターＥＰ１ＬＰ２（配列番号：８／配列番号：１１）である。第４断片はＩＢＶＭａｓｓＭａｔｒｉｘ遺伝子（アミノ酸１−２３２）についての暗号領域を含有し、ほぼ１５００塩基対ＸｂａＩないしＳｐｅＩＩＢＶｃＤＮＡ第４に由来する。第５断片は合成後期プロモーターＬＰ１（配列番号：９）。第６断片はイー・コリｌａｃＺの暗号領域を含有し、プラスミドｐＪＦ７５１(Ferrariら，1985)に由来する。相同ベクター６２２−４９.１ＩＢＶマサチューセッツ（Ｍａｓｓ）ヌクレオキュプシド遺伝子をＦＰＶに挿入する目的でプラスミド６２２−４９.１を構築した。ｕｉｄＡマーカー遺伝子およびＩＢＶＭａｓｓヌクレオキュプシド遺伝子をカセットとしてユニークＳｆｉＩ部位にて相同ベクター４５１−０８.２２に挿入した。挿入したＳｆｉＩ断片は、以下の源からの制限断片を連結することによって、標準的な組換えＤＮＡ技術(Maniatisら，1982およびSambrook，1989)を利用して構築した。第１断片は合成初期／後期プロモーターＥＰ１ＬＰ２（配列番号：８／配列番号：１１）である。第２断片はＩＢＶＭａｓｓヌクレオキュプシド遺伝子の暗号領域を含有し、ほぼ３８００塩基対ＰｓｔＩないしＩＢＶｃＤＮＡ断片に由来する。第３断片は合成後期プロモーターＬＰ１（配列番号：９）である。第４断片はイー・コリｕｎｉＡの暗号配列を含有し、プラスミドｐＲＡＪ２６０(Clonetech)に由来する。相同ベクター５８４−３６.１２ＮＤＶＨＮおよびＦ遺伝子をＦＰＶに挿入する目的でプラスミド５８４−３６.１２を構築した。ＮＤｖＨＮおよびＦ遺伝子をユニークＳｆｉＩ部位にて相同ベクター４４３−８８.１４（実施例１Ｂ参照）に挿入した。ＮＤＶＨＮおよびＦ遺伝子は、親相同ベクターにおけるＯＲＦと同一の転写向きに挿入した。ＳｆｉＩ断片の詳細な記載は図１Ａ−１Ｃに示す。挿入したＳｆｉＩ断片は、図Ａ−１Ｃに示した合成ＤＮＡ配列を持つ以下の源からの制限断片を連結することによって、標準的な組換えＤＮＡ技術（Maniatis ら，1982およびSambrook，1989)を利用して構築した。第１断片は全長ＮＤＶＨＮｃＤＮＡクローン（Ｂ１株）のほぼ１８１１塩基対ＡｖａＩＩないしＮａｅＩ制限断片である。断片２は全長ＮＤＶＦｃＤＮＡ（Ｂ１株）のほぼ１８１２塩基対ＢａｍＨＩないしＰｓｔＩ制限断片である。断片３は、プラスミドｐＢＲ３２２のほぼ２３５塩基対ＰｓｔＩないしＳｃａＩ制限断片である。相同ベクター６９４−１０.４感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）ｇＢおよびｇＤ遺伝子をＦＰＶに挿入する目的でプラスミド６９４−１０.４を構築した。イー・コリβ−グルクロニダーゼｕｎｉＡマーカー遺伝子、それに先行するＩＬＴＶｇＢおよびｇＤ遺伝子をカセットとしてユニークＳｆｉＩ部位にて相同ベクター４５１−０８.２２に挿入した。カセットは、示した合成ＤＮＡ配列を持つ以下の源からの制限断片を連結することによって、標準的な組換えＤＮＡ技術(Maniatisら，1982およびS ambrook，1989)を利用して構築した。第１断片は合成初期／後期プロモーターＥＰ１ＬＰ２（配列番号：８／配列番号：１１）である。第２断片はＩＬＴＶｇＢの暗号領域を含有し、ほぼ３０００塩基対ＩＬＴウイルスゲノムＥｃｏＲＩ断片に由来する。プロモーターおよびｇＢは、ｇＢ遺伝子の完全な暗号領域を発現するように融合させることに注意されたい。第３断片は合成初期／後期プロモーターＥＰ１ＬＰ２（配列番号：８／配列番号：１１）である。第４断片はＩＬＴＶｇＤ遺伝子の暗号領域を含有し、ＩＬＴＶＫｐｎＩゲノム制限断片＃８（１０.６ＫＢ）のほぼ２０６０塩基対ＥｃｏＲＩないしＢｃＩＩ制限サブ断片に由来した。プロモーターおよびｇＤ遺伝子は、合成プロモーターに由来する３アミノ酸、続いてのｇＤ遺伝子のアミノ酸３ないし４３４よりなるハイブリッド蛋白質を発現するように融合させることに注意されたい。第５断片は、合成後期プロモーターＬＰ１（配列番号：９）である。最後の断片はイー・コリｕｎｉＡの暗号領域を含有し、プラスミドｐＲＡＪ２６０(Clonetech)に由来する。プロモーターおよびuｎｉＡ遺伝子は、合成プロモーターに由来する３アミノ酸、続いてのｕｎｉＡ遺伝子のアミノ酸１ないし６０２よりなるハイブリッド蛋白質を発現するように融合させることに注意されたい。相同ベクター７４９−７５.８２プラスミド７４９−７５.８２を用いて、外来性ＤＮＡをＦＰＶに挿入した。それは、イー・コリβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子、およびＦＰＶＤＮＡがすぐに隣接する感染性嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）ポリメラーゼ遺伝子を一体化させる。このプラスミドを組換えＦＰＶを創製するための相同組換え手法に従って用いると、外来性遺伝子につきコードするＤＮＡを含有するウイルスを得る。β −ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ＩＢＤＶポリメラーゼ遺伝子は合成後期／初期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに注意されたい。相同ベクターは、適当な合成ＤＮＡ配列を持つ以下の源からの制限断片を連結させることによって、標準的な組換えＤＮＡ技術（１１および１４）を利用して構築した。プラスミドベクターはｐＳＰ６４(Promega)のほぼ２９９９塩基対ＥｃｏＲＩ制限断片に由来した。断片１は２.８ｋｂＥｃｏＲＩＦＰＶゲノム断片（配列番号：５）のほぼ１１８４塩基対ＥｃｏＲＩないしＳｎａＢＩ制限サブ断片である。断片２は、ＩＢＤＶＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡクローニングおよびボリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によって合成したほぼ２７００ＥｃｏＲＩないしＡｓｃＩ制限断片である。ｃＤＮＡおよびＰＣＲプライマー（５’−ＣＡＣＧＡＡＴＴＣＴＧＡＣＡＴＴＴＴＣＡＡＣＡＧＴＣＣＡＣＡＧＧＣＧＣ−３’；１２／９３.４）(配列番号：)および５’−ＧＣＴＧＴＴＧＧＡＣＡＴＣＡＣＧＧＧＣＣＡＧＧ−３’；９／９３.２８）(配列番号：)を用いて、ＩＢＤＶポリメラーゼ遺伝子の５’末端のほぼ１１００塩基対ＥｃｏＲＩないしＢｃｌＩ断片を合成した。ｃＤＮＡおよびＰＣＲプライマー（５’−ＡＣＣＣＧＧＡＡＣＡＴＡＴＧＧＴＣＡＧＣＴＣＣＡＴ−３’；１２／９３.２）（配列番号：）および５’−ＧＧＣＧＣＧＣＣＡＧＧＣＧＡＡＧＧＣＣＧＧＧＧＡＴＡＣＧＧ−３’；１２／９３.３）(配列番号)を用いて、ＩＢＤＶポリメラーゼ遺伝子の３’末端のほぼ１７００塩基対ＢｃｌＩないしＡｓｃＩ断片を合成した。２つの断片をＢｃｌＩ部位で連結して、ほぼ２８００塩基対ＥｃｏＲＩないしＢｃｌＩ断片を形成させた。断片３はプラスミドｐＪＦ７５１（７）のほぼ３００２塩基対ＢａｍＨＩないしＰｖｕＩＩ制限断片である。断片４は２.８ｋｂＥｃｏＲＩＦＰＶゲノム断片（配列番号：５）のほぼ１６２６塩基対ＳｎａＢＩないしＥｃｏＲＩ制限サブ断片である。相同ベクター７５１−０７.Ｄ１プラスミド７５１−０７.Ｄ１を用いて、外来性ＤＮＡをＦＰＶに挿入した。それは、イー・コリβ−ガラクトシダーゼ（ＩａｃＺ）マーカー遺伝子、およびＦＰＶＤＮＡがすぐに隣接するニワトリインターフェロン（ｃＩＦＮ）遺伝子を一体化させる。このプラスミドを組換えＦＰＶを創製するための相同組換え手法に従って用いると、外来性遺伝子につきコードするＤＮＡを含有するウイルスを得る。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ｃＩＦＮ遺伝子は合成後期／初期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに注意されたい。相同ベクターは、適当な合成ＤＮＡ配列を持つ以下の源からの制限断片を連結させることによって、標準的な組換えＤＮＡ技術（１７）を利用して構築した。プラスミドベクターはｐＳＰ６４(Promega)のほぼ２９９９塩基対ＥｃｏＲＩ制限断片に由来した。断片１は２.８ｋｂＥｃｏＲＩＦＰＶゲノム断片（配列番号：５）のほぼ１６２６塩基対ＥｃｏＲＩないしＳｎａＢＩ制限サブ断片である。断片２は、コンカナバリンＡ刺激ニワトリ脾臓細胞から単離したＲＮＡの逆転写およびポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）(Sambrook)によって由来したｃＩＦＮ遺伝（１７）につきコードするほぼ５７７塩基対ＥｃｏＲＩないしＢｇｌＩＩ制限断片である。逆転写およびＰＣＲで使用したアンチセンスプライマー(６／９４.１３）は5’ＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＧＡＧＧＴＧＣＧＴＴＴＧＧＧＧＣＴＡＡＧＴＧＣ−３’(配列番号：)であった。ＰＣＲで使用したセンスプライマー（６／９４.１２）は５’ＣＣＡＣＧＧＡＴＣＣＡＧＣＡＣＡＡＣＧＣＧＡＧＴＣＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴ−３’（配列番号：）であった。逆転写およびＰＣＲから得られたＢａｍＨＩ断片をゲル生成し、第２ＰＣＲ反応のための鋳型として用いて、ユニークＥｃｏＲＩ部位を５’末端に、ユニークＢｇｌＩＩ部位を３’末端に導入した。第２ＰＣＲ反応はプライマー６／９４.２２（５’ＣＣＡＣＧＡＡＴＴＣＧＡＴＧＧＣＴＧＴＧＣＣＴＧＣＡＡＧＣＣＣＡＣＡＧ−３’；配列番号）を５’末端、およびプライマー６／９４.３４（５’ −ＣＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＧＧＴＧＣＧＴＴＴＧＧＧＧＣＴＡＡＧＴＧＣ−３’ ；配列番号:）を３’で用いて、ほぼ５７７塩基対断片を得た。ＤＮＡ断片はアミノ末端の３１アミノシグナル配列およびニワトリインターフェロンをコードする成熟蛋白質の１６２アミノ酸を含む、ニワトリ・インターフェロン蛋白質（１７）のアミノ酸１ないしアミノ酸１９３の暗号配列を含有する。断片３はプラスミドｐＪＦ７５１（７）のほぼ３００２塩基対ＢａｍＨＩないしＰｖｕＩＩ制限断片である。断片４は２.８ｋｂＥｃｏＲＩＦＰＶゲノム断片（配列番号：５）のほぼ１８８４塩基対ＳｎａＩないしＥｃｏＲＩ制限サブ断片である。相同ベクター７５１−５６.Ｃ１プラスミド７５１−５６.Ｃ１を用いて、外来性ＤＮＡをＦＰＶに挿入した。それは、イー・コリβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子、およびＦＰＶＤＮＡがすぐに隣接するニワトリ骨髄単球成長因子（ｃＭＧＦ）遺伝子を一体化させる。このプラスミドを組換えＦＰＶを創製するための相同組換え手法に従って用いると、外来性遺伝子につきコードするＤＮＡを含有するウイルスを得る。 β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は合成後期痘プロモーター（ＬＰ１）の制御下にあり、ｃＭＧＦ遺伝子は合成後期／初期痘プロモーター（ＬＰ２ＥＰ２）の制御下にあることに注意されたい。相同ベクターは、適当な合成ＤＮＡ配列を持つ以下の源からの制限断片を連結させることによって、標準的な組換えＤＮＡ技術（１１および１４）を利用して構築した。プラスミドベクターはｐＳＰ６４(Promega)のほぼ２９９９塩基対ＥｃｏＲＩ制限断片に由来した。断片１は２.８ｋｂＥｃｏＲＩＦＰＶゲノム断片（配列番号：５）のほぼ１１８４塩基対ＥｃｏＲＩないしＳｎａＢＩ制限サブ断片である。断片２は、コンカナバリンＡ刺激ニワトリ脾臓細胞から単離したＲＮＡの逆転写およびポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）(Sambrook,1989)によって由来したｃＭＧＦ遺伝（１６）につきコードするほぼ６４０塩基対ＥｃｏＲＩないしＢａｍＨＩ断片である。逆転写およびＰＣＲで使用したアンチセンスプライマー（６／９４.２０）は５’ＣＧＣＡＧＧＡＴＣＣＧＧＧＧＣＧＴＣＡＧＡＧＧＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＧ−３’ (配列番号：)であった。ＰＣＲで用いたセンスプライマー（５／９４.５）は５ ’ＧＡＧＣＧＧＡＴＣＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＣＡＣＡＧＡＧＣＴＧ−３ ’(配列番号：)であった。ＰＣＲに由来するＢａｍＨＩ断片をプラスミドにサブクローンし、５’末端にプライマー６／９４．１６（５’−ＧＣＧＣＧＡＡＴＴＣＣＡＴＧＴＧＣＴＧＣＣＴＣＡＣＣＣＣＴＧＴＧ３’;配列番号：）および３ ’末端にプライマー６／９４.２０（５’ＣＧＣＡＧＧＡＴＣＣＧＧＧＧＣＧＴＣＡＧＡＧＧＣＧＧＧＣＧＡＧＧＴＧ−３’;配列番号：）を用いる、第２ＰＣＲ反応用の鋳型として用いて、ほぼ６４０塩基対断片を得た。該ＤＮＡ断片はアミノ末端に２３アミノ酸シグナル配列および成熟蛋白質をコードするｃＭＧＦの１７８アミノ酸を含むｃＭＧＦ蛋白質（１６）のアミノ酸１ないしアミノ酸２０１の暗号配列を含有する。図３はプラスミドｐＪＦ７５１（７）のほぼ３００２塩基対ＢａｍＨＩないしＰｖｕＩＩ制限断片である。断片４は２.８ｋｂＥｃｏＲＩＦＰＶゲノム断片（配列番号：５）のほぼ１６２６塩基対ＳｎａＩないしＥｃｏＲＩ制限サブ断片である。実施例１外来性ＤＮＡのＦＰＶへの挿入用の部位適当な挿入部位を規定するために、ＦＰＶＥｃｏＲＩ制限断片をプラスミドベクターｐＳＰ６４(Promega)中に生じさせた。これらの制限断片のいくつかを制限マッピング分析に付した。ユニークな平滑切断制限エンドヌクレアーゼ部位は同一であり、クローン化ＦＰＶＤＮＡ領域内にマップされた。平滑制限部位を、合成ＤＮＡリンカー（オリゴ６６.０４；５’−ＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＣＣＴＣＧＡＧＧＣＣＡ−３’ 配列番号：１およびオリゴ６６．０５；５’ＴＧＧＣＣＴＣＧＡＧＧＧＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣ３’配列番号：２）の使用を通じてＮｏｔＩおよびSｆｉＩ部位に変換した。β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子を潜在的部位の各々に挿入した。かかる外来性ＤＮＡインサートを含有するプラスミドを、組換えＦＰＶを創製するための相同組換え手法に従って用いて、外来性ＤＮＡを含有するＦＰＶを構築することができる。この手法を成功させるためには、挿入部位はＦＰＶの複製に必須でない領域にあること、および該部位は、ウイルスおよびプラスミドＤＮＡの間の相同組換えを媒介するのに適したＦＰＶＤＮＡがすぐに隣接することが重要である。ｌａｃＺマーカー遺伝子を含有するプラスミドを、組換えＦＰＶを創製するための相同組換え手法で利用した。組換えういるすの創製は、酵素マーカー遺伝子を発現する組換えＦＰＶについてのスクリーニングによって測定した。３つの部位を首尾よく用いて、組換えウイルスを生じさせた。各々の場合、得られたウイルスは容易に１００％まで精製され、外来性ＤＮＡの挿入に適した部位を明らかに規定した。これらの部位を規定するのに用いた３つの相同ベクターを以下に記載する。実施例１Ａ相同ベクター４４３−８８.８相同ベクター４４３−８８.８は３.５ＫＢＦＰＶゲノムＥｃｏＲＩ断片を含有し、外来性ＤＮＡをＦＰＶに挿入するのに有用である。このＥｃｏＲＩ断片は、ＦＰＶゲノム断片ＳａｌＩＣおよびＰｓｔＩＦ(Couparら，1990)のほぼ５ .５ＫＢ重複にマップされた。前記したＮｏｔＩ／ＳｆｉＩリンカーをこの断片のユニークＨｐａＩ部位に挿入した。この部位を６８０挿入部位と命名する。相同ベクター４４３−８８.８をＤＮＡ配列分析によって特徴つけた。ＨｐａＩ部位に直ぐに隣接するＤＮＡ配列のほぼ１４９５塩基対を決定した(配列番号：３)。この配列は、３８３アミノ酸のオープンリーディングフレームがＨｐａＩ挿入部位にまたがることを示す。ＨｐａＩ部位はアミノ酸２２６においてＯＲＦを遮る。このＯＲＦは、既知のいずれの痘ウイルス遺伝子に対するアミノ酸相同性も示さない。実施例１Ｂ相同ベクター４４３−８８.１４相同ベクター４４３−８８.１４は２.８ＫＢＦＰＶゲノムＥｃｏＲＩ断片を含有し、外来性ＤＮＡのＦＰＶへの挿入に有用である。前記ＮｏｔＩ／ＳｆｉＩリンカーをこの断片のユニークＳｎａＢＩ部位に挿入した。この部位を６８１挿入部位と命名する。相同ベクター４４３−８８.１４をＤＮＡ配列分析によって特徴付けた。２.８ＫＢ断片の全配列を決定した(配列番号：５)。この配列は、ＳｎａＩ部位が、その片側で、制限部位に向かって読まれる４２２アミノ酸（ＯＲＦ１）の完全なＯＲＦと直ぐに隣接し、他方側が、やはり制限部位に向かって読まれる３８７アミノ酸の不完全なＯＲＦ（ＯＲＦ２）と直ぐに隣接する。両ＯＲＦ１およびＯＲＦ２はワクシニアウイルスＭ１Ｌ遺伝子（ｒｅｆ）との相同性を共に有する。該Ｍ１Ｌ遺伝子は、ウイルス宿主範囲機能に関与することが示されているワクシニアウイルスＫ１Ｌ遺伝子との相同性を有する。実施例１Ｃ相同ベクター４５１−０８.２２相同ベクター４５１−０８.２２は４.２ＫＢＦＰＶゲノムＥｃｏＲＩ断片を含有し、外来性ＤＮＡのＦＰＶへの挿入に有用である。前記したＮｏｔＩ／ＳｆｉＩリンカーをこの断片のユニークＳｔｕＩ部位に挿入した。ユニークＭｌｕＩ部位はＳｔｕＩ挿入部位からほぼ５００塩基対離れて位置する。この部位を５４０挿入部位と命名する。実施例２ニューカッスル病および鶏痘に対する二価ワクチンＮＤＶからの蛋白質を発現する組換えＦＰＶは、マレク病およびニューカッスル病双方に対して保護する二価ワクチンを作成する。本発明者らは、ＮＤＶ蛋白質を発現するいくつかの組換えＦＰＶを構築した：Ｓ−ＦＰＶ−０１３(実施例２Ａ)、Ｓ−ＦＰＶ−０３５(実施例２Ｂ)、Ｓ−ＦＰＶ−０４１(実施例２Ｃ)、Ｓ−ＦＰＶ−０４２(実施例２Ｄ)、およびＳ−ＦＰＶ−０４３(実施例２Ｅ)。実施例２ＡＳ−ＦＰＶ−０１３Ｓ−ＦＰＶ−０１３は２つの外来性遺伝子を発現する組換え鶏痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ遺伝子）およびニューカッスル病ウイルス血球凝集素についての遺伝子（ＨＮ）を６９１挿入部位に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーターＬＰ１の制御下にあり、ＨＮ遺伝子は合成後期プロモーターＬＰ２の制御下にある。Ｓ−ＦＰＶ−０１３はＳ−ＦＰＶ−００１から誘導した。これは、組換えＦＰＶを創製するための相同組換え手法において、相同ベクター４５１−７９.９５（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＦＰＶ−００１を利用して達成された。酵素マーカー遺伝子を発現する組換えＦＰＶについてのスクリーニングによってトランスフェクションストックをスクリーニングした。赤色プラークの最終結果はＳ−ＦＰＶ−０１３と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラークアッセイによってモニターした複数継代によってβ−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサート安定性につきこのウイルスを検定した。最初の３ラウンドの精製の後、全ての観察されたプラークは青色であり、これは、ウイルスが純粋で、安定でマーカー遺伝子を発現することを示す。組換えＦＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラークスクリーニングを用い、Ｓ−ＦＰＶ−０１３をＮＤＶ特異的抗原の発現につき検定した。ＮＤＶＨＮ特異的モノクローナル抗体（３−１Ｇ−５）は、Ｓ−ＦＰＶ−００１陰性対照プラークとではなく、Ｓ−ＦＰＶ−０１３プラークと特異的に反応することが示された。全てのＳ−ＦＰＶ−０１３の観察されたプラークはモノクローナル抗体抗血清と反応し、これは、ウイルスがＮＤＶ外来性遺伝子を安定に発現することを示す。実施例２ＢＳ−ＦＰＶ−０３５Ｓ−ＦＰＶ−０３５は２つの外来性遺伝子を発現する組換え鶏痘ウイルスである。ニューカッスル病ウイルスＨＮ遺伝子を６８０挿入部位に挿入した（実施例１Ａ参照）。ＨＮ遺伝子は合成初期／後期プロモーターＥｐ１ＬＰ２の制御下にある。Ｓ−ＦＰＶ−０３５はＳ−ＦＰＶ−００１から誘導した。これは、組換えＦＰＶを創製するための相同組換え手法において、相同ベクター４８９−２１.１（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＦＰＶ−００１を利用して達成された。組換えＦＰＶを精製するためのプラークハイブリダイゼーション手法によってトランスフェクションストックをスクリーニングした。プラークハイブリダイゼーションの最終結果はＳ− ＦＰＶ−０３５と命名した組換えウイルスであった。組換えＦＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラークスクリーニングを用い、Ｓ−ＦＰＶ−０３５をＮＤＶ特異的抗原の発現につき検定した。ＮＤＶＨＮ特異的モノクローナル抗体（３−１Ｇ−５）は、Ｓ−ＦＰＶ−００１陰性対照プラークとではなく、Ｓ−ＦＰＶ−０３５プラークと特異的に反応することが示された。全てのＳ−ＦＰＶ−０３５の観察されたプラークはモノクローナル抗体と反応し、これは、ウイルスがＮＤＶ外来性遺伝子を安定に発現することを示す。実施例２ＣＳ−ＦＰＶ−０４１Ｓ−ＦＰＶ−０４１は２つの外来性遺伝子を発現する組換え鶏痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ遺伝子）およびニューカッスル病ウイルス融合（Ｆ）蛋白質についての遺伝子を６８１挿入部位に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーターＬＰ１の制御下にあり、Ｆ遺伝子は合成初期／後期プロモーターＥＰ１ＬＰ２の制御下にある。Ｓ−ＦＰＶ−０４１はＳ−ＦＰＶ−００１から誘導した。これは、組換えＦＰＶを創製するための相同組換え手法において、相同ベクター５０２−２７.５（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＦＰＶ−００１を利用して達成された。酵素マーカー遺伝子を発現する組換えＦＰＶについてのスクリーニングによってトランスフェクションストックをスクリーニングした。赤色生成の最終結果はＳ−ＦＰＶ−０４１と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載したごとき青色プラークアッセイによる複数継代によって、このウイルスを、β −ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサート安定性につき検定した。最初の３ラウンドの精製の後、観察された全てのプラークは青色であり、これは、ウイルスが純粋で、安定で、マーカー遺伝子を発現していることを示す。組換えＦＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラークスクリーニングを用い、Ｓ−ＦＰＶ−０４１をＮＤＶ特異的抗原の発現につき検定した。ＮＤＶＦ特異的モノクローナル抗体（５−３Ｆ−２）は、Ｓ−ＦＰＶ−００１陰性対照プラークとではなく、Ｓ−ＦＰＶ−０４１プラークと特異的に反応することが示された。全てのＳ−ＦＰＶ−０４１の観察されたプラークはモノクローナル抗体と反応し、これは、ウイルスがＮＤＶ外来性遺伝子を安定に発現することを示す。実施例２ＤＳ−ＦＰＶ−０４２Ｓ−ＦＰＶ−０４２は２つの外来性遺伝子を発現する組換え鶏痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ遺伝子）およびニューカッスル病ウイルス融合（Ｆ）蛋白質についての遺伝子を６８１挿入部位に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーターＬＰ１の制御下にあり、Ｆ遺伝子は合成初期／後期プロモーターＥＰ１ＬＰ２の制御下にある。ニューカッスル病ウイルス血球凝集素（ＨＮ）遺伝子は６８０挿入部位は挿入した。ＨＮ遺伝子は合成初期／後期プロモーターＥＰ１ＬＰ２の制御下にある。Ｓ−ＦＰＶ −０４２はＳ−ＦＰＶ−０３５から誘導した。これは、組換えＦＰＶを創製するための相同組換え手法において、相同ベクター５０２−２７.５（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＦＰＶ−０３５を利用して達成された。酵素マーカー遺伝子を発現する組換えＦＰＶについてのスクリーニングによってトランスフェクションストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ− ＦＰＶ−０４２と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載したごとき青色プラークアッセイによる複数継代によって、このウイルスを、β−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサート安定性につき検定した。最初の３ラウンドの精製の後、観察された全てのプラークは青色であり、これは、ウイルスが純粋で、安定で、マーカー遺伝子を発現していることを示す。組換えＦＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラークスクリーニングを用い、Ｓ−ＦＰＶ−０４２をＮＤＶ特異的抗原の発現につき検定した。ＨＮ（３−１Ｇ−５）およびＦ（５−３Ｆ−２）双方につき特異的なモノクローナル抗体は、Ｓ−ＦＰＶ−００１陰性対照プラークとではなく、Ｓ−ＦＰＶ−０４２プラークと特異的に反応することが示された。全てのＳ−ＦＰＶ−０４２の観察されたプラークはモノクローナル抗体と反応し、これは、ウイルスがＮＤＶ外来性遺伝子を安定に発現することを示す。実施例２ＥＳ−ＦＰＶ−０４３Ｓ−ＦＰＶ−０４３は２つの外来性遺伝子を発現する組換え鶏痘ウイルスである。ニューカッスル病ウイルスＦ蛋白質およびＨＮ蛋白質についての遺伝子を６８０挿入部位に挿入した。ＦおよびＨＮ遺伝子は、各々、合成初期／後期プロモーターＥＰ１ＬＰ２の制御下にある。Ｓ−ＦＰＶ−０４３はＳ−ＦＰＶ−０３５から誘導した。これは、組換えＦＰＶを創製するための相同組換え手法において、相同ベクター５０２−２６.２２（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＦＰＶ−００１を利用して達成された。組換えＦＰＶを精製するためのプラークハイブリダイゼーション手法によってトランスフェクションストックをスクリーニングした。プラークハイブリダイゼーション精製の最終結果はＳ−ＦＰＶ−０４３と命名した組換えウイルスであった。Ｓ−ＦＰＶ−０４３は、特許手続の目的の微生物の国際的寄託に関するブダペスト条約に従って、米国２０８５２、メリーランド州、ロックビル、パーク・ローン１２３０１のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに、ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ２３９５の下で寄託した。組換えＦＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラークスクーニングを用い、Ｓ−ＦＰＶ−０４３をＮＤＶ特異的抗原の発現につき検定した。ＨＮ( ３−１Ｇ−５)およびＦ（５−３Ｆ−２）双方につき特異的なモノクローナル抗体は、Ｓ−ＦＰＶ−００１陰性対照プラークとではなく、Ｓ−ＦＰＶ−０４３プラークと特異的に反応することが示された。全てのＳ−ＦＰＶ−０４３の観察されたプラークはモノクローナル抗体抗血清と反応し、これは、ウイルスがＮＤＶ外来性遺伝子を安定に発現することを示す。組換えＦＰＶ発現および抗原のテスト１日齢ＳＰＦヒヨコ（HyVac Inc.)のグループを組換え鶏痘ウイルスＳ−ＦＰＶ−０３５、Ｓ−ＦＰＶ−０４１、またはＳ−ＦＰＶ−０４３で免疫化した。非ワクチン接種対照も含ませた。ワクチン接種の３週間後、鳥類をビルレントＮＤＶまたはビルレントＦＰＶいずれかで筋肉内攻撃した(表１)。攻撃したヒヨコを、ＮＤＶによる臨床的徴候および死亡に１き、１４日間毎日観察した。非ワクチン接種対照鳥類は１００％死亡率を示した。Ｓ−ＦＰＶ−０４３ワクチン接種鳥類はＦＰＶ攻撃に対して１００％保護を示した。Ｓ−ＦＰＶ−０３５でワクチン接種した鳥類は、Ｓ−ＦＰＶ−０４１で免疫化した鳥類で観察された８５％と比較して９５％保護を示した。これらの結果は、ＨＮまたはＦ単独を発現する組換体は部分的保護のみを供する。両ＮＤＶ蛋白質を同一ウイルスＳ−ＦＰＶ−０４３に組み合わせた場合、致死的ＮＤＶ攻撃に対する保護の増強が得られ、低保護用量の結果となる。ＦＰＶで攻撃したヒヨコを痘病変につきスコア取りした。非ワクチン接種対照鳥類は、ＦＰＶ病変に対して保護を示した。Ｓ−ＦＰＶ−０４３でワクチン接種した鳥類はＦＰＶ病変から完全に保護された。Ｓ−ＦＰＶ−０４３でのワクチン接種によって付与された免疫性の持続を調べた。ＳＰＦヒヨコの群を１日齢においてＳ−ＦＰＶ−０４３で免疫化し、次いで、ＮＤＶまたはＦＰＶいずれかでワクチン接種６週間後に攻撃した。Ｓ−ＦＰＶ −０４３ワクチン接種鳥類においてＮＤＶおよびＦＰＶ攻撃に対して完全に保護が観察され、他方、非ワクチン接種対照は両攻撃ウイルスに対して全く感受性であった。これらの結果は、Ｓ−ＦＰＶ−０４３によって供された免疫性の持続はブロイラー鳥の寿命にわたるであろうことを示す(〜６週間)。組換えＳ−ＦＰＶ−０４３で産卵期の雌鳥をワクチン接種する効果は、ワクチン接種後の卵生産によって評価した。５０羽の雌鳥の１の群をワクチン接種し、ワクチン接種群と同一の条件下で収容した５０羽の第２の群を非ワクチン接種対照として供した。毎日の卵生産をワクチン接種後４週間モニターした。雌鳥の２つの群で卵生産に差異は認められず、これは、本ワクチンが産卵雌鳥における卵生産の悪影響を与えないであろうことを示す。ＮＤＶおよびＦＰＶ双方に対する母体抗体の存在下、Ｓ−ＦＰＶ−０４３がヒヨコを能動的に免疫化し得るか否かを判断するために実験を行った。ＮＤＶおよびＦＰＶ免疫化群れから得たヒヨコをＳ−ＦＰＶ−０４３でワクチン接種し、ワクチン接種３週間後に、それらをビルレントＮＤＶおよびビルレントＦＰＶいずれかで攻撃した。臨床的応答を、同一群れからの非ワクチン接種ヒヨコおよび抗体陰性群れからの非ワクチン接種ヒヨコと比較した(表２)。抗体陰性群れから得られたヒヨコはＮＤＶ攻撃の後に１００％死亡率を示した。ＮＤＶに対する抗体を母体から得たことが知られている非ワクチン接種ヒヨコにおいて、ＮＤＶ攻撃に対する保護は３０ないし６０％の範囲であった。母体抗体陰性ヒヨコをＳ−ＦＰＶ−０４３でワクチン接種すると、保護レベルは７５ないし８５％の範囲まで増加し、これは、能動免疫化を示唆する。３０％から７５％（群れ１）および５５％から８５％（群れ２）へのＮＤＶ保護の増加は、ＮＤＶおよびＦＰＶ双方に対する母体抗体を部分的に克服するＳ−ＦＰＶ−０４３の能力を明らかに証明する。ＦＰＶ保護の減少（９０％）が群れ１で観察され、これは、ＦＰＶ複製のいくらかの阻害を示唆する。実施例２ＦＳ−ＦＰＶ−０７４Ｓ−ＦＰＶ−０７４は２つの外来性遺伝子を発現する組換え鶏痘ウイルスである。ニューカッスル病ウイルスＦ蛋白質およびＨＮ蛋白質を６８１挿入部位に挿入した。ＦおよびＨＮ遺伝子は、各々、後期／初期プロモーターＬＰ２ＥＰ２の制御下にある。Ｓ−ＦＰＶ−０７４はＳ−ＦＰＶ−００１から誘導した。これは、組換えＦＰＶを創製するための相同組換え手法において、相同ベクター５８４−３６.１２( 材料および方法参照)およびウイルスＳ−ＦＰＶ−００１を利用して達成された。組換えＦＰＶを精製するためのプラークハイブリダイゼーション手法によってトランスフェクションストックをスクリーニングした。プラークハイブリダイゼーションの最終結果はＳ−ＦＰＶ−０７４と命名した組換えウイルスであった。組換えＦＰＶにおける外来性遺伝子についての黒色プラークスクリーニングを用い、Ｓ−ＦＰＶ−０７４をＮＤＶ特異的抗原の発現につき検定した。ＮＤＶＨＮ（３−１Ｇ−５）およびＦ（５−３Ｆ−２）に特異的なモノクローナル抗体は、Ｓ−ＦＰＶ−００１陰性対照プラークとではなくＳ−ＦＰＶ−０７４プラークと特異的に反応することが示された。全てのＳ−ＦＰＶ−０７４の観察されたプラークはモノクローナル抗体と反応し、これは該ウイルスがＮＤＶ外来性遺伝子を安定に発現していることを示す。Ｓ−ＦＰＶ−０７４はＮＤＶからの外来性抗原を発現する。このウイルスはニューカッスル病および鶏痘に対する多価ワクチンとして有用である。実施例３マレク病ウイルス（ＭＤＶ）からの蛋白質を発現する組換え鶏痘ウイルスは、鶏痘ウイルスおよびマレク病ウイルス双方に対して保護するワクチンを作成する。本発明者らは、ＭＤＶ蛋白質を発現するいくつかの組換えＦＰＶを構築した：Ｓ−ＦＰＶ−０８１、Ｓ−ＦＰＶ−０８２、Ｓ−ＦＰＶ−０８５。これらのうち、Ｓ−ＦＰＶ−０８２およびＳ−ＦＰＶ−０８５はニューカッスル病ウイルスからの蛋白質も発現する。これらのウイルスは、鶏痘ウイルス、マレク病ウイルス、およびニューカッスル病ウイルスに対してワクチン接種するのに有用である。Ｓ−ＦＰＶ−０８５は、さらに、感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）からの蛋白質も発現し、それらをＩＬＴＶに対するワクチンとして有用とする。実施例３ＡＳ−ＦＰＶ−０８１Ｓ−ＦＰＶ−０８１は３つの外来性遺伝子を発現する組換え鶏痘ウイルスである。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ遺伝子）およびマレク病ウイルス（ＭＤＶ）糖蛋白質Ｄ（ｇＤ）および糖蛋白質Ｂ（ｇＢ）についての遺伝子を６８１挿入部位に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーターＬＰ１の制御下にあり、ＭＤＶｇＤおよびｇＢ遺伝子は、各々、合成初期／後期プロモーターＬＰ２ＥＰ２およびＥＰ１ＬＰ２の制御下にある。Ｓ−ＦＰＶ−０８１はＳ−ＦＰＶ−００１から誘導した。これは、組換えＦＰＶを創製するための相同組換え手法において、相同ベクター６０８−１０.３（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＦＰＶ−００１を利用して達成された。酵素マーカー遺伝子を発現する組換えＦＰＶについてのスクリーニングによってトランスフェクションストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＦＰＶ−０８１と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラークアッセイによってモニターした複数継代によってβ− ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサート安定性につきこのウイルスを検定した。最初の３ラウンドの精製の後、全ての観察されたプラークは青色であり、これは、ウイルスが純粋で、安定でマーカー遺伝子を発現することを示す。組換えＦＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラークスクリニングを用い、Ｓ−ＦＰＶ−０８１をＭＤＶ特異的抗原の発現につき検定した。ＭＤＶ感染ニワトリからの回復期血清はＳ−ＦＰＶ−００１陰性対照プラークとではなく、Ｓ−ＦＰＶ−０８１プラークと特異的に反応することが示された。全てのＳ −ＦＰＶ−０８１の観察されたプラークはニワトリ抗血清と反応し、これは、ウイルスがＭＤＶ外来性遺伝子を安定に発現することを示す。ＭＤＶ−感染ニワトリからの回復期血清を用いる感染細胞溶解物のウェスタンブロットアッセイは、Ｓ−ＦＰＶ−０８１がＭＤＶ糖蛋白質ＢおよびＭＤＶ糖蛋白質Ｄを発現していたことを示した。Ｓ−ＦＰＶ−０８１はＭＤＶからの外来性抗原を発現する。このウイルスは、マレク病および鶏痘に対する多価ワクチンとして有用である。実施例３ＢＳ−ＦＰＶ−０８２Ｓ−ＦＰＶ−０８１は５つの外来性遺伝子を発現する組換え鶏痘ウイルスである。ニューカッスル病ウイルスＦ蛋白質およびＨＮ蛋白質についての遺伝子を６８０挿入部位に挿入した。ＦおよびＨＮ遺伝子、各々、合成初期／後期プロモーターＥＰ１ＬＰ２の制御下にある。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびマレク病ウイルス（ＭＤＶ）ｇＤおよびｇＢについての遺伝子を６８１挿入部位に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーターＬＰ１の制御下にあり、ＭＤＶｇＤおよびｇＢ遺伝子は、各々、合成初期／後期プロモーターＬＰ２ＥＰ２およびＥＰ１ＬＰ２の制御下にある。Ｓ−ＦＰＶ−０８２はＳ−ＦＰＶ−０４３から誘導した。これは、組換えＦＰＶを創製するための相同組換え手法において、相同ベクター６０８−１０.３（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＦＰＶ−０４３を利用して達成された。酵素マーカー遺伝子を発現する組換えＦＰＶについてのスクリーニングによってトランスフェクションストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＦＰＶ−０８２と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラークアッセイによってモニターした複数継代によってβ− ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサート安定性につきこのウイルスを検定した。最初の３ラウンドの精製の後、全ての観察されたプラークは青色であり、これは、ウイルスが純粋で、安定でマーカー遺伝子を発現することを示す。組換えＦＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラークスクリーニングを用い、Ｓ−ＦＰＶ−０８２をＭＤＶ特異的抗原の発現につき検定した。ＭＤＶ感染ニワトリからの回復期血清はＳ−ＦＰＶ−００１陰性対照プラークとではなく、Ｓ−ＦＰＶ−０８２プラークと特異的に反応することが示された。全てのＳ−ＦＰＶ−０８２の観察されたプラークはニワトリ抗血清と反応し、これは、ウイルスがＭＤＶ外来性遺伝子を安定に発現することを示す。Ｓ−ＦＰＶ−０８２はＮＤＶおよびＭＤＶからの外来性抗原を発現する。このウイルスは、ニューカッスル病、マレク病および鶏痘に対する多価ワクチンとして価値があろう。実施例３ＣＳ−ＦＰＶ−０８５Ｓ−ＦＰＶ−０８５は８つの外来性遺伝子を発現する組換え鶏痘ウイルスである。ニューカッスル病ウイルスＦ蛋白質およびＨＮ蛋白質についての遺伝子を６８０挿入部位に挿入した。ＦおよびＨＮ遺伝子、各々、合成初期／後期プロモーターＥＰ１ＬＰ２の制御下にある。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ）およびマレク病ウイルス（ＭＤＶ）ｇＤおよびｇＢについての遺伝子を６８１挿入部位に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーターＬＰ１の制御下にあり、ＭＤＶｇＤおよびｇＢ遺伝子は、各々、合成初期／後期プロモーターＬＰ２ＥＰ２およびＥＰ１ＬＰ２の制御下にある。イー・コリβ −グルクロニターゼについての遺伝子（ｕｉｄＡ遺伝子）および感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）ｇＤおよびｇＢについての遺伝子を５４０挿入部位に挿入した。ｕｉｄＡ遺伝子は合成後期プロモーターの制御下にあり、ＩＬＴＶｇＤおよびｇＢ遺伝子は、各々、合成初期／後期プロモーターＥＰ１ＬＰ２の制御下にある。Ｓ−ＦＰＶ−０８５はＳ−ＦＰＶ−０８２から誘導した。これは、組換えＦＰＶを創製するための相同組換え手法において、相同ベクター５８６−３６.６（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＦＰＶ−０８２を利用して達成された。酵素マーカー遺伝子を発現する組換えＦＰＶについてのスクリーニングによってトランスフェクションストックをスクリーニングした。青色プラーク（β−グルクロニターゼ）精製の最終結果はＳ−ＦＰＶ−０８５と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラークアッセイによってモニターした複数継代によってβ−グルクロニターゼ発現、純度、およびインサート安定性につきこのウイルスを検定した。最初の３ラウンドの精製の後、全ての観察されたプラークは青色であり、これは、ウイルスが純粋で、安定でマーカー遺伝子を発現することを示す。組換えＦＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラークスクリーニングを用い、Ｓ−ＦＰＶ−０８５をＭＤＶ特異的抗原の発現につき検定した。Ｓ− ＦＰＶ−０８５はＮＤＶ、ＭＤＶおよびＩＬＴＶからの外来性抗原を発現する。このウイルスはニューカッスル病、マレク病、感染性喉頭気管炎および鶏痘に対する多価ワクチンとして有用である。実施例４感染性喉頭気管炎ウイルス(ＩＬＴＶ)からの蛋白質を発現する組換え鶏痘ウイルス(ＦＰＶ)は、ＦＰＶおよびＩＬＴＶ双方に対して保護するワクチンを作成する。本発明者らは、ＩＬＴＶ蛋白質を発現するいくつかの組換えＦＰＶを構築した：Ｓ −ＦＰＶ−０９５、Ｓ−ＦＰＶ−０８３、Ｓ−ＦＰＶ−０９７。これらのうち、Ｓ−ＦＰＶ−０８３およびＳ−ＦＰＶ−０９７はニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）からの蛋白質も発現し、それらを同様にＮＤＶに対するワクチンとしても有用てする。実施例４ＡＳ−ＦＰＶ−０９５Ｓ−ＦＰＶ−０９５は３つの外来性遺伝子を発現する組換え鶏痘ウイルスである。イー・コリβ−グルクロニターゼについての遺伝子（ｕｒｉＡ遺伝子）および感染性喉頭気管炎ウイルス（ＭＤＶ）糖蛋白質Ｄ（ｇＤ）および糖蛋白質Ｂ（ｇＢ）についての遺伝子を５４０挿入部位に挿入した。ｕｉｄＡ遺伝子は合成後期プロモーターＬＰ１の制御下にあり、ＩＬＴＶｇＤおよびｇＢ遺伝子は、各々、合成初期／後期プロモーターＥＰ１ＬＰ２の制御下にある。Ｓ−ＦＰＶ−０９５はＳ−ＦＰＶ−００１から誘導した。これは、組換えＦＰＶを創製するための相同組換え手法において、相同ベクター６９４−１０.４（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＦＰＶ−００１を利用して達成された。酵素マーカー遺伝子を発現する組換えＦＰＶについてのスクリーニングによってトランスフェクションストックをスクリーニングした。青色プラーク精製（β −グルクロニターゼ）の最終結果はＳ−ＦＰＶ−０９５と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラークアッセイによってモニターした複数継代によってβ−グルクロニターゼ発現、純度、およびインサート安定性につきこのウイルスを検定した。最初の３ラウンドの精製の後、全ての観察されたプラークは青色であり、これは、ウイルスが純粋で、安定でマーカー遺伝子を発現することを示す。組換えＦＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラークスクリーニングを用い、Ｓ−ＦＰＶ−０９５をＩＬＴＶ特異的抗原の発現につき検定した。ＩＬＴＶｇＢおよびｇＤはＳ−ＦＰＶ−００１陰性対照プラークとではなく、Ｓ −ＦＰＶ−０９５プラークと特異的に反応することが示された。全てのＳ−ＦＰＶ−０９５の観察されたプラークは抗血清と反応し、これは、ウイルスがＩＬＴＶ外来性遺伝子を安定に発現することを示す。Ｓ−ＦＰＶ−０９５はＩＬＴＶからの外来性抗原を発現する。このウイルスは、感染性喉頭気管炎および鶏痘に対する多価ワクチンとして有用である。実施例４ＢＳ−ＦＰＶ−０８３Ｓ−ＦＰＶ−０８３は５つの外来性遺伝子を発現する組換え鶏痘ウイルスである。ニューカッスル病ウイルスＦ蛋白質およびＨＮ蛋白質についての遺伝子を６８０挿入部位に挿入した。ＦおよびＨＮ遺伝子、各々、合成初期／後期プロモーターＥＰ１ＬＰ２の制御下にある。イー・コリβ−グルクロニターゼについての遺伝子（ｕｉｄＡ遺伝子）および感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴ）ｇＤおよびｇＢについての遺伝子を５４０挿入部位に挿入した。ｕｉｄＡ遺伝子は合成後期プロモーターＬＰＩの制御下にあり、ＩＬＴｇＤおよびｇＢ遺伝子は、各々、合成初期／後期プロモーター（ＥＰ１ＬＰ２）の制御下にある。Ｓ−ＦＰＶ−０８３はＳ−ＦＰＶ−０４３から誘導した。これは、組換えＦＰＶを創製するための相同組換え手法において、相同ベクター５８６−３６.６（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＦＰＶ−０４３を利用して達成された。酵索マーカー遺伝子を発現する組換えＦＰＶについてのスクリーニングによってトランスフェクションストックをスクリーニングした。青色プラーク精製の最終結果はＳ−ＦＰＶ−０８３と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラークアッセイによってモニターした複数継代によってβ− グルクロニターゼ発現、純度、およびインサート安定性につきこのウイルスを検定した。最初の３ラウンドの精製の後、全ての観察されたプラークは青色であり、これは、ウイルスが純粋で、安定でマーカー遺伝子を発現することを示す。組換えＦＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラークスクリーニングを用い、Ｓ−ＦＰＶ−０８３をＩＬＴＶ特異的抗原の発現につき検定した。ＩＬＴＶ感染ニワトリからの回復期血清はＳ−ＦＰＶ−００１陰性対照プラークとではなく、Ｓ−ＦＰＶ−０８３プラークと特異的に反応することが示された。全てのＳ−ＦＰＶ−０８３の観察されたプラークはニワトリ抗血清と反応し、これは、ウイルスがＩＬＴV外来性遺伝子を安定に発現することを示す。Ｓ−ＦＰＶ−０８３はＮＤＶおよびＩＬＴＶからの外来性抗原を発現する。このウイルスは、ニューカッスル病、感染性喉頭気管炎および鶏痘に対する多価ワクチンとして価値があろう。実施例４ＣＳ−ＦＰＶ−０９７Ｓ−ＦＰＶ−０９７は５つの外来性遺伝子を発現する組換え鶏痘ウイルスである。ニューカッスル病ウイルスＦ蛋白質およびＨＮ蛋白質についての遺伝子を６８０挿入部位に挿入した。ＦおよびＨＮ遺伝子、各々、合成初期／後期プロモーターＥＰ１ＬＰ２の制御下にある。イー・コリβ−グルクロニターゼについての遺伝子（ｕｉｄＡ遺伝子）および感染性喉頭気管炎ウイルスに（ＩＬＴＶ）ｇＤおよびｇＢについての遺伝子を５４０挿入部位に挿入した。ｕｉｄＡ遺伝子は合成後期プロモーターＬＰ１の制御下にあり、ＩＬＴＶｇＤおよびｇＢ遺伝子は、各々、合成初期／後期プロモーターＥＰ１ＬＰ２の制御下にある。Ｓ−ＦＰＶ−０９７はＳ−ＦＰＶ−０４３から誘導した。これは、組換えＦＰＶを創製するための相同組換え手法において、相同ベクター６９４−１０.４（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＦＰＶ−０４３を利用して達成された。酵素マーカー遺伝子を発現する組換えＦＰＶについてのスクリーニングによってトランスフェクションストックをスクリーニングした。青色プラーク精製の最終結果はＳ−ＦＰＶ−０９７と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラークアッセイによってモニターした複数継代によってβ− グルクロニターゼ発現、純度、およびインサート安定性につきこのウイルスを検定した。最初の３ラウンドの精製の後、全ての観察されたプラークは青色であり、これは、ウイルスが純粋で、安定でマーカー遺伝子を発現することを示す。組換えＦＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラークスクリーニングを用い、Ｓ−ＦＰＶ−０９７をＩＬＴＶ特異的抗原の発現につき検定した。ＩＬＴＶｇＢおよびｇＤはＳ−ＦＰＶ−００１陰性対照プラークとではなくＳ− ＦＰＶ−０９７プラークと特異的に反応することが示された。全てのＳ−ＦＰＶ −０９７の観察されたプラークは抗血清と反応し、これは、ウイルスがＩＬＴＶ外来性遺伝子を安定に発現することを示す。全てのＳ−ＦＰＶ−０９７の観察されたプラークはニワトリ抗血清と反応し、これはウイルスがＩＬＴＶ外来性遺伝子を安定に発現することを示す。ＮＦＶＨＮ（３−１Ｇ−５）およびＦ（５− ３Ｆ−２）に特異的なモノクローナル抗体はＳ−ＦＰＶ−００１陰性対照プラークとではなくＳ−ＦＰＶ−０９７プラークと特異的に反応することが示された。全てのＳ−ＦＰＶ−０９７の観察されたプラークはモノクローナル抗体と反応し、これは、ウイルスがＮＤＶ外来性遺伝子を安定に発現することを示す。Ｓ−ＦＰＶ−０９７はＮＤＶおよびＩＬＴＶからの外来性抗原を発現する。このウイルスは、ニューカッスル病、感染性喉頭気管炎および鶏痘に対する多価ワクチンとして有用であろう。実施例５感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）からの蛋白質を発現する組換え鶏痘ウイルスは、ＦＰＶおよびＩＢＶ双方に対して保護するワクチンを作成する。本発明者らは、ＩＢＶ蛋白質を発現する２つの組換えＦＰＶを構築した：Ｓ−ＦＰＶ−０７２およびＳ−ＦＰＶ−０７９。これらのウイルスは共にニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）からの蛋白質も発現し、それらをＮＤＶに対するワクチンとして有用とする。実施例５ＡＳ−ＦＰＶ−０７２Ｓ−ＦＰＶ−０７２は５つの外来性遺伝子を発現する組換え鶏痘ウイルスである。ニューカッスル病ウイルスＦ蛋白質およびＨＮ蛋白質についての遺伝子を６８０挿入部位に挿入した。該ＦおよびＨＮ遺伝子は、各々、合成初期／後期プロモーターＥＰ１ＬＰ２の制御下にある。イー・コリβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ遺伝子）についての遺伝子および感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）マサチューセッツスパイク蛋白質（Mass Spike）およびマサチューセッツマトリックス蛋白質(Mass Matrix)についての遺伝子を６８１挿入部位に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーターＬＰ１の制御下にあり、ＩＢＶ MassSpileおよびMass Matrix遺伝子は、各々、合成初期／後期プロモーターＥＰ１ＬＰ２の制御下にある。Ｓ−ＦＰＶ−０７２はＳ−ＦＰＶ−０４３から誘導した。これは、組換えＦＰＶを創製するための相同組換え手法において、相同ベクター５３８.５１−２７（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＦＰＶ−０４３を利用して達成された。酵素マーカー遺伝子を発現する組換えＦＰＶについてのスクリーニングによってトランスフェクションストックをスクリーニングした。赤プラーク精製の最終結果はＳ−ＦＰＶ−０７２と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラークアッセイによってモニターした複数継代によってβ− ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサート安定性につきこのウイルスを検定した。最初の３ラウンドの精製の後、全ての観察されたプラークは青色であり、これは、ウイルスが純粋で、安定でマーカー遺伝子を発現することを示す。組換えＦＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラークスクリーニングを用い、Ｓ−ＦＰＶ−０７２をＮＤＶおよびＩＢＶ特異的抗原の発現につき検定した。ＩＢＶMass Spike蛋白質に対するモノクローナル抗体１５−８８はＳ− ＦＰＶ−００１陰性対照プラークとではなく、Ｓ−ＦＰＶ−０７２プラークと特異的に反応することが示された。全てのＳ−ＦＰＶ−０７２の観察されたプラークはモノクローナル抗体と反応し、これは、ウイルスがＩＢＶ外来性遺伝子を安定に発現することを示す。ＩＢＶ Mass Spike 蛋白質に対するモノクローナル抗体を用いる感染細胞溶解物のウェスタンブロットアッセイは、Ｓ−ＦＰＶ− ０７２が９０ｋＤＩＢＶ Mass Spike蛋白質を発現していたことを示した。ＨＮ（３−１Ｇ−５）およびＦ（５−３Ｆ−２）双方に特異的モノクローナル抗体はＳ−ＦＰＶ−００１陰性対照プラークではなく、Ｓ−ＦＰＶ−０７２プラークと特異的に反応することが示された。すべてのＳ−ＦＰＶ−０７２の観察されたプラークはモノクローナル抗体と反応し、これは、ウイルスがＮＤＶ外来性遺伝子を安定に発現することを示す。Ｓ−ＦＰＶ−０７２はＮＤＶおよびＩＢＶからの外来性抗原を発現する。このウイルスは、ニューカッスル病、感染性気管炎、および鶏痘に対する多価ワクチンとして有用である。実施例５ＢＳ−ＦＰＶ−０７９は７つの外来性遺伝子を発現する組換え鶏痘ウイルスである。ニューカッスル病ウイルスＦ蛋白質およびＨＮ蛋白質についての遺伝子を６８０挿入部位に挿入した。ＦおよびＨＮ遺伝子、各々、合成初期／後期プロモーターＥＰ１ＬＰ２の制御下にある。イー・コリβ−ガラクトシダーゼについての遺伝子（ｌａｃＺ遺伝子）および感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）マサチューセッツスパイク蛋白質(Mass Spike)およびマサチューセッツマトリックス(Mass Matrix)についての遺伝子を６８１挿入部位に挿入した。ｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーターＬＰ１の制御下にあり、ＩＢＶ Mass SpikeおよびMass Ｍ遺伝子は、各々、合成初期／後期プロモーターＥＰ１ＬＰ２の制御下にある。イー・コリβ−グルクロニダーゼ（ｕｒｄＡ）遺伝子およびＩＢＶ Mass ヌクレオキャプシド蛋白質は５４０挿入部位に挿入した。ｕｉｄＡ遺伝子は合成後期／初期プロモーターＬＰ２ＥＰ２の制御下にあり、ＩＢＶ Massヌクレオキャプシド遺伝子は合成初期／後期プロモーターＥＰ１ＬＰ２の制御下にある。Ｓ−ＦＰＶ−０７９はＳ−ＦＰＶ−０７２から誘導した。これは、組換えＦＰＶを創製するための相同組換え手法において、相同ベクター６１１−４９．１（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＦＰＶ−０７２を利用して達成された。酵素マーカー遺伝子を発現する組換えＦＰＶについてのスクリーニングによってトランスフェクションストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＦＰＶ−０７９と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラークアッセイによってモニターした複数継代によってβ− ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサート安定性につきこのウイルスを検定した。最初の３ラウンドの精製の後、全ての観察されたプラークは青色であり、これは、ウイルスが純粋で、安定でマーカー遺伝子を発現することを示す。組換えＦＰＶにおける外来性遺伝子発現についての黒色プラークスクリーニングを用い、Ｓ−ＦＰＶ−０７９をＮＤＶおよびＵＢＶ特異的抗原の発現につき検定した。ＩＢＶ Mass Spike蛋白質に対するモノクローナル抗体１５−８８はＳ −ＦＰＶ−００１陰性対照プラークとではなく、Ｓ−ＦＰＶ−０７２プラークと特異的に反応することが示された。全てのＳ−ＦＰＶ−０７９の観察されたプラークはモノクローナル抗体抗血清と反応し、これは、ウイルスがＩＢＶ外来性遺伝子を安定に発現することを示す。ＩＢＶ Mass Spike蛋白質に対するモノクローナル抗体を用いる感染細胞溶解物のウェスタンブロットアッセイは、Ｓ−ＦＰＶ−０７９が９０ｋＤＩＢＶ Mass Spike蛋白質を発現していたことを示した。ＨＮ（３−１Ｇ−５）およびＦ（５−３Ｆ−２）双方に特異的モノクローナル抗体はＳ−ＦＰＶ−００１陰性対照プラークではなく、Ｓ−ＦＰＶ−０７９プラークと特異的に反応することが示された。すべてのＳ−ＦＰＶ−０７９の観察されたプラークはモノクローナル抗体と反応し、これは、ウイルスがＮＤＶ外来性遺伝子を安定に発現することを示す。Ｓ−ＦＰＶ−０７９はＮＤＶおよびＩＢＶからの外来性抗原を発現する。このウイルスは、ニューカッスル病、感染性気管支炎および鶏痘に対する多価ワクチンとして価値があろう。実施例６組換え鶏痘ウイルス、ニワトリ・インターフェロン（ｃＩＦＮ）を発現するＳ −ＦＰＶ −０９９またはＳ−ＦＰＶ−１０１、ニワトリ骨髄単球成長因子（ｃＭＧＦ）を発現するＳ−ＦＰＶ−１００を用いて、家禽の病気に対してワクチンを添加すると、免疫応答を増強させる。ニワトリ骨髄単球成長因子（ｃＭＧＦ）は哺乳動物インターロイキン−６蛋白質に相同であり、ニワトリ・インターフェロン（ｃＩＦＮ）は哺乳動物インターフェロンＩ型に相同である。単独で、あるいは特異的鳥類病に対するワクチンと組み合わせて用いると、Ｓ−ＦＰＶ−０９９、Ｓ−ＦＰＶ−１００およびＳ−ＦＰＶ−１０１は、限定されるものではないが、マレク病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、感染性喉頭気管炎ウイルス、感染性気管支炎ウイルス、感染性嚢病ウイルスを含めた鳥類病を引き起こすウイルスに対する粘膜、体液、または細胞媒介免疫性の増強を供する。Ｓ−ＦＰＶ−０９９Ｓ−ＦＰＶ−０９９は２つの外来性遺伝子を発現する組換え鶏痘ウイルスである。ニワトリ・インターフェロン（ｃＩＦＮ）およびイー・コリｌａｃＺについての遺伝子を、２．８ｋＢＥｃｏＲＩＦＰＶゲノム断片におけるユニークＳｎａＢＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（６８１挿入部位）に挿入した。該ｃＩＦＮ遺伝子は合成後期／初期プロモーターＬＰ２ＥＰ２の制御下にあり、イー・コリｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーターＬＰ１の制御下にある。Ｓ−ＦＰＶ−０９９はＳ−ＦＰＶ−００１から誘導した。これは、組換えＦＰＶを創製するための相同組換え手法において、相同ベクター７５１−０７.Ｄ１（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＦＰＶ−００１を利用して達成された。酵素マーカー遺伝子を発現する組換えＦＰＶについてのスクリーニングによってトランスフェクションストックをスクリーニングした。赤プラーク精製の最終結果はＳ−ＦＰＶ−０９９と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラークアッセイによってモニターした複数継代によってβ− ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサート安定性につきこのウイルスを検定した。最初の３ラウンドの精製の後、全ての観察されたプラークは青色であり、これは、ウイルスＳ−ＦＰＶ−０９９が純粋で、安定でマーカー遺伝子を発現することを示す。Ｓ−ＦＰＶ−０９９からの上清は細胞培養においてインターフェロン活性を有する。ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）へのＳ−ＦＰＶ−０９９条件培地の添加は、水泡性口内炎ウイルスまたはシチメンチョウのヘルペスウイルスによるＣＥＦ細胞の感染を阻害する。Ｓ−ＦＰＶ−０９９は、単独で、あるいは家禽の病気に対するワクチンに添加した場合、免疫応答を増強させるのに有用である。Ｓ−ＦＰＶ−１００Ｓ−ＦＰＶ−１００は２つの外来性遺伝子を発現する組換え鶏痘ウイルスである。ニワトリ骨髄単球成長因子（ｃＭＧＦ）およびイー・コリｌａｃＺについての遺伝子を、２.８ｋＢＥｃｏＲＩＦＰＶゲノム断片におけるユニークＳｎａＢＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（６８１挿入部位）に挿入した。該ｃＭＧＦ遺伝子は合成後期／初期プロモーターＬＰ２ＥＰ２の制御下にあり、イー・コリｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーターＬＰ１の制御下にある。Ｓ−ＦＰＶ−１００はＳ−ＦＰＶ−００１から誘導した。これは、組換えＦＰＶを創製するための相同組換え手法において、相同ベクター７５１−５６.Ｃ１（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＦＰＶ−００１を利用して達成された。酵素マーカー遺伝子を発現する組換えＦＰＶについてのスクリーニングによってトランスフェクションストックをスクリーニングした。赤プラーク精製の最終結果はＳ−ＦＰＶ−１００と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラークアッセイによってモニターした複数継代によってβ− ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサート安定性につきこのウイルスを検定した。最初の３ラウンドの精製の後、全ての観察されたプラークは青色であり、これは、ウイルスＳ−ＦＰＶ−１００が純粋で、安定でマーカー遺伝子を発現することを示す。Ｓ−ＦＰＶ−１００は単独で、あるいは家禽の病気に対するワクチンに添加した場合に免疫応答を増強させるのに有用である。Ｓ−ＦＰＶ−１０１Ｓ−ＦＰＶ−１０１は４つの外来性遺伝子を発現する組換え鶏痘ウイルスである。ニワトリ・インターフェロン（ｃＩＦＮ）およびイー・コリｌａｃＺについての遺伝子を、２.８ｋＢＥｃｏＲＩＦＰＶゲノム断片におけるユニークＳｎａＢＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（６８１挿入部位）に挿入した。該ｃＩＦＮ遺伝子は合成後期／初期プロモーターＬＰ２ＥＰ２の制御下にあり、イー・コリｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーターＬＰ１の制御下にある。ニューカッスル病ウイルスＦ蛋白質およびＨＮ蛋白質についての遺伝子を６８０挿入部位に挿入した。ＦおよびＨＮ遺伝子は合成初期／後期プロモーターＥＰ１ＬＰ２の制御下にある。Ｓ−ＦＰＶ−１０１はＳ−ＦＰＶ−０４３から誘導した。これは、組換えＦＰＶを創製するための相同組換え手法において、相同ベクター７５１−０７.Ｄ１（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＦＰＶ−０４３を利用して達成された。酵素マーカー遺伝子を発現する組換えＦＰＶについてのスクリーニングによってトランスフェクションストックをスクリーニングした。赤プラーク精製の最終結果はＳ−ＦＰＶ−１０１と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラークアッセイによってモニターした複数継代によってβ− ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサート安定性につきこのウイルスを検定した。最初の３ラウンドの精製の後、全ての観察されたプラークは青色であり、これは、ウイルスＳ−ＦＰＶ−１０１が純粋で、安定でマーカー遺伝子を発現することを示す。Ｓ−ＦＰＶ−１０１からの上清は細胞培養においてインターフェロン活性を有する。ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）へのＳ−ＦＰＶ−１０１条件培地の添加は、水泡性口内炎ウイルスまたはシチメンチョウのヘルペスウイルスによるＣＥＦ細胞の感染を阻害する。Ｓ−ＦＰＶ−１０１は、単独で、あるいは家禽の病気に対するワクチンに添加した場合、免疫応答を増強させるのに有用である。Ｓ− ＦＰＶ−１０１はニューカッスル病および家禽に対する多価ワクチンとして有用である。実施例７膜アンカー配列を欠くニューカッスル病ウイルスＨＮおよびＦ蛋白質を発現する組換え鶏痘ウイルスは鶏痘およびニューカッスル病に対する優れたワクチンである。ニューカッスル病ウイルスに対して暴露されたまたはワクチン接種された雌鳥からの１日齢ヒヨコは、ＮＤＶＨＮおよびＦ蛋白質を発現する組換え鶏痘ウイルスを含有するワクチンを中和することができるＮＤＶに対する抗体を担う。ＮＤＶＨＮまたはＦ蛋白質に特異的なＶＮモノクローナル抗体を用いるイン・ビトロウイルス中和（ＶＮ）アッセイは、ＮＤＶＨＮおよびＦ蛋白質を発現する組換え鶏痘ウイルスを中和することが示された。これらの結果は、ＮＤＶＨＮおよびＦ糖蛋白質が鶏痘ウイルスビリオンに取り込まれることを示唆する。ニューカッスル病ウイルスに対する母体抗体に対するワクチンの効果を増大させるために、各蛋白質の膜アンカードメインを欠くＮＤＶＨＮおよびＦ蛋白質を発現する組換え鶏痘ウイルスを構築する。得られた組換えウイルスは、ニューカッスル病ウイルスに対する強力な体液性および細胞媒体免疫応答を生じるワクチン接種動物の血清に分泌されるＮＤＶＨＮおよびＦ蛋白質を生成する。ＮＤＶＨＮおよびＦ蛋白質はＦＰＶ粒子の表面に存在せず、かくして、ワクチンした１日齢ヒヨコに存在する母体抗体による中和を回避する。ニューカッスル病ウイルスのＢ１株（ＡＴＣＣＶＲ−１０８）からの血球凝集素−ノイニミニダーゼ（ＨＮ）および融合（Ｆ）遺伝子を、オリゴｄＴ感作ポリＡ選択したｍＲＮＡを用いて、ｃＤＮＡクローンとして単離した。融合（Ｆ）蛋白質は、ウイルスエンベロープと宿主細胞原形質膜との融合による宿主細胞へのＮＤＶの浸透を媒介する。２つのジスルフィド−結合ポリペプチドＦ１およびＦ２への不活性前駆体Ｆ_oの翻訳後切断は融合活性Ｆ蛋白質を生じるのに必要であり、それにより、感染性ビリオンが生じる。Ｆ_oの切断後に生成したＦ１の新しい疎水性Ｎ−末端は、パラミキソウイルスに特徴的な融合の原因であり、かくして、ビルレンスを決定する。ＮＤＶＢ１株における必要な蛋白質切断シグナル（対合した塩基残基）は改変され、それにより、Ｆ_oのＦ１およびＦ２の切断を妨げ、その結果、弱毒化ＮＤＶ株が得られる。ＮＤＶＦシグナル配列（ａａ１−２５）のＶＰ２（ｃＦＰ１４７）への付加の結果、ＴＣ流体中にＶＰ２が分泌されるが、その保護応答をなくする(Paolett iら，ＷＯ９３／０３１４５)。脂質二重層と相互作用する３種の疎水性ドメインがＦ糖蛋白質に存在する：１）一次翻訳産物Ｆ_oのＮ−末端におけるシグナル配列；２）Ｆ１のＮ−末端；および３）Ｆ１のＣ−末端近くの膜貫通アンカードメイン。ＮＤＶのＢ１株のＦ糖蛋白質は長さが５４４アミノ酸であり、５００位ないし５２６位の２７アミノ酸（ＬＩＴＹＩＶＬＴＩＩＳＬＶＦＧＩＬＳＬＳＬＡＣＹＬＭＹ）にわたる膜貫通アンカードメインを持つ。ＮＤＶＦ蛋白質のアミノ酸１−４９９は、再生サイクルを通じて発現を指令する、ＥＰ１ＬＰ２またはＬＰ２ＥＰ２のごとき初期および後期プロモーター双方として機能する合成プロモーター要素の制御下で発現される。この結果、ウイルス組立ての前またはその間に内方膜蛋白質（Ｍ）と相互作用すると考えられる、アミノ酸５２７−５４４の細胞質テイルが欠失する。合成初期／後期プロモーターからのＣ−末端膜アンカードメインを欠くＮＤＶＦ蛋白質を発現する組換え鶏痘ウイルスを構築する。血球凝集素−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）糖蛋白質は赤血球を凝集させ、抽出する能力を持つＮＤＶを供する。該プロセスは２つの工程：赤血球細胞表面上の受容体へのウイルスの付着（凝集）およびノイラミニダーゼ酵索活性による受容体の破壊（抽出）よりなる。主要な疎水性アンカードメインはＨＮのＮ−末端近くに存在し、Ｎ−末端が脂質二重層に繋がれるという考えを支持する。ＮＤＶのＢ１株のＨＮ糖蛋白質は長さが５７７のアミノ酸であり、２７位から５４位の２８アミノ酸（ＩＡＩＬＦＬＴＶＶＴＬＡＩＳＶＡＳＬＬＹＳＭＧＡＳＴＰＳ）にわたる膜貫通アンカードメインを持つ。極端なＮ−末端アミノ酸（１ないし２６）は比較的親水性である。ＨＮ蛋白質のアミノ酸５５ないし５７７は、再生サイクルを通じて発現を指令する、ＥＰ１ＬＰ２またはＬＰ２ＥＰ２のごとき、初期および後期プロモーター双方として機能する合成プロモーター要素の制御下で発現される。ＮＤＶＨＮポリペプチドは、そのアミノ末端に、ＰＲＶｇＸシグナル配列のごとき、膜輸送シグナル配列を有して、蛋白質がワクチン接種動物の血清に分泌されることを指令する。Ｎ−末端膜アンカードメインを欠き、合成初期／後期プロモーターからのＮ−末端ＰＲＶｇＸシグナル配列を含有するＮＤＶＨＮ蛋白質を発現する組換え鶏痘ウイルスを構築する。別法として、ＮＤＶＨＮポリペプチドは、２７位ないし５４位の２８アミノ酸にわたる膜貫通アンカードメインの欠失を含み、アミノ酸１ないし２６および５５ないし５７７を保持する。合成初期／後期プロモーターからの膜アンカードメイン（アミノ酸２７ないし５４）を欠くＮＤＶＨＮ蛋白質を発現する組換え鶏痘ウイルスを構築する。合成初期／後期プロモーターからの各蛋白質の膜アンカードメインを各ＮＤＶＨＮおよびＦ蛋白質双方を発現する組換え鶏痘ウイルスを構築する。得られた組換えウイルスは、ニューカッスル病ウイルスに対する強力な体液性および細胞媒介免疫応答を生じるワクチン化動物の血清中に分泌されるＮＤＶＨＮおよびＦ蛋白質を生じる。ＮＤＶＨＮおよびＦ蛋白質はＦＰＶ粒子の表面には存在せず、かくして、ワクチン接種した１日齢ヒヨコに存在する母体抗体による中和を回避する。実施例８特異的組織または器官に遺伝子産物を標的化するのに有用なＦＰＶウイルス粒子の表面の細胞表面受容体を発現する組換え鶏痘ウイルス。ニューカッスル病ウイルスに対する母体抗体を担うニワトリからの血清は、細胞培養中のニワトリ胚繊維芽細胞に対するＳ−ＦＰＶ−０４３による生産的感染およびプラーク形成を阻害する。この結果の１つの解釈は、Ｓ−ＦＰＶ−０４３で発現されたＮＤＶＨＮおよびＦ蛋白質の抗原性エピトープが鶏痘ウイルス粒子の表面に提示されるということである。ＦＰＶ粒子の表面における蛋白質の提示は、特異的遺伝子産物を特異的正常細胞タイプまたは腫瘍細胞タイプに標的化するのに有用である。ＦＰＶ粒子の表面に提示される蛋白質は、限定されるものではないが、ウイルスを細胞表面のインテグリン受容体に標的化するであろうインテグリン；ウイルスを赤血球細胞の表面のエリトロポエチン受容体に標的化するであろうエリトロポエチン；正常または腫瘍細胞の表面の特異的蛋白質または受容体に標的化するであろう抗体または他の蛋白質を含む。また、鶏痘ウイルスはサイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、またはコロニー刺激因子を送達し、これは、腫瘍または病気を引き起こす生物に対する強力な体液性または細胞媒介免疫応答を刺激する。鶏痘ウイルスの表面に提示された蛋白質は、融合蛋白質として、鶏痘ゲノムから、ＮＤＶＨＮまたはＦ蛋白質の膜アンカードメインに、または膜アンカードメインを含有する他の蛋白質に発現される。サイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、またはコロニー刺激因子は、融合蛋白質として、膜に結合しない、可溶性形態としてＰＲＶｇＸ、イー・コリβ−ガラクトジターゼまたはもう１つの蛋白質に発現される。融合蛋白質はサイトカイン蛋白質を安定化し、それを動物の血清中に拡散させて、その細胞標的に到達させる。実施例９Ｓ−ＦＰＶ−０９８Ｓ−ＦＰＶ−０９８は２つの外来性遺伝子を発現する組換え鶏痘ウイルスである。感染性嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）ポリメラーゼ遺伝子、およびイー・コリｌａｃＺを６８１挿入部位に挿入した。ＩＢＤＶポリメラーゼ遺伝子は合成後期／初期プロモーターＬＰ２ＥＰ２の制御下にあり、イー・コリｌａｃＺ遺伝子は合成後期プロモーターＬＰ１の制御下にある。Ｓ−ＦＰＶ−０９８はＳ−ＦＰＶ−００１から誘導した。これは、組換えＦＰＶを創製するための相同組換え手法において、相同ベクター７４９−７５.８２（材料および方法参照）およびウイルスＳ−ＦＰＶ−００１を利用して達成された。酵素マーカー遺伝子を発現する組換えＦＰＶについてのスクリーニングによってトランスフェクションストックをスクリーニングした。赤色プラーク精製の最終結果はＳ−ＦＰＶ−０９８と命名した組換えウイルスであった。材料および方法に記載した青色プラークアッセイによってモニターした複数継代によってβ−ガラクトシダーゼ発現、純度、およびインサート安定性につきこのウイルスを検定した。最初の３ラウンドの精製の後、全ての観察されたプラークは青色であり、これは、ウイルスＳ−ＦＰＶ−０９８が純粋で、安定でマーカー遺伝子を発現することを示す。Ｓ−ＦＰＶ−０９８は、ＩＢＤＶポリメラーゼ蛋白質の発現で有用である。Ｓ −ＦＰＶ−０９８は組換えＩＢＤＶ弱毒化ワクチンに対するイン・ビトロアプローチで有用である。弱毒化IＢＤＶ株からのＲＮＡ株は、ＩＢＤＶゲノムの二本鎖の短いまたは長いセグメントを合成するためのＴ３またはＴ７プロモーター（ pBlueScriptプラスミド;Strategene,Inc.）を用い、細菌発現系で合成される。ＩＢＤＶ二本鎖ＲＮＡセグメントおよびＳ−ＦＰＶ−０９８をＶｅｒｏ細胞にトランスフェクトする。鶏痘ウイルスはＩＢＤＶポリメラーゼを発現するが、Ｖｅｒｏ細胞中で複製しない。Ｓ−ＦＰＶ−０９８から産生されるＩＢＤＶポリメラーゼは、二本鎖ＲＮＡゲノム鋳型から感染性弱毒化ＩＢＤＶウイルスを合成する。得られた弱毒化ＩＢＤＶウイルスはニワトリにおける感染性嚢病に対するワクチンとして有用である。ウイルス搬送送達系および／またはサブユニットアプローチを用いるＩＢＳワクチンの構築に対する別法として、ＩＢＤウイルスＲＮＡは、大（セグメントＡ）および小（セグメントＢ）二本鎖ＲＮＡサブユニット双方を表すｃＤＮＡクローンに由来する全長ＲＮＡを用い、直接に操作してウイルスを再構築する。ＩＢＤウイルスの創製はこのように第１の２つのアプローチよりも優れたいくつかの利点を供する。まず、もしＩＢＤウイルスをＲＮＡ鋳型を用いて再創製すれば、転写（ＲＮＡの生成）に先立って、ウイルスゲノムのクローン化ｃＤＮＡコピーを操作することができる。このアプローチを用い、ビルレントＩＢＤ株を弱毒化し、ビルレント株のそれを持つ弱毒化ワクチン骨格のＶＰ２可変領域を置き換えることができる。そうするにおいて、本発明は、ワクチン株の安全性および効果を供しつつ、ビルレントＩＢＤＶ株に対する保護を供する。さらに、このアプローチを用い、本発明は、関連するビルナウイルス感染性膵臓壊死ウイルス（ＩＰＮＶ）に由来するＲＮＡポリメラーゼおよびＩＢＤＶに由来するポリ蛋白質を用いて、温度感受性ＩＢＤウイルスを構築し、テストする。ＩＰＮＶポリメラーゼはＩＢＤＶのそれよりも低い温度にて最適活性を有する。もしＩＰＮＶポリメラーゼがＩＰＮＶに存在する調節シグナルを認識すれば、ハイブリッドウイルスはニワトリにおいて存在する上昇した温度にて弱毒化されることが期待される。別法として、ＩＢＤＶ血清型２ウイルスに由来するＲＮＡポリメラーゼおよびＩＢＤＶ血清型１ウイルスに由来するポリ蛋白質を用いて創製されるＩＢＤウイルスを構築し、テストすることができる。まず、BursaVacワクチン株(Sterwin Labs）を用いＩＢＤＶ（二本鎖ＲＮＡセグメントＡおよびＢ）の完全なゲノムを表すｃＤＮＡクローンを構築する。一旦、セグメントＡおよびＢの全長コピーを表すｃＤＮＡが構築されると、鋳型ＲＮＡが調製される。ＩＢＤＶは二セグメント二本鎖ＲＮＡウイルスとして存在するので、pBlueScriptプラスミド(Stratagene，Tnc.)を用いて各セグメントのセンスおよびアンチセンスＲＮＡ鎖が生産される。これらのベクターは、高度に特異的なファードプロモーターＳＰ６またはＴ７を利用して、イン・ビトロで基質量のＲＮＡを生成する。ユニーク制限エンドヌクレアーゼ部位を３’ＰＣＲプライマーに設計して、転写の間にラン−オフ転写体の生成につきＤＮＡを線状化する。精製されたＲＮＡ転写体（４ストランド）をＶｅｒｏにトランスフェクトして、ＲＮＡが感染性であるか否かを判断する。もしＩＢＤウイルスが生成されると、ＩＢＤＶ特異的Ｍａｂを用いて色黒プラークアッセイによって測定されるごとく、さらなる操作は必要ではなく、ワクチン株の作成を開始することができる。この方法の利点は、このようにして作成したＩＢＤウイルスは純粋で、生成をほとんど／全く必要とせず、一般に、新しいワクチンを生成するのに必要な時間を減少されるであろうことである。もし陰性結果が精製されたＲＮＡを用いて得られたならば、ヘルパーウイルスの使用によって、機能的ウイルスＲＮＡポリメラーゼが必要である。環状化管構造を形成する二本鎖ＲＮＡ分子ポリメラーゼ(Mul ler & Nitschke，Virology 159，174-177，1987)を用い、鎖置換（セミー保存）メカニズムによって、ビルナウイルスはそれらの核酸を複製する。鶏痘ウイルスにおける約８７８アミノ酸のＲＮＡポリメラーゼオープンリーディングフレームが発現され、この組換えウイルス（Ｓ−ＦＰＶ−０９８）を用いて、イン・トランスにて機能的ＩＢＤＶＲＮＡポリメラーゼを供する。鶏痘ウイルスは非鳥類細胞（Ｖｅｒｏ細胞）において免疫学的に認識可能な外来性抗原を発現し、ここに、ウイルスベクターの生成的複製の徴候はない(Paolettiら，Technological A dvances in Vaccins Development，321-334，1988，AlanR．Liss，Inc.)。本発明においては、ＩＢＤＶポリメラーゼ蛋白質は、細胞をＦＰＶ複製で汚染することなく、鶏痘ウイルスベクターを用い、トランスフェクトされたＲＮＡとして同一細胞で発現される。ＩＢＤウイルスがゲノムＲＮＡを用いてイン・ビトロで生成されるという証明に関し、感染性嚢病に対する改良された生弱毒化ウイルスワクチンを開発する。ＩＢＤウイルスを生成する新たに規定された系と共に組換えＤＮＡ技術を用い、弱毒化ウイルスの保存の容易化を行う。この技術を用い、ビルレンスおよび弱毒化された免疫原性ＩＢＤＶワクチンの原因であるＩＢＤＶの領域を同定する。本発明は、ビルレントＩＢＤ株または弱毒化ワクチン骨格のビルレント株のそれでの置き換えを提供し、かくして、ワクチン株の安全性および効果を提供しつつビルレント株に対して保護する。実施例１０ニワトリ・インターフェロン（ｃＩＦＮ）遺伝子を、相同組換え技術によって、野生型（ＦＰＶ）ウイルスにクローン化した。略言すると、最近公表された配列(Sekellick,M.ら，1994)からのプライマー配列を用いるＲＴ／ＰＣＲによって、ｃＩＦＮの全暗号領域を活性化ニワトリ脾臓細胞ＲＮＡから単離した。ｃＩＦＮ、およびＦＰＶ／ｃＩＦＮを含有する組換えＦＰＶウイルス（Ｓ−ＦＰＶ−０９９）を、初期および後期プロモーター双方として機能し、全ウイルス複製サイクルを通じて発現を指令する合成痘ウイルスプロモーター（ＬＰ２ＳＰ２）の制御下で全ｃＩＦＮＯＲＦを含有するように作成した。ニューカッスル病（ＮＤＶ）抗原ＨＮおよびＦを含有するように予め作成したＦＰＶウイルスを相同組換えの間の親ウイルスとして使用し、ｃＩＦＮおよびＮＤＶ遺伝子を共発現させる組換え鶏痘ウイルスを得る以外は、同様にして、ＦＰＶ／ｃＩＦＮ＋ＮＤＶ（Ｓ −ＦＰＶ−１０１）を作成した。全ての組換えウイルスは、合成後期（ＬＰ１）痘プロモーターの制御下にある、ｃＩＦＮと縦列関係にあるように作成したｌａｃＺ遺伝子を含有する。全てのプロモーター／遺伝子構築体をプロモーター／ｃＩＦＮ結合部にて配列決定して、適当なＤＮＡ暗号フレームの一体性を確認した。β−ガラクトシダーゼの共発現は、組換えウイルスの単離およびプラーク精製を容易とした。独立したウイルス挿入部位を、鶏痘ウイルスにおけるｃＩＦＮ遺伝子およびＮＤＶ遺伝子の挿入に使用した。挿入部位はＳＰＶおよびＦＰＶ双方で非必須ウイルス遺伝子を中断することが判明した。ｃＩＦＮ遺伝子の存在を確認するために、暗号領域に直ぐに隣接するｃＩＦＮ特異的プライマーを用い、ＰＣＲによって組換えウイルスＤＮＡを分析した。全てのウイルスＤＮＡは、予期された６００ｂｐ増幅ｃＩＦＮＤＮＡ産物を生じた。加えて、非放射性標識ｃＩＦＮｃＤＮＡプローブを用いて、ウイルスＤＮＡについてのサザーンブロット分析を行った。転写および翻訳開始／終止シグナルを横切って、ｃＩＦＮ遺伝子カセットを含有するプラスミド構築体を配列決定して、ＯＲＦの全体を確認した。細胞培養における組換えウイルスの増殖特性組換えＦＰＶ／ｃＩＰＮおよびＦＰＶ／ｃＩＦＮ＋ＮＤＶは、ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＰ）細胞におけるそれらの増殖につき減衰されることが判明した。プラークサイズは有意に減少し、ウイルス力価は、野生型ＦＰＶと比較して、０ .９−１.４ｌｏｇ低かった。本発明者らは、鶏痘ウイルスは、他の痘ウイルス、例えば、ワクシニア、牛痘につき報告されている抗−ＩＦＮメカニズムと同様に抗−ＩＦＮメカニズムを有すると提案する。また、これらのメカニズムはウイルスが外因的に発現されたｃＩＦＮの阻害効果を克服するのを助けると提案する。従って、鶏痘ウイルスは感染し、複製し、生産的感染状態を維持することができる。ニワトリにおける組換えＦＰＶ／ｃＩＦＮウイルスのイン・ビボ特性１０日齢ヒヨコを、増大させる投与量にて組換えＦＰＶ／ｃＩＦＮ（Ｓ−ＦＰＶ−０９９）ウイルスで皮下接種した。接種１０日後に、全てのヒヨコを、ヒツジ赤血球細胞（ＳＲＢＣ）およびブルセラ・アボルトウス（Brucella abortus)( BA)の混合物で接種した。ＦＰＶ／ｃＩＦＮウイルス接種の１５日後に、血清を収集し、合計体重およびＳＲＢＣおよびＢＳに応答する抗体を測定し、ヒヨコを剖検分析のために犠牲にした。これらのデータは、ＰＢＳ単独で接種したヒヨコと比較して、組換えＦＰＶ／ｃＩＦＮウイルスの接種に関連した、ヒヨコ体重、ＳＲＢＣおよびＢＡ抗体応答または肉眼病理学Ｃで有意な差異はなかった。従って、このウイルスは１０日齢ヒヨコで安全なようである。１日齢ヒヨコを、ＮＤＶＢ１（１０⁶ＥＬＤ₅₀／ヒヨコ）単独で、またはＦＰＶ／ｃＩＦＮ（１０³ｐｆｕ／ヒヨコ）での皮下接種に加えて、接種した。ワクチン接種２週間後に、ニワトリ死亡率を記録した。ＮＤＶＢＩ単独で、またはＮＤＶＢ１プラスＦＰＶ野生型ウイルスでワクチン接種したヒヨコは、ＮＤＶ−Ｂ１およびＦＰＶ／ｃＩＦＮで共ワクチン接種したニワトリ（この群では、全てのヒヨコは生きたままであった）と比較して、２０−３０％死亡率を示した。引き続いて、全てのヒヨコを、ＮＤＶの病原株（ＧＢ−ＴＸ）にて、ワクチン接種４週間後に攻撃した。「無処理」対照群におけるものを除き、全てのヒヨコは保護された。これらのデータは、ＮＤＶＢ１ワクチン誘導死亡率は、ワクチンの保護能力に影響することなく死亡率を低下させたことを示す。１７日齢ニワトリ胚をＦＰＶ／ｃＩＦＮ／ＮＤＶウイルス、ＦＰＶ野生型ウイルスまたはＰＢＳ希釈剤（０．２ｍｌ）で接種した。ヒヨコを孵化させ、次いで、隔離ユニットに入れ、死亡率につき１週間観察した。これらのデータは、ＦＰＶ／ｃＩＦＮ＋ＮＤＶまたはＦＰＶ野生型でのニワトリ肺の接種は正常な孵化に干渉しないことを示す。３週齢ＳＰＦヒヨコをＦＰＶ／ｃＩＦＮ／ＮＤＶ組換えウイルスの５００ｐｆｕ／ヒヨコで皮下ワクチン接種した。ワクチン接種の９日および２８日後に血清を収集して、ＮＤＶに対して生起された抗体応答の中和を測定した。全てのニワトリをＮＤＶの病原株でワクチン接種２８日に攻撃した、ＮＤＶ誘導死亡率につき１５日間観察した。これらのデータは、ワクチン接種ヒヨコが、ＦＰＶ／ＮＤＶ／ｃＩＦＮ組換えウイルスでのワクチン接種のたった９日後に検出可能な抗− ＮＤＶ抗体応答を生じたことを示す。これらの抗体レベルは少なくとも２８日間維持された。加えて、ＦＰＶ／ｃＩＦＮ／ＮＤＶ組換えウイルスでワクチン接種したニワトリはＮＤＶのビルレント株での攻撃に対して全て保護された。１日齢ＳＰＦヒヨコを、ＦＰＶ／ｃＩＦＮ／ＮＤＶ組換えウイルスの５００ｐｆｕ／ヒヨコで皮下ワクチン接種した。ヒヨコを、ビルレントＮＤＶ（ＧＢ−ＴＸ）でのワクチン接種４、７および１５日後に、鼻孔内／眼内攻撃し、各場合にＮＤＶ誘導死亡率を１５日間観察した。これらのデータは、ワクチン接種ヒヨコが、ワクチン接種７日後に攻撃した場合にビルレントＮＤＶに対して耐性であるが、ワクチン接種４後と早くにてはそうでないことを示す。かくして、ＦＰＶ／ｃＩＦＮ／ＮＤＶ組換えウイルスでのワクチン接種に続くＮＤＶに対する免疫性の開始はワクチン接種後４日および７日の間に起こる。〔結論〕１．組換え鶏痘ウイルスは、ＶＳＶ感染からのＣＥＦ細胞の保護によって測定して、感染細胞の上清に生物学的に活性なニワトリ・インターフェロンを発現する。２．組換えＳＰＶ／ｃＩＦＮ感染細胞からの上清で発現されたニワトリ・インターフェロンは、用量依存的に、ＨＶＴでの感染に対してＣＥＦを保護することが示された。３．ＳＰＶ／ｃＩＦＮから発現されたニワトリ・インターフェロンはＬＰＳと相乗的作用して、酸化窒素誘導によって検出してニワトリ・マクロファージを活性化する。４．組換えＦＰＶ／ｃＩＦＮウイルスは、６×１０⁴ｐｆｕ／ヒヨコの投与量にて１０日齢ヒヨコで安全であることが判明した。５．組換えＦＰＶ／ｃＩＦＮウイルスは、ＮＤＶ感染に対してヒヨコを保護するワクチンの能力に影響することなく、ＮＤＶＢ１ワクチン誘導死亡率を低下させることが判明した。６．イン・オボでの組換えＦＰＶ／ｃＩＦＮ／ＮＤＶウイルスの接種は正常な孵化に干渉しないようである。７．組換えＦＰＶ／ｃＩＦＮ／ＮＤＶウイルスは、維持免疫性でのワクチン接種後９日ないしワクチン接種の２８日後と早期に、３週齢ヒヨコで抗−ＮＤＶ中和抗体を誘導することが示された。さらに、３週齢ヒヨコはワクチン接種後２８日においてビルレントＮＤＶ攻撃から十分に保護された。８.組換えＦＰＶ／ｃＩＦＮ／ＮＤＶウイルスはワクチン接種７日後と早期にビルレントＮＤＶ攻撃から１日齢ヒヨコを保護することが示された。９．前記したデータは、ニワトリＩＦＮを発現する組換え鶏痘ウイルスがイン・ビトロ、イン・ビボおよびイン・オボで免疫変調剤として有利な適用を有することが示す。

【手続補正書】【提出日】１９９８年２月１２日【補正内容】（１）請求の範囲を別紙の通りに訂正する。（２）明細書第１頁下から１２行目、下から９行目および下から４行目に「ＦＲＰ」とある記載を、「ＦＰＶ」と訂正します（３）明細書第２頁第１９行に「羽にない領域」とある記載を、「羽のない領域」と訂正します。請求の範囲１．鶏痘ウイルスゲノムに挿入されたサイトカインをコードする外来性ＤＮＡを含む組換え鶏痘ウイルスであって、該外来性ＤＮＡは、鶏痘ウイルスゲノムにおける２．８ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントに対応するゲノム領域内に挿入され、且つ該ウイルスが導入された宿主細胞で発現され得る組換え鶏痘ウイルス。２．請求項１に記載の組換え鶏痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡが、２．８ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントに対応するゲノム領域内のＳｎａＢ１部位内に挿入される組換え鶏痘ウイルス。３．鶏痘ウイルスゲノムに挿入されたサイトカインをコードする外来ＤＮＡを含む組換え鶏痘ウイルスであって、該外来ＤＮＡは、鶏痘ウイルスゲノムにおけるＳａｌＩＣフラグメントおよびＰｓｔＩＦフラグメント内の３．５ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントに対応したゲノム領域内に挿入され、且つ該ウイルスが導入された宿主細胞で発現され得る組換え鶏痘ウイルス。４．請求項１に記載の組換え鶏痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡが、３．５ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントに対応するゲノム領域内のＨｐａＩ部位内に挿入される組換え鶏痘ウイルス。５．鶏痘ウイルスゲノムに挿入されたサイトカインをコードする外来性ＤＮＡを含む組換え鶏痘ウイルスであって、該外来性ＤＮＡは、鶏痘ウイルスゲノムにおける４．２ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントに対応するゲノム領域内に挿入され、且つ該ウイルスが導入された宿主細胞で発現され得る組換え鶏痘ウイルス。６．請求項１に記載の組換え鶏痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡが、４．２ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントに内のＭｌｕＩ部位内に挿入される組換え鶏痘ウイルス。７．請求項１、３または５に記載の組換え鶏痘ウイルスであって、前記サイトカインがニワトリ骨髄単球成長因子（ｃＭＧＦ）またはニワトリ・インターフェロン（ｃＩＦＮ）である組換え鶏痘ウイルス。８．請求項７に記栽の組換え鶏痘ウイルスであって、Ｓ−ＦＰＶ−１００と命名された組換え鶏痘ウイルス。９．請求項７に記載の組換え鶏痘ウイルスであって、Ｓ−ＦＰＶ−１０１と命名された組換え鶏痘ウイルス。１０．請求項１、３または５に記載の組換え鶏痘ウイルスであって、前記サイトカインがインターロイキン−２、インターロイキン−６、インターロイキン− １２、インターフェロン類、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、およびインターロイキン受容体からなる群から選択される組換え鶏痘ウイルス。１１．請求項７に記載の組換え鶏痘ウイルスであって、更に、前記鶏痘ウイルスゲノムの非必須領域内に挿入された第二の外来ＤＮＡを具備する組換え鶏痘ウイルス。１２．請求項１１に記載の組換え鶏痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡががニューキャッスル病ウイルス血球凝集素（ＮＤＶＮＨ）またはニューカッスル病ウイルス融合素（ＮＤＶＦ）をコードする組換え鶏痘ウイルス。１３．請求項１２に記載の組換え鶏痘ウイルスであって、Ｓ−ＦＰＶ−０９９と命名された組換え鶏痘ウイルス。１４．請求項７に記載の組換え鶏痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡがプロモータの制御下にある組換え鶏痘ウイルス。１５．請求項１４に記載の組換え鶏痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡが内因性の上流ポックスウイルスプロモータの制御下にある組換え鶏痘ウイルス。１６．請求項１４に記載の組換え鶏痘ウイルスであって、前記外来ＤＮＡが異種上流プロモータの制御下にある組換え鶏痘ウイルス。１７．請求項１５に記載の組換え鶏痘ウイルスであって、前記プロモータが、合成ポックスウイルスプロモーター、ポックス合成後期プロモーター１、ポックス合成後期プロモーター２初期プロモーター２、ポックスＯ１Ｌプロモーター、ポックス１４Ｌプロモーター、ポックスＩ３Ｌプロモーター、ポックスＩ２Ｌプロモーター、ポックスＩ１Ｌプロモーター、およびポックスＥ１０Ｒプロモーターから選択される組換え鶏痘ウイルス。１８．外来ＤＮＡを鶏痘ウイルスのウイルスゲノムに挿入することにより組換え鶏痘ウイルスを製造するための相同ベクターであって：ａ）鶏痘ウイルスのウイルスゲノム内に通常は存在しない二本鎖の外来ＤＮＡと；ｂ）該外来性ＤＮＡの一方の端部にあり、且つ鶏痘ウイルスゲノム暗号領域の非必須領域の一方側に位置するウイルスゲノムに対して相同な二本鎖鶏痘ウイルスＤＮＡと；ｃ）該外来性ＤＮＡの他の端部にあり、且つ鶏痘ウイルスゲノム暗号領域の非必須領域の他方側に位置するウイルスゲノムに対して相同な二本鎖鶏痘ウイルスＤＮＡ；とから実質的になる二本鎖ＤＮＡ分子を具備する相同ベクター。１９．請求項１８に記載の相同ベクターであって、前記外来性ＤＮＡ配列がサイトカインをコードする相同ベクター。２０．請求項１９に記載の相同ベクターであって、前記サイトカインがニワトリ骨髄単球成長因子（ｃＭＧＦ）またはニワトリ・インターフェロン（ｃＩＦＮ）である相同ベクター。２１．請求項１８に記載の相同ベクターであって、前記外来ＤＮＡ配列がポリペプチドをコードする相同ベクター。２２．請求項１８に記載の相同ベクターであって、前記外来ＤＮＡ配列がブロモーターの制御下にある相同ベクター。２３．鶏痘ウイルスに対して動物を免疫化するためのワクチンであって、免疫化有効量の請求項１記載の組換え鶏痘ウイルスおよび適切な担体を含有するワクチン。２４．ヒト病原体に対して動物を免疫化する方法であって、前記動物に対して、免疫化有効量の請求項３２記載のワクチンを投与することを具備した方法。２５．動物病原体に対して動物を免疫化する方法であって、前記動物に対して、免疫化有効量の請求項３２記載のワクチンを投与することを具備した方法。２６．鳥類の免疫応答を増強させる方法であって、有効量の請求項１記載の組換え鶏痘ウイルスおよび適切な担体を個体に投与することを具備した方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｒ 1:92） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者シンガー、フィリップ・エーアメリカ合衆国、カリフォルニア州 92117、サン・ディエゴ、ジェニファー・ストリート 3616

Claims

【特許請求の範囲】１．鶏痘ウイルスゲノムＤＮＡに挿入された外来性ＤＮＡ配列を含み、ここに、該外来性ＤＮＡ配列は鶏痘ウイルスゲノムＤＮＡの非必須領域内に挿入され、鶏痘ウイルス感染宿主細胞で発現され得る組換え鶏痘ウイルス。２．該外来性ＤＮＡ配列が鶏痘ウイルスゲノムＤＮＡの非必須領域内のオープンリーディングフレームに挿入される請求項１記載の組換え鶏痘ウイルス。３．該外来性ＤＮＡ配列がポリペプチドをコードする請求項１記載の組換え鶏痘ウイルス。４．該ポリペプチドが抗原性である請求項３記載の組換え鶏痘ウイルス。５．さらに、検出可能なマーカーをコードする外来性ＤＮＡ配列を含む請求項１記載の組換え鶏痘ウイルス。６．該検出可能マーカーがイー・コリのベータ−ガラクトシダーゼである請求項５記載の組換え鶏痘ウイルス。７．検出可能マーカーがイー・コリのベータ−グルクロニダーゼである請求項５記載の組換え鶏痘ウイルス。８．該外来性ＤＮＡ配列がサイトカインをコードする請求項１記載の組換え鶏痘ウイルス。９．該サイトカインがニワトリ骨髄単球成長因子（ｃＭＧＦ）またはニワトリ・インターフェロン（ｃＩＦＮ）である請求項８記載の組換え鶏痘ウイルス。１０．Ｓ−ＦＰＶ−１００と命名される請求項９記載の組換え鶏痘ウイルス。１１．Ｓ−ＦＰＶ−１０１と命名される請求項９記載の組換え鶏痘ウイルス。１２．さらに、ニューカッスル病ウイルス血球凝集素（ＮＤＶＨＮ）、またはニューカッスル病ウイルス融合（ＮＤＶＦ）を含む請求項９の組換え鶏痘ウイルス。１３．Ｓ−ＦＰＶ−０９９と命名された請求項１２記載の組換え鶏痘ウイルス。１４．サイトカインがインターロイキン−２、インターロイキン−６、インターロイキン−１２、インターフェロン、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、およびインターロイキン受容体よりなる群から選択される請求項８記載の組換え鶏痘ウイルス。１５．該抗原性ポリペプチドが：ヒト・ヘルペスウイルス、単純疱疹ウイルス −１、単純疱疹ウイルス−２、ヒト・サイトメガロウイルス、エプスタイン−バールウイルス、帯状水泡ウイルス、ヒト・ヘルペスウイルス−６、ヒト・ヘルペスウイルス−７、ヒト・インフルエンザ、ヒト免疫不全ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルスよりなる群から由来する請求項４記載の組換え鶏痘ウイルス。１６．該抗原性ポリペプチドがＢ型肝炎ウイルスコア蛋白質またはＢ型ウイルス表面蛋白質である請求項４記載の組換え鶏痘ウイルス。１７．該抗原性ポリペプチドがウマ・インフルエンザウイルスである請求項４記載の組換え鶏痘ウイルス。１８．該抗原性ポリペプチドがウマ・インフルエンザウイルスＡ型／アラスカ９１ノイラミニダーゼ、ウマ・インフルエンザＡ型／ケンタッキー９１ノイラミニダーゼ、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／プラーク５６ノイラミニダーゼ、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／マイアミ６３ノイラミニダーゼ、ウマ・インフルエンザウイルスＡ型／ケンタッキー８１ノイラミニダーゼ、ウマ・ヘルペスウイルス１型糖蛋白質Ｂ、およびウマ・ヘルペスウイルス１型糖蛋白質Ｄよりなる群から選択される請求項１７記載の組換え鶏痘ウイルス。１９．該抗原性ポリペプチドが：ブタ・コレラウイルスｇＥ１、ブタ・コレラウイルスｇＥ２、ブタ・インフルエンザウイルス血球凝集素、ノイラミニダーゼ、マトリックスおよび核蛋白質、偽狂犬病ウイルス糖蛋白質Ｂ、偽狂犬病ウイルス糖蛋白質Ｃおよび偽狂犬病ウイルス糖蛋白質Ｄ、およびＰＲＲＳウイルスＯＲＦ７よりなる群に由来する請求項４記載の組換え鶏痘ウイルス。２０．該抗原性ポリペプチドが、感染性ウシ喉頭気管炎ウイルスｇＥ、ウシ呼吸器系シンシチウムウイルス付着蛋白質（ＢＲＳＶＧ）、ウシ呼吸器系シンシチウムウイルス融合蛋白質（ＢＲＳＶＦ）、ウシ呼吸器系シンシチウムウシヌクレオキャプシドウイルス３型融合蛋白質、およびウシ・バラインフルエンザウイルス３型血球凝集素ノイラミニダーゼよりなる群から選択される請求項４記載の組換え鶏痘ウイルス。２１．該抗原性ポリペプチドがウシ・ウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）糖蛋白質４８または糖蛋白質５３である請求項４記載の組換え鶏痘ウイルス。２２．該外来性ＤＮＡ配列が、感染性ネコ免疫不全ウイルスｇａｇ、感染性ネコ免疫不全ウイルスｅｎｖ、感染性喉頭気管炎ウイルス糖蛋白質Ｂ、感染性喉頭気管炎ウイルスｇＩ、感染性喉頭気管炎ウイルスｇＤ、感染性ウシ喉頭気管炎ウイルス糖蛋白質Ｇ、感染性ウシ喉頭気管炎ウイルス糖蛋白質Ｅ、偽狂犬病ウイルス糖蛋白質５０、偽狂犬病ウイルスＩＩ糖蛋白質Ｂ、偽狂犬病ウイルスＩＩＩ糖蛋白質Ｃ、偽狂犬病ウイルス糖蛋白質Ｅ、偽狂犬病ウイルス糖蛋白質Ｈ、マレク病ウイルス糖蛋白質Ａ、マレク病ウイルス糖蛋白質Ｂ、マレク病ウイルス糖蛋白質Ｄ、ニューカッスル病ウイルス血球凝集素またはノイラミニダーゼ、ニューカッスル病ウイルス融合、感染性嚢病ウイルスＶＰ２、感染性嚢病ウイルスＶＰ３、感染性嚢病ウイルスＶＰ４、感染性嚢病ウイルスポリ蛋白質、感染性気管支炎ウイルススパイク、感染性気管支炎ウイルスマトリッマス、およびヒヨコ貧血ウイルスよりなる群から由来する抗原性ポリペプチドをコードする請求項４記載の組換え鶏痘ウイルス。２３．該外来性ＤＮＡ配列がプロモーターの制御下にある請求項１記載の組換え鶏痘ウイルス。２４．該外来性ＤＮＡ配列が内因性上流ポックスウイルスプロモーターの制御下にある請求項２３記載の組換え鶏痘ウイルス。２５．該外来性ＤＮＡ配列が異種上流プロモーターの制御下にある請求項２３記載の組換え鶏痘ウイルス。２６．該プロモーターが合成ポックスウイルスプロモーター、痘合成後期プロモーター１、痘合成後期プロモーター２初期プロモーター２、痘Ｏ１Ｌプロモーター、痘Ｉ４Ｌプロモーター、痘Ｉ３Ｌプロモーター、痘Ｉ２Ｌプロモーター、痘ＩＩＬプロモーター、および痘ＥＩＯＲプロモーターから選択される請求項２３記載の組換え鶏痘ウイルス。２７．ａ）通常は鶏痘ウイルスのウイルスゲノム内には存在しない二本鎖外来性ＤＮＡ；ｂ）該外来性ＤＮＡの一方の端部における、鶏痘ウイルスのウイルスゲノムの暗号領域の非必須領域の一方側に位置するウイルスゲノムと相同な二本鎖鶏痘ウイルスＤＮＡ；およびｃ）該外来性ＤＮＡの他の端部における、鶏痘ウイルスのウイルスゲノムの暗号領域の非必須領域の他方側に位置するウイルスゲノムに相同な二本鎖鶏痘ウイルスＤＮＡ；より実質的になる二本鎖ＤＮＡ分子を含み、外来性ＤＮＡを鶏痘ウイルスのウイルスゲノムに挿入することによって組換え鶏痘ウイルスを生成させるための相同ベクター。２８．該外来性ＤＮＡ配列がサイトカインをコードする請求項２７記載の相同ベクター。２９．該サイトカインがリワトリ骨髄単球成長因子（ｃＭＧＦ）またはラワトリ・インターフェロン（ｃＩＦＮ）である請求項２７記載の相同ベクター。３０．該外来性ＤＮＡ配列がポリペプチドをコードいる請求項２７記載の相同ベクター。３１．該ポリペプチドが抗原性である請求項３０記載の相同ベクター。３２．該外来性ＤＮＡ配列がプロモーターの制御下にある請求項２７記載の相同ベクター。３３．免疫化有効量の請求項１記載の組換え鶏痘ウイルスおよび適当な担体を含む鶏痘ウイルスに対して動物を免疫化するためのワクチン。３４．免疫化有効量の請求項３２記載のワクチンを投与することを特徴とするヒト病原体に対して動物を免疫化する方法。３５．免疫化有効量の請求項３２記載のワクチンを動物に投与することを特徴とする動物病原体に対して動物を免疫化する方法。３６．有効量の請求項１記載の組換え鶏痘ウイルスおよび適当な担体を個人に投与することを特徴とする能動的免疫応答を増強させる方法。