CN108040484A - 基于慢病毒载体的日本脑炎免疫原性组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基于慢病毒载体的日本脑炎(JE)免疫原性组合物。本发明针对表达膜蛋白前体(prM)和包膜蛋白(E)，尤其是日本脑炎病毒(JEV)的糖蛋白或其免疫原性片段，的重组慢病毒载体。本发明还提供表达慢病毒载体的细胞，在哺乳动物宿主中防止JEV感染的应用和方法，所述宿主特别是人或动物宿主，具体是猪或小猪，优选家猪或家养小猪。

Description

基于慢病毒载体的日本脑炎免疫原性组合物
技术领域
本发明涉及基于慢病毒载体的日本脑炎(JE)免疫原性组合物。本发明针对表达膜蛋白前体(prM)和包膜蛋白(E)的重组慢病毒载体，尤其是日本脑炎病毒(JEV)的糖蛋白或其免疫原性片段。本发明还提供表达慢病毒载体的细胞，在哺乳动物宿主中防止JEV感染的应用和方法，所述宿主特别是人或动物宿主，具体是猪或小猪，优选家猪或家养小猪。
发明背景
日本脑炎归因于蚊子传播的日本脑炎病毒(JEV)(黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒(Flavivirus)属成员)感染(Go等，2014；Hubalek等，2014；Weaver和Barrett，2004；Yun和Lee，2014)。JEV包含编码多蛋白的正单链RNA基因组，所述多蛋白加工成3个结构蛋白即衣壳蛋白(C)、膜蛋白前体(prM)和包膜蛋白(E)以及7个非结构蛋白即NS1到NS5(Yun和Lee，2014)。病毒组装在内质网膜腔中发生，在该处核衣壳与异二聚体prME相联形成不成熟的JEV病毒体。后者通过分泌途径转运，其中病毒体通过在转运高尔基体中由弗林蛋白酶将prM切割成膜(M)蛋白而变得成熟(Yun和Lee，2014)。另外，如同其它黄病毒，JEV产生病毒样颗粒(VLP)，其仅组装自prM和E蛋白，并经历与真病毒颗粒相同的成熟过程(Kuwahara和Konishi，2010)。这些VLP能在缺乏任何其它病毒组分的情况下产生并展示与真病毒体类似的生物活性(Kuwahara和Konishi，2010)。
JEV通常在地方性动物并周期中在三带喙库蚊(Culex tritaeniorhynchus)蚊群之间维持并扩增于脊椎动物宿主，如水鸟和家猪(Go等，2014；Hubalek等，2014；Impoinvil等，2013)。马和人被认为是终宿主，因为它们不会发展出足以感染蚊子的病毒血症水平(Impoinvil等，2013)。在过去几十年中，JEV的亚洲地理分布出现扩张且近期报道了JEV可能已引入欧洲(Campbell等，2011；Zeller 2012)。
基于病毒包膜蛋白序列的系统发生研究可使JEV株分成基因型G1到G5(Gao等，2014；Hubalek等，2014；LeFlohic等，2013；Schuh等.，2013；Solomon等，2003；Weaver和Barrett，2004)。最初，大部分传播的JEV株属于G3且是东南亚国家主要流行病的源头。近期，在数个亚洲国家中观察到流行从JEV G3向G1转变，而一些JEV G5株偶尔在中国和韩国得到分离(Gao等，2013；Le Flohic等，2013；Li等，2014；Pan等，2011；Schuh等，2014；Takhampunya等，2011)。
JEV是亚洲引起医学兴趣的最重要病毒性脑炎的病原体，每年发病率为50,000例和约10,000起死亡(Campbell等，2011；Go等，2014；Yun和Lee，2014)。约20-30％有症状的人病例是致命的，而30-50％非致命病例可能发展出长期神经病学后遗症。对于JE疾病没有可用的抗病毒治疗。针对JEV的疫苗目前可用于人和一些动物如马及猪：其是灭活的小鼠脑源性，灭活的细胞培养源性，活的减毒和活的减毒、嵌合黄热病病毒-JEV疫苗(Bonaparte等，2014；Dubischar-Kastner和Kanesan-Thasna，2012；Erra等,2013；Fan等，2013；Halstead和Thomas，2011；Impoinvil等，2013；Ishikawa等.，2014；Marks等，2012；Song等，2012；Yang等，2014；Yun和Lee，2014)。然而，其中一些缺乏长期免疫性且减毒活疫苗株可能有毒力回复的风险(Yun和Lee，2014)。JEV疫苗的成本效率也被认为是一个重要障碍(Impoinvil等，2013)。
就基于基因的免疫而言，慢病毒载体代表一个新型和有吸引力的平台。慢病毒载体有效转导非分裂树突细胞(DC)的能力允许延长经内源通路的抗原呈递，其进而翻译成诱导强烈的、多表位和持久的体液以及细胞免疫应答。因此，越来越多的临床前试验显示慢病毒载体在传染性疾病和抗肿瘤疫苗接种领域中的高疫苗功效(Beignon等，2009；Di Nunzio等，2012；Fontana等，2014；Grasso等，2013；Hu等，2011；Sakuma等，2012)。发明人先前证明整合和非整合的慢病毒载体都是有前途的疫苗接种载体，抵御虫媒病毒如西尼罗河病毒(WNV)，其属于黄病毒属的JE血清组(serocomplex)(Coutant等，2008；Iglesias等，2006)。这些报道首次证明慢病毒载体针对传染性病原引发保护性抗体应答的能力。实际上，用单次小剂量(single minute dose)的重组慢病毒TRIP载体免疫可在小鼠中赋予针对WNV致死攻击的有力消毒保护，所述载体表达可溶型WNV E蛋白(Coutant等，2008；Iglesias等，2006)。体液免疫在保护免受JEV感染中发挥关键作用(Konishi，2013；Dubischar-Kastner和Kanesan-Thasna，2012)，因此，引起保护性抗体应答对开发安全JEV疫苗重要(Larena等，2013)。
国际专利申请WO2005/111221涉及用于表达黄病毒蛋白的重组慢病毒载体以及其作为疫苗的应用。特别地，其描述重组慢病毒载体在制备免疫原性组合物中的应用以防止和/或治疗敏感物种的黄病毒感染，所述载体包括编码黄病毒科病毒的至少一种蛋白或所述蛋白的至少8个氨基酸的免疫原性肽的多核苷酸片段。
国际专利申请WO2007/052165涉及慢病毒载体在制备药物中的应用，所述载体包括编码抗原的异源核酸且其中抗原在动物细胞内的表达引发所述动物的体液应答，所述药物能在给所述动物施用时产生抗体。例如，抗原表达诱发保护性免疫抵御黄病毒，即WNV。
国际专利申请WO2009/019612涉及慢病毒基因转移载体和其医学应用。这些载体可用于引起免疫应答以防止或治疗发病状态(pathogenic state)，包括病毒感染、寄生虫和细菌感染或癌症。所述慢病毒载体能包括编码至少一种来源于黄病毒，例如来自JEV的抗原多肽的多核苷酸。
国际专利申请WO2005/06570涉及2个重组腺病毒(RAd)，即表达JEV的prM和膜锚定E蛋白(Ea)的RAdEa和表达JEV的prM和分泌性E蛋白(Es)的RAdEs。Kaur等(2002)描述了质粒pMEa和pMEs，其含有编码JEV的prM和所述Ea或Es的cDNA。
考虑持续需要疫苗提供保护性体液免疫应答抵御JEV感染，包括抵御多种JEV基因型，发明人设计了表达选定的JEV蛋白质的新型慢病毒载体，所述选定的蛋白质被证明引起保护性免疫应答抵御具有不同基因型的一种或多种JEV。所得结果显示表达JEV prM和E蛋白的重组TRIP载体可在接种疫苗的小鼠中引发并加强抗原特异性、体液、广泛中和性应答。
发明内容
本发明涉及重组慢病毒载体基因组，包含慢病毒顺式活性元件、Ψ包装信号、Rev响应元件(RRE)和DNA垂悬部分(flap)中心多嘌呤序列(cPPT)/中央终止序列(CTS)，以及编码日本脑炎病毒(JEV)膜前体(prM)蛋白和包膜(E)蛋白或其免疫原性片段的转录单位，所述顺式活性元件包括长末端重复(LTR)或修饰的LTR，包括部分缺失3’LTR中大部分U3区。另外，载体基因组可包括慢病毒来源的WPRE序列。
在本发明的一个优选实施方案中，所述慢病毒载体基因组所含的慢病毒序列涵盖以下顺式活性序列：HIV1-5’LTR(1-636位，如SEQ ID NO:26所示)，RRE(1301-1534位，如SEQID NO:27所示)，CPPT-CTS(2056-2179位，如SEQ ID NO:28所示)，WPRE(与prME编码多核苷酸重组的载体基因组中4916-5520位，或与prMEΔTM编码多核苷酸重组的载体基因组中4772-5376位，如SEQ ID NO:30所示)，HIV1-3’LTR(与prME编码多核苷酸重组的载体基因组中5605-5866位，或与prMEΔTM编码多核苷酸重组的载体基因组中5461-5722位，如SEQ ID NO:31所示)。有利的是，载体基因组没有编码慢病毒功能性结构蛋白的序列。
本文所用的术语“重组慢病毒载体基因组”指转入宿主细胞的多核苷酸构建体，所述转入是所述宿主细胞用与所述构建体重组的质粒(转移载体)转染的结果，或是宿主细胞用包含所述载体基因组作为其基因组的载体颗粒转导的结果。
根据本发明，表述“E蛋白”是指表达自JEV基因组的全长蛋白或糖蛋白，且还涵盖由其可溶形式组成的此蛋白或糖蛋白的变体，即通过缺失其2个跨膜(TM)结构域对全长蛋白修饰的蛋白/糖蛋白。因此，除非本申请另有说明，所公开的实施方案类似地关注全长蛋白/糖蛋白和可溶性蛋白/糖蛋白由。
“其免疫原性片段”指JEV的prM或E蛋白部分，其中所述部分包括B表位，当由本发明的重组慢病毒载体表达时，所述B表位引起抗体应答。
本发明还涉及由慢病毒顺式活性元件、Ψ包装信号、RRE和DNA垂悬部分cPPT/CTS，以及编码prM和E蛋白或其免疫原性片段的转录单位组成的重组慢病毒载体基因组，所述顺式活性元件包括LTR或修饰的LTR，包括部分缺失的3’LTR。
根据本发明，所述转录单位包括编码JEV 3型(例如JEV RP9株或JEV中山株)的所述蛋白质的多核苷酸。
在一个特定实施方案中，所述转录单位是基于编码prM或E蛋白的序列的密码子优化序列，其中进行密码子优化以提高这些JEV蛋白在哺乳动物宿主细胞，尤其是人细胞中的表达水平。技术人员了解如何就哺乳动物细胞表达来进行密码子优化，且本申请公开了密码子优化序列的特定示例。
在一个特定实施方案中，prM信号肽编码多核苷酸的自然和密码子优化的核苷酸序列以及本发明所用prM信号肽的氨基酸序列是分别如SEQ ID No:1、SEQ ID No:2和SEQID No:3所示的序列。
在一个特定实施方案中，全长prM蛋白编码多核苷酸的自然和密码子优化的核苷酸序列以及本发明所用全长prM蛋白的氨基酸序列是分别如SEQ ID No:4、SEQ ID No:5和SEQ ID No:6所示的序列。
在一个优选实施方案中，所述E蛋白是全长E蛋白。在另一实施方案中，所述E蛋白是可溶形式(sE或EΔTM)，缺乏全长E蛋白的2个C末端跨膜结构域。所得蛋白可以是在确定的宿主细胞中表达的糖蛋白。根据表达E蛋白的细胞，糖基化可不同。
在一个特定实施方案中，全长E蛋白编码多核苷酸的自然和密码子优化的核苷酸序列以及本发明全长E蛋白的氨基酸序列是分别如SEQ ID No:7、SEQ ID No:8和SEQ IDNo:9所示的序列。
在一个特定实施方案中，缺乏2个C末端跨膜结构域的可溶型全长E蛋白编码多核苷酸的自然和密码子优化的核苷酸序列以及本发明缺乏2个C末端跨膜结构域的可溶型全长E糖蛋白的氨基酸序列是分别如SEQ ID No:10、SEQ ID No:11和SEQ ID No:12所示的序列。
在一个特定实施方案中，第一跨膜结构域(TMD1)编码多核苷酸的自然和密码子优化的核苷酸序列以及E蛋白第一跨膜结构域(TMD1)的氨基酸序列是分别如SEQ ID No:13、SEQ ID No:14和SEQ ID No:15所示的序列。
在一个特定实施方案中，第二跨膜结构域(TMD2)编码多核苷酸的自然和密码子优化的核苷酸序列以及E蛋白第二跨膜结构域(TMD2)的氨基酸序列是分别如SEQ ID No:16、SEQ ID No:17和SEQ ID No:18所示的序列。
在一个特定实施方案中，所述prM蛋白编码多核苷酸具有SEQ ID NO:5序列且E蛋白编码多核苷酸具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11序列。
在一个特定实施方案中，prM蛋白和全长E蛋白(prM-E蛋白)编码多核苷酸的自然和密码子优化的核苷酸序列以及本发明prM-E蛋白的氨基酸序列是分别如SEQ ID No:19、SEQ ID No:20和SEQ ID No:21所示的序列。
在一个特定实施方案中，prM蛋白和缺乏2个C末端跨膜结构域的可溶型全长E蛋白(prMEΔTM蛋白)编码多核苷酸的自然和密码子优化的核苷酸序列以及本发明prM-缺乏2个C末端跨膜结构域的可溶型E蛋白(prMEΔTM蛋白)的氨基酸序列是分别如SEQ ID No:22、SEQID No:23和SEQ ID No:24所示的序列。
在本发明的一个优选实施方案中，所述prM蛋白和全长或可溶性E蛋白是基因3型JEV的那些。
在一个特定实施方案中，本发明涉及重组慢病毒载体基因组，其中提供prM和E蛋白的JEV是基因3型(G3)JEV，如RP-9株。
本文所用的术语“编码”定义当核酸分子置于表达控制序列(包括转录用启动子)下时，为了产物表达，所述分子转录和适当情况下翻译于选定细胞或细胞系中的能力。因此，本发明所述“编码多核苷酸”是指具有翻译成氨基酸序列的序列的核酸，且所述核酸可克隆到或置于表达控制序列，尤其是异源启动子的控制下以提供转录单位。
在一个特定实施方案中，本发明涉及重组慢病毒载体基因组，其能衍生自人类免疫缺陷病毒(HIV)例如HIV-1或HIV-2、山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、VISNA、猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫科动物免疫缺陷病毒(FIV)或牛科动物免疫缺陷病毒(BIV)。
在一个优选实施方案中，所述慢病毒载体基因组衍生自HIV尤其是HIV-1的基因组。
在另一个优选实施方案中，所述慢病毒载体基因组衍生自FIV的基因组。
本发明所述基于慢病毒的载体是置换型载体，意味着编码慢病毒蛋白的初始慢病毒基因组序列基本在载体基因组中缺失，导致缺乏来自亲本慢病毒的任何病毒蛋白表达。
根据另一个特定实施方案中，所述重组慢病毒载体基因组是复制缺陷型，这是因为缺乏任何慢病毒蛋白表达，即因为缺失慢病毒载体基因组所有或部分gag和pol基因或者慢病毒基因组gag和pol基因突变，从而gag和pol基因不能编码功能性GAG和POL蛋白。
本文所定义的载体基因组没有慢病毒结构基因或没有全部慢病毒结构基因的部分，从而防止来自其序列的结构蛋白表达。由此，载体基因组与DNA质粒重组时，是转移载体。
因此，载体基因组可以是置换型载体，其中所有在2个LTR之间的病毒蛋白编码序列缺失和被编码JEV多肽的重组多核苷酸取代，且其中重新插入元件与本文所述需要的顺式激活序列关联的DNA垂悬部分。联系颗粒制备公开涉及载体基因组组成的其它特征。
在一个优选实施方案中，所述载体基因组内，慢病毒载体基因组的3’LTR序列至少没有激活子(增强子)和没有U3区的启动子。在另一个特定实施方案中，所述3’LTR区没有U3区(ΔU3)。在此方面，参考WO 01/27300和WO 01/27304中的对应描述。
在一个特定实施方案中，载体基因组内，LTR 5’的U3区被非慢病毒U3或适合驱动tat非依赖性原发转录的启动子取代。此情况中，所述载体不依赖tat反式激活因子。
载体基因组还包括Ψ包装信号。包装信号包括编码gag ORF N末端片段(约15-30AA)的序列。在一个特定实施方案中，其序列能用移码突变或ATG起始密码子突变修饰以防止任何可能的gag肽转录/翻译干扰该转录单位的转录/翻译。
任选地，载体基因组还包括选自剪接供体位点(SD)、剪接受体位点(SA)和/或RRE的元件。
本发明所述基于慢病毒的载体是所谓基于TRIP的载体，涵盖本发明载体基因组和包括DNA垂悬部分。
用于制备本发明慢病毒载体的载体基因组的结构和组成是基于本领域所述原理和这类慢病毒载体示例，主要公开于(Zennou等，2000；Firat H.等，2002；VandenDriesscheT.等，2002)。例如，pTRIP[Δ]U3CMV-GFP以I-2330号保藏于CNCM的11.10.1999(InstitutPasteur,25-28Rue du Docteur Roux,75724,Paris Cedex 15,France)。还参考专利申请WO 99/55892、WO01/27300和WO 01/27304的公开内容，包括所保藏的生物材料。
DNA垂悬部分慢病毒来源的核苷酸序列包括2个必需区即cPPT和CTS区，其中cPPT和CTS区在含有其的DNA复制期间诱导三链DNA结构(之前定义于Zennou等,Cell,2000,101,173-185；和国际专利申请WO99/55892及WO01/27300)。
在一个特定实施方案中，所述DNA垂悬部分插入感兴趣多核苷酸上游，有利但不必需位于载体基因组的大致中心位置。适合本发明的DNA垂悬部分可获自慢病毒，尤其是人慢病毒。
或者，其可获自CAEV(山羊关节炎脑炎病毒)病毒、EIAV(马传染性贫血病毒)病毒、VISNA病毒、SIV(猴免疫缺陷病毒)病毒或FIV(猫科动物免疫缺陷病毒)病毒。DNA垂悬部分可合成制备(化学合成)或通过从上述合适来源扩增提供DNA垂悬部分的DNA，如通过聚合酶链式反应(PCR)。在一个更优选的实施方案中，所述DNA垂悬部分获自HIV逆转录病毒，例如HIV-1或HIV-2病毒，包括这2类的任何分离株。
如上所定义，本发明涉及重组慢病毒载体基因组，其进一步包括置于异源启动子(即启动子不衍生自提供顺式激活序列的慢病毒基因组)控制下的多核苷酸，从而提供转录单位。有利地，所述启动子可以是促进B细胞应答的启动子。特定启动子是具有SEQ ID NO:29序列的巨细胞病毒立早(immediate early)(CMVie)启动子。其它启动子可就其性质特定选择为组成型启动子、组织特异启动子或诱导型启动子。合适启动子的示例涵盖以下基因的启动子：EF1α、人PGK、PPI(前胰岛素原)、硫代糊精(thiodextrin)、铁蛋白L链或铁蛋白H链、凝乳酶β4、凝乳酶β10、半胱氨酸蛋白酶抑制剂核糖体蛋白L41、CAG、SV40或MND。
因此，在另一个更特定实施方案中，本发明涉及本文所定义的重组慢病毒载体，其基因组包括3’-LTR以及置于异源启动子控制下的编码prM和E蛋白的多核苷酸以形成转录单位，所述3’-LTR中U3区的启动子和激活子缺失。
因而所得的载体基因组与待用作转移载体的质粒载体重组或克隆于其中。
由此，在一个特定实施方案中，本发明涉及重组慢病毒载体，其是基于TRIP的载体。
在本发明的一个特定实施方案中，所述基因组载体因而作为本文所公开pTRIP质粒提供，其是基于HIV1的载体，包括如上和Iglesias,M.C等(J.Gene Med.,2006,8:265-274)定义的DNA垂悬部分序列。
在本发明的另一个特定实施方案中，所述基因组载体作为pTRIP质粒提供，其是基于FIV的载体，包括由FIV产生的DNA-Flap序列。
优选地，本发明涉及重组慢病毒转移载体pTRIPΔU3.CMV，其中编码JEV prM和E蛋白(全长或可溶性E，sE)的多核苷酸被克隆，并涉及用其获得的重组慢病毒载体颗粒。
在一个特定实施方案中，本发明涉及重组慢病毒转移载体pTRIPΔU3.CMV/JEV.prME载体，其重组慢病毒主干具有如SEQ ID NO:34所定义核酸序列，并涉及用其获得的重组慢病毒载体颗粒。
在另一个特定实施方案中，本发明涉及重组慢病毒转移载体pTRIPΔU3.CMV/JEV.prMEΔTM载体，其重组慢病毒主干具有如SEQ ID NO:35所定义核酸序列，并涉及用其获得的重组慢病毒载体颗粒。
在一个特定实施方案中，上述用于制备本发明重组慢病毒载体基因组的构建体内，转移载体的CMV启动子被上面列表公开中的启动子取代。
本发明还涉及含本发明重组慢病毒载体基因组的DNA质粒。
本发明还涉及用DNA质粒转染或遗传转化的宿主细胞，所述质粒包括本发明的重组慢病毒载体基因组(转移载体)。
本发明还涉及用本发明的重组慢病毒转移载体和额外的质粒载体转染或遗传转化的宿主细胞，所述额外的质粒载体用于包装和表达包膜以进行假型化。
本发明的宿主细胞用这些载体转染，通过本领域技术人员熟知的方法，即通过化学转染(磷酸钙、lipofectamine)、基于脂质的技术(脂质体)、电穿孔、光致穿孔(photoporation)……
本文所用的术语“转染”指包含本发明的重组慢病毒转移载体的细胞(瞬时表达)，而术语“遗传转化”指其基因组由本发明多核苷酸明确修饰的细胞(永久表达)。
所述瞬时或稳定转化细胞可以是任何原核(细菌)或真核(酵母、昆虫或包括哺乳动物尤其是人在内的动物)细胞。在一个实施方案中，细胞是非人细胞。在一个特定实施方案中，本发明细胞是分离的人细胞，“分离”指在其天然环境外。
在本发明的一个特定实施方案中，所述细胞是HEK 293T(人胚肾)细胞系，具体公开于Zennou等(Cell,2000,101,173-185)。
用于表达慢病毒载体颗粒的生产细胞转染或遗传转化有本发明所述DNA质粒和编码异源包膜蛋白的DNA质粒，特别是选自VSV-G印第安纳株和VSV-G新泽西株的VSV包膜蛋白，以及包装构建体作为编码慢病毒GAG和POL蛋白的DNA质粒。编码POL蛋白的基因可突变从而能制备非整合慢病毒载体。
本发明还涉及用本文所公开转移载体获得的重组慢病毒载体颗粒，尤其是pTRIPΔU3.CMV/JEV.prME载体和pTRIPΔU3.CMV/JEV.prMEΔTM载体，并根据熟知方法产生且其用至少一种另外病毒包膜蛋白进行假型化。
表述“重组慢病毒载体”或“重组慢病毒载体颗粒”定义在质粒载体转染后宿主细胞或生产细胞中表达的所得病毒样颗粒(VLP)，所述质粒载体由转移载体、编码选定包膜蛋白的包膜载体和根据本领域熟知方法反式提供慢病毒蛋白(如慢病毒GAG和POL蛋白，特别是突变的POL蛋白以防止整合)的包装载体组成。
术语“重组慢病毒载体颗粒”涵盖重组病毒颗粒和重组病毒样颗粒。
病毒样颗粒由呈现用于重组慢病毒基因组衣壳化的蛋白不完整组装产生，其采用的方式不能形成真病毒颗粒。
本发明的慢病毒载体颗粒通过将本发明的慢病毒载体转导入细胞来形成。这些颗粒包含与E蛋白非共价相联的prM多聚体，对应于前体prM.E通过内质网的酶(信号肽酶)变成prM和E的切割产物，在prM/M蛋白最后15个氨基酸的水平切割，即VVFTILLLLVAPAYS，其氨基酸序列如SEQ ID NO:25所定义。
在本发明的另一实施方案中，所述慢病毒载体颗粒表达prM和sE蛋白。
与Iglesias M.C.等(2006)所公开的不同，发明人观察到JEV E蛋白通过慢病毒载体颗粒的表达在接受该颗粒的宿主中未有效诱导抗体应答。相反，其在E蛋白与prM蛋白共表达时获得有效抗体应答。相较于用编码prMEΔTM的慢病毒载体颗粒所得结果，用编码prME的慢病毒载体颗粒获得更高的抗体应答。
所述假型化包膜蛋白可以是水泡性口炎病毒糖蛋白G(VSV-G)，其是作为野生型病毒颗粒表面外壳的跨膜蛋白。其也是工程化的慢病毒载体的常见外壳蛋白。印第安纳水泡性口炎病毒(VSV-G IND)和新泽西水泡性口炎病毒(VSV-NJV)是优选的病毒以对本发明的慢病毒载体基因组进行假型化。其VSV-G蛋白公开于Genbank，其中呈现数个毒株。对于VSV-G新泽西株，特别参考具有登录号V01214的序列。其它菌株如伊斯法罕、VSV-G CV、Cocal能替代使用。
最优选的VSV-G是印第安纳水泡性口炎病毒(VSV-G IND)，Genbank登录号为AAA48370.1，对应于菌株JO2428。
根据本发明的另一特定实施方案，所述重组慢病毒载体颗粒是整合缺陷型(或非整合)，这由提供包装构建体的质粒载体上所存在慢病毒的pol基因突变或缺失引起。能形成整合缺陷型颗粒的合适突变为本领域熟知并阐述于WO 2009/019612。
在一个特定实施方案，所述重组慢病毒载体颗粒用作哺乳动物中预防性治疗抵御JEV感染的活性成分，所述哺乳动物是动物或人。
本文所用的术语“动物”指脊椎动物宿主，优选家畜和耕畜。用本发明重组慢病毒颗粒治疗的优选动物候选是猪尤其是家猪，鸟尤其是鹭科鸟以及马。目标动物的非详尽列表包括非鸟类脊椎动物、家禽、驴、牛(包括多种牛科动物)、绵羊(ovins)、山羊(caprins)、绵羊(sheep)、山羊(goat)、野生哺乳动物、爬行动物、两栖动物、鸡、鸭、鹅、火鸡、兔、啮齿动物(包括仓鼠、大鼠和小鼠)、宠物(包括狗和猫)……
在最优选的实施方案中，所述动物是猪或小猪，特别是家猪或家养小猪。
在另一个特定实施方案中，所述重组慢病毒载体颗粒用作活性成分并以单一剂量或多剂量施用，适于引发针对JEV prM和/或E蛋白的抗体应答，尤其是针对JEV prM和/或E蛋白的保护性抗体应答。
更具体地，所述重组慢病毒载体颗粒用作哺乳动物中预防性治疗抵御JEV感染的活性成分，所述哺乳动物是动物或人，其中治疗包括以初免-加强方案施用所述重组慢病毒载体。
优选地，用于初次引发免疫应答的所述慢病毒载体颗粒和加强该应答的慢病毒载体颗粒通过上述不同的非交叉反应VSV-G包膜蛋白进行假型化，特别是用印第安纳VSV株的VSV-G蛋白或新泽西VSV株的VSV-G蛋白进行假型化。
在一个特定实施方案中，所述重组慢病毒载体颗粒用于预防性治疗抵御基因型G3JEV感染。
在另一个实施方案中，所述重组慢病毒载体颗粒用于预防性治疗抵御基因型G1和G3或基因型G1、G3和G5JEV感染。
在一个特定实施方案中，本发明的重组慢病毒载体颗粒引起针对多个JEV基因型的中和性抗体，尤其是针对基因型G1和G3或基因型G1、G3和G5JEV。
本发明的重组慢病毒载体颗粒用于制备免疫用的免疫原性组合物，尤其是哺乳动物宿主中的预防性免疫抵御JEV感染，特别是人或动物宿主。
在一个特定实施方案中，本发明的重组慢病毒载体颗粒在乳动物宿主中引起保护性体液免疫应答抵御JEV感染，特别是人或动物宿主，即引起保护性抗体应答抵御JEV感染，尤其是引起宿主中的中和性抗体。
尽管由于众所周知的原因，尚未在人类中观察此免疫应答，但动物宿主的公开结果高度支持对人有类似的预期。
因此，本发明的特定慢病毒载体颗粒提供针对JEV预防性疫苗接种的特异性感兴趣的选物。
另一方面，本发明涉及含本发明所述重组慢病毒载体颗粒的免疫原性组合物，剂量足以引发免疫抗体应答，其包括或不包括辅助佐剂。
表述“免疫原性组合物”指含至少本发明慢病毒载体颗粒作为有效成分的组合物，给宿主，尤其是哺乳动物宿主，特别是人或动物宿主施用所述组合物适合。用于全身或局部施用时，此组合物可进一步包括药学上合适的赋形剂或载体和/或载剂。“药学上可接受载体”指无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或任何常规类型的制剂辅助成分。“药学上可接受载体”在所用剂量和浓度对受体无毒并与制剂其它成分相容；合适的载体包括但不限于磷酸盐缓冲盐溶液、蒸馏水、乳液如油/水乳液、多种类型的润湿剂无菌溶液等、右旋糖、甘油、盐水、乙醇，和其组合。
在本发明的一个优选实施方案中，所述免疫原性组合物采用冷冻干燥形式，冷冻干燥在冷冻保护性化合物如海藻糖存在的情况下完成(Bieganski等.Biotechnol Prog,1998,14,615-620)。
本发明的免疫原性组合物具有引起免疫应答的能力，即宿主免疫系统针对所述至少一种多肽(由所述转录单元编码)的任何应答，尤其是引起抗体应答。本发明的整合缺陷型慢病毒载体还显示其在宿主中引起抗体的能力。
如本文所定义，免疫应答涵盖由所述组合物引发的体液应答即抗体，其针对由慢病毒载体基因组表达的所述至少一种JEV多肽而产生。在一个特定实施方案中，所述体液应答是保护性体液应答。保护性体液应答主要产生成熟的抗体，对其抗原有高亲和性，如IgG。在一个特定实施方案中，保护性体液应答诱导中和性抗体产生。
在本发明的一个特定实施方案中，尽管有缺陷型整合酶，本发明的慢病毒载体基因组能引发早期免疫应答，特别是诱导抗体应答。表述“早期免疫应答”指在“加强”施用组合物后约一周内赋予的保护性免疫应答(针对JEV感染的保护)。
在另一实施方案中，由本发明组合物赋予的免疫应答是持久性免疫应答，即所述免疫应答在组合物施用后至少2个月仍能检测到，优选至少3个月且最优选至少6个月。当免疫应答是体液免疫应答时，可以通过任何合适方法如ELISA、免疫荧光(IFA)、病灶减少中和试验(FRNT)、免疫沉淀或蛋白质印迹检测特异性抗体显示持久性应答。
在另一实施方案中，独立于上面的实施方案，由本发明组合物赋予的免疫应答强度取决于慢病毒载体的注射剂量。
有趣的是，用非整合基因转移载体在单次初免-加强施用本发明组合物后引发所述免疫应答、早期免疫应答和/或持久性免疫应答。
本发明还涉及含本发明所述重组慢病毒载体颗粒的疫苗组合物，其表达所定义的JEV蛋白，包括或不包括辅助佐剂。
认为本发明组合物(尤其是本文定义的重组慢病毒载体基因组或本发明的重组慢病毒载体颗粒)在JEV攻击经免疫宿主后具有抵御JEV感染的保护能力，能延迟和/或减弱所述JEV感染后通常引起的症状，通过施用本发明组合物来寻求针对该感染的保护，或特别是当JEV感染延迟时。
根据本发明的一个特定实施方案，所述免疫原性组合物配制用于经胃肠外途径施用，如皮下(s.c.)、皮内(i.d.)、肌肉内(i.m.)、腹膜内(i.p.)或静脉内(i.v.)注射。
最优选的施用是肌肉内(i.m.)注射。
根据本发明的另一个特定实施方案，所述免疫原性组合物配制用于以一个或多个施用剂量施用，尤其是初免-加强施用方案。
本文所用的术语“初免-加强方案”涵盖引起免疫应答的第一施用步骤和加强免疫应答的一个或多个后续施用步骤。
因此，有效的初免-加强系统能用于迭代施用，能在宿主内连续初次引发和加强免疫应答，特别是在需要其的宿主中注射后。“迭代”意味着给宿主施用2次或更多的有效成分即本发明的重组慢病毒颗粒。初免和加强免疫能以不同或相同剂量给予宿主，注射可以数周间隔给予，尤其是4周或更长的间隔。
在一个特定实施方案中，所述免疫原性组合物不包括辅助佐剂。
待施用的量(剂量)取决于待治疗对象，包括患者状况、个体免疫系统状态、施用途径和宿主尺寸。合适的剂量范围从103TU(转录单位)到107TU，且能由本领域技术人员视情况改良。
优选地，免疫原性组合物以一个施用剂量施用，包括等于0.5ng-5000ng的本发明重组慢病毒载体颗粒剂量，优选0.5ng-50ng，更优选50-500ng。
本发明还涉及免疫学有效量的本发明所述重组慢病毒载体颗粒或本发明所述免疫原性组合物或本发明所述疫苗组合物，用于在哺乳动物宿主特别是人或动物宿主中预防性免疫抵御JEV感染，尤其是当JEV为基因3型或1型或5型时，其中所述颗粒或组合物与药学上可接受载剂和/或佐剂混合。
本发明还涉及在哺乳动物宿主特别是人或动物宿主中免于JEV感染的方法，包括给予药学上有效量的本发明所述重组慢病毒载体颗粒或本发明所述免疫原性组合物或本发明所述疫苗组合物，其中所述颗粒或组合物与药学上可接受载剂和/或佐剂混合。
本文所用的表述“用于免于JEV感染”指阻碍或延迟日本脑炎病毒感染的方法，特别是当伴随感染或其之后的症状减弱、延迟或缓解时或当感染病毒从宿主中清除时。
本文所定义的“药学上可接受载剂”涵盖组合物内能配制本发明所述重组慢病毒载体的任何物质。载剂是生理上可接受的任何物质或物质组合，即适合其用于接触宿主，特别是人，并且因此是无毒的。这类载剂示例是磷酸盐缓冲盐溶液、蒸馏水、乳液如油/水乳液、多种类型的润湿剂无菌溶液等。当免疫原性组合物采用冻干形式时，这类载剂还包括冷冻保护性化合物如海藻糖。
例如，本文所定义的“佐剂”包括脂质体、油相如弗氏类型佐剂，常用于带水相的乳液或能包括水不溶性无机盐如氢氧化铝、硫酸锌、胶态氢氧化铁、磷酸钙或氯化钙。
本发明还涉及产生适于制备JEV疫苗的重组慢病毒载体颗粒的方法，包括以下步骤或由以下步骤组成：
a)在宿主细胞如HEK-293T细胞系中转染重组慢病毒转移载体，所述载体携带本发明所述慢病毒载体基因组；
b)用编码包膜蛋白VSG尤其是印第安纳或新泽西VSV株的VSV-G的质粒载体以及编码慢病毒GAG和POL或突变的POL蛋白的作为包装构建体的质粒载体共转染步骤a)的细胞；
c)回收表达JEV抗原的重组慢病毒颗粒。
本发明还涉及本发明所述重组慢病毒载体基因组或本发明所述重组慢病毒载体颗粒作为活性成分用于体外产生免疫原性组合物或疫苗组合物。
本发明的其它特征和优势通过下面的实施例显而易见并且也在附图中阐述。
附图简要说明
图1.TRIP/JEV载体的构建策略。构建TRIP/JEV载体的2种策略的示意图。在顶部，来自JEV(带prM和E基因)的基因组RNA组成的示意图。编码来自G3JEV RP-9株的prM和E的密码子优化序列克隆到TRIP慢病毒载体内，在人巨细胞病毒立早启动子(CMVie)控制下。TRIP/JEV.prME载体包括prM的信号肽序列(SP)，然后是G3JEV RP-9株的完整prM和E基因区。TRIP/prMEΔTM载体包括同一JEV序列，除了E缺失其2个跨膜结构域TMD1和TMD2。
图2.通过TRIP/JEV载体表达来自JEV的重组prM和E。在TRIP/JEV-转导的293T细胞中检测重组JEV prM和E蛋白。(A)所转导的细胞的免疫荧光分析，用抗E mAb 4G2作为一抗。(B、C)来自放射免疫沉淀试验(RIPA)细胞裂解物(B)或用TRIP/JE或TRIP/GFP载体转导的细胞上清(C)的prM和E的免疫沉淀分析。(B)中，胞内prM和E用针对JEV RP-9株的小鼠多克隆血清(JEV抗血清)检测。(B)中，来自转导细胞上清的JEV E和prM分别用mAb 4G2或针对JEVRP-9株的小鼠多克隆血清(JEV抗血清)检测。(C)中，JEV VLP浓缩自TRIP/JE载体转导细胞的上清并用抗E mAb 4G2和JEV抗血清免疫印迹来分析。TRIP/GFP用作阴性对照。对应prM、E或EΔTM和钙联蛋白(CNX)的带用箭头指示到印迹右侧。
图3.通过抗TRIP/JEV抗体识别JEV prM和E。来自用JEV RP-9株(JEV)感染的或模拟感染的(mi.)Vero细胞的溶于RIPA缓冲液的细胞裂解物用来自Balb/c小鼠的合并的(pooled)免疫血清(抗血清)通过免疫印迹试验测试，所述小鼠用5log10TU的TRIP/JEV.prME或TRIP/JEV.prMEΔTM载体接种两次。在加强接种后3周收集TRIP/JEV抗血清。针对JEV RP-9株的小鼠多克隆血清(JEV抗血清)用作阳性对照。对应JEV E、NS1/NS1’和prM蛋白的带用箭头指示印迹左侧。
图4.嵌合的活JEV的构建策略和其通过抗TRIP/JEV血清的识别。(A)嵌合JEV的示意图，其中来自JEV G3(病毒株RP-9)的结构蛋白区被来自JEV G1(病毒株CNS_Laos_2009)或G5(病毒株XZ0934)的对应物取代。所得嵌合的JEV G1/3和G5/3在JEV G3中分别纳入来自JEV G1或G5的C、prM和E编码序列。亲本设计成JEV G3/3。(B、C)通过JEV抗血清(左)或TRIP/JEV抗血清(右)识别嵌合JEV蛋白。来自Vero细胞的溶于RIPA缓冲液的细胞裂解物通过用所示抗体免疫印迹来分析，所述细胞用亲本JEV G3(G3/3)、嵌合的JEV G1/3和G5/3感染或模拟感染(mi.)。抗JEV.NS5(NS5)和抗钙联蛋白(CNX)抗体用于标准化蛋白表达水平。
图5.被动转移TRIP/JEV抗血清后的体内保护。3周龄C56Bl/6小鼠组i.p.接种含0.01ml合并的免疫血清的0.1ml DPBS，所述血清收集自JEV感染的小鼠(JEV G3抗血清)或加强后2个月的TRIP/JEV接种的小鼠。接种DPBS(PBS)的小鼠用作组对照。一天后，小鼠i.p.接种5log10的TU JEV RP-9株并观察死亡率。记录20天的存活。灰盒告知生病小鼠数目。黑盒告知未能撑过病毒性脑炎的小鼠数目。
图6.产生和鉴定JEV报告病毒颗粒(RVP)。
A.产生诱导型JEV复制子细胞系。前述JEV-RP9(g3)复制子表达海肾萤光素酶报告蛋白(reporter)取代JEV结构蛋白(Chien H-L等.2011.J Virol85:4698–4706)，修饰该复制子从而能用Tet-ExpressTM诱导复制子RNA表达。HEK293T细胞用此JEV复制子稳定转化。海肾萤光素酶信号用作复制子RNA稳态积累的标记物，在稳定JEV复制子细胞诱导后4、24、48和72h测量。发明人观察到信号从24到72h递增，对应于输入RNA的复制。显示n>3个重复的代表性实验。
B.产生JEV RVP。为产生RVP，JEV复制子细胞系转染有编码JEV结构基因的JEV质粒，在Tet-ExpressTM诱导型启动子控制下。诱导JEV复制子和结构基因的表达，在诱导后24、48和72h收集含RVP的上清。未转染有JEV结构基因的细胞上清用作对照。成功的RVP产生用感染性测定检测，其中BHK21细胞用200μl上清感染并在感染后24h分析海肾表达。RVP的产生峰值在诱导后48h获得。显示n>3个重复的代表性实验。RLU，海肾光度单位。
C.和D.产生和鉴定JEV g3及g5RVP。用表达JEV g3或JEV g5结构基因的质粒转染JEV复制子细胞。RVP的合成和生产在诱导后48h分析。显示n>3个重复的代表性实验。C.细胞裂解物通过蛋白质印迹分析JEV E且钙联蛋白(CNX)作为加样对照。胞内JEV g5E积聚低于就JEV g3蛋白所观察到的。纯化上清中释放的RVP并用JEV E抗体(胞外)通过蛋白质印迹分析。JEV g5RVP的产生显著低于JEV g3RVP的产生。D.培养物上清中的RVP含量还通过定量复制子RNA来分析。如就病毒蛋白积聚所观察，JEV g5RVP上清中的复制子RNA比JEV g3RVP上清少很多。连同获自对应感染性测定(如B.所述)的值，对复制子RNA水平的定量绘图。尽管JEV g5RVP产量减少，所产生的颗粒表现为能作为JEV g3RVP进入新细胞。
图7.JEV g3或g5RVP用连续稀释的血清孵育，所述血清在20天收集自接种有1000ffu JEV g3(左)或JEV g5(右)的小鼠。收集自3只单独小鼠的血清用于各实验且收集自DPBS注射小鼠的血清用作对照。孵育后，RVP用于感染BHK21细胞。胞内海肾萤光素酶活性在感染后24h定量，作为成功RVP进入的量度。感染性作为用对照血清所得海肾萤光素酶活性的函数进行测量。收集自JEV接种的小鼠的血清有效抑制RVP进入。
图8.用TRIP/JEV.prME免疫的小猪的抗JEV IgG应答。(A)中，2组4只小猪用6(低剂量)或7log10TU(高剂量)TRIP/JEV.prME肌肉内免疫。作为对照，2只动物接种低或高剂量TRIP/GFP。动物在用同一初始剂量(垂直箭头)初次免疫后4周加强。血清样品每周收集并以1:400稀释度通过间接ELISA检测抗JEV E IgG的存在。(B)中，一组3只动物实验性感染JEV中山株。免疫血清以1:400稀释度通过间接ELISA检测抗JEV E IgG的存在。(C、D)中，描绘来自低(C)或高(D)剂量TRIP/JEV.prME免疫后1-10周的抗JEV E IgG1/IgG2的盒型图。垂直箭头指示加强。(E)中，JEV中山株感染小猪的免疫血清中的抗JEV E IgG1/IgG2水平。
图9.用TRIP/JEV.prME免疫的小猪的中和性抗体应答。针对抵御JEV的中和能力，通过PRNT50检测低或高剂量TRIP/JEV.prME免疫的小猪血清。(A)中，针对JEV G3RP-9株，检测在免疫前、初免后3周或加强后6周收集的小猪血清。(B)中，针对抵御JEV G1和G3株以及JEV嵌合G5/G3的交叉中和能力，检测在加强后收集的TRIP/JEV.prME抗血清。(C)中，针对JEV G1、G3以及JEV嵌合G5/G3，通过PRNT50检测实验性感染JEV G3中山株的动物内的抗JEV抗体的中和活性。
实施例
材料与方法
细胞和抗体
白纹伊蚊(Mosquito Aedes albopictus)C6/36细胞在28℃维持于补充有10％热灭活胎牛血清(FBS)的Leibovitz培养基(L15)。非洲绿猴肾源性Vero细胞在37℃维持于补充有5％FBS的达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)。人成神经细胞瘤源性SK-N-SH和人肾源性HEK-293T细胞维持于补充有10％FBS的DMEM。
高度纯化的抗泛黄病毒(pan flavivirus)E单克隆抗体(mAb)4G2由RD Biotech(France)生产。小鼠mAb抗JEV NS5如前所述(Katoh等.2011)。针对钙联蛋白和的抗体分别购自Enzo Life Sciences和New England Biolabs。辣根过氧化物酶(HRP)-缀合的山羊抗小鼠IgG和抗兔IgG抗体获自Bio-Rad Laboratories。HRP-缀合的山羊抗猪抗体获自Bethyl Laboratories。Alexa Fluor-缀合的山羊抗小鼠IgG抗体获自Jackson ImmunoResearch。
产生活的嵌合JEV
用于本研究的JEV G3RP-9株(Chen等，1996；Lin等，1996)的分子克隆pBR322(CMV)-JEV-RP-9如前所述(Liang等，2009)。JEV G3中山株获自国家致病性病毒中心(NCPV,Salisbury,UK)并在Vero细胞中传代2次。用于产生嵌合活JEV的质粒构建在他处详述。简言之，在2208-2213位(病毒多蛋白的残基705和706)产生独特限制性位点(Afl II)的沉默突变通过PCR诱变直接引入pBR322(CMV)-JEV-RP-9。所得pBR322(CMV)-JEV-RP-9(Afl II)质粒用作模板产生嵌合JEV。对应于114-2213核苷酸且侧翼有独特位点Apa I和Afl II的片段用JEV G1株CNS769_老挝_2009(Genbank登录号KC196115)或JEVG5株XZ0934(Genbank登录号JF915894)(Li等，2011)的片段取代，JEV G1株CNS769_老挝_2009的片段对应于切除自JEV cDNA的115-2214区(Aubry等，2013)，JEVG5株XZ0934的片段对应于获自合成基因的114-2213区(Genecust)。所得质粒具有JEV G3骨架，其中结构区被衍生自JEV G1或G5的对应物取代。为产生活JEV，重组分子克隆pBR322(CMV)-JEV-G1/3和pBR322(CMV)-JEV-G5/3用Lipofectamine 2000(Life Technologies)转染入HEK-293T细胞。转染后3天，收集病毒上清并用于感染C6/36细胞以培养嵌合JEV G1/3和JEV G5/3的终储液。通过提取病毒RNA，然后反转录PCR并测序核实其序列。
产生重组慢病毒载体
为构建表达JEV蛋白的重组慢病毒载体，用合成基因(Genecust)对JEV G3株RP-9初始序列进行修饰，所述修饰优化哺乳动物细胞中的prM和E基因表达。将编码prM信号肽(之后是prM和E糖蛋白)的哺乳动物密码子优化序列克隆到pTRIPΔU3CMV质粒的BamH1和Xho1限制性位点，以产生pTRIPΔU3CMV/JEVprME。优化序列通过诱变PCR进一步修饰以产生TRIPΔU3CMV/JEVprMEΔTM，其包含编码prM和缺失其2个跨膜结构域的E(EΔTM)的基因。
如前所述，慢病毒颗粒通过瞬时钙共转染293T细胞来产生(Zennou等，2000)，但采用以下修改：转染后24小时，细胞培养培养基用无血清DMEM(Dulbecco)取代。在转染后48小时收集上清，通过数轮低速离心澄清并在-20℃储存。重组慢病毒载体用印第安纳(IND)或新泽西(NJ)血清型的VSV-G包膜蛋白进行假型化(Beignon等，2009)。在所得载体TRIP/JEV.prME和TRIP/JEV.prMEΔTM中，CMV立早启动子(CMVie)驱动重组JEV蛋白的组成型表达。通过对来自转导的293T细胞的细胞裂解物进行实时PCR确定TRIP/JEV载体储液的效价，并表示为转导单位(TU)/ml(Iglesias等，2006)。带有IND或NJ VSV.G包膜蛋白的非浓缩TRIP/JEV.prM载体效价分别是6.69 106TU/ml和1.78 106TU/ml。带有IND或NJ VSV.G包膜蛋白的TRIP/JEV.prMEΔTM载体效价分别是1.26 107TU/ml和1.76 106TU/ml。疫苗储液通过PBS稀释调整，并接种于小鼠或猪而无需进一步浓缩。
测量病毒效价的病灶免疫试验
将Vero细胞接种于24孔板。10倍稀释的不同样品在DMEM中一式二份制备，向细胞加入200μl的各稀释液。板在37℃孵育1小时。移出未吸附的病毒，之后向各孔加入1mlDMEM，DMEM补充有1.6％羧甲基纤维素(CMC)、10mM HEPES缓冲液、72mM碳酸氢钠和2％FBS，然后在37℃孵育2天。吸出CMC覆盖，细胞用PBS洗涤并用4％多聚甲醛固定15分钟，然后是0.1％Triton-X100透化5分钟。固定后，细胞用PBS洗涤并用抗E mAb 4G2室温孵育1小时，之后是HRP-缀合抗小鼠IgG抗体孵育。板用VIP过氧物酶底物试剂盒(VectorLaboratories)根据厂商说明显影。
产生JEV抗原
以感染复数或模拟感染用JEV接种大瓶的Vero细胞单层。收获用JEV(JEV抗原)感染的或模拟感染(正常细胞抗原或NCA)的细胞的上清液并澄清。
上清用7％w/v PEG 6,000(Fluka)沉淀，离心，病毒团块悬于冷PBS用于JEV灭活，所述PBS补充有溶于0.1M Sorensen缓冲液(pH 9.0)的0.1％β-丙内酯。灭活JEV抗原的工作稀释度(1:200)在“内部”间接ELISA基础上估计，使用完善的人阳性JEV血清样品和已验证的JEV抗原。
为纯化重组JEV VLP，来自TRIP/JEV转导的细胞的上清通过在4℃3,000g离心5分钟来澄清，加样到蔗糖垫层溶液(cushion)(含15％蔗糖的10mM Tris-HCl[pH 7.5],2.5mMEDTA,50mM NaCl)上，随后在4℃100,000g离心2.5小时。离心后，团块悬于50μl冷TNE缓冲液并通过免疫印迹试验分析。
在果蝇(Drosophila)S2细胞中产生重组病毒抗原需要表达系统(LifeTechnologies)。将编码prM和之后来自JEV G3株SA-14的EΔTM(Genbank登录号M55506)的合成基因克隆到穿梭质粒载体pMT/BiP/SNAP，这是衍生的pMT/BiP/V5-His载体(LifeTechnologies)，其中SNAP-标签序列(Covalys BioSciences AG)已框内插入昆虫BiP信号肽(未发表数据)。所得质粒pMT/BiP/JEV.prMEΔTM-SNAP编码prM，然后是与N末端融合的EΔTM。编码JEV G1株JaNAr0102/日本/2002/蚊子(Genbank登录号AY377577)、JEVG3株GP05(Genbank登录号FJ979830)和JEV G5株10-1827(Genbank登录号JN587258)的E蛋白结构域III(EDIII)的合成基因在质粒pMT/BiP/SNAP中框内融合SNAP-标签C末端。所得质粒pMT/BiP/JEV.prMEΔTM-SNAP和pMT/BiP/SNAP-JEV.EDIII根据厂商推荐(LifeTechnologies)转染入S2细胞以建立用于G1、G3及G5的稳定细胞系S2/JEV.prMEΔTM-SNAP和S2/SNAP-JEV.EDIII。镉诱导S2/JEV.prMEΔTM-SNAP和S2/SNAP-JEV.EDIII细胞系10天后，分泌的可溶性带His标签嵌合蛋白在螯合柱色谱和随后的Superdex柱上纯化。经纯化嵌合蛋白EΔTM-SNAP蛋白和SNAP-JEV.EDIII蛋白的蛋白估算用BCA蛋白检测试剂盒(赛默科技(Thermo Scientific))测定。重组SNAP蛋白用作阴性抗原对照。
免疫检测病毒蛋白
对于免疫印迹试验，将蛋白样品应用于Bis-Tris 4-12％胶(LifeTechnologies)，然后电印到PDVF膜上。蛋白用适当稀释的单克隆一抗或小鼠多克隆免疫血清探测。PBS-吐温(Tween)洗涤后，膜用HRP缀合二抗孵育。反应用PierceTMECL蛋白质印迹底物(Thermo Scientific)检测。
对于免疫荧光试验，细胞用溶于PBS的3.2％多聚甲醛固定并用溶于PBS的0.1％Triton X-100透化。JEV E蛋白用mAb 4G2检测，然后用AlexaFluor488缀合的二抗孵育。盖玻片装有带DAPI的Gold抗淬灭试剂(Life Technologies)。载玻片用荧光显微镜(Axioplan 2Imaging,蔡司(Zeiss))检测。
小鼠免疫和攻击
6周龄雌性Balb/c小鼠在无病原体条件下饲养于巴斯德研究所动物设施内。方案和后续实验得到巴斯德研究所的动物实验控制伦理委员会(CETEA)的伦理批准并根据法国规章向高等教育暨研究部(n°000762.1)申报。
实验遵循巴斯德研究所实验动物护理办公室指南进行。小鼠组腹膜内(i.p.)接种溶于0.1ml补充有0.2％无内毒素血清白蛋白的DPBS的重组慢病毒载体。免疫的小鼠通过通过眶后窦水平穿刺来放血。各接种有重组慢病毒载体的小鼠组内存在极低的个体变异性，证明可以在后续实验中的应用合并的血清(Iglesias等，2006)。对于被动血清保护实验，合并的免疫血清在JEV株RP-9攻击前一天通过i.p.途径转入3周龄C57/Bl6小鼠。监测受攻击小鼠的病态迹象和死亡。对显示病毒性脑炎症状的动物实施安乐死。小猪免疫和攻击，如deWispelaere等，PLOS Negl.Trop.Dis.2015所述
猪实验遵循瑞士动物福利条例(LANAT兽医服务)的指导进行。
来自内部繁殖的7周龄无特定病原体的瑞士地方品种小猪以组饲养，且在开始实验前给予一周的新环境适应时间。
对于免疫，TRIP/JEV.prME慢病毒载体用PBS(Life Technologies)稀释成0.5ml终体积。TRIP/GFP慢病毒载体免疫用作阴性对照(Iglesias等，2006)。5只小猪的组中，4只用不同剂量的TRIP/JEV.prME载体肌肉内接种疫苗且1只注射等剂量的对照慢病毒载体TRIP/GFP。所免疫的动物在第一次免疫接种前放血，随后每周放血直至实验结束。第一次免疫接种后4周，所有动物进行加强免疫接种，所用重组慢病毒载体的剂量与第一时间点相同。出于伦理原因，作为猪中的保护，没有进行致死攻击。作为对照，3只动物通过口鼻途径接种7log10TCID50的活JEV中山G3。所有猪发展出暂时性发烧和病毒血症，并在4-6天后完全恢复。每周检测动物血清的抗JEV抗体。
通过间接ELISA和中和试验检测抗体
间接ELISA测量免疫小鼠和小猪中的抗JEV IgG产生。96孔ELISA板(Nunc)在4℃过夜包被0.1ml灭活的天然JEV抗原或高纯重组JEV抗原，所述抗原以1μg.mL-1浓度稀释于PBS。NCA和SNAP用作阴性对照抗原。洗涤后，板用2倍连续稀释的合并的血清样品(从1:100稀释开始)孵育，然后用1:10,000稀释的HRP缀合抗小鼠IgG抗体孵育。加入TMB底物后，在450nm测量吸光度。通过将JEV抗原OD450值均值除以平均对照抗原OD450值，获得各免疫小鼠或小猪组的免疫状态比(ISR)。抗JEV抗体在小鼠血清中的终点效价计算为ISR值>3.0的血清最终稀释的倒数。如就小鼠所述检测猪血清，使用HRP缀合的山羊抗猪抗体作为二抗。免疫前获得的猪血清用作阴性对照。间接ELISA如de Wispelaere等，J.Virol.2015所述进行。
小鼠和猪血清抗体针对JEV的中和能力分别通过病灶减少中和试验(FRNT)或蚀斑(PRNT)减少中和试验在Vero细胞上测定。合并来自各组的小鼠血清样品。一式三份单独检测猪血清，从1:5血清稀释开始。合并的小鼠或单独的猪血清样品在补充有2％FBS的DMEM中进行2倍连续稀释，起始稀释为1:10，并用等体积病毒悬液在37℃孵育2小时，所述悬液包含100FFU JEV。通过FFA测定Vero细胞单层的剩余感染性(见上)。终点效价计算为所测的使FFU数目减少50％(FRNT50)或使PFU(PRNT50)减少50％最高血清稀释的倒数。
统计分析
组之间的统计比较通过单向ANOVA分析，使用用于MacOSX的GraphPad Prism 6.0a版(GraphPad Software Inc,La Jolla California USA)。P值小于0.05被视作统计上显著。
对数秩(Mantel-Cox)检验用于比较生存数据。免疫的猪的组之间的抗体水平通过Mann Whitney U检验比较，显著性水平设为5％。GraphPad(GraphPad SoftwareInc.,La Jolla,CA,USA)用于所有统计分析。
JEV复制子细胞系
修饰JEV-RP9复制子质粒J-R2A(Chien H-L等，2011.J Virol85:4698–4706)，使得丁型肝炎病毒核酶置于紧邻JEV-RP9 3’-末端，且之后是猿猴病毒40(SV40)聚(A)序列。为此，pBR322(CMV)-JEV-RP9质粒中的对应序列通过NsiI和ClaI消化来剪切，并克隆到类似处理的J-R2A内。其次，修饰该质粒，用诱导型PTRE3G启动子(Clontech)取代SP6启动子。PTRE3G启动子扩增自pTRE3G载体(Clontech，货号631173)，使用引物5’-ctcgagtttactccctatcagtga-3’(SEQ ID NO:36，XhoI位点加下划线)和5’-tcacacagataaacttctcggttcactaaacgagct-3’(SEQ ID NO:37，JEV-RP9核苷酸1-18加下划线)。扩增JEV-RP9基因组的核苷酸1-249，使用引物5’-agctcgtttagtgaaccgagaagtttatctgtgtga-3’(SEQ ID NO:38，PTRE3G启动子核苷酸291-308加下划线)和5’-tgataagagccagcacgaatcg-3’(SEQ ID NO:39)。设计引物使得2个片段共有36个核苷酸同源的序列。使用这些前2个片段的第二轮PCR能扩增包含融合JEV-RP9的核苷酸1-249的PTRE3G启动子的片段。此片段用XhoI和ApaI消化并克隆入经SalI和ApaI处理的J-R2A质粒。所得pTRE3G-JEV-RP9.复制子质粒在Stbl2细胞(Life Technologies，货号10268-019)中扩增。用pTRE3G-JEV-RP9.复制子和pTK-Hyg选择载体(Clontech，货号631750)共转染HEK293T细胞，并用50μg/ml潮霉素选择稳定细胞。
JEV复制子表达用Tet-ExpressTM系统(Clontech，货号631177)根据厂商说明诱导。诱导后1小时，去除含诱导物的培养基，向细胞加入补充有2％FBS的DMEM。在诱导后所示时间，收集细胞，样品根据海肾萤光素酶检测系统(Promega，货号E2820)说明进行处理。萤光素酶信号用Centro XS3LB960(Berthold Technologies)酶标仪读取。
报告病毒颗粒(RVP)
扩增涵盖EV-RP9结构基因的片段，使用引物5’-gaagatctatgactaaaaaaccaggagggcccggt-3’(SEQ ID NO:40，BglII位点加下划线)和5’-ttctgcagtcaagcatgcacattggtcgctaaga-3’(SEQ ID NO:41，PstI位点加下划线)。该片段用BglII和PstI消化并克隆入类似处理的pTRE3G质粒(Clontech，货号631173)。所得pTRE3G-JEV-RP9.CprME质粒在Stbl2(Life Technologies，货号10268-019)细胞中扩增。含JEV-XZ0934结构基因的pTRE3G-JEV-XZ0934.CprME质粒与pTRE3G-JEV-RP9.CprME质粒类似设计并通过GeneCust合成。为产生JEV g3或JEV g5RVP，将HEK293T-JEV-RP9.复制子细胞接种于10-cm培养皿，然后用Lipofectamine2000(Life Technologies公司，货号11668-019)根据厂商说明分别转染pTRE3G-JEV-RP9.CprME或pTRE3G-JEV-XZ0934.CprME。JEV复制子和结构基因的表达用Tet-ExpressTM系统(Clontech，货号631177)根据厂商说明诱导。含RVP的上清在诱导后48小时收集并通过1,000g离心5分钟来澄清，等分样品在-80℃保存。
对于RVP纯化，澄清的上清加样到蔗糖垫层溶液(含15％蔗糖的TNE(10mM Tris-HCl[pH 7.5],2.5mM EDTA,50mM NaCl))上，在4℃100,000g离心2.5小时。弃上清，纯化的RVP悬于TNE缓冲液。
对于感染性测定，将BHK21细胞接种于24孔或96孔组织培养板的补充有2％FBS的DMEM。随后，向细胞加入纯化的RVP或含RVP的上清部分，板在37℃孵育1小时。移出未吸附的RVP，之后向细胞加入补充有2％FBS的DMEM，然后在37℃孵育。感染后24小时，样品根据海肾萤光素酶检测系统(24孔模式，Promega，货号E2820)或萤光素酶检测系统(96孔模式，Promega，货号E2720)的说明进行处理。海肾萤光素酶信号用Centro XS3LB960(Berthold Technologies)酶标仪读取。
结果
产生TRIP/JEV载体
发明人之前报道，用非复制型慢病毒载体单次免疫在WNV脑炎小鼠模型中诱导出稳健的保护性体液应答，所述载体表达可溶型西尼罗河病毒E糖蛋白(Iglesias等，2006；Coutant等，2008)。为评价表达来自JEV包膜蛋白的慢病毒载体对引起能免于JEV感染的体液应答的潜能，将编码G3的JEV prM和E的密码子优化基因插入慢病毒TRIP载体(图1)。发明人产生TRIP/JEV.prME和TRIP/JEV.prMEΔTM慢病毒载体，其表达prM信号肽然后是膜蛋白prM和包膜糖蛋白E(prME)，其是天然的或缺失其2个C末端跨膜结构域(prMEΔTM)。这些构建体中，prM有助于糖蛋白E的折叠、稳定性和有效分泌。
表达JEV蛋白的慢病毒载体用印第安纳血清型的VSV-G蛋白进行假型化。非复制型TRIP/JEV.prME和TRIP/JEV.prMEΔTM颗粒在HEK-293T细胞上产生，分别达到6.8和7.1log10TU/ml的效价。
通过用TRIP/JEV.prME或TRIP/JEV.prMEΔTM载体转导HEK-293T细胞，来评价重组JEV蛋白的抗原性。TRIP/GFP载体用作对照。转导后48小时，发明人通过免疫荧光试验分析E胞内表达，在表达prME或prMEΔTM的TRIP/JEV转导细胞中观察到类似的染色模式(图2A)。采用小鼠抗JEV抗血清的免疫印迹试验(图2B)在来自用TRIP/JEV载体转导的HEK-293T细胞的RIPA裂解物中检测到胞内的重组prM和E。2种重组JEV蛋白都在用TRIP/JEV载体转导的HEK-293T细胞上清中发现，但仅TRIP/JEV.prME载体对prM分泌有效，表明可溶型E的表达可能减少prM释放到胞内区室内(图2C，顶部)。由于JEV prM和E具有自组装成VLP的能力，发明人决定通过经蔗糖垫层溶液超离心细胞上清评估VLP是否从用TRIP/JEV载体转导的293T细胞中分泌。用抗E mAb 4G2和抗JEV血清通过免疫印迹试验分析团块(图2C，底部)。含prM和E的胞外JEV VLP在转导有TRIP/JEV.prME载体的293T细胞上清中积聚，但TRIP/JEV.prMEΔTM载体没有。
由于TRIP/JEV.prMEΔTM载体在释放prM和形成VLP方面效率低，缺失E的C末端区可能妨碍形成稳定的prME复合体。这些结果共同显示通过TRIP/JEV.prME载体转导细胞可导致重组JEV VLP有效分泌。
通过TRIP/JEV载体免疫在小鼠中诱导JEV特异性抗体
为评估慢病毒TRIP/JEV载体诱导的体液应答，成年BALB/c小鼠通过i.p.途径接种剂量增加的TRIP/JEV.prME或TRIP/JEV.prMEΔTM(每只动物3-5log10TU)。免疫后21天，从各小鼠组收集血清。通过间接ELISA检测合并的血清是否存在抗JEV IgG，使用灭活的JEV颗粒作为包被病毒抗原(表1)。NCA用作对照抗原。TRIP/JE载体剂量低于每只动物5log TU时，针对JEV的抗体应答很少或没有。5log10TU剂量诱导抗JEV特异性抗体显著产生，平均效价对于TRIP/JEV.prME达到1,600且对于TRIP/JEV.prMEΔTM达到400(表1，上排)。在接种于小鼠的最高剂量(6log TU)，TRIP/JEV.prME抗体平均效价达到10,000。由于非浓缩TRIP/JE载体通过i.p.途径在小鼠中接种的体积过大，后面的剂量不再使用。因此，我们决定在后续小鼠免疫中选择独特的5log10TU剂量。为确定抗JEV产生的时程，接受5log TU TRIP/JEV.prME或TRIP/JEV.prMEΔTM的Balb/c小鼠在免疫后7、14和21天放血(表1，下排)。抗JEV抗体在免疫第14天可检测并在第21天达到显著效价。
表1.单一剂量TRIP/JEV载体引起的抗JEV抗体应答
1.小鼠通过腹膜内途径接种TRIP/JEV载体。通过间接ELISA测定抗JEV抗体效价，使用灭活的JEV G3作为病毒抗原。
2.小鼠用105TU接种并在感染后不同天数收集免疫血清。
3.n.d.:未进行。
为提高抗JEV特异性抗体的产生，免疫的小鼠在首次接种后4周接受5log10TU重组TRIP/JEV载体的加强剂量，所述载体带有不同VSV株(新泽西)的VSV-G包膜蛋白。加强接种后3周收集免疫血清，ELISA测量显示抗JEV抗体效价增加40倍。抗JEV IgG的产生对于TRIP/JEV.prME平均效价达到64,000，而对于TRIP/JEV.prMEΔTM平均效价达到16,000。
接受TRIP/JEV.prME的小鼠展示针对prM和E的特异性抗体(图3)。相反，来自TRIP/JEV.prMEΔTM接种小鼠的血清仅主要包含抗E抗体，这归因于prM保留在转导的细胞的胞内区室。
接受2剂TRIP/JEV.prMEΔTM或TRIP/JEV.prME的Balb/c小鼠引起抗E抗体效价，范围类似为约1,000(表2)。发明人接着评价免疫血清是否也与来自不同JEV基因型的E蛋白反应。由于黄病毒EDIII在病毒体表面是可及的且包含亚型特异性中和性表位，发明人使用G1、G3和G5的重组的带SNAP标签的EDIII蛋白作为病毒抗原，用于间接ELISA。抗JEV G3抗体识别来自G1的EDIII以及更低水平的G5(表2)。无论所测JEV基因型如何，接受TRIP/JEV.prME或TRIP/JEV.prMEΔTM的免疫小鼠引起类似或甚至更高的抗EDIII抗体效价，从4,000到8,000。因此，TRIP/JE.prME和TRIP/JE.prMEΔTM都能诱导类似水平的抗EDIII抗体，其与不同JEV基因型广泛反应。重要的是应注意，定向针对JEV G3的小鼠JEV抗血清识别来自JEV G1和G5的EDIII的效率低于TRIP/JEV免疫血清。
表2.TRIP/JEV抗血清针对重组JEV抗原的反应性
a S2细胞中产生的高纯重组蛋白用作间接ELISA的病毒抗原。rEΔTM可溶型E来自JEV G3。rEDIII:来自不同JEV基因型的E的结构域III。
b通过对合并的血清进行间接ELISA测定。在小鼠免疫血清中抗体的终点效价作为最终血清稀释的倒数，ISR值>3.0。
c小鼠对接种活JEV G3株RP9的抗体应答。
d小鼠对接种TRIP/JEV载体的抗体应答。小鼠用5log TU TRIP/JEV载体i.p.接种2次，间隔1个月。加强后3周收集血清。
TRIP/JEV免疫后在小鼠中引起的JEV抗血清的体外交叉保护活性
进行病灶减少中和试验(FRNT)以评估TRIP/JEV载体引起中和性抗体应答抵御JEVG3的能力(表3)。获自的Balb/c小鼠的免疫血清的FRNT50为150，所述小鼠从JEV株RP-9的致死攻击中恢复。在接种有单一剂量log10TU TRIP/JEV载体的小鼠中观察到FRNT50为10的弱效价。在初免后一个月的加强剂量引起40(TRIP/JEV.prMEΔTM)-80(TRIP/JEV.prME)的JEV中和性抗体效价(表3)。
由于TRIP/JEV载体表达的JEV抗原衍生自JEV G3，发明人评价其针对所出现JEV基因型即G1和G5的保护能力。为研究此问题，发明人决定用来自JEV G1或G5的对应部分取代JEV G3感染性cDNA中编码C、prM和E的区域(图4A)。由于TRIP/JEV载体免疫仅针对JEV结构蛋白，迄今尚未研究JEV G1和G5非结构蛋白的贡献。嵌合JEV G1/3或JEV G5/3的生长与培养细胞系中的JEV G3/3相当(图6)。免疫印迹分析显示来自JEV G3/3感染小鼠的免疫血清识别来自JEV的prM和E，无论JEV基因型如何(图4B，左图)。
发明人观察到来自嵌合JEV G5/3的E比其它病毒迁移更快，且prM用JEV G3/3抗血清微弱测得。当发明人用慢病毒载体免疫接种产生的小鼠免疫血清进行此实验时，获得基本类似的结果。TRIP/JEV载体免疫的小鼠的血清识别所有嵌合JEV的prM和E(TRIP/JEV.prME)或单独E(TRIP/TRIP/JEV.prMEΔTM)(图4B，右图)。如用JEV G3抗血清所观察，TRIP/JEV.prME免疫引起特异性抗JEV抗体，所述抗体与来自嵌合JEV G5/3的prM弱反应。作为对照，抗NS5抗体显示与来自所测全部嵌合JEV的NS5有类似反应性。因此，TRIP/JEV.prME抗血清针对来自JEV G5的prM的低抗原反应性不是HEK-293T细胞中低病毒生长的结果。与TRIP/JEV.prME不同，TRIP/JEV.prMEΔTM能诱导抗体，所述抗体能类似地识别来自嵌合JEVG1/3、G3/3和G5/3的E蛋白。一个解释是可溶型E表现出更倾向产生识别高保守表位的抗体，所述表位在prME复合体或JEV VLP内可能具有隐蔽性。
进行FRNT试验以评估TRIP/JEV载体引起中和性抗体应答抵御JEV G1/3或G5/3的能力(表3)。Balb/c小鼠用JEV G3感染产生的血清对嵌合JEVG1/3和G5/3的FRNT50分别为140及50。接受TRIP/JEV载体的免疫的小鼠发展出针对嵌合JEVG1/3和G5/3的中和性抗体效价(表3)。
表3针对不同JEV基因型的抗TRIP/JEV抗体中和活性
a嵌合JEV G1/3和G5/3以及亲代JEV G3株RP9(G3/3)。
b小鼠对接种JEV株RP9的抗体应答。
c FRNT50，使JEV的FFU数降低至少50％的最高血清稀释。
d小鼠对接种TRIP/JEV载体的抗体应答。小鼠用5log TU TRIP/JEV载体i.p.接种2次，间隔1个月。加强后3周收集血清。
相较于TRIP/JEV.prMEΔTM，TRIP/JEV.prME载体能引起略高水平的中和性抗JEV抗体。TRIP/JEV所诱导非抗体对嵌合JEV G5/3的低中和能力与其针对JEV G5的E蛋白的弱反应性密切相关(图4B，右图)。这些数据显示TRIP/JEV载体能刺激JEV中和性抗体产生，其与JEV基因型1、3反应良好，而G5的效果较小。
TRIP/JEV免疫后在小鼠中引发的JEV抗血清体内保护活性
初步数据显示JEV株RP9感染C57Bl/6乳鼠在一周内致死。由于小鼠对RP9的易感性随着年龄迅速下降，发明人不能在TRIP/JEV载体的长期初免-加强免疫接种阶段后攻击小鼠。因此，发明人决定应用将TRIP/JEV抗血清被动转移到C57Bl/6乳鼠内的操作。为确定TRIP/JEV.prME或TRIP/JEV.prMEΔTM免疫接种后在小鼠中引起的体液免疫是否具有体内保护性，12只C57Bl/6小鼠(3周龄)组接受i.p.接种10μl合并的免疫血清，所述血清收集自加强后2个月的TRIP/JEV接种小鼠。JEV株RP-9接种BALB/c小鼠的合并的免疫血清用作阳性对照。纳入PBS接种的6只小鼠组。被动转移抗血清后1天，小鼠用5log10FFU JEV株RP-9i.p.攻击。在3周中每天观察动物的疾病临床迹象和死亡(图5)。
PBS接种的约70％小鼠在攻击后9-11天内死亡，而施用JEV免疫血清可诱导85％生存率。2个对照组之间的差异在统计上显著(P<0.05)。从转移合并的血清后，在C57Bl/6小鼠中观察到保护性被动免疫，所述血清来自TRIP/JEV.prME(生存率60％)或TRIP/JEV.prMEΔTM(生存率5％)接种2次的小鼠。接种单一剂量TRIP/JEV免疫血清的2组小鼠与PBS对照组之间的差异在统计上显著(P<0.01)。这些数据显示单一剂量TRIP/JEV抗血清在致死剂量JEV攻击的小鼠中赋予部分保护。
血清中和
从接种后20天存活的小鼠中所收集的血清的中和活性用单轮报告病毒颗粒(RVP)测定。RVP在用JEV-RP9(g3)亚基因组复制子稳定转化的细胞中产生，所述复制子表达病毒非结构蛋白和海肾萤光素酶报告蛋白(图6A)。这些细胞用表达JEV g3或JEV g5结构蛋白(C、prM和E)的质粒转染，引起RVP的成功释放(图6C和6D)。重组RVP成功进入新的靶细胞可引起萤光素酶报告基因的基因组释放和后续表达。这类系统显示敏感和有效用于血清中和试验(Dowd KA等，Jost CA,Durbin AP,Whitehead SS,Pierson TC.2011.PLoS Pathog.7:e1002111)。有趣的是，发明人显示JEV g3感染下存活的BALB/c小鼠血清有效中和JEV g3和g5RVP(图7，左)。在相互试验(reciprocal assay)中，JEV g5感染下存活的BALB/c小鼠血清具有针对JEV g5RVP的中和活性，但针对JEV g3RVP的中和弱(图7，右)。
血清中和试验
血清样品获自用1000ffu JEV-RP9(g3)或JEV-XZ0934(g5)接种后20天的3周龄BALB/c小鼠。血清通过56℃加热30分钟来去补体，并在补充有2％FBS的DMEM中2倍连续稀释，起始稀释度为1:10。各稀释液在37℃孵育1小时，用等体积的纯化的g3或g5RVP。如上所述，在96孔板中接种的BHK细胞上测定剩余RVP感染性。
TRIP/JEV.prME在猪中诱导中和抗JEV抗体产生
由于基于慢病毒表达JEV VLP对引发中和性抗体应答尤其有效，发明人评价TRIP/JEV.prME刺激猪中保护性体液应答的能力。7周龄小猪组用6(低剂量)或7(高剂量)log10TU的TRIP/JEV.prME肌肉内免疫(图8)。作为对照，2只动物接受低或高剂量表达报告蛋白GFP的重组慢病毒载体。用重组EΔTM-SNAP蛋白作为病毒抗原的间接ELISA用于每周评价抗JEVE抗体在免疫的猪中的产生(图8A)。初次接种后前4周中的抗体应答监测显示有效产生抗JEV E抗体。低与高剂量免疫的比较未显示此时间段中抗JEV E抗体产生的显著差异。抗JEVE抗体水平在第4周进行的加强免疫后提高，并在初免后至少1.5个月达到平稳阶段。相较于低剂量，高剂量TRIP/JEV.prME更有效引发高水平的特异性抗体产生(P＝0.028)。如图8B所示，用单一剂量活JEV实验性感染猪后3周诱导的抗JEV抗体效价与通过7log10TU TRIP/JEV.prME慢病毒载体初免/加强免疫而在动物中刺激产生的那些相当。
抗JEV E抗体的分型显示TRIP/JEV.prME在初免后2周刺激IgG1和IgG2产生，之后于第3周下降，即使在高剂量也如此(图8C和8D)。抗JEV E IgG1和IgG2的水平与感染第3周在JEV中山株攻击小猪中观察到的都类似(图8E)。用TRIP/JEV.prME初免的动物中，第4周的加强在初免后10周偏向提高IgG2产生，无论接种剂量如何。
还就初免后3周和加强后6周的中和性抗体，检测获自慢病毒TRIP/JEV.prME载体免疫动物的单独血清样品(图9)。接受单一剂量6-7log10TU TRIP/JEV.prME的免疫的小猪发展出10-30范围的中和性抗体效价抵御同源JEV G3株RP-9，并在加强后达到多至160的效价(图9A)。更高剂量的TRIP/JEV.prME诱导更强的记忆中和性抗体应答。
检测小猪免疫血清显示，无论接种剂量如何，RIP/JEV.prME引起针对JEV G3中山株、JEV G5株XZ0934(用嵌合JEV G5/G3测试)和JEV G1株CNS769_Laos_2009(程度较低)的中和性抗体(图9B)。重要的是，抗TRIP/JEV.prME抗体的中和活性模式与收集自实验性感染JEV中山株的小猪组的免疫血清中所观察到的类似(图9C)。
这些结果显示TRIP/JEV.prME能在小猪中引起高效价的中和性抗体，所述小猪接受2次7log10TU慢病毒载体接种，间隔1个月。另外，发明人发现TRIP/JEV.prME能刺激中和JEV G1及G5的抗JEV抗体产生。
讨论
VSV-G假型化的慢病毒载体尤其适于疫苗目的，在分裂和非分裂细胞如树突细胞中有效递送病毒抗原，引起人和动物中激活稳健的获得性免疫(Hu等，2011)。直接注射基于慢病毒TRIP的载体导致病毒抗原表达和抗体应答无效。发明人报道基于慢病毒TRIP的载体能初次引发基于抗体的应答，所述载体编码来自WNV的包膜E糖蛋白，所述应答在小鼠模型中赋予长期免疫保护抵御WNV脑炎(Coutant等，2008；Iglesias等，2006)。本研究的目的是评估2个基于慢病毒TRIP的载体、TRIP/JEV.prME载体以及TRIP/JEV.prMEΔTM载体在小鼠和小猪中引发保护性体液免疫应答的能力，所述基于慢病毒TRIP的载体表达来自JEV的prM及E蛋白。这些构建体中，prM确实发挥E伴侣的作用且两者都具有自组装成VLP的能力。重组JEV prM和E的共表达引起VLP在转导有TRIP/JEV.prME载体的人细胞中胞外分泌。由于TRIP/JEV.prMEΔTM载体不能分泌JEV VLP，发明人推断没有跨膜结构域的E蛋白可能有利于prM保留于胞内区室，这减少VLP产生。
基于抗体的免疫应答在针对JEV的疫苗中发挥关键作用，且E蛋白用作主要靶标以给予保护性免疫抵御JEV相关疾病(Erra等，2013；Konishi)。接种单一低剂量(5log10TU)TRIP/JEV载体的小鼠具有显著水平的JEV特异IgG，初免后1个月的加强剂量引起抗JEV抗体效价增加40倍。在间接ELISA和免疫印迹试验中记载抗JEV抗体的反应性，采用不同JEV抗原和嵌合JEV。用TRIP/JEV.prME载体而非TRIP/JEV.prMEΔTM载体免疫的小鼠发展出特异抗prM抗体。这种结果可能涉及TRIP/JEV.prME载体产生胞外JEV VLP的能力。TRIP/JEV抗血清识别JEV抗原的分析显示，用2个TRIP/JEV载体免疫产生水平相当的抗体，针对E蛋白以及位于其来自JEV G1、G3和G5的抗原结构域III(EDIII)的类型特异性表位。鉴于EDIII包含数个中和表位和宿主细胞受体识别位点用于黄病毒(Samuel等，2006)，发明人的结果确认有或没有其C末端区的重组E蛋白基本保存天然E蛋白的免疫原性。中和试验证明TRIP/JEV载体能引起针对JEV G1、G3和G5的中和性抗体，就如同活的JEV G3。单一剂量的10μl TRIP/JEV抗血清在体内能赋予部分保护抵御JEV G3的致死攻击。然而，TRIP/JEV.prME在产生中和抗JEV抗体方面比TRIP/JEV.prMEΔTM略微更有效。
TRIP/JEV载体能有效发展中和性抗体的事实表明，TRIP/JEV.prME和TRIP/JEV.prMEΔTM都可能刺激保护性体液应答抵御不同JEV基因型，显示其在一种以上基因型共传播的流行区中的效用。虽然公认体液免疫应答是抵御JEV感染的保护性免疫主要组成部分，发明人无法排除细胞免疫也在建立长期保护抵御JEV中起作用。
TRIP/JEV.prME和TRIP/JEV.prMEΔTM都呈现为有前途的JEV疫苗，用于针对不同JEV基因型的兽用疫苗接种。JEV VLP的显著优势之一是其刺激持久性抗体介导免疫的效率。
总之，本研究的目的是评估2个基于慢病毒TRIP的载体、TRIP/JEV.prME载体以及TRIP/JEV.prMEΔTM载体在小鼠和小猪中诱导保护性体液应答的能力，所述基于慢病毒TRIP的载体表达来自JEV基因型3的包膜prM及E糖蛋白。
转导293T细胞显示TRIP/JEV.prME载体有效分泌组装自prM和E的病毒样颗粒(VLP)，而TRIP/JEV.prMEΔTM载体仅分泌缺乏其2个跨膜结构域的可溶型E。接种一个剂量各TRIP/JEV载体的小鼠具有显著水平的JEV特异IgG，初免后一个月的加强剂量引起抗JEV抗体效价显著增加。用TRIP/JEV载体的小鼠初免加强可引起水平相当的总抗体，针对E蛋白以及来自JEV基因型1、3和5的类型特异性表位。
中和试验显示TRIP/JEV.prME在产生中和抗JEV抗体方面比TRIP/JEV.prMEΔTM略微更有效。通过使用在JEV基因型3骨架中包含来自JEV基因型1或5的prM和E的嵌合JEV，发明人证明TRIP/JEV载体能引起针对JEV的中和性抗体，无论基因型如何。被动血清保护试验显示，单一剂量TRIP/JEV抗血清在用致死剂量JEV攻击的小鼠中赋予部分保护。因此，TRIP/JEV.prME和TRIP/JEV.prMEΔTM都呈现为有前途的JEV疫苗，用于针对不同JEV基因型的兽用疫苗接种，显示其在流行区的重大效用。
普遍认为体液免疫应答是抵御JEV感染的保护性免疫主要组成部分(Dubischar-Kastner等，2012；Larena等，2013)。与VLP适合作为疫苗抵御包括日本脑炎在内的虫媒病毒性疾病的想法一致(Kuwahara等，2010；Piljman等，2015)，TRIP/JEV.prME是产生中和抗JEV抗体的更有效慢病毒载体，在其被动转入JEV攻击小鼠后赋予部分保护。以1个月间隔在小猪中接种2个7log10TU剂量的TRIP/JEV.prME载体对引起高效价抗JEV中和性抗体高度有效，其潜在能保护猪免于JEV感染。TRIP/JEV.prME能刺激中和JEV G3和G5的抗JEV抗体产生，而G1的程度较低。预估JEV基因型变化对疫苗效力的潜在影响，获自G3疫苗注射猪的免疫血清显示针对JEV G1的较低病毒株特异交叉中和性抗体效价(Fan等，2012)。这种观察促使开发新兽用疫苗用于猪，特异性定向针对该特定JEV基因型(Yang等，2014)。尽管TRIP/JEV.prME载体在猪中引起针对G1病毒的中和性抗体，但发明人确实注意到其水平低于其它所测JEV基因型。然而，针对JEV G1病毒的中和性抗体能达到1:40，因而可足以在猪中实现保护。
本研究中，发明人证明用表达JEV VLP的TRIP/JEV载体免疫猪对初次引发抗原特异体液免疫尤其有效，并引发针对JEV基因型1、3和5的中和性抗体应答。产生中和病毒的抗体对猪免于JEV感染关键(Imoto等，2010)，至少为1:10的效价指示保护性体液免疫(VanGessel等，2011)。慢病毒TRIP/JEV.prME载体引起的中和性抗体效价足以在家猪中赋予保护抵御不同JEV基因型，这能在一种以上基因型传播的流行区中具有巨大效用。
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Arg Cys Trp Val Arg Ala Ile Asp Val Gly Tyr Met Cys Glu Asp Thr
35 40 45
Ile Thr Tyr Glu Cys Pro Lys Leu Thr Met Gly Asn Asp Pro Glu Asp
50 55 60
Val Asp Cys Trp Cys Asp Asn Gln Glu Val Tyr Val Gln Tyr Gly Arg
65 70 75 80
Cys Thr Arg Thr Arg His Ser Lys Arg Ser Arg Arg Ser Val Ser Val
85 90 95
Gln Thr His Gly Glu Ser Ser Leu Val Asn Lys Lys Glu Ala Trp Leu
100 105 110
Asp Ser Thr Lys Ala Thr Arg Tyr Leu Met Lys Thr Glu Asn Trp Ile
115 120 125
Ile Arg Asn Pro Gly Tyr Ala Phe Leu Ala Ala Val Leu Gly Trp Met
130 135 140
Leu Gly Ser Asn Asn Gly Gln Arg Val Val Phe Thr Ile Leu Leu Leu
145 150 155 160
Leu Val Ala Pro Ala Tyr Ser
165
<210> 7
<211> 1500
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> native nucleotide sequence of the polynucleotide encoding the
full-length E protein.
<400> 7
tttaattgtc tgggaatggg caatcgtgac ttcatagaag gagccagtgg agccacttgg 60
gtggacttgg tgctagaagg agatagctgc ttgacaatta tggcaaacga caaaccaaca 120
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tatcatgctt cagtcactga catctcgacg gtggctcggt gccccacgac tggagaagcc 240
cacaacgaga agcgagctga tagtagctat gtgtgcaaac aaggcttcac tgatcgtggg 300
tggggcaacg gatgtggact tttcgggaag ggaagcattg acacatgtgc aaaattctcc 360
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atttttgtgc atggaaccac cacttcggaa aaccatggga attattcagc gcaagttggg 480
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ggtgactacg gagaagtcac actggactgt gagccaagga gtggactgaa cactgaagcg 600
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ctcgctctcc cctggacgtc cccttcgagc acagcgtgga gaaacagaga actcctcatg 720
gagtttgaag aggcgcacgc cacaaaacag tccgttgttg ctcttgggtc acaggaagga 780
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acatcaggcc acctgaaatg taggctgaaa atggacaaac tggctctgaa aggcacaacc 900
tatggcatgt gcacagaaaa attctcgttc gcaaaaaatc cggcggacac tggtcacgga 960
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tccgttgcga gcctcaatga catgaccccc gttgggcggc tggtgacagt gaaccccttc 1080
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gctttggcct tcttagccac aggaggtgtg ctcgtgttct tagcgaccaa tgtgcatgct 1500
<210> 8
<211> 1500
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> codon-optimized nucleotide sequence of the polynucleotide
encoding the full-length E protein.
<400> 8
tttaactgct tgggcatggg caacagggat ttcatcgagg gcgcctccgg ggcaacctgg 60
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> full-length E protein.
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Thr Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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<210> 10
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> native nucleotide sequence of the polynucleotide encoding the
soluble form of the E protein lacking the two C-terminal
transmembrane domains (EdeltaTM).
<400> 10
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<210> 11
<211> 1356
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> codon-optimized nucleotide sequence of the polynucleotide
encoding the soluble form of the E protein lacking the two
C-terminal transmembrane domains (EdeltaTM).
<400> 11
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> soluble form of the E protein lacking the two C-terminal
transmembrane domains (EdeltaTM).
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Thr Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser
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130 135 140
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145 150 155 160
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<210> 13
<211> 60
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> native nucleotide sequence of the polynucleotide encoding the
first transmembrane domain (TMD1) of the E protein.
<400> 13
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<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> codon-optimized nucleotide sequence of the polynucleotide
encoding the first transmembrane domain (TMD1) of the E protein.
<400> 14
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<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
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second transmembrane domain (TMD2) of the E protein.
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<210> 17
<211> 48
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> codon-optimized nucleotide sequence of the polynucleotide
encoding the second transmembrane domain (TMD2) of the E protein.
<400> 17
gctctggctt tcctggccac aggcggggtg ctcgtgtttc tggctacc 48
<210> 18
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> second transmembrane domain (TMD2) of the E protein.
<400> 18
Ala Leu Ala Phe Leu Ala Thr Gly Gly Val Leu Val Phe Leu Ala Thr
1 5 10 15
<210> 19
<211> 2001
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> native nucleotide sequence of the polynucleotide encoding the
prM-E protein.
<400> 19
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ttcaactcca taggaaaagc cgttcaccaa gtgtttggtg gtgccttcag aacactcttt 1860
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ttagcgacca atgtgcatgc t 2001
<210> 20
<211> 2001
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> codon-optimized nucleotide sequence of the polynucleotide
encoding the prM-E protein.
<400> 20
atgaagctgt ccaactttca ggggaagctg ctcatgacaa ttaacaacac tgatattgcc 60
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gagtcttctc tcgtcaacaa gaaggaggca tggctggata gcactaaggc cacccgctac 360
ctcatgaaga ctgagaactg gatcattcgg aaccctggat acgcttttct ggctgccgtg 420
ctggggtgga tgctggggag caacaacgga cagcgcgtgg tcttcaccat tcttctcttg 480
ttggtcgctc ctgcttacag ctttaactgc ttgggcatgg gcaacaggga tttcatcgag 540
ggcgcctccg gggcaacctg ggtggatttg gtgctcgaag gagacagctg cctcaccatc 600
atggccaacg acaagcccac cctcgacgtg aggatgatca acatcgaggc ttcccaactg 660
gccgaggtca gaagctactg ttaccatgcc agcgtgacag atatttccac agtggctagg 720
tgcccaacta caggcgaggc ccacaacgag aaaagggctg atagtagcta tgtctgtaaa 780
cagggcttta ccgatcgggg gtggggcaac gggtgtgggc tgttcgggaa ggggtccatt 840
gatacctgtg ctaagttcag ttgcacttcc aaggccatcg gcaggacaat tcagcctgag 900
aatattaagt acgaggtcgg catctttgtg cacgggacaa ccacaagcga gaaccacggg 960
aactactccg ctcaagtggg cgccagccag gccgccaagt ttacagtgac tcccaacgcc 1020
cccagtatta ctctgaagct gggagactat ggcgaggtga ccctggattg cgagcccaga 1080
tccggcctga acaccgaggc tttttacgtg atgacagtcg gctccaagag tttcttggtg 1140
cacagggagt ggtttcacga cctcgctctc ccctggacaa gcccctcctc aactgcttgg 1200
agaaacagag agctcctgat ggagttcgaa gaggctcatg ccactaagca gagcgtcgtg 1260
gcattgggga gtcaggaagg cggactccac caggcccttg ccggagccat cgtggtcgag 1320
tacagctcaa gcgtgaagtt gaccagtgga cacctgaagt gtagactgaa gatggacaaa 1380
ctggctctga aggggacaac atacggcatg tgcaccgaga agttcagctt cgccaaaaat 1440
cccgcagaca ccgggcatgg gacagtcgtc atcgagctta gctacagcgg ctccgacgga 1500
ccatgcaaga ttccaattgt gagcgtggcc tctctcaacg atatgactcc cgtgggccgg 1560
ctggtgactg tgaacccatt cgtggccact tccagcgcta acagcaaggt gttggtggag 1620
atggagccac ctttcgggga cagctatatt gtggtggggc ggggagacaa acagatcaac 1680
catcattggc acaaggccgg gtcaacactc ggcaaggcct tttcaacaac tctcaaggga 1740
gcccagagac tggccgccct cggcgacaca gcctgggatt tcgggtcaat cggcggggtg 1800
ttcaactcaa tcgggaaggc tgtccaccag gtgttcggcg gagcctttcg gaccctgttt 1860
gggggaatgt cttggattac tcaggggctg atgggggctc tgcttctttg gatgggcgtc 1920
aacgcccggg acaggagtat cgctctggct ttcctggcca caggcggggt gctcgtgttt 1980
ctggctacca atgtccatgc t 2001
<210> 21
<211> 667
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> prM-E protein.
<400> 21
Met Lys Leu Ser Asn Phe Gln Gly Lys Leu Leu Met Thr Ile Asn Asn
1 5 10 15
Thr Asp Ile Ala Asp Val Ile Val Ile Pro Thr Ser Lys Gly Glu Asn
20 25 30
Arg Cys Trp Val Arg Ala Ile Asp Val Gly Tyr Met Cys Glu Asp Thr
35 40 45
Ile Thr Tyr Glu Cys Pro Lys Leu Thr Met Gly Asn Asp Pro Glu Asp
50 55 60
Val Asp Cys Trp Cys Asp Asn Gln Glu Val Tyr Val Gln Tyr Gly Arg
65 70 75 80
Cys Thr Arg Thr Arg His Ser Lys Arg Ser Arg Arg Ser Val Ser Val
85 90 95
Gln Thr His Gly Glu Ser Ser Leu Val Asn Lys Lys Glu Ala Trp Leu
100 105 110
Asp Ser Thr Lys Ala Thr Arg Tyr Leu Met Lys Thr Glu Asn Trp Ile
115 120 125
Ile Arg Asn Pro Gly Tyr Ala Phe Leu Ala Ala Val Leu Gly Trp Met
130 135 140
Leu Gly Ser Asn Asn Gly Gln Arg Val Val Phe Thr Ile Leu Leu Leu
145 150 155 160
Leu Val Ala Pro Ala Tyr Ser Phe Asn Cys Leu Gly Met Gly Asn Arg
165 170 175
Asp Phe Ile Glu Gly Ala Ser Gly Ala Thr Trp Val Asp Leu Val Leu
180 185 190
Glu Gly Asp Ser Cys Leu Thr Ile Met Ala Asn Asp Lys Pro Thr Leu
195 200 205
Asp Val Arg Met Ile Asn Ile Glu Ala Ser Gln Leu Ala Glu Val Arg
210 215 220
Ser Tyr Cys Tyr His Ala Ser Val Thr Asp Ile Ser Thr Val Ala Arg
225 230 235 240
Cys Pro Thr Thr Gly Glu Ala His Asn Glu Lys Arg Ala Asp Ser Ser
245 250 255
Tyr Val Cys Lys Gln Gly Phe Thr Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys
260 265 270
Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ile Asp Thr Cys Ala Lys Phe Ser Cys
275 280 285
Thr Ser Lys Ala Ile Gly Arg Thr Ile Gln Pro Glu Asn Ile Lys Tyr
290 295 300
Glu Val Gly Ile Phe Val His Gly Thr Thr Thr Ser Glu Asn His Gly
305 310 315 320
Asn Tyr Ser Ala Gln Val Gly Ala Ser Gln Ala Ala Lys Phe Thr Val
325 330 335
Thr Pro Asn Ala Pro Ser Ile Thr Leu Lys Leu Gly Asp Tyr Gly Glu
340 345 350
Val Thr Leu Asp Cys Glu Pro Arg Ser Gly Leu Asn Thr Glu Ala Phe
355 360 365
Tyr Val Met Thr Val Gly Ser Lys Ser Phe Leu Val His Arg Glu Trp
370 375 380
Phe His Asp Leu Ala Leu Pro Trp Thr Ser Pro Ser Ser Thr Ala Trp
385 390 395 400
Arg Asn Arg Glu Leu Leu Met Glu Phe Glu Glu Ala His Ala Thr Lys
405 410 415
Gln Ser Val Val Ala Leu Gly Ser Gln Glu Gly Gly Leu His Gln Ala
420 425 430
Leu Ala Gly Ala Ile Val Val Glu Tyr Ser Ser Ser Val Lys Leu Thr
435 440 445
Ser Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Lys Met Asp Lys Leu Ala Leu Lys
450 455 460
Gly Thr Thr Tyr Gly Met Cys Thr Glu Lys Phe Ser Phe Ala Lys Asn
465 470 475 480
Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Ile Glu Leu Ser Tyr Ser
485 490 495
Gly Ser Asp Gly Pro Cys Lys Ile Pro Ile Val Ser Val Ala Ser Leu
500 505 510
Asn Asp Met Thr Pro Val Gly Arg Leu Val Thr Val Asn Pro Phe Val
515 520 525
Ala Thr Ser Ser Ala Asn Ser Lys Val Leu Val Glu Met Glu Pro Pro
530 535 540
Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg Gly Asp Lys Gln Ile Asn
545 550 555 560
His His Trp His Lys Ala Gly Ser Thr Leu Gly Lys Ala Phe Ser Thr
565 570 575
Thr Leu Lys Gly Ala Gln Arg Leu Ala Ala Leu Gly Asp Thr Ala Trp
580 585 590
Asp Phe Gly Ser Ile Gly Gly Val Phe Asn Ser Ile Gly Lys Ala Val
595 600 605
His Gln Val Phe Gly Gly Ala Phe Arg Thr Leu Phe Gly Gly Met Ser
610 615 620
Trp Ile Thr Gln Gly Leu Met Gly Ala Leu Leu Leu Trp Met Gly Val
625 630 635 640
Asn Ala Arg Asp Arg Ser Ile Ala Leu Ala Phe Leu Ala Thr Gly Gly
645 650 655
Val Leu Val Phe Leu Ala Thr Asn Val His Ala
660 665
<210> 22
<211> 1857
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> native nucleotide sequence of the polynucleotide encoding the
prM-EdeltaTM protein.
<400> 22
atgaagttgt caaatttcca ggggaagctt ttgatgacca ttaacaacac ggacattgca 60
gacgttatcg tgattcccac ctcaaaagga gagaacagat gctgggtccg ggcaatcgac 120
gtcggctaca tgtgtgagga cactatcacg tacgaatgtc ctaagcttac catgggcaat 180
gatccagagg atgtggattg ctggtgtgac aaccaagaag tctacgtcca atatggacgg 240
tgcacgcgga ccagacattc caagcgaagc aggagatccg tgtcggtcca aacacatggg 300
gagagttcac tagtgaataa aaaagaggct tggctggatt caacgaaagc cacacgatat 360
ctcatgaaaa ctgagaactg gatcataagg aatcctggct atgctttcct ggcggcggta 420
cttggctgga tgcttggcag taacaacggt caacgcgtgg tattcaccat cctcctgctg 480
ctggttgctc cggcttacag ttttaattgt ctgggaatgg gcaatcgtga cttcatagaa 540
ggagccagtg gagccacttg ggtggacttg gtgctagaag gagatagctg cttgacaatt 600
atggcaaacg acaaaccaac attggacgtc cgcatgatca acatcgaagc tagccaactt 660
gctgaggtca gaagttactg ttatcatgct tcagtcactg acatctcgac ggtggctcgg 720
tgccccacga ctggagaagc ccacaacgag aagcgagctg atagtagcta tgtgtgcaaa 780
caaggcttca ctgatcgtgg gtggggcaac ggatgtggac ttttcgggaa gggaagcatt 840
gacacatgtg caaaattctc ctgcaccagt aaagcgattg ggagaacaat ccagccagaa 900
aacatcaaat acgaagttgg catttttgtg catggaacca ccacttcgga aaaccatggg 960
aattattcag cgcaagttgg ggcgtcccag gcggcaaagt ttacagtaac acccaatgct 1020
ccttcgataa ccctcaaact tggtgactac ggagaagtca cactggactg tgagccaagg 1080
agtggactga acactgaagc gttttacgtc atgaccgtgg ggtcaaagtc atttctggtc 1140
catagggaat ggtttcatga cctcgctctc ccctggacgt ccccttcgag cacagcgtgg 1200
agaaacagag aactcctcat ggagtttgaa gaggcgcacg ccacaaaaca gtccgttgtt 1260
gctcttgggt cacaggaagg aggcctccat caggcgttgg caggagccat cgtggtggag 1320
tactcaagct cagtgaagtt aacatcaggc cacctgaaat gtaggctgaa aatggacaaa 1380
ctggctctga aaggcacaac ctatggcatg tgcacagaaa aattctcgtt cgcaaaaaat 1440
ccggcggaca ctggtcacgg aacagttgtc atcgaactct cctactctgg gagtgatggc 1500
ccctgcaaaa ttccgattgt ctccgttgcg agcctcaatg acatgacccc cgttgggcgg 1560
ctggtgacag tgaacccctt cgtcgcgact tccagtgcca attcaaaggt gctggtcgag 1620
atggaacccc ccttcggaga ctcctacatc gtagttggaa ggggagacaa gcagatcaac 1680
caccattggc acaaagctgg aagcacgctg ggcaaagcct tttcaacaac tttgaaggga 1740
gctcagagac tggcagcgtt gggtgacaca gcctgggact ttggctccat tggaggggtc 1800
ttcaactcca taggaaaagc cgttcaccaa gtgtttggtg gtgccttcag aacactc 1857
<210> 23
<211> 1857
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> codon-optimized nucleotide sequence of the polynucleotide
encoding the prM-EdeltaTM protein.
<400> 23
atgaagctgt ccaactttca ggggaagctg ctcatgacaa ttaacaacac tgatattgcc 60
gatgtcattg tcatccctac atccaagggc gaaaaccggt gctgggtccg ggccatcgac 120
gtcgggtaca tgtgcgaaga taccattaca tacgaatgcc ccaagctgac catgggaaac 180
gatcctgagg acgtggattg ctggtgcgac aaccaggagg tgtacgtgca gtacgggcgg 240
tgcacaagga cacggcactc caagcgctct cggcggagcg tgtccgtgca gacccacggc 300
gagtcttctc tcgtcaacaa gaaggaggca tggctggata gcactaaggc cacccgctac 360
ctcatgaaga ctgagaactg gatcattcgg aaccctggat acgcttttct ggctgccgtg 420
ctggggtgga tgctggggag caacaacgga cagcgcgtgg tcttcaccat tcttctcttg 480
ttggtcgctc ctgcttacag ctttaactgc ttgggcatgg gcaacaggga tttcatcgag 540
ggcgcctccg gggcaacctg ggtggatttg gtgctcgaag gagacagctg cctcaccatc 600
atggccaacg acaagcccac cctcgacgtg aggatgatca acatcgaggc ttcccaactg 660
gccgaggtca gaagctactg ttaccatgcc agcgtgacag atatttccac agtggctagg 720
tgcccaacta caggcgaggc ccacaacgag aaaagggctg atagtagcta tgtctgtaaa 780
cagggcttta ccgatcgggg gtggggcaac gggtgtgggc tgttcgggaa ggggtccatt 840
gatacctgtg ctaagttcag ttgcacttcc aaggccatcg gcaggacaat tcagcctgag 900
aatattaagt acgaggtcgg catctttgtg cacgggacaa ccacaagcga gaaccacggg 960
aactactccg ctcaagtggg cgccagccag gccgccaagt ttacagtgac tcccaacgcc 1020
cccagtatta ctctgaagct gggagactat ggcgaggtga ccctggattg cgagcccaga 1080
tccggcctga acaccgaggc tttttacgtg atgacagtcg gctccaagag tttcttggtg 1140
cacagggagt ggtttcacga cctcgctctc ccctggacaa gcccctcctc aactgcttgg 1200
agaaacagag agctcctgat ggagttcgaa gaggctcatg ccactaagca gagcgtcgtg 1260
gcattgggga gtcaggaagg cggactccac caggcccttg ccggagccat cgtggtcgag 1320
tacagctcaa gcgtgaagtt gaccagtgga cacctgaagt gtagactgaa gatggacaaa 1380
ctggctctga aggggacaac atacggcatg tgcaccgaga agttcagctt cgccaaaaat 1440
cccgcagaca ccgggcatgg gacagtcgtc atcgagctta gctacagcgg ctccgacgga 1500
ccatgcaaga ttccaattgt gagcgtggcc tctctcaacg atatgactcc cgtgggccgg 1560
ctggtgactg tgaacccatt cgtggccact tccagcgcta acagcaaggt gttggtggag 1620
atggagccac ctttcgggga cagctatatt gtggtggggc ggggagacaa acagatcaac 1680
catcattggc acaaggccgg gtcaacactc ggcaaggcct tttcaacaac tctcaaggga 1740
gcccagagac tggccgccct cggcgacaca gcctgggatt tcgggtcaat cggcggggtg 1800
ttcaactcaa tcgggaaggc tgtccaccag gtgttcggcg gagcctttcg gaccctg 1857
<210> 24
<211> 619
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> prM-EdeltaTM protein.
<400> 24
Met Lys Leu Ser Asn Phe Gln Gly Lys Leu Leu Met Thr Ile Asn Asn
1 5 10 15
Thr Asp Ile Ala Asp Val Ile Val Ile Pro Thr Ser Lys Gly Glu Asn
20 25 30
Arg Cys Trp Val Arg Ala Ile Asp Val Gly Tyr Met Cys Glu Asp Thr
35 40 45
Ile Thr Tyr Glu Cys Pro Lys Leu Thr Met Gly Asn Asp Pro Glu Asp
50 55 60
Val Asp Cys Trp Cys Asp Asn Gln Glu Val Tyr Val Gln Tyr Gly Arg
65 70 75 80
Cys Thr Arg Thr Arg His Ser Lys Arg Ser Arg Arg Ser Val Ser Val
85 90 95
Gln Thr His Gly Glu Ser Ser Leu Val Asn Lys Lys Glu Ala Trp Leu
100 105 110
Asp Ser Thr Lys Ala Thr Arg Tyr Leu Met Lys Thr Glu Asn Trp Ile
115 120 125
Ile Arg Asn Pro Gly Tyr Ala Phe Leu Ala Ala Val Leu Gly Trp Met
130 135 140
Leu Gly Ser Asn Asn Gly Gln Arg Val Val Phe Thr Ile Leu Leu Leu
145 150 155 160
Leu Val Ala Pro Ala Tyr Ser Phe Asn Cys Leu Gly Met Gly Asn Arg
165 170 175
Asp Phe Ile Glu Gly Ala Ser Gly Ala Thr Trp Val Asp Leu Val Leu
180 185 190
Glu Gly Asp Ser Cys Leu Thr Ile Met Ala Asn Asp Lys Pro Thr Leu
195 200 205
Asp Val Arg Met Ile Asn Ile Glu Ala Ser Gln Leu Ala Glu Val Arg
210 215 220
Ser Tyr Cys Tyr His Ala Ser Val Thr Asp Ile Ser Thr Val Ala Arg
225 230 235 240
Cys Pro Thr Thr Gly Glu Ala His Asn Glu Lys Arg Ala Asp Ser Ser
245 250 255
Tyr Val Cys Lys Gln Gly Phe Thr Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys
260 265 270
Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ile Asp Thr Cys Ala Lys Phe Ser Cys
275 280 285
Thr Ser Lys Ala Ile Gly Arg Thr Ile Gln Pro Glu Asn Ile Lys Tyr
290 295 300
Glu Val Gly Ile Phe Val His Gly Thr Thr Thr Ser Glu Asn His Gly
305 310 315 320
Asn Tyr Ser Ala Gln Val Gly Ala Ser Gln Ala Ala Lys Phe Thr Val
325 330 335
Thr Pro Asn Ala Pro Ser Ile Thr Leu Lys Leu Gly Asp Tyr Gly Glu
340 345 350
Val Thr Leu Asp Cys Glu Pro Arg Ser Gly Leu Asn Thr Glu Ala Phe
355 360 365
Tyr Val Met Thr Val Gly Ser Lys Ser Phe Leu Val His Arg Glu Trp
370 375 380
Phe His Asp Leu Ala Leu Pro Trp Thr Ser Pro Ser Ser Thr Ala Trp
385 390 395 400
Arg Asn Arg Glu Leu Leu Met Glu Phe Glu Glu Ala His Ala Thr Lys
405 410 415
Gln Ser Val Val Ala Leu Gly Ser Gln Glu Gly Gly Leu His Gln Ala
420 425 430
Leu Ala Gly Ala Ile Val Val Glu Tyr Ser Ser Ser Val Lys Leu Thr
435 440 445
Ser Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Lys Met Asp Lys Leu Ala Leu Lys
450 455 460
Gly Thr Thr Tyr Gly Met Cys Thr Glu Lys Phe Ser Phe Ala Lys Asn
465 470 475 480
Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Ile Glu Leu Ser Tyr Ser
485 490 495
Gly Ser Asp Gly Pro Cys Lys Ile Pro Ile Val Ser Val Ala Ser Leu
500 505 510
Asn Asp Met Thr Pro Val Gly Arg Leu Val Thr Val Asn Pro Phe Val
515 520 525
Ala Thr Ser Ser Ala Asn Ser Lys Val Leu Val Glu Met Glu Pro Pro
530 535 540
Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Val Gly Arg Gly Asp Lys Gln Ile Asn
545 550 555 560
His His Trp His Lys Ala Gly Ser Thr Leu Gly Lys Ala Phe Ser Thr
565 570 575
Thr Leu Lys Gly Ala Gln Arg Leu Ala Ala Leu Gly Asp Thr Ala Trp
580 585 590
Asp Phe Gly Ser Ile Gly Gly Val Phe Asn Ser Ile Gly Lys Ala Val
595 600 605
His Gln Val Phe Gly Gly Ala Phe Arg Thr Leu
610 615
<210> 25
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> the last 15 amino acids of the prM/M protein.
<400> 25
Val Val Phe Thr Ile Leu Leu Leu Leu Val Ala Pro Ala Tyr Ser
1 5 10 15
<210> 26
<211> 636
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of HIV1- 5'LTR
<400> 26
tggaagggct aattcactcc caacgaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca 60
cacaaggcta cttccctgat tagcagaact acacaccagg gccagggatc agatatccac 120
tgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagcc agagaagtta gaagaagcca 180
acaaaggaga gaacaccagc ttgttacaac ctgtgagcct gcatgggatg gatgacccgg 240
agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac ggtggcccga 300
gagctgcatc cggagtactt caagaactgc tgatatcgag cttgctacaa gggactttcc 360
gctgggggac tttccaggga ggcgtggcct gggcgggact ggggagtggc gagccctcag 420
atcctgcata taagcagctg ctttttgcct gtactgggtc tctctggtta gaccagatct 480
gagcctggga gctctctggc taactaggga acccactgct taagcctcaa taaagcttgc 540
cttgagtgct tcaagtagtg tgtgcccgtc tgttgtgtga ctctggtaac tagagatccc 600
tcagaccctt ttagtcagtg tggaaaatct ctagca 636
<210> 27
<211> 234
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of RRE
<400> 27
aggagctttg ttccttgggt tcttgggagc agcaggaagc actatgggcg cagcgtcaat 60
gacgctgacg gtacaggcca gacaattatt gtctggtata gtgcagcagc agaacaattt 120
gctgagggct attgaggcgc aacagcatct gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca 180
gctccaggca agaatcctgg ctgtggaaag atacctaaag gatcaacagc tcct 234
<210> 28
<211> 124
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of cPPT-CTS
<400> 28
ttttaaaaga aaagggggga ttggggggta cagtgcaggg gaaagaatag tagacataat 60
agcaacagac atacaaacta aagaattaca aaaacaaatt acaaaaattc aaaattttcg 120
ggtt 124
<210> 29
<211> 527
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of CMV promoter
<400> 29
cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60
gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 120
atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 180
aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 240
catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 300
catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 360
atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 420
ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 480
acggtgggag gtctatataa gcagagctcg tttagtgaac cgtcaga 527
<210> 30
<211> 605
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of WPRE
<400> 30
aattcccgat aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa 60
ctatgttgct ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat 120
tgcttcccgt atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta 180
tgaggagttg tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc 240
aacccccact ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt 300
ccccctccct attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg 360
ggctcggctg ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc 420
atggctgctc gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 480
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 540
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgca 600
tcggg 605
<210> 31
<211> 262
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of HIV1- 3'LTR
<400> 31
actggaaggg ctaattcact cccaacgaag acaagatcgt cgagagatgc tgcatataag 60
cagctgcttt ttgcttgtac tgggtctctc tggttagacc agatctgagc ctgggagctc 120
tctggctaac tagggaaccc actgcttaag cctcaataaa gcttgccttg agtgcttcaa 180
gtagtgtgtg cccgtctgtt gtgtgactct ggtaactaga gatccctcag acccttttag 240
tcagtgtgga aaatctctag ca 262
<210> 32
<211> 2073
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of the polynucleotide encoding the signal
peptide-prME protein.
<400> 32
atgggcggaa acgaagggtc cattatgtgg ctcgcctccc tggccgtggt gatcgcctgc 60
gccggagcaa tgaagctgtc caactttcag gggaagctgc tcatgacaat taacaacact 120
gatattgccg atgtcattgt catccctaca tccaagggcg aaaaccggtg ctgggtccgg 180
gccatcgacg tcgggtacat gtgcgaagat accattacat acgaatgccc caagctgacc 240
atgggaaacg atcctgagga cgtggattgc tggtgcgaca accaggaggt gtacgtgcag 300
tacgggcggt gcacaaggac acggcactcc aagcgctctc ggcggagcgt gtccgtgcag 360
acccacggcg agtcttctct cgtcaacaag aaggaggcat ggctggatag cactaaggcc 420
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<210> 33
<211> 1929
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of the polynucleotide encoding the signal
peptide-prMEdeltaTM protein.
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<211> 5866
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> recombinant lentiviral backbone TRIPdeltaU3.CMV/JEV.prME
<400> 34
tggaagggct aattcactcc caacgaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca 60
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<220>
<223> recombinant lentiviral backbone TRIPdeltaU3.CMV/JEV.prMEdeltaTM
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agatggacaa actggctctg aaggggacaa catacggcat gtgcaccgag aagttcagct 4320
tcgccaaaaa tcccgcagac accgggcatg ggacagtcgt catcgagctt agctacagcg 4380
gctccgacgg accatgcaag attccaattg tgagcgtggc ctctctcaac gatatgactc 4440
ccgtgggccg gctggtgact gtgaacccat tcgtggccac ttccagcgct aacagcaagg 4500
tgttggtgga gatggagcca cctttcgggg acagctatat tgtggtgggg cggggagaca 4560
aacagatcaa ccatcattgg cacaaggccg ggtcaacact cggcaaggcc ttttcaacaa 4620
ctctcaaggg agcccagaga ctggccgccc tcggcgacac agcctgggat ttcgggtcaa 4680
tcggcggggt gttcaactca atcgggaagg ctgtccacca ggtgttcggc ggagcctttc 4740
ggaccctgtg atgactcgag ctcaagcttc gaattcccga taatcaacct ctggattaca 4800
aaatttgtga aagattgact ggtattctta actatgttgc tccttttacg ctatgtggat 4860
acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg tatggctttc attttctcct 4920
ccttgtataa atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt gtggcccgtt gtcaggcaac 4980
gtggcgtggt gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac tggttggggc attgccacca 5040
cctgtcagct cctttccggg actttcgctt tccccctccc tattgccacg gcggaactca 5100
tcgccgcctg ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct gttgggcact gacaattccg 5160
tggtgttgtc ggggaagctg acgtcctttc catggctgct cgcctgtgtt gccacctgga 5220
ttctgcgcgg gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct caatccagcg gaccttcctt 5280
cccgcggcct gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct tcgccttcgc cctcagacga 5340
gtcggatctc cctttgggcc gcctccccgc atcgggaatt ctgcagtcga cggtaccttt 5400
aagaccaatg acttacaagg cagctgtaga tcttagccac tttttaaaag aaaagggggg 5460
actggaaggg ctaattcact cccaacgaag acaagatcgt cgagagatgc tgcatataag 5520
cagctgcttt ttgcttgtac tgggtctctc tggttagacc agatctgagc ctgggagctc 5580
tctggctaac tagggaaccc actgcttaag cctcaataaa gcttgccttg agtgcttcaa 5640
gtagtgtgtg cccgtctgtt gtgtgactct ggtaactaga gatccctcag acccttttag 5700
tcagtgtgga aaatctctag ca 5722
<210> 36
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ctcgagttta ctccctatca gtga 24
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tcacacagat aaacttctcg gttcactaaa cgagct 36
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agctcgttta gtgaaccgag aagtttatct gtgtga 36
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tgataagagc cagcacgaat cg 22
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<213> Artificial Sequence
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gaagatctat gactaaaaaa ccaggagggc ccggt 35
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<223> Primer
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ttctgcagtc aagcatgcac attggtcgct aaga 34

Claims (27)

1.一种重组慢病毒载体基因组，所述基因组包含慢病毒顺式活性元件、Ψ包装信号、Rev响应元件(RRE)和DNA垂悬部分中心多嘌呤序列(cPPT)/中央终止序列(CTS)，以及编码日本脑炎病毒(JEV)膜蛋白前体(prM)和包膜蛋白(E)或其免疫原性片段的转录单位，所述顺式活性元件包括长末端重复(LTR)或修饰的LTR，包括部分缺失的3’LTR。
2.如权利要求1所述的重组慢病毒载体基因组，其中所述E蛋白是全长E蛋白或缺失全长E蛋白的2个C末端跨膜结构域的其可溶形式。
3.如权利要求1或2所述的重组慢病毒载体基因组，其中所述慢病毒3’LTR中缺失U3区的启动子和激活子，且其中将编码prM和E蛋白的多核苷酸置于异源启动子控制下，例如巨细胞病毒立早(CMVie)启动子。
4.如权利要求1-3中任一项所述的重组慢病毒载体基因组，其中所述编码prM蛋白的多核苷酸具有SEQ ID NO:5的序列且编码E蛋白的多核苷酸具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11的序列。
5.如权利要求1-4中任一项所述的重组慢病毒载体基因组，其中所述慢病毒载体基因组衍生自HIV，特别是HIV-1的基因组。
6.如权利要求1-5中任一项所述的重组慢病毒载体基因组，其中所述慢病毒载体基因组衍生自FIV基因组。
7.如权利要求1-6中任一项所述的重组慢病毒载体基因组，其是因为所述慢病毒基因组的所有或部分gag和pol基因缺失或者所述慢病毒基因组的gag和pol基因突变，从而gag和pol基因不能编码功能性GAG和POL蛋白所致的复制缺陷型。
8.如权利要求1-7中任一项所述的重组慢病毒载体基因组，其是核酸序列由SEQ IDNO:34所限定的pTRIPΔU3.CMV/JEV.prME载体，或核酸序列由SEQ ID NO:35所限定的pTRIPΔU3.CMV/JEV.prMEΔTM载体。
9.如权利要求1-8中任一项所述的重组慢病毒载体基因组，其中所述prM和E编码序列是JEV基因型3(G3)的，例如JEV RP9株或JEV中山株。
10.一种DNA质粒，所述质粒包含权利要求1-9中任一项所述的重组慢病毒载体基因组。
11.一种宿主细胞，所述细胞用权利要求10所述的DNA质粒转染或遗传转化，特别地，其是HEK 293T(人胚肾)细胞系。
12.表达权利要求1-9中任一项所述重组慢病毒载体基因组的重组慢病毒载体颗粒，所述载体颗粒用水泡性口炎病毒糖蛋白G(VSV-G)蛋白质进行假型化，尤其是用VSV印第安纳株VSV-G或新泽西株的VSV蛋白进行假型化。
13.如权利要求12所述的重组慢病毒载体颗粒，用作在哺乳动物中针对JEV感染的预防性治疗的活性成分，所述哺乳动物是动物或人。
14.如权利要求13所述的重组慢病毒载体颗粒，其中所述动物是猪或小猪，特别是家猪或家养小猪。
15.如权利要求12-14中任一项所述的重组慢病毒载体颗粒，其是因为所述慢病毒的pol基因突变或缺失所致的整合缺陷型。
16.如权利要求12-15中任一项所述的重组慢病毒载体颗粒，用作活性成分并以适于引发针对JEV prM和/或E蛋白的抗体应答，尤其是针对JEV prM和/或E蛋白的保护性抗体应答的剂量施用，所述剂量是单剂量或多剂量。
17.如权利要求12-16中任一项所述的重组慢病毒载体颗粒，用作在哺乳动物中针对JEV感染的预防性治疗的活性成分，所述哺乳动物是动物或人，其中所述治疗包括以初免-加强方案施用所述重组慢病毒载体。
18.如权利要求17所述的用于所述用途的重组慢病毒载体颗粒，其中用于初次引发免疫应答的慢病毒载体颗粒和加强该应答的慢病毒载体颗粒用不同的非交叉反应VSV-G包膜蛋白进行假型化，特别是用印第安纳VSV株的VSV-G蛋白或新泽西VSV株的VSV-G蛋白进行假型化。
19.如权利要求17或18所述的重组慢病毒载体颗粒，用于针对JEV基因型G1、G3和任选地G5感染的预防性治疗。
20.如权利要求17或18所述的重组慢病毒载体颗粒，用于针对JEV基因型G3感染的预防性治疗。
21.一种免疫原性组合物，所述组合物包含权利要求12-20中任一项所述的重组慢病毒载体颗粒，剂量足以引发哺乳动物宿主的免疫抗体应答，其包含或不包含辅助佐剂。
22.如权利要求21所述的免疫原性组合物，其是冻干形式，在冷冻保护性化合物如海藻糖存在的情况下进行冻干。
23.如权利要求21或22所述的免疫原性组合物，其中配制所述组合物用于经胃肠外途径施用，如皮下(s.c.)、皮内(i.d.)、肌肉内(i.m.)、腹膜内(i.p.)或静脉内(i.v.)注射。
24.如权利要求21-23中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述组合物配制成以一个或多个施用剂量施用，尤其是以初免-加强施用方案施用。
25.免疫学有效量的权利要求12-20中任一项所述重组慢病毒载体颗粒或权利要求21-24中任一项所述免疫原性组合物，用于在哺乳动物宿主特别是人或动物宿主中针对JEV感染，尤其是当JEV为基因型3或1或5时，进行预防性免疫，其中所述颗粒或组合物与药学上可接受的载剂和/或佐剂混合。
26.一种生产适于制备JEV疫苗的重组慢病毒载体颗粒的方法，所述方法包括以下步骤或由以下步骤组成：
a)在宿主细胞如HEK-293T细胞系中转染重组慢病毒转移载体，所述载体携带权利要求1-9中任一项所述慢病毒载体基因组；
b)用编码包膜蛋白VSG尤其是印第安纳或新泽西VSV株的VSV-G的质粒载体以及编码慢病毒GAG和POL或突变的POL蛋白的作为包装构建体的质粒载体共转染步骤a)的细胞；
c)回收表达JEV抗原的重组慢病毒颗粒。
27.如权利要求1-9中任一项所述的重组慢病毒载体基因组或如权利要求12-20中任一项所述的重组慢病毒载体颗粒作为活性成分用于体外产生免疫原性组合物的用途。
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