CN1429911A

CN1429911A - 慢病毒载体系统，产生载体的方法及其应用

Info

Publication number: CN1429911A
Application number: CN 01130159
Authority: CN
Inventors: 李信墙
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-12-30
Filing date: 2001-12-30
Publication date: 2003-07-16

Abstract

本发明公开了一种能感染或转导分裂或不分裂哺乳动物靶细胞的高安全性的慢病毒载体系统，载体不含有或少含有辅助基因，也不含有或少含有重叠基因组，且所含基因处于T7启动子和终止子之间或痘病毒启动子和终止子之间：本发明还公开了一种生产高滴度且安全性好的慢病毒载体的方法，包括构建质粒组，质粒组转导细胞，并用痘病毒感染而获得载体；还公开了慢病毒载体在制备药品或治疗疾病中的应用。

Description

慢病毒载体系统，产生载体的方法及其应用

发明所属领域

本发明涉及一种慢病毒载体系统，具体的说，本发明涉及能感染或转导分裂或不分裂哺乳动物靶细胞的慢病毒载体系统，载体不含有或少含有辅助基因和重叠基因，以及利用痘病毒产生慢病毒载体的方法以及获得的慢病毒载体在制备药品或治疗疾病中的应用。

背景技术状况

基因治疗是纠正人类缺失基因的最终办法，广泛地说基因治疗要取得成功要依靠一个有效的基因转移系统，这个系统要求有效的基因治疗领域的状况是有很多可以弥补相应缺陷的有用基因，但是缺乏基因传递的载体，这样研究一种基因载体去适应基因传递的要求就很重要。

现在基因传递系统分为两类：病毒型和非病毒型。从各种病毒衍生出的病毒载体包括逆转录病毒，腺病毒、腺病毒相关病毒、picarnovirus、假病毒属等。慢病毒载体被认为是目前最有潜力的用于基因治疗的载体，慢病毒载体通过慢病毒衍生而来。HIV、SIV和FIV等都属于这个家族的。

基于HIV的载体是目前研究得最多的一种。它们被证明能在体内高效的转移基因，并能完成传递基因在各种器官中长期表达，像在脑中，视网膜中，肝中和肌肉中。再有它能把基因转移到分化的细胞和未分化的细胞。而且，用这个带有基因地载体可以被简单的注射液传输。最后，这个载体为了达到不同的靶细胞和组织可用各种各样不同类型的包膜蛋白包装成病毒粒子。通过改变胞膜，载体粒子还可以避开先前形成的抗特殊胞膜的抗体。

Iwakuma.T.等建立一个HIV-1衍生载体生产系统，包括三个质粒：一个包装载体pHP2，一个转化质粒pTV，和一个可编码质粒pHEF-VSV-G。把这三个质粒共转染进TE671人类横纹肌肉瘤细胞一天能产生出10⁵-10⁶感染浓度/每毫升病毒载体。它们修饰了PTV的长重复末端，构建了一个安全的慢病毒生产系统，用切除末端的巨细胞病毒的早期直接增强启动子替代5’端U3，并删除了3’端U3，即使这种优势修饰也有产生衍生病毒的可能。再删除3’端U5则会削弱载体的功能，导致这个系统的安全性都比较低。

由Naldini等创立的，并由Dull等发展完善的慢病毒载体系统里，单独编码HIV gag/pol，Rev，VSV-G胞膜蛋白和RNA载体的4个质粒要用于转染293T细胞。当HIV-1前体多聚蛋白gag/pol和Gag在生产载体粒子的细胞表达后，它们接着包装载体RNA并从细胞膜芽裂形成病毒粒子，当VSV-G蛋白与Gag/Pol共表达，得到的质粒将会在其表面存在VSV-G蛋白，这就可以使粒子进入宿主细胞更容易。尽管这个包装系统限制了很多HIV附属蛋白的表达，但由于有几个重叠区，所以有可能引起重组产生复制的活病毒，一个是RRE编码序列，有234bp长，而且存在于载体RNA编码质粒和编码gag/pol的质粒中。第二个是在5’末端编码区域长350bp得到一个含有5’LTR的DNA片断，剪接供体和受体，gag/pol，RRE，和3’段LTR的重组型，可以增加活病毒的复制。再有这个系统需要用4个不同质粒同时进入一个核的可能性比一个或两个质粒同时进入核的可能性低得多，这肯定会减低生产效率。慢病毒载体的报道序列通常只有10⁵的转导区用于小规模的生产。最后，在转染过程中，一些质粒会整合到宿主细胞的染色体上，这个系统用修饰了的细胞系统生产载体粒子，它有从载体生产细胞里得到致癌基因地潜在危险性，并把基因整合到受体细胞的染色体上。

中国专利9719888.3采用在启动子位于5’长末端重复序列(LTR)的非慢病毒表达调控元件，且定位于LTR的中间，中国专利97198767.X提出了一种不含有或少含有慢病毒辅助基因的慢病毒载体，既是这样，由于基因间存在着重叠区，存在着回复突变的危险性，另外，各基因间的启动子处于杂乱无章中，影响相互之间的协调，导致产量不高。

尽管目前研究的众多慢病毒载体有许多优点，但其缺点是在制备载体的过程中有形成的复制型病毒存在的潜在危险性。这个安全性问题阻碍了慢病毒载体用于人类的基因治疗。另一个问题是很难达到生产载体病毒的高滴度，这样使这个载体系统很难用于治疗。

发明技术内容

本发明的目的是提供一种新型的高安全性的慢病毒载体系统，该系统不含有辅助基因或重叠基因，安全性高。

本发明的另一个目的是提供一种生产高滴度且安全性好的慢病毒载体的生产方法。

本发明的再一个目的是慢病毒载体在制备药品和治疗疾病中的应用。

一种能感染或转导分裂或不分裂哺乳动物靶细胞的慢病毒载体系统，不含有或少含有辅助基因，其特征是：慢病毒载体基因不含有或少含有重叠基因组，且所含基因处于T7启动子和终止子之间或痘病毒启动子和终止子之间。

HIV-1病毒的辅助基因包括Vpr，Vif，Tat，Nef，以及其它慢病毒的类似辅助基因，不重叠基因指基因编码序列不重叠，主要是指其结构基因，蛋白基因和调控基因，特别是Rev及U3启动子

一种优化的慢病毒载体系统，其慢病毒载体基因包括：

(1)GAG-POL基因处于痘病毒启动子和终止子之间；

(2)VSV-G基因处于T7启动子和终止子之间；

(3)载体RNA编码序列处于T7启动子和终止子之间。一种更优化的慢病毒载体系统，其慢病毒载体基因包括：

(1)来源于HIV-1的GAG-POL基因处于痘病毒启动子和终止子之间；

(2)来源于水泡性口膜炎病毒糖蛋白的VSV-G基因处于T7启动子和终止子之间；

(3)载体RNA编码序列处于T7启动子和终止子之间，且T7启动子之后连着3个G核甘酸序列，再于R和U5相连。

来源于HIV-1的GAG-POL基因最好处于痘病毒PvacE/L启动子和Tvac终止子之间；载体RNA编码序列从5’端到3’端的最佳顺序为T7启动子，3G序列，R，U5，起始子结合位点，包装信号，CMV启动子，增强性绿色荧光蛋白编码区，多聚嘌呤序列(PPT)，U3，3G序列，R，和T7终止子。

由于包膜上含有VSV-G蛋白容易引起细胞融合，而且VSV-G蛋白在载体的生产细胞里过量表达，会导致大量的细胞融合，因此采用传统的系统生产载体粒子会降低载体粒子的产量。本发明为了抑制VSV-G蛋白在包装细胞中的过量表达，用T7启动子调控VSV-G蛋白表达。在用再用含T7噬菌体RNA聚合酶的痘病毒感染细胞，只有10％T7RNA聚合酶的转录物加了帽，能被宿主细胞的翻译系统表达。用T7RNA聚合酶能抑制有功能的mRNA及其蛋白的合成。再者，在载体RNA编码序列里，直接在T7启动子后设置了三个G，以提高T7RNA聚合酶的转录效率，得到的载体RNA转录物在5’端有三各G，在逆转录过程中，有载体5’端复制的强终止子DNA与载体RNA3’端通过3’R的碱基互补配对退火。为了使逆转录不断进行，在3’U3和R之间需有三个G才能同强终止子DNA 3’末端的3个G互补配对，HIV-1HB株的基因组RNA在3’U3和R中间有3个G。这样的基因结构和独特的质粒，保证了构建载体系统的安全性和载体的高滴度

在这个载体系统里依赖含T7RNA聚合酶的痘病毒的转录安全在细胞质中进行，不需要HIV、Tat和Rev那种中间型的反势激活；再有，在包装系统中进行，也不需要U3启动子的功能；这个载体整合到宿主染色体后不会机会宿主细胞的癌基因，减少致病可能。为了克服在用痘病毒复制机制产生病毒载体中的污染感染性的痘病毒的重要问题，最佳方法是采用一个缺少必须基因D13L的缺陷型痘病毒。

一种生产慢病毒载体系统的方法，其特征是：制备不含有或少含有重叠基因组，且基因处于T7启动子和终止子之间或痘病毒启动子和终止子之间的质粒组，将质粒组转染入宿主细胞，再用含T7噬菌体RNA聚合酶的痘病毒感染已转染质粒组的宿主细胞而获得慢病毒载体。

一种优化的生产慢病毒载体系统的方法，其特征是：

制备下列质粒组

(1)在痘病毒启动子和终止子之间的，来源于HIV-1的GAG-POL质粒；

(2)在T7启动子和终止子之间的，来源于水泡性口膜炎病毒糖蛋白的VSV-G质粒；

(3)在T7启动子和终止子之间的载体RNA编码序列质粒，且在T7启动子之后连着3个G核甘酸序列，再与R和U5相连；

将上述三种质粒共转染宿主细胞，再用含T7噬菌体RNA聚合酶的痘病毒感染已转染质粒组的宿主细胞而获得慢病毒载体。

一种更优化的生产慢病毒载体系统的方法是先制备下列质粒组：

(1)痘病毒PvacE/L启动子和Tvac终止子之间的，来源于HIV-1的GAG-POL质粒；

(3)在T7启动子和终止子之间的载体RNA编码序列质粒，且从5’端到3’端的顺序为T7启动子，3G序列，R，U5，起始子结合位点，包装信号，CMV启动子，增强性绿色荧光蛋白编码区，多聚嘌呤序列，U3，3G序列，R，和T7终止子；

将上述三种质粒共转染宿主细胞，再用含T7噬菌体RNA聚合酶的痘病毒或者用含T7噬菌体RNA聚合酶的D13L缺陷型痘病毒感染已转染质粒组的宿主细胞而获得慢病毒载体。

D13L是编码一个病毒粒子组装所需的65kDa结构蛋白的。抑制它的表达不会影响病毒DNA的复制和病毒蛋白的合成，但会阻截病毒的形成，从而生产的载体中不含有痘病毒。

将在痘病毒启动子(PvacE/L)和终止子(Tvac)之间的HIV-1HXB2gag/pol多聚蛋白的开放阅读框克隆到质粒pUCl9的多克隆位点，从而得到pGAG-POL-Vpr，属于PNL4/3基因型。含有HIV-1HXB2gag/pol多聚蛋白的开放阅读框的pGAG-POL-Vpr质粒于2001年4月19日保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC M201014。

将在噬菌体T7启动子和终子之间的疱疹口炎性病毒G(VSV-G)蛋白开放阅读框克隆到质粒pT7的多克隆位点，从而得到质粒pVSV-G。在噬菌体T7启动予和终止子之间的疤疹口炎性病毒G(VSV-G)蛋白开放阅读框的pVSV-G质粒于2001年4月19日保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCCM201015。

在T7启动子和终止子之间的RNA编码序列，该序列的编码区排列顺序为从5’端到3’端顺序是R，UR，起始子结合位点，包装信号，CMV启动子，增强型绿色荧光蛋白(EGFP)编码区，多聚嘌吟序列，U3利R的质粒，克隆到质粒pBR322的多克隆位点，从而得到质粒pHIV，属于PNL4/3基因型。在T7启动子和终止子之间的RNA编码序列的pHIV质粒于2001年4月19门保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC M201017。

采用Lipofect Amine转染法，用等量的pGAG-POL-Vpr、pVSV-G和pHIV共转染HeLa细胞系，培养液是含2.5％胎牛血清的DMEM。经过4个小时的转染后，除去转染介质，并用含2.5％胎牛血清的DMEM取代，DMEM培养基中含有107pfuvTF7.3或vT7D13L重组痘病毒。经2小时的接种后，除去接种物，细胞在含2.5％胎牛血清的DMEM中进行培养。经48小时的温育后，收集含HIV-1型慢病毒裁体的细胞培养上清液。

与先前的载体系统及生产载体的系统比较，本发明的慢病毒载体系统和生产方法的优点是：

1.由这个系统生产出来的载体其生物安全性比现在所说的各种慢病毒载体都好。首先，我们从基因中除掉慢病毒的辅助蛋白基因和相应序列，以及重叠基因，包括Vpr，Vif，Tat，Nef，TAR，RRE，Rev及U3启动子，这样将会完全阻止活的慢病毒的复制。其次，因为载体的生产是完全在细胞质里进行的，大大减少了从生产载体粒子的细胞里携带基因到受体细胞的危险性。

2.本发明的载体系统里质粒只需要转运到细胞里，因此转运效率要比转运到细胞核中高很多；另外细胞质中的质粒DNA将被痘病毒DNA聚合酶复制，导致载体RNA的复制数和包装蛋白的合成将会增加，而且其自身蛋白质的合成依赖痘病毒的感染，宿主的蛋白合成机制将被动痘病毒同化，这将增加包装组分的合成。

本发明的慢病毒载体或本发明制备的载体在制备药品或治疗疾病中的应用。本发明的慢病毒载体可以被简单的注射液传输。

术语“载体RNA”是指含有一个外源基因表达框并能被包装成病毒粒子的RNA。

术语“病毒粒子”是指一个病毒基因组核苷酸被包装好的病毒。

术语“载体粒子”是指编码一个表达框的核苷酸被包装好的修饰过的病毒粒子。

术语“缺陷型痘病毒”是指缺少一个亲本痘病毒必须基因的痘病毒。

附图说明

图1显示了本发明慢病毒载体基因组的基本成分

图2显示了生产本发明慢病毒载体的示意图

图3显示了本发明慢病毒载体基因组的部分详细图

图4显示了制备缺陷型痘病毒vTF7-3D13L的示意图

具体实施例

实施例1.核心蛋白和酶类基因的质粒的构造：将在痘病毒启动子(PvacE/L)和终止子(Tvac)之间的HIV-1HXB2 gag/pol多聚蛋白的开放阅读框克隆到质粒pUCl9的多克隆位点，从而得到pGAG-POL-Vpr，属于PNL4/3基因型。含有HIV-1HXB2gag/pol多聚蛋白的开放阅读框的pGAG-POL-Vpr质粒于2001年4月19日保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC M201014。

实施例2外膜蛋白质粒的构造：将在噬菌体T7启动子和终子之间的疱疹口炎性病毒G(VSV-G)蛋白开放阅读框克隆到质粒pT7的多克隆位点，从而得到质粒pVSV-G。在噬菌体T7启动予和终止子之间的疤疹口炎性病毒G(VSV-G)蛋白开放阅读框的pVSV-G质粒于2001年4月19日保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCCM201015。

实施例3，载体RNA编码序列质粒的构造：在T7启动子和终止子之间的RNA编码序列，该序列的编码区排列顺序为从5’端到3’端顺序是R，UR，起始子结合位点，包装信号，CMV启动子，增强型绿色荧光蛋白(EGFP)编码区，多聚嘌吟序列，U3利R的质粒，克隆到质粒pBR322的多克隆位点，从而得到质粒pHIV，属于PNL4/3基因型。在T7启动子和终止子之间的RNA编码序列的pHIV质粒于2001年4月19门保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCCM201017。

实施例4检测载体生产细胞里的载体RNA、VSV-G蛋白、Gag和Gag-Pol的表达。

为了确定在用了质粒pVEC RNA、pGAG/POL和pVSV-G转染再用重组痘病毒VTG7-3感染的HeLa细胞的载体RNA、VSV-G蛋白和包装蛋白的表达。我们用Westem印迹除去Gag(55kDa)、Gag-pol(160kDa)，用Northen印迹除去全长载体RNA。用DNA酶处理从生产细胞里抽提的RNA，防止由遗留质粒DNA引起的假阳性。

实施例5检测细胞培养上清液里的载体粒子

为了检测细胞培养上清液里的载体粒子，我们检测HIV-1壳蛋白P24，逆转录酶活性和载体RNA。用0.2μm的滤膜过滤上清，除去细胞和残渣，避免HIV壳蛋白残留，和细胞里的载体RNA的残留。

检测P24。P24是HIV-1的壳蛋白。它经常作为病毒粒子数量的指示剂。可用ELISA方法检测细胞培养上清里含有的P24。

检测逆转录酶活性。逆转录酶存在于HIV病毒体里。它是在病毒体组装时病毒的蛋白水解酶剪切了前体Gag/Pol多聚蛋白形成的P51和P66的二聚体。这个逆转录酶的活性通常也作为载体粒子的指示剂。通常用于检测逆转录酶活性的方法是，检测抗原接触过酌dT，这个dT以在有polyA为模板时用逆转录酶标记上[a-³²pIdTTPl。

检测载体RNA，这个载体RNA能用RTPCR来检测。只有用RTPCR去肯定只有RNA被包装到载体粒子里，去除从破裂细胞里释放到培养基的RNA和编码载体RNA的质粒DNA这很重要。为了这个目的，要用RNA酶去处理载体生产细胞培养的上清液。被包膜保护的载体RNA要用硫氰酸胍再用苯酚氯仿抽提。用乙酸沉淀后，用水溶解RNA沉淀，再用DNA酶处理除去DNA。灭活DNA酶后，就可以用RTPCR法来去除RNA里的载体RNA了。可用400-500bp片段的报导基因作为起始子(引物)。如果载体RNA存在，DNA链的合成时必需用RTPCR而不是PCR。再有，全长载体RNA能用Northern印迹去除。为了达到用Northern印迹分析载体RNA的纳克水平，载体粒子需在抽提RNA前用超速离心法浓缩。

实施例6检测转化效率

制备的载体粒子的转化效率由两个标准判断：转化滴度和原始细胞的转化能力。转化的测量包括报导基因的表达和受体细胞的药物抗性基因。

靶细胞的转化：载体粒子被VSV-G蛋白包裹，因此在将载体粒子与靶细胞共同孵育时载体应可进入广谱的宿主细胞里。先进行初步实验，可用人类细胞如hela细胞检测载体粒子。如果成功，可用原始分化细胞和未分化细胞作为受体细胞。在初始研究中，应用复制型痘病毒重组体转录载体粒子。在载体粒子的制备物中残余的痘病毒会在几天内在细胞培养中扩散。为了避免痘病毒的感染，可以把EGFP的增加作为一个指示，在24小时宿主转化中EGFP的表达将被清除。当用缺陷型重组痘病毒作载体粒子的转导时，药物抗性标记(如，磷酸转移新霉素)可被用于筛选稳定的转导细胞。

载体粒子的滴度测定：测定载体粒子的滴度，要把靶细胞和经过一系列稀释的载体粒子生产细胞培养上清液起接种。然后计数转导细胞。利用载体所带的报导基因或药物抗性基因来观察或筛选细胞。

实施例7检测清除载体制备物中的活的复制型HIV-1

理论上，我们的包装系统不会在载体粒子产物中出现活的复制型HIV-1。但因为这个HI-1衍生载体将用于人类的基因治疗，我们必须肯定复制型活的HIV-1病毒不存在于载体粒子制备物中。我们用于指示复制型活HIV-1病毒存在的指示剂是重组产物5’LTR-gag/pol-3’LTR的存在。尽管5’LTRgag/pol-3，LTR本身不会导致复制型活HIV-1的出现，但这样的序列出现标志着通过复制型活病毒的重组也许出现。

为了检测5’LTR-gag/pol-3’LTR序列，HeLa细胞要和制备好的载体粒子一起接种，比例是每十个细胞对应一个载体，这样确保有足够的载体粒子的受体细胞。把细胞进行无选择培养。定期从细胞里抽提DNA，除去5’LTR-gag/pol-3’LTR，再用PCR法插入。

实施例8构建D13L一缺陷型痘病毒

为了用痘病毒作为辅助去生产慢病毒载体，需构建一个D131基因缺陷的能自由复制的活病毒。ZhangY和B.Moss已报导构建出一个重组痘病毒，他用Escherichia.coli(大肠杆菌)乳糖操纵子调控D13L基因表达。但在抑制剂IPTG存在时得到重组痘病毒的复制不能被完全抑制，这是由于有D13L基因残余转录物存在。为了完全去除D13L基因的表达，我们计划用细菌的gpt基因替代在vTF7-3里的D13L基因，从而除去痘病毒基因组中的D13L基团。生产和选择D13L缺陷型vTF7-3(vTF7-3ΔDl3L)的方法已在图4中列出。

制备D13L缺陷型重组子的第一步是：①构建一个目标质粒。它包含一个在痘病毒前后启动子和终止子之间的gpt编码组。gpt转录单元有两个侧翼500bp片段，且与D13L基因编码区上下游的侧翼序列同源。②用得到的质粒pGPT转染CV-I细胞(Arcc#ccL70)，再用vTF7-3重组痘病毒感染细胞。48小时后，收集细胞并裂解释放出痘病毒粒。③筛选出D13L基因缺陷型重组体vTF7-3Δ13L。用含有在痘病毒前后启动子控制下的D13L基因的质粒pDl31瞬时转染BS-C-11细胞(ATCC#CCL26)，然后用含有D13L缺陷型重组子的稀释细胞裂解液。在存在MPA(mycophenolic acid)，黄嘌吟和次黄嘌吟时，由于pDl3L提供D13L基因gpt阳性重组子将复制形成噬斑。收集噬斑，用³²P-标记的gptcDNA作为探针以Dotblootting法确定gpt基因的存在。Gpt阳性病毒经几次BS-C-1细胞的MPA筛选进一步纯化。为了确定gpt阳性病毒是D13L缺陷型，将进行不提供D13L基因时BS-C-1细胞培养中病毒无能力形成噬斑的试验。

复制型牛痘菌病毒的检测。为了增强检测的敏感性，我们用B一半乳糖苷酶作为复制型痘苗病毒的指示剂。Hela以在痘苗启动子控制下含LacZ基因的质粒瞬间感染，以使细胞被痘苗病毒感染后可表达β一半乳糖苷酶。对12孔板中转染的Hela用产载体颗粒细胞的上清滤液(0.45μm)接种。分时固定并取样观察表达β酶的细胞。表达酶的细胞数增加就说明制备物中存在复制型痘病毒。同时还应做Hela培养的痘病毒噬斑形成。

实施例9检测vTF7-3ΔDl3L生产能自由复制的活病毒的慢病毒载体粒子的能力。

用vTF7-3ΔDl3L生产慢病毒载体象“载体粒子牛产方法”里说的去做。检测包装蛋白，VSV-G蛋白和载体RNA的表达，壳按“检测载体RNA，VSV-G蛋白，6ag和Gag/pol在裁体生产细胞里表达”里的方法去做。检测载体粒子则按“检测细胞培养液中的载体粒子”里的方法去做。为了检测转化效率和活HIV的复制机制来检测载体粒子制备物可按“检测转化效率”和“清除在载体粒子里复制型活的HIV-1”里说的方法去做。另外，复制型活的HIV-1将用以下方法检测，保证载体制备物能自由复制活的痘病毒。

清除复制型活的痘病毒。为了增强检测的敏感性，我们用β一半乳糖苷酶作为复制型痘苗病毒的指示剂。对Hela细胞用在痘病毒启动子控制下含lacZ基因的质粒进行瞬时感染，以便细胞被痘病毒感染后可表达β一半乳糖苷酶。对12孔板中转染的Hela细胞用产载体颗粒细胞的的上清滤液(0.45um)接种。分时固定并取样观察表达β一半乳糖苷酶的细胞。表达β一半乳糖苷酶的细胞数量增加就说明制备物中存在复制型痘病毒。

同时噬菌斑的形成将检测Hela细跑的培养。

实施例10测定HIV-1型基因转移载体的滴度

在24孔板中加入HeLa细胞，每孔10⁵个细胞，24小时后，用含1％胎牛血清的Opti-DMEM(GIBCO-BRL)将收集的实施例⑤细胞培养物上清夜10倍稀释，每孔加入1M1的稀释后的上清液。24小时后，绿色荧光细胞就可以用显微镜进行计数。

Claims

1.一种能感染或转导分裂或不分裂哺乳动物靶细胞的慢病毒载体系统，不含有或少含有辅助基因，其特征是：慢病毒载体基因不含有或少含有重叠基因组，且所含基因处于T7启动子和终止子之间或痘病毒启动子和终止子之间。

2.根据权利要求1所述的慢病毒载体系统，其特征是：慢病毒载体基因不含有或少含有HIV-1辅助基因或重叠基因，Vpr，Vif，Tat，Nef，Rev及U3启动子

3.根据权利要求1所述的慢病毒载体系统，其特征是：慢病毒载体基因

(1)GAG-POL基因处于痘病毒启动子和终止子之间；

(2)VSV-G基因处于T7启动子和终止子之间；

(3)载体RNA编码序列处于T7启动子和终止子之间。

4.根据权利要求3所述的慢病毒载体系统，其特征是：慢病毒载体基因

(1)来源于HIV-1的GAG-POL基因处于痘病毒启动子和终止子之间；

5.根据权利要求4所述的慢病毒载体系统，其特征是：载体RNA编码序列从5’端到3’端的顺序为T7启动子，3G序列，R，U5，起始子结合位点，包装信号，CMV启动子，增强性绿色荧光蛋白编码区，多聚嘌呤序列(PPT)，U3，3G序列，R，和T7终止子。

6.根据权利要求4所述的慢病毒载体系统，其特征是：来源于HIV-1的GAG-POL基因处于痘病毒PvacE/L启动子和Tvac终止子之间；

7.生产权利要求1-6所述的慢病毒载体系统的方法，其特征是：制备不含有或少含有重叠基因组，且基因处于T7启动子和终止子之间或痘病毒启动子和终止子之间的质粒组，将质粒组转染入宿主细胞，再用含T7噬菌体RNA聚合酶的痘病毒感染已转染质粒组的宿主细胞而获得慢病毒载体。

8.根据权利要求7所述的慢病毒载体生产方法，其特征是：

制备下列质粒组

(3)在T7启动子和终止子之间的载体RNA编码序列质粒，且在T7启动子之后连着3个G核甘酸序列，再与R和U5相连；将上述三种质粒共转染宿主细胞，再用含T7噬菌体RNA聚合酶的痘病毒感染已转染质粒组的宿主细胞而获得慢病毒载体。

9.根据权利要求8所述的慢病毒载体生产方法，其特征是：制备下列质粒组

(3)在T7启动子和终止子之间的载体RNA编码序列质粒，且从5’端到3’端的顺序为T7启动子，3G序列，R，U5，起始子结合位点，包装信号，CMV启动子，增强性绿色荧光蛋白编码区，多聚嘌呤序列，U3，3G序列，R，和T7终止子；将上述三种质粒共转染宿主细胞，再用含T7噬菌体RNA聚合酶的痘病毒感染已转染质粒组的宿主细胞而获得慢病毒载体。

10.根据权利要求9所述的慢病毒载体生产方法，其特征是：

制备下列质粒组

(1)CCTCC-M201014

(2)CCTCC-M201015

(3)CCTCC-M201017

将上述三种质粒共转染宿主细胞，再用含T7噬菌体RNA聚合酶的D13L缺陷型痘病毒感染已转染质粒组的宿主细胞而获得慢病毒载体。

11.慢病毒载体在制备药品或治疗疾病中的应用。