CN103946385B - 作为对抗hiv-1的疫苗的嵌合非整合型慢病毒基因组 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种含有非整合型嵌合逆转录病毒基因组的核酸，所述非整合型嵌合逆转录病毒基因组包括：不整合至人类细胞中的山羊慢病毒、山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)或另一逆转录病毒的5’和3’的长末端重复序列(LTR)；以及另一逆转录病毒的至少一种病毒基因。本发明还涉及含有这种核酸的载体，含有所述载体或所述核酸的免疫原性组合物或疫苗组合物，以及它们在治疗和/或预防由逆转录病毒引起的感染或由病原体诱导的疾病中的应用。

Description

作为对抗HIV-1的疫苗的嵌合非整合型慢病毒基因组
技术领域
本发明的目标是核酸，该核酸包括非整合型嵌合逆转录病毒基因组，所述非整合型嵌合逆转录病毒基因组包括：不整合至人类细胞中的山羊慢病毒(山羊关节炎-脑炎病毒VAEC(或在英语中为CaprineArthritisEncephalitisVirus，CAEV))或另一逆转录病毒的5’和3’末端重复序列(STR、或在英语中为长末端重复序列(LongTerminalRepeat，LTR))；以及，另一逆转录病毒的至少一种病毒基因。本发明还涉及含有这种核酸的载体，含有所述载体或所述核酸的免疫原性组合物或疫苗组合物，以及它们在治疗和/或预防由逆转录病毒所引起的感染或由病原体所诱导的疾病中的应用。
背景技术
目前，开发对抗逆转录病毒感染的有效疫苗是全球重大公共卫生挑战。最近，已经基于具有能够在被接种的宿主中表达免疫原性蛋白的载体的应用，开发了疫苗。在细菌中进行扩增后，这些疫苗的载体经纯化并且被直接注射至需要接种的宿主中。因此，通过宿主细胞控制载体，表达免疫原性蛋白并且将该免疫原性蛋白提供到I类和II类主要组织相容性复合体的分子中，从而能够引起对抗这些免疫原性蛋白的免疫应答。凭借逆转录病毒的疫苗载体进行的首次接种测试给出了如下的可能性：示出在鸡群中进行对抗劳斯氏肉瘤病毒(Chebloune等人.，1991，JVirol，65，5374-5380)、新城疫病毒(Cosset，Bouquet等人，1991，Virology185，862-866)以及随后的流感病毒(Robinson，HuntetWebster，1993，Vaccine，11(9)：957-960)的免疫是可能的。
该接种途径对于控制人类免疫缺陷病毒(HIV)是尤其感兴趣的。现今，获得性免疫缺陷综合症(AIDS)仍然是全球性公共卫生难题，有大于三千三百万的已感染个体，并且有大于2百万的个体死亡以及每天有大约3百万的新感染者。非洲是受感染最多的大陆，但是感染正在亚洲和一些东欧国家中快速增长，该现象无疑是由于缺少早期检测的手段并且缺乏对感染的治疗。此外，由于经济性质的限制，发展中国家中的许多感染HIV的患者并不能得到任何治疗，因此促使了感染的大规模传播。因此，AIDS对经济的影响在接下来的几年里无疑是非常重要的。在欧洲，AIDS依然是最重大的一种传播病症，在西欧和中欧有约1百万人患有AIDS并且每年有超过20000的新感染者；而且，在东欧有约1.5百万人患有AIDS并且每年有超过200000的新感染者。因此，终止该感染的预防性疫苗的开发保有优先权。
尽管直至今天已经做出了许多努力，但是还没有为人类提供对抗由HIV引起的感染或对抗由该病毒诱导的发病的保护的安全且令人满意的疫苗。不过，进行的很多研究已经给出了如下的可能性：为了理解迄今为止所使用的疫苗策略的失败，而积累宝贵知识；以及，界定诱导免疫应答的疫苗的所需特性，该免疫应答给出对抗导致AIDS的慢病毒的保护。
疫苗应当明显诱导CD8+T淋巴细胞应答，CD8+T淋巴细胞应答与在原发感染期间控制病毒相关，并且该CD8+T淋巴细胞应答的存在已被证实对于控制已感染的非人灵长类中的病毒载量来说是必不可少的(Jin等人.，1999，JExpMed，189：991-998)。此外，细胞毒性T淋巴细胞(CTL)存在于长期非渐进性病人(LTNP)中(Rinaldo等人.，1995，JVirol，69：5838-5842)，或者进一步存在于暴露于HIV但未感染HIV的受试者中(Makedonas等人，2002，AIDS，16：1595-1602)。这些因素和其它因素显示出这种应答在控制病毒复制和/或预防该疾病中的重要性。
此外，疫苗应当诱导CD4+T细胞的应答，CD4+T细胞对于刺激和维持基于抗-HIV的CD8+T淋巴细胞的应答来说是必不可少的(Kalams等人.，1999，JVirol，73：6715-6720)。CD4+T细胞对于建立和维持基于由B淋巴细胞(BL)产生的抗体的应答来说也是必不可少的。因此，示出被SIV感染的且BL贫乏的猕猴控制它们的病毒载量不如猴子控制的那么好(Johnson等人，2003，JVirol，77：375-381)。考虑到这些结果以及前述的结果，似乎必须是对抗HIV的疫苗应当刺激免疫系统的B和T应答。
在许多经测试的疫苗策略中，发现了涉及被称为减毒的慢病毒的那些疫苗策略。因此，示出后者可能可再现地诱导对抗同源和异源测试病毒的最好保护(Yankee等人，2009，Virology，383：103-111；Genesca，McChesney和Miller，2009，JInternMed，265：67-77；Reynolds等人.，2008，JExpMed，205：2537-2550；Amara等人.，2005，JVirol，79：15356-15367；Whitney和Ruprecht，2004，CurrOpinInfectDis，17：17-26)。然而，由于它们不可逆地整合至宿主的基因组中以及与前病毒潜伏有关的反复感染的可能性，这些病毒在一些成人和在新生儿中是致病的(Desrosiers，1994，AIDSResHumRetroviruses，10：331-332；Hofmann-Lehmann等人.，2003，AIDS，17：157-166；Baba等人.，1999，NatMed，5：194-203；Baba等人.，1995，Science，267：1820-1825；Yankee等人.，2009，Virol，383：103-111)。由于伦理和安全性原因，这些减毒的慢病毒不能就这样用在人类中。
对此，基于病毒载体的DNA疫苗从未与人类或动物中的病症发展相关联，并且因此是更加安全的。然而，在猴子中经过测试的载体证实不能保护动物免受实验性的感染(Liu等人.，2006，Virology，351：444-454；Singh等人.，2005，JVirol，79：3419-3428)。
因此，需要新型的疫苗接种的载体，该载体使慢病毒抗原能够在质量和数量上均以较高水平进行表达，目的在于诱导对抗致病病毒的防护性应答。
先前，发明人已经描述了包括全病毒基因组的传染性病毒基因组，其中完整病毒基因组含有CAEV的RTL以及另一逆转录病毒基因组的一个或两个基因(Bouzar等人，2007，Virology，364(2)：269-280；Bouzar等人.，2004，Virology，326(1)：47-56；Bouzar等人.，2003，Virology，309(1)：41-52；Yuhai等人.，2009，Retrovirology，6(2)：22)。这些基因组被用于研究由人类和猴子的高致病性逆转录病毒所诱导的发病机理。
发明内容
发明人已经发现，山羊关节炎-脑炎病毒(VAEC(或在英语中为CaprineArthritisEncephalitisVirus，CAEV))的末端重复序列(RTS，或在英语中为长末端重复序列(LongTerminalRepeat，LTR))的使用给出了如下的可能性：改进接种的逆转录病毒基因组的表达，且改进对抗致病逆转录病毒的保护性应答的诱导，同时避免它们整合至宿主细胞中。发明人尤其证实了山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)的长末端重复序列(LTR)能够使与其相关联的基因进行组成型表达，并且该长末端重复序列(LTR)不依赖于CAEV的病毒tat基因(更具体地，不依赖于CAEV的病毒tat基因的蛋白)来表达病毒基因组(该长末端重复序列融合在其中)的基因，因此使得病毒抗原能够强表达。因此，发明人开发了SIV和HIV型(VIH，或在英文中为HIV(HumanImmunodeficiencyVirus))灵长类的慢病毒与CAEV之间的嵌合基因组，该嵌合基因组具有不会整合且非复制的性质，同时能够进行表达存在于基因组中的HIV和SIV的所有抗原的复制循环。发明人证实了在灵长类细胞(HEK293)中的这些基因组的转染使得所存在的基因的所有蛋白都能进行表达，并且这些蛋白被组装成病毒颗粒。该病毒颗粒能够在靶细胞中进行单一的感染循环(即，假循环)，且不会使病毒基因组整合至这些靶细胞中。NOD/SCID小鼠(经人类单核细胞人源化的)的免疫证实了存在对抗病毒抗原的强烈特异性的体液和细胞免疫应答。
定义
“核酸”是指单四级(monoquatemary)形式和双-四级(bi-quaternary)螺旋形式的核苷(腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、尿嘧啶核苷或胞嘧啶核苷；“RNA分子”)或脱氧核苷(脱氧腺嘌呤核苷、脱氧鸟嘌呤核苷、脱氧尿嘧啶核苷或脱氧胞嘧啶核苷；“DNA分子”)的磷酸酯聚合物的形式。双-四级螺旋DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA是可能的。术语核酸，并且尤其是DNA分子或RNA分子仅仅是指分子的初级结构或二级结构，并不限于具体的三级形式。因此，该术语包括尤其是在线状或环状DNA分子(例如，限制性片段)、病毒、质粒和染色体中发现的双-四级DNA。当提及具体的双-四级DNA分子的结构时，本文根据常规知识来描述序列，仅给出了沿DNA的非转录链(即，与mRNA具有同源序列的链)的5′至3′方向上的序列。
在本发明的上下文中，“包括非整合型嵌合逆转录病毒基因组的核酸”是指包括在至少两种逆转录病毒的cis位中起作用的核酸序列，所述核酸不能整合宿主细胞的基因组。所述核酸包括在第一逆转录病毒的5’和3’中的长末端重复序列(LTR)，以及第二逆转录病毒的至少一个病毒基因。
“逆转录病毒”是指其基因组由RNA分子组成并且包括逆转录酶的病毒，即，逆转录病毒科(Retroviridae)的成员。逆转录病毒被分为三种类型：肿瘤病毒、慢病毒和泡沫病毒。肿瘤病毒尤其由以下种类组成：小鼠白血病病毒(MLV)、禽白血病病毒(ALV)、劳斯氏肉瘤病毒(VSR，或在英文中为RSV(RousSarcomaVirus))或梅森-菲舍猴病毒(simianMason-Pfizervirus)。慢病毒由以下种类组成：1型人类免疫缺陷病毒(VIH-1，或在英文中为HIV-1(humanimmunodeficiencyvirusoftype1))、2型人类免疫缺陷病毒(VIH-2，或在英文中为HIV-2(humanimmunodeficiencyvirusoftype2))、猿猴免疫缺损病毒(VIS，或在英文中为SIV(simianimmunodeficiencyvirus))、猫免疫缺陷病毒(VIF，或在英文中为FIV(felineimmunodeficiencyvirus))、牛免疫缺陷病毒(VIB，或在英文中为BIV(bovineimmunodeficiencyvirus))、绵羊髓鞘脱落病毒(VMV)、山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)或马传染性贫血病毒(VAIE，或在英文中为EIAV(EquineInfectiousAnaemiaVirus))。泡沫病毒可为HFV。当逆转录病毒为HIV-1时，它可以属于任何血清组，例如属于血清组M(血清型A-D、F-H、J、K)、血清组O、血清组N或血清组P。当逆转录病毒为HIV-2时，它可以属于任何血清组，例如属于血清组A或血清组B。
“病毒基因”是指在逆转录病毒基因组中存在的基因。在本发明的上下文中，病毒基因可为gag基因、pol基因、vif基因、vpx基因、vpr基因、nef基因、tat基因、rev基因、vpu基因或env基因。
表示“组特异性抗原”的基因“gag”编码前体多蛋白gag，该前体多蛋白gag被剪切以产生逆转录病毒的基本结构蛋白，该基本结构蛋白为衣壳蛋白，核壳体的蛋白和基质蛋白。例如，HIV的蛋白gag为衣壳蛋白p24的前体、核壳体蛋白p6和p7的前体以及基质蛋白p17的前体。作为非限制性实施例，基因gag为HIV-1的基因gag(NCBI基因识别号(IDNo.)155030，于2011年8月20日更新)、HIV-2的基因gag(NCBI基因IDNo.14900001，于2011年8月27日更新)、SIV的基因gag(NCBI基因IDNo.956108，于2011年8月27日更新)或FIV的基因gag(NCBI基因IDNo.1489988，于2011年8月20日更新)。
基因“pol”编码逆转录酶、整合酶和蛋白酶。作为非限制性实施例，基因pol为HIV-1的基因pol(NCBI基因IDNo.155348，于2011年8月27日更新)、HIV-2的基因pol(NCBI基因IDNo.1490001，于2011年8月27日更新)、FIV的基因pol(NCBI基因IDNo.1489989，于2011年8月27日更新)或SIV的基因pol(NCBI基因IDNo.956107，于2011年8月20日更新)。
基因“vif”或“病毒感染因子”编码产生感染性病毒颗粒所需的蛋白。作为非限制性实施例，基因vif为HIV-1的基因vif(NCBI基因IDNo.155459，于2011年8月7日更新)、HIV-2的基因vif(NCBI基因IDNo.1724712，于2010年1月21日更新)、FIV的基因vif(NCBI基因IDNo.1724709，于2010年2月7日更新)或SIV的基因vif(NCBI基因IDNo.1490005，于2010年1月21日更新)。
基因“vpr”编码病毒蛋白R，病毒蛋白R在将细胞周期停止在G2期、在调控预整合复合体从细胞质至细胞核的运输、病毒复制中起到重要作用。作为非限制性实施例，基因vpr为HIV-1的基因vpr(NCBI基因IDNo.155807，于2011年8月7日更新)、HIV-2的基因vpr(NCBI基因IDNo.1724718，于2010年1月21日更新)或SIV的基因vpr(NCBI基因IDNo.956112，于2011年1月15日更新)。
基因“vpx”编码涉及基因vpr的病毒蛋白X。作为非限制性实施例，基因vpx为HIV-2的基因vpx(NCBI基因IDNo.1724714，于2011年3月19日更新)或SIV的基因vpx(NCBI基因IDNo.1490006，于2011年7月16日更新)。
基因“nef”编码被称为负调控因子的27kDa至25kDa的十八酰化的蛋白，该蛋白在体内CD4淋巴细胞减少中起到关键作用。作为非限制性实施例，基因nef为HIV-1的基因nef(NCBI基因IDNo.156110，于2011年8月7日更新)、HIV-2的基因nef(NCBI基因IDNo.1724715，于2011年3月19日更新)或SIV的基因nef(NCBI基因IDNo.1490008，于2011年7月2日更新)。
基因“tat”编码被称为“转录反式激活因子”的具有86至101个氨基酸的蛋白，该蛋白增加逆转录病毒基因组的转录率。作为非限制性实施例，基因tat为HIV-1的基因tat(NCBI基因IDNo.155871，于2011年8月20日更新)、HIV-2的基因tat(NCBI基因IDNo.1724713，于2010年2月7日更新)或SIV的基因tat(NCBI基因IDNo.956113，于2010年2月7日更新)。
基因“rev”编码被称为“病毒颗粒表达调控子”的蛋白，该蛋白使得病毒RNA能够从细胞核输出至细胞质。作为非限制性实施例，基因rev为HIV-1的基因rev(NCBI基因IDNo.155908，于2011年8月7日更新)、HIV-2的基因rev(NCBI基因IDNo.1724716，于2011年5月21日更新)或SIV的基因rev(NCBI基因IDNo.1490003，于2011年1月15日更新)。
基因“vpu”编码被称为“病毒蛋白U”的蛋白，该蛋白涉及病毒出芽以及病毒颗粒释放的改进。作为非限制性实施例，基因vpu为HIV-1的基因vpu(NCBI基因IDNo.155945，于2011年8月7日更新)或SIV的基因vpu(NCBI基因IDNo.2828723，于2010年1月21日更新)。
基因“env”编码前体蛋白gp160，该前体蛋白gp160成熟并且被剪切以产生包膜蛋白gp120和gp41。作为非限制性实施例，基因env为HIV-1的基因env(NCBI基因IDNo.155971，于2011年8月7日更新)、HIV-2的基因env(NCBI基因IDNo.1724717，于2011年6月18日更新)、FIV的基因env(NCBI基因IDNo.1489987，于2011年6月18日更新)或SIV的基因env(NCBI基因IDNo.1490007，于2011年6月18日更新)。
从本申请的意义上说，术语“包括(comprises)”或“包括(comprising)”根据具体方式来表示“由...组成(consistin)”或“由...组成(consistingin)”。
核酸
发明人已经证实了山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)的长末端重复序列使得与其相关联的基因能够进行组成型表达，并且该长末端重复序列并不依赖于病毒基因tat来表达病毒基因组(该长末端重复序列融合在其中)的基因，因此使得病毒抗原能够强表达。此外，发明人表明这些LTR的单独存在防止了该LTR融合在其中的异源逆转录病毒基因组的整合。
因此，本发明涉及一种包括非整合型嵌合逆转录病毒基因组的核酸，其中，所述嵌合逆转录病毒基因组包括：
在第一逆转录病毒的5’中和3’中的长末端重复序列(LTR)，所述第一逆转录病毒为诸如山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、绵羊髓鞘脱落病毒(VMV)、马传染性贫血病毒(EIAV)的慢病毒，或肿瘤病毒或泡沫病毒；以及
第二逆转录病毒的至少一种病毒基因，所述第二逆转录病毒不是所述第一逆转录病毒。
优选地，所使用的LTR序列源自不会整合“宿主”或“患者”基因组的逆转录病毒，所述宿主或患者为在其基因组中可整合第二和/或第三逆转录病毒的宿主或患者。例如当第一逆转录病毒为CAEV时，所述宿主或患者不是山羊，但可以是人类、猴子、猫或马；或者当第一逆转录病毒为EIAV时，所述宿主或者患者不是马，但是可以是人类、猴子、猫或绵羊；或者当第一逆转录病毒为VMV时，所述宿主或患者不是绵羊，但可以是人类、猴子、猫或马。
在尤其优选的实施方式中，“第一逆转录病毒”为山羊关节炎-脑炎病毒或CAEV。CAEV为山羊的慢病毒型的逆转录病毒，该病毒涉及人类免疫缺陷病毒(HIV)，但是不在它的宿主中引发AIDS型的任何病症。
“长末端重复序列”(英文中为LTR)是指能够控制转录的序列，即，包括增强子、启动子、用于启始转录的一个或若干个信号、用于终止转录的一个或若干个信号、用于聚腺苷化的一个或若干个信号。在本发明的上下文中，CAEV的LTR包括增强子、启动子和用于启始转录的信号，以及用于终止转录的信号和聚腺苷化信号。优选地，在CAEV的5’和3’中的LTR是相同的，并且包括序列SEQIDNO.：3或由序列SEQIDNO.：3组成。
在另一实施方式中，使用绵羊髓鞘脱落病毒(VMV)的LTR或马科EIAV的慢病毒的LTR。在VMV的5’中的LTR包括在参考序列NCBINC_001452.1(于2008年12月8日更新)的第1～161位中发现的序列，或者由在参考序列NCBINC_001452.1(于2008年12月8日更新)的第1～161位中发现的序列组成。在VMV的3’中的LTR包括在参考序列NCBINC_001452.1(于2008年12月8日更新)的第9106～9202位中发现的序列，或者由在参考序列NCBINC_001452.1(于2008年12月8日更新)的第9106～9202位中发现的序列组成。在EIAV的5’中的LTR包括在参考序列NCBINC_001450(于2010年3月11日更新)的第61～381位中发现的序列，或者由在参考序列NCBINC_001450(于2010年3月11日更新)的第61～381位中发现的序列组成。在EIAV的3’中的LTR包括在参考序列NCBINC_001450(于2010年3月11日更新)的第7269～8289位中发现的序列，或者由在参考序列NCBINC_001450(于2010年3月11日更新)的第7269～8289位中发现的序列组成。
在又一实施方式中，使用诸如小鼠白血病病毒(MLV)、禽白血病病毒(ALV)、劳斯氏肉瘤病毒(RSV)或梅森-菲舍猴病毒的肿瘤病毒的LTR，或诸如HFV的泡沫病毒的LTR。在MLV的5’中的LTR包括在参考序列NCBINC_001702.1(于2011年2月5日更新)的第1～210位中发现的序列，或者由在参考序列NCBINC_001702.1(于2011年2月5日更新)的第1～210位中发现的序列组成。在MLV的3’中的LTR包括在参考序列NCBINC_001702.1(于2011年2月5日更新)的第5735～8135位中发现的序列，或者由在参考序列NCBINC_001702.1(于2011年2月5日更新)的第5735～8135位中发现的序列组成。在ALV的5’中的LTR包括在参考序列NCBINC_015116.1(于2011年4月18日更新)的第1～594位中发现的序列，或者由在参考序列NCBINC_015116.1(于2011年4月18日更新)的第1～594位中发现的序列组成。在ALV的3’中的LTR包括在参考序列NCBINC_015116.1(于2011年4月18日更新)的第5338～7489位中发现的序列，或者由在参考序列NCBINC_015116.1(于2011年4月18日更新)的第5338～7489位中发现的序列组成。在RSV的5’中的LTR包括在参考序列NCBINC_001407.1(于2008年12月8日更新)的第22～102位中发现的序列，或者由在参考序列NCBINC_001407.1(于2008年12月8日更新)的第22～102位中发现的序列组成。在RSV的3’中的LTR包括在参考序列NCBINC_001407.1(于2008年12月8日更新)的第9058～9292位中发现的序列，或者由在参考序列NCBINC_001407.1(于2008年12月8日更新)的第9058～9292位中发现的序列组成。在梅森-菲舍猴病毒的5’中的LTR包括在参考序列NCBINC_001550.1(于2008年12月8日更新)的第26～123位中发现的序列，或者由在参考序列NCBINC_001550.1(于2008年12月8日更新)的第26～123位中发现的序列组成。在梅森-菲舍猴病毒的3’中的LTR包括在参考序列NCBINC_001550.1(于2008年12月8日更新)的第7573～7811位中发现的序列，或者由在参考序列NCBINC_001550.1(于2008年12月8日更新)的第7573～7811位中发现的序列组成。在HFV的5’中的LTR包括在参考序列NCBINC_001364.1(于2009年4月22日更新)的第1～1760位中发现的序列，或者由在参考序列NCBINC_001364.1(于2009年4月22日更新)的第1～1760位中发现的序列组成。在HFV的3’中的LTR包括在参考序列NCBINC_001364.1(于2009年4月22日更新)的第11487～13246位中发现的序列，或者由在参考序列NCBINC_001364.1(于2009年4月22日更新)的第11487～13246位中发现的序列组成。
发明人已经表明了山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)的长末端重复序列(LTR)并不依赖于病毒基因tat来表达病毒基因组(该长末端重复序列融合在其中)的基因，有利地，根据本发明的核酸不含有所述第一逆转录病毒的tat基因。
在本发明的上下文中，“第二逆转录病毒”与第一逆转录病毒不同。第二逆转录病毒可为肿瘤病毒、慢病毒或泡沫病毒。因此，例如，当使用CAEV的LTR时，第二逆转录病毒不是CAEV。优选地，第二逆转录病毒为：肿瘤病毒，诸如小鼠白血病病毒(MLV)、禽白血病病毒(ALV)、劳斯氏肉瘤病毒(RSV)或梅森-菲舍猴病毒；慢病毒，诸如1-型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)、2-型人类免疫缺陷病毒HIV-2、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)或马传染性贫血病毒(EIAV)；或泡沫病毒，诸如HFV。更优选地，第二逆转录病毒为HIV-1、HIV-2、SIV或FIV。
优选地，所述第二逆转录病毒的至少一种病毒基因选自gag基因、pol基因、vif基因、vpx基因、vpr基因、nef基因、tat基因、rev基因、vpu基因和env基因。在具体的方面中，所述嵌合逆转录病毒基因组包括所述第二逆转录病毒的至少两种病毒基因、三种病毒基因(例如基因gag、pol、vif，或基因gag、pol、env)、四种病毒基因、五种病毒基因、六种病毒基因、七种病毒基因、八种病毒基因、九种病毒基因、十种病毒基因。有利地，所述嵌合逆转录病毒基因组包括所述第二逆转录病毒的基因tat。仍然更优选地，所述嵌合逆转录病毒基因组包括所述第二逆转录病毒的一套基因gag、pol、vif、vpx、vpr、nef、tat、rev、vpu和env。
在尤其优选的方面中，所述嵌合逆转录病毒基因组包括SIV、HIV-1、HIV-2或FIV的gag基因、pol基因、vif基因、vpx基因、vpr基因、nef基因、tat基因、rev基因、vpu基因和env基因。在又一优选的方面中，所述嵌合逆转录病毒基因组包括SIV的逆转录病毒基因组的序列(SEQIDNO.：4)、HIV-1的逆转录病毒基因组的序列(SEQIDNO：2)、HIV-2的逆转录病毒基因组的序列(SEQIDNO：5)或FIV的逆转录病毒基因组的序列(SEQIDNO：6)，或由SIV的逆转录病毒基因组的序列(SEQIDNO.：4)、HIV-1的逆转录病毒基因组的序列(SEQIDNO：2)、HIV-2的逆转录病毒基因组的序列(SEQIDNO：5)或FIV的逆转录病毒基因组的序列(SEQIDNO：6)组成。
在图1至图4中分别示意性地示出了SIV、HIV-1、HIV-2和FIV的嵌合逆转录病毒基因组。
在具体的实施方式中，所述嵌合逆转录病毒基因组进一步包括第三逆转录病毒的至少一种病毒基因，所述第三逆转录病毒不是第一逆转录病毒，也即，与所述第一逆转录病毒不同。因此，例如，当使用CAEV的LTR时，所述第三逆转录病毒不是CAEV。所述“第三逆转录病毒”可选自如上限定的逆转录病毒中的一种。
当所述嵌合逆转录病毒基因组包括第二逆转录病毒的至少一种病毒基因和第三逆转录病毒的至少一种病毒基因，所述第二逆转录病毒与所述第三逆转录病毒不同。所述第二逆转录病毒和所述第三逆转录病毒可属于相同或不同的类型，例如，所述第二逆转录病毒和所述第三逆转录病毒可各自为肿瘤病毒、慢病毒或泡沫病毒，或者所述第二逆转录病毒和所述第三逆转录病毒可分别为(i)慢病毒和泡沫病毒，或相反地为泡沫病毒和慢病毒；(ii)肿瘤病毒和慢病毒，或相反地为慢病毒和肿瘤病毒；或者(iii)泡沫病毒和肿瘤病毒，或相反地为肿瘤病毒和泡沫病毒。
优先地，当所述嵌合逆转录病毒基因组包括第二逆转录病毒的至少一种病毒基因和第三逆转录病毒的至少一种病毒基因，所述第二逆转录病毒和所述第三逆转录病毒各自为慢病毒，并且优选地，所述慢病毒选自HIV-1、HIV-2、SIV、FIV或EIAV。仍然更优选地，第二逆转录病毒和第三逆转录病毒是不同种类、血清组或血清型的慢病毒。因此，例如，当所述第二逆转录病毒为HIV-1时，所述第三逆转录病毒为HIV-2；或进一步地，当所述第二逆转录病毒为血清组M的HIV-1时，所述第三逆转录病毒为血清组O的HIV-1；或者进一步地，当所述第二逆转录病毒为血清组M的HIV-1和血清型1的HIV-1时，所述第三逆转录病毒为血清组M和血清型B的HIV-1。
优选地，所述第三逆转录病毒的所述至少一种病毒基因选自gag基因、pol基因、vif基因、vpx基因、vpr基因、nef基因、tat基因、rev基因、vpu基因和env基因。在具体的方面中，所述嵌合逆转录病毒基因组进一步包括所述第三逆转录病毒的至少两种病毒基因、三种病毒基因、四种病毒基因、五种病毒基因、六种病毒基因、七种病毒基因、八种病毒基因、九种病毒基因或十种病毒基因。有利地，所述嵌合逆转录病毒基因组包括基因tat。
仍然更优选地，所述嵌合逆转录病毒基因组进一步包括所述第三逆转录病毒的一套基因gag、pol、vifvpx、vpr、nef、tat、rev、vpu和env，即，所述嵌合逆转录病毒基因组包括：所述第二逆转录病毒的一套基因gag基因、pol基因、vif基因、vpx基因、vpr基因、nef基因、tat基因、rev基因、vpu基因和env基因，和所述第三逆转录病毒的一套基因gag基因、pol基因、vif基因、vpx基因、vpr基因、nef基因、tat基因、rev基因、vpu基因和env基因。
因此，所述嵌合逆转录病毒基因组可包括：所述第二逆转录病毒的一种病毒基因和所述第三逆转录病毒的九种病毒基因；或者所述第二逆转录病毒的两种病毒基因和所述第三逆转录病毒的八种病毒基因；或者所述第二逆转录病毒的三种病毒基因和所述第三逆转录病毒的七种病毒基因；或者所述第二逆转录病毒的四种病毒基因和所述第三逆转录病毒的六种病毒基因；或者所述第二逆转录病毒的五种病毒基因和所述第三逆转录病毒的五种病毒基因；或者所述第二逆转录病毒的六种病毒基因和所述第三逆转录病毒的四种病毒基因；或者所述第二逆转录病毒的七种病毒基因和所述第三逆转录病毒的三种病毒基因；或者所述第二逆转录病毒的八种病毒基因和所述第三逆转录病毒的两种病毒基因；或者所述第二逆转录病毒的九种病毒基因和所述第三逆转录病毒的一种病毒基因。因此，在非限制性的实施例中，所述嵌合逆转录病毒基因组可包括：所述第二逆转录病毒的gag基因和所述第三逆转录病毒的pol基因、vif基因、vpx基因、vpr基因、nef基因、tat基因、rev基因、vpu基因和env基因；或者所述第二逆转录病毒的gag基因、pol基因和所述第三逆转录病毒的vif基因、vpx基因、vpr基因、nef基因、tat基因、rev基因、vpu基因和env基因；或者所述第二逆转录病毒的gag基因、pol基因、vif基因和所述第三逆转录病毒的vpx基因、vpr基因、nef基因、tat基因、rev基因、vpu基因和env基因；或者所述第二逆转录病毒的gag基因、pol基因、vif基因、vpx基因和所述第三逆转录病毒的vpr基因、nef基因、tat基因、rev基因、vpu基因和env基因；或者所述第二逆转录病毒的gag基因、pol基因、vif基因、vpx基因、vpr基因和所述第三逆转录病毒的nef基因、tat基因、rev基因、vpu基因和env基因；或者所述第二逆转录病毒的gag基因、pol基因、vif基因、vpx基因、vpr基因、nef基因和所述第三逆转录病毒的tat基因、rev基因、vpu基因和env基因；或者所述第二逆转录病毒的gag基因、pol基因、vif基因、vpx基因、vpr基因、nef基因、tat基因和所述第三逆转录病毒的rev基因、vpu基因和env基因；或者所述第二逆转录病毒的gag基因、pol基因、vif基因、vpx基因、vpr基因、nef基因、tat基因、rev基因和所述第三逆转录病毒的vpu基因和env基因；或者所述第二逆转录病毒的gag基因、pol基因、vif基因、vpx基因、vpr基因、nef基因、tat基因、rev基因、vpu基因和所述第三逆转录病毒的env基因。
在尤其优选的方面中，所述嵌合逆转录病毒基因组包括所述第二逆转录病毒的gag基因、pol基因、vif基因、vpx基因、vpr基因和所述第三逆转录病毒的nef基因、tat基因、rev基因、vpu基因和env基因。
在仍然更优选的方面中，所述嵌合逆转录病毒基因组包括SIV的gag基因、pol基因、vif基因、vpx基因和vpr基因及HIV-1的nef基因、tat基因、rev基因、vpu基因和env基因，或者相反地包括HIV-1的gag基因、pol基因、vif基因、vpx基因和vpr基因及SIV的nef基因、tat基因、rev基因、vpu基因和env基因。在另一尤其优选的方面中，所述嵌合逆转录病毒基因组包括HIV-1的gag基因、pol基因、vif基因、vpx基因和vpr基因及HIV-2的nef基因、tat基因、rev基因、vpu基因和env基因，或者相反地包括HIV-2的gag基因、pol基因、vif基因、vpx基因和vpr基因及HIV-1的nef基因、tat基因、rev基因、vpu基因和env基因。在仍然更优选地方面中，所述嵌合逆转录病毒基因组包括SEQIDNO：7或由SEQIDNO：7组成，图5中示出了该嵌合逆转录病毒基因组的图示。
在具体的实施方式中，当pol基因存在于嵌合逆转录病毒基因组中时，所述pol基因为删除了编码整合酶(in)的序列的pol基因。优选地，从所述pol基因中删除序列SEQIDNO：8(SIV的整合酶序列)、SEQIDNO：9(HIV-1的整合酶序列)、SEQIDNO：10(HIV-2的整合酶序列)或SEQIDNO：11(FIV的整合酶序列)。
因此，在尤其优选的实施方式中，所述逆转录病毒基因组包括序列SEQIDNO：1、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14或SEQIDNO：15，或由序列SEQIDNO：1、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14或SEQIDNO：15组成。
在图6至图10中分别示意性示出了包括SEQIDNO：1、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14或SEQIDNO：15，或由序列SEQIDNO：1、SEQIDNO：12、SEQIDNO：13、SEQIDNO：14或SEQIDNO：15组成的嵌合逆转录病毒基因组。
本发明还涉及一种包括根据本发明的核酸的载体。
术语“载体”是指染色体外因子，通过载体，DNA或RNA序列(即“外源”基因)可被引入宿主细胞中，从而转化宿主并且使得被引入的序列能够表达(即转录和翻译)。染色体外因子可为自我复制序列、噬菌体序列或核苷酸序列，单链或双链DNA或RNA，质粒，粘粒。载体典型地含有可传递剂(transmissibleagent)和选择性标记物的DNA，在该可传递剂的DNA中可插入外源DNA。将DNA片段插入至另一DNA片段中的常规手段涉及酶的使用，该酶被称为限制酶，在特定位点(核苷酸的特定基团，也被称为限制性位点)处剪切DNA。一般来说，外源DNA被插入DNA载体的一个或若干个限制性位点处，并且随后通过载体被转送至具有可传递剂的DNA的宿主细胞中。包括添加或插入的DNA的DNA片段或序列(诸如载体)也可被称为“DNA构建体”。载体的常见类型为“质粒”，质粒通常为独立存在的双链DNA分子，通常是细菌来源的，可容易地接受额外的(外源)DNA并且可容易地被引入到合适的宿主细胞中。已经描述了用于在不同真核和原核宿主中进行复制和/或表达的大量的载体(包括质粒)。在本发明的上下文中，载体包括选择性标记物(诸如提供对抗生素的抗性的基因)或根据本发明的核酸。优选地，所述抗性基因为提供对氨苄西林或卡那霉素的抗性的基因。
根据本发明的核酸和/或载体可用于转化或转染细胞或宿主有机体，即用于表达根据本发明的嵌合逆转录病毒基因组。
术语“宿主细胞”是指以任何方式被选择的、被修饰的、被转化的、被转染的、被转导的、被培养的、或被使用的或被操作的任何有机体的任何细胞，用于通过该细胞来产生物质，例如，通过该细胞来表达基因、DNA序列、蛋白、病毒颗粒。在本发明的上下文中，宿主细胞为哺乳动物细胞。合适的宿主细胞包括，但并不限于，HEK293细胞、人类CD4+T淋巴细胞系CEMx174和M8166、人类CD4+T淋巴细胞、人类CD8+T淋巴细胞、人类血液的单核细胞。
根据本领域技术人员已知的标准技术可实现根据本发明的核酸和/或载体对细胞或宿主有机体的转化，诸如，通过转染、电穿孔、微量注射、转导、细胞融合、DEAE-葡聚糖、使用磷酸钙的沉淀、或使用基因枪、或DNA载体转运体(例如，参见Wu等人.，1992，JBiolChem267：963-967；Wu等人.，1988，JBiolChem263：14621-14624；Hartmut等人.，加拿大专利申请第2,012,311号，1990年3月15日公布)。
免疫原性组合物或疫苗组合物及其应用
根据本发明的核酸或载体可用于免疫原性目的或疫苗的目的。
因此，本发明还涉及包括根据本发明的核酸或载体的免疫原性组合物或疫苗组合物。
在本发明的上下文中，术语“疫苗”是指预防性或治疗性疫苗。
免疫原性组合物或疫苗组合物是指可能诱导对抗上文限定的逆转录病毒的免疫应答的组合物。免疫应答是指涉及T淋巴细胞(例如CD4+和CD8+T淋巴细胞和B淋巴细胞)的应答。
根据实施方式，根据本发明的免疫原性组合物或疫苗组合物是单价的，即它能够对抗单一逆转录病毒，例如对抗HIV-1或HIV-2的免疫应答。
根据另一实施方式，根据本发明的免疫原性组合物或疫苗组合物是多价的(multivalent)，即，它能够对抗若干种逆转录病毒的免疫应答，例如对抗HIV-1和HIV-2或若干种病原体的免疫应答，例如对抗HIV-1和VHC(英文中为丙型肝炎病毒(HepatitisCVirrus，HCV))的免疫应答。在该情况下，疫苗载体表达任一种病原体的抗原。
根据另一实施方式，根据本发明的免疫原性组合物或疫苗组合物是多价的(polyvalent)。可通过将若干根据本发明的单价免疫原性组合物或疫苗组合物相组合，得到这种免疫原性组合物或疫苗组合物。免疫原性组合物或疫苗组合物可进一步包括对抗另一病毒的至少一种其它的疫苗(即减毒的活病毒、灭活病毒或病毒亚单元)，该另一病毒诸如为性传播病毒，例如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或乳头瘤病毒。
在优选的实施方式中，根据本发明的免疫原性组合物或疫苗组合物包括药学可接受的载剂。
“药学可接受的载剂”是指其中可配制根据本发明的免疫原性组合物或疫苗组合物的任何载剂。该载剂包括盐溶液，诸如磷酸盐缓冲液。一般来说，根据给药方法和途径以及根据标准的药学实践来选择稀释剂或载剂。药学可接受的载剂包括但并不限于：离子交换剂，铝，硬脂酸铝，卵磷脂，用于递送自乳化药物的系统诸如D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸，用作药物剂型的表面活性剂诸如吐温(Tweens)或其它聚合物递送基质，血清蛋白诸如人血清蛋白，缓冲物质诸如磷酸盐，甘氨酸，山梨酸，山梨酸钾，植物的饱和脂肪酸甘油酯的混合物，水，盐或电解质，诸如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，硅胶，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，基于纤维素的物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜡，聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物以及羊毛脂。环糊精(诸如A-、B-、和g-环糊精)，或化学修饰的衍生物(诸如包括2-和3-羟丙基-b-环糊精的羟烷基环糊精，或其它溶解的衍生物)也可有利地用于改进根据本发明的组合物的递送。
根据本发明的组合物可进一步含有佐剂。为了该目的，可使用在疫苗领域中常规使用的任何药学可接受的佐剂或佐剂的混合物。作为合适的佐剂的实例，可提及的是铝盐(诸如氢氧化铝或磷酸铝)和DC-Chol(DC-胆固醇)。为了该目的，可使用在疫苗领域中常规使用的任何药学可接受的佐剂或佐剂的混合物。作为合适的佐剂的实例，可提及的是铝盐(诸如氢氧化铝或磷酸铝)和DC-Chol。
根据本发明的组合物可含有辅助基因，即是表达如下蛋白的基因：该蛋白通过增加表达的病毒蛋白的免疫原性来起到辅助作用。例如，编码细胞因子，诸如白介素(II)[IL-2、IL12、IL-15...或GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)]的基因。这些辅助基因被并入疫苗质粒中或作为独立的表达质粒而被共注入。
可使用本领域技术人员已知的给药方法。具体地，根据本发明的核酸、载体、免疫原性组合物或疫苗组合物可口服给药、吸入给药或经由肠胃外途径给药(尤其是通过皮内注射、皮下注射、静脉注射、髓内注射或肌内注射)。当使用肠胃外途径时，根据本发明的核酸、载体、免疫原性组合物或疫苗组合物可为包括在安瓿或瓶子中的可注射的溶液和悬浮液的形式。通常，通过将根据本发明的核酸、载体、免疫原性组合物或疫苗组合物与缓冲液、乳化剂、稳定剂、防腐剂、增溶剂相混合来得到用于肠胃外递送的形式。根据已知的技术，这些混合物随后被灭菌，并且被包装成皮内注射、皮下注射、静脉注射、髓内注射或肌内注射的形式。本领域技术人员可使用基于有机磷酸盐的缓冲液作为缓冲液。乳化剂的实例包括甲基纤维素、阿拉伯胶、羧甲基纤维素钠。稳定剂的实例包括亚硫酸钠、焦亚硫酸钠。且防腐剂的实例包括对羟基苯甲酸钠、山梨酸、甲酚和氯甲酚。核酸、载体、免疫原性组合物或疫苗组合物也可为经冷冻干燥的形式。
疫苗DNA溶液可被直接注射，或也可利用商购的电穿孔仪进行体内电穿孔来给药，或者被包裹在脂质体或纳米粒子中来给药，或者通过使用将疫苗DNA更好地引入到接种的宿主细胞中的任何体内转染的方法来给药。
在其它方面中，本发明涉及一种根据本发明的核酸、一种根据本发明的载体和/或一种根据本发明的免疫原性组合物或疫苗组合物在预防和/或治疗由逆转录病毒所引起的感染中的应用。
“预防(prevent)”或“预防(prevention)”是指抑制逆转录病毒的感染，即预防逆转录病毒引起感染，或预防逆转录病毒在已感染的受试者体内的传播或逆转录病毒从一个受试者至另一受试者的传播。
“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”是指限制疾病的严重性，以及预防复发性感染，即，限制潜伏性感染或持续性感染的再活化，以及找到对由逆转录病毒所引起的感染症状的进行补救的方法。逆转录病毒为上文所限定的，并且优选地，逆转录病毒为HIV-1、HIV-2或FIV。
术语“患者”或“受试者”或“宿主”是指人类或非人类的哺乳动物，或鸟类。优选地，患者为灵长类、鼠科(小鼠)、猫科(猫)、犬科(狗)、马科的成员(马)、鸟、人类(包括女人、男人、成年人和儿童)。
本申请还涉及一种为有需要的受试者进行接种或对有需要的受试者进行治疗的方法，所述方法包括给予预防有效量或治疗有效量的根据本发明的核酸，根据本发明的载体，或根据本发明的免疫原性组合物或疫苗组合物。
“预防有效量或治疗有效量”是指核酸的量、载体的量、免疫原性组合物或疫苗组合物的量能够对被治疗的受试者产生治疗或预防效果。治疗效果可为客观的(即通过测试或标记物来测定)或主观的(即受试者示出效果的迹象或感受到效果)。有效量可在约0.01至5000μg/kg之间变动，或者在约0.1至1000μg/kg之间变动，或者在约1至500μg/kg之间变动。有效量也可根据给药途径，使用或未使用体内转染方法，受试者的大小和重量，以及根据其它药剂共使用的可能性而变动。
在本发明的上下文中，根据本发明的核酸或根据本发明的载体或根据本发明的免疫原性组合物或疫苗组合物的给药模式可经由静脉途径、皮下途径、皮内途径、髓内途径或肌内途径来实现。
参照下面的实施例，将更加详细地解释本发明，但并不限制本发明的范围。
附图说明
图1：由序列SEQIDNO.：2编码的核酸的图示。
图2：由序列SEQIDNO.：4编码的核酸的图示。
图3：由序列SEQIDNO.：5编码的核酸的图示。
图4：由序列SEQIDNO.：6编码的核酸的图示。
图5：由序列SEQIDNO.：7编码的核酸的图示。
图6：由序列SEQIDNO.：1编码的核酸的图示。
图7：由序列SEQIDNO.：12编码的核酸的图示。
图8：由序列SEQIDNO.：13编码的核酸的图示。
图9：由序列SEQIDNO.：14编码的核酸的图示。
图10：由序列SEQIDNO.：15编码的核酸的图示。
图11：CAEV的基因组，质粒pSHIVKU2、pCA-LTR-SHIVKU2IN-的质粒和pΔ4SHIVKU2的构建体的图示。
图12：对Balb/c小鼠的分泌IFN-γ的T淋巴细胞数量的评定。对照BALB/c的具有免疫能力的小鼠的脾细胞和经pΔ4SHIVKU2和pCA-LTR-SHIVKU2IN-免疫的小鼠的脾细胞，并且用Gag、Env肽和肽Tat+Rev+Nef池进行刺激。计算1百万PBMC的斑点数量。
图13：对在经免疫的NOD/SCID-hu小鼠中的分泌IFN-γ的人类T淋巴细胞数量的评定。通过人血的单核细胞进行重建，并且用pΔ4SHIVKU2或pCA-LTR-SHIVKU2IN-或pSHIVKU2进行免疫的免疫缺陷的小鼠脾细胞经Gag、Env肽和肽池Tat+Rev+Nef进行刺激。计算1百万PBMC的斑点数并且被标准化至20％。
图14：制备载体CA-LTR-SHIVKU2-IN-的示意图。
图15：载体CA-LTR-SHIVKU2的图示。
图16：载体CA-LTR-SHIVKU2-IN-的图示。
图17：制备载体CAL-HIV-IN-的示意图。
图18：载体CAL-HIV-IN-的图示。
具体实施方式
SEQIDNo：1代表嵌合逆转录病毒基因组的序列，包括SAEV的LTR和删除了编码整合酶的序列的SHIV基因组。
SEQIDNo：2代表嵌合逆转录病毒基因组的序列，包括CAEV的LTR和HIV-1的基因组。
SEQIDNo：3代表CAEV的LTR的序列。
SEQIDNO：4代表嵌合逆转录病毒基因组的序列，包括CAEV的LTR和SIV的基因组。
SEQIDNO：5代表嵌合逆转录病毒基因组的序列，包括CAEV的LTR和HIV-2的基因组。
SEQIDNO：6代表嵌合逆转录病毒基因组的序列，包括CAEV的LTR和FIV的基因组。
SEQIDNO：7代表嵌合逆转录病毒基因组的序列，包括CAEV的LTR和SHIV的基因组。
SEQIDNO：8代表SIV整合酶的序列。
SEQIDNO：9代表HIV-1整合酶的序列。
SEQIDNO：10代表HIV-2整合酶的序列。
SEQIDNO：11代表FIV整合酶的序列。
SEQIDNO：12代表嵌合逆转录病毒基因组的序列，包括CAEV的LTR和删除了编码整合酶的序列的HIV-1的基因组。
SEQIDNO：13代表嵌合逆转录病毒基因组的序列，包括CAEV的LTR和删除了编码整合酶的序列的HIV-2的基因组。
SEQIDNO：14代表嵌合逆转录病毒基因组的序列，包括CAEV的LTR和删除了编码整合酶的序列的FIV的基因组。
SEQIDNO：15代表嵌合逆转录病毒基因组的序列，包括CAEV的LTR和删除了编码整合酶的序列的SIV的基因组。
SEQIDNO：16代表载体pCA-LTR-SHIVKU2的序列。
SEQIDNO：17代表载体pCA-LTR-SHIVKU2-IN-的序列。
SEQIDNO：18代表载体CAL-HIV-IN-的序列。
实施例
1.材料和方法
1.1.疫苗载体(图1)
1.1.1.载体pCA-LTR-SHIV KU2 和pCA-LTR-SHIV KU2 -IN-
载体CA-LTR-SHIVKU2包括类人猿和人类免疫缺陷病毒(SHIV)的基因组，其中删除了SIV的LTR并替代为CAEV的LTR。SHIV包括由SIV-mac239其中之一组成的嵌合基因组，其中，删除了SIV的tat基因、env基因和rev基因并替代为HIV-1的vpu基因、tat基因、env基因和rev基因。因此，载体具有在CAEV的5’和3’中的LTR的转录控制下的SIV的vpr基因、vpx基因、gag基因、pol基因、vif基因和nef基因以及HIV-1的tat基因、rev基因、vpu基因和env基因。将编码整合酶(in)的序列从pol基因中删除。未删除编码整合酶的序列的疫苗载体pCA-LTR-SHIVKU2由序列SEQIDNO：16(图15)组成。删除了编码整合酶的序列的载体pCA-LTR-SHIVKU2-IN-由SEQIDNO：17(图16)组成。
通过下列方式得到载体CA-LTR-SHIVKU2-IN-的构建体(图14)。用EcoR1和Nar1消化载体SHIV-KU2，并且随后去除0.8kb的LTR片段。随后用EcoR1和Nar1消化CAEV-pBSCA载体，纯化0.5kb的片段LTR。随后两个片段进行连接。然后用Stu1和Ava1消化载体SHIV-1LTRCA，并且随后去除0.8kb的LTR片段。用引物Stu1和Ava1扩增CAEV的3’中的LTR，用Stu1和Ava1消化PCR产物，并且纯化0.5kb的LTR片段。两个片段进行连接以生成CAL-SHIVKU2。最后，完成在pol基因中用Kpn1和Acc1进行的消化，以去除314bp的SHIV整合酶基因，从而生成CAL-SHIVKU2-IN-。
1.1.2.载体pSHIV KU2 和Δ4SHIV KU2
质粒pSHIVKU2和pΔ4SHIVKU2为用作对照的质粒。它们的构建体已经在许多出版物中进行了描述(LiuZQ等人，2006，RamakrisnaHegde等人.，2005)。
1.2疫苗DNA的生产
1.2.1.细菌培养
将含有质粒的大肠杆菌K12(JM109)细菌放入含有0.05mg/ml卡那霉素的5mlBL培养基中进行预培养，随后在30℃、在150转/分钟(rpm)下进行搅拌的条件下孵育一夜。将来自预培养的细菌悬浮液以1：100000稀释在BL培养基中，并且随后将50μl的稀释液涂布在皮氏培养皿(Petridish)中的琼脂/BL/卡那霉素的表面上，随后在32℃孵育一夜。将在皮氏培养皿的琼脂上生长的分离的克隆播种在5ml的含有0.05mg/ml卡那霉素的液体培养基BL中，随后在30℃、在150rpm下进行搅拌的条件下孵育一夜。培养物的一部分(1ml)用于根据推荐的程序通过Macherey-Nagel或Qiagen的Mini-prep试剂盒来快速提取DNA，随后提取出的DNA在1％的琼脂糖凝胶上进行分离来检测其质量。对应于判断是满意的细菌被用于播种1L培养基，随后在如上文所述的相同条件下进行孵育以分离大量制备的DNA。
1.2.2.大量制备：质粒提取
通过离心(4000g，4℃，15min)收获沉淀物形式的在30℃、搅拌(150rpm)条件下孵育一夜的细菌，并且将沉淀物重悬在8ml重悬缓冲液(Tris-HCl50mMpH8，EDTA10mM)。然后，通过加入8ml碱性裂解缓冲液(NaOH200mM，1％SDS)来裂解细胞，以释放质粒DNA。通过加入8ml中和缓冲液(3M乙酸钾，pH5.5)来中和裂解液。随后混合物在冰中孵育5分钟，并且在4℃、15,000g离心15分钟。含有DNA的溶液被转移至预先平衡的柱子中，以保留住质粒DNA。用洗涤缓冲液冲洗三次柱子，随后洗脱DNA，并且用异丙醇进行沉淀。通过离心(30min，15000g，4℃)得到经沉淀的DNA沉淀物。然后用2ml70％的乙醇冲洗DNA，并且在4℃、15000g来离心10min，以去除过量的杂质和盐，随后将沉淀物进行干燥，并且重悬在合适体积的超纯水中。
随后，通过分光光度法在等于260nm的波长λ处确定DNA溶液的浓度，并且随后通过在1％的琼脂糖凝胶上的电泳迁移来检测质粒的质量。在用限制酶例如BamH1和EcoR1消化之后，在琼脂糖凝胶上检测质粒的大小和质粒的完整度。
1.2.3.通过酶消化来检测质粒pCA-LTR-SHIV KU2 -IN-
在37℃下，在各种酶合适的1X缓冲液中，并且最终体积为20μl，用2单位的酶EcoR1、BamH1或Sph1来消化0.5μg等份的质粒60分钟。通过使用TAE的1X缓冲液在1％琼脂糖凝胶中进行电泳迁移，并且用溴化乙锭(ETB)来显现，并且在UV下观察凝胶来检测消化图谱。
1.3细胞培养和处理：
1.3.1.细胞模型和培养条件
细胞系获自美国国立卫生研究院(NationalInstituteofHealth)AIDS研究和参考试剂计划(AIDSResearchandReferenceReagentProgram)。将在10％二甲亚砜(DMSO)中的细胞冷冻保藏在-170℃的液氮中。将其解冻并随后培养在培养瓶中。
HEK293T(永生的人胚肾293)细胞为人胚肾细胞的永久系。由于其非常容易以可达到100％的非常高的转染效率进行转染，而使用该细胞系。慢病毒基因组在这些细胞中强表达，并且蛋白组装成传染性颗粒，并且它们与指示细胞(CEM或M8166)共培养能够形成典型的合胞体。HEK293T细胞是贴壁的，以单层培养在培养瓶的表面上，且培养在补充有10％胎牛血清(FCS)、1％的盘尼西林(5000单位/ml)、链霉素5000μg/ml和1％的庆大霉素(10mg/ml)的MEM培养基中。将细胞维持在37℃、含有5％的CO2的潮湿气氛中。每三天更换一次培养基。为了进行传代培养，去除营养培养基，用dPBS/EDTA冲洗细胞，并且在37℃、0.5％胰蛋白酶-0.01％EDTA的存在下孵育1分钟。在细胞的分离之后，立即将一定体积的MEM培养基加入至细胞中，并且随后将这些细胞均质化并且转移至新的培养瓶中。
细胞CEMx174和M8166是人类CD4+T淋巴细胞，能够感染人类和猿猴慢病毒，并且形成典型的细胞致病变效应(CPE)。他们是非贴壁的，且培养在补充有10％的SCS、1％的盘尼西林-链霉素和1％的庆大霉素的RPMI培养基中。将这些细胞维持在37℃、含有5％的CO2的潮湿气氛中。通过在1500G进行5分钟的离心步骤，以每三天更换一次培养基。随后通过连续的抽吸和释放到合适体积的培养基来重悬沉淀物。
1.3.2.使用体外生物测试进行功能性评定
使用质粒pCA-LTR-SHIVKU2-IN-或pSHIVKU2的HEK293T的转染
使用的转染方法为使用ExGen500的方法。ExGen500(Euromedex，法国)由基于线性聚乙烯亚胺的阳离子聚合物组成。该聚合物具有非常大的阳离子电荷密度，从而使得它能够与DNA通过离子键而形成络合物。然后，这些ExGen500/DNA络合物能够与一般的阴离子细胞的质膜发生相互作用(经由硫酸化蛋白多聚糖的相互作用)。接着发生络合物被细胞内吞，以及向核内体/溶酶体运输。通过它在酸性pH下的质子化能力，ExGen500可以缓冲酸泡(acidvesicle)的介质，从而防止转染的DNA发生降解。该性质还引起渗透休克(osmoticshock)，该渗透休克使得DNA能够被释放在细胞质中。ExGen500随后促进DNA朝向细胞核的运输，并且避免它被细胞质的核酸酶降解。
将5μg质粒DNA加入至350μl150mM的NaCl溶液和15μlExGen500中。混合物在室温下孵育40分钟。接下来，将该混合物加入至含有HEK-293T的培养瓶中，HEK-293T被刚刚更新的培养基覆盖。
CEMx174的感染和病毒原液的扩增
经pCA-LTR-SHIVKU2-IN-或pSHIVKU2的DNA转染的HEK-293T与CEMx174进行共培养，并且从第48小时起，CEMx174产生由ECP的形成所表现出感染的标志，ECP的形成是由形成合胞体的CEMx174的融合而导致的。已感染的CEMx174被转移至存在有新鲜CEMx174的新培养瓶中以扩增病毒，扩增的病毒在上清液中收获。
病毒生产
在第48小时起，凭借注射器进行病毒原液的收获，然后在使其通过0.22μm直径的过滤器以去除细胞碎片之后，将其放入管中，该管被储存在-80℃。
使用病毒对细胞进行接种
等份的病毒上清液(10～100μl)用于对靶细胞进行接种，以通过细胞病变的出现或通过检测标记基因的表达来评定其感染性。
病毒对非贴壁细胞的滴定
含有病毒的上清液经十步稀释(连续的稀释)在培养基中以得到从10-1至10-6的稀释液，稀释液用于一式四份地接种在24孔板的孔中，其中每孔含有在0.5～1ml的RPMI培养基中的1.105个细胞。从而经接种的细胞在37℃以及5％的CO2中孵育，并且通过每3天更换一次培养基维持。定期观察ECP的发展。
1.4.电子显微镜观察经pCA-LTR-SHIVKU2-IN-转染的HEK293T细胞
带着检查由疫苗基因组pCA-LTR-SHIVKU2-IN-所产生的蛋白是否组装成病毒颗粒的目的，发明人使用电子显微镜(EM)进行了形态学研究。
经pCA-LTR-SHIVKU2-IN-、pSHIVKU2或Δ4SHIVKU2转染的HEK293T细胞的样品被固定在用二甲胂酸缓冲液(0.1M的二甲胂酸钠)稀释的2.5％的戊二醛溶液中。随后它们在4℃，在含有1％的四氧化锇(OsO4)的二甲胂酸缓冲液中进行60分钟后固定。随后样品在4℃且在黑暗中，在乙酸双氧铀(pH4)中孵育过夜。随后将样品浸入用乙醇分别稀释至30％、60％、90％和100％的连续浴中保持10分钟。接下来，将样品浸入纯乙醇和环氧树脂的50/50混合物(8ml的DDSA、7ml的MNA或13ml的环氧基树脂)中保持2小时。随后在将样品放置在纯环氧树脂中保持2小时，然后被包在比姆(Beem)胶囊中并且开始在60℃下进行48小时的聚合。
凭借具有超薄显微切片机的金刚石切片器来进行这些区域的超薄切割。将这些厚度为70nm的切片放置在铜载网上，从而凭借日本电子(Jeol)1200EX透射电子显微镜在80kV的电压下进行观察。
1.5.使用pCA-LTR-SHIVKU2-IN-疫苗DNA免疫小鼠
1.5.1.NOD/SCID小鼠的人源化和疫苗接种
用剂量为120厘戈瑞的γ射线来辐照6周龄的小鼠50秒。
使用人类血液的PBMC对小鼠进行人源化
对在柠檬酸钠上全血样进行离心(2000g，10min，20℃)，以回收在血浆和红细胞之间的白细胞层。将细胞稀释在3倍的PBS/EDTA中，小心地放置在聚蔗糖(Ficoll)垫层(用于分离淋巴细胞的介质)上，并且随后在20℃以2,000g离心45分钟。回收PBMC，用PBS/EDTA冲洗若干次，并且重悬在PBSx1中，并且随后将在0.1ml中的50.106pBMC经由腹膜内途径注入每只小鼠中。
小鼠的免疫
在人源化后的48至72小时之后，SCID-hu细胞与50μg的pCA-LTR-SHIVKU2-IN-、pSHIVKU2或pΔ4SHIVKU2的DNA一起经由肌内途径(IM)注入。用100μg的每种DNA通过IM注射来直接免疫6～8周龄的BALB/c小鼠。
1.5.2.评价体液应答的方法
亚诺(Abnova)夹层酶联免疫吸附测定(ELISA)测试：
该测试是基于对于对抗病毒抗原的抗体的检测，并且该抗体结合至96孔板的孔的底部。在孔中放置有待测试的血清(在免疫后的不同时间点回收的)、阳性对照和阴性对照。抗-HIVAc(抗体)可选地存在，且结合在病毒抗原上。在对孔进行若干次冲洗以去除过量和非特异性的结合之后，加入具有生物素分子的第二检测抗体，生物素分子与耦合至HPRO酶的链霉亲和素相互作用。随后通过加入酶的底物TMB来检测形成的抗原/Ac复合物，这将引起显色反应。该颜色以通过ELISA光度读出器中读出的光密度来表示。
将试剂和产物放置在室温下。将试剂盒提供的阴性对照和阳性对照(100μl)、空白样(100μl)，以及10μl血清样品和50μl血清样品放置在孔中，最终体积为100μl。将该板在37℃孵育30分钟，用冲洗溶液进行洗涤。将稀释至1：100的第二Ac溶液(100μl)加入除了空白样的所有孔中。然后用封口膜覆盖该板并且在37℃孵育20分钟。在冲洗步骤之后，加入TMB溶液A和B，在实验室的温度下孵育该板15分钟。为了终止着色反应，每孔加入100μl的2NH2SO4。在450nm处读出该板。
吸光度值等于或大于阈值的样品被认为是阳性的，该阈值根据以下公式确定：截留值＝NCx+0.100且NCx＝两个阴性对照的吸光度值的平均值。
血清-中和测试
该技术是基于血清-中和Ac(血清-N)抑制对病毒敏感的细胞感染的能力。为了检测和评定血清-NAc，使恒定量的感染性病毒与待测试的血清系列稀释液相接触，随后将该混合物接种至微孔板上的受纳细胞培养物中并且孵育3至5天。通常来说，病毒通常来说是致细胞病变的毒株，因此ECP数量的缺乏和降低表明在被测试的血清中存在Ac。
将病毒原液SHIVKU2在RPMI中稀释至1：1000(测定病毒上清液体积的100TCID50，其对应于50％具有合胞体的孔的病毒的稀释浓度)，以及从NOD/SCID对照小鼠、用pCA-LTR-SHIVKU2-IN-或pSHIVKU2人源化和接种的小鼠中回收的血清被稀释在相同的培养基中(以10、20、40、80、160和320x稀释浓度)。经稀释的病毒和血清稀释液在96孔板中混合(100μl/孔)，将该混合物在4℃孵育1小时。，然后将混合物放置在预先在24孔板中培养的M8166细胞(1.105个细胞/孔)上。在该实验中，用源于pSHIVKU2而没有任何血清的病毒来作为阳性对照，且阴性对照对应于仅有细胞。
评定细胞应答的方法：酶联免疫斑点测试
该测试的目的是检测和评定作为对抗原刺激特异性应答而分泌IFN-γ的T淋巴细胞(TL)的比例。
首先，深度麻醉小鼠，并且随后采取全血和脾脏。将小鼠脾脏放入在冰中的RPMI培养基中。在干燥管中的血液用于分离血清。在PBS和1％的EDTA的存在下，在一对叶片之间研磨皮氏培养皿中的脾脏，以分离脾细胞。在PBS/EDTA中将细胞冲洗两次(离心2000G，5min，20℃)，以纯化和富集具有脾细胞的细胞。在孔中播种细胞之后，用PBS冲洗该板，随后与PBS+10％SCS在实验室的温度下孵育30分钟。在每个孔中播种细胞(5.105个脾细胞)，然后用最终浓度为2μg/ml的Gag、Env、Tat、Rev和Nef蛋白的肽池来接种。将阳性对照(在试剂盒中包括的CD3-2)和阴性对照加入测试中。用铝箔覆盖该板，在37℃孵育19小时。冲洗细胞和肽，随后加入生物素化(7-b6-生物素)的抗-IFN-γ的单克隆抗体，并且覆盖该板，在室温下孵育2h。加入稀释在含有0.5％的FCS的PBS(100μl/孔)，并且该板在室温下孵育1小时。在另一个冲洗步骤之后，随后加入TMB(显影底物)，随后，在出现蓝斑之后冲洗该板并且进行干燥。在双目放大镜下以40倍的放大率来完成板的读出。
对于每种条件，通过计算重复斑点的数量的平均值以及标准差来确定孔的阳性标准。计算1百万PBMC的斑点的数量，并且该数量被标准化至在NOD/SCID小鼠中得到的数据的20％。如果该斑点的平均值大于每百万PBMC中有大于10个斑点(对应于对照培养物所得到的斑点的平均值)，则认为测试是阳性的。
1.6.通过流式细胞术对抗原特异性的T细胞的表型和功能性检验
1.6.1.外周单核细胞的分离
如上所示制备人类外周血的单核细胞。根据上述程序分离的小鼠脾脏的脾细胞也被重悬在AIMV培养基中，而不具有任何用于孵育和细胞计数测试的血清。
1.6.2.细胞的抗原刺激和培养
为了检验抗原的特异性细胞是否能够增殖且产生细胞因子和裂解分子，用CFSE(1μg/ml)在37℃对脾细胞和PBMC标记10分钟，并且随后用PBS1X来冲洗细胞以除去过量物。经标记的细胞以1mlAIMV培养基中2.106/孔的量播种在96孔板的深孔中，并且随后在抗-CD49和CD28共刺激Ac的存在下，用以2μg/ml的量的不同肽池(Gag、Env和Tat+Rev+Nef)进行刺激。没有任何肽的细胞被用作阴性对照，并且加入2μg/ml的植物凝集素(PHA)的细胞被用作阳性对照。将细胞培养5天(37℃，具有湿度)，然后在标记这些细胞之前用相同的肽池再刺激6小时。通过离心(2,000G，5min，4℃)收获细胞，重悬在100μl的PBS中，并且用表面Ac(CD3、CD4和CD8)[PacificBlue(太平洋之蓝)抗-人类CD3(5μl)，PE抗-人类CD4(10μl)和APC/Cy7抗-人类CD8(10μl)]在室温下进行首次标记30分钟。随后离心细胞，然后用PBS1X冲洗，然后进行固定，并且在100μl的BD的CytofixCytoperm中使细胞是可渗透的。随后，在4℃，细胞与“抗-人类IFN-γPE-Cy7”和“AlexaFluor647抗-人类颗粒酶A”Ac(5μl)孵育20分钟来进行细胞质标记。最后，用PBS冲洗细胞且用4％PFA进行固定，然后使用流式细胞分析仪获得和分析。
1.6.3.仪器
使用连接BDFACSDiva6软件包的来自BD的LSRII流式细胞分析仪。该仪器能够进行高达13种荧光参数以及2种物理参数的测量，该物理参数是FSC大小(前向散射)和复杂度(complexity)或粒团SSC(侧散射)。该仪器装配有三种激光。在488nm处发射的蓝色激光可独立地激发若干种荧光染料(FITC、PE、PE-Cy7)。在633nm处发射的红色激光可激发APC和APC-Cy7荧光染料，最后在405nm处发射的紫色激光可激发PacificBlue荧光染料。
1.7.猕猴的免疫
在该研究中总共使用了12只食蟹猕猴。6只猕猴形成对照组，其它的6只猕猴形成接种组。经由肌内途径(4mg/动物和1mg/动物)通过电穿孔(EP)进行DNA的单次双注射，以免疫动物。
用单剂量的疫苗进行该免疫策略的原因是多重的。一个主要原因不会扰乱由与每一再免疫步骤相关的初始效应T细胞所引起的记忆T细胞的生成、成熟和增殖。
经免疫的动物经受纵向跟踪(一周一次进行4周，随后一周2次直至第32周，随后1周4次进行10个月)以检验由疫苗所诱导的免疫应答。在免疫前的2周和1周时采取血液样品用于检验可能的本底应答。分离外周血的单核细胞(PBMC)并且用于通过表面和胞浆内标记，以及通过流式细胞术来分析，使用ELISPOTIFN-λ测试来评定T细胞的应答。
2.结果
2.1.pCA-LTR-SHIVKU2-IN-质粒构建体的定性和定量检测
2.1.1.pCA-LTR-SHIV KU2 -IN-质粒的存在
当从多克隆细菌培养物中分离质粒DNA，其中多克隆细菌培养物获自BL培养基中的预培养物，该预培养物用于播种大体积的BL液体培养基时，观察到显著比例的约2000bp的游离基因。电泳图谱也表明存在对应于质粒的约14000bp(理论上为13739bp)的单一DNA带。
当从细菌培养物中分离DNA，其中细菌培养物首先在皮氏培养皿上产生以得到分离的克隆，这些克隆已被用于预培养和大量培养以用于分离和纯化质粒DNA时，在分离0.5μg的DNA之后得到的电泳图谱示出缺乏任何游离基因，并且示出对应于pCA-LTR-SHIVKU2-IN-质粒的环状、螺旋和超螺旋形式的高分子量DNA的三条带。通过分光光度法检测我们两种制备方法的质粒DNA的纯度和定量分析。在波长230nm、260nm和280nm处测量的吸光度值用于分别确定260/280比例(为1.75和1.82)和260/230比例(2.04和1.92)，这表明了我们的DNA具有令人满意的质量。DNA浓度分别为545μg/ml和765μg/ml。
2.1.2.pCA-LTR-SHIV KU2 -IN-的酶消化
用EcoR1消化质粒的图谱显示出存在在EcoRI位点处切割出约5,000bp和7,500bp的两条带；用BamH1消化质粒的图谱显示出存在在BamH1位点处切割出2400bp、4,900bp和7,400bp的三条带；以及用Sph1消化质粒的图谱显示出存在在单个Sph1位点处切割出的位于10000bp处的条带。用BamHl消化还观察到2400bp的额外条带，并且该条带应来自游离基因。
2.2.功能性的评定：质粒DNA对细胞的作用
用表达GFP的对照质粒pCG-GFP、质粒pSHIVKU2，并且随后用质粒pCA-LTR-SHIVKU2-IN-转染HEK293T细胞。转染有质粒pCG-GFP的细胞能够通过评价GFP+细胞的数量来评估转染效率。
为了检测转染有pCA-LTR-SHIVKU2-IN-或pSHIVKU2的HEK293T细胞产生诱导典型合胞体的病毒体，这些细胞与CEMx174一起共培养，随后在显微镜下观察ECP的发生。用ECP表征产生的两种共培养物。
为了检测通过经转染细胞所产生的SHIVKU2病毒是否复制了若干次，而将经转染的细胞的上清液用于感染M8166人类CD4+T淋巴细胞系。使用SHIVKU2得到的结果清楚地表明它感染且诱导ECP，尤其是使用高受纳的M8166细胞系。这些ECP在48小时之后马上出现，但是也在迟来的阶段中出现。
接下来，为了检测疫苗载体pCA-LTR-SHIVKU2-IN-的DNA仅允许单一的复制周期(因为它删除了in基因)，回收的含有CA-LTR-SHIVKU2-IN-病毒的上清液首次被接种，随后第二次被接种至正在培养的M8166细胞。首次接种从48小时开始并且在76小时结束时产生ECP，它们是更大量的。回收这些感染的细胞的上清液并将该上清液再次接种至M8166。与之前的接种不同，在接种后的48小时或76小时时均未观察到ECP。这些结果能够得出这样的结论：pCA-LTR-SHIVKU2-IN-仅能够对培养细胞进行一次转导。
典型ECP的存在暗示质粒DNA在HEK293T细胞中复制，并且已经产生了CA-LTR-SHIVKU2-IN-病毒体。第一次感染的ECP表明M8166人类CD4+TL系通过产生的颗粒而具有感染性，并且在第二次感染中它们的缺失表明在细胞中缺乏生产性复制。
2.3.对转染有pCA-LTR-SHIV KU2 -IN-的HEK293T细胞中病毒颗粒的形态 进行的电子显微分析
接下来，确定由疫苗pCA-LTR-SHIVKU2-IN-基因组产生的蛋白是否在HEK293T细胞中适当地组装成病毒颗粒。通过EM检验转染有质粒pCA-LTR-SHIVKU2-IN-的HEK293T细胞的形态。
结果表明病毒颗粒以芽体和已经与细胞分离的成熟病毒颗粒的形式存在于细胞的表面。因此，pCA-LTR-SHIVKU2-IN-疫苗的病毒蛋白为了产生在细胞外侧上出芽的病毒颗粒而进行组装。
2.4.对人源化的SCID小鼠和BALB/c小鼠进行接种的体内测试
2.4.1.在接种有pCA-LTR-SHIV KU2 -IN-的SCID-hu小鼠中评估体液应答
利用商购的ELISA测试的方式，检测免疫后约1个月时所采集的经免疫小鼠的血清样品中的Ac存在，该Ac特异性地结合病毒的抗原。在表1(下面)中总结了该分析的结果。这些结果表明类似于用SHIVKU2的DNA免疫的小鼠样品，来自用疫苗pCA-LTR-SHIVKU2-IN-的DNA免疫的小鼠的约一半的样品具有较小的阳性比例(分别为44％和37％)，这不同于来自用pΔ4SHIVKU2免疫的小鼠的样品(50％)。这些结果证实了疫苗pCA-LTR-SHIVKU2-IN-的DNA在NOD/SCID-hu小鼠中诱导体液应答的能力。在3个用pΔ4SHIVKU2免疫的小鼠的血清中的1个样品具有的OD值大于在用pCA-LTR-SHIVKU2-IN-和pSHIVKU2免疫的小鼠的血清的样品所获得的OD值。该质粒是非复制性，病毒的蛋白保持与转染的细胞的膜相关联，从而应诱导较少的Ac。
表1：在用pΔ4SHIVKU2、pCA-LTR-SHIVKU2-IN-和pSHIVKU2免疫的系列对照SCID小鼠、SCID-hu小鼠和SCID-hu小鼠，以及对照组的血清中抗体的检测。
2.4.2.通过血清-中和作用分析中和活性
通过ELISA发现接种有选定的质粒pCA-LTR-SHIVKU2-IN-或SHIVKU2的SCID-hu小鼠的血清的OD为阳性。由于血清的量少，因此不能通过血清-中和作用来检验ELISA测试具有强OD值的确切样品。发现为阴性的SCID-hu小鼠和接种有pCA-LTR-SHIVKU2-IN-的SCID-hu小鼠的血清样品也可用于ELISA测试，以确保测试的可靠性。
表2：对免疫小鼠的血清的中和活性的分析。将稀释液(1/10、1/20...1/320)与病毒SHIVKU2(100TCID50)相混合，孵育，且随后用于接种M8166细胞。在接种后的5天之后，列出了诱导的EPC，且该诱导的EPC用于评定血清-中和活性。说明：+++对应于强中和作用；++对应于相当高的中和作用；+对应于较小中和作用；-对应于无中和作用。对于CA-LTR-SHIVKU2等，示出了两种类型的样品，具有较小中和图谱的样品类型与其他两种样品进行比较。
在经SHIVKU2病毒感染，且没有与任何血清孵育(76ECP)或与未免疫小鼠的血清孵育(42ECP)(阴性对照)的M8166细胞中，所得到的ECP的数量较高，这使我们能够将病毒中和作用的阴性阈值设置为42ECP(在表中未示出该数据)。另一方面，当病毒与经CA-LTR-SHIVKU2-IN-或SHIVKU2的DNA免疫的小鼠的1/10稀释的血清孵育时，ECP的数量变成准零。该数量随着血清稀释的增加而逐渐增加，这表明剂量效应。例如，在用pCA-LTR-SHIVKU2-IN-免疫的小鼠的血清在1/10稀释时，得到5ECP；而在1/320稀释时，得到69ECP的值，该值类似于无任何血清的对照组的值。
2.4.3.对在接种的BALB/c小鼠中pCA-LTR-SHIV KU2 -IN-的免疫原性的评 定
为了研究pCA-LTR-SHIVKU2-IN-疫苗在BALB/c小鼠中的免疫原性，将单一剂量的100μg的DNA经由肌内途径注入动物中。通过ELISPOT来检验抗原的特异性脾脏细胞(脾细胞)的比例。实际上，该研究的结果显示出了所使用的DNA具有诱导对抗所有研究抗原的特异性免疫应答的能力(图12)。经质粒pΔ4SHIVKU2诱导的T细胞的应答比经质粒pCA-LTR-SHIVKU2-IN-诱导的应答高两倍。在两种DNA之间效率上的这种小差异可能与pΔ4SHIVKU2的DNA质量优于pCA-LTRSHIVKU2-IN-的DNA质量相关。尽管如此，这些结果仍然给出了确定由这些疫苗在正常小鼠中诱导基础水平的免疫应答的可能性，并且给出了与在SCID-hu小鼠中得到的免疫应答进行比较的可能性。
2.4.4.对用不同的DNA免疫的NOD/SCID-hu小鼠中的细胞应答的评定
用单一剂量的50μg的CA-LTR-SHIVKU2-IN-、Δ4SHIVKU2或SHIVKU2的DNA通过肌内注射来免疫NOD/SCID-hu小鼠，随后脾脏用于通过ELISPOT来检测免疫应答以评定抗原的特异性细胞的比例，以及用于产生IFN-γ。如图13所示，存在显著数量的T细胞，该T细胞应答于Gag、Env或Tat+Rev+Nef抗原的刺激产生以SIV或HIV肽形式的人类INF-γ。有意思地是，注意到在用pCA-LTR-SHIVKU2-IN-免疫后得到的应答准类似与用pSHIVKU2免疫得到的应答，并且这两者都明显高于在用pΔ4SHIVKU2免疫后得到的应答。通过pCA-LTR-SHIVKU2诱导的应答的主要作用是对抗于Gag和Tat+Rev+Nef抗原。
这些结果整体上证实了pCA-LTR-SHIVKU2的DNA在NOD/SCID-hu小鼠中是高度免疫原性的，并且pCA-LTR-SHIVKU2的DNA优选诱导对抗抗原的应答，该抗原已知与对抗致病病毒的防护相关。
2.5.通过流式细胞术对抗原的特异性T细胞进行的表型和功能性检验
2.5.1.在第零天进行单标记(在回收小鼠的脾脏时的那一天进行)
使用这些单标记一方面为了检验选定的抗体是否确实检测那些靶点，并且另一方面用于评定人类细胞在SCID-hu小鼠脾脏中的存在和比例。
在流式细胞仪中分析人源化小鼠和非人源化小鼠的未被标记的淋巴细胞，以测量在细胞基础状态中的荧光(阴性对照)。
用联接有荧光物“PacificBlue”的人类抗-CD3Ac来进行CD3+TLs的检测。这些细胞在接种有质粒pCA-LTR-SHIVKU2-IN-的SCID-hu细胞中分离的细胞曲线中的102处形成峰。该峰在SCID-非-hu小鼠中回收的细胞中并不存在。
无论对于对照或我们测试的样品中，对于用抗-CD4+Ac(CD4抗-人类PE)单标记的细胞中未观察到显著的峰。这可能是由于所使用的抗-CD4Ac应该是非功能性的。
为了检测CD8+TLs，使用联接有荧光物APC/Cy7的人类抗-CD8单克隆Ac。在用pCA-LTR-SHIVKU2-IN-接种的SCID-hu小鼠中分离的细胞曲线中，能够检测到位于102和103之间的峰，而在SCID-非-hu小鼠中未检测到峰。
不能评定产生GRA分子的淋巴细胞的比例，这是因为没有在来自用联接有AlexaFluor647的抗-GRAAc标记的免疫小鼠和未免疫的小鼠的细胞中观察到峰的不同。
另一方面，对于用pCA-LTR-SHIVKU2-IN-接种的SCID-hu小鼠的细胞，用联接有荧光物PE-Cy7的人类抗-IFN-γAc标记的细胞显示出在位于102处的明显的峰，该峰在非免疫的SCID-非-hu小鼠的细胞中是缺失的。
2.5.2.在经免疫的动物中的T细胞的表型和功能。
为了检验病毒抗原的特异性T细胞的表型和功能，用CFSE标记的细胞与(Gag，、Env和Tat+Rev+Nef)肽孵育5天，随后用相同的肽再刺激6小时。随后用Ac来标记细胞，然后如上进行检验。
该分析结果显示出存在产生IFN-γ并且具有GRA分子的CD3+和CD8+细胞，特别是来自经接种的NOD/SCID-hu小鼠的细胞。事实上，在经免疫的NOD/SCID-hu小鼠中至少6％的CD8+TL细胞产生IFN-γ且1.7％的产生GRAA，而在对照小鼠中，仅2.5％的CD8+TL细胞产生IFN-γ且0.6％的产生GRAA。这些结果证实了存在CD3+、CD8+活化的细胞，这些CD3+、CD8+活化的细胞产生GRA和IFN-γ，且对应于有我们的疫苗pCA-LTR-SHIVKU2-IN-所诱导的效应细胞免疫应答。
2.6.猕猴中免疫应答和体液应答的分析
2.6.1.通过ELISPOTIFN-λ测试进行T细胞的免疫应答的分析
从采集的血液样品中分离的单核细胞部分用于凭借商购试剂盒来评定在应答于病毒Gag、Pol、Env和Tat+Rev+Nef抗原的刺激而分泌IFN-λ的细胞的比例。表3中示出了第一个20周的分析结果。结果清楚地显示出：在疫苗载体CAL-SHIV-IN-的单一给药之后，所有动物均出现特征为抗原的特异性细胞(分泌IFN-λ)的细胞免疫应答。这些应答由于具有彼此不同的CMH-1单倍型的动物而是异源的。免疫应答的特征是在免疫后(PI)2～4周时出现第一初始应答峰，随后从PI的8～10周出现更多延迟的应答峰，并且没有第二次免疫。非常有兴趣地是，注意到第二峰的强度通常远远大于第一峰的强度，尤其是对于BX80动物，该BX80动物中分泌IFN-λ的细胞的数量增加了3倍。
2.6.2.在经接种的猴子中利用多参数流式细胞仪对T细胞的免疫应答进行 的分析
通过反映所有动物都出现了由T细胞组成的应答，其中该T细胞进行扩增并且对于通过疫苗载体表达的所有抗原都是特异性的(表4)，通过多参数流式细胞仪的分析结果将证实通过ELISPOT得到的结果。这些应答在动物之间是异质的，并且还反映了第一初始应答期延长达约PI的8周，随后是收缩期(2～4周)，并且随后是再次出现期。持续该通过多参数流式细胞仪对免疫应答进行的纵向追踪，直至在第52周实施用测试病毒SIVmac251进行的毒性测试。
表4：在接种的猴子中，在初始性扩张期、收缩期和最后的再次出现或二次扩张期的时刻，应答于抗原刺激的CD4+和CD8+增殖的T细胞的值的总结。示出对应于每个时期的周数。数字对应于应答刺激而增殖的每一抗原的特异性T细胞与T细胞总数相比的百分比。
2.6.3.对猕猴中体液应答的分析。
用商购的ELISA试剂盒进行SHIV的抗-抗原抗体的检测，该ELISA试剂盒能够检测HIV-1的抗-Env抗体。在每个血液取样点收获的血清的纵向检验表明在BX80动物中从PI第20周开始存在抗-Env抗体，且在BX73动物中从第8周开始存在抗-Env抗体。通过对抗SHIV蛋白的Western印迹法证实了在阳性血清中存在抗体，在Western印迹法中显示出对抗Gag-p27蛋白的强信号和对抗gpl60/gpl20糖蛋白的信号。
2.6.4.结论
这些结果清楚地证实了疫苗DNA(CAL-SHIV-IN-)的单一注入能够诱导T细胞和体液(抗体)免疫应答。T细胞应答对抗由疫苗载体表达的所有病毒抗原。它们是持久的，且遵循常规扩张、收缩和记忆存储(storage-in-memory)的方式。通过分型还证实了中心类型记忆T细胞和记忆效应细胞的存在。
2.7.表达HIV - 1的所有抗原的新型载体：载体CAL-HIV-IN-的构建和功能 分析
从载体CAL-SHIVKU2-IN-的基因组中，通过Nar1和Sph1酶的双酶切删除SIV的gag基因、pol基因、vif基因、vpx基因和vpr基因，并且通过Nru1的部分酶切和Not1酶的完全酶切删除SIV的nef基因。然后纯化剩余的片段。该载有HIV的tat基因、rev基因和env基因(与CAEV的RTL形成框架)并且通过质粒pET来运输的片段用于引入载有HIV-1的gag基因、pol基因、vif基因、vpx基因和vpr基因的5kb片段和载有HIV-1的nef基因的620bp片段，且生成载体CAL-HIV-IN-(图17)。删除了编码整合酶序列的CAL-HIV-IN-载体由序列SEQIDNO：18组成。
2.7.1.功能性的评定：质粒DNA对细胞的作用
利用ExGen和制造商建议的程序通过转染将载体DNA引入至GHOST-CXCR4和HEK-293T细胞中。随后，经转染的GHOST-CXR4细胞变成是荧光的，证实了HIV-1的病毒蛋白、更具体地是Tat蛋白通过疫苗载体进行表达，Tat蛋白反式激活在HIV的RTL控制下GFP(绿色荧光蛋白)基因的表达。
转染有疫苗载体CAL-HIV-IN-的HEK-293T细胞的上清液用于接种M8166，指示出现细胞病变效应的CD4+T细胞，表征HIV感染。这些结果提供了如下证据：疫苗载体表达的蛋白组装成病毒颗粒，能够感染M8166指示细胞。具有细胞病变效应的这些细胞并不产生任何能够再次感染M8166指示细胞以及诱导细胞病变效应的能力。该结果表明CAL-HIV-IN-与在整合酶缺失下的单一复制周期相关。
为了评价在转染后产生的病毒蛋白，在感染后的24h、48h和72h收获用疫苗载体转染的HEK-293T细胞的上清液，且用ELISA检验Gagp24蛋白的存在。在表5中示出了该蛋白的量的测量值。它们表明从在转染后24h时的100ng/ml至在转染后72h时的135ng/ml的蛋白积累。
24h 48h 72h
Gag p24浓度 100ng/ml 110ng/ml 135ng/ml
表5：对被分泌在用疫苗载体CAL-HIV-IN-转染的HEK293T细胞的上清液中的HIV-1的Gagp24蛋白的评估。在用载体CAL-HIV-IN-的DNA进行转染后的24h、48h和72h之后，对在HEK293T细胞的上清液中积累的蛋白p24进行定量。
2.7.2.对BALB/C小鼠的免疫和对诱导的免疫应答的表征
使用3组6周龄的BALB/c小鼠(每组6只)：两组用于免疫，且第三组为对照组。将载体CAL-HIV-IN-的DNA以100μg/小鼠的量经由肌内途径注入两组免疫的小鼠中。在两周后处死一组中的动物，在免疫后(PI)三周处死另一组中的动物。在PI的两周处死对照组小鼠。采集每只小鼠的脾脏，并且分离出脾细胞，然后如上所述将其用于ELISPOT测试或用于多参数流式细胞仪的分析。在表6中示出了通过ELISPOT的分析结果。该结果表明存在分泌IFN-λ的所有抗原特异性细胞。这些细胞中的大部分对Gag抗原和Tat+Rev+Nef抗原都具有特异性。在免疫后的2周和3周的应答是基本类似的。
表6：在免疫后的2周和3周，通过ELISPOT对用疫苗载体CAL-HIV-IN-免疫的BABL/c小鼠的脾细胞进行的分析的结果总结。用ELISPOTIFN-λ测试，检验从经由肌内途径以每只小鼠100μg的量免疫的小鼠脾脏中分离的脾细胞，以评估分泌应答于由肽池(Gag、Env和Tat+Rev+Nef、TRN)刺激而分泌细胞因子的T细胞的数量。示出了在免疫后的2周和3周，每一种抗原和被检验的6只小鼠的斑点数量的平均值。
通过流式细胞仪分析的结果(表7)证实了对由疫苗载体CAL-HIV-IN-表达的所有抗原的特异性CD4+和CD8+T细胞免疫应答。
表7：通过多参数流式细胞仪分析的结果的总结。数字对应于基于T细胞的总数量，应答于抗原刺激而增殖的每种抗原的特异性T细胞的百分比。

Claims (5)

1.一种包括嵌合逆转录病毒基因组的核酸，其中，所述嵌合逆转录病毒基因组包括：
在第一逆转录病毒的5’中和3’中的长末端重复序列LTR，所述第一逆转录病毒为山羊关节炎-脑炎病毒CAEV；以及
第二逆转录病毒的病毒基因，所述第二逆转录病毒是HIV-1，
其中，证实了下面的条件a)或下面的条件b)：
a)所述嵌合逆转录病毒基因组包括所述HIV-1的gag基因、pol基因、vif基因、vpx基因、vpr基因、nef基因、tat基因、rev基因、vpu基因和env基因，其中该pol基因是删除了编码整合酶in的序列的pol基因，或者
b)所述嵌合逆转录病毒基因组包括SIV的gag基因、pol基因、vif基因、vpx基因、vpr基因和nef基因，和HIV-1的tat基因、rev基因、vpu基因和env基因，其中该pol基因是删除了编码整合酶in的序列的pol基因。
2.一种重组的载体，包括权利要求1所述的核酸。
3.一种由SEQIDNO:17或SEQIDNO:18组成的重组载体。
4.一种免疫原性组合物或疫苗组合物，包括根据权利要求1所述的核酸，或根据权利要求2或3所述的载体。
5.根据权利要求1所述的核酸，根据权利要求2或3所述的载体或根据权利要求4所述的疫苗组合物在制造用于预防或治疗由逆转录病毒引起的感染的药剂中的应用，其中所述逆转录病毒是HIV-1或SIV。
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DeVol The author hereby certifies that the use of copyrighted material in the thesis manuscript entitled: Induction and Characterization of Immune Responses in small animals using a Venezuelan Equine Encephalitis Virus (VEE) Replicon System, Expressing Human Immunodeficiency Virus Type-1 (HIV-1) Envelope Genes
DeVol Induction and characterization of immune responses in small animals using a Venezuelan equine encephalitis virus (VEE) replicon system, expressing human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) envelope genes

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