FR2979919A1 - Genomes lentiviraux chimeriques non-integratifs comme vaccins innovants contre vih-1 - Google Patents

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Abstract

La présente invention a pour objet des acide nucléiques comprenant des génomes rétroviraux chimériques non intégratifs comprenant les séquences terminales répétées (STR) 5' et 3' du lentivirus caprin : virus de l'Arthrite-Encéphalite Caprine (VAEC) ou d'un autre rétrovirus ne s'intégrant pas dans les cellules humaines et au moins un gène viral d'un autre rétrovirus. L'invention concerne également un vecteur comprenant un tel acide nucléique, une composition immunogène ou vaccinale comprenant ledit vecteur ou ledit acide nucléique, ainsi que leur utilisation pour le traitement et/ou la prévention d'une infection par un rétrovirus ou une maladie induite par un agent pathogène.

Description

Génomes lentiviraux chimériques non intégratifs comme vaccins innovants contre le VIH-1 La présente invention a pour objet des acides nucléiques comprenant des génomes rétroviraux chimériques non intégratifs comprenant les séquences terminales répétées (STR) 5' et 3' du lentivirus caprin : virus de l'Arthrite-Encéphalite Caprine (VAEC) ou d'un autre rétrovirus ne s'intégrant pas dans les cellules humaines et au moins un gène viral d'un autre rétrovirus. L'invention concerne également un vecteur comprenant un tel acide nucléique, une composition immunogène ou vaccinale comprenant ledit vecteur ou ledit acide nucléique, ainsi que leur utilisation pour le traitement et/ou la prévention d'une infection par un rétrovirus ou une maladie induite par un agent pathogène. A l'heure actuelle, le développement de vaccins efficaces contre les infections rétrovirales est un enjeu majeur de santé publique au niveau mondial. Récemment, il a été développé des vaccins basés sur l'utilisation de vecteurs ayant la capacité d'exprimer des protéines immunogènes chez l'hôte vacciné. Ces vecteurs vaccinaux, après amplification dans des bactéries, sont purifiés et directement injectés chez l'hôte nécessitant une vaccination. Le vecteur est ainsi pris en charge par les cellules de l'hôte, les protéines immunogènes sont exprimées et présentées aux molécules du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I et II, permettant ainsi de générer des réponses immunes contre ces protéines immunogènes. Les premiers tests de vaccination à l'aide de vecteur vaccinaux rétroviraux ont permis de montrer qu'une immunisation contre le virus du sarcome de Rous (Chebloune et al., 1991, J Virol, 65, 5374-5380), le virus de la maladie de New Castle (Cosset, Bouquet et aL, 1991, Virology 185, 862-866) puis de l'influenza (Robinson, Hunt et Webster, 1993, Vaccine, 11(9) : 957-960) était possible chez le poulet. Cette approche vaccinale est particulièrement intéressante pour lutter contre le virus de l'immunodéficience humaine (VIH). Le syndrome de l'immunodéficience acquise (SIDA) continue aujourd'hui d'être un problème de santé publique mondial avec plus de 33 millions d'individus infectés, et avec plus de 2 millions de décès et près de 3 millions de nouvelles infections par an. L'Afrique est le continent le plus affecté, mais l'infection grandit rapidement en Asie et dans certains pays d'Europe de l'Est, ce phénomène étant certainement dû au manque de moyens pour la détection précoce et au manque de traitement de l'infection. De plus, du fait de limitations d'ordre économique, de nombreux patients infectés par le VIH dans les pays en développement ne bénéficient d'aucun traitement, et contribuent donc à la dissémination massive de l'infection. L'impact économique du SIDA sera donc certainement très important au cours des prochaines années. En Europe, le SIDA reste une des pathologies transmissibles la plus importante, avec environ 1 million de personnes vivant avec le SIDA et plus de 20000 nouvelles infections par an en Europe de l'Ouest et en Europe Centrale ; et avec environ 1.5 millions de personnes vivant avec le SIDA et plus de 200000 nouvelles infections par an en Europe de l'Est. Le développement d'un vaccin prophylactique stoppant cette infection reste donc une priorité. Malgré de nombreux efforts, il n'existe, à ce jour, aucun vaccin sécuritaire et satisfaisant permettant la protection de l'homme contre l'infection par le VIH ou contre la pathogénèse induite par ce virus. Néanmoins, les nombreuses recherches effectuées ont permis d'accumuler de précieuses connaissances pour comprendre les échecs des stratégies vaccinales utilisées jusqu'à présent, et de définir les propriétés requises d'un vaccin induisant des réponses immunes protectrices contre les lentivirus responsables du SIDA. Le vaccin doit notamment induire une réponse lymphocytaire T CD8+, qui est associée au contrôle du virus lors de la primo-infection, et dont la présence a été montrée comme étant indispensable pour le contrôle de la charge virale chez les primates non-humains infectés (Jin et al., 1999, J Exp Med, 189 : 991-998). De plus, des lymphocytes T cytotoxiques (LTC) sont présents chez des patients non-progresseurs à long terme (LTNP) (Rinaldo et al., 1995, J Virol, 69 : 5838-5842), ou encore chez des sujets exposés mais non infectés par le VIH (Makedonas et al., 2002, AIDS, 16 : 1595-1602). Ces éléments et d'autres, montrent l'importance de telles réponses dans le contrôle de la réplication virale et/ou la prévention de la maladie.
De plus, la vaccination doit induire une réponse de cellules T CD4+, qui sont indispensables pour la stimulation et le maintien de la réponse à base de lymphocytes T CD8+ anti-VIH (Kalams et al., 1999, J Virol, 73: 6715-6720). Les cellules T CD4+ sont aussi indispensables pour la mise en place et le maintien de la réponse à base d'anticorps produits par les lymphocytes B (LB). Il a ainsi été montré que des macaques infectés par le VIS et déplétés en LB contrôlaient moins bien leur charge virale que des singes témoins (Johnson et al., 2003, J Virol, 77 : 375-381). Au vu de ces résultats et des précédents, il semble donc nécessaire qu'un vaccin contre le VIH doive stimuler les réponses B et T du système immunitaire. Parmi les nombreuses stratégies vaccinales testées se trouve celles faisant intervenir des lentivirus dits atténués. Il a ainsi été montré que ceux-ci permettent d'induire de manière reproductible la meilleure protection contre les virus d'épreuve homologues et hétérologues (Yankee et al., 2009, Virology, 383 : 103-111 ; Genesca, McChesney et Miller, 2009, J Intern Med, 265 : 67-77 ; Reynolds et al., 2008, J Exp Med, 205: 2537-2550 ; Amara et al., 2005, J Virol, 79 : 15356-15367 ; Whitney et Ruprecht, 2004, Curr Opin Infect Dis, 17 : 17-26). Cependant, du fait de leur intégration irréversible dans le génome de l'hôte et de la probabilité d'infection récurrente liée à des latences provirales, ces virus sont pathogéniques chez certains adultes et chez les nouveaux-nés (Desrosiers, 1994, AIDS Res Hum Retroviruses, 10 :331-332 ; Hofmann-Lehmann et al., 2003, AIDS, 17 : 157-166 ; Baba et al., 1999, Nat Med, 5 : 194-203 ; Baba et al., 1995, Science, 267: 1820-1825 ; Yankee et al., 2009, Virol, 383: 103-111). Pour des raisons d'éthique et de sécurité, ces lentivirus atténués ne peuvent donc en aucun cas être utilisés en l'état chez l'homme. La vaccination ADN basée sur des vecteurs viraux n'a quant à elle jamais été associée à un développement de pathologies, ni chez l'homme, ni chez les animaux, et de ce fait est plus sécuritaire. Cependant, testés chez le singe, ces vecteurs se sont avérés être incapables de protéger les animaux contre une infection expérimentale (Liu et al., 2006, Virology, 351 : 444-454 ; Singh et al., 2005, J Virol, 79 : 3419-3428). Il existe donc le besoin de nouveaux vecteurs vaccinants permettant d'exprimer les antigènes lentiviraux à des niveaux plus élevés tant en quantité qu'en qualité, dans l'objectif d'induire des réponses protectrices contre les virus pathogéniques.
Les inventeurs ont ainsi découvert que l'utilisation des séquences terminales répétées (STR) du virus de l'Arthrite-Encéphalite Caprine (VAEC) permettait d'améliorer l'expression de génomes rétroviraux vaccinants et l'induction de réponses protectrices contre les rétrovirus pathogéniques, tout en évitant leur intégration dans les cellules hôtes. Les inventeurs ont ainsi développé des génomes chimériques, entre les lentivirus des primates de type VIS et VIH et le VAEC, qui ont les propriétés d'être non intégratifs et non réplicatifs, tout en étant capables d'effectuer un cycle de réplication pour exprimer tous les antigènes du VIH et du VIS présents dans les génomes. Les inventeurs ont démontré que la transfection de ces génomes dans des cellules de primates (HEK293) permet l'expression de toutes les protéines des gènes présents et que ces protéines sont assemblées en particules virales capables d'effectuer un cycle unique d'infection (i.e. un pseudo-cycle) dans des cellules cibles, sans intégration du génome viral dans ces cellules cibles. L'immunisation de souris NOD/SCID humanisées avec des cellules mononuclées humaines a démontré la présence de fortes réponses immunes humorales et cellulaires spécifiques contre les antigènes viraux.35 Définitions Par « acide nucléique », on entend la forme polymérique ester phosphate des ribonucléosides (adénosine, guanosine, uridine ou cytidine ; "molécules d'ARN") ou des désoxyribonucléosides (désoxyadénosine, désoxyguanosine, désoxythymidine ou désoxycytidine ; "molécules d'ADN") sous forme monocaténaire ou sous forme d'une hélice bicaténaire. Des hélices bicaténaires ADN-ADN, ADN-ARN et ARN-ARN sont possibles. Le terme acide nucléique, et en particulier molécule d'ADN ou d'ARN, ne se réfère qu'à la structure primaire ou secondaire de la molécule, et ne se limite aucunement à des formes tertiaires particulières. Ainsi, ce terme comprend l'ADN bicaténaire que l'on trouve, entre autres, dans les molécules d'ADN linéaire ou circulaire (par exemple, fragments de restriction), les virus, les plasmides et les chromosomes. Lorsque l'on évoque la structure de molécules d'ADN bicaténaire particulières, les séquences peuvent être décrites ici conformément à la convention normale qui ne donne la séquence que dans la direction 5' vers 3' le long du brin non transcrit de l'ADN (c'est-à-dire le brin ayant une séquence homologue à l'ARNm). Dans le contexte de l'invention, « un acide nucléique comprenant un génome rétroviral chimérique non intégratif » désigne un acide nucléique qui comprend les séquences d'acide nucléique agissant en cis d'au moins deux rétrovirus, ledit acide nucléique n'étant pas capable de s'intégrer dans le génôme d'une cellule hôte. L'acide nucléique inclut les Séquences Terminales Répétées (STR) en 5' et en 3' d'un premier rétrovirus, et au moins un gène viral d'un deuxième rétrovirus. Par "rétrovirus", on entend un virus dont le génome consiste en une molécule d'ARN et qui comprend une transcriptase inverse, i.e. un membre de la famille des Retroviridae. Les rétrovirus sont divisés en trois genres : oncovirus, lentivirus et spumavirus. Les oncovirus sont notamment composés des espèces suivantes : le virus de la leucémie murine (MLV), le virus de la leucose aviaire (ALV), le virus du Sarcome de Rous (VSR), ou le virus Mason-Pfizer simien. Les lentivirus sont composés des espèces suivantes : le virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1), le virus de l'immunodéficience humaine de type 2 (VIH-2), le virus de l'immunodéficience simienne (VIS), le virus de l'immunodéficience féline (VIF), le virus de l'immunodéficience bovine (VIB), le virus Maedi Visna (VMV) du mouton, le virus de l'Arthrite-Encéphalite Caprine (VAEC) ou le virus de l'anémie infectieuse équine (VAIE). Le spumavirus peut être le HFV. Lorsque le rétrovirus est le VIH-1, il peut être de n'importe quel sérogroupe, par exemple de sérogroupe M (sérotype A-D, F-H, J, K), O, N ou P. Lorsque le rétrovirus est le VIH-2, il peut être de n'importe quel sérogroupe, par exemple de sérogroupe A ou B.
Par « gène viral », on entend un gène présent dans un génome rétroviral. Dans le contexte de l'invention, le gène viral peut être le gène gag, pol, vif, vpx, vpr, nef, tat, rev, vpu ou env. Le gène « gag » signifiant « group specific antigen » code pour la polyprotéine précurseur Gag qui est clivée pour donner les protéines structurelles fondamentales des rétrovirus, que sont les protéines de capside, les protéines de la nucléocapside, et les protéines de la matrice. Par exemple, la protéine Gag du VIH est le précurseur de la protéine de capside p24, des protéines de la nucléocapside p6 et p7, et de la protéine de matrice p17. A titre d'exemple non limitatif, le gène gag est le gène gag du VIH-1 (NCBI gene ID N°155030, mise à jour du 20 août 2011), du VIH-2 (NCBI gene ID N°14900001, mise à jour du 27 août 2011), du VIS (NCBI gene ID N°956108, mise à jour du 27 août 2011) ou du VIF (NCBI gene ID N°1489988, mise à jour du 20 août 2011). Le gène « pol » code pour une transcriptase inverse, une intégrase et une protéase. A titre d'exemple non limitatif, le gène pol est le gène pol du VIH-1 (NCBI gene ID N°155348, mise à jour du 27 août 2011), du VIH-2 (NCBI gene ID N°1490001, mise à jour du 27 août 2011), du VIF (NCBI gene ID N°1489989, mise à jour du 27 août 2011) ou du VIS (NCBI gene ID N°956107, mise à jour du 20 août 2011). Le gène « vif » ou « viral infectivity factor » code pour une protéine requise pour la production de virions infectieux. A titre d'exemple non limitatif, le gène vif est le gène vif du VIH-1 (NCBI gene ID N°155459, mise à jour du 7 août 2011), du VIH-2 (NCBI gene ID N°1724712, mise à jour du 21 janvier 2010), du VIF (NCBI gene ID N°1724709, mise à jour du 7 février 2010) ou du VIS (NCBI gene ID N°1490005, mise à jour du 21 janvier 2010). Le gène « vpr » code pour la protéine virale R qui joue un rôle important dans l'arrêt du cycle cellulaire en phase G2 et dans la régulation du transport du complexe de pre-intégration du cytoplasme vers le noyau, la réplication virale. A titre d'exemple non limitatif, le gène vpr est le gène vpr du VIH-1 (NCBI gene ID N°155807, mise à jour du 7 août 2011), du VIH-2 (NCBI gene ID N°1724718, mise à jour du 21 janvier 2010) ou du VIS (NCBI gene ID N°956112, mise à jour du 15 janvier 2011).
Le gène « vpx » code pour la protéine virale X et est apparenté au gène vpr. A titre d'exemple non limitatif, le gène vpx est le gène vpx du VIH-2 (NCBI gene ID N°1724714, mise à jour du 19 mars 2011) ou du VIS (NCBI gene ID N°1490006, mise à jour du 16 juillet 2011). Le gène « nef» code pour la protéine myristylée de 27 à 25 kDa, appelée Facteur de Régulation Négative, qui joue un rôle clé dans la déplétion des lymphocytes CD4 in vivo. A titre d'exemple non limitatif, le gène nef est le gène nef du VIH-1 (NCBI gene ID N°156110, mise à jour du 7 août 2011), du VIH-2 (NCBI gene ID N°1724715, mise à jour du 19 mars 2011) ou du VIS (NCBI gene ID N°1490008, mise à jour du 2 juillet 2011). Le gène « tat » code pour une protéine de 86 à 101 acides aminés, appelée « Trans-Activator of Transcription », qui augmente le taux de transcription du génome rétroviral. A titre d'exemple non limitatif, le gène tat est le gène tat du VIH-1 (NCBI gene ID N°155871, mise à jour du 20 août 2011), du VIH-2 (NCBI gene ID N°1724713, mise à jour du 7 février 2010) ou du VIS (NCBI gene ID N°956113, mise à jour du 7 février 2010). Le gène « rev » code pour une protéine appelée « Regulator of Virion Expression » qui permet l'exportation de l'ARN viral du noyau vers le cytoplasme. A titre d'exemple non limitatif, le gène rev est le gène rev du VIH-1 (NCBI gene ID N°155908, mise à jour du 7 août 2011), du VIH-2 (NCBI gene ID N°1724716, mise à jour du 21 mai 2011) ou du VIS (NCBI gene ID N°1490003, mise à jour du 15 janvier 2011). Le gène « vpu » code pour une protéine appelée « Viral Protein U » qui est impliquée dans le bourgeonnement viral et l'amélioration de la libération des virions. A titre d'exemple non limitatif, le gène vpu est le gène vpu du VIH-1 (NCBI gene ID N°155945, mise à jour du 7 août 2011) ou du VIS (NCBI gene ID N°2828723, mise à jour du 21 janvier 2010). Le gène « env » code pour la protéine précurseur gp160 qui est maturée et clivée pour donner les protéines de l'enveloppe gp120 et gp41. A titre d'exemple non limitatif, le gène env est le gène env du VIH-1 (NCBI gene ID N°155971, mise à jour du 7 août 2011), du VIH-2 (NCBI gene ID N°1724717, mise à jour du 18 juin 2011), du VIF (NCBI gene ID N°1489987, mise à jour du 18 juin 2011) ou du VIS (NCBI gene ID N°1490007, mise à jour du 18 juin 2011).
Acide nucléique Les inventeurs ont démontré que les Séquences Terminales Répétées (STR) du virus de l'arthrite-encéphalite caprine (VAEC) permettaient l'expression constitutive des gènes leur étant associés et n'étaient pas dépendantes du gène tat viral pour exprimer les gènes d'un génome viral auquel elles sont fusionnées, permettant ainsi une expression forte d'antigènes viraux. De plus, les inventeurs ont montré que la seule présence de ces STR empêchait l'intégration d'un génome rétroviral hétérologue auquel elles sont fusionnées. L'invention concerne donc un acide nucléique comprenant un génome rétroviral chimérique non-intégratif, dans lequel ledit génome rétroviral chimérique comprend : - les Séquences Terminales Répétées (STR) en 5' et en 3' d'un premier rétrovirus, ledit premier rétrovirus étant un lentivirus, tel que le virus de l'Arthrite-Encéphalite Caprine (VAEC), le virus Maedi Visna (VMV) du mouton, le virus de l'anémie infectieuse équine (VAIE), ou un oncovirus ou un spumavirus, et - au moins un gène viral d'un deuxième rétrovirus, ledit deuxième rétrovirus n'étant pas le premier rétrovirus.
Les séquences STR utilisées proviennent de préférence d'un rétrovirus qui ne s'intègre pas dans le génome d'un « hôte » ou « patient », ledit hôte ou patient étant un hôte ou patient dans le génome duquel les deuxième et/ou troisième rétrovirus peuvent s'intégrer. Par exemple, lorsque le premier rétrovirus est le VAEC, ledit hôte ou patient n'est pas un caprin mais peut être un homme, un singe, un chat, ou un cheval, ou lorsque le premier rétrovirus est le VAIE, ledit hôte ou patient n'est pas un cheval mais peut être un homme, un singe, un chat, ou un ovin, ou lorsque le premier rétrovirus est le VMV, ledit hôte ou patient n'est pas un ovin mais peut être un homme, un singe, un chat, ou un cheval. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, le « premier rétrovirus » est le virus de l'Arthrite-encéphalite Caprine ou VAEC. Le VAEC est un rétrovirus de type lentivirus de la chèvre qui s'apparente au virus de l'immunodéficience humaine (VIH), mais qui ne provoque pas de pathologie de type SIDA chez son hôte. Par « Séquences Terminale Répétées» (LTR en anglais), on désigne une séquence permettant le contrôle de la transcription, c'est-à-dire comprenant un enhancer, un promoteur, un ou plusieurs signal(ux) d'initiation de la transcription, un ou plusieurs signal(ux) de terminaison de la transcription, un ou plusieurs signal(ux) de polyadénylation. Dans le contexte de l'invention, les STR du CAEV comprennent un enhancer, un promoteur et un signal d'initiation de la transcription ainsi qu'un signal de terminaison de la transcription et un signal de poly-adénylation. De manière préférée, les STR en 5' et en 3' du CAEV sont identiques et comprennent ou consistent en la séquence SEQ ID NO : 3. Dans d'autres modes de réalisation, les STR du Virus Maedi Visna (VMV) ou celles du lentivirus des équidés VAIE sont utilisées. La STR en 5' du VMV comprend ou consiste en la séquence se trouvant en position 1 à 161 de la Séquence de Référence NCBI NC 001452.1 (mise à jour du 8 décembre 2008). La STR en 3' du VMV comprend ou consiste en la séquence se trouvant en position 9106 à 9202 de la Séquence de Référence NCBI NC 001452.1 (mise à jour du 8 décembre 2008). La STR en 5' du VAIE comprend ou consiste en la séquence se trouvant en position 61 à 381 de la Séquence de Référence NCBI NC_001450 (mise à jour du 11 mars 2010). La STR en 3' du VMV comprend ou consiste en la séquence se trouvant en position 7269 à 8289 de la Séquence de Référence NCBI NC_001450 (mise à jour du 11 mars 2010).
Dans encore d'autres modes de réalisation, les STR d'un oncovirus, tel que le virus de la leucémie murine (MLV), le virus de la leucémie aviaire (ALV), le virus du Sarcome de Rous (VSR), ou le virus Mason-Pfizer simien, ou les STR d'un spumavirus, tel que le HFV sont utilisés. La STR en 5' du MLV comprennent ou consistent en la séquence se trouvant en position 1 à 210 de la Séquence de Référence NCBI NC_001702.1 (mise à jour du 5 février 2011). La STR en 3' du MLV comprend ou consiste en la séquence se trouvant en position 5735 à 8135 de la Séquence de Référence NCBI NC_001702.1 (mise à jour du 5 février 2011). La STR en 5' du ALV comprend ou consiste en la séquence se trouvant en position 1 à 594 de la Séquence de Référence NCBI NC_015116.1 (mise à jour du 18 avril 2011). La STR en 3' du ALV comprend ou consiste en la séquence se trouvant en position 5338 à 7489 de la Séquence de Référence NCBI NC_015116.1 (mise à jour du 18 avril 2011). La STR en 5' du VSR comprend ou consiste en la séquence se trouvant en position 22 à 102 de la Séquence de Référence NCBI NC_001407.1 (mise à jour du 8 décembre 2008). La STR en 3' du VSR comprend ou consiste en la séquence se trouvant en position 9058 à 9292 de la Séquence de Référence NCBI NC_001407.1 (mise à jour du 8 décembre 2008). La STR en 5' du virus Mason-Pfizer simien comprend ou consiste en la séquence se trouvant en position 26 à 123 de la Séquence de Référence NCBI NC 001550.1 (mise à jour du 8 décembre 2008). La STR en 3' du virus Mason-Pfizer simien comprend ou consiste en la séquence se trouvant en position 7573 à 7811 de la Séquence de Référence NCBI NC 001550.1 (mise à jour du 8 décembre 2008). La STR en 5' du HFV comprend ou consiste en la séquence se trouvant en position 1 à 1760 de la Séquence de Référence NCBI NC 001364.1 (mise à jour du 22 avril 2009). La STR en 3' du HFV comprend ou consiste en la séquence se trouvant en position 11487 à 13246 de la Séquence de Référence NCBI NC 001364.1 (mise à jour du 22 avril 2009). Dans le contexte de l'invention, le « deuxième rétrovirus » est différent du premier rétrovirus et peut être un oncovirus, un lentivirus ou un spumavirus. Ainsi par exemple, lorsque les STR du VAEC sont utilisés, le second rétrovirus n'est pas le VAEC. De manière préférée, le deuxième rétrovirus est un oncovirus, tels que le virus de la leucémie murine (MLV), le virus de la leucose aviaire (ALV), le virus du Sarcome de Rous (VSR), ou le virus Mason-Pfizer simien, un lentivirus, tel que le virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1), le virus de l'immunodéficience humaine de type 2 (VIH-2), le virus de l'immunodéficience simienne (VIS), le virus de l'immunodéficience féline (VIF) ou le virus de l'anémie infectieuse équine (VAIE), ou un spumavirus, tel que le HFV. De manière particulièrement préférée, le deuxième rétrovirus est le VIH-1, le VIH-2, le VIS ou le VIF. De manière préférée, ledit au moins un gène viral dudit deuxième rétrovirus est sélectionné parmi les gènes gag, pol, vif, vpx, vpr, nef, tat, rev, vpu et env. Dans un aspect particulier, ledit génome rétroviral chimérique comprend au moins deux, trois, quatre, cinq, six, sept, huit, neuf, dix gènes viraux dudit deuxième rétrovirus. De manière encore plus préférée, ledit génome rétroviral chimérique comprend l'ensemble des gènes gag, pol, vif, vpx, vpr, nef, tat, rev, vpu et env dudit deuxième rétrovirus. Dans un particulièrement aspect préféré, ledit génome rétroviral chimérique comprend les gènes gag, pol, vif, vpx, vpr, nef, tat, rev, vpu et env du VIS, du VIH-1, VIH- 2 ou du VIF. Dans un aspect encore préféré, ledit génome rétroviral chimérique comprend ou consiste en la séquence du génome rétroviral du VIS (SEQ ID NO : 4), du génome rétroviral du VIH-1 (SEQ ID NO : 2), du génome rétroviral du VIH-2 (SEQ ID NO : 5), ou du génome rétroviral du FIV (SEQ ID NO : 6).
Les génomes rétroviraux chimériques du VIS, du VIH-1, du VIH-2 et du VIF sont respectivement schématiquement représentés dans les figures 1 à 4. Dans un mode de réalisation particulier, ledit génome rétroviral chimérique comprend en outre au moins un gène viral d'un troisième rétrovirus, ledit troisième rétrovirus n'étant pas le premier rétrovirus. Ainsi, par exemple, lorsque les STR du VAEC sont utilisés, ledit troisième rétrovirus n'est pas le VAEC. Ledit « troisième rétrovirus » peut être choisi parmi l'un des rétrovirus tels que définis ci-dessus. Lorsque ledit génome rétroviral chimérique comprend au moins un gène viral d'un deuxième rétrovirus et au moins un gène viral d'un troisième rétrovirus, lesdits deuxième rétrovirus et troisième rétrovirus sont différents. Lesdits deuxième rétrovirus et troisième rétrovirus peuvent être ou ne pas être de genre différents, par exemple lesdits deuxième et troisième rétrovirus peuvent être chacun un oncovirus, un lentivirus, ou un spumavirus, ou lesdits deuxième et troisième rétrovirus peuvent être respectivement (i) un lentivirus et un spumavirus, ou inversement un spumavirus et un lentivirus, (ii) un oncovirus et un lentivirus, ou inversement un lentivirus et un oncovirus, ou (iii) un spumavirus et un oncovirus, ou inversement un oncovirus et un spumavirus. Préférentiellement, lorsque ledit génome rétroviral chimérique comprend au moins un gène viral d'un deuxième rétrovirus et au moins un gène viral d'un troisième rétrovirus, lesdits deuxième rétrovirus et troisième rétrovirus sont chacun un lentivirus, et de manière préférée, ledit lentivirus est sélectionné parmi le VIH-1, le VIH-2, le VIS, le VIF ou le VAIE.
De manière encore plus préférée, le deuxième rétrovirus et le troisième rétrovirus sont des lentivirus d'espèce, de sérogroupe, ou de sérotype différents. Ainsi, par exemple lorsque ledit deuxième rétrovirus est le VIH-1, ledit troisième rétrovirus est le VIH-2, ou encore lorsque ledit deuxième rétrovirus est le VIH-1 de sérogroupe M, ledit troisième rétrovirus est le VIH-1 de sérogroupe O, ou encore lorsque ledit deuxième rétrovirus est le VIH-1 de sérogroupe M et de sérotype 1, ledit troisième rétrovirus est le VIH-1 de sérogroupe M et de sérotype B. De manière préférée, ledit au moins un gène viral dudit troisième rétrovirus est sélectionné parmi les gènes gag, pol, vif, vpx, vpr, nef, tat, rev, vpu et env. Dans un aspect particulier, ledit génome rétroviral chimérique comprend en outre au moins deux, trois, quatre, cinq, six, sept, huit, neuf ou dix gènes viraux dudit troisième rétrovirus. De manière encore plus préférée, ledit génome rétroviral chimérique comprend en outre l'ensemble des gènes gag, pol, vif, vpx, vpr, nef, tat, rev, vpu et env dudit troisième rétrovirus, c'est-à-dire que le ledit génome rétroviral chimérique comprend l'ensemble des gènes gag, pol, vif, vpx, vpr, nef, tat, rev, vpu et env dudit deuxième rétrovirus et l'ensemble des gènes gag, pol, vif, vpx, vpr, nef, tat, rev, vpu et env dudit troisième rétrovirus. Ledit génome rétroviral chimérique peut donc comprendre un gène viral dudit deuxième rétrovirus et neuf gènes viraux dudit troisième rétrovirus, ou deux gènes viraux dudit deuxième rétrovirus et huit gènes viraux dudit troisième rétrovirus, ou trois gènes viraux dudit deuxième rétrovirus et sept gènes viraux dudit troisième rétrovirus, ou quatre gènes viraux dudit deuxième rétrovirus et six gènes viraux dudit troisième rétrovirus, ou cinq gènes viraux dudit deuxième rétrovirus et cinq gènes viraux dudit troisième rétrovirus, ou six gènes viraux dudit deuxième rétrovirus et quatre gènes viraux dudit troisième rétrovirus, ou sept gènes viraux dudit deuxième rétrovirus et trois gènes viraux dudit troisième rétrovirus, ou huit gènes viraux dudit deuxième rétrovirus et deux gènes viraux dudit troisième rétrovirus, ou neuf gènes viraux dudit deuxième rétrovirus et un gène viral dudit troisième rétrovirus. A titre d'exemples non limitatifs, ledit génome rétroviral chimérique peut donc comprendre le gène gag dudit deuxième rétrovirus et les gènes pol, vif, vpx, vpr, nef, tat, rev, vpu et env dudit troisième rétrovirus ; ou les gènes gag et pol dudit deuxième rétrovirus et les gènes vif, vpx, vpr, nef, tat, rev, vpu et env dudit troisième rétrovirus ; ou les gènes gag, pol, vif dudit deuxième rétrovirus et les gènes vpx, vpr, nef, tat, rev, vpu et env dudit troisième rétrovirus ; ou les gènes gag, pol, vif, vpx dudit deuxième rétrovirus et les gènes vpr, nef, tat, rev, vpu et env dudit troisième rétrovirus ; ou gag, pol, vif, vpx, vpr dudit deuxième rétrovirus et les gènes nef, tat, rev, vpu et env dudit troisième rétrovirus ; ou les gènes gag, pol, vif, vpx, vpr, nef dudit deuxième rétrovirus et les gènes tat, rev, vpu et env dudit troisième rétrovirus ; ou les gènes gag, pol, vif, vpx, vpr, nef, tat dudit deuxième rétrovirus et les gènes rev, vpu et env dudit troisième rétrovirus ; ou les gènes gag, pol, vif, vpx, vpr, nef, tat, rev dudit deuxième rétrovirus et les gènes vpu et env dudit troisième rétrovirus ; ou les gènes gag, pol, vif, vpx, vpr, nef, tat, rev, vpu dudit deuxième rétrovirus et le gène env dudit troisième rétrovirus.
Dans aspect particulièrement préféré, ledit génome rétroviral chimérique comprend les gènes gag, pol, vif, vpx et vpr dudit deuxième rétrovirus et les gènes nef, tat, rev, vpu et env dudit troisième rétrovirus. Dans un aspect encore plus préféré, ledit génome rétroviral chimérique comprend les gènes gag, pol, vif, vpx et vpr du VIS et les gènes nef, tat, rev, vpu et env du VIH-1, ou inversement les gènes gag, pol, vif, vpx et vpr du VIH-1 et les gènes nef, tat, rev, vpu et env du VIS. Dans un autre aspect particulièrement préféré, ledit génome rétroviral chimérique comprend les gènes gag, pol, vif, vpx et vpr du VIH-1 et les gènes nef, tat, rev, vpu et env du VIH-2, ou inversement les gènes gag, pol, vif, vpx et vpr du VIH-2 et les gènes nef, tat, rev, vpu et env du VIH-1. Dans un aspect encore plus préféré, ledit génome rétroviral chimérique comprend ou consiste en la séquence SEQ ID NO : 7 (une représentation schématique de ce génome rétroviral chimérique se trouve en figure 5). Dans un mode de réalisation particulier, lorsque le gène pol est présent dans le génome rétroviral chimérique, ledit gène pol est un gène pol délété des séquences codant l'intégrase (in). De manière préférée, ledit gène pol est délété de la séquence SEQ ID NO : 8 (séquence de l'intégrase du VIS), SEQ ID NO :9 (séquence de l'intégrase du VIH- 1), SEQ ID NO :10 (séquence de l'intégrase du VIH-2), ou SEQ ID NO :11 (séquence de l'intégrase du FIV). Ainsi, dans un mode de réalisation particulièrement préféré, ledit génome rétroviral comprend ou consiste en la séquence SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14 ou SEQ ID NO : 15. Les génomes rétroviraux chimériques comprenant ou consistant en la séquence SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14 ou SEQ ID NO : 15 sont respectivement schématiquement représentés en figures 6 à 10. L'invention concerne également un vecteur comprenant un acide nucléique selon l'invention. Le terme « vecteur » désigne un élément extrachomosomique par lequel une séquence d'ADN ou d'ARN (i.e. un gène « étranger ») peut être introduite dans une cellule hôte, de manière à transformer l'hôte et à permettre l'expression (i.e. transcription et traduction) de la séquence introduite. L'élément extrachromosomique peut être une séquence auto-réplicative, une séquence de phage ou une séquence nucléotidique, un ADN ou ARN simple ou double brin, un plasmide, un cosmide. Un vecteur contient typiquement l'ADN d'un agent transmissible, dans lequel un ADN étranger est inséré et un marqueur de sélection. Un moyen commun d'insérer un fragment d'ADN dans un autre segment d'ADN implique l'utilisation d'enzymes, appelées enzymes de restriction, qui clivent l'ADN au niveau de sites spécifiques (groupes spécifiques de nucléotides), appelés sites de restriction. Généralement, l'ADN étranger est inséré au niveau d'un ou plusieurs sites de restriction du vecteur ADN, et ensuite transporté par le vecteur dans une cellule hôte avec l'ADN de l'agent transmissible. Un segment ou une séquence d'ADN comprenant un ADN ajouté ou inséré, tel qu'un vecteur, peut aussi être appelé « une construction d'ADN ». Un type commun de vecteur est un « plasmide », qui généralement est une molécule autonome d'ADN double-brin, généralement d'origine bactérienne, qui peut facilement accepter un ADN additionnel (étranger) et qui peut facilement être introduit dans une cellule hôte appropriée. Un nombre important de vecteurs, incluant les plasmides, ont été décrits pour la réplication et/ou l'expression dans différents hôtes eucaryotes et procaryotes. Dans le contexte de l'invention, le vecteur comporte un marqueur de sélection, tel qu'un gène de résistance à un antibiotique, et un acide nucléique selon l'invention. De manière préférée, le gène de résistance est un gène de résistance à l'ampicilline ou à la kanamycine. Les acides nucléiques et/ou le vecteur selon l'invention peuvent être utilisés pour transformer ou transfecter une cellule ou un organisme hôte, i.e. pour l'expression du génome rétroviral chimérique selon l'invention. Le terme « cellule hôte » désigne n'importe quelle cellule de n'importe quel organisme qui est sélectionnée, modifiée, transformée, transfectée, transduite, cultivée, ou utilisée ou manipulée d'une façon ou d'une autre, pour la production d'une substance par la cellule, par exemple pour l'expression d'un gène, d'une séquence d'ADN, d'une protéine, d'un virion par la cellule. Dans le contexte de l'invention, la cellule hôte est une cellule mammifère. Des cellules hôtes appropriées incluent, sans être limitant, les cellules HEK293, les lignées lymphocytaires T CD4+ humaines CEMx174 et M8166, les lymphocytes T CD4+ humains, les lymphocytes T CD8+ humains, les cellules mononucléées du sang humain. La transformation de la cellule ou de l'organisme hôte par l'acide nucléique et/ou le vecteur selon l'invention peut être réalisée selon les techniques standards connues de l'homme du métier, comme par exemple par transfection, électroporation, microinjection, transduction, fusion de cellules, DEAE-Dextran, précipitation au phosphate de calcium, ou utilisation de pistolet à gènes, ou un transporteur de vecteur d'ADN (voir par exemple, Wu et al., 1992, J Biol Chem 267 :963-967 ; Wu et al., 1988, J Biol Chem 263 :14621-14624 ; Hartmut et al., demande de brevet canadienne No. 2 012 311, publiée le 15 mars 1990). Composition immunogène ou vaccinale et leurs utilisations L'acide nucléique ou le vecteur selon l'invention peuvent être utilisés dans un but immunogène ou vaccinal. Ainsi, l'invention concerne également une composition immunogène ou vaccinale comprenant un acide nucléique ou un vecteur selon l'invention. Dans le contexte de la présente demande, le terme « vaccinal » est relatif à la vaccination prophylactique ou thérapeutique. Par composition immunogène ou vaccinale, on entend une composition permettant d'induire une réponse immune contre un rétrovirus tel que défini précédemment. Par réponse immune, on entend une réponse faisant intervenir les lymphocytes T, par exemple les lymphocytes T CD4+ et CD8+, et les lymphocytes B.
Selon un mode de réalisation, la composition immunogène ou vaccinale selon l'invention est monovalente, i.e. elle permet une réponse immune contre un seul rétrovirus, par exemple contre le VIH-1 ou le VIH-2. Selon un autre mode de réalisation, la composition immunogène ou vaccinale selon l'invention est multivalente, i.e. elle permet une réponse immune contre plusieurs rétrovirus, par exemple contre le VIH-1 et le VIH-2 ou plusieurs agents pathogènes, par exemple contre le VIH-1 et le VHC. Dans ce cas le vecteur vaccinant exprime les antigènes de l'un et de l'autre agent pathogène. Selon un autre mode de réalisation, la composition immunogène ou vaccinale selon l'invention est polyvalente. Une telle composition immunogène ou vaccinale peut être obtenue en combinant plusieurs compositions immunogènes ou vaccinales monovalentes selon l'invention. La composition immunogène ou vaccinale peut en outre comprendre au moins un autre vaccin, i.e. un virus vivant atténué, un virus inactivé ou une sous-unité virale, contre un autre virus, tel qu'un virus sexuellement transmissible, comme par exemple le virus de l'hépatite B, le virus de l'hépatite C ou le papillomavirus.
Dans un mode de réalisation préféré, la composition immunogène ou vaccinale selon l'invention comprend un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Un « véhicule pharmaceutiquement acceptable » désigne n'importe quel véhicule dans lequel la composition immunogène ou vaccinale selon l'invention peut être formulée. Cela inclut une solution saline telle qu'un tampon phosphate salin. En général, un diluant ou un véhicule est choisi selon le mode et la voie d'administration, et selon la pratique pharmaceutique standard. Un véhicule pharmaceutiquement acceptable inclut, sans limitation, des échangeurs d'ions, l'aluminium, du stéarate d'aluminium, la lécithine, les systèmes de délivrance de médicaments auto-émulsionnants tels que le D-a-tocopherol polyethyleneglycol 1000 succinate, des surfactants utilisés sous forme de dosage pharmaceutique tels que les Tweens ou d'autres matrices de délivrance polymériques, des protéines du sérum telles que l'albumine humaine, des substances tampon telles que les phosphates, la glycine, l'acide sorbique, le sorbate de potassium, des mélanges de glycérides d'acides gras saturés de végétaux, de l'eau, des sels ou des électrolytes, tels que le sulfate de protamine, le phosphate d'hydrogène disodique, le phosphate d'hydrogène de potassium, le chlorure de sodium, les sels de zinc, la silice colloïdale, le trisilicate de magnésium, la polyvinylpyrrolidone, des substances à base de cellulose, le polyéthylène glycol, la carboxyméthylcellulose de sodium, les polyacrylates, les cires, les bloc de polymères de polyéthylène-polyoxypropylène et la graisse de laine. Les cyclodextrines tels que les A-, B-, et g-cyclodextrines, ou des dérivés chimiquement modifiées tels que hydroxyalkylcyclodextrines, y compris 2-et 3-hydroxypropyl-b- cyclodextrines, ou d'autres dérivés solubilisés peuvent également être avantageusement utilisé pour améliorer la délivrance des compositions selon l'invention. Les compositions selon l'invention peuvent en outre contenir un adjuvant. Tout adjuvant ou mélange d'adjuvants pharmaceutiquement acceptable classiquement utilisé dans le domaine des vaccins peut être utilisé à cette fin. On peut citer à titre d'exemples d'adjuvants appropriés les sels d'aluminium tels que l'hydroxyde d'aluminium ou le phosphate d'aluminium et le DC-Chol. Tout adjuvant ou mélange d'adjuvants pharmaceutiquement acceptable classiquement utilisé dans le domaine des vaccins peut être utilisé à cette fin. On peut citer à titre d'exemple d'adjuvant approprié les sels d'aluminium tels que l'hydroxyde d'aluminium ou le phosphate d'aluminium et le DC-Chol.
Les compositions selon l'invention peuvent contenir des gènes adjuvants, c'est-à- dire des gènes qui expriment des protéines qui vont jouer le rôle d'adjuvants en augmentant l'immunogénicité des protéines virales exprimées. Par exemple les gènes qui codent pour les cytokines telles que les interleukines (II) [IL-2, IL12, IL-15,...ou le GMCSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)]. Ces gènes adjuvant sont soit incorporés dans le plasmide vaccinal, soit co-injectés sous forme de plasmides d'expression séparés. N'importe quelle méthode d'administration connue de l'homme du métier peut être utilisée. En particulier, l'acide nucléique, le vecteur, la composition immunogène ou vaccinale selon l'invention peuvent être administrés par voie orale, par inhalation, ou par voie parentérale (en particulier par injection intradermique, sous cutanée, intraveineuse, intramédullaire ou intramusculaire). Lorsque la voie parentérale est utilisée, l'acide nucléique, le vecteur, la composition immunogène ou vaccinale selon l'invention peuvent être sous forme de solutions et suspensions injectables, conditionnés en ampoules ou en flasques. Les formes pour une délivrance parentérale sont généralement obtenues en mélangeant l'acide nucléique, le vecteur, la composition immunogène ou vaccinale selon l'invention avec des tampons, d'émulsifiants, des stabilisants, des conservateurs, des agents solubilisants. Selon des techniques connues, ces mélanges peuvent ensuite être stérilisés et conditionnés sous formes d'injections intradermique, sous cutanée, intraveineuse, intramédullaire ou intramusculaire. L'homme du métier peut utiliser des tampons basés sur des sels de phosphate organique en tant que tampon. Des exemples d'agent émulsifiants incluent la méthylcellulose, l'acacia, la carboxymethylcellulose de sodium. Des exemples de stabilisants incluent le sulphite de sodium, le métasulfite de sodium, et des exemples de conservateurs incluent le P-hydroxybenzoate de sodium, l'acide sorbique, le crésol et le chlorocrésol. L'acide nucléique, le vecteur, la composition immunogène ou vaccinale peuvent également être sous forme lyophilisée.
La solution d'ADN vaccinale peut être injectée directement ou bien administrée par électroporation in vivo en utilisant un électroporateur commercial ou bien encapsulée dans des liposomes ou des nanoparticules ou en utilisant tout procédé de transfection in vivo qui permet une meilleure introduction de l'ADN vaccinal dans les cellules de l'hôte vacciné.
Dans un autre aspect, l'invention concerne un acide nucléique selon l'invention, un vecteur selon l'invention et/ou une composition immunogène ou vaccinale selon l'invention pour leur utilisation dans la prévention et/ou le traitement d'une infection par un rétrovirus. Par « prévenir » ou « prévention », on entend l'inhibition d'une infection rétrovirale, i.e. empêcher le rétrovirus de provoquer une infection, ou prévenir la propagation du rétrovirus à l'intérieur d'un sujet infecté ou d'un sujet à l'autre. Par « traiter » ou « traitement, on entend la limitation de la sévérité de la maladie, la prévention des infections récurrentes, i.e. limiter la réactivation des infections latentes ou persistantes, et pallier les symptômes des infections par un rétrovirus. Le rétrovirus est tel que défini précédemment, et de manière préférée le rétrovirus est le VIH-1, le VIH-2 ou le VIF. Le terme « patient » ou « sujet » ou « hôte » désigne un mammifère humain ou non-humain, ou un oiseau. Préférentiellement, le patient est un primate, un murin (souris), un félin (chat), un canin, un équidé (un cheval), un oiseau, un humain, incluant les femmes, les hommes, les adultes et les enfants.
La présente invention concerne également une méthode de vaccination ou de traitement d'un sujet le nécessitant comprenant l'administration d'une quantité prophylactiquement ou thérapeutiquement efficace d'un acide nucléique selon l'invention, ou d'un vecteur selon l'invention, ou d'une composition immunogène ou vaccinale selon l'invention. Une « quantité prophylactiquement ou thérapeutiquement efficace » désigne une quantité d'acide nucléique, de vecteur ou de composition immunogène ou vaccinale permettant de conférer un effet thérapeutique ou prophylactique sur le sujet traité. L'effet thérapeutique peut être objectif (i.e. mesurable par des tests ou des marqueurs) ou subjectif (i.e. le sujet donne une indication d'un effet ou ressent un effet). Une quantité effective peut varier d'environ 0,01 pg/Kg à 5000 pg/Kg, alternativement d'environ 0,1 to à 1000 pg/Kg, alternativement d'environ 1 à 500 pg/Kg. Les quantités effectives vont aussi varier selon la voie d'administration, l'utilisation ou non de méthode de transfection in vivo, la taille et le poids du sujet, ainsi que selon la possibilité d'une co-utilisation avec d'autres agents. Dans le contexte de l'invention, le mode d'administration de l'acide nucléique selon l'invention, ou du vecteur selon l'invention, ou de la composition immunogène ou vaccinale selon l'invention peut être réalisée par voie intraveineuse, sous cutanée, intradermique, intramédulaire, ou intramusculaire.
L'invention va être expliquée plus en détail par les exemples suivants, sans en limiter sa portée. DESCRIPTIF DES FIGURES Figure 1 : Représentation ID NO : 2. Figure 2 : Représentation ID NO :4. Figure 3 : Représentation ID NO : 5. Figure 4 : Représentation ID NO : 6. Figure 5 : Représentation ID NO : 7.
Figure 6 : Représentation ID NO : 1. schématique de l'acide nucléique codé par la séquence SEQ schématique de l'acide nucléique codé par la séquence SEQ schématique de l'acide nucléique codé par la séquence SEQ schématique de l'acide nucléique codé par la séquence SEQ schématique de l'acide nucléique codé par la séquence SEQ schématique de l'acide nucléique codé par la séquence SEQ Figure 7 : Représentation schématique de l'acide nucléique codé par la séquence SEQ ID NO : 12. Figure 8 : Représentation schématique de l'acide nucléique codé par la séquence SEQ ID NO 13.
Figure 9 : Représentation schématique de l'acide nucléique codé par la séquence SEQ ID NO : 14. Figure 10 : Représentation schématique de l'acide nucléique codé par la séquence SEQ ID NO : 15. Figure 11 : Représentation schématique de la construction du génome du CAEV, du plasmide pS H IVKu2, pCA-LTR-SHIVKU2IN- et du pO4SHIVKU2- Figure 12 : Evaluation du nombre de lymphocytes T sécrétant l'IFN-y des souris Balb/c. Cellules de rates de souris immunocompétentes BALB/c témoins et immunisées avec p3.4SHIVKu2 et pCA-LTR-SHIVKu2IN- et stimulées par les peptides Gag, Env et le pool peptidique Tat+Rev+Nef. Le nombre de spots a été calculé pour 1 million de PBMCs.
Figure 13 : Évaluation du nombre de Lymphocytes T humains sécrétant l'IFN-y chez les souris NOD/SCID-hu immunisées. Cellules de rates de souris immunodéficientes reconstituées par les cellules mononucléées du sang humain et immunisées avec p3.4SHIVKu2 ou pCA-LTR-SHIVKU2IN- ou pSHIVKu2 sont stimulées par les peptides Gag, Env et par le pool peptidique Tat+Rev+Nef. Le nombre de spots a été calculé pour 1 million de PBMCs et normalisé à 20%. Figure 14 : Représentation de la préparation du vecteur CA-LTR-SHIVKU2-IN-. Figure 15 : Représentation schématique du vecteur CA-LTR-SHIVKU2. Figure 16 : Représentation schématique du vecteur CA-LTR-SHIVKU2-IN-.
DESCRIPTIF DES SEQUENCES - SEQ ID NO : 1 représente la séquence d'un génome rétroviral chimérique comprenant les STR du VAEC et le génome du SHIV délété des séquences codant l'intégrase. - SEQ ID NO : 2 représente la séquence d'un génome rétroviral chimérique comprenant les STR du VAEC et le génome du VIH-1. - SEQ ID NO : 3 représente la séquence du STR du VAEC. - SEQ ID NO : 4 représente la séquence d'un génome rétroviral chimérique comprenant les STR du VAEC et le génome du VIS. - SEQ ID NO : 5 représente la séquence d'un génome rétroviral chimérique comprenant les STR du VAEC et le génome du VIH-2.35 - SEQ ID NO : 6 représente la séquence d'un génome rétroviral chimérique comprenant les STR du VAEC et le génome du VIF. - SEQ ID NO : 7 représente la séquence d'un génome rétroviral chimérique comprenant les STR du VAEC et le génome du SHIV. - SEQ ID NO : 8 représente la séquence de l'intégrase du VIS. - SEQ ID NO : 9 représente la séquence de l'intégrase du VIH-1. - SEQ ID NO : 10 représente la séquence de l'intégrase du VIH-2. - SEQ ID NO : 11 représente la séquence de l'intégrase du VIF. - SEQ ID NO : 12 représente la séquence d'un génome rétroviral chimérique comprenant les STR du VAEC et le génome du VIH-1 délété des séquences codant l'intégrase. - SEQ ID NO : 13 représente la séquence d'un génome rétroviral chimérique comprenant les STR du VAEC et le génome du VIH-2 délété des séquences codant l'intégrase. - SEQ ID NO : 14 représente la séquence d'un génome rétroviral chimérique comprenant les STR du VAEC et le génome du FIV délété des séquences codant l'intégrase. - SEQ ID NO : 15 représente la séquence d'un génome rétroviral chimérique comprenant les STR du VAEC et le génome du SIV délété des séquences codant l'intégrase. - SEQ ID NO : 16 représente la séquence du vecteur pCA-LTR-SHIVKU2. - SEQ ID NO : 17 représente la séquence du vecteur pCA-LTR-SHIVKU2-IN-.
EXEMPLES 1. Matériel et méthodes 1.1. Les vecteurs vaccinants (Figure 1) 1.1.1. Vecteurs -CA-LTR-SH IVKu2 et -CA-LTR-SH IVKu2-IN- Le vecteur CA-LTR-SHIVKU2 contient le génome du Virus de l'Immunodéficience Simienne et Humaine (SHIV) délété des STR du VIS et remplacés par les STR du VAEC. Le SHIV contient un génome chimérique composé de celui du VIS-mac239 dans lequel les gènes tat, env et rev du VIS ont été délétés et remplacés par les gènes vpu, tat, env et rev du VIH-1. Le vecteur porte donc les gènes vpr, vpx, gag, pol, vif et nef de VIS et les gènes tat, rev et env de VIH-1 sous le contrôle transcriptionnel des STR en 5'et 3' du VAEC. Le gène pol a été délété des séquences codantes de l'intégrase (in). Le vecteur vaccinant pCA-LTR-SHIVKu2 non délété des séquences codantes de l'intégrase consiste en la séquence SEQ ID NO : 16 (Figure 15). Le vecteur pCA-LTR-SHIVKU2-IN-, délété des séquences codantes de l'intégrase consiste en la séquence SEQ ID NO : 17 (Figure 16).
La construction du vecteur CA-LTR-SHIVKU2-IN- a été réalisée de la manière suivante (Figure 14). Le vecteur SHIV-KU2 a été digéré avec EcoR1 et Nar1, puis le fragment STR de 0.8 kb a été enlevé. Le vecteur CAEV-pBSCA a ensuite été digéré avec EcoR1 et Narl et le fragment STR de 0.5 kb a été purifié. Les deux fragments ont ensuite ont subit une ligation. Le vecteur SHIV-1 LTRCA a ensuite été digéré avec Stul et Aval et le fragment STR de 0.8 kb a été enlevé. Le STR en 3' du VAEC a été amplifié avec des amorces Stul et Aval, les produits de la PCR ont été digérés par Stul et Aval et le fragment STR de 0.5 kb a été purifié. Les deux fragments ont subit une ligation pour générer le CAL-SHIV Ku2. Enfin une digestion avec Kpnl et Accl dans le gène pol a été réalisée pour enlever 314 pb du gène de l'intégrase du SHIV pour générer le CAL-SHIV KU2- IN-. 1.1.2. Vecteurs pSHIVKU2et A4SHIVKu2 Les plasmides pSHIVKu2 et p04SHIVKu2 sont des plasmides utilisés comme témoins. Leurs constructions ont été décrites dans de nombreuses publications (Liu ZQ et al., 2006, Ramakrisna Hegde et al., 2005). 1.2 Production de l'ADN vaccinal 1.2.1. Culture bactérienne Les bactéries E. coli K12 (JM109) contenant le plasmide sont mises en pré-culture dans 5 ml de milieu LB contenant 0,05 mg/ml de kanamycine puis incubées une nuit à 30°C sous agitation à 150 tr/min (tpm). A partir de la pré-culture, la suspension bactérienne est diluée au 100 000ème dans du milieu LB, puis 50 pl de la dilution sont étalés sur la surface de l'agar/LB/Kanamycine contenu dans une boîte de pétri qui est ensuite incubée à 32°C pendant une nuit. Les colonies isolées développées sur l'agar de la boite de pétri sont ensemencées dans 5 ml de milieu liquide LB contenant 0,05 mg/ml de kanamycine et mises en culture sous agitation à 150 tpm à 30°C durant une nuit. Une fraction (1m1) de la culture est utilisée pour une extraction rapide de l'ADN à l'aide du kit Mini-prep de Macherey-Nagel ou Qiagen, selon le protocole recommandé, puis l'ADN extrait est séparé sur gel d'agarose à 1% pour vérifier sa qualité. Les bactéries correspondant à l'ADN jugé satisfaisant sont utilisées pour ensemencer les cultures de 1 L qui sont cultivées dans les mêmes conditions que précédemment, pour l'isolement d'ADN en maxipréparation. 1.2.2. Maxi-préparation : extraction plasmidique Les bactéries cultivées sous agitation (150 tpm) à 30°C pendant une nuit sont récoltées en culot par centrifugation (4000 g, 4°C, 15 min) et le culot est resuspendu dans 8 ml du tampon de resuspension (Tris-HCI 50mM pH8, EDTA 10mM). Les cellules sont ensuite lysées par addition de 8 ml de tampon de lyse alcalin (NaOH 200mM, 1% SDS) pour libérer l'ADN plasmidique. Le lysat est neutralisé par adjonction de 8 ml de tampon de neutralisation (acétate de potassium 3M pH 5,5). Le mélange est ensuite incubé 5 min dans la glace puis centrifugé 15 minutes à 15 000g à 4°C. La solution contenant l'ADN est transvasée dans une colonne préalablement équilibrée permettant de retenir l'ADN plasmidique. La colonne est lavée trois fois avec le tampon de lavage puis l'ADN est élue et précipité avec de l'isopropanol. Le culot d'ADN précipité est obtenu par centrifugation (30 min, 15 000 g à 4°C). L'ADN est ensuite lavé avec 2 ml d'éthanol 70% et centrifugé 10 min à 4°C à 15 000g pour enlever les excès d'impuretés et de sels puis le culot est séché et resuspendu dans un volume approprié d'eau ultrapure. La concentration de la solution d'ADN est alors déterminée par spectrophotométrie à une longueur d'onde À égale à 260 nm puis la qualité du plasmide est vérifiée par migration électrophorétique sur un gel d'agarose 1%. La taille du plasmide et l'intégrité du plasmide sont vérifiées sur gel d'agarose après digestion par des enzymes de restriction Bam H1 et Eco R1 par exemple. 1.2.3. Vérification du -lasmide -CA-LTR-SHIVKu2-IN- ar digestion enz mati ue Une fraction aliquote de 0,5 pg du plasmide est soumise à digestion avec 2 unités d'enzymes EcoR1, BamH1 ou Sph1 pendant 60 minutes à 37°C dans du tampon 1X approprié pour chaque enzyme, et dans un volume final de 200. Le profil de la digestion est vérifiée par migration électrophorétique dans un gel d'agarose 1% avec un tampon TAE 1X et révélé par du bromure d'éthidium (BET) et observation du gel sous UV. 1.3 Cultures cellulaires et traitements: 1.3.1. Modèles cellulaires et conditions de cultures Les lignées cellulaires ont été obtenues auprès du National Institutes of Health AIDS Research and Reference Reagent Program aux États Unis. Les cellules sont cryoconservées dans 10% de diméthyle sulfoxide (DMSO), à -170°C dans l'azote liquide. Elles sont décongelées puis cultivées dans des flacons de culture.
Les cellules HEK293T (Human Embryonic Kidney 293 immortalisé) constituent une lignée permanente de cellules de rein d'embryon humain. Elles sont utilisées du fait qu'elles sont très faciles à transfecter, avec des efficacités de transfection très élevées qui peuvent atteindre les 100%. Le génome lentiviral est exprimé fortement dans ces cellules et les protéines s'assemblent en particules infectieuses et leur co-culture avec les cellules indicatrices (CEM ou M8166) permet la formation de syncytia typiques. Les cellules HEK293T sont adhérentes, cultivées en monocouche à la surface des flasques dans du milieu MEM supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal (SVF), 1% de pénicilline 5,000 Unit/ml streptomycine 5,000 pg/ml et 1% de gentamycine 10 mg/ml. Les cellules sont maintenues à 37°C sous atmosphère humide à 5% de 002. Le milieu de culture est changé tous les trois jours. Pour effectuer des sous-cultures, le milieu nutritif est éliminé, les cellules sont lavées avec d PBS/EDTA et incubées 1 minute à 37°c en présence de trypsine 0,5%-EDTA 0.01%. Après décollement des cellules, un volume de milieu MEM est immédiatement ajouté aux cellules puis les cellules sont homogénéisées et transférées dans de nouvelles flasques. Les cellules CEMx174 et M8166 sont des lignées de lymphocytes T CD4+ humaines qui sont permissives à l'infection par les lentivirus humains et simiens et forment des effets cytopathogènes (ECP) typiques. Elles sont non adhérentes et sont cultivées dans du milieu RPMI supplémenté par 10% de SVF, 1% de pénicilline-streptomycine et 1% de gentamycine. Les cellules sont maintenues à 37°C sous atmosphère humide à 5% de 002. Le milieu est changé tous les trois jours en effectuant une étape de centrifugation à 1500g pendant 5 minutes. Le culot est ensuite resuspendu par aspirations et refoulements successifs dans un volume approprié de milieu de culture. 1.3.2. Évaluation fonctionnelle avec test biologique in vitro Transfection des HEK293T avec les plasmides pCA-LTR-SHIVKU2-IN- ou pSHIVKU2 La méthode de transfection utilisée est la méthode avec ExGen500. Le ExGen500 (Euromedex, France) est composé d'un polymère cationique à base de polyéthylènimine linéaire. Ce polymère possède une très grande densité de charge cationique permettant de former des complexes avec l'ADN par liaisons ioniques. Ces complexes ExGen500/ADN sont alors capables d'interagir avec les membranes plasmiques des cellules généralement anioniques (interaction via les protéoglycanes sulfatés). Il s'ensuit une endocytose des complexes par les cellules et leur transport vers des endosomes/lysosomes. Par sa capacité de protonation à pH acide, le ExGen500 permet de tamponner le milieu des vésicules acides empêchant ainsi la dégradation de l'ADN transfecté. Cette propriété provoque aussi un choc osmotique, qui permet à l'ADN d'être libéré dans le cytoplasme de la cellule. Le ExGen500 favorise ensuite le transport de l'ADN vers le noyau et évite sa dégradation par les nucléases cytoplasmiques. Cinq pg de l'ADN du plasmide sont ajoutés à 350 pl de solution de NaCI 150 mM et à 15 pl de ExGen 500. Le mélange est incubé 40 minutes à température ambiante. Puis le mélange est ajouté dans les flasques contenant les HEK-293T recouvertes de milieu fraichement renouvelé.
Infection des CEMx174 et amplification du stock viral Les HEK-293T transfectées par l'ADN du pCA-LTR-SHIVKU2-IN- ou du pSHIVKu2 sont mises en co-culture avec les CEMx174, et à partir de 48 heures les CEMx174 développent des signes d'infection se traduisant par la formation d'ECP qui résultent de la fusion des CEMx174 pour former des syncitia. Les CEMx174 infectées sont transférées dans une nouvelle flasque en présence de CEMx174 fraiches pour amplifier le virus qui est récolté dans le surnageant. Production virale La récolte du stock viral s'effectue à partir de 48 heures à l'aide d'une seringue, puis les débris cellulaires sont éliminés par passage à travers un filtre de diamètre 0,22pm avant d'être mis dans des tubes qui sont stockés à -80°C. Inoculation des cellules par le virus Une fraction aliquote (10-100 pl) du surnageant de virus est utilisée pour inoculer les cellules cibles afin d'évaluer son infectiosité par le développement cytopathique ou par détection d'expression de gènes marqueurs. Titration du virus sur des cellules non adhérentes Le surnageant contenant du virus est dilué de dix en dix (dilutions successives) dans du milieu pour obtenir des dilutions de 10-1 à 10-6 qui sont utilisées pour inoculer en quadriplate des puits contenant 1.105 cellules par puits dans 0,5 à 1 ml de milieu RPMI dans une plaque de 24 puits. Les cellules ainsi inoculées sont incubées à 37°C et 5% de CO2 et entretenues par changement de milieu tous les 3 jours. Elles sont observées régulièrement pour le développement d'ECP. 1.4. Microscopie électronique de cellules HEK293T transfectées avec le pCA-LTRSHIVKU2-IN- Dans l'objectif d'examiner si les protéines produites par le génome vaccinal pCA- LTR-SHIVKU2-IN- s'assemblaient en particules virales, les inventeurs ont réalisé des études morphologiques par microscopie électronique (ME). Les échantillons de cellules HEK293T transfectées avec le pCA-LTR-SHIVKU2-IN-, pSHIVKu2 ou 3.4SHIVKu2 sont fixés dans une solution de glutaraldéhyde 2.5% diluée dans un tampon cacodylate (0,1M de cacodylate de sodium). Ils sont ensuite post-fixés, à 4°C, dans du tampon cacodylate contenant 1% de tetraoxyde d'Osmium (0s04), pendant 60 minutes. Les échantillons sont ensuite incubés pendant la nuit à 4°C à l'obscurité dans de l'acétate d'uranyle à pH 4. Les échantillons sont ensuite plongés dans des bains successifs de 10 minutes d'éthanol dilué respectivement à 30%, 60%, 90% et 100%. Ensuite les échantillons sont immergés pendant deux heures dans un mélange 50/50 d'éthanol pur et de résine Epoxy (8 ml de DDSA, 7 ml de MNA, de 13 ml d'Epoxy). Les échantillons sont ensuite placés deux heures dans de la résine Epoxy pure avant d'être inclus dans des capsules Beem et mis à polymériser pendant 48 heures à 60°C. Des coupes ultrafines de ces régions sont effectuées à l'aide d'un couteau en diamant à l'aide d'un ultra microtome. Ces coupes de 70 nm d'épaisseur sont déposées sur des grilles en cuivre pour être observées sous une tension de 80kV à l'aide d'un ME à transmission Jeol 1200 EX. 1.5. Immunisation des souris avec l'ADN vaccinal pCA-LTR-SHIVKU2-IN-. 1.5.1. Humanisation et vaccination des souris NOD/SCID Les souris âgées de 6 semaines sont irradiées avec une dose de 120 Centigray de rayonnement gamma pendant 50 secondes. Humanisation des souris avec des PBMC du sang humain Le sang total prelevé sur citrate de sodium est centrifugé (2000g, 10 min, 20°C) pour récupérer la couche de cellules blanches entre le plasma et les cellules rouges. Les cellules sont diluées 3 fois dans du PBS/EDTA, déposées délicatement au-dessus d'un coussin de Ficoll (milieu de séparation des lymphocytes) puis centrifugé 45 minutes à 2000g à 20°C. Les PBMC sont récupérées, lavées plusieurs fois dans du PBS/EDTA et resuspendues dans du PBSx1 puis 50.106 PBMC dans 0,1 ml sont injectés pour chaque souris par voie intra-péritonéale.
Immunisation des souris Après 48-72h post-humanisation, les souris SCID-hu sont injectées par voie intramusculaire (IM) avec 50 pg d'ADN du pCA-LTR-SHIVKU2-IN-, pSHIVKu2 ou pO4SHIVKU2- Les souris BALB/c âgées de 6-8 semaines sont directement immunisées par injection IM avec 100 pg de chacun des ADNs. 1.5.2. Méthode d'évaluation de la réponse humorale Test ELISA en Sandwich Abnova: Ce test est basé sur la détection des anticorps dirigés contre les antigènes viraux qui sont fixés au fond des puits de la plaque 96 puits. Les sérums à tester (récupérés à différents temps post-immunisation), les contrôles positifs et négatifs sont déposés dans les puits. Les Ac anti-HIV éventuellement présents se fixent sur les antigènes viraux. Après plusieurs lavages des puits pour éliminer l'excès et les fixations non spécifiques, est rajouté un Ac secondaire de détection qui porte une molécule de biotine qui interagit avec la streptavidine couplée à l'enzyme HPRO. Les complexes antigène/Ac formés seront alors détectés par addition du substrat de l'enzyme, le TMB, qui donnera naissance à une réaction colorée. La coloration est traduite en densité optique par lecture avec un photomètre lecteur d'ELISA. Les réactifs et produits sont amenés à température ambiante. Les contrôles négatifs et positifs (100p1) fournis dans le kit, les blancs (100p1) et les échantillons de sérum 10 et 50 pl sont déposés dans les puits dans un volume final de 100p1. La plaque est incubée pendant 30 minutes à 37°C, puis rincée avec la solution de lavage. La solution d'Ac secondaire diluée au centième est ajoutée (100 pl) dans tous les puits sauf dans les blancs. La plaque est ensuite recouverte avec du papier parafilm et incubée 20 minutes à 37°C. Une solution A et B de TMB est ajouté après une étape de lavage et la plaque est incubée 15 min à température du laboratoire. Pour stopper l'étape de coloration, 100p1 de H2SO4 à 2N sont ajoutés par puits. La lecture de la plaque est faite à 450 nm. Sont considérés comme positifs, les échantillons ayant une valeur d'absorbance égale ou supérieure à la valeur seuil, la valeur seuil étant déterminée selon la formule suivante : Cutoff Value= NCx + 0,100 avec NCx = la moyenne des valeurs d'absorbance des deux contrôles négatifs. Test de séro-neutralisation Cette technique se base sur la capacité des Ac séroneutralisants (séro-N) à inhiber l'infection de cellules sensibles au virus. Pour la détection et l'évaluation des Ac séro-N sériques, une quantité constante de virus infectieux est mise en contact avec des dilutions en série du sérum à tester, puis le mélange est inoculé à une culture cellulaire permissive sur microplaques et incubé 3 à 5 jours. Le virus est le plus souvent une souche cytopathogène, et par conséquent l'absence ou la réduction en nombre d'ECP traduit la présence d'Ac dans le sérum testé. Le stock viral SHIVKU2 est dilué au millième dans du RPMI (le volume de surnageant du virus est déterminé pour 100 TCID50, qui correspond à la dilution de virus pour laquelle 50% des puits présentent des syncitia) et les sérums récupérés des souris NOD/SCID témoins, humanisées et vaccinées avec pCA-LTR-SHIVKU2-IN- ou pSH1VKu2 sont dilués dans le même milieu (aux dilutions 10, 20, 40, 80, 160 et 320). Le virus dilué et les dilutions de sérum sont mélangés dans une plaque 96 puits (100µI/puits) et le mélange est mis à incuber 1h à 4°C. Le mélange est ensuite déposé sur des cellules M8166 (1.105 cellules/puits) préalablement mise en culture dans une plaque de 24 puits. Dans cette expérience, le contrôle positif est représenté par le virus provenant du pSHIVKu2 sans sérum et le contrôle négatif correspond aux cellules seules.
Méthode d'évaluation de la réponse cellulaire : Test Elispot Ce test a pour but de mettre en évidence et d'évaluer la proportion de lymphocytes T (LT) qui sécrète l'IFN-y en réponse spécifique à une stimulation antigénique. Les souris sont préalablement profondément anesthésiées puis le sang total et la rate sont prélevés. Les rates des souris sont mises dans du milieu RPMI dans la glace. Le sang dans des tubes sec est utilisé pour isoler le sérum. Les splénocytes sont isolés suite à un broyage de la rate dans une boite de pétri entre une paire de lames en présence de PBS et d'EDTA 1%. Les cellules sont lavées 2 fois dans du PBS/EDTA (centrifugation 2000g, 5 min à 20°c) afin de purifier et d'enrichir en splénocytes. Avant d'ensemencer les puits avec les cellules, la plaque est lavée avec du PBS puis incubée 30 min avec PBS+SVF 10% à température du laboratoire. Les cellules (5.105 splénocytes) sont ensemencées dans chaque puits, et sont inoculées avec des pools de peptides des protéines Gag, Env, Tat, Rev et Nef à une concentration finale de 2 pg/ml. Des contrôles positifs (CD3-2 inclus dans le kit) et négatifs, sont ajoutés à l'essai. La plaque est recouverte d'une pochette d'aluminium et est mise à incuber à 37°C pendant 19 heures. Les cellules et peptides sont lavés, puis l'Ac monoclonal anti-IFN-y biotinylé (7-b6-biotin) est ajouté, et la plaque est recouverte et incubée pendant 2h à température ambiante. La streptavidine diluée dans du PBS contenant 0,5% de SVF est ajoutée (1000/puits) et la plaque est incubée 1 h à température ambiante. Le TMB, substrat révélateur, est ajouté par la suite après une autre étape de lavage, puis la plaque est lavée et séchée après émergence de spots bleus. La lecture de la plaque est faite à la loupe binoculaire au grossissement *40. Les critères de positivité d'un puits sont déterminés pour chaque condition en calculant la moyenne du nombre de spots des duplicats, ainsi que les écarts-types. Le nombre de spots est calculé pour 1 million de PBMC et est normalisé à 20% pour les données obtenues chez les souris NOD/SCID. Le test est considéré comme étant positif si la valeur de la moyenne des spots est supérieure à 10 spots par million de PBMC qui correspond à la moyenne de spots obtenus avec les contrôles de culture. 1.6. Examens phénotypiques et fonctionnels des cellules T spécifiques de l'antigène par cytométrie en flux 1.6.1. Isolement des cellules mononuclées périphériques Les cellules mononuclées du sang périphérique humain sont préparées comme indiqué ci-dessus. Les splénocytes des rates de souris isolés selon le protocole décrit ci-dessus sont aussi resuspendus dans le milieu AIM V sans sérum pour la culture et tests de cytométrie. 1.6.2. Stimulation antigénique et mise en culture des cellules Pour examiner si les cellules spécifiques de l'antigène sont capables de proliférer et de produire des cytokines et des molécules lytiques, les splénocytes et les PBMCs sont marqués au CFSE (1 pg/ml) pendant 10 min à 37°C, puis les cellules sont lavées avec du PBS 1X pour éliminer l'excès. Les cellules marquées sont ensemencées dans des puits profonds de plaques de 96 puits à raison de 2.106/puits dans 1 ml de milieu AIM V, puis stimulées avec les différents pools de peptides (Gag, Env et Tat+Rev+Nef) à raison de 2 pg/ml en présence des Ac de co-stimulation anti-CD49 et CD28. Des cellules sans peptides sont utilisées comme contrôle négatif et des cellules additionnées de phytohémaglutinine (PHA) 2µg/ml sont utilisées comme contrôle positif. Les cellules sont cultivées pendant 5 jours (37°C sous humidité) puis restimulées avec les mêmes pools de peptides pendant 6 heures avant de les marquer. Les cellules sont récoltées par centrifugation (2000g, 5 min, 4°C), resuspendues dans 100 pl de PBS et d'abord marquées avec les Ac de surface (CD3, CD4 et CD8) [Pacific Blue anti-human CD3 (5 pl), PE anti-human CD4 (10 pl) et APC/Cy7 anti-human CD8 (10 pl)] pendant 30 min à température ambiante. Les cellules sont ensuite centrifugées et lavées au PBS 1X puis fixées et perméabilisées dans 100 pl de Cytofix Cytoperm de BD. Les cellules sont ensuite incubées pendant 20 minutes à 4°C avec les Ac « anti-human IFN-y PE-Cy7 » et « Alexa Fluor 647 anti-human Granzyme A » (5 pl) pour les marquages cytoplasmiques. Les cellules sont enfin lavées avec du PBS et fixées avec de la PFA 4% avant l'acquisition et l'analyse au cytomètre de flux. 1.6.3. Instrumentation Un cytomètre en flux LSRII de chez BD relié au logiciel BD FACSDiva6 a été utilisé. Cet instrument permet de mesurer jusqu'à 13 paramètres de fluorescence et deux paramètres physiques que sont la taille FSC (Forward Scatter) et la complexité ou granulosité SSC (Side Scatter). L'instrument est équipé de trois lasers. Le laser bleu émettant à 488nm peut exciter indépendamment plusieurs fluorochromes (FITC, PE, PE- Cy7). Le laser rouge qui émet à 633nm peut exciter les fluorochromes APC et APC-Cy7. Et enfin le laser violet qui émet à 405nm peut exciter le fluorochrome Pacific Blue. 2. Résultats 2.1. Vérification qualitative et quantitative de la construction du plasmide pCA-LTRSHIVKU2-IN- 2.1.1. Présence du -lasmide -CA-LTR-SHIVKu2-IN- Lorsque l'ADN plasmidique a été isolé à partir d'une culture bactérienne polyclonale obtenue d'une pré-culture en milieu LB utilisée pour ensemencer un gros volume de milieu liquide de LB, une proportion importante d'épisome est observée autour de 2000pb. Le profil éléctrophorétique met également en évidence la présence d'une seule bande d'ADN autour de 14 000 pb (qui en théorie fait 13 739 pb) correspondant au plasmide. Lorsque l'ADN est isolé à partir d'une culture bactérienne réalisée d'abord sur boîte de pétri pour obtenir des colonies isolées, ces colonies ayant été utilisées pour la préculture et la culture en masse servant à l'isolement et purification de l'ADN plasmidien, le profil éléctrophorétique obtenu après séparation de 0.5 pg d'ADN montre l'absence d'épisome et met en évidence trois bandes d'ADN de haut poids moléculaire, correspondant aux formes circulaires, enroulées et superenroulées du plasmide pCALTR-SHIVKU2-IN-. La pureté et l'évaluation quantitative des ADN plasmidiques de nos deux préparations ont été vérifiées par spectrophotomètrie. Les valeurs des mesures de l'absorbance aux longueurs d'ondes 230, 260 et 280 ont été utilisées pour déterminer les rapports 260/280 qui étaient de 1,75 et 1,82 et à 260/230 de 2,04 et 1,92 respectivement, témoignent d'une qualité satisfaisante de notre ADN. Les concentrations d'ADN sont respectivement de 545 pg/m1 et 765 pg/ml. 2.1.2. Di estion enz mati ue du -CA-LTR-SHIVKu2-IN- Le profil de la digestion du plasmide avec EcoR1 révèle la présence de deux bandes d'environ 5000 et 7500 pb provenant des coupures au niveau des deux sites EcoRI, trois bandes avec Bam H1 de 2400 pb, 4900pb et 7400pb résultant des coupures au niveau des deux sites Bam H1, et une bande avec Sph1 située à 10 000pb résultant de la coupure au niveau du site unique Sph1. Une bande supplémentaire de 2400 pb est également observée avec la digestion BamH1 et elle résulterait de l'épisome. 2.2. Evaluation de la fonctionnalité : Effet de l'ADN plasmidien sur les cellules Les cellules HEK293T ont été transfectées avec un plasmide contrôle pCG-GFP exprimant la GFP, le plasmide pSHIVKu2, puis avec le plasmide pCA-LTR-SHIVKU2-IN-.
Les cellules transfectées avec le plasmide pCG-GFP ont permis d'estimer l'efficacité de transfection par évaluation du nombre de cellules GFP+.
Pour vérifier que les cellules HEK293T transfectées avec pCA-LTR-SHIVKU2-INou pSHIVKu2 produisent des virions qui induisent des syncitia typiques, ces cellules ont été mises en co-culture avec des CEMx174, puis l'apparition des ECP a été suivie par observation sous le microscope. L'une et l'autre co-culture ont produit des ECP caractéristiques. Pour vérifier que le virus SHIVKU2 produit par les cellules transfectées se réplique plusieurs fois, le surnageant des cellules transfectées a été utilisé pour infecter la lignée lymphocytaire T CD4+ humaine M8166. Les résultats obtenus avec le SHIVKU2, montrent clairement qu'il infecte et induit des ECP surtout avec la lignée cellulaire hautement permissive M8166. Ces ECP apparaissent dès 48 heures mais aussi à des stades tardifs. Puis pour vérifier que l'ADN du vecteur vaccinal pCA-LTR-SHIVKU2-IN- ne permet qu'un seul cycle de réplication (comme il est délété du gène in), le surnageant récupéré contenant le virus CA-LTR-SHIVKU2-IN- a été inoculé une première fois, puis une seconde fois à des M8166 en culture. La première inoculation a produit des ECP à partir de 48 heures et au bout de 76 heures ils étaient plus nombreux. Le surnageant de ces cellules infectées a été récupéré et inoculé une nouvelle fois à des M8166. Contrairement à l'inoculation précédente, aucun ECP n'est visible ni à 48 ni à 76 heures post-inoculation. Ces résultats permettent de conclure que le pCA-LTR-SHIVKU2-IN- permet de transduire une seule fois les cellules cibles en culture.
La présence des ECP typiques, suggère que l'ADN plasmidique s'est répliqué dans les cellules HEK293T et a produit des virions CA-LTR-SHIVKU2-IN-. Les ECP de la première infection témoignent de l'infectivité de la lignée de LT CD4+ humaine M8166 par les particules produites, et leur absence lors de la deuxième infection témoigne du déficit de réplication productive dans ces cellules. 2.3. Analyse en microscopie électronique de la morphogenèse des particules virales dans les cellules HEK293T transfectées avec le pCA-LTR-SHIVKU2-IN- Il a ensuite été déterminé si les protéines produites par le génome vaccinal pCA- LTR-SHIVKU2-IN- s'assemblaient correctement en particules virales dans les cellules HEK293T. La morphologie des cellules HEK293T transfectées avec le plasmide pCA- LTR-SHIVKU2-IN- a été examinée par ME. Les résultats ont montré que les particules virales sont présentes à la surface des cellules sous forme de bourgeons et de particules virales matures qui se sont détachées des cellules. Ainsi, les protéines virales du vaccin pCA-LTR-SHIVKU2-IN- s'assemblent pour donner des particules virales qui bourgeonnent à l'extérieur des cellules. 2.4. Test in vivo du vaccin sur les souris SCID humanisées et sur les souris BALB/c 2.4.1. Evaluation de la réponse humorale chez les souris SCID-hu vaccinées avec le pCA-LTR-SHIVKu2-IN- Les échantillons de sérum des souris immunisées, prélevés à environ 1 mois post- immunisation sont examinés pour la présence d'Ac qui se lient spécifiquement aux antigènes du virus à l'aide d'un test ELISA commercial. Les résultats de cette analyse sont synthétisés dans le tableau 1 (ci-dessous). Ces résultats montrent qu'environ la moitié des échantillons provenant des souris immunisées avec l'ADN vaccinal pCA-LTRSHIVKU2-IN-, comme ceux immunisées avec l'ADN du SHIVKU2, possèdent des proportions moins élevées de positifs (44% et 37% respectivement) contrairement à ceux provenant des souris immunisées avec le p3,4SHIVKu2 (50%). Ces résultats démontrent la capacité de l'ADN vaccinal pCA-LTR-SHIVKU2-IN- à induire des réponses humorales chez les souris NOD/SCID-hu. Un échantillon sur trois de sérum des souris immunisées avec le p3,4SHIVKu2, a sa valeur de DO supérieure à celles obtenues avec les échantillons de sérums de souris immunisées avec le pCA-LTR-SHIVKU2-IN- et le pSHIVKu2. Ce plasmide est non réplicatif, les protéines du virus restent associées à la membrane des cellules transfectées et donc devrait induire moins d'Ac. Échantillons A4SHIV CA-LTR SHIVKU2- IN- SHIV témoins Contrôle positifs Contrôle négatifs Blancs Nombre d'échantillon 6 16 19 2 2 2 2 Nombre de 3 7 7 2 2 2 2 positivité Intervalle de 0,3 - 1,823 0,26 - 0,9 0,34 - 1,64 0,01 - 0,19 1,9 - 2,2 0,15 - 0,16 0,01- 0,03 positivité d'absorbance Tableau 1 : Détection d'Ac dans les échantillons de sérums de souris SCID témoins, SCID-hu et SCID-hu immunisées avec pA4SHIVKu2, pCA-LTR-SHIVKU2-IN- et pSHIVKu2 et des contrôles. 2.4.2. Analyse de l'activité neutralisante par séro-neutralisation Les sérums de souris SCID-hu vaccinées avec les plasmides pCA-LTR-SHIVKu2- IN- ou SHIVKU2 sélectionnés sont ceux dont la DO a été trouvée positive par ELISA. A cause de la faible quantité de sérum, certains échantillons à forte valeur de DO pour le test ELISA, n'ont pu être examinés par séro-neutralisation. Un échantillon de sérum de souris SCID-hu et vaccinées avec le pCA-LTR-SHIVKU2-IN- trouvé négatif a également été utilisé pour le test ELISA pour s'assurer de la fiabilité du test. Echantillons CA-LTR-SHIVKU2-IN- (3 échantillons) SHIV (1 échantillon) Dilutions Neutralisation intervalle d'ECP neutralisation Intervalle ECP 10 20 40 80 160 320 +++/+++ 5 - 9 +++ ++ ++ ++ + 4 12 20 15 26 44 ++/++ 14 - 19 +/- 25 - 44 +/- 27 - 49 +/- 31 - 57 +/- 28 - 69 Tableau 2 : Analyse de l'activité neutralisante des sérums des souris immunisées. Des dilutions (1/10, 1/20,...1/320) ont été mélangées avec du virus SHIVKU2 (100 TCID50), incubées puis utilisées pour inoculer des cellules M8166. Au bout de 5 jours post-inoculation les EPC induits sont énumérés et utilisés pour évaluer l'activité séroneutralisante. Légende: +++ correspondent à une forte neutralisation, ++ neutralisation assez élevée, + moins de neutralisation, - aucune action de neutralisation. Pour les CA- LTR-SHIVKU2, deux types d'échantillons sont représentés, un type d'échantillon ayant un profil moins neutralisant par rapport aux deux autres échantillons. Le nombre d'ECP obtenu est plus élevé dans les cellules M8166 infectées par le virus SHIVKU2 incubé sans sérum (76 ECP) ou avec le sérum de la souris non immunisée (42 ECP) (contrôles négatifs), ce qui nous a permis de fixer le seuil de négativité de neutralisation virale à 42 ECP (données non représentées dans le tableau). Par contre, le nombre d'ECP devient quasiment nul lorsque le virus est incubé avec du sérum dilué au 1/10 des souris immunisées avec l'ADN du CA-LTR-SHIVKU2-IN- ou SHIVKU2. Ce nombre augmente au fur et à mesure qu'on augmente la dilution des sérums indiquant un effet dose. Par exemple avec le sérum d'une souris immunisée avec pCA-LTR-SHIVKU2-IN- à la dilution 1/10 on obtient 5 ECP, alors qu'à la dilution 1/320 on obtient une valeur de 69 ECP, valeur similaire à celle du contrôle sans sérum. 2.4.3. Évaluation de l'immuno énicité du -CA-LTR-SHIVKU2-IN- chez les souris BALB/c vaccinées Pour étudier l'immunogénicité du vaccin pCA-LTR-SHIVKU2-IN- chez les souris BALB/c, les animaux ont été injectés avec une dose unique de 100 pg d'ADN par voie intramusculaire. La proportion de cellules de la rate (splénocytes) spécifiques des antigènes a été examinée par ELISPOT. Les résultats de cetteviraux et secrétant l'IFN-y étude démontrent bien la capacité des ADN utilisés à induire des réponses immunes spécifiques dirigés contre tous les antigènes étudiés (Figure 12). Les réponses T cellulaires avec le plasmide p04SHIVKu2 sont deux fois plus élevées qu'avec le plasmide pCA-LTR-SHIVKu2-IN-. Cette petite différence d'efficacité entre les deux ADNs pourrait être liée à une meilleure qualité de l'ADN du pA4SHIVKu2 que du pCA-LTRSHIVKU2-IN-.
Ces résultats permettent néanmoins de connaître le niveau de base des réponses immunes induites par ces vaccins chez les souris normales et permettent de faire la comparaison avec les réponses immunes obtenues chez la souris SCID-hu. 2.4.4. Evaluation de la réponse cellulaire chez les souris NOD/SCID-hu immunisées avec les différents ADNs. Les souris NOD/SCID-hu ont été immunisées par injection intramusculaire avec une seule dose de 50 pg d'ADN du CA-LTR-SHIVKU2-IN-, 3,4SHIVKu2 ou SHIVKU2, puis les splénocytes ont été utilisés pour examiner la réponse immune par ELISPOT pour évaluer la proportion de cellules spécifiques de l'antigène et produisant l'IFN-y. Comme le montre la figure 13, il y a un nombre important de cellules T produisant de l'INF-y humain en réponse à une stimulation par les antigènes Gag, Env ou Tat+Rev+Nef sous forme de peptides du VIS ou du VIH. Il est intéressant de noter que les réponses obtenues après immunisation avec le pCA-LTR-SHIVKU2-IN- sont quasi-similaires à celles obtenues avec pSHIVKu2 et qui sont toutes les deux très nettement supérieures à celles obtenues après immunisation avec le pO4SHIVKu2. La prédominance des réponses induites par le pCA- LTR-SHIVKU2 est contre les antigènes Gag et Tat+Rev+Nef. L'ensemble de ces résultats démontre que l'ADN du pCA-LTR-SHIVKU2 est très immunogénique chez les souris NOD/SCID-hu et qu'il induit préférentiellement des réponses contre les antigènes connus pour être associés à la protection contre les virus pathogéniques. 2.5. Examens phénotypiques et fonctionnels des cellules T spécifiques de l'antigène par cytométrie en flux 2.5.1. Monomarquage effectué à jour zéro (réalisé le jour de récupération des rates de souris) Ces mono-marquages servent d'une part, à examiner que les anticorps choisis détectent bien les cibles, et d'autre part à évaluer la présence et la proportion des cellules humaines dans les rates des souris SCID-hu. Les lymphocytes non marqués des souris humanisées et non humanisées ont été analysés en cytométrie en flux pour mesurer la fluorescence à l'état basale des cellules (contrôle négatif). La détection des LT CD3+ est effectuée avec Ac anti-CD3 humain couplé au fluorochrome "Pacific Blue". Ces cellules forment un pic à 102 dans le profil des cellules isolées chez les souris SCID-hu vaccinées avec le plasmide pCA-LTR-SHIVKU2-IN-. Ce pic n'est pas présent dans les cellules récupérées chez les souris SCID non hu. Pour les cellules mono-marquées avec l'Ac anti-CD4+ (PE anti-human CD4), que ce soit pour le témoin ou pour notre échantillon testé, aucun pic significatif n'a été observé. Ceci serait dû à l'Ac anti-CD4 utilisé qui serait non fonctionnel. Pour la détection des LT CD8+, un Ac monoclonal anti-CD8 humain couplé au fluorochrome APC/Cy7 a été utilisé. Il permet la mise en évidence d'un pic situé entre 102 et 103 dans le profil des cellules isolées chez les souris SCID-hu vaccinées avec pCALTR-SHIVKu2-IN- et non chez les souris SCID non hu. La proportion de lymphocytes produisant les molécules de GRA n'a pu être évaluée du fait qu'aucune différence de pic n'a été observée sur les cellules issues de souris immunisées et non immunisées marquées avec l'Ac anti-GRA A couplé à l'Alexa Fluor 647. Par contre, les cellules marquées avec l'Ac anti-IFN-y humain couplé au fluorochrome PE-Cy7 ont montré un net pic situé à 102 avec les cellules de souris SCIDhu vaccinées avec pCA-LTR-SHIVKu2-IN- qui est absent avec les cellules des souris SCID non-hu non immunisées. 2.5.2. Phénotypage et fonctions des cellules T chez les animaux immunisées. Pour examiner le phénotype et les fonctions des cellules T spécifiques des antigènes du virus, les cellules marquées au CFSE sont incubées pendant 5 jours avec les peptides (Gag, Env et Tat+Rev+Nef), puis re-stimulées pendant 6 heures avec les mêmes peptides. Les cellules sont ensuites marquées avec les Ac et examinées comme ci-dessus indiqué. Les résultats de cette analyse montrent la présence de cellules CD3+ et CD8+ qui produisent de l'IFN-y et qui possèdent des molécules de GRA surtout avec les cellules provenant de souris NOD/SCID-hu vaccinées. En effet, au moins 6% des LT CD8+ produisent IFN-y et 1,7% produisent le GRA A chez les souris NOD/SCID-hu immunisées, contre seulement 2,5% et 0,6% respectivement chez les souris contrôles. Ces résultats démontrent la présence de cellules CD3+ CD8+ activées, productrices de GRA et d'IFN-y qui correspond à une réponse immune cellulaire effectrice induite par notre vaccin pCALTR-SHIVKU2-IN-.

Claims (12)

  1. REVENDICATIONS1. Acide nucléique comprenant un génome rétroviral REVENDICATIONS1. Acide nucléique comprenant un génome rétroviral chimérique, dans lequel ledit génome rétroviral chimérique comprend : - les séquences terminales répétées (STR) en 5' et en 3' d'un premier rétrovirus, ledit premier rétrovirus étant le virus de l'Arthrite-Encéphalite Caprine (VAEC), le virus Maedi Visna (VMV), ou le virus de l'anémie infectieuse des équidés (VAIE), et - au moins un gène viral d'un deuxième rétrovirus, ledit deuxième rétrovirus (i) n'étant pas le premier rétrovirus et (ii) étant un lentivirus sélectionné parmi le virus de I'immunodéficience humaine de type I (VIH-1), le VIH-2, le virus de l'immunodéficience simienne (VIS), le virus de l'immunodéficience féline (VIF) ou le virus de l'anémie infectieuse équine (VAIE).
  2. 2. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce que le génome rétroviral chimérique comprend en outre au moins un gène viral d'un troisième rétrovirus, ledit troisième rétrovirus (i) n'étant pas le premier rétrovirus et (ii) étant un lentivirus sélectionné parmi le virus de I'immunodéficience humaine de type I (VIH-1), le VIH-2, le virus de l'immunodéficience simienne (VIS), le virus de l'immunodéficience féline (VIF) ou le virus de l'anémie infectieuse équine (VAIE).
  3. 3. Acide nucléique selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit au moins un gène dudit deuxième rétrovirus ou troisième rétrovirus est choisi parmi les gènes gag, pol, vif, vpx, vpr, nef, tat, rev, vpu et env.
  4. 4. Acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit génome chimérique lentiviral comprend les gènes gag, pol, vif, vpx, vpr du VIS et les gènes nef, tat, rev, vpu et env du VIH-1.
  5. 5. Acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit génome chimérique lentiviral comprend les gènes gag, pol, vif, vpx, vpr, nef, tat, rev, vpu et env du VIH-1 ou les gènes gag, pol, vif, vpx, vpr, nef, tat, rev, vpu et env du VIH-2.
  6. 6. Acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit gène pol, lorsqu'il est présent, est un gène pol délété des séquences codant l'intégrase (in).
  7. 7. Acide nucléique selon la revendication 6, caractérisé en ce que ledit génome rétroviral chimérique non-intégratif comprend la séquence SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO :2 ou SEQ ID NO : 6.
  8. 8. Vecteur recombinant comprenant un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 7.
  9. 9. Composition immunogène ou vaccinale comprenant un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, ou un vecteur selon la revendication 8.
  10. 10. Acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, vecteur selon la revendication 8, ou composition vaccinale selon la revendication 9, pour son utilisation pour la prévention ou le traitement d'une infection par un rétrovirus.
  11. 11. Acide nucléique, vecteur, ou composition vaccinale pour leur utilisation selon la revendication 10, dans laquelle le rétrovirus est un oncovirus, un lentivirus ou un spumavirus.
  12. 12. Acide nucléique, vecteur, ou composition vaccinale pour leur utilisation selon la revendication 10 ou 11, dans laquelle le rétrovirus est le VIH-1, le VIH-2 ou le VIF.
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