CN116254298A - 一种慢病毒包装滴度试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及病毒包装领域,具体涉及一种慢病毒包装滴度试剂盒。本发明对现有病毒包装载体进行了改造,构建了高病毒包装滴度试剂盒。本发明针对常规病毒辅助质粒,在保留慢病毒包装所必须的必要元件的基础上对复制起始位点、启动子、终止子、增强子等组合原件进行了优化,构建了高效病毒包装载体和高滴度病毒包装试剂盒。本发明构建的试剂盒,载体转染效率高,病毒包装滴度高,具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及病毒包装领域,具体涉及一种慢病毒包装滴度试剂盒。
背景技术
随着当今医学技术的不断革新,分子生物学、生物化学等学科的发展和基因序列的不断深入研究,基因治疗技术在上世纪末应运而生;该技术通过纠正或补偿基因缺陷和异常表达来达到治疗疾病的目的,已成为治疗先天遗传性、免疫性、某些感染性、血液性疾病以及肿瘤的新焦点。其中,慢病毒载体(Lentivirus vector,LV)因其转染效率高,可感染分裂期和非分裂期细胞,可容纳较大的基因片段等优点,在基因治疗领域有着广泛的应用前景。
慢病毒属(lentivirus)在分类上属于逆转录病毒科,为二倍体RNA病毒。其基因结构包括gag、pol、env、vif、vpr、nef、vpu和2个调节基因tat和rev等。其中,gag负责编码合成衣壳蛋白(p24)、内膜蛋白(p17)以及核衣壳蛋白(p7)等关键蛋白,pol负责编码病毒复制相关酶,env负责编码病毒包膜糖蛋白。rev参与调节蛋白的表达,tat与病毒的长末端重复序列(long terminal repeats,LTRS)结合后促进病毒的所有基因的转录。vif、vpr、vpu、nef为辅助基因,将辅助基因编码的蛋白当做毒力因子,可用来主导宿主细胞的感染以及识别。
而慢病毒载体则是以慢病毒的基因组为基础,将其中多个和病毒活性相关的序列结构去除,使其具有生物学的安全性,然后,再在这个基因组骨架中引入实验所需要的目标基因的序列和表达结构,并将之制备成载体。慢病毒载体由最初的HIV-1型载体系统经过不断优化发展至今已更新到第四代质粒系统,为四质粒系统,也是目前使用最广泛的慢病毒载体系统。
第一个质粒发挥组装功能,编码形成病毒颗粒所必需的蛋白,全部pol以及gag序列包括在此质粒内,且去掉了4个辅助基因。第二个质粒含具整合、逆转录以及组装功能的反式作用序列因子,此质粒为病毒载体最为关键的部分,包括RRE、LTR。第三个质粒负责编码翻译合成VSV的糖蛋白G。第四个质粒含曾经包含在组装质粒内的rev序列。在慢病毒的制备中,把四个质粒一同转染到细胞中,使其增殖,最终获得表达质粒。
然而慢病毒载体也存在一定的局限性—病毒滴度低,这使得基因治疗成本变得十分昂贵,与基因疾病患者对基因药物的需求存在巨大的矛盾。因此,构建更加高效的慢病毒载体以提高慢病毒滴度从而加速基于慢病毒载体的基因药物的发展显得尤为重要。
由于慢病毒载体主要来源为HIV病毒,其生物安全性成为使用者担心的主要问题之一,为阻止慢病毒载体整合进宿主基因组形成有复制能力的HIV病毒,其分子结构被不断改进,慢病毒载体中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代,属于假型病毒,同时为降低病毒基因重组几率,目前人们广泛使用四质粒系统来包装滴度,但这也直接导致了病毒包装效率低下的问题。因此亟需从各个方面对慢病毒包装载体进行优化,从而得到一种可用于提高慢病毒包装滴度的试剂盒,使得慢病毒基因广泛应用于研究和临床。
发明内容
有鉴于此,本发明要解决的技术问题在于提供一种慢病毒包装滴度试剂盒。
本发明提供了载体组合,其包括辅助质粒A,辅助质粒B。
本发明中,所述辅助质粒A由质粒A’改造而来,质粒A’的结构元件包括CMV启动子、HIV-1gag、RRE、HIV-1pol、AmpR、ori、HBB 3’UTR,其表达组成病毒中心和结构的蛋白质gag和转录酶。改造后的辅助质粒A的结构元件包括CAG启动子、HIV-1gag、RRE、HIV-1pol、kanR、pUC ori、rBG pA;其中,所述CAG启动子序列如SEQ ID NO:3所示;所述rBG pA核酸如SEQ IDNO:4所示。
本发明中,所述辅助质粒B由质粒B’改造而来,质粒B’的结构元件包括Rev、HIV-LTR、AmpR、f1 ori、ori、RSV启动子。改造后的辅助质粒B的结构元件包括Rev、hBG pA、kanR、pUC ori、RSV;其中,所述hBG pA核酸如SEQ ID NO:5所示。
本发明中,所述辅助质粒A的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;所述辅助质粒B的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
进一步的,本发明所述的载体组合还包括辅助质粒C和表达质粒。
本发明中,所述辅助质粒C含有VSV-G衣壳编码基因。本发明所述辅助质粒C选自pMD.G、pMD2.G、pVSV-G、VSV.G、pCAG-VSVG、pHDM-VSV-G、pCEF-VSV-G、pCI-VSVG、pRP[Exp]-CMV>VSVG、pCMV-VSV-G、pLP/VSVG或pVPack-VSV-G中的至少一种。本发明以载体pRP[Exp]-CMV>VSVG为辅助质粒,用于本发明所述的病毒包装试剂盒的构建。
本发明中,所述的表达质粒包括目的基因,本发明实施例中,所述以荧光蛋白EGFP编码基因为例对效果进行验证,实际使用中,可根据需求将EGFP替换为待研究的其它目的基因;本发明所述的表达质粒为慢病毒载体,具体的,可以选自第二代或第三代慢病毒表达载体,如pLV或pLVX系列载体、pLKO系列载体、pSMPUW或pLenti系列等HIV表达载体中的至少一种。本发明以pLV载体pLV[Exp]-CMV>EGFP为表达载体用于本发明所述的病毒包装试剂盒的构建。
本发明所述的载体组合中,所述辅助质粒A、辅助质粒B、慢病毒包装辅助质粒C、表达质粒的质量比为(1~9):(1~9):4:10。
本发明针对常规病毒辅助质粒进行了改造,改造在保留慢病毒包装所必须的必要元件的基础上对复制起始位点、启动子、终止子、增强子等组合原件进行了优化,构建了高效病毒包装载体组合。实验结果表明,本发明所述辅助质粒A、辅助质粒B、辅助质粒C、表达质粒的质量比为7:7:4:10时病毒包装滴度显著提高,显著高于未改造的载体组合,载体改造效果明显。
本发明中,所述的载体组合中的各个质粒协调互助用于高滴度病毒载体组合及试剂盒的构建。
本发明所述载体组合或载体,是指核酸载体,是一种重组DNA分子,其包含期望的编码序列和对可操作连接的编码基因在具体宿主生物内的表达所必不可少的合适的核酸序列或元件。对模式动物或哺乳动物细胞中的表达必需的核酸序列或元件包括启动子,核糖体结合位点及可能的其它序列。已知真核细胞利用启动子,增强子以及终止子。一经转化进入合适的宿主,载体可以独立于宿主基因组进行复制和发挥作用,或者,在一些情况下,自己整合进入基因组。在本说明书中,“质粒”和“载体”有时可以交换通用,因为质粒是当前最普遍使用的载体形式。然而,本发明意图包括表达载体的这样的其它形式,其发挥等价作用,其在本领域是已知的或将变为已知的,包括但不限于:质粒,噬菌体颗粒,病毒载体和/或仅为潜在的基因组插入物。
本发明提供了所述的载体组合在制备病毒包装试剂中的应用。
本发明中,所述的病毒包括腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、阮病毒,本发明对此不作限定。本发明中,所述的载体组合主要用于慢病毒的包装。
本发明中,所述的病毒包装试剂包括所述的载体组合中的单个或多个质粒与本领域常用的试剂混合后制成的病毒包装试剂,本发明对此不做限定。进一步的,所述的病毒包装试剂的剂型包括液剂、粉剂、乳剂、油剂等。
本发明提供了宿主,其包含本发明所述的载体组合。
本发明中,所述的宿主包括大肠杆菌,其可作为载体构建、扩繁或保存的工厂。
本发明提供了慢病毒包装试剂盒,其包括本发明所述的载体组合和转染试剂。
本发明中,所述的慢病毒包装试剂盒中的转染试剂包括磷酸钙、脂质体、脂质体纳米微粒、聚合物或多肽、病毒感染增强剂等。所述的脂质体包括阳离子脂质体,所述的阳离子脂质体包括DOTA、DOTMA、DOSPA、DOGS或DC-chol。所述的聚合物转染试剂包括聚-β-氨基脂、聚乳酸-乙醇酸共聚物或聚乙烯亚胺。
进一步的,本发明所述的转染试剂,还包括针对不同细胞系的转染试剂,其包括A204细胞系转染试剂、A549细胞系转染试剂、ASMC转染试剂、CAKI-1细胞系转染试剂、CFPEO细胞系转染试剂、CHO细胞系转染试剂、嗜铬细胞系转染试剂、D-407细胞系转染试剂、DI-TNC1细胞系转染试剂、FADU细胞系转染试剂、成纤维细胞系转染试剂、HCAEC细胞系转染试剂、HCN-1A细胞系转染试剂、HCS-2细胞系转染试剂、HEK-293细胞系转染试剂、HELA细胞系转染试剂、HT-29细胞系转染试剂、HUH-7细胞系转染试剂、角质形成细胞系转染试剂、LNCAP细胞系转染试剂、MEF细胞系转染试剂、MRC-5细胞系转染试剂、NIH3T3细胞系转染试剂、PANC1细胞系转染试剂、PC-3细胞系转染试剂、PGHAM细胞系转染试剂、U87细胞系转染试剂、VERO细胞系转染试剂、SK-N-MC细胞系转染试剂、SKNAS细胞系转染试剂、WERI-RB-1细胞系转染试剂、PC-12细胞系转染试剂、3LL细胞系转染试剂或ASPC-1细胞系转染试剂,本发明对此不做限定。
在一些具体实施例中,本发明利用磷酸钙将所述载体组合转化受体细胞,用于病毒包装效果的鉴定。进一步的,所述的受体细胞包括但不限于HEK-293、HEK293T、Hep G2、HELA、CHO-K1、COS-1、COS-7、NIH3T3、A204、A549、D-407、CHO、HCS-2、HT-29、U87或Sf9。
本发明提供了慢病毒的包装方法,其为利用本发明所述的载体组合或本发明所述的包装试剂盒生产慢病毒。
本发明对现有病毒包装载体进行了改造,构建了高病毒包装滴度试剂盒。本发明针对常规病毒辅助质粒,在保留慢病毒包装所必须的必要元件的基础上对复制起始位点、启动子、终止子、增强子等组合原件进行了优化,构建了高效病毒包装载体和高滴度病毒包装试剂盒。本发明构建的病毒包装试剂盒,载体转染效率高,病毒包装滴度高,具有广泛的应用前景。
附图说明
图1示辅助质粒A’载体图谱;
图2示辅助质粒pUC19-Kana-CAG-HIV-gag-pol-RRE-rBG pA图谱;
图3示辅助质粒B’载体图谱;
图4示辅助质粒pUC19-Kana-RSV-Rev-hBG pA图谱;
图5示第一次优化不同辅助载体组合下293T细胞包装慢病毒滴度;
图6示第二次优化不同辅助载体组合下293T细胞包装慢病毒滴度;
图7示不同辅助载体组合下293T细胞包装慢病毒48h的效果(放大倍数10×EGFP:30ms white light:10ms);
图8示LV转导293T细胞48h的效果(放大倍数10×EGFP:30ms white light:10ms);
图9示贴壁293T细胞包装48h的效果(放大倍数10×EGFP:30ms white light:10ms);
图10示5μL LV转导293T 48h的效果(放大倍数10×EGFP:30ms white light:10ms)。
具体实施方式
本发明提供了一种慢病毒包装滴度试剂盒,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
(如SEQ ID NO:1所示)。
载体B的核苷酸序列为:
CAG启动子核苷酸序列为:
rBG pA核苷酸序列为:
本发明采用的试材皆为普通市售品,皆可于市场购得。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1提高慢病毒包装滴度的试剂盒的构建
对常规慢病毒辅助载体进行改造并对其进行用量优化后,开发了一种提高慢病毒包装滴度的试剂盒,该试剂盒的原理是保留了慢病毒包装所必须的几个元件,即VSV-G、gag-pol、rev、RRE、LTR,对载体上的复制起始位点、启动子、终止子、增强子等元件进行组合优化,从而获得更加高效的慢病毒包装载体。该试剂盒包括:
慢病毒包装辅助质粒A,pUC19-Kana-CAG-HIV-gag-pol-RRE-rBG pA;
慢病毒包装辅助质粒B,pUC19-Kana-RSV-Rev-hBG pA;
慢病毒包装辅助质粒C,pRP[Exp]-CMV>VSVG;
包含荧光蛋白EGFP的慢病毒表达质粒(载体D),pLV[Exp]-CMV>EGFP;
转染试剂:CaCl2、HBS。
该高慢病毒包装滴度的试剂盒中的辅助载体pUC19-Kana-CAG-HIV-gag-pol-RRE-rBG pA和pUC19-Kana-CAG-HIV-gag-pol-RRE-rBG pA经过结构与用量优化后,与其余慢病毒包装载体组合能够包装出滴度更高的慢病毒,从而提高慢病毒包装效率,这对慢病毒在推动基因治疗的发展中具有重要意义。
1、质粒的改造
1.1、构建慢病毒包装辅助质粒A
辅助质粒A的出发载体A’质粒图谱见图1,利用常规生物实验技术手段改造后的辅助质粒A(pUC19-Kana-CAG-HIV-gag-pol-RRE-rBG pA)图谱见图2,载体序列如SEQ ID NO:1所示。
1.2、构建慢病毒包装辅助质粒B(pUC19-Kana-RSV-Rev-hBG pA)
辅助质粒B的出发载体B’质粒图谱见图3,利用常规生物实验技术手段改造后的辅助质粒B(pUC19-Kana-RSV-Rev-hBG pA)图谱见图4,载体序列如SEQ ID NO:2所示。
2、载体用量的优化
确定慢病毒包装载体组合并分别优化载体A和B的用量。各载体组合及其用量如表1所示。
表1慢病毒包装载体组合方式及用量
载体A | 载体B | 载体A′ | 载体B′ | 载体C | 载体D | |
组合1 | 1μg | / | / | 5.75μg | 4μg | 10μg |
组合2 | 3μg | / | / | 5.75μg | 4μg | 10μg |
组合3 | 5μg | / | / | 5.75μg | 4μg | 10μg |
组合4 | 7μg | / | / | 5.75μg | 4μg | 10μg |
组合5 | 9μg | / | / | 5.75μg | 4μg | 10μg |
组合6 | / | 1μg | 7.5μg | / | 4μg | 10μg |
组合7 | / | 3μg | 7.5μg | / | 4μg | 10μg |
组合8 | / | 5μg | 7.5μg | / | 4μg | 10μg |
组合9 | / | 7μg | 7.5μg | / | 4μg | 10μg |
组合10 | / | 9μg | 7.5μg | / | 4μg | 10μg |
组合11 | / | / | 7.5μg | 5.75μg | 4μg | 10μg |
各载体名称如下,载体A:pUC19-Kana-CAG-HIV-gag-pol-RRE-rBG pA ;载体B:pUC19-Kana-RSV-Rev-hBG pA;载体A′、载体B′和载体C为常规慢病毒包装辅助载体;载体D:pLV[Exp]-CMV>EGFP。组合11为常规慢病毒包装体系。
3、病毒包装与初步优化
3.1包装
HEK293T细胞在10cm平皿中生长密度达到70%~80%时,将完全培养基替换为包装培养基。将表1中各质粒按照不同的组合方式混合后,分别转移至1.5mL CaCl2溶液中混匀,边涡旋质粒CaCl2混合物,边向其中滴加1.5mL HBS,转染体系配制完成后静置20min,然后将转染混合物转移至细胞培养皿中,6h后将培养皿中的包装培养基更换培养基,完成病毒包装。
3.2收毒
48小时后拍照观察转染图片,图片见图7;随后收集慢病毒上清液,使用PEG进行浓缩,然后使用300μL HBSS重悬慢病毒沉淀。
3.3滴度检测
分别采用ELISA法和qPCR法检测病毒滴度;其中qPCR检测法取5μL病毒液转导293T细胞,48h后观察荧光表达情况,图片见第八部分图6,并检测滴度。
检测结果如图8所示,当控制载体B′、C、D的添加量不变,改变载体A(pUC19-Kana-CAG-HIV-gag-pol-RRE-rBG pA)的添加量(组合1~5)时,Elisa法测出来的LV滴度随着载体A添加量的增多而提高,其最高滴度为3.76E+10VP/mL,略低于对照组(组合11)5.15E+10VP/mL;而qPCR法所测滴度则是先随载体A添加量的增多而增高,当其添加量为7μg时,达最高滴度8.49E+8TU/mL,继续增加质粒用量至9μg时,滴度略有下降,为8.37E+8TU/mL,均略低于对照组1.16E+9TU/mL。
当控制载体A′、C、D的添加量不变,改变载体B的添加量时,Elisa法测出的LV滴度随着载体B(pUC19-Kana-RSV-Rev-hBG pA)添加量的增多而提高,其最高滴度为4.64E+10VP/mL,略低于对照组5.15E+10VP/mL,而qPCR法所测滴度则是先随载体B添加量的增多而增高,当其添加量为7μg时,达最高滴度1.76E+09TU/mL,继续增加质粒用量至10μg时,滴度略有下降,为1.61E+9TU/mL,这两组结果均高于对照组1.16E+9TU/mL。
4、再次优化
根据上述优化结果,选择最优添加量的载体A和载体B与载体C和载体D进行组合包装慢病毒,具体组合方式及对照组别见表2。
表2慢病毒包装载体组合方式及用量
载体A | 载体B | 载体A′ | 载体B′ | 载体C | 载体D | |
组合1 | / | / | 7.5μg | 5.75μg | 4μg | 10μg |
组合2 | 7μg | / | / | 5.75μg | 4μg | 10μg |
组合3 | / | 7μg | 7.5μg | / | 4μg | 10μg |
组合4 | 7μg | 7μg | / | / | 4μg | 10μg |
组合1为常规慢病毒包装体系(对照组),组合4将7μg辅助质粒pUC19-Kana-CAG-HIV-gag-pol-RRE-rBG pA和7μg辅助质粒pUC19-Kana-RSV-Rev-hBG pA 和定量的载体C和D组合包装慢病毒,包装图片见图9,滴度结果见图6,两种方法检测出的滴度均比对照组更高。组合1的Elisa滴度为1.14E+11VP/mL,组合4的Elisa滴度达1.65E+11VP/mL;组合1的qPCR滴度为2.02E+9TU/mL,组合4的qPCR滴度达2.87E+9TU/mL,有效病毒颗粒提高约1.5倍。取等体积病毒进行细胞转导,见图10,组合4的荧光绿和荧光强度明显强于对照组,其效果明显。
以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.载体组合,其包括辅助质粒A,辅助质粒B;
所述辅助质粒A的结构元件包括CAG启动子和HIV-1gag;
所述辅助质粒B的结构元件包括Rev和hBG pA。
2.根据权利要求1所述的载体组合,其特征在于,
所述辅助质粒A的结构元件还包括RRE、HIV-1pol、kanR、pUC ori、rBG pA;
所述辅助质粒B的结构元件还包括:kanR、pUC ori、RSV。
3.根据权利要求1或2所述的载体组合,其特征在于,
所述辅助质粒A中CAG启动子核酸序列如SEQ ID NO:3所示;
所述辅助质粒A中rBG pA的核酸序列如SEQ ID NO:4所示;
所述辅助质粒B中hBG pA的核酸序列如SEQ ID NO:5所示。
4.根据权利要求1~3任一项所述的载体组合,其特征在于,还包括辅助质粒C和表达质粒,其中,
所述辅助质粒C含有VSV-G衣壳编码基因;
所述表达质粒含有目的基因。
5.根据权利要求1~4任一项所述的载体组合,所述辅助质粒A、辅助质粒B、辅助质粒C、表达质粒的质量比为(1~9):(1~9):4:10。
6.权利要求1~5任一项所述的载体组合在制备病毒包装试剂中的应用。
7.宿主,其含有权利要求1~5任一项所述的载体组合。
8.慢病毒包装试剂盒,其包括权利要求1~5任一项所述的载体组合和转染试剂。
9.根据权利要求8所述的慢病毒包装试剂盒,其特征在于,所述转染试剂为磷酸钙。
10.慢病毒包装方法,其利用权利要求1~5任一项所述的载体组合或权利要求8或9所述的慢病毒包装试剂盒进行慢病毒包装。
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