CN101160055A - 慢病毒载体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于基因治疗、癌症治疗、制备重组蛋白如抗体和疫苗和其它治疗目的的慢病毒载体。公开了新慢病毒载体，例如含有相反方向的辅助序列和/或最少功能的LTR序列，可用于制备高效转导载体。还设计了载体以表达沉默RNA和反义多核苷酸。

Description

慢病毒载体及其用途

本申请要求2005年2月16日提交的美国临时申请号60/653,386；2005年3月10日提交的美国临时申请号60/660,310；2005年5月18日提交的美国临时申请号60/682,059；和2005年10月5日提交的美国临时申请号60/723,768的利益，它们被全文纳入本文作为参考。

附图简述

图1是以相反方向包含vsv-g和gag-pol的双质粒体系的辅助载体的示意图。

图2是表达绿荧光蛋白(GFP)的转移载体的示意图。

图3是用于三质粒体系的Tat和Rev表达示意图，其中包膜和gag-pol序列位于另一个质粒上。

图4是本发明模块转移载体的实例。

发明描述

本发明提供了慢病毒载体、转导载体、慢病毒体系、及它们在功能染色体、药物开发、靶体确认、蛋白质制备(例如治疗性蛋白质、疫苗、单克隆抗体)、基因治疗和治疗方法中的用途。使用本发明提供的新载体、或者使用本领域已知的慢病毒载体和体系，例如转移载体(例如美国专利5,885,806或6,114,141)或非转移或自失活载体(例如美国专利5,994,136或428,953)，可以实现本文公开的任何方法。

慢病毒转导载体

本发明涉及慢病毒转导载体及其制备构件，它们可以用于将感兴趣的可表达多核苷酸序列引入宿主细胞内。慢病毒转导载体是包膜的病毒颗粒，包含可表达的多核苷酸序列，可以渗入靶宿主细胞内，从而将可表达的序列运送到细胞内。包膜颗粒优选用工程化病毒包膜蛋白或来自另一病毒种类(包括非慢病毒)的天然病毒包膜蛋白质假型化，以改变天然慢病毒的宿主范围和传染性。如下面详述，转导载体可以用于广泛的用途，包括例如制备蛋白质(包括制备疫苗)，用于基因疗法，转移治疗性多肽，转移siRNA、核酶、反义多核苷酸和其它功能性多核苷酸等。所述转导载体可以运送单个或双基因，可以包含抑制序列(例如RNAi或反义)。在某些实施方案中，转导载体还运送包含修饰的3′LTR的核酸，其具有降低的但不是消失的转录活性。

慢病毒辅助构件

本发明提供了慢病毒辅助构件(例如质粒或分离的核酸)。所述构件包含如下元件：其可用于在相容的宿主细胞内制备功能性慢病毒转导载体，并将可表达的异源序列包装到其中。这些元件包括结构蛋白(例如gag前体)、加工蛋白(例如pol前体)如蛋白酶、包膜蛋白质、和在宿主细胞内制备蛋白质和组装功能性病毒颗粒所需的表达和调整信号。尽管下述实施方案的同一质粒上包含包膜和gag-pol前体，但是如果需要，它们可以被置于另外的质粒上，包括gag、pol和包膜蛋白质各自的独立质粒。

本发明的慢病毒辅助质粒可以在任何合适的顺序或位置包含一种或多种下列元件，例如：a)慢病毒5′LTR，其包含功能性天然启动子，该启动子可操作地联接至编码慢病毒gag和pol的多核苷酸序列(例如慢病毒gag-pol前体)；和b)可操作地联接至包膜编码序列的异源启动子。慢病毒5′LTR可以任选地含有位于天然序列上游的异源增强子序列。

任何合适的慢病毒5′LTR均能用于本发明，包括获自任何慢病毒种类、亚种、菌株或进化枝的LTR。其中包括灵长类和非灵长类慢病毒。种类等的具体实例包括但不限于例如：HIV-1(包括亚种、进化枝、或菌株，例如A、B、C、D、E、F和G、R5和R5X4病毒等)、HIV-2(包括亚种、进化枝或菌株，例如R5和R5X4病毒等)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、猿/人免疫缺陷病毒(SHIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、山羊-关节炎-脑炎病毒、Jembrana病病毒、绵羊慢病毒、绵羊脱髓鞘性脑白质炎病毒和马感染性贫血病毒。可以广泛利用这些病毒的基因组序列，例如：HIV-1(NC_001802)、HIV-2(NC_001722)、SIV(NC_001549)、SIV-2(NC_004455)、山羊-关节炎-脑炎病毒(NC_001463)、猿-人免疫缺陷病毒(NC_001870)、FIV(NC_001482)、Jembrana病病毒(NC_001654)、绵羊(NC_001511)、绵羊脱髓鞘性脑白质炎病毒(NC_001452)、马感染性贫血病毒(NC_001450)和BIV(NC_001413)。

慢病毒5′LTR包含用于基因表达的信号，包括增强子、启动子、转录初始化(帽子)、转录终止子和多腺苷酸化。它们通常被描述为具有U3、R和U5区域。LTR的U3区域包含增强子、启动子和转录调整信号，包括RBEIII、NF-kB、Sp1、AP-1和/或GABP基元。TATA框位于从R序列开始约25个碱基对处，这取决于5′LTR的来源种类和菌株。可以利用完全完整的5′LTR，或者利用修饰的拷贝。修饰优选涉及R区域，其中TAR序列被取代(参见下面)、和/或删除所有或部分U5区域。修饰的5′LTR优选包含启动子和增强子活性，例如优选是天然U3、具有被取代TAR的修饰的R、和天然U5。

5′LTR可以可操作地联接至编码慢病毒gag和pol的多核苷酸序列。术语“可操作地联接”指LTR的定位方式可以驱动所述编码序列的转录。在天然慢病毒中，gag和pol编码序列被组织为Gag-Pol前体。编码55-kD Gag前体蛋白的gag序列也称为p55。在熟化为四个较小蛋白的过程中，p55被病毒编码的蛋白酶4(pol基因的产物)裂解，四个较小蛋白名为MA(基质[p17])、CA(壳体[p24])、NC(核壳体[p9])和p6。pol前体蛋白被病毒编码的蛋白酶从Gag上裂解掉，进一步消化以分离蛋白酶(p10)、RT(p50)、RNaseH(p15)、和整合酶(p31)活性。

辅助质粒中可以存在一种或多种剪接供体(SD)位点。剪接提供位通常位于5′LTR的3′末端和包装序列之间。也可能存在下游剪接受体(SA)，例如在pol序列的3′末端。SD位置可以在载体的任何有效位置以多个拷贝存在。SD可能包含天然慢病毒序列，或者它可能为其突变拷贝。

天然Gag-Pol序列可以用于辅助载体内，或者可以进行修饰。这些修饰(下面有更详细的描述)包括嵌合Gag-Pol，其中Gag和Pol序列获自不同的病毒(例如不同种类、亚种、菌株、进化枝等)，和/或其中所述序列已经被修饰以促进转录和/或翻译，和/或降低重组。在本发明的其它实施方案中，编码gag和pol前体的序列可以被分离并置于不同的载体构件中，其中各序列具有其自身的表达信号。

HIV-1的RNA基因组包含约120个核苷ψ包装信号，在病毒组装过程中，它由Gag多蛋白的核壳体(NC)区域识别。如果HIV前病毒远离5′LTRU5区域，则包装信号的关键部分位于主要剪接供体(SD)位点和gag初始化密码子之间。辅助质粒的包装信号功能性缺失，以避免将功能活性的gag-pol前体包装到病毒转导载体内。参见例如美国专利5,981,276(Sodroski等人)，其中描述了包含gag、但缺少包装信号的载体。

为了提高、改进、增强等gag-pol前体的转录，额外的启动子和增强子序列可以置于5′LTR的上游。有用启动子的实例包括哺乳动物启动子(例如结构性、诱导性、组织特异性)，来自其它慢病毒种类的CMV、RSV、LTR，和如上面和下面所述的其它启动子。

此外，质粒可以进一步包含转录终止信号，例如polyA信号，它可以有效地终止由启动子序列驱动的转录。可以利用任何合适的polyA序列，例如来自β球蛋白的序列(哺乳动物、人、兔等)、胸苷激酶、生长激素、SV40、和许多其它种类。

辅助构件可以进一步包含含有异源启动子的包膜模块，该启动子可操作地联接至包膜编码序列。包膜多肽位于病毒表面上，参与病毒颗粒对宿主细胞的识别和感染。通过例如用由不同(异源)病毒种类或已经用其它方式修饰的病毒表达的包膜修饰或取代包膜多肽，可以改变宿主范围和特异性。这称为假型化。参见例如Yee等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：9564-9568，1994。因为其广泛的种类和组织向性、提供物理稳定性的能力和对载体颗粒的高度传染性，已经广泛使用疱疹性口腔炎病毒(VSV)蛋白G(VSV G)。参见例如Yee等，Methods Cell Biol.，(1994)43：99-112。

可以不受限制地利用包膜多肽，包括例如HIV gp120(包括天然和修饰的形式)、Moloney鼠类白血病病毒(MoMuLV or MMLV)、Harvey鼠类肉瘤病毒(HaMuSV或HSV)、鼠乳腺瘤病毒(MuMTV或MMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV或GALV)、Rous肉瘤病毒(RSV)、肝炎病毒、流感病毒(VSV-G)、Moloka、狂犬病、线状病毒(例如Ebola和Marburg，例如GP1/GP2包膜，包括NP 066246和Q05320)、双嗜性逆转录病毒、α病毒等。其它实例包括例如来自Togaviridae、Rhabdoviridae、Retroviridae、Poxviridae、Paramyxoviridae的包膜蛋白，和其它包膜的病毒家族。其它示例包膜来自位于全球性网络ncbi.nlm.nih.gov/genomes/VIRUSES/virases.html上的下列数据库所列的病毒。

而且，可以将病毒包膜蛋白修饰或工程化以包含下述多肽序列，该序列允许转导载体靶向和感染其正常范围以外的宿主细胞或将转导更特异性地限制到细胞或组织类型上。例如，包膜蛋白可以与导向序列一起加入框内，导向序列例如受体配体、抗体(使用抗体或重组抗体型分子的抗原结合部分，例如单链抗体)、及其多肽分子的一部分或其修饰物(例如其中糖基化位置存在于目标序列内)，当该导向序列位于转导载体外壳上时，有利于将病毒颗粒定向输送至感兴趣的靶细胞内。而且，包膜蛋白可以进一步包含调整细胞功能的序列。在混合细胞群中，用转导载体调整细胞功能可以增加或降低对某些细胞类型的转导效率。例如，用含有可特异性结合干细胞的配体或结合伙伴的包膜序列可以更特异性地转导干细胞，而不是在血液或骨髓中发现的其它细胞类型。这些配体在本领域中是已知的。非限制性实例为干细胞因子(SCF)和Flt-3配体。其它实例包括例如抗体(例如细胞类型特异性单链抗体)、和对组织如肺、肝、胰腺、心脏、内皮、平滑肌、乳腺、前列腺、上皮、血管癌症等特异性的其它任何抗原(包括受体)。

当可操作地联接时，可以利用任何异源启动子来驱动病毒包膜编码序列的表达。实例包括例如CMV、E1Fα、E1Fα-HTLV-1杂合启动子、铁蛋白启动子、可诱导启动子、组成型启动子、和本文所述的其它启动子等。

在本发明的优选实施方案中，gag和pol序列位于包膜序列的相反转录方向。后者意味着转录的方向是相反或逆转的。通过将相应的启动子放在相反的方向(例如相互面对)或使用双向启动子(例如Trinklein等，GenomeResearch 14：62-66，2004)，可以实现上述目标。这种排列可以用于安全的目的，例如用于降低功能性重组HIV基因组的重组和/或制备的风险。所述载体的安全性得到提高，因为转录连读将不可能导致即包含功能gag-pol也包含包膜序列的RNA。通过利用可终止转录的强多腺苷酸化序列，可以防止转录干扰。强转录终止序列的实例在本领域中是已知的，包括例如兔β-球蛋白多腺苷酸化信号(Lanoix和Acheson，EMBO J.1988 Aug；7(8)：2515-22)。还参见Plant等，Molecular and Cellular Biology，April 2005，第3276-3285页，Vol.25，No.8。此外，可以将其它元件插入和gag-pol和包膜编码序列之间，以促进转录终止，例如靶向任何假定连读序列的顺式作用核酶或RNAi序列。类似地，可以将不稳定序列、终止序列和停顿位点放置在编码序列之间。

除了其中存在的5′LTR和/或gag和pol序列，辅助质粒可以进一步包括获自不同慢病毒种类、组、亚种、亚组、菌株或进化枝的TAR元件，即它对于质粒构件所含的其它慢病毒元件是异源的。在5′LTR中，TAR优选位于其正常位置，例如在LTR的U3和U5元件之间，例如当天然R被异源慢病毒种类的R′代替时。各种慢病毒种类的实例列于上面，从中可以获得异源TAR元件。

TAR元件是反式活化响应区域或响应元件，位于病毒DNA的5′LTR(例如R)并处于相应RNA的5′末端。当存在于慢病毒RNA中时，转录反式活化剂Tat与之结合，从而多倍地激活从HIVLTR的转录。Tat是RNA结合蛋白，可结合至由TAR元件形成的短干回路结构。

当利用异源TAR元件时，通过用来自另一种类的TAR序列代替其天然TAR，可以常规地修饰的5′LTR。TAR区域的实例是公知的。参见例如DeAreliano等，AIDS Res.Human Retro.，21-.949-954，2005。这种修饰的的慢病毒5′LTR可以包括完整的U3和U5区域，从而LTR是完整功能的。TAR区域或完整的R可以被取代。

如上所述，Tat多肽与TAR序列结合。Tat编码序列可能存在于辅助质粒内，或者它可能位于包装体系的另一元件上。例如，可以将它整合到用于制备病毒转导载体的细胞系基因组内，或者位于引入细胞系内的另一质粒或载体构件上。可以使用任何Tat多肽，只要它可以与TAR结合并活化RNA的转录。其中包括获自相同或不同种类作为同源TAR元件的天然Tat序列，以及工程化的或修饰的的Tat序列。

辅助质粒可以进一步包含RRE元件，包括获自与5′LTR或gag和pol序列不同的慢病毒种类的RRE元件。RRE元件是rev多肽的结合位点，rev多肽是13-kD序列特异性RNA结合蛋白。包含RRE序列的构件的有效表达取决于rev多肽。Rev结合至rev响应元件(“RRE”)的复合RNA二级结构的240碱基区域，rev响应元件位于HIV的第二内含子中，远离pol和gag编码序列。rev与RRE的结合有利于将未剪接和不完全剪接的病毒RNA从核输出到细胞质，从而调整HIV蛋白质的表达。RRE元件可以位于构件的任何适当位置上，优选在Gag-Pol前体后面，在其大概天然位置内。类似地，对于Tat多肽，可以利用任何合适的rev多肽，只要它保留着与RRE结合的能力。Rev编码序列可以存在于辅助质粒、转移质粒、独立质粒内，或者整合到用于制备转导载体的宿主细胞系内。类似地，tat编码编码序列可以存在于辅助质粒、转移质粒、独立质粒内，或者整合到用于制备转导载体的宿主细胞系内。

本发明构件所含的任何序列都可以是从其天然形式修饰得到以例如提高转录、提高翻译、降低或改变二级RNA结构、和/或降低重组。修饰包括例如核苷的添加、删除、取代和置换。例如，通过用非天然密码子代替天然密码子，可以修饰gag、pol、rev和tat编码序列，例如通过用在宿主细胞内翻译更有效的密码子取代它们，来提高宿主细胞的翻译。宿主细胞可以被称为相容性细胞，例如来表明当序列在特定宿主细胞类型中表达时，序列修饰具有其效果。此外，可以修饰序列以除去调整元件，例如包装序列。还能改变序列以消除重组位点。重组点的实例为例如Zhuang等，J.Virol，76：11273-11282，2002所公开的。

进一步的实施方案包括开发用于制备慢病毒载体和包装细胞系的辅助体系，然后将其进一步开发成用于任何给定载体构件的制备体细胞系。一个所述实施方案是使用细胞蛋白来提高慢病毒载体的制备。Sam68属于包含KH区域的蛋白质家族。一些KH蛋白质是翻译调节剂，而认为其它KH蛋白质可以介导可选择的剪接。Sam68在体外和体内结合HIV-1的Rev响应元件(RRE)，在RRE介导的基因表达和病毒复制中，可以功能性代替HIV-1 Rev和/或与HIV-1 Rev协同(Modem等Nucleic Acids Research，2005，Vol.33，873-879)。此外，还显示Sam68可增强其它复合逆转录病毒的Rev样蛋白的活性。近期，证实Sam68可增强要输出至细胞质的未剪接HIV-1RNA的3最初末端加工。除Sam68(即SLM-1、SLM-2、QKI-5、QKI-6和QKI-7)之外的其它KH蛋白还可以增加Rev/RRE介导的基因表达。然而，在所测试的KH蛋白中，只有Sam68可以活化组成型转移元件(CTE)介导的gag基因在人细胞内的表达。当Rev过度表达时，Sam68与Rev协同以充分提高包含RRE的RNA从核的输出。Rev不存在时Sam68的过度表达还有利于包含RRE的mRNA的核输出。因此为了提高基于HIV的慢病毒载体从制备体细胞的制备，可以从辅助构件表达Sam 68，以促进将慢病毒载体RNA输出到细胞质内，并提高慢病毒载体颗粒的制备。可以从rev依赖型或rev非依赖型辅助构件表达Sam68。本发明不限于Sam68，还可以靶向与HIV RNA相关的其它蛋白质，例如SF2/ASF、hRIP、hRNP A1、p54nrb/PSF和RRE BP49。相反，靶向Sam68或这些其它蛋白质的RNAi可以被插入慢病毒载内，作为针对HIV感染的基因治疗方法抑制野生型HIV RNA作为基因形式的输出。参见下面详述的HIV疗法。

慢病毒转移载体

本发明还提供了慢病毒转移载体。转移载体是包含多核苷酸序列的构件，被包装在转导慢病毒载体内。当包含5′LTR和3′LTR时，转移载体可以用于制备可整合到宿主基因组内的转导载体。这种整合可以通过例如使pol序列辅助质粒上存在的整合酶分子突变而加以防止。然而，整合载体优选用于长期基因递送。

本发明的慢病毒转移质粒载体可以包括一种或多种下列组分：a)慢病毒5′LTR多核苷酸序列；b)远离所述5′LTR的包装序列(ψ)；和c)修饰的包含TATA框序列的慢病毒3′LTR，但所述TATA框序列缺少3′U3序列5′。至少一种可表达的异源多核苷酸序列可以插入转移载体内，例如在包装序列和3′LTR的U5区域之间。

任何适当的慢病毒5′LTR序列均可以被置于转移载体内。这样的序列可以是完整和完全天然的，或者它可以如上所述被修饰，例如通过用异源TAR序列(R)代替TAR序列，或者通过用非天然发生的核苷代替其中的核苷，以使重组事件最小化。前述5′LTR具有U3、R和U5区域，这些区域存在，但可能以一定的方式修饰以使它们保留其功能性质。

远离所述5′LFR的包装序列(ψ)也可以存在于转移载体内。该序列(约110个核苷)由Gag的NC区域识别，顺式地用于促进将感兴趣的异源序列包装到转导载体内。参见例如Lever等，J.Virol.(1989)，63：4085-4087；Amarasinghe等，J Mol.Bio.(2001)，314(5)：961-970。ψ包封序列相对邻近序列是自治的。可以常规地确定它在转移载体中的位置。参见例如Man andBaltimore，J Virol.，54(2)：401-407，1985，其中使用报告基因来优化包装序列的位置。

转移载体还可以包括慢病毒3′LTR。3′LTR具有U3、R5和U5区域，其两侧分别为TTP和PBS序列。3′LTR可能是完整和天然的，但优选是被修饰的。修饰优选地包括产生下述LTR的修饰，所述LTR保留最少量功能活性例如转录(启动子-增强子)功能活性。可以常规地确定所述转录活性，例如使用报告基因。生成具有降低的(与天然3′LTR相比)和最小功能活性的修饰的实例包括例如删除U3区域内TATA框的5′(上游)。这种删除可以包括例如删除或修饰一个或多个下列转录调整位点，例如RBEIII、NF-kB、和/或Sp1、以及PPT位点。具有最小转录活性的3′LTR的实例包括修饰的慢病毒3′LTR，该3′LTR包含TATA框序列，但所述TATA框序列缺少3′U3序列5′，或者其中5′序列被修饰(删除、替代、添加)，从而使它们不是功能活性的。例如，可以将NF-kB和Sp1位点诱变成失活和/或不能结合至调整蛋白的位点。5′上游区域的删除包括从TATA框的T核苷删除约5、10、15、20、25、30、40、50等个核苷。保留的转录活性量可以为例如约0.1-1％、0.1-2％、0.1-5％、0.1-10％、0.1-20％、0.1-25％、0.5-5％、0.5-10％、0.5-20％、0.5-25％；约0.1％；约0.5％；约1％；约2％；约5％；约7％、约10％等。

U3区域的5′末端对于整合是必需的(末端二核苷酸+att序列)。因此，末端二核苷酸和att序列可以代表可以被删除的U3序列的5′边界。此外，转移载体可以包括RRE序列，该序列可以位于中心多嘌呤追踪序列的上游或下游。RRE或中心多嘌呤追踪序列可以来自天然或非天然(异源)慢病毒载体序列。

通过插入异源序列，包括可表达的编码序列如可表达的shRNA、核酶、反义、微小RNA′s和aptamer序列，可以功能性地打断3′LTR的5′区域(例如U3)。这些序列可以由pol II和pol III(例如人U6、鼠U6和人H1、7SK)启动子表达，在载体基因组中可以位于3′LTR内或LTR上游和5′LTR下游。关于启动子，参见例如Werner，T.(1999).Models for prediction and recognitionof eukaryotic promoters.Mammalian Genome 10，168-175。

然而，修饰的3′LTR可以保留着启动U3区域以外的序列，例如PPT、R和U5。对于5′LTR，可以用来自不同慢病毒种类或亚种的异源TAR序列代替R区域内的TAR元件。

由于病毒转录在5′LTR U3区域的3′末端处开始，所以这些序列不是病毒mRNA的一部分，其来自3′LTR的拷贝作为模板用于产生整合的前病毒内的两种LTR。如果U3区域内的3′LTR拷贝在载体构件内改变，则载体RNA仍然由制备体细胞内的完整5′LTR产生，但不能在靶细胞内再生。这样的载体的转导导致后代病毒内两种LTR的失活。因此，逆转录病毒是自失活的(SIN)，所述载体被称为SIN转移载体。参见例如Mirta等，Nucl.AcidRes.，30(21)：ell3，2002；Zufferey等，J.Virol，72：9873-9880，1998；美国专利6,428,953(Naldini等)。

可以将可表达的异源多核苷酸序列插入转移载体内，例如在包装序列和3′LTR之间。可表达的序列是基本上以其有效负荷包装在病毒转导载体内的序列。任何感兴趣的异源序列均可以不受限制地插入转移载体内，包括编码治疗蛋白质、酶、和抗体等的序列，siRNA，反义、微小RNA、aptamer、核酶、任何基因抑制或沉默序列；和要通过慢病毒转录载体递送至宿主细胞的任何序列。

术语“可表达的”指所述多核苷酸序列可以在细胞内被转录和翻译。赋予可表达性的序列包括例如增强子、启动子、聚合酶结合位点、核酶附着位点、剪接供体位点和剪接受体位点、多腺苷酸化信号、转录初始化和终止序列等。

当可操作地联接时，上述任何启动子均可以用于驱动异源序列的表达。当本发明的载体编码细胞毒性或细胞静止多肽(即表达损害宿主细胞的产物的基因)时，可诱导的启动子体系优选可操作地联接其编码序列，从而在不需要基因表达时，可以调整其表达，以使宿主毒性最小化。例如，当四环素从转移细胞中去除时，四环素可调整的基因表达体系(GossenandBujard，Proc.Natl.Acad.Sd.，89：5547-5551，1992)可以用于提供可诱导的基因表达。

可以用于诱导控制基因表达的其它体系是利用启动子包含响应元件的体系。在这样的体系中，当被启动子包含元件结合时，启动子失活。诱导物配体例如以定量的方式开启启动子，其中诱导物的高浓度与较高的转录活性相关。例如，RheoSwitch基因调节体系具有三种主要成分：结合至靶基因启动子区域的所有RheoCept蛋白受体、要调整的靶基因、和所有有机小分子配体诱导物。启动子包含受体结合的特有响应元件，只有在诱导物结合至受体并活化转录时，才开启靶基因表达。参见例如Kumar等，J.Biol.Chem.，Vol.279，Issue 26，27211-27218，2004年6月25日，″Highly FlexibleLigand Binding Pocket of Ecdysone Receptor：A single amino acid change leadsto discrimination between two groups of nonsteroidal ecdysone agonists″。通过整合可以杀灭载体转导的细胞的基因，可诱导的体系还可以用于提高载体的安全性。在所述应用中，可诱导的启动子表达第二基因，该基因调整第二可诱导启动子的表达，然后该第二可诱导启动子在活化后将表达“自杀”或安全基因，从而导致杀灭被转导的细胞。双重调整“开关”的优点是自杀或安全基因不会表达，直到它第一次被诱导，因此如果具有免疫原性，将不会表达所述基因，直到添加至少一种前药以刺激一种所述可诱导基因的表达。双重调整开关的其它优点是缺少前药时的背景表达将远远低于使用单开关时的表达。在表达自杀或安全基因时，将需要至少第二前药来真正杀灭细胞。非限制性实例是来自第一可诱导启动子的转录调节蛋白表达，然后第一可诱导启动子结合并强化第二可诱导体系，然后第二可诱导体系表达任何感兴趣的基因，优选自杀或安全基因。对于本身由添加前药而活化的自杀或安全基因的表达，这种非限制性实例并非意味着限制单个可诱导启动子体系的用途。而且上述实例并非意味着限制安全或自杀基因的应用，但任何感兴趣的基因或序列均可以由这样的双重可诱导表达体系来表达。

为了提高转移载体的灵活性和产生模块载体体系，可以进一步将多重克隆位点(MCS)包含在载体内，以促进感兴趣的异源序列的插入。所述MCS可促进引入任何启动子、单基因、双基因和任选的基因抑制序列，例如反义、核酶、shRNA、RNAi、微小RNA、aptamer、反式显性突变蛋白等。优选的实施方案是表达已经被修饰的感兴趣的基因，从而使其核苷序列是相对于细胞内源性基因的简并密码子，另外，相同的载体表达能够抑制或沉默感兴趣的天然基因的基因抑制或沉默序列。通过表达已经在这些区域内被修饰的感兴趣的蛋白质，同时表达抑制或沉默感兴趣的天然未修饰基因表达的基因抑制或沉默序列，这种方法在理解各种蛋白质区域功能的方面具有巨大用途。这种应用还可以用于基因治疗法，用于治疗疾病。例如，表达靶向β-血红蛋白的RNAi的慢病毒载体可以抑制或沉默镰刀细胞贫血患者的镰刀血红蛋白。相同的慢病毒载体还可以表达正常的血红蛋白分子，该分子的密码子已经在RNAi靶向的位点被简并。通过这种方法，表达镰刀球蛋白的红细胞可以抑制镰刀球蛋白的表达，同时表达天然血红蛋白并校正基因变异。慢病毒载体将被递送到干细胞群内，干细胞群将产生表达血红蛋白的红细胞，并最终将变成红细胞。这种方法可以用于治疗各种疾病，包括癌症、基因病和感染性疾病。

转移载体可以进一步包含其它额外的元件，例如以下列顺序排列(上述元件)：5′LTR、PBS、包装序列、剪接供体(SD)、复制起点、任选的中心多嘌呤束(PPT)、RRE、MCS、剪接受体(SA)、和修饰的最少功能的3′LTR。可表达的异源多核苷酸序列可以插入剪接供体位点和3′LTR的U5区域之间。转移载体还可以包含一个或多个SD(天然或修饰的)位点，如上面描述时辅助载体所述。

当存在于宿主细胞内时，复制起点可以用于提高构件的复件数。SV40ori通常用于该目的，例如在制备SV40大T抗原的细胞内，例如HEK293-T细胞。

转移载体中可以含有位于MCS 3′的其它元件，包括例如用于稳定mRNA的合成内含子或其它序列、用于促进翻译来自单个mRNA的两个开放读取框的内部核糖体进入位点(IRES)、可选择的标记物、和转录终止信号(例如多腺苷酸化位点)。

可以使用其它元件来促进两个开放读取框的表达。一个实例是2A/2B肽序列，它促进多肽在预定位置的裂解(Szymczak等，Nature Biotechnology，22：589594，2004)。通过这种方法，可以由来自单个开放读取框的慢病毒载体制备由自裂解2A序列分离的两个多肽序列。另一个实例是使用内部核糖体初始化序列或IRES元件，例如两个非限制性实例：来自小核糖核酸病毒或口足病病毒的那些。还参见Donnelly等，J.Gen.Virol.，82：1013-1025，2001。

本发明还提供了转移载体构件，包含例如：a)慢病毒5′LTR，其包含可操作地联接至编码天然慢病毒gag和pol(或其片段)的多核苷酸序列的功能性天然启动子，和有效终止由所述天然启动子所驱动的转录的异源polyA信号，其中转录终止信号存在于gag-pol序列起点的下游，和b)可操作地联接位于gag-pol序列下游的异源多核苷酸序列的异源启动子。

本发明还提供了表达构件，包括：a)慢病毒5′LTR，其包含可操作地联接编码天然慢病毒gag和pol(或其片段)的多核苷酸序列的功能性天然启动子，和有效终止由所述天然启动子所驱动的转录的异源polyA信号，其中翻译终止信号存在于gag-pol序列起点的下游，b)位于gag-pol序列下游的剪接受体，和c)位于gag-pol序列下游的异源多核苷酸序列，gag-pol序列可操作地联接至5′LTR启动子。

转移载体可以包含任何上述用于转移载体的元件和/或典型地包含慢病毒转移载体。gag-pol序列不但可以是基本上完全的，其中插入上述转录终止子，而且还可以利用其部分片段，例如包含包装序列的片段。终止信号可以放置在gag-pol编码序列的任何地方，但优选位置是仅产生不完全gag编码序列拷贝并且不产生pol编码序列的地方。异源多核苷酸序列可以位于gag-pol序列的初始密码子的下游，其位点能可操作地联接5′LTR启动子。可以常规确定该位置，例如使用报告基因来确定哪个位置有利于可操作地联接。可以将异源序列插入完全的gag-pol编码序列中，位于转录终止子的下游。可选择地，gag-pol序列可以是部分序列，异源序列可以在部分序列和3′转录终止子后面。

微小RNA、shRNA和其它异源序列的载体表达的任选模板是如下载体，该载体含有通过修饰5′LTR下游的gag-pol序列而包含完整但无功能的gag-pol序列。这种修饰产生gag-pol多肽ATG起始位置下游的终止密码子，但不会干扰用于包装的顺式作用元件。RNAi、微小RNA序列被插入gag-pol序列下游。含有额外的顺式元件将稳定载体，从而导致提高功能效应子序列的滴度和制备。在另一个实施方案中，所述载体表达靶向至多个位点的RNAi、微小RNAs或shRNA(反义等)，以提高信号效应子RNAi有效抑制靶序列表达的可能性。

要使pol序列的翻译或转录失活，还可以将多核苷酸插入gag和pol编码序列之间，例如异源序列、异源表达盒(例如启动子、编码序列和polyA)、siRNA、反义、翻译(例如终止密码子)和/或转录终止序列。作为对终止密码子的响应，蛋白质合成或释放的终止发生于核糖体上。终止密码子的实例包括例如UAG、UAA和UGA。还参见Cassan和Rousset，″UAG readthroughin mammalian cells：Effect of upstream and downstream stop codon contextsreveal different signals，″BMC Molecular Biology 2001，2：3。

慢病毒包装体系

本发明还提供了用于制备慢病毒转导载体的慢病毒包装体系。包装体系指可用于制备完全包装的和功能性慢病毒转导载体的多种构件。它们包括例如上面详述的慢病毒辅助构件和转移构件(例如以质粒的形式，即双质粒、三质粒或多质粒体系)。辅助构件优选包含gag-pol前体和包膜蛋白，但它们各自也可以存在于不同构件上。在这种情况下，所述体系可以包括两种辅助构件。

此外，所述体系可以进一步包括用于表达多肽的构件，所述多肽反式作用以增强转导载体的制备。它们优选包括质粒，所述质粒含有分别与RRE和TAR序列相互作用的可表达rev和tat多肽。而且，它们可以存在于相同质粒上，例如其中每个包含其自身的转录终止信号，或者其中编码序列被IRES序列分离，以使用相同的信使RNA实现翻译。例如，所述体系可以包括三种质粒或构件，包括辅助质粒、转移质粒和用于表达rev和/或tat多肽的质粒。

优选不在转录体系所含的任何构件上表达通常存在于慢病毒内的其它多肽，如附助蛋白质nef、vif、vpr和vpu。任选地，来自SIV的vpx蛋白可以由载体质粒、辅助质粒或辅助质粒之一表达，或者由质粒单独或与其它序列组合表达。vpx蛋白可以促进基于HIV或其它慢病毒的载体的转导效率的提高。

本发明的构件还可以包含复制起点(例如pUC以利于大肠杆菌内的高拷贝复制和保留)、可选择的标记物、和其它序列，例如用于在细菌内制备辅助构件和转移构件。此外，可以用标记物检验载体的存在，因此可用于证实感染和整合。标记物基因的存在还确保了只有表达插入物的那些宿主细胞的选择和生长。典型的选择基因编码针对抗体和其它毒性物质如组氨醇、嘌呤霉素、匀霉素、新霉素、甲氨蝶呤等和细胞表面标记物提供耐受的蛋白质。

本发明的辅助载体和转移载体可以排除例如下专利描述或主张的载体及其一个或多个元件：美国专利5,994,136、6,165,782和6,428,953(Naldini)；美国专利6,013,516(Verma)；美国专利5,665,577和5,981,276(Sodroski)；美国专利5,817,491(Yee)；美国专利6,555,107；美国专利6,627,442；美国专利U.S.6,051,427(Finer等)；美国专利6,924,123(Kingsman等)；美国专利5,591,264(Barber等)。

载体构成

进一步提供了通过将辅助序列包含在慢病毒载体构件内，来提高慢病毒载体安全性的机制。已知包含直接重复的逆转录病毒是不稳定的，不稳定水平直接与直接重复序列的长度成比例。大于200个碱基的直接重复序列能非常有效地从人逆转录病毒如人慢病毒切除。通过在载体和辅助序列之间的可能重组位置的上游提供来自不需要的辅助构件的辅助序列，可以改进慢病毒载体的安全性。例如，将VSV-G序列掺入慢病毒载体内是不合适的。优选实施方案是将VSV-G(优选不包括poly A位点)的3′或远端区域的500-1000个碱基置于载体内，位于潜在重组位点上游的(例如恰好远离慢病毒载体包装位点)。如果来自辅助构件的VSV-G序列与载体之间发生重组，则将形成直接重复序列，从而导致不稳定性、和随后在逆转录过程中其被从载体删除。

其它实施方案是可诱导的制备体系，其包含以可诱导的方式用RNA序列稳定的靶蛋白mRNA。例如，作为对血清的响应，3′RhoB未翻译区域(UTR)可以稳定表达毒性蛋白质或其它感兴趣的蛋白质的靶RNA。另一个实例是将eotaxin 3′未翻译区域联接至感兴趣的靶区域，其通常具有低半衰期，但将TNF-α和IL-4添加到细胞中可以稳定它。可选择地，在胰岛素存在的情况下，CYP2E1和CYP2B1 mRNA的5′编码区域内的16 mer序列所含的序列可以将靶RAN去稳定。在除去胰岛素后，靶RNA被去稳定化，蛋白质可以被表达(Trong等Biochem J.2004年12月23)。优选的发明是使用这种去稳定序列来制备包装细胞系，该细胞系可以以可诱导的方式制备毒性蛋白质如VSV-G。通过将去稳定序列与VSV-G或其它蛋白质联接并且添加或除去稳定因子，可以获得VSV-G或其它蛋白质的可诱导表达。优选实施方案是表达毒性蛋白质的辅助构件，该辅助构件含有使编码毒性蛋白质的mRNA去稳定的RNA序列，但在响应一些稳定因子时被稳定。进一步优选的实施方案是编码联接至RNA不稳定序列的感兴趣的蛋白质基因的慢病毒载体，在添加稳定mRNA的一些因子后，所述RNA不稳定序列可以被稳定地表达。

另一个实施方案是慢病毒载体包装细胞系，它在可诱导的启动子体系下表达靶向VSV-G蛋白质的RNAi。在选择细胞系的过程中，抗VSV-GRNAi是有活性的，然后被诱导关闭以启动慢病毒载体的制备。这种可诱导的启动子在本领域中是已知的，在本申请中也做了描述(Gossen，M.，和Bujard，H.，″Tight Control of Gene Expression in Mammalian Cells byTetracycline-responsive Promoters，″Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89：5547-5551)。其他人已经使用可诱导的体系来诱导VSV-G在包装细胞系中的表达(Yang等人，美国专利5,750,396；Verma，美国专利6,218,181)。然而，可选择的控制毒性蛋白质如VSV-G的表达的方法是通过放置基因表达抑制物从而在可诱导启动子如四环素响应性启动子的控制下靶向毒性蛋白质，但这种特定的可诱导体系是非限制性的，可以使用其它可诱导的体系。基因表达的抑制物可以为反义、RNAi(其中存在几种变体，上面描述了一些)、核酶或本身无毒的反式显性突变蛋白质。优选实施方案是ddRNAi的可诱导表达，以在保持细胞系的过程中抑制VSV-G表达，然后在载体制备过程中将其“关闭”。在细胞生长的具体相中和载体制备以外的应用中，可以使用相同的方法来诱导各种蛋白质的表达。例如，可以用细胞周期抑制剂或靶向促进细胞周期或细胞分化的基因的第二RNAi的表达来定时RNAi的表达。在其它潜在的靶基因中，可以靶向的其它序列是涉及细胞死亡、分裂、代谢、蛋白合成和代谢、细胞周期、核酸合成和代谢以及细胞分化的基因。通过使用内部核糖体进入序列(IRES)或本领域已知的类似序列，将靶向毒性或有害蛋白质的RNAi可操作地与基因联接，可以实现上述目标。仅仅通过用缓冲序列分离两个RNAi序列，还能将RNAi与第二RNAi联接。缓冲序列在本领域中是已知的，它们是不干扰RNAi序列功能的任何序列。

上述方法可以用于制备更安全的辅助载体体系，来制备慢病毒载体，其中RNAi或RNA不稳定序列用于防止慢病毒载体的毒性或有害重组。RNAi可以靶向辅助构件的开放读取框架之间的单个或多个潜在的连读区域。RNA不稳定序列(也称为mRNA-和蛋白质去稳定元件)，例如PEST序列、P1、P2、cUb和Ub、九聚物UUAUUUAUU(SEQ ID NO：1)的1、2或4拷贝(分别为N1、N2和N4)、来自c-fos和c-myc 3′-UTR的富含AU的元件(ARE)。优选的实施方案是双去稳定的构件，其由以下构成：至少一个RNA去稳定元件和至少一个蛋白质去稳定元件，该构件可以被插入不希望具有连读的基因之间的区域。例如，不希望VSV-G包膜和Gag或Pol蛋白位于同一mRNA上，因此靶向辅助构件的VSV-G和Gag或Pol开放读取框架之间(或假定重组区域)的单个或多个区域的RNAi将是本发明的优选实施方案。优选实施方案是使用shRNAi或ddRNAi靶向辅助构件区域，如果连读，该区域可能产生包含Gag和/或Pol和VSV-G包膜蛋白的RNA。通过在不希望发生连读RNA和/或蛋白质序列的编码序列之间插入所述不稳定元件或降解序列，可以用RNA或蛋白质不稳定或降解序列防止连读转录或连读蛋白序列。可以将降解序列放在所有开放连读框架中，因此可以重复至少三次；因为在读取或重组事件之前要不必要预先知道所使用的真实读取框架。还提供方法，通过确保gag-pol和vsv-g处于三双密码子序列的不同相内，来防止膜和gag-pol开放连读框架产生连读多蛋白。优选vsv-g处于gag-pol的下游和gag-pol密码子三重序列的1相。

在另一个实施方案中，通过插入可诱导的RNAi或反义序列，可以提高慢病毒载体的安全性，该序列靶向任何下述序列，如果它与载体重组将有害。例如抗vsv-g序列(即抗包膜多核苷酸序列，如RNAi或反义)可以插入主要剪接受体位点的上游，从而它只在载体制备过程的后期和只在基因组载体RNA中表达。通过这种方法，将不会显著影响载体滴度。然而，如果应该接着发生重组事件，则RNAi或反义序列将结合VSV序列并破坏重组。因此，辅助载体(或转移载体)可以进一步包括可有效抑制所述包膜编码序列翻译的反义多核苷酸。反义的设计在本领域中是公知的，可以包括插入载体的完全反义序列，或者足够与包膜正义RNA杂交并抑制其翻译的部分反义序列。

另一个实施方案是存在于慢病毒载体或辅助表达构件内的下述肽序列：KETWETWWTE(SEQ ID NO：2)。该肽序列是逆转录酶二聚化的有力抑制物。该肽可以以两种方式使用：用于从包装体系制备更安全的慢病毒载体，或者用于HIV/AIDS基因疗法。对于制备更安全的包装体系，将肽插入gag-pol和包膜(如VSV-G)编码序列之间，只在两个开放读取框架之间连读时表达。然后制备该肽，以通过抑制逆转录酶二聚化和包装到病毒颗粒内，来抑制载体的存活力。在第二种方式中，它由基于HIV的慢病毒载体表达，用于治疗HIV/AIDS。包含表达所述肽的载体的细胞制备缺陷颗粒，该颗粒在用野生型HIV感染时没有二聚化的逆转录酶。这允许用体内存在的抗原决定簇刺激免疫响应，而不产生感染性病毒。在第三方式中，所述肽可以从慢病毒载体作为第二基因表达，来防止载体在初始转导后的任何进一步代谢。所述肽序列或多个序列将只在靶细胞内而不在制备过程中表达，因为在制备过程中所述肽将脱离其在载体内的启动子序列，但作为干涉性直接重复序列将启动子与要表达的肽序列再连接的结果，将在靶细胞中制备肽。相同的方法可以用于表达毒性蛋白质，而不是抑制逆转录酶二聚化的肽。临时性地，如下组织载体：源自慢病毒的5′LTR、包装序列、内部启动子、不小于500个碱基(优选但不限于)的序列(包含位于其5′边界的剪接供体位点和强的剪接受体位点)、干扰序列、同样不小于500个碱基的序列(不包含剪接供体位点但具有单个或多个点突变的剪接受体位点，该位点弱于强剪接受体位点)、密码子初始化序列、肽编码序列(或毒性蛋白质)、密码子停止序列、poly A、和源自慢病毒的3′LTR。

近期，暗示LMO2基因参与白血病的发生，但显示该基因在T细胞发展过程中不重要(McCormack MP，Forster A，Drynan L，Pannell R，Rabbitts THMoI Cell Biol.2003 Dec；23(24)：9003-13)。优选实施方案是表达反义、核酶、RNAi或抑制物LMO2基因表达的慢病毒载体，来提高慢病毒载体或逆转录病毒载体在治疗下述人类疾病基因过程中的安全性，在所述疾病中CD34或血细胞类型由慢病毒或逆转录病毒载体转导，其中慢病毒或逆转录病毒整合到所述细胞的染色体内。

除了LMO2外，已经显示当由HIV载体转导时，其它基因将被上调或下调(Zhao等，Gene Therapy，12：311-319，2005)。例如，EEF1α在人脐带静脉上皮细胞中上调了10倍，而Clusterin上调了3倍。要防止由这些基因的过度表达引起的任何有害作用，可以构建慢病毒载体以表达针对过度表达基因的RNAi，或者编码和表达过低表达基因。通过这种方式，可以提高慢病毒载体的安全性。

此外，详述了慢病毒载体，在该慢病毒载体中，在慢病毒蛋白的密码子初始化序列周围和包含该密码子初始化序列处使用点删除、两碱基删除、三碱基删除或大于三碱基删除来删除所有密码子初始化位点。通过这种方式，载体保留着最大壳体化所需的顺式作用序列，但不能制备野生型慢病毒。而且，隐藏密码子初始化位点也被删除。在优选实施方案中，删除了密码子初始化位点周围的足够多序列，以产生空间来插入上述基因或RNAi，从而提高载体治疗作用或所需非治疗作用的强度，例如提高细胞系的蛋白质制备。

其优点在于细胞蛋白质不是免疫原的，因此它们的过度表达将不会导致针对包含载体而且还没有被野生型慢病毒感染的细胞的免疫响应。

进一步提供了表达多种基因或RNAi的上述载体，所述多种基因或RNAi导致：(1)活化细胞和提高由所述细胞制备的缺陷性载体颗粒；(2)刺激免疫响应；(3)提高缺陷性颗粒的制备；和/或(4)降低感染性慢病病毒颗颗粒的产生。上面描述了这些基因或RNAi。

转导载体的制备

本发明还提供了转导载体及其制备方法。上述具体实施方案可以短暂地用于宿主细胞以制备转导载体。可以用于制备载体的宿主细胞的实例包括任何哺乳动物或人细胞系或基本细胞。非限制性实例包括例如293、HT1080、Jurkat和SupT1细胞。其它实例为CHO、293、Hela、VERO、L929、BHK、NIH 3T3、MRC-5、BAE-1、HEP-G2、NSO、U937、Namalwa、HL60、WEHI 231、YAC1、U266B1、SH-SY5Y、CHO如CHO-K1(CCL-61)、293(如CRL-1573)。

本发明提供了制备慢病毒转导载体的方法，该方法包括例如：a)用慢病毒辅助质粒转染宿主细胞并转移质粒，以产生制备细胞系；和b)在能有效制备慢病毒转导载体的条件下培养所述经转化的制备细胞。任何合适的转染方法均可以用于载体制备过程，包括电穿孔、磷酸钙转染、PEI聚合物介导的转染、fecturin或基于脂质的转染法。优选将转导载体分泌到细胞培养基中，它可以在那里被恢复和任选地富集或纯化。

可以用下述任何方法修饰用于制备转导载体的细胞系，以增加载体蛋白质的制备，例如通过将RNAi或反义序列引入敲除基因，该敲除基因降低限制载体制备的基因的表达，或者通过引入增加载体制备的序列。还可以将编码细胞或病毒增强子的序列工程化到细胞系中(例如使用额外的质粒载体)，例如疱疹病毒、乙型肝炎病毒，它们作用于HIVLTR以增加病毒产物或细胞反式激活蛋白质的水平。细胞反式激活蛋白质包括例如NF-kB、UV光响应因子、和T细胞活化因子。

可以用组成型DNA常规转化细胞系，例如使用电穿孔、磷酸钙、脂质体等，以将DNA引入细胞内。细胞可以被共转化(即使用辅助载体和转移载体)，或者可以在分别的步骤中转换它们，其中每个步骤包括引入不同的载体。

在能有效制备转导载体的条件下培养细胞。所述条件包括例如获得蛋白质制备所需的特定环境。所述环境包括例如：适当的缓冲液、氧化剂、还原剂、pH、共因子、温度、离子浓度、在细胞使用时的合适细胞年龄和/或阶段(例如在细胞周期的特定部分，或处于表达特定基因的特定阶段)、培育条件(包括细胞介质、底物、氧、二氧化碳、葡萄糖和其它糖底物、血清、生长因子等)。

转导效率

除了上述包膜修饰外，刺激细胞以提高转导不限于表达细胞表面上的配体。通过用至少两种类型的载体转导细胞，可以进一步提高体外或体内的转导效率。第一载体称为“促进载体”，其中所述载体可制备蛋白质或配体，它们可刺激靶细胞更易于接纳掺入表达治疗或其它相关序列的转导载体。为了产生高效的载体介导的转导，除了用于刺激靶细胞的蛋白质、配体或因子外，促进载体可以进一步包括安全或自杀基因。这样，促进载体可以表达转导载体高效转导所需的蛋白质、表面配体、或因子，然后一旦转导载体介导了靶细胞群的高效转导，就将它们从靶细胞混合物中去除。这种方法可以用于转导干细胞，其中至少一种促进载体可以表达SCF、TPO和Flt-3配体的组合，各促进载体包含安全或自杀基因，一旦将前药添加到细胞群中，所述基因就会减少群内的细胞。安全或自杀基因在本领域中是已知的，在本申请下文中有更详细的描述。任选地，促进载体可以表达来自可诱导启动子的蛋白质、因子或配体，该启动子可以单独或与安全或自杀基因组合联合使用。将可诱导体系与安全或自杀基因分层可以用于提高蛋白质/因子/配体/RNA/反义等制备的敏感性和特异性(可诱导体系可以被制成组织特异性的)、和安全或自杀基因的表达。来自促进载体的蛋白质/因子/配体/RNAi的表达可以任选地由组织特异性启动子表达，以限制促进载体向特定细胞类型表达序列。在优选实施方案中，将促进载体添加到具有最小刺激的细胞群内，从而没有靶细胞被优先转导以表达靶细胞刺激因子，但仍然用安全或自杀基因标记，从而它们可以在后期被去除。在一段时间后(在添加促进载体后至少1小时到长达几周，但优选第二天)，为了高效介导转导，将转导载体添加到细胞中。

细胞系

本发明还提供了开发下述细胞系的方法，该细胞系的生长性增强、对介质所含昂贵因素的依赖减少、能产生更高的蛋白质收率、并能产生更高的载体颗粒滴度。例如，近期已经报道HEK 293细胞可特异性提高细胞受体的表达，通过向细胞培养基中添加特异性配体，它们显示出可提高增殖潜能(Allison等，Bioprocess International 3：1，38-45，2005)。优选实施方案是表达有关HEK 293细胞的配体蛋白质的最佳组合的多种慢病毒载体，然后通过高通量方法将细胞分类，以分离包含多个慢病毒载体拷贝的HEK 293细胞克隆。这些细胞包含HIV载体的组合，所述载体表达HIV载体内所含的多种不同的配体基因拷贝。配体基因可以被密码子优化或添加突变，以进一步提高它们的表达。优选的组合包含在最终分离的克隆细胞内表达的多个配体蛋白质拷贝，最终分离克隆细胞然后可能具有多种用途。可以用于蛋白质或抗体(包括单克隆、人化、单链)制备。还可以用于制备载体，例如但不限于慢病毒载体。可以仅仅容易地从这些现在优化的细胞系中制备其它载体如Adeno和Adeno相关载体、鼠逆转录病毒载体、SV40载体和其它载体。在HEK 293细胞中显示表达/活性增加的受体及其配体的列表包括例如：AXL受体(gas6)；EGF受体(EGF)、趋化因子受体(fractalline)；PDGF受体，β(PDGF)；IL-15R-α；IL-2R-α；趋化因子受体2(MCP1)；IL-2R、γ；IL-1R-1；CSF-1受体；制瘤素受体；IL-4R；维生素D3受体；neuropilin1(VEGF)；巨噬细胞刺激性受体1(MSP)；NGF-R；PDGFR-α受体；IL-11-R，例如α；IL-10-R，例如β；FGF-R-4(aFGF)；BMP受体，例如II型(BMP-2)；TGF-R，例如β受体II(TGF-β)；FGF-R-1(bFGF)；趋化因子受体4(SFD1a)；干扰因子γ受体1和2。参见BioProcess International，January 2005.表1，“Growth factor/cytokine receptors expressed by HEK-293”。这些细胞将具有更高的蛋白质和载体制备潜能，将较少依赖于介质中包含的配体因子的存在，因为细胞本身将制备这些因子并将它们分泌到介质中。

对于其它细胞类型如CHO细胞，其它受体-配体组合可能是重要的。例如认为胰岛素生长受体I、胰岛素生长因子和胰岛素在细胞内具有抗凋亡活性。可以构建多种慢病毒载体，从而将胰岛素生长因子受体(I或II)、胰岛素生长因子(I或II)、胰岛素和需要制备的靶蛋白质全部包含在载体内，用于转导制备细胞如CHO细胞，并选择适当的克隆，优选使用高通量方法，以选择显示极高靶蛋白制备的克隆。最佳克隆不可以是高度表达所有工程化的基因或基因表达抑制物的细胞，而是各基因的最佳表达水平，对于一些可以是低水平表达。慢病毒载体体系和使用多种慢病毒载体来工程化所述细胞系的价值在于，各载体拷贝数目任意或随机分布到用慢病毒载体混合物转导的细胞群内，因此通过改变混合物中各载体的量，可以优化每个单独的第二基因或抑制序列的拷贝数目。载体和第二基因或基因抑制序列的优选组合是各慢病毒载体表达需要制备的感兴趣的蛋白质，此外任选地，表达通过影响制备细胞的存活力或一些方面直接或间接提高蛋白质收率、或载体收率的至少一种RNAi或基因。然而，为了提高这些第二序列的作用，包含仅表达第二基因或基因表达抑制物的至少一种慢病毒载体也是有益的。

可以工程化到慢病毒载体内以正面影响胰岛素生长因子受体途径、细胞生长和存活力的其它基因(或所述基因的抑制物)有：Akt基因家族成员(Akt1、Akt2、Akt3)、p13K、Ras、Raf、MEK、MAPK p42、MAPK p44、14-3-3蛋白质、Bad、和Grb/SOS。为了刺激相关途径，结合至所述途径适当受体的配体可以由慢病毒载体表达，从而为细胞提供适当的信号，来正面影响细胞的蛋白质、载体(不限于慢病毒载体)或疫苗制备。在一些情况下，可能优选的是慢病毒载体既表达受体和也表达配体，以刺激特定的途径。还可以构建嵌合受体，以产生特定途径的特定刺激。这样还可以减少需要在细胞内生成的配体数目，因为一种配体可以通过嵌合受体刺激多种途径，嵌合受体具有相同的配体结构区域但不同的胞内信号区域。相反，还可以使用包含不同结合区域和相同信号区域的嵌合受体来调整所刺激的途径类型。嵌合受体在本领域中是已知的，本发明不仅能用于蛋白质、疫苗或载体制备，而且能用于基因疗法。其它基因在由慢病毒载体过度表达(或由RNAi、反义、核酶等抑制)后也可以正面影响细胞如CHO或293细胞(非限制性实例)内蛋白质、疫苗或载体制备，这些基因有：骨巨噬细胞蛋白质-2、PACEsol、磷脂酶D PBK(磷酸肌醇3-激酶)、p70S6K(p70 S6激酶)和ERK(胞外信号调节的激酶)、CDKN1、CCNB1、CDC20、CDK20、CDK4、CDKN3、CCNC、BMP1、MADH4、GA4、RCA、ATPS、HAT4、GAPDH、SP3、TCEBIL、TFAP2B、SMARCA4、EIF4E、RAB2、D1 S155E、SSI-1、WT1、MYC、TSG101、SHC3、PHB、TCF 12、NHX、E2F4、TAF3C、STAT6、BCL2、NERF-2、POU2F1、NFKB1、EIF4E、BMI1、MYBL2、PIM1、KRAS2、RPA1A、JUNB、ABL1、TIM、SAS、AKT1、CSF3R、BCR、MXI1、TNFAIP6、AIP1、ILK、PTK2、CSK、CSNK2B、GK、PRKCA、MADH2、LIMK1、PIK3CA、PRKCd、PPP6C、细胞PrP，和参与生长、代谢、细胞周期和发生的其它蛋白质类型。优选实施方案是在慢病毒载体包装或制备细胞中，表达靶向细胞朊病毒蛋白质(PrP)、BSE或可以损害细胞系的其它不利物质的RNAi。作为非限制性实例，进一步优选的实施方案是表达细胞PrP抑制物如抗PrP RNAi的辅助构件或包装细胞系。相反，所述蛋白质可以由RNAi等过度表达或抑制，以用于疾病如遗传疾病、HIV/AIDS或癌症的基因疗法。用于治疗用途的优选慢病毒载体组合物是可正面影响体内蛋白质制备的单克隆抗体或蛋白质(或多种蛋白质)和至少第二基因(或基因抑制物如RNAi)的表达。第二基因或基因抑制物不限于用于体内蛋白质制备的胞内蛋白质，而可以是影响免疫响应、身体代谢、激素或细胞因子制备的蛋白质。作为对可诱导启动子体系或体内所含一些因子如蛋白质、病毒或在疾病过程中产生的因子的响应，可以产生第二基因(至少一种第二基因)或基因抑制物(至少一种第二基因抑制物)。这样，通过制备第二基因，可以调整第一蛋白质或抗体(例如单克隆、人化、单链)的制备。参与人蛋白质正确糖基化的蛋白质也可以由慢病毒载体在需要制备的蛋白质之后表达。来自某些物种类的糖基化可以引起对蛋白质如单克隆抗体的有害作用，因此表达产生那些特定糖基化模式的那些酶的抑制物将增加重组蛋白质产物的安全性和效率。例如，源自小鼠和其它哺乳动物的细胞系糖基化与人糖基化非常相似。然而，几个显著的区别可能影响产物的质量以及生物活性。大多数鼠源细胞系(例如NSO细胞)包含额外的糖基化酶。将该酶称为α1，3-半乳糖基转移酶；它介导将来自α构型UDPGal的Gal残基转移到内部和/或暴露的Gal残基。人具有针对α-Gal抗原决定簇的抗体。尽管没有文献证据提出rIgG上α-Gal抗原决定簇的存在能对人产生免疫性，但管理机构可能会对包含α-Gal残基的治疗性糖蛋白产生关注。因此要增强更优化的人用蛋白糖基化，可以将靶向鼠α1，3-半乳糖基转移酶的RNAi(或类似抑制物)插入慢病毒载体内，以产生缺少鼠α1，3-半乳糖基转移酶蛋白质或鼠α1，3-半乳糖基转移酶蛋白质水平降低的细胞系，从而使治疗性糖蛋白上不存在α-Gal残基。另一个实例是存在于啮齿动物细胞如CHO细胞内的CMP-N-乙酰神经氨酸羟化酶。该酶在人体内不以活性形式表达，证据显示重组治疗糖蛋白中存在Neu5Gc可能导致免疫响应。通过包含靶向该酶的RNAi或反义RAN序列，可以工程化慢病毒载体，使之即包含感兴趣的蛋白质基因，又降低中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系内的CMP-Neu5 Ac羟化酶活性从而降低所得糖共轭物的Neu5Gc含量。所述两个实例并不是限制性的，通过抑制不想要的酶/因子，或通过过度表达所需的酶以提高或优化所需蛋白质或待制备因子的性质，还可以靶向参与糖基化或其它细胞过程的其它酶。

RNAi还可以靶向潜在的不需要的病毒或随发性病毒，或者不希望在用于制备载体、蛋白质、因子或疫苗的细胞系中有复制的任何病毒或细菌。例如，可以用RNAi技术靶向支原体核糖体或信使RNA，以防止支原体和污染物的复制。这种抑制细胞内随发性病毒或细胞复制的方法可以延伸用于制备其它病毒载体(例如腺病毒载体、Adeno感兴趣的病毒载体、疱疹病毒载体、多瘤病毒基载体、逆转录病毒载体和慢病毒载体)或疫苗(例如流感、天花、风疹、埃博拉病毒、牛痘)。在ncbi.nlm.mh.gov/genomes/VIRUSES/viruses.html可以找到可用所述方法靶向的完整病毒列表。cDNAs和RNAi在载体制备体系中的表达可以用于进一步提高HIV载体制备。例如刺激细胞生长的基因可以提高细胞的生物合成，并因此导致的更高的细胞HIV载体制备，和更高的滴度载体。可以被过度表达的基因是如下基因：它们能提高碳水化合物代谢、能量代谢、参与共栖生物的生物降解的蛋白质、核酸和氨基酸代谢、mRNA的转录或可活化细胞分化和生长的蛋白质或基因如BcL-2的翻译。此外，通过抑制减缓或阻断细胞生长的基因、或抑制HIV载体颗粒制备的基因，RNAi技术可以用于提高载体制备。例如，靶向蛋白质的RNAi可以抑制细胞分化、细胞生长、细胞代谢、核酸和氨基酸代谢、mRNA转录或蛋白质翻译，从而提高HIV载体颗粒的制备。可以在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/找到所述基因及其已知途径的完整列表。可以使用几种方法来增加细胞系制备慢病毒载体。首先，可以将来自人或另一有机体的cDNA库用包装构件共转染或插入HIV载体中，用于转导进入包含制备HIV载体颗粒所需基因的包装细胞内。可以在多孔模板中自动进行所述方法的每个步骤，以进一步提高体系的生产量。

另一个实施方案包括靶向慢病毒载体中除要表达的感兴趣基因之外的蛋白酶基因的基因抑制物如RNAi，或者所述蛋白酶基因位于另外的慢病毒载体中，但该另外的慢病毒载体作为混合物添加到细胞中，从而使细胞被包含感兴趣的基因的载体和表达RNAi的载体两者转导，优选所述RNAi靶向所述蛋白酶基因或不想要的另一基因。被靶向的蛋白酶可以是任何单个蛋白酶或蛋白酶的组合，它们可以不利地影响所需蛋白质或所需感兴趣的因子的制备或纯化。蛋白质家族及具体的非限制实例为：半胱氨酸蛋白酶如Caspases、组织蛋白酶；锌蛋白酶(金属蛋白酶)如羧肽酶、各种底物金属蛋白酶；丝氨酸蛋白酶如胰岛素、糜蛋白酶、和弹性蛋白酶。在细胞系的蛋白质制备相过程中，泛素途径也可以是有用的靶。可以将RNAi插入靶向泛素、泛素活化酶(E1)、泛素共轭酶(E2)和/或泛素蛋白连接酶(E3)的慢病毒载体中。优选靶向泛素途径的RNAi由可诱导的启动子表达，从而仅在特定的时间段过程中发生泛素化的抑制。对靶向泛素的RNAi的诱导并非对本发明的限制，慢病毒载体结构性地表达靶向蛋白酶的RNAi，优选参与细胞死亡的蛋白酶是理想的。所述蛋白酶包括但不限于天冬氨酸盐特异性半胱氨酸蛋白酶(ASCPs)、丝氨酸蛋白酶如Omi/HtrA2、capases、硫醇蛋白酶的ICE家族如ICE/CED-3蛋白酶、粒酶B。可选择地，载体可以表达抑制凋亡的基因如IAP蛋白质。所述用于调整细胞表现型的方法并不限于细胞内的蛋白质制备，还可以用于产生转基因动物，以及用于疫苗和治疗目的。这些申请的优选实施方案是由组织特异性启动子表达第二基因或基因抑制序列。

关于慢病毒载体内存在的任何第二基因，进一步优选的实施方案是用氨基酸序列标记蛋白质，从而允许从包含需要纯化的蛋白质的蛋白质混合物中迅速除去该第二蛋白质。这样，通过使用一个普通氨基酸序列标记，可以迅速除去第二蛋白质的任何蛋白质组合，从而可以迅速纯化目标蛋白质。目标蛋白质可以具有不同的标记，或者可以根本没有标记，如果目的是制备和纯化天然蛋白质，则这样是优选的。相反，感兴趣的蛋白质可以被单独标记。而且，所述载体可以在体内用于人基因疗法和产生转基因小鼠；并不只限于用于体外体系。

制备多肽的方法

本发明还提供了利用慢病毒转导载体(如本文公开的转导载体)来制备多肽的方法、和所述方法的产物。该方法可以包括一个或多个下列步骤，例如：用慢病毒转导载体转导宿主细胞，以形成经转导的宿主细胞，其中所述载体包含编码感兴趣的异源多肽的可表达形异源多核苷酸；在能有效制备所述感兴趣的多肽的条件下培养所述经转导的宿主细胞；从所述宿主分离多肽，当多肽被分泌到培养基中时，从培养基中分离。编码多肽的异源多核苷酸序列可以包括转录、翻译、和/或分泌到介质内(例如分泌序列)所必需的任何其它序列。根据本发明，可以转导任何细胞系，包括本文所述的任何细胞系，尤其是例如CHO(例如CHO DG44)和HEK293(例如HEK293F)。

可以常规制备转导载体，包括按照本文所述的方法。例如，在能有效制备功能性转导载体的条件下，可以用辅助质粒(包含合适的包膜和gag/pol前体)和包含异源编码序列的转移载体来转化制备细胞系。可以根据转导目标宿主细胞的能力选择包膜蛋白质，在该宿主细胞中不会制备该多肽。对于制备流感疫苗，优选下列细胞系和相应的包膜蛋白质，例如293或CHO；VSV-G、ampho、Mokola、和Paramyxoviridae(例如参见互联网ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/Ictv/fs jaram.htm)。

宿主细胞的实例包括例如哺乳动物细胞；人细胞如A2058黑素瘤、C3A肝、G-402肾、C8166T-细胞、Caco-2克隆、和K562骨髓；CHO；293F、293 FT等，包括上文和下文所述、ATCC网址(www.atcc.org)上存在的其它细胞系、和其它细胞来源。

可以表达任何合适或所需的异源序列，包括例如：疫苗、干扰素(α、β、γ、ε)、红细胞生成素、因子III、凝结因子、抗体及其片段(例如包括单链、Fab、和人化的)、胰岛素、趋化因子、细胞因子、生长因子、血管生成调节因子、凋亡调节因子等。可以常规制备单链抗体(例如单链可变片段或“scFv”)。

在本发明的某些实施方案中，慢病毒转导载体可以用于制备用作疫苗的抗原制剂。可以根据本发明制备任何合适的抗原，包括获自朊病毒、病毒、分支杆菌、原生动物(例如疟原虫(疟疾))、锥体虫、细菌(例如链球菌、Neisseria等)的抗原。

可以用包含一个或多个异源多核苷酸序列的单一慢病毒载体转导宿主细胞，或者使用多个慢病毒载体，其中每个载体包含相同或不同的异源多核苷酸序列。例如，通过在单独载体上表达单独的亚单位，但用所有载体感染相同的宿主细胞，从而在细胞内发生组装，可以制备多亚单位抗原(包括细胞内和细胞表面的多个亚单位成分)。

疫苗通常包含多种抗原成分，例如源自不同蛋白质、和/或源自相同蛋白质的不同抗原决定簇。例如，对抗病毒疾病的疫苗可以包含获自该病毒的一种或多种多肽序列，其中当施用至宿主时，该疫苗能引发免疫或保护响应来对抗病毒。

如上所述，本发明还可以用于制备多肽多聚体，例如其中制备的抗原制剂包括不止一种多肽。例如，病毒壳体可以由多于一种多肽亚单位组成。用携带不同病毒包膜序列的载体转导宿主细胞，当在细胞内表达时，蛋白质可以自组装成包含多于一种蛋白质亚单位的三维结构(例如以其天然构型)。该结构可以拥有功能活性，包括抗原活性、酶活性、细胞结构活性等。此外，当在合适的细胞系内表达时，它们可以被分泌到细胞培养基内，从而促进纯化。例如，当使用慢病毒转导载体将流感N和H衣壳蛋白质、和任选的M蛋白质(参见下面)引入制备细胞系内时，可以在细胞内形成空衣壳或病毒样颗粒(VLP)，然后分泌到培养基内。可以常规分离和纯化所述VLP，然后作为流感疫苗施用。VLP是例如自组装的衣壳，其中不包含实质量(例如没有)的病毒RNA。VLP优选可以引发免疫响应，该响应可有效地提供至少一定程度的保护来对抗天然的感染性病毒颗粒，或至少引发针对其的抗体。

目前，有许多可利用的病毒疫苗，包括用于疾病如麻疹、腮腺炎、肝炎(甲型和乙型)、风疹、流感、polio、天花、水痘、腺病毒、日本脑炎、狂犬病、埃博拉等的疫苗。本发明可以用来制备针对任何上述疾病的疫苗。

慢病毒转导体系是特别有益的，因为它们可缩短开发和制备有效流感疫苗的时间，从而使得公共健康部门更快速地对变化中的流感疾病模式作出反应。目前，流感病毒，尤其是A型和B型菌株是世界范围内严重疾病和死亡的主要原因。在美国，流感在所有死亡原因中排列第七，导致高数目的住院(200,000)、工作损失天数(7千万)、和受限的活动天数(34亿6千万)，从而造成显著的经济影响。参见例如dhhs.gov/nvpo/influenza vaccines.html。流感A病毒的表面抗原频繁变化，而B型流感病毒的改变不那么频繁。一种菌株感染后的免疫性不能完全对抗随后的抗原变体。结果是，每年必须设计对抗流感的新疫苗来匹配最可能引起下一次流行的循环菌株。世界卫生组织建立了流感监视网络，每年推荐流感疫苗组合物。与目前使用的标准鸡蛋技术相比，本发明的慢病毒转导体系可显著降低制备有效疫苗所需的时间，例如前者可能用八个月，而使用本文所述的方法只占用例如五周或更少时间。

可根据本发明为其制备疫苗的病毒实例包括例如：正粘病毒、流感病毒A(包括HA和NA蛋白质不同的所有菌株，例如(非限制性实例)H1N1、H1N2、H2N2、H3N2、H7N7和H3N8)；流感B、流感C、thogoto病毒(包括hori、Batken病毒、SiAR 126病毒)、和isavirus(例如感染性大马哈鱼贫血病毒)。其中包括从所有物种分离出或传播的流感，包括来自无脊椎动物、脊椎动物、哺乳动物、人类、非人灵长类、猴子、猪、牛、和其它家畜、鸟类、驯养家畜如火鸡、鸡、鹌鹑和鸭、野鸟(包括水生和陆生鸟类)、爬虫等的分离物。其中还包括已经通过例如突变、抗原漂移、抗原转变、重组等改变的已有菌株，尤其是毒性和/或种间传播(例如人对人)已经增加的菌株。

特别感兴趣的是如下流感病毒，它们是动物共患病的和/或跨物种的，因为它们有广阔的宿主范围，或者因为在受宿主体内的重组，和/或由于天然或直接的突变。例如，H5N1(参考病毒上存在的表面抗原亚型，血凝素5型和神经氨酸酶1型)是鸟流感A的亚型，它引起亚洲驯养鸟类中的流感暴发。到2005年11月为止，超过1亿2千万鸟类受感染而死，或者被杀死以防止进一步传播。这种病毒还会传感给人类宿主(“鸟流感”)，在人类宿主中具有很高的致命性。

流感抗原制剂(例如疫苗)可以包含天然存在于流感病病毒颗粒中的一种或多种多肽。然而，优选不包含能产生天然致病病毒的任何多肽基因。这些多肽基因包括例如血凝素(由HA基本编码)、神经氨酸酶(由NA基因编码)、核蛋白(由NA基因编码)、基质(M1)蛋白(由M基因编码)、M2(由M基因编码)、非结构蛋白(由NS基因编码)、和聚合酶。天然病病毒颗粒覆盖在脂质双层中，脂质双层“镶满”完整蛋白质H和N(“衣壳层”)。基质蛋白(M1)在病毒膜下形成蛋白质层(“基质层”)，这些蛋白质涉及病毒组装、稳定性和完整性。参见例如Harris等，Virol.289：34-44，2001。M2蛋白质是膜蛋白离子通道。本发明的VLP可以包含H、N、和任选的M1和M2蛋白。所述蛋白的序列在本领域中是已知的，和/或可以在GenBank中鉴定。参见例如Widjaja等J Virol，78：8771-8779，2004关于M1和M2序列。

可以将它们分别克隆到不同的转移载体上或位于同一质粒上，并用于制备转导载体。在本发明的一个实施方案中，可以制备多个转导载体，它们分别包含独特的流感基因序列(例如编码H、N、M1，以形成三种不同的转导载体)。当这些载体在同一宿主细胞内共同表达时(例如CHO或293)，就形成可以分泌到介质中的自组装VLP，离心分离它，然后作为疫苗施用。

流感A H5.已经鉴别了至少九种H5亚型。已经在人群中记载有H5感染，例如目前在亚洲和欧洲流行的HPAI H5N1，它们可以引起严重的疾病或死亡。

流感AH7.已经鉴别了至少九种H7亚型。H7感染在人中很少见，但可以在直接接触过感染鸟类的人中发生。症状包括结膜炎和/或上呼吸症状。H7病毒包括例如H7N2、H7N7和H7N3，已经在人类中引起过中等至严重的致命疾病。H亚型在流行病学上最重要，因为它们控制着病毒结合并进入细胞的能力，然后病毒会在那里增殖。N亚型控制着新形成的病毒从细胞中的释放。

流感A H9.已经鉴别了至少九种H9亚型。极少报告流感A H9感染人类。然而有报道当感染H9菌株时儿童具有流感样症状。

本发明提供了疫苗来对抗所有鸟流感亚型(例如H和N亚型)，包括已有亚型、其衍生物、及其重组物，例如可以从人传播至人的亚型和重组物。已经描绘了各种分离物，尤其是H5亚型。参见例如Stem-Ramirez，J.Virol，2004，78，4892-4901；Guan等，Proc.Nat l.Acad.Sci，2004，101，81 56-8161。

本发明的转导载体可以用于高水平制备异源蛋白，例如当所述蛋白质分泌到培养基中时，每毫升未处理的培养基可制备约0.1至约0.3mg/ml或更高的重组异源蛋白。

本发明还提供了制备抗体的方法。例如，提供了制备单克隆抗体(例如人、小鼠和其它哺乳动物类型)的方法，而不需要杂交瘤细胞或动物模型。在一个非限制性实例中，将表达致瘤蛋白的慢病毒载体转导到前面已经用抗原刺激的小鼠外周血B细胞上。这些载体可有效地转导小鼠细胞，使得它们成为抗原制备细胞。在第二个非限制性实例中，制备了两种慢病毒载体，一种表达抗体重链，而第二载体表达抗体轻链。基因的恒定区域源自人(或如果需要，来自其它物种)的免疫球蛋白基因(例如IgG、IgM或免疫球蛋白的其它类型)。基因的可变区域被修饰的或退化以产生差异。通过本领域已知的任何合适技术可以获得退化序列并克隆到慢病毒载体内，以产生表达重或轻免疫球蛋白分子的慢病毒载体库。通过用两种载体转导细胞以产生包含重链和轻链的功能抗体，可以制备抗体。可以筛选经转导的并进行表达的细胞，与抗原结合，然后可以分离阳性抗原并进行多轮亲和力成熟。

所述方法的优点是以无偏好方法制备了抗体。其它方法如常规的杂交瘤细胞和Xenomouse技术依赖于B细胞，该B细胞已经进行了克隆选择并删除了特定的抗体克隆，因为它们对内生的例如小鼠组织有反应性。一些这些被删除的克隆可能作为抗体是有价值的，因为它们可以与人抗原相互反应。所述方法的优点在于：没有删除分子抗体克隆，它们全部以无偏倚的方法分析，并且不是完全人化(如果需要人化)的抗体分子。慢病毒载体的另一个优点在于：可以以高度多样性将基因转导到细胞内，以在一个细胞内制备多种抗体类型。这减少了需要制备形成包含极多样抗原结合位置库的细胞数目。第二个优点是将重链基因和轻链基因置于不同的慢病毒载体内，从而通过以高于1的感染多样性转导细胞，可以产生额外的多样性。例如，如果使用MOI为10来将分别表达重链和轻链的慢病毒载体转导给细胞，则在各细胞中制备的抗体组合数目为100。因此在96孔板中，当单个孔中存在约10,000个细胞时，则在96孔板的单个孔中，用该方法可以产生的可能变种数目为1,000,000。因此，按照比例，使用该方法可以产生大量抗体变种。该方法不限于对于细胞的各构件应用MOI为10，如果需要，也可以使用更高的MOI。例如，如果使MOI为100，则各细胞可以制备10,000个变种抗体，96孔板的各孔可以制备10,000,000,000个变种。因此每个96孔板可以制备1×10¹²个变种抗体分子，这些分子可以进行筛选对抗靶抗原，在本领域中有许多已知筛选方法(例如ELISA)。一旦已经鉴定特定的孔产生了所需的抗体反应，则通过限制稀释可以克隆抗体，以找到表达正确抗体的细胞。一旦鉴定了该克隆，则可以使用PCR克隆出表达重和轻抗体链的载体。然后可以用辅助构件转染载体DNA以制备载体。可选择地，可以直接用辅助构件转染该细胞克隆(PEI、磷酸钙、脂质转染、或本领域已知的其它转染方法)，以制备变种慢病毒载体。然后可以将所制备的载体滴定，然后以较低MOI转导细胞，但细胞的量更大，以分离制备相关抗体的克隆。一旦分离了细胞克隆，就可以通过用较高感染多样性转导细胞，将抗体制备成较高滴度，相同的方法不限于完整的抗体分子，还可以用于单链抗体、抗体片段、噬菌体展示和其它抗体样分子，所有这些在本领域中均是已知的。除了表达抗体外，载体还能表达其它基因以提高单克隆抗体的制备，或者提高它们的收率。这些基因可能是致癌基因，例如ras和myc，也可以使用其它基因，例如抗凋亡基因如Bcl-2。而且，这些载体可以用于从已经暴露于抗原的动物的血B细胞中产生单克隆抗体。例如通过使用致癌基因组合或基因沉默RNA，可以将来自暴露于抗原的小鼠的B细胞转换为骨髓瘤细胞。这些基因包括例如：生长因子，包括例如双调蛋白、B-淋巴细胞刺激剂、白介素16(IL 16)、胸腺生成素、TRAIL、Apo-2、Pre B细胞克隆增强因子、表皮分化感兴趣的因子1(EDF1)、表皮单核细胞活化多肽II、巨噬细胞迁移抑制因子MIF、天然杀伤细胞增强因子(NKEFA)、骨生成蛋白8(骨生成蛋白2)、骨生成蛋白6、连接因子生长因子(CTGF)、CGI-149蛋白(神经内分泌分化因子)、细胞因子A3(巨噬细胞炎性蛋白1-α)、Glialblastoma细胞分化感兴趣的蛋白(GBDR1)、肝细胞瘤源生长因子、神经介肽U-25前体、任何肿瘤基因、致癌基因、原致癌基因或细胞调节基因(可以在condor.bcm.tmc.edu/oncogene中找到)、血管表皮生长因子(VEGF)、血管表皮生长因子B(VEGF-B)、T-细胞特异性RANTES前体、胸腺树枝细胞源因子1；受体，例如Activin A受体II型(ACVR2)、β-信号序列受体(SSR2)、CD 14单核细胞LPS受体、CD36(胶原型1/血小板反应蛋白受体)样2、CD44R(Hermes抗原gp90自导受体)、G蛋白偶联受体9、趋化因子C×C受体4、克隆刺激因子2受体β(CSF2RB)、FLT-3受体酪氨酸激酶、类似于暂时受体的潜在C受体、杀伤细胞血凝素样受体亚族B、低密度脂蛋白受体基因、低亲和力Fc-γ受体HC、MCP-1受体、单核细胞化学趋化物1受体(CCR2)、核受体亚族4、组A、成员1、孤儿G蛋白偶联受体GPRC5D、过氧化物酶增殖活化受体γ-Pheromore相关受体(rat)、后叶加压素活化的钙迁移假定受体(Vasopression-activated calcium mobilizing putative receptor)、视黄酸x受体、Toll-样受体6、透膜活化剂和CAML相互作用剂(TACI)、B细胞成熟肽(BCMA)、CSF-1受体、干扰素(α、β和γ)受体1(IFNAR1)。可以调整以增加抗体制备的途径包括例如泛素/蛋白体；telpmerase；FGFR3；和McI-1。可以被靶向以提高抗体制备的其它基因包括下表所列的那些：

骨髓瘤细胞系和非骨髓瘤细胞系之间的差异表达(Claudio et.al.Blood，Vol/100，Issue6，2175-2186，September15，2002)
				克隆识别	基因/克隆匹配	序号	Unlgene
上调的PCL1920PCL0833PCL2440MYE4362PCL1712PCL2089PCL1633PCL0849PCL1492MYE4007BCMAPCL1414PCL1515PCL0308PCL0940MYE2868MYE2693PCL5267MYE3869a	葡萄糖调节的蛋白质58kDa(MGC3178)染色体组基因(染色体2克隆RP11-218L22)来自cDNA克隆IMAGE：1694766 3’的EST染色体组DNA克隆(染色体14BACR-214N1)孕酮受体膜组分-2(PGRMC2)假定的蛋白质FLJ22332(c2h2型，锌手指)染色体组DNA克隆(来自7的BAC CTD 2022G18)多发性骨髓瘤致瘤基因-1(MU M1)/(IPF4)骨髓瘤EST PCL1492BUP蛋白质B细胞成熟蛋白(BCMA)肿瘤排斥抗原-1(TRA1)与粘液素2前体弱相似蛋白酶体(α亚单位，2型)(PSMA2)硒蛋白T骨髓瘤EST MYE2868信号识别颗粒14kD(SRP14)骨髓瘤EST PCL5267骨髓瘤EST MYE3869a	12345678910111213141516171819	Hs.289101Hs.134923Hs.9071Hs.111092Hs.82132Hs.35660Hs.2556Hs.82689Hs.20183Hs.181309Hs.8148Hs.180394

PCL5298PCL1662PCL0105MYE4521PCL4099PCL1657MYE2821MYE4493PCL3222MYE1378aMYE2209MYE4932PCL3824PCL4079PCLA441下调的PCLA897PCL5225PCL0639MYE3255aPCL4678PCL2015PCL3726PCL3287PCL4214MYE5079PCL1818MYE2310PCL3027MYE3019PCL1701MYE1012PCL2226

与脑特异性血管生成抑制因子-1(BAI-1)相似与有丝分裂纺锤体组装的染色体蛋白相似CD138/syndecan-1(SDC1)膜连蛋白A2，脂皮素II，依钙(结合)蛋白I染色体组DNA克隆(BAC CTA-227L24，7q21.1-q21.2)假设的蛋白质FLJ11200核糖体蛋白L4(RPL4)DNA结合蛋白CPBP骨髓瘤EST PCL3222假定的蛋白质F LJ10055(与具有WD重复的蛋白质相似)热休克70kDa蛋白5X盒结合蛋白-1(XB P1)PIM-2染色体组DNA克隆(染色体5克隆CTC-504A5)羰基还原酶-1(CBR1)层连蛋白受体-1(67kD，核糖体蛋白SA)骨髓瘤EST PCL3222骨髓瘤EST PCL0639核糖体蛋白S2(RPS2)核仁磷酸蛋白骨髓瘤EST PCL2015淋巴细胞胞质蛋白-1(L-丝束蛋白)肿瘤蛋白，翻译性控制的-1(TPT1)蛋白磷酸酶2，调控亚单位B(PPP2R2A)核糖体蛋白S2(RPS2)高迁移率族蛋白-1(HMG1)3-磷酸甘油醛脱氢酶骨髓瘤EST PCL3027核糖体蛋白L31(RPL31)肌动蛋白，γ-1(ACTGI)骨髓瘤EST MYE1012核糖体蛋白L10(RPL10)

2021222324252627282930313233341234567891011121314151617

Hs.16773HS.82109Hs.217493Hs.107381Hs.286Hs.285313Hs.9398Hs.75410Hs.149923Hs.80205Hs.88778Hs.181357Hs.182426Hs.9614Hs.76506HS.279860Hs.179574Hs.182426Hs.337757Hs.169476Hs.184014Hs.14376Hs.29797

MYE2056

核糖体蛋白L5(RPL5)

18

Hs.180946

克隆	序列	与已知蛋白质或结构域的同源	登录号
				MYE4005MYE3305MYEE6227PCL1515PCL5298PCL1662PCL2089MYE1378PCL1215PCL1952PCL2063PCL2220PCL2520PCL2835PCL2999PCL3405MYE4184PCL3139PCL0758MYE1302MYE2885MYE5546MYE6872MYE5259MYE6738PCL0791MYE4229a	522523246251272160239410310235112191389132320401365375294410183347220218333235310	含SH2结构域的接头DEAD盒解螺旋酶torsinB和torsinA与粘液素弱相似与脑特异性血管生成抑制因子-1相似与有丝分裂纺锤体的染色体蛋白相似新的c2h2型锌手指与Trp Arp(WD)重复蛋白质相似Tigger1转座酶睾丸发育相关的NYD-SP19Pm5蛋白与GTP结合蛋白相似的DKFZp586D0222Ankyrin结构域v-rel鸟类网状内皮细胞增生病病毒致瘤基因APOBEC1(阿朴脂蛋白B编辑蛋白)促性腺激素诱导的转录因子-2与RAY/RABIC(RAYL)相似的GTP结合蛋白ZNF140样蛋白质与KIAA0790相似(52％)含PARP结构域的蛋白DKFZp566D244.1假定的蛋白质DKFZp434H132S68401(牛)葡萄糖诱导的基因(HS1119D91)与转录调节因子相似的假定蛋白质与Rad4相似的假定蛋白质DKFZP564C186含SH3结构域的蛋白质Plekstrin同源和FYVE锌手指结构域含FL20273蛋白的RNA识别基序	KM_032855.1AAC27435.1AAC51733.1A43932 BAA23647.1S41044 BC008901.1XM_008266.3U49973 AAK53407NM_014287AL136929.1Z70310XM_012000.2AK022802NM_016264.1XM_009956.1AF155656 AB018333 CAB59261.1XM_007645.3XM_009498.1AL117513 CAB43240 BC008374.1XM_016836.1NM_019027.1

MYE4229aCluster96PCL1850PCL2185PCL4352MYE4184PCL5805MYE4482MYE5150PCL1756PCL1178

310707215118376365210271132340286

含FL20273蛋白的RNA识别基序新的蛋白质二硫化物异构酶含Myb样DNA结合结构域的蛋白质与CDK5活化因子结合蛋白相似的FLJ13660与精氨酸/色氨酸富集的剪接因子-4相似的FLJ11021新的蛋白质二硫化物异构酶含BH3结构域的蛋白质MMTV受体变体-2(Mtvr2)与孕酮受体相连的p48相似瞬时型感受器潜在的C前体(GIP样蛋白质)含SAM结构域的蛋白质FLJ21610

NM_019027.1BC001199.1NM_022365.1XM_017042.1XM_016227.1XM_009956.1XM_002214.1AF052151.1XM_010011AP36951XM_015753.1

制备慢病毒转导载体的方法

本发明还提供了使用流通超速离心法(flow-through ultracentrifugation)和高速离心法、和切向流过滤来浓缩和纯化慢病毒载体的方法。流通超速离心法在过去已经用于纯化RNA肿瘤病毒(Toplin等，Applied Microbiology15：582-589，1967；Burger等，Journal of the National Cancer Institute 45：499-503，1970)。本发明提供了使用流通超速离心法来纯化慢病毒载体的方法。该方法可以包括一个或多个下列步骤。例如，可以使用细胞工厂或生物反应器体系由细胞制备慢病毒载体。可以使用瞬时转染体系(见上)，或者还可以类似地使用包装或制备细胞系。如果需要，可以在将材料装载到超速离心机之前采用预净化步骤。可以使用连续流动或批量沉淀进行流通超速离心。用于沉淀的材料为例如：氯化铯、酒石酸钾和溴化钾，它们可产生高密度和低粘度，尽管它们全部是腐蚀性的。CsCl经常用于工艺开发，因为它所产生的广泛密度梯度(1.0至1.9g/cm³)可以获得高纯度。溴化钾可以以高密度使用，但能只在升高的温度下，即25℃下使用，这与一些蛋白质的稳定性不相容。蔗糖被广泛使用，因为其廉价、无毒和可以形成适于分离大多数蛋白质、亚细胞部分和完整细胞的梯度。典型的最大密度为约1.3g/cm³。蔗糖的渗透性可能对细胞是有毒的，在这种情况下可以使用复合梯度材料，例如Nycodenz。梯度内可以具有1个或多个梯级。优选实施方案使用梯级蔗糖梯度。材料的体积优选为每轮0.5至约200升，流速优选每小时5至约25升。优选操作速度为25,000至40,500rpm，从而产生高至122,000×g的力。转子可以以所需体积部分静态卸载。优选实施方案以每份100ml卸载经离心的材料。然后可以使用凝胶过滤或尺寸排阻色谱法在所需的缓冲液中交换包含经纯化的和经浓缩的慢病毒载体的分离部分。可选择地，还可以使用阴离子或阳离子交换色谱，或者进行缓冲液交换或进一步纯化的其它方法。而且，如果需要，还可以将切向流动过滤用于缓冲液交换和最后的剂型。切向流动过滤(TFF)还可以用作替代步骤进行超速或高速离心，其中应该进行两步骤TFF程序。第一步骤将减少载体上清液的体积，而第二步骤将用于缓冲液交换、最后配方和更进一步浓缩材料。TFF膜的膜尺寸应为100至500千道尔顿，其中TFF第一步骤的优选膜尺寸应为500千道尔顿，而第二TFF的优选膜尺寸应为300至500千道尔顿。最后的缓冲液应包含允许载体长期贮存的材料。

本发明还提供了方法来浓缩和纯化慢病毒载体。该方法使用包含粘附细胞的细胞工厂，或者包含悬浮细胞的生物反应器，用载体和辅助构件将它们转染或转导以产生慢病毒载体。生物反应器的非限制性实例包括Wave生物反应器体系和Xcellerex生物反应器。两种都是抛弃型体系。然而也可以使用非抛弃型体系。构件可以是本文所述的那些，以及其它慢病毒转导载体。可选择地，可以制备细胞系以产生慢病毒载体，而不需要转导或转染。在转染后，可以收获并过滤慢病毒载体，以除去颗粒，然后使用连续流动高速或超速离心机来离心。优选实施方案使用高速连续流动装置如JCF-A带和具有高速离心机的连续流动转子。还优选将Contifuge Stratus离心机用于中等规模的慢病毒载体制备。还优选任何连续流动离心机，其中离心速度大于5,000×g RCF并小于26,000×g RCF。优选地，连续流动离心力为约10,500×g至23,500×g RCF，旋转时间为20小时至4小时，将较长的离心时间用于较慢的离心力。可以在更密集材料的衬垫(其非限制性实例为蔗糖，但可以使用其它试剂来形成衬垫，这在本领域中是公知的)上离心慢病毒载体，从而使慢病毒载体不会形成不可过滤的聚集物，聚集物是直接离心载体所面临的问题，会导致病毒载体球。连续流动离心到衬垫上使得载体避免形成大聚集物，并仍可以从产生慢病毒载体的大体积转染材料中将载体浓缩至高水平。而且，可以使用第二层较小密度的蔗糖来联合慢病毒载体制备物。连续流速离心机的流速优选为1至100ml/分钟，但也可以使用更高和更低的流速。调整流速以提供充足的时间使载体进入离心机核心，从而没有显著量的载体由于高流速而损失。如果需要更高的流速，可以然后将离开连续流动离心机的材料再循环，使它第二次经过离心机。在使用连续流动离心机浓缩载体后，可以使用切向流动过滤(TFF)进一步浓缩载体，或者TFF体系可以只用于缓冲液交换。TFF体系的非限制性实例是由GF-Healthcare制备的Xampler过滤器体系。优选的过滤器是MW限度为500,000MW或更少的过滤器。优选地，使用MW限度为300,000MW的过滤器。还可以使用100,000MW限度的过滤器。对于更大的体积，可以使用更大的过滤器，本领域技术人员将易于发现在最后填充载体制备物之前用于该最后缓冲液交换和/或浓缩步骤的正确的TFF体系。最后的填充制备物可以包含能稳定载体的因子-糖是常用的，也是本领域中已知的。

疫苗和HIV治疗

已知肿瘤细胞在细胞表面表达肿瘤特异性抗原。相信这些抗原具有差的免疫原性，主要因为它们代表致癌基因或通常存在于宿主体内的其它细胞基因的基因产物，因此不能清楚地被识别为非自身。尽管许多研究者已经试图靶向针对来自各种肿瘤特异性抗原的抗原决定簇的免疫响应，但没有人成功地激发足够的体内肿瘤免疫性。在过去30年中，记载有数千患者施用肿瘤细胞抗原作为疫苗制剂，但这些努力的结果证明肿瘤细胞免疫不能提供合理的基础来设计或构建有效的疫苗。即使当患者表达肿瘤特异性抗体或细胞毒性T细胞时，这种免疫响应也与相关疾病的抑制无关。免疫体系保护宿主的这种失败可能是由于免疫原性差的肿瘤抗原的表达，或者是由于各种肿瘤细胞特异性抗原的异源表达。适宜地呈递肿瘤抗原激发以有效抑制肿瘤生长的免疫响应仍然是开发有交癌症疫苗的关键问题。而且，非慢病毒载体不会优化这种呈递，抗原表达的数量和持续时间也很重要。仍然极为需要方法以下述方式向个体的免疫体系呈递免疫原性差的作为“自身”抗原的肿瘤抗原，该呈递方式可激发足够有力的免疫响应来抑制受体体内肿瘤细胞的生长。本发明通过提供包含趋化因子和肿瘤抗原的融合蛋白，克服了本领域前述的限制和缺点，该蛋白可以产生体内免疫响应，从而导致抑制肿瘤细胞。本发明还通过提供包含趋化因子和HIV抗原的融合蛋白，克服了前述HIV疫苗开发领域的缺点，该蛋白能有效作为疫苗来治疗或防止HIV感染。还提供了构造更安全的慢病毒载体的方法、纯化慢病毒载体的方法和使用慢病毒载体检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法。

本发明还提供了治疗或预防个体HIV感染的方法，该方法包括向个体施用源自下列蛋白质的下列肽的任何组合：趋化因子、自杀基因、HIV蛋白质、细胞因子、细胞表面蛋白质、肿瘤抗原、或影响细胞产生HIV的任何细胞基因(通过过度表达细胞基因或通过RNAi抑制其表达等)，它们均由慢病毒载体提供和表达。

另一个优选实施方案是用于治疗的慢病毒载体，它表达天然或融合多肽，所述多肽包含任何单独或组合的人趋化因子和病毒或细胞抗原(例如HIV、白喉毒素抗原)、趋化因子(例如IP-10、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MIP1、RANTES、SDF-1、MIG和/或MDC)或促凋亡蛋白质、自杀基因蛋白质或促进炎性响应的蛋白质。

此外，本发明提供了在个体体内产生免疫响应的方法，该方法包括向个体施用本发明的任何单独或融合多肽，包括趋化因子和人免疫缺陷病毒(HIV)抗原、或趋化因子、促凋亡基因、自杀基因和肿瘤抗原，作为蛋白质或编码由慢病毒载体表达的单独或融合多肽的核酸。还提供了治疗个体癌症的方法，该方法包括向个体施用表达本发明的任何单独或融合多肽的慢病毒载体，包括趋化因子和肿瘤抗原，作为蛋白质或编码融合多肽的核酸。

还提供了治疗或预防个体HIV感染的方法，该方法包括向个体施用源自下列蛋白质的下列肽的任何组合：趋化因子、自杀基因、HIV蛋白质、细胞因子、细胞表面蛋白、肿瘤抗原、或影响细胞产生HIV的任何细胞基因(通过过度表达细胞基因或由RNAi抑制其表达等)，它们均由慢病毒载体提供和表达。

本发明还提供了HIV载体，当用感染了HIV个体体内的感染性或缺陷性HIV颗粒感染HIV载体细胞时，所述HIV载体可以产生HIV颗粒。所述载体包含抑制或过度表达细胞宿主因子的下列天然或突变形式的序列，从而导致病毒颗粒与野生型HIV颗粒相比致病性较少，或者优选是无致病性的。它们包括例如：APOBEC家族成员(APOBEC1、2、3A、3B、3C、3D、3E、3F、CEM15/Apobec-3G)、AID、ACF、Tsg101、Vps 4、Vps 28、Vps 37、Vps 32、ESCRT-1、ESCRT-2、ESCRT-3、TRBP-1、Sam68、包含KH区域的蛋白质、参与病毒颗粒二聚化和成熟的细胞蛋白质、Hck、胞内细胞粘着分子(ICAMs)例如ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、ICAM-4和ICAM-5；白细胞功能相关的抗原-1(LFA-1)和巨噬细胞抗原1(Mac-1)、Trim5-α、Trim1、人CRM1、细胞朊病毒蛋白(PrP)、E2F-4、亲环蛋白A、成员或JAK/STAT途径、TIP30、人Rev-相互作用蛋白质(hRIP)、糖基磷-脂酰基肌糖(GPI)-锚定蛋白、CD4、CD36、PRP4、HSP27、HSP70、p38 MAPK、任何丝裂原活化蛋白(MAP)激酶超家族的成员、Tip 110、TGFβ-1、MCP-1、干扰素调节因子(IRF)、IRF-1、IRF-2、IRF-3、IRF-4、IRF-5、IRF-6、IRF-7；RA5、SDF-1α、CCR5、CXCR4、TNF受体超家族(TNFRSF)、CD40配体(CD40L，也称为CD 154或TNFSF5)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-13、IL-14、IL-15、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、TNF-α、红细胞生成素、血小板生成素、干细胞因子、flk2/flt3配体和异源核蛋白A2。慢病毒载体可以包含本专利申请其它地方讨论的任何基因组合或基因表达抑制物。慢病毒载体内表达的优选基因组合是IFN-α和IFN-β。更优选的组合是表达IFN-α和IFN-β的慢病毒载体，由IRES元件或移码突变分离，允许从相同的mRNA翻译两种基因。

除去细胞的方法

本发明还提供了利用慢病毒载体去除(例如净化)细胞(例如体内或体外)的方法。所述慢病毒载体可以包含细胞毒性、细胞静止、或自杀基因，当在靶细胞内表达时，它们可以导致细胞死亡。

例如，本发明提供了选择性感染和整合到肿瘤细胞内而不是正常细胞内的慢病毒载体，尤其是极难用任何载体、包括慢病毒载体转导的造血干细胞。事实上，只有在特定干细胞因子存在的情况下，才能用多次转导来实现大于85％功效的造血干细胞有效转导(Davis等，Blood，2004)。只能在用特定因子刺激T细胞后才能获得大于90％的T细胞转导(Humeau等2004)。因此，本发明使用慢病毒载体将基因选择性递送到肿瘤细胞内而不是正常细胞内，以从造血细胞(和其它细胞)移植物中清除肿瘤细胞，从而减少疾病复发的可能性。基因可以是“自杀基因”，即可诱导细胞凋亡的基因或刺激免疫响应的基因。可选择地，可以选择其产物提供条件性杀灭机理的基因或序列来分化细胞。通过这种方式，表达特定蛋白质然后进行后续处理可以有效地杀灭肿瘤细胞。后续处理包括化学和物理处理。用于化学处理的试剂包括使用酶或与基因产物反应以杀灭宿主细胞的其它化合物。物理处理包括使细胞经受辐射、UV光等。该方法具体使用表达感兴趣的基因的慢病毒载体，该基因可以净化或刺激免疫响应来对抗污染性细胞(包括但不限于可能妨碍制备或可能引起有害事件的细胞或肿瘤或恶性细胞、前恶性细胞、原癌细胞、致瘤性细胞或任何异常细胞类型)，该方法包括：(1)在一段时间内，将载体添加到要需要清除污染细胞的细胞制剂中，导致超过99％的污染细胞被慢病毒载体转导，其中移植物内的正常细胞被慢病毒载体转导的频率小于污染细胞的频率；和(2)将细胞制剂施用至需要该细胞制剂的患者。可选择地洗涤细胞以除去过量的载体，但这不是必需的。在肿瘤细胞更特异表达或具有顺式作用序列的启动子存在下，载体可以额外地表达慢病毒载体所含的“感兴趣的净化基因(GOI)”，增加致瘤细胞而不是正常细胞内GOI mRNA的稳定性，或者顺式作用序列促进正常细胞内而不是致瘤细胞内GOI mRNA不稳定性的。其它启动子体系也可以顺序应用，例如可诱导的启动子体系。其实例为四环素可诱导的启动子体系。

有几种基因类型可以用于本发明。例如，单纯疱疹病毒1型(HSV-I)，胸苷激酶(TK)基因提供了这种条件性杀灭机理来分化细胞。使用HSV-1-TK的选择性优点源自如下事实：即与哺乳动物TK相比，该酶对某些核苷类似物具有更高的亲和力，例如无环鸟苷、更昔洛韦和FIAU(McLaren at al.，n：Herpes Virus and Virus Chemotherapy,R.Kono，ed.，第57-61页，Amsterdam，Elsevier(1985))。这些药物转化为核苷样前体，掺入复制细胞的DNA中，从而破坏基因组的完整性，并最终导致细胞死亡。几项研究已经成功地将TK的条件性毒性用于转基因小鼠的开发研究(Borrelli等，Nature339：538-541(1983)；Heyman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：2698-2702(1989))，作为针对培养细胞内的非同源重组事件的可选择标记物(Capecchi，M.R.，Trends in Genetics 5(3)：70-76(1989))，用于杀灭细胞培养的野生型疱疹病毒(Corey和Spear，N.Engl.J.Med.314：686-691(1986)；Corey和Spear，N.Engl.J.Med.314：749-756(1986))，和选择缺少TK活性的疱疹病毒突变物(Coen等，Science 234：53-59(1986))。可利用其它“自杀基因”(例如http://www.zgene.net/technology.html)，使用TK并不是限制性实例。还可以组合或单独使用凋亡基因。实例包括：TNF配体家族：LTA(TNF-b)、LTB(LT-b)、TNF(TNF-α)、TNFSF4(OX40配体)、TNFSF5(CD40配体)、TNFSF6(FasL)、TNFSF7(CD27配体)、TNFSF8(CD30配体)、TNFSF9(4-1BB配体)、TNFSF10(TRAIL)、TNFSF11(TRANCE)、TNFSF12(Apo3L)、TNFSF13(APRIL)、TNFSF14(HVEM-L)。TNF受体家族：LTBR、TNFRSF1A(TNFR1)、TNFRSF1B(TNFR2)、TNFRSF4(OX40)、TNFRSF5(CD40)、TNFRSF6(Fas)、TNFRSF7(CD27)、TNFRSF8(CD30)、TNFRSF9(4-1BB)、TNFRSF10A(DR4)、TNFRSF10B(DR5)、TNFRSF10C(DcR1)、TNFRSF10D(DcR2)、TNFRSF12(DR3)、TNFRSF14(HVEM)。Bcl-2家族：BAD、BAK1、BAX、BCL2、BCL2A1(bfl-1)、BCL2L1(bcl-x)、BCL2L11(bim-样蛋白质)、BCL2L2(bcl-w)、BIK、BLK、BNIP3(nip3)、BOK(Mtd)、HRK、MCL-1。Caspase家族：CASP1、CASP2、CASP3、CASP4、CASP5、CASP6、CASP7、CASP8、CASP9、CASP10、CASP13、CASP14。IAP家族：BIRC1(NIAP)、BIRC2(IAP2)、BIRC3(IAP1)、BIRC4(XIAP)、BIRC5(Survivin)、BIRC6(Bruce)。TRAF家族：TANK(1-TRAF)、TRAF1、TRAF2、TRAF3(CRAF1)、TRAF4、TRAF5、TRAF6、TRIP。CARD家族：APAF1、ASC、BCL10(HuE10)、NOD1(CARD4)、NOL3(Nop30)、RIPK2(CARDIAC)。死亡结构域家族：CRADD、DAPK2、FADD、MYD88、RIPK1。死亡效应结构域家族：CASP8AP2(FLASH)、CFLAR(CASPER)、FADD、LOC51283(BAR)。CIDE结构域家族：CIDEA、CIDEB、DFFA、DFFB。p53和ATM途径：ATM、CHEK1(chk1)、CHEK2(chk2、Rad53)、GADD45A、MDM2、P63、RPA3、TP53(p53)。

免疫原性或细胞因子基因也可以单独使用或与自杀基因或凋亡基因组合使用。所述基因的实例为：接头蛋白：FADD、IRAK1、IRAK2、MYD88、NCK2、TNFAIP3、TRADD、TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAF5、TRAF6。细胞表面受体：ACVR1、ACVR1B、ACVR2、ACVR2B、ACVRL1、CD28、CD3F、CD3G、CD3Z、CD69、CD80、CD86、CNR1、CTLA4、CYSLTR1、FCER1A、FCER2、FCGR3A、GPR44、HAVCR2、OPRD1、P2RX7、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10。趋化因子和受体：BLR1、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CX3CL1、CX3CR1、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCR4、GPR2、SCYE1、SDF2、XCL1、XCL2、XCR1。细胞因子和受体：AMH、AMHR2、BMPR1A、BMPR1B、BMPR2、C19orf10(IL27w)、CER1、CSF1、CSF2、CSF3、DKFZp451J0118、FGF2、GFI1、IFNA1、IFNB1、IFNG、IGF1、IL1A、IL1B、IL1R1、IL1R2、IL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3、IL4、IL4R、IL5、IL5RA、IL6、IL6R、IL6ST、IL7、IL8、IL8RA、IL8RB、IL9、IL9R、IL10、IL10RA、IL10RB、IL11、IL11RA、IL12A、IL12B、IL12RB1、IL12RB2、IL13、IL13RA1、IL13RA2、IL15、IL15RA、IL16、IL17、IL17R、IL18、IL18R1、IL19、IL20、KITLG、LEP、LTA、LTB、LTB4R、LTB4R2、LTBR、MIF、NPPB、PDGFB、TBX21、TDGF1、TGFA、TGFB1、TGFB1I1、TGFB2、TGFB3、TGFB1、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、TH1L、TNF、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF7、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRSF11A、TNFRSF21、TNFSF4、TNFSF5、TNFSF6、TNFSF11、VEGF、ZFPM2、RNF110(ZNF144)。信号转导蛋白：CABIN1、CALM1、CALM2、CALM3、CAMK2B、CAMK4、CDC25A、CDKN1A、CDKN2B、CHUK、CSNK2A1、CSNK2B、ENG、EVI1、GSK3A、GSK3B、IKBKB、IKBKE、IKBKG、IL18BP、ITK、JAK1、JAK2、JAK3、KPNA5、KPNB3、LAG3、LAT、MADH1、MADH2、MADH3、MADH4、MADH5、MADH6、MADH7、MADH9、MAP2K4、MAP2K7、MAP3K1、MAP3K2、MAP3K7、MAP3K7IP1、MAP3K14、MAPK3、MAPK8、MAPK9、MAPK10、MAPK14、MHC2TA、NAP4、NBL1、NMA、NUP214、PAK1、PLAU、PPP3CB、PPP3CC、PPP3R1、PTPRC、RIPK1、SERPINE1、SLA、SOCS1、SOCS2、SOCS3、SOCS4、SOCS5、SOCS7、TBK1、TIMP1、TRPV6、TSC22、TYK2、VAV1、VAV2、VAV3、XPO5。响应基因和其它相关基因：AGT、BAD、BCL2、BCL3、BF、C3、CHRD、CKTSF1B1、COL1A1、COL1A2、COL3A1、FST、HRAS、ICAM1、ICAM2、ICAM3、ICAM4、ICAM5、IGFBP3、IGSF6、ITGB5、ITGB7、IVL、MGC27165、MYF5、NCAM1、NOS2A、ORM1、PIN1、RFX1、RFX2、RFX3、RFX4、RFX5、RFXANK、RFXAP、RFXDC1、SAA1、SELE、SELL、SELPLG、SFN、TGIF、VCAM。转录因子：ATF2、CEBPB、CREB1、CREBBP、EGR1、EGR2、EGR3、ELK1、ELK3、EP300、FKBP1B、FLJ14639(NIP45)、FOS、FOSL1、FOSL2、FOXP3、GATA3、GATA4、GRLF1、ICOS、IRF1、JUN、JUNB、JUND、MAF、MAX、MEF2A、MEF2B、MEF2D、MYC、NFAT5、NFATC1、NFATC2、NFATC3、NFATC4、NFKB1、NFKB2、NFKBIA、NFKBIB、NFKBIE、NFKBIL1、NFKBIL2、NFRKB、RAF1、REL、RELA、RELB、RUNX1、RUNX2、SP1、SP3、SRF、STAT1、STAT4、STAT6、TFCP2、YY1。

自杀基因疗法还可以称为前药活化基因疗法，其可以用于提高靶细胞对前药诱导的凋亡的敏感性。使用慢病毒载体引入自杀基因使得肿瘤细胞可以局部活化前药，从而限制向靶组织产生有毒的药物代谢物。自杀基因疗法体系包括例如HSV-tk与抗病毒前药更昔洛韦组合，和细菌基因胞核嘧啶脱氨酶与前药5-氟胞核嘧啶组合。还可以使用细胞色素P-450酶，它可以与各种抗癌前药组合，例如环磷酰胺及其异构体ifosfamide。

过去曾试图使用载体来治疗移植物抗宿主(“GVH”)病，该病是异源移植的副作用，具有很高的死亡率。这些努力都失败了，因为既不能实现供体淋巴细胞的高转导效率，也不能有效靶向引起移植物抗宿主病的细胞。本发明提供使用慢病毒转导载体来解决上述缺陷。本发明提供了新策略来治疗异源移植过程中的移植物抗宿主病(GVHD)。目前，异源移植导致由移植物抗宿主病引起的高死亡率，其中来自供体的淋巴细胞将宿主识别为外来物，并开始破坏正常宿主组织。尽管来自供体的淋巴细胞可以有效破坏肿瘤细胞，但GVHD副作用阻碍将异源和无关供体移植作为治疗各种癌症形式的手段。本方法使用慢病毒载体来治疗或防止移植物抗宿主病。该方法使用表达自杀基因的慢病毒载体，该自杀基因用于转导供体淋巴细胞群。

其它策略包括表达凋亡基因或表达由可诱导启动子表达的存活因子的RNAi。所述有效负荷是非限制性实例，任何基因或基因沉默序列都可以用于调节异源T细胞的功能，而不是在将来简单杀灭相同位置的细胞。在用表达自杀基因或诱导细胞死亡的基因或RNAi的慢病毒载体转导之前或转导过程中，该方法用抗CD3和抗CD28抗体(或其它刺激物，如促有丝分裂素、细胞因子、其它因子)刺激供体淋巴细胞。刺激将允许慢病毒载体更高地和甚至完全地转导淋巴细胞群。因此，一旦转导细胞被输注到患者体内，则如果异源移植物引起GVHD，则可以用前药治疗，以诱导细胞杀灭介导GVHD的淋巴细胞。前药的水平还可以以剂量依赖的方式降低GVHD，从而可以保持移植物对抗肿瘤的效果。

由于同种活性T细胞是GVHD的调节物，所以处理淋巴细胞或外周血细胞群的优选方法是用载体更特异性地靶向这些细胞。由于已知慢病毒载体能更有效地转导活性更高的细胞，所以如果相对于与非同源活性T细胞更选择性地活化同源活性T细胞，则慢病毒载体将更有效地转导同源活性T细胞。可以如下特异性活化异源活性T细胞：将供体淋巴细胞(或白细胞、或CD4 T细胞)与受者细胞(白细胞、红细胞或其它受体细胞；细胞可以被辐射或处理以杀灭或防止细胞生长)或受者细胞提取物混合，同时以适当的MOI(感染复数)将载体添加到细胞群中，以选择性地转导异源活性细胞而不转导不被混合细胞刺激的非异源活性细胞。优选方法是将受者的红细胞与供者淋巴细胞混合，因为这些细胞表达MHC抗原，包括次要MHC抗原(Zimring等，Blood.2006 Jan 1；107(1)：187-9)，并且它们不能用载体稳定转导，因为它们是无核的。本领域技术人员可以容易地确定该MOI，其中可以用表达报告子的载体确定哪种细胞已经被转导。在将红血细胞与供者淋巴细胞混合并用慢病毒载体转导后，将淋巴细胞洗涤并优选与红血细胞分离，然后输注至患者体内。可通过几种技术将红血细胞与淋巴细胞分离，这些技术包括球分离或ficoll梯度离心，这在本领域中是已知的。将分离的红血细胞而非其它细胞类型用于刺激的优点在于：(1)它们易于获得(2)它们在刺激后易于除去(3)它们不会生长，因此不会持续刺激供者淋巴细胞，和(4)它们不会由载体转导。经转导的异源活性细胞可以在输注前在体外被破坏，或者在输注至患者后被破坏。可选择地，可以用细胞提取物或肽刺激细胞，细胞提取物或肽是患者特异性的，源自患者的特定次要或主要组织相容性抗原复合物(MHC)基因。表达特异性MHC基因的提取物或肽/蛋白质的制备在本领域中是已知的。优选地，提取物源自非肿瘤组织，从而更特异性地转导同种特异性细胞而不是与疾病相关抗原特异性的细胞。将提取物或肽/蛋白质脉冲加入供者细胞，以刺激异源活性细胞，使慢病毒载体产生有效的转导。在用载体转导后，可以将细胞洗涤，然后冷冻储藏或输注给患者。可以优选在IL-2中短期培养细胞，然后输注给患者。

用于T细胞转导的替代方法使用混合淋巴细胞群中的可溶性CD3、IL-2(或两种可溶因子的组合，或者一种可溶因子和一种固定因子或配体的组合)。在可溶CD3和IL-2存在的情况下，将慢病毒载体添加到淋巴细胞群中，特别不能加到纯化的CD4 T细胞群中。可选择地，可由辅助载体表达可溶性CD3和IL-2，如本申请其它地方所述。混合淋巴细胞环境的作用是刺激除CD3和IL-2以外的细胞，从而当慢病毒载体添加到细胞中时，可以高度有效的转导。这种用慢病毒载体转导T细胞的方法可广泛用于各种用途，包括但不限于治疗遗传性、感染性和致瘤性疾病。

而且，细胞中任选地掺入自杀基因或安全基因的方法具有广泛的用途。一个非限制性应用是慢病毒载体组合介导的天然或嵌合T细胞报告子表达，该报告子与自杀基因一起靶向患病细胞。这种基因修饰的的细胞(可能是自体固有的，或者源自永生化细胞)可以靶向疾病细胞，例如癌细胞或感染了病原体的细胞，然后可以用前药治疗患者以消除T细胞并且以旁观者效应消灭癌症、感染细胞或疾病细胞。这种方法可以单独使用，或者与本申请所述的任何其它方法组合使用。

该方法的一个非限制性实例使用包含下述基因的慢病毒载体，该基因可以杀灭或破坏慢病毒载体转导的细胞。优选地，该基因是以可诱导的方式表达的，和/或该基因只有在前药存在的情况下才活化。有许多诱导性启动子可利用，非限制性实例是四环素诱导的启动子或组织特异性启动子。有许多自杀基因可利用，包括疱疹病毒胸苷激酶基因和果蝇Dm-dNK激酶基因，它使被这些基因转导的细胞对前药敏感，从而在体外或体内引入药物后诱导细胞杀灭或死亡。还可以使用启动子诱导的基因沉默序列来诱导细胞死亡。

本发明还提供了通过启动子特异性的自杀基因表达来治疗血液病的方法。有许多自杀基因可利用，包括疱疹病毒胸苷激酶基因和果蝇Dm-dNK激酶基因，它使被这些基因转导的细胞对前药敏感，从而在体外或体内引入药物后诱导细胞杀灭或死亡。功能性染色体组的新方法已经识别出在击疾病细胞内具有提高转录活性或转录后mRNA存活力的基因。这些疾病细胞的独特性质可以用于开发慢病毒载体方案来治疗这些疾病。该方法使用以组织特异性方式表达自杀基因的慢病毒载体。非限制性实例为在CD19 B细胞特异性启动子的控制下表达果蝇Dm-dNK激酶基因的慢病毒载体，可用于治疗B细胞相关的白血病和淋巴瘤。通过骨髓移植将这种慢病毒载体递送到干细胞中。在白血病复发时，患者服用前药，表达CD19的所有细胞(所有B细胞)将被杀灭。在具有进展性癌症的患者中，要忍受功能性B淋巴细胞的损失，可以用免疫球蛋白静脉施用给患者。通过杀灭复发的B细胞相关肿瘤细胞，挽救了患者的生命。通过使用只在肿瘤中而不在正常B细胞中发现的启动子或转录后元件，可以使得这种方案对肿瘤细胞类型的特异性更强。

使用将基因盒转导入细胞的慢病毒载体，也可以消除靶细胞，该基因盒包含可操作地联接至自杀基因、细胞毒性基因、和细胞静止基因的组织特异性启动子。例如，可以用由内皮细胞启动子特异性表达的自杀基因转导造血干细胞。当一些干细胞分化成内皮细胞时，这些细胞可以被活化自杀基因的前药特异性地杀灭。近期，发现在治疗癌症的骨髓移植过程中，来自癌症细胞的血管内皮源自骨髓细胞。因此，通过像特洛伊木马一样标记它们，可以杀灭需要生长和形成转移的内皮肿瘤。类似地，当将干细胞用于治疗时(例如用于再生心脏、胰腺、肝、神经、血管等组织)，通过用基因盒转导干细胞，可以控制在不希望的细胞类型中表达时出现的不希望的分化转移事件，这种分化转移导致干细胞死亡。

慢病毒载体的用途

慢病毒载体、尤其是HIV载体，可以实现这些体系的潜能，以产生具有各种表型的细胞库，以特异性地测试各种药物和生物制剂的特异性和安全性。

在这里提供了使用HIV载体、包装质粒或包装细胞系的方法和组合物，以在高通量设置中直接、迅速和明确地测量未知功能样本核酸的功能。该方法包括如下步骤：通过将一组cDNA、DNA、EST、基因、合成寡核苷酸、shRNAi、ddRNAi或核酸库插入到HIV载体质粒中，构建质粒形式的载体，该HIV载体质粒没有表达功能性HIV蛋白质的HIV基因；用一种或多种辅助质粒将HIV载体质粒共转染到细胞系或包装细胞系中，所述细胞系或包装细胞系具有复制和包装HIV载体必需的补充成分。结果是优选以小型化、高通量设置产生一组重组HIV载体或重组HIV载体库，包括但不限于96和384孔模板模式、矩阵、将载体印刷到载玻片和类似的方法。为了识别和确定样本核酸编码产物的功能，用表达样本核酸产物的重组HIV载体以高通量设置转导宿主或宿主细胞，从而改变宿主的表型。

优选实施方案是包含cDNA或RNAi库的HIV载体，它们被转染或转导到细胞或包装细胞系内，其中辅助载体表达包膜基因，允许将载体颗粒包装以感染或转导邻近的细胞，以扩增载体。如果最初转染或转导进入包装细胞或包装细胞系的各载体是同样的，则与不能有效产生的那些载体相比，那些更有效产生的载体将更迅速地扩增。然后可以通过许多方法测定各样品的载体滴度。一种所述方法是ELISA测定法，该方法在本领域中是公知的，其中被测定的蛋白质是来自细胞培养基内的HIV的p24抗原。可以用于确定哪个克隆更有效地产生HIV载体的其它方法是荧光测定法，例如载体内编码绿荧光蛋白。使用荧光蛋白的优选实施方案是在由同一启动子表达cDNA和荧光蛋白质，二者位于相同mRNA以内，并被翻译初始化序列分离以引起翻译第二基因产物。这种翻译初始化序列在本领域中是已知的。例如，内部核糖体进入位点序列(IRES)是常用的一种。通常，从IRES下游基因表达不如从上游基因表达有效。如果下游基因的表达水平低于可接受的水平，则为了提高其表达，可能将转录后调整元件(PRE)插入下游基因的远端。由于HIV内的易错型逆转录酶分子和HIV重组的能力，可以将该方法改良以产生具有向性改变的载体包膜蛋白质。在每轮扩增过程中，HIV载体在其基因组内产生错误，从而可以改变其中所含的包膜序列，从而改变病毒载体的结合亲和力和可能的向性。通过使用靶细胞作为包含辅助成分的包装细胞系(例如特定的癌细胞类型)，与向性降低或有缺陷而不能复制的载体相反，对所述细胞系的向性增高的载体将在每轮复制过程中被优先选择。在选择后，通过PCR，使用位于包膜序列5′和3′的载体特异性引物，可以分离改变的包膜并描绘其特征。包膜序列不需要以天然包膜序列开始，但可以包括由本领域已知的几种技术产生的包膜蛋白质变体库。选择程序不需要限制细胞培养基。

可以用包装组分产生转基因动物，用于在动物中对HIV载体进行全部动物的选择。包装组分可能需要设计成种属特异性的；例如对于猴体内的复制，可能优选SIV包装基因(例如gag、pol、调整或附属基因)为HIV包装基因，不过仍然使用HIV基因组作为转移载体(例如，HIV gag非编码部分上方的5′HIV-LTR，包含包装序列、任选的rre元件及其剪接接受序列、包膜基因、和3′HIV-LTR)。在组织特异性启动子下，在将载体施用至动物后，包膜基因可以在特定的器官或组织中表达。通过这种方法，使用包含某些包装基因用于包装和迁移载体的转基因动物可以产生高度特异性的靶载体。

另一个实施方案是用慢病毒载体确定基因功能时的自动过程。要确定基因的功能，将一套cDNA或RNAi插入到HIV载体内，以产生HIV载体库，分别表达一个cDNA、一个RNAi、或一个cDNA和一个RNAi、两个cDNA、两个cDNA和一个RNAi、一个cDNA和两个RNAi、或靶向感兴趣的特定基因的至少两个RNAi。该方法的每个步骤可以在多孔模板中进行并且自动化，以进一步提高体系的能力。这种高通量体系有利于体外和体内表达分析来自人和其它有机体的大量样本核酸，并且与本领域可利用的其它技术相比有显著改进。本发明使用高通量制备包含一种或多种样本核酸的重组HIV载体库，然后高通量筛选宿主体内的腺病毒载体库，以改变宿主的表型，作为确定样本核酸表达产物以功能的方法。使用核酸构件和补充包装细胞，以高通量设置产生HIV载体库。样本核酸库可以是一组清楚定义或未定义的序列，或者可以是一池(pool)未定义或已定义的序列。第一核酸构件相对较小，易于操纵含有样本核酸的接头质粒(adapter plasmid)和表达盒。第二核酸构件包含一种或多种核酸分子，相互部分重叠和/或与第一构件内的序列重叠，包含复制和包装重组HIV必需的至少全部HIV序列，接头质粒或包装构件或细胞没有提供这些序列。将第一和第二核酸构件共同转染到包装细胞内，当它由多于一个核酸分子组成时，导致第一和第二核酸构件内的重叠序列之间的同源重组和第二核酸构件之间的同源重组。以高通量设置将HIV载体库引入宿主体内，它生长以允许充分表达由样本核酸编码的产物，从而允许检测并分析其生物学活性。宿主可以是体外培养的细胞或动物或植物模型。充分表达由样本核酸编码的产物改变了宿主的表型。使用任何一种测定体外和/或体内生物学活性的方法，鉴别并分析被改变的表型，从而确定样本核酸产物的功能。

本发明与目前使用技术相比有几个优点。全部过程是自动化的，尤其当在96孔或其它多孔模式中执行时。用多种不同体外方法进行高通量筛选提供了在相对短暂的时间内有效获得功能信息的方法。鉴定体外或原位显示或诱导宿主产生所需表型的重组HIV载体库的成员，以将库分成可操控的多种重组腺病毒载体，或者可以在体外动物模型中检验的克隆。本发明的另一个明显优点是该方法产生了不含可复制慢病毒(RCL)的腺病毒库。RCL污染全部库将是主要的阻碍，尤其是如果库被连接扩增用于多次筛选程序。

另一个实施方案是表达谷氨酸合成酶(GS)基因的慢病毒载体，具有所需的重组蛋白质或单克隆抗体基因。已知GS是非常重要的代谢物，导致对高表达重组蛋白质或单克隆抗体的细胞的强选择。HIV载体将在同一载体内包含重组蛋白质基因和GS基因。可选择地，包含重组蛋白质、GS或提高重组蛋白质产率的另一种基因的多个载体也是本发明的优选实施方案。可能使用其它选择方法，包括但不限于嘌呤黄素、表面标记基因表达和其它方法。

本发明还描述了一种方法，该方法使用上述高通量方法，来分离基因以提高蛋白质、疫苗、或单克隆抗体的制备产率。表达cDNA或RNAi的慢病毒或HIV载体库由重组蛋白质或单克隆抗体构成，它们在单独的慢病毒或HIV载体或包含cDNA或RNAi库(包括shRNAi和ddRNAi、或其它基因表达抑制物，例如核酶、反义、aptamers、反式显性突变蛋白质等)的载体上表达。制备并添加载体到用于制备蛋白质的细胞中和使用上述高通量模式表达重组蛋白质的单独细胞克隆。蛋白质制备量可由本领域已知的方法测量，可以鉴别表达高水平蛋白质的克隆。可以使用上述载体特异性引物扩增来自所述库的具体cDNA或RNAi并鉴定序列。通过将它包含在每个HIV载体构件中，或者通过构建当前结构性表达已识别的cDNA或RNAi的细胞系，这种cDNA或RNAi然后可以用于提高其它蛋白质或单克隆抗体的制备。

本发明的另一个方面是慢病毒载体，它表达靶向蛋白酶基因的RNAi，具有所需的重组蛋白质、单克隆抗体或疫苗基因。已知在纯化过程中，蛋白酶显著降低所需重组蛋白质或单克隆抗体的收率。HIV载体将在同一载体中包含重组蛋白质基因和用于一个或多个蛋白酶基因的RNAi。可选择地，包含重组蛋白质、抗蛋白酶RNAi或另一种基因的多种载体也是本发明的优选实施方案，所述另一种基因能促进重组蛋白质在纯化过程中的收率。

本发明还提供了一种方法，该方法通过抑制影响纯化过程收率的蛋白质来分离基因，以提高下游纯化过程中的蛋白质或单克隆抗体的产率。这种方法对于上述高通量方法极为有用。表达cDNA或RNAi的至少一个慢病毒或HIV载体库由重组蛋白质或单克隆抗体构成，在单独的慢病毒或HIV载体或包含cDNAs或RNAi库的载体上表达。制备并添加载体到用于制备蛋白质的细胞中和使用上述高通量模式表达重组蛋白质的单独细胞克隆。然后通过本领域已知的方法纯化重组蛋白质或单克隆抗体并测量收率。鉴别包含高收率蛋白质或重组抗体的具体细胞克隆。使用上述载体特异性引物可以扩增来自所述库的具体cDNA或RNAi并鉴定序列。通过将它包含在每个HIV载体构件中，或者通过构建当前结构性表达已识别的cDNA或RNAi的细胞系，这种cDNA或RNAi然后可以用于提高其它蛋白质或单克隆抗体的产生。

另一个实施方案也是表达cDNA或RNAi的慢病毒载体，所述RNAi抑制产生单克隆抗体、蛋白质或疫苗的细胞系中的潜在病毒、朊病毒或细菌污染物。一个非限制性实例是在表达蛋白质的慢病毒载体中表达的RNAi，靶向牛海绵体脑病致病因子、或Creutzfeld-Jakob病(CJD)致病因子，它们是生物制剂制备过程中的潜在制备污染物。抗BSE或抗CJD RNAi的表达将使BSE或CJD致病因子污染制备的危险最小化，从而提高这样制备的生物学制剂的安全性。HIV载体可以包含重组蛋白质和针对可能造成污染的一种或多种致病因子的RNAi。可选择地，包含重组蛋白质、抗蛋白酶RNAi或另一种基因的多种载体也是本发明的优选实施方案，所述另一种基因能促进重组蛋白质在纯化过程中的收率。本发明还能被改良以包括基因或RNAi，使认为对重组产物的制备和质量有害或不利的任何基因的产生最小化。

慢病毒载体还可以用于制备在一种或多种基因的过度表达或抑制方面不相同的细胞系库。为了获得具有特定表型的所需细胞，将多种载体表达基因添加到细胞中。所述基因可以从荧光标记物基因的上游克隆，例如使用上述元件如IRES，从而可以从相同的mRNA翻译标记物和感兴趣的基因。优选通过上述高通量方法克隆细胞，所述细胞具有过度表达的基因和由RNAi介导的表达下调的基因的正确组合。如果原材料是原代细胞，优选基因之一可以是使细胞永生的基因，例如表达逆转录酶(TERT)，或专利中所述的其它方法(US6686159或6358739)。然而，任何细胞，包括已有细胞系都可以用作原材料。

另一个示例性实施方案是用多种慢病毒载体修饰细胞，所述慢病毒载体包含感兴趣的表达的基因和/或基因表达的抑制物，然后使用高通量方法分离细胞克隆，以分离具有所需基因型和/或表型的细胞克隆。

本发明还提供了识别选择性影响感兴趣的基因或其表达产物或其途径中下游基因或蛋白质的实验化合物的方法，该方法包括与细胞一起培养多种慢病毒载体以对这些细胞进行基因修饰，使它们包含下述基因：其过度表达感兴趣的基因、和过度表达至少一种第二基因或者至少感兴趣的第二基因的抑制物序列，其中多种细胞然后通过高通量方法分离，以分离具有所需基因型和/或本型的细胞克隆。

本发明还提供了识别改变哺乳动物细胞中蛋白质或基因表达水平的制剂的方法，该方法包括与细胞一起培养多种慢病毒载体以对这些细胞进行基因修饰，使它们包含下述基因：其过度表达感兴趣的基因、和过度表达至少一种第二基因或者至少相关第二基因的抑制物序列，其中多种细胞然后通过高通量方法分离，以分离具有所需基因型和/或表型的细胞克隆；然后在候选制剂存在的情况下培养所述细胞并确定所述候制选剂对细胞的影响。

本发明的另一方面是表达刺激免疫响应的cDNA或RNAi的慢病毒载体。优选实施方案是表达GM-CSF、CD40L和/或任何细胞因子或免疫响应刺激物的HIV载体。所述载体可能是迁移载体或非迁移载体，这取决于所需治疗或疫苗用途。除了细胞因子基因外，自杀基因可插入载体内，以诱导包含载体的细胞在施用前药后凋亡。

另一个实施方案是用慢病毒载体来发现使用双杂交技术在哺乳动物细胞内新的蛋白质-蛋白质相互作用。一个实例由Promega Corporation(www.promega.com)提供。双杂交体系是检测体内蛋白质-蛋白质相互作用的极有力的方法。双杂交体系的基础是在一些转录因子内发现的分子区域。在CheckMate^TM哺乳动物双杂交体系中，pBIND载体在多种克隆区域上游包含酵母GAL4 DNA结合区域，pACT载体在多种克隆区域上游包含疱疹病毒VP 16活化区域。而且，pBIND载体表达Renilla肾形荧光素酶，这使得使用者可以使转染效率标准化。编码两种潜在相互作用的感兴趣的蛋白质的两种基因被克隆到pBIND和pACT载体中，以产生分别与GAL4的DNA结合区域和VP 16的活化区域的融合蛋白。pG51uc载体在最小TATA盒的上游包含五个GAL4结合位点，TATA盒位于萤火虫荧光素酶基因(luc+)上游。pGAL4和pVP16融合结构用pG51uc载体转染到哺乳动物细胞内。在转染两到三天后，将细胞溶解，使用Dual-Luciferase报告子测定体系测定Renilla荧光素酶和萤火虫荧光素酶的量。作为GAL4和VP融合结构的两种测试蛋白质之间的相互作用导致比阴性对照高的萤火虫荧光素酶表达。这样的双杂交体系可以容易地用于慢病毒载体，以直接筛选哺乳动物细胞内的蛋白质-蛋白质相互作用。

上列标题作为指导，其中某些信息可以在本申请中找到，但所述标题并非是在申请中这样主题的信息的唯一来源。上面引用的所有申请、专利和公开的全部内容被全部引入本文作为参考。2005年2月16日提交的美国临时申请号60/653,386；2005年3月10日提交的60/660,310；2005年5月18日提交的60/682,059；和2005年10月5日提交的60/723,768被全文纳入本文作为参考。

Claims (45)

1.慢病毒辅助质粒，其包含：

a)慢病毒5′LTR，其含有可操作地联接至编码慢病毒gag和pol的多核苷酸序列的功能性天然启动子，和可有效终止由该天然启动子驱动的转录的异源polyA信号；

b)可操作地联接至包膜编码序列的异源启动子，和可有效终止由该异源启动子驱动的转录的异源polyA信号；

其中所述天然启动子和异源启动子以相反的转录方向存在于所述质粒中，而且所述质粒缺少功能性包装序列。

2.如权利要求1所述的慢病毒辅助质粒，其中所述质粒包括从所述5′LTR以外的不同慢病毒种获得的TAR元件，并包括从所述5′LTR以外的不同慢病毒种获得的RRE元件。

3.如权利要求1所述的慢病毒辅助质粒，其中所述5′LTR是天然的。

4.如权利要求1所述的慢病毒辅助质粒，其中所述质粒还包括编码Tat多肽或Rev多肽的可表达多核苷酸序列，该序列可操作地联接至启动子。

5.如权利要求1所述的慢病毒辅助质粒，其中所述5′LTR是HIV-1或HIV-2。

6.如权利要求1所述的慢病毒辅助质粒，其中所述编码慢病毒gag和pol的多核苷酸序列是HIV-1 gag和HIV-1 pol或HIV-2 gag和HIV-2 pol。

7.如权利要求1所述的慢病毒辅助质粒，其中所述编码gag和pol的多核苷酸序列包括至少一种非天然密码子，以在相容性宿主体内表达时提高所述编码序列的翻译。

8.如权利要求1所述的慢病毒辅助质粒，其中在所述pol序列和包膜编码序列之间存在多核苷酸序列，它是终止密码子或p7 KETWETWWTE编码序列。

9.如权利要求1所述的慢病毒辅助质粒，其中所述包膜编码序列用于VSV-G包膜或线状病毒包膜。

10.如权利要求1所述的慢病毒辅助质粒，还包含可有效抑制所述包膜编码序列翻译的反义多核苷酸。

11.慢病毒转移载体，其包含：

a)慢病毒5′LTR；

b)远离所述5′LTR的慢病毒包装序列；

c)修饰的慢病毒3′LTR，其包含TATA框序列，但所述TATA框序列缺少3′U3序列5′，其中所述3′LTR的转录活性降低。

12.如权利要求12所述的慢病毒转移载体，还包含d)可操作地联接至异源多核苷酸序列的异源启动子。

13.如权利要求12所述的慢病毒转移载体，其中缺少3′U3的序列是TATA框序列的5′至20个核苷之内。

14.如权利要求12所述的慢病毒转移载体，其中所述3′LTR还包括可操作地联接到第二异源多核苷酸序列的第二异源启动子，其中所述启动子和异源多核苷酸序列被插入到3′LTR内，其插入位置可有效降低所述3′LTR的转录活性。

15.如权利要求12所述的慢病毒转移载体，还包含第二异源启动子，该启动子可操作地联接至编码感兴趣的第二基因的异源序列。

16.如权利要求16所述的慢病毒转移载体，其中所述第一和第二异源编码序列被内部核糖体进入位点分隔开。

17.如权利要求16所述的慢病毒转移载体，其中每个所述异源编码序列还包含可有效终止由所述天然启动子驱动的转录的异源polyA信号。

18.用于制备慢病毒转导载体的慢病毒包装体系，包括：

a)权利要求1的慢病毒辅助质粒，

b)权利要求12的慢病毒转移载体，和

c)质粒，其包含可操作地联接至异源启动子的rev多肽编码序列，和可操作地联接至异源启动子的tat多肽编码序列。

19.含有权利要求1的辅助载体的分离细胞。

20.含有权利要求12的转移载体的分离细胞。

21.含有权利要求19的慢病毒包装体系的分离细胞。

22.制备慢病毒转导载体的方法，包括：

在有效制备转导载体的条件下，在宿主细胞内共表达包含权利要求19的包装体系的质粒。

23.在宿主细胞内制备感兴趣的多肽的方法，包括：

用慢病毒转导载体转导宿主细胞，以形成经转导的宿主细胞，其中所述载体包含可表达的异源多核苷酸，该异源多核苷酸编码感兴趣的分泌的异源多肽。

24.如权利要求24所述的方法，其中所述宿主细胞是CHO或293细胞。

25.如权利要求24所述的方法，还包括在有效制备所述感兴趣的多肽的条件下培养所述经转导的宿主细胞。

26.如权利要求24所述的方法，其中用多种慢病毒转导载体转导所述宿主细胞，其中每个载体包含编码不同多肽的不同异源多核苷酸。

27.如权利要求27所述的方法，其中各所述异源多核苷酸编码病毒壳体的至少一种壳体多肽，当该多肽在所述宿主细胞内表达时会自组装成所述病毒壳体。

28.如权利要求28所述的方法，其中至少一种多核苷酸编码流感病毒的血凝素或神经氨酸酶多肽。

29.如权利要求24所述的方法，其中用编码血凝素、神经氨酸酶、和基质(M1)多肽的多核苷酸转导所述宿主细胞。

30.如权利要求30所述的方法，其中各个多核苷酸存在于不同病毒转导载体内。

31.权利要求30的产物。

32.识别可提高多肽在宿主细胞内的制备的多肽或基因的方法，该方法包括：

制备多种经转导的宿主细胞，各细胞用至少两种不同的慢病毒转导子转导，该转导子包含序列相互不同的可表达的异源多核苷酸，和

依据与所述异源序列相关的功能活性筛选所述宿主细胞。

33.如权利要求33所述的方法，其中所述异源序列为RNAi序列、多肽编码序列、或感兴趣的基因的反义序列。

34.在慢病毒载体内，所述改进包括将异源多核苷酸插入3′LTR内，其中所述插入导致3′LTR具有最小的转录活性。

35.治疗与将供体淋巴细胞移植给宿主有关的GVHD疾病的方法，该方法包括：

用慢病毒转导载体转导供体淋巴细胞，该载体包含编码细胞静止元件或细胞毒性元件的可表达的多核苷酸序列或可选择性表达的多核苷酸序列，

任选地，在接受者多肽或细胞存在的情况下转导细胞，和

将所述经转导的淋巴细胞输注到所述宿主体内。

36.如权利要求35所述的方法，其中所述可选择性表达的基因可操作地联接至可诱导的启动子，或联结至在外源性导入化学品的情况下活化的启动子。

37.如权利要求35所述的方法，其中所述可选择性表达的基因编码RNAi或促凋亡多肽。

38.如权利要求35所述的方法，其中所述细胞毒性元件是疱疹胸苷激酶或多底物激酶基因的编码序列。

39.如权利要求38所述的方法，还包括施用有效量的更昔洛韦、AZT、flurada或无环鸟苷，其中所述量可有效导致所述经转导宿主细胞的细胞死亡。

40.如权利要求35所述的方法，还包括在转导所述供体细胞的同时或之前，使所述供体细胞与有效量的宿主自身抗原接触。

41.表达载体，其包含：

a)慢病毒5′LTR，其包含可操作地联接至编码天然慢病毒gag和pol的多核苷酸序列的功能性天然启动子，和可有效终止由所述天然启动子驱动的转录的异源polyA信号，其中在gag-pol序列起点的下游存在翻译终止信号；

b)位于gag-pol序列下游的剪接受体，和

c)位于gag-pol序列下游的异源多核苷酸序列，其可操作地联接至5′LTR启动子。

42.慢病毒转导载体，其包含T细胞受体和细胞毒性元件。

43.慢病毒载体包装或制备细胞系，其表达靶向VSV-G的可诱导基因抑制序列或沉默序列。

44.用慢病毒载体转导外周血淋巴细胞群的方法，其中所述淋巴细胞群在用所述慢病毒载体转导前没有纯化为亚群。

45.用慢病毒载体治疗癌症的方法，其中用表达细胞毒性元件的慢病毒载体处理干细胞，该元件可操作地联接至内皮特异性启动子，并且其中所述干细胞被输注到癌症患者体内。

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