CN116218880A - 一种提高病毒滴度的重组载体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种提高病毒滴度的重组载体及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116218880A
CN116218880A CN202111459208.6A CN202111459208A CN116218880A CN 116218880 A CN116218880 A CN 116218880A CN 202111459208 A CN202111459208 A CN 202111459208A CN 116218880 A CN116218880 A CN 116218880A
Authority
CN
China
Prior art keywords
plasmid
hiv
lentivirus
sequence
packaging
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202111459208.6A
Other languages
English (en)
Inventor
李俊
张鹏潮
刘开春
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fundamenta Therapeutics Inc
Original Assignee
Fundamenta Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fundamenta Therapeutics Inc filed Critical Fundamenta Therapeutics Inc
Priority to CN202111459208.6A priority Critical patent/CN116218880A/zh
Publication of CN116218880A publication Critical patent/CN116218880A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15031—Uses of virus other than therapeutic or vaccine, e.g. disinfectant
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15051—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2740/15052—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及提高病毒滴度的重组载体及其制备方法和应用。本发明提供基因转移载体，其具有突变的SL2序列，所述序列选自：(1)SEQ ID NO:1‑7中任一种或多种或其RNA对应物，(2)源自慢病毒的与(1)所述序列具有至少90％，优选至少93％相同性的序列。使用本发明的基因转移载体制备病毒，可以显著提高病毒包装滴度。

Description

一种提高病毒滴度的重组载体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高病毒滴度的重组载体及其制备方法和应用。
背景技术
慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。区别于一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。慢病毒介导的基因表达持续且稳定，并随细胞基因组的分裂而分裂。慢病毒具有宿主范围广，免疫原性低，基因容量大，可以长期表达等优点，已被广泛地应用于基础研究和临床试验中。
慢病毒包装系统主要有慢病毒表达载体和包装载体及包膜载体构成，包装病毒所用细胞一般为293T细胞，其主要过程是将组成慢病毒系统的质粒共转染293T细胞，48-72h后收集细胞培养基上清，从而获得所需的慢病毒。近年来，研究者对慢病毒生产过程的多个步骤进行了优化(例如，转染条件，质粒比例，细胞培养条件等)以提高病毒生产力(Ansorgeet al.2010)。也有研究者对慢病毒载体上的剪接点进行简单突变，但提升慢病毒滴度的效果不理想(Koldej et al.2009)。因此，目前慢病毒生产的滴度仍然较低，大大限制了慢病毒在疾病治疗中的应用，本领域亟需提高细胞生产慢病毒包装效率的方法。
发明内容
本发明第一方面提供一种核酸分子，其具有突变的SL2序列，所述序列选自：
(1)SEQ ID NO:1-7中任一种或多种或其RNA对应物，
(2)源自慢病毒的与(1)所述序列具有至少90％，优选至少93％相同性的序列。
在一个或多个实施方案中，所述慢病毒是HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、EIAV、BIV或VMV。
本发明第二方面提供一种基因转移载体，其具有突变的SL2序列，所述序列选自：
(1)SEQ ID NO:1-7中任一种或多种或其RNA对应物，
(2)源自慢病毒的与(1)所述序列具有至少90％，优选至少93％相同性的序列。
在一个或多个实施方案中，(2)中所述慢病毒是HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、EIAV、BIV或VMV。
在一个或多个实施方案中，所述基因转移载体是慢病毒载体。
在一个或多个实施方案中，所述基因转移载体衍生自HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、EIAV、BIV或VMV。
在一个或多个实施方案中，所述基因转移载体是慢病毒穿梭质粒，优选是衍生自HIV-1的慢病毒穿梭质粒，更优选CTG1。
本发明还提供一种慢病毒包装组合物，包含包膜质粒、包装质粒、和穿梭质粒，所述穿梭质粒具有突变的SL2序列，所述序列选自：
(1)SEQ ID NO:1-7中任一种或多种或其RNA对应物，
(2)源自慢病毒的与(1)所述序列具有至少90％，优选至少93％相同性的序列。
在一个或多个实施方案中，(2)中所述慢病毒是HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、EIAV、BIV或VMV。
在一个或多个实施方案中，穿梭质粒、包膜质粒和包装质粒各自独立衍生自HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、EIAV、BIV或VMV。
在一个或多个实施方案中，所述穿梭质粒是CTG1。
在一个或多个实施方案中，所述包膜质粒是VSVG。
在一个或多个实施方案中，所述包装质粒DR8.9。
在一个或多个实施方案中，所述组合物中包膜质粒、包装质粒和穿梭质粒的质量比为4-10:1-6:0.2-3，优选5-8:2-5:0.5-2，更优选6:3:1。
本发明还提供一种慢病毒包装组合物的制备方法，所述方法包括将包膜质粒、包装质粒、穿梭质粒以4-10:1-6:0.2-3，优选5-8:2-5:0.5-2，更优选6:3:1的质量比混合，所述穿梭质粒具有突变的SL2序列，所述序列选自：
(1)SEQ ID NO:1-7中任一种或多种或其RNA对应物，
(2)源自慢病毒的与(1)所述序列具有至少90％，优选至少93％相同性的序列。
在一个或多个实施方案中，(2)中所述慢病毒是HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、EIAV、BIV或VMV。
在一个或多个实施方案中，穿梭质粒、包膜质粒和包装质粒各自独立衍生自HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、EIAV、BIV或VMV。
在一个或多个实施方案中，所述包膜质粒是VSVG。
在一个或多个实施方案中，所述包装质粒DR8.9。
本发明还提供一种用于慢病毒包装的试剂盒，包含本文第二方面所述的基因转移载体，任选还包含包膜质粒和/或包装质粒。
在一个或多个实施方案中，包膜质粒和包装质粒各自独立衍生自HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、EIAV、BIV或VMV。
在一个或多个实施方案中，所述穿梭质粒是CTG1。
在一个或多个实施方案中，所述包膜质粒是VSVG。
在一个或多个实施方案中，所述包装质粒DR8.9。
在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包含PEI、细胞培养基、和/或丁酸钠。
本发明还提供一种慢病毒制备方法，所述方法包括将包膜质粒、包装质粒和本文第二方面所述的基因转移载体与细胞接触的步骤，任选还包括孵育混合物和/或收集上清液的步骤。
在一个或多个实施方案中，所述细胞是293T细胞。
本发明还提供一种慢病毒，包含本发明第一方面任一实施方案的核酸分子。
在一个或多个实施方案中，所述慢病毒是HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、EIAV、BIV或VMV，或其衍生物。
在一个或多个实施方案中，所述慢病毒是由本发明任一实施方案所述的慢病毒制备方法制得的慢病毒。
附图说明
图1显示突变质粒慢病毒滴度对比图。
图2显示穿梭质粒CTG1的质粒图谱。
图3显示包膜质粒VSVG的质粒图谱。
图4显示包装质粒DR8.9的质粒图谱。
具体实施方式
发明人发现，将源自慢病毒的基因转移载体中的SL2序列进行适当突变，可以显著提高基因转移载体的病毒包装滴度。本发明通过对HIV-1剪接供体位点突变的基础上对密码子进行了进一步优化，从而提高慢病毒滴度。
本文中，“基因转移载体”是将目标基因转移到靶细胞内(例如细胞核内)的工具载体，包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、痘苗病毒载体、慢病毒载体等。
本文中，“慢病毒”包括灵长类慢病毒，如人类免疫缺陷病毒(HIV)和猴免疫缺陷病毒(SIV)，以及非灵长类慢病毒如猫免疫缺陷病毒(FIV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和维斯纳-梅迪病毒(VMV)等。HIV包括HIV-1和HIV-2。HIV(例如HIV-1)的基因组全长约9200bp，含有结构基因gag、pol、env以及调节基因tat、rev、nef、vif、vpr和vpu。
本文包含衍生自慢病毒的载体或载体系统。常用的慢病毒载体以三质粒系统为代表。第一代载体系统由包装质粒、包膜质粒及载体质粒(穿梭质粒)3种质粒组成。载体质粒携带了5’端LTR和全部5’端非翻译区域(包括gag编码序列)，另外还带有rev应答元件(Revresponsive element，RRE)及3’端LTR。包装质粒由HIV-1前病毒基因组作简单修改得到，其5’端LTR由异源病毒启动子/增强子元件取代。为了防止来自辅助质粒的RNA衣壳化，将5’端主要剪接供体位点和gag编码序列起始端之间的包装信号区删除，而下游的启动子由外源多聚腺苷酸信号(polyA)取代。这样的辅助结构能表达所有的病毒蛋白，包括tat及rev。env由单独的包膜质粒携带并在病毒生产过程中共转染后表达。
将包装质粒上的vif、vpr、vpu和nef基因敲除可以降低潜在的毒害作用，得到第二代慢病毒载体，其他方面与上述第一代载体系统一致。这种载体系统仍然具有体外感染细胞的能力。
为了进一步增加载体系统的安全性，可以采用将gag/pol和rev编码序列隔离的方法。这样的包装系统使用四质粒来代替原有的三质粒包装系统。质粒一携带了gag/pol编码序列及RRE(包装质粒1)，质粒二包含了编码rev的序列(包装质粒2)，质粒三是载体质粒(穿梭质粒)，质粒四表达env(包膜质粒)。
本文的慢病毒载体系统还包括对上述载体系统的任何改造，包括对任一质粒的改造，只要改造后的载体系统仍具有原系统的基因转移的功能，或者改造后的质粒仍具有原质粒在基因转移中所行使的功能或部分功能并且使用该改造后质粒的慢病毒载体系统仍具有基因转移的功能。例如，对3’LTR的U3区启动子进行失活突变、在任一质粒中插入提高目的基因转导效率和/或表达效率的元件(例如WPRE)、修复cPPT序列等。
本发明提供的基因转移载体具有突变的SL2序列，所述序列选自SEQ ID NO:1-7中任一种或多种或其RNA对应物，优选选自SEQ ID NO:2-7，更优选选自SEQ ID NO:2或5。所述序列还可以是源自慢病毒(例如HIV-2、SIV、FIV、EIAV、BIV或VMV)的并且与SEQ ID NO:1-7中任一种所述序列具有至少90％，优选至少93％相同性的序列。在示例性实施方案中，突变的SL2序列位于衍生自HIV-1的慢病毒穿梭质粒中，例如CTG1。本文所述的核酸分子和载体可以是DNA或RNA。通常，包装系统的质粒是DNA载体，导入细胞后表达为RNA和蛋白，然后自组装为由蛋白包裹RNA的病毒。因此，本文还包括具有上述基因转移载体(DNA或RNA)的慢病毒或其衍生物。本文中，慢病毒的衍生物主要包括用于在基因工程中将目的基因导入靶细胞基因组的衍生自天然慢病毒的类似物，它们通常是由慢病毒载体系统(如本文前述)制备的减毒形式的慢病毒。
对载体的核酸序列进行突变可使用本领域已知的任何方法，例如同源重组、基因编辑(基于CRISPR、ZFN等)、核酸合成等。
本发明还提供包含本文所述基因转移载体(例如慢病毒穿梭质粒)的组合物，该组合物用于慢病毒包装和转染细胞，包含包膜质粒、包装质粒和本文所述的基因转移载体(例如慢病毒穿梭质粒)。包装质粒、包膜质粒和穿梭质粒各自可以是一种或多种质粒。组合物中的穿梭质粒、包膜质粒和包装质粒各自独立衍生自HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、EIAV、BIV或VMV，只要得到的组合可以进行慢病毒包装即可。本领域技术人员知晓可供使用的质粒及其组合方式。通常，同一质粒具有多个仅相差极少数量(例如数个)碱基的序列变体(参见例如https://www.addgene.org/21373/、https://www.addgene.org/12259/、https://www.addgene.org/12263/)。本领域知晓这些变化均对质粒的功能没有实质影响，本发明包括慢病毒质粒的此类变化。在示例性实施方案中，穿梭质粒是CTG1(包括基于pSICO的质粒，例如pHIV-EGFP)，包膜质粒是VSVG(包括基于pMD2.G的质粒)，包装质粒是DR8.9(包括基于pCMVR8.2的质粒，例如pCMV delta R8.2)。这些质粒的序列参见上述网站，其包含在本发明的内容中。
本发明还包括基因转移载体(例如慢病毒穿梭质粒)的具有原质粒功能的同源变体，例如具有至少80％、90％或95％序列相同性的变体。此外，本领域知晓验证慢病毒包装效果的实验方法，例如通过流式细胞仪检测标记蛋白表达水平来分析病毒滴度、或者PCR检测细胞中病毒拷贝数的方法检测滴度。
所述组合物中包膜质粒、包装质粒和穿梭质粒的用量和比例可由本领域技术人员根据需要进行设置，例如为4-10:1-6:0.2-3或5-8:2-5:0.5-2。在示例性实施方案中，包膜质粒、包装质粒和穿梭质粒的质量比为6:3:1。
在知晓了慢病毒包装组合物的组分后，可根据本领域常规方法制备组合物。例如，将包膜质粒、包装质粒、穿梭质粒以4-10:1-6:0.2-3，优选5-8:2-5:0.5-2，更优选6:3:1的质量比在缓冲液中混合。
上述基因转移载体或组合物可以试剂盒的形式提供。试剂盒中的各组分可以独立分装的形式或任意组合分装的形式存在。例如包膜质粒、包装质粒和穿梭质粒可以各自单独分装或两两任意组合分装或混合分装。所述试剂盒还可包含用于慢病毒包装和/或转染的试剂，例如PEI、细胞培养基、丁酸钠、待转染细胞。
本发明还提供使用本文所述载体或载体系统制备慢病毒的方法。通常，可使用本领域常规的利用载体系统制备慢病毒的方法。本领域技术人员知晓此类方法以及所需试剂、细胞等。示例性的方法包括将本文所述的包膜质粒、包装质粒和基因转移载体与细胞(例如293T细胞)接触的步骤，任选还包括在适于细胞转染和生产慢病毒的条件下孵育混合物和/或收集上清液的步骤。本发明还包括由此获得慢病毒。本领域知晓适于细胞转染和生产慢病毒的条件，例如在含有合适浓度的PEI和丁酸钠的细胞培养基(例如Opti-MEM)中混合质粒后与细胞于37℃、5％CO2孵育至少24小时。
具体实施方式中，制备慢病毒的方法包括：(1)构建质粒：将慢病毒穿梭质粒CTG1上的SL2序列突变为如SEQ ID NO:1-7中任一所示序列；和(2)配制溶液：将所述慢病毒包膜质粒、包装质粒、穿梭质粒按照6:3:1混合配制成溶液，得到质粒溶液。在一个或多个实施方案中，所述方法还包括在得到所述慢病毒的质粒溶液后，转染细胞并收集慢病毒的步骤，具体例如：
(1)将293T/17细胞接种于24孔板上；
(2)待细胞汇合度达到90％进行转染实验；
(3)制备转染混合液：
(i)将PEI和所述质粒溶液分别加入一定体积(根据生产规模确定)的Opti-MEM中，混匀后室温静置10min；
(ii)将PEI稀释液快速加入到质粒稀释液中，PEI和总质粒的质量比为2:1，用移液管混匀后室温静置15min；和
(iii)在孵育好的转染混合液中加入1.0mM的丁酸钠，混合均匀；
(4)转染：弃掉细胞培养瓶内原有培养基，将转染混合液缓慢地加入到细胞中；48小时后收集慢病毒载体上清液，保存于-80℃冰箱。
以下将以具体实施例的方式对本发明作进一步说明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非用于限制本发明的范围。实施例中所用到的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域的常规方法和试剂。
实施例中未说明的药品、试剂均为本领域商用产品(慢病毒包膜质粒VSVG、包装质粒DR8.9、穿梭质粒CTG1购自Addgene公司，质粒纯化试剂盒购自Qiagen公司)。未说明的操作均采用本领域常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook,J.,Russell,David W.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rdedition,2001,NY,Cold Spring Harbor)。
实施例
实施例1：质粒构建
慢病毒包膜质粒VSVG、包装质粒DR8.9、穿梭质粒CTG1购自Addgene公司。包装质粒DR8.9(pCMV delta R8.2，货号12263)；包膜质粒VSVG(pMD2.G，货号12259)；穿梭质粒载体(pHIV-EGFP，货号21373)上述质粒的序列参见Addgene公司网站，其包含在本发明的内容中。
从NCBI网站数据库搜索到HIV-1基因序列信息，找到HIV-1的SL2序列(GGCGACUGGUGAGUACGCC(SEQ ID NO:8)，在慢病毒穿梭质粒CTG1上找到相应序列，并将慢病毒穿梭质粒CTG1上的SL2相应序列突变为GGCGACTGGCGAGCACGCC(SEQ ID NO:1)。
将重组质粒送苏州金唯智生物科技有限公司进行测序，将测序结果与拟合成的序列比对来验证序列是否正确。测序引物如下：
正义序列：CAGGGACTTGAAAGCGAAAGGGAAAC(SEQ ID NO:9)；
反义序列：CTAGCCTCCGCTAGTCAAAATTTTTGGC(SEQ ID NO:10)。
经测序正确后，使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，由此制备得到的慢病毒穿梭突变质粒1(具有GGCGACUGGCGAGCACGCC)。采用相同的方法，制备得到其余多种突变体，包括慢病毒穿梭突变质粒2(具有GGCGACTGCTGACTACGCC)，慢病毒穿梭突变质粒3(具有GGCGACTGGAGAGAACGCC)，慢病毒穿梭突变质粒4(具有GGCGACTGGGGAGGACGCC)，慢病毒穿梭突变质粒5(具有GGCGATTGATGAATACGCC)，慢病毒穿梭突变质粒6(具有GGCGAGTGATGAATACGCC)，慢病毒穿梭突变质粒7(具有GGCGACTGATGAATACGCC)。
实施例2：慢病毒转染和滴度测定
慢病毒转染：
(1)将293T/17细胞接种于24孔板上；
(2)待细胞汇合度达到90％的时候进行转染试验；
(3)配制试剂：包膜质粒:包装质粒:穿梭质粒＝6:3:1，溶剂是注射用水；
(4)转染：
(4.1)将PEI和质粒分别加入Opti-MEM中，混匀后室温静置10min；
(4.2)将PEI稀释液快速加入到质粒稀释液中，PEI和总质粒的质量比为2:1，用移液管混匀后室温静置15min；
(4.3)在孵育好的转染混合液中加入1.0mM的丁酸钠，混合均匀；
(4.4)弃掉细胞培养瓶内原有培养基，将转染混合液缓慢地加入到细胞中，37℃、5％CO2孵育；
(4.5)转染48小时后收集慢病毒载体上清液；
(5)将慢病毒载体上清液保存于-80℃冰箱。
收集病毒上清转染细胞后使用流式细胞术测定滴度：
(1)293T细胞按1×105/孔细胞数铺于24孔板中，做标记后将24孔板放回二氧化碳培养箱37℃、5％CO2培养；
(2)病毒上清5倍或10倍倍比稀释，一般稀释3-5个梯度。病毒稀释液按100μL/孔加入到提前铺好293T细胞的24孔板中。轻轻转圈摇晃后，将24孔板放回二氧化碳培养箱37℃、5％CO2中；
(3)病毒感染24h后，取出24孔板，每孔补加700ul 2％FBS的DMEM。补加完成后放回二氧化碳培养箱37℃、5％CO2中继续培养48h。
(4)48h后取病毒感染的细胞进行流式检测，并确定病毒滴度。
滴度结果见图1，其中对照是未突变质粒。
序列表
<110> 苏州方德门达新药开发有限公司
<120> 一种提高病毒滴度的重组载体及其制备方法和应用
<130> 215749
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SL2 mutant
<400> 1
ggcgactggc gagcacgcc 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SL2 mutant
<400> 2
ggcgactgct gactacgcc 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SL2 mutant
<400> 3
ggcgactgga gagaacgcc 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SL2 mutant
<400> 4
ggcgactggg gaggacgcc 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SL2 mutant
<400> 5
ggcgattgat gaatacgcc 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SL2 mutant
<400> 6
ggcgagtgat gaatacgcc 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SL2 mutant
<400> 7
ggcgactgat gaatacgcc 19
<210> 8
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SL2
<400> 8
ggcgacuggu gaguacgcc 19
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 9
cagggacttg aaagcgaaag ggaaac 26
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 10
ctagcctccg ctagtcaaaa tttttggc 28

Claims (10)

1.一种核酸分子，其具有突变的SL2序列，所述序列选自：
(1)SEQ ID NO:1-7中任一种或多种或其RNA对应物，
(2)源自慢病毒的与(1)所述序列具有至少90％，优选至少93％相同性的序列，
优选地，所述慢病毒选自HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、EIAV、BIV或VMV。
2.一种基因转移载体，其具有突变的SL2序列，所述序列选自：
(1)SEQ ID NO:1-7中任一种或多种或其RNA对应物，
(2)源自慢病毒的与(1)所述序列具有至少90％，优选至少93％相同性的序列，
优选地，项目(2)中所述慢病毒选自HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、EIAV、BIV或VMV。
3.如权利要求2所述的基因转移载体，其特征在于，所述基因转移载体是慢病毒载体，
优选地，
所述基因转移载体是慢病毒穿梭质粒，和/或
所述基因转移载体衍生自HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、EIAV、BIV或VMV。
4.一种慢病毒包装组合物，包含包膜质粒、包装质粒、和穿梭质粒，所述穿梭质粒具有突变的SL2序列，所述序列选自：
(1)SEQ ID NO:1-7中任一种或多种或其RNA对应物，
(2)源自慢病毒的与(1)所述序列具有至少90％，优选至少93％相同性的序列，
优选地，项目(2)中所述慢病毒选自HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、EIAV、BIV或VMV。
5.如权利要求4所述的慢病毒包装组合物，其特征在于，所述穿梭质粒、包膜质粒和包装质粒各自独立衍生自HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、EIAV、BIV或VMV，
优选地，所述慢病毒包装组合物中包膜质粒、包装质粒和穿梭质粒的质量比为4-10:1-6:0.2-3。
6.一种慢病毒包装组合物的制备方法，所述方法包括将包膜质粒、包装质粒、穿梭质粒以4-10:1-6:0.2-3的质量比混合，所述穿梭质粒具有突变的SL2序列，所述序列选自：
(1)SEQ ID NO:1-7中任一种或多种或其RNA对应物，
(2)源自慢病毒的与(1)所述序列具有至少90％，优选至少93％相同性的序列，
优选地，项目(2)中所述慢病毒选自HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、EIAV、BIV或VMV。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述穿梭质粒、包膜质粒和包装质粒各自独立衍生自HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、EIAV、BIV或VMV。
8.一种用于慢病毒包装的试剂盒，包含权利要求2-3中任一项所述的基因转移载体，任选还包含包膜质粒和/或包装质粒，
优选地，
所述包膜质粒和包装质粒各自独立衍生自HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、EIAV、BIV或VMV，和/或
所述试剂盒还包含PEI、细胞培养基、和/或丁酸钠。
9.一种慢病毒制备方法，所述方法包括将包膜质粒、包装质粒和权利要求2-3中任一项所述的基因转移载体与细胞接触的步骤，任选还包括孵育混合物和/或收集上清液的步骤，
优选地，所述细胞是293T细胞。
10.一种慢病毒，包含权利要求1任一项所述的核酸分子，
优选地，
所述核酸分子是RNA，
所述慢病毒选自HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、EIAV、BIV或VMV，或其衍生物，和/或
所述慢病毒是由权利要求9所述的慢病毒制备方法制得的慢病毒。
CN202111459208.6A 2021-12-02 2021-12-02 一种提高病毒滴度的重组载体及其制备方法和应用 Pending CN116218880A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111459208.6A CN116218880A (zh) 2021-12-02 2021-12-02 一种提高病毒滴度的重组载体及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111459208.6A CN116218880A (zh) 2021-12-02 2021-12-02 一种提高病毒滴度的重组载体及其制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116218880A true CN116218880A (zh) 2023-06-06

Family

ID=86568313

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111459208.6A Pending CN116218880A (zh) 2021-12-02 2021-12-02 一种提高病毒滴度的重组载体及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116218880A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10017785B2 (en) Polypurine tract modified retroviral vectors
KR102423444B1 (ko) 레트로바이러스 벡터
JP2016539629A (ja) レトロウイルスベクター
JP6212039B2 (ja) 真核細胞の形質導入に有用なウイルスベースのベクター組成物
US7803582B2 (en) Recombinant vector and use in gene therapy
US6712612B1 (en) Safe and stable retroviral helper cell line and related compositions and methods
CN116218880A (zh) 一种提高病毒滴度的重组载体及其制备方法和应用
CN114181954A (zh) 优化的慢病毒包装系统
US20230151388A1 (en) Modified vectors for production of retrovirus
CA3222751A1 (en) Lentiviral vector
US20120034693A1 (en) Recombinant vector and use in gene therapy
CN117677706A (zh) 慢病毒载体
JP2022170641A (ja) レンチウイルスパッケージングシステム、それにより製造されたレンチウイルス、及び、該レンチウイルスで形質導入された細胞、並びに、それを使用して宿主細胞のレンチウイルスの収率を向上させる方法
KR20230154075A (ko) 세포 및 유전자 치료를 위한 바이러스 벡터 생성자 세포를 생성하고 최적화하기 위한 조성물 및 방법
CN113699112A (zh) 表达重组hsv-1 us11蛋白的工程细胞及其在提高慢病毒包装效率中的应用
CN117660535A (zh) 一种慢病毒载体、其制备方法和应用
CN117867028A (zh) 慢病毒包装系统
Binder et al. Lentivirus vectors

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication