CN117677706A

CN117677706A - 慢病毒载体

Info

Publication number: CN117677706A
Application number: CN202280040578.2A
Authority: CN
Inventors: S·摩尔; T·艾迪; M·B·冈萨雷斯
Original assignee: Touchlight Genetics Ltd
Current assignee: Touchlight Genetics Ltd
Priority date: 2021-06-08
Filing date: 2022-06-08
Publication date: 2024-03-08
Also published as: GB202207077D0

Abstract

本发明涉及一种新型闭合线性DNA载体，其适用于慢病毒颗粒的生产。值得注意的是，本发明涉及包括转基因的载体(通常称为“有效负载”载体)的新构型，其使得与缺乏这种构型的闭合线性DNA载体相比，能够制备更大产量的感染性慢病毒颗粒，特别是更大产量的携带转基因的慢病毒颗粒。此外，发明人通过优化载体输入量和构建体比率，开发了对使用闭合线性DNA的慢病毒生产的改善。本发明还涉及使用所述构建体、任选地结合改进的生产载体和/或优化的策略来产生感染性慢病毒颗粒的方法。

Description

慢病毒载体

技术领域

本发明涉及一种新型闭合线性DNA载体，其适用于慢病毒颗粒的生产。值得注意的是，本发明涉及包括转基因的载体(通常称为“有效负载”载体)的新构型，其使得与缺乏这种构型的闭合线性DNA载体相比，能够制备更大产量的感染性慢病毒颗粒，特别是更大产量的携带转基因的慢病毒颗粒。此外，发明人通过优化载体输入量和构建体比率，开发了对使用闭合线性DNA的慢病毒生产的改善。本发明还涉及使用本文所述的构建体、任选地结合改进的生产载体和/或优化的策略来产生感染性慢病毒颗粒的方法。

发明背景

病毒载体为修饰真核细胞提供了一种有效的手段，其用途现已广泛应用于学术实验室和工业环境中以进行研究和临床基因治疗应用。病毒载体的范围非常广泛，从腺病毒等DNA病毒到逆转录病毒等RNA病毒。慢病毒是逆转录病毒科病毒的一个属，其特征是具有正义单链RNA基因组，编码gag、pol和env蛋白编码基因，以及调节基因tat和rev。感染性慢病毒病毒体(virion)通过与宿主细胞膜直接融合或受体介导的内吞作用进入宿主细胞，进入后释放慢病毒核心并发生慢病毒基因组的逆转录。由此产生的双链前病毒DNA随后被整合到受感染的宿主细胞的基因组中，在那里它依靠宿主机制来启动和完成组装感染性颗粒所需的病毒蛋白的转录和翻译。

基于该框架并利用慢病毒的高效整合能力，已开发慢病毒颗粒(LVP)作为哺乳动物细胞中基因转移的有效媒介物。绝大多数慢病毒颗粒衍生自研究最广泛的慢病毒HIV-1，但也已开发其他慢病毒作为基因转移媒介物，例如HIV-2和猿猴免疫缺陷病毒，以及非灵长类慢病毒，包括猫免疫缺陷病毒、牛免疫缺陷病毒和山羊关节炎脑炎病毒。

已经开发了几代复制缺陷型慢病毒颗粒系统，以克服有关HIV-1对人类的致病性的安全问题。原则上，这是通过以下方式实现的：(1)通过消除非必要的慢病毒毒力/辅助基因，生成“最小慢病毒基因组”；(2)将慢病毒生产所必需的慢病毒基因/序列分离至适当的构建体/盒中，以将产生具有复制能力的慢病毒的可能性最小化。最近开发的第三代慢病毒(LV)系统由四个独立的载体组成：两个编码rev和gag-pol的包装载体，其中(i)rev编码用于病毒基因组核输出的蛋白表达，(ii)gag和pol分别编码病毒衣壳结构蛋白和逆转录酶、整合酶和蛋白酶；(iii)编码env的包膜载体，其负责介导细胞进入的包膜糖蛋白的表达；和(iv)编码由异源强启动子驱动的转基因的转移载体。在例如Dull et al,Journal OfVirology,72(1998)中描述了第三代四重转染生产系统，该文献通过引用并入本文。进一步的进展是自失活(SIN)构建体的开发，其中转移载体包含SIN慢病毒长末端重复(LTR)构型，其中3'LTR的U3区域中的同源启动子/增强子序列缺失，从而减少了慢病毒颗粒插入位点附近的基因被不必要激活的风险，并且降低了慢病毒颗粒动员的风险。

SIN慢病毒颗粒安全性的提高，加上其稳定转导分裂细胞和非分裂细胞的能力，促进了慢病毒颗粒作为基因治疗载体在临床研究中的使用呈指数增长。然而，临床试验需要大量的高滴度的感染性慢病毒颗粒，从而需要高效、经济且可放大的生产方法。

慢病毒颗粒合成可分为两大类，稳定慢病毒颗粒生产和瞬时慢病毒颗粒生产。前一种方法涉及将编码单个转基因的转移载体转染到稳定的慢病毒颗粒生产细胞系中，该细胞系具有生产功能性慢病毒颗粒所需的辅助功能。然而，开发能够生产高滴度慢病毒颗粒的稳定生产细胞系的困难意味着瞬时慢病毒颗粒生产受到青睐。目前的瞬时慢病毒颗粒生产方法基于用编码慢病毒元件(rev、gag-pol、env)的多种DNA载体和转移载体对受纳包装细胞系(permissive packaging cell line)进行共转染。通常，DNA载体是质粒DNA(pDNA)的形式，并且优选的包装细胞是人胚肾293细胞系(HEK293)或其衍生物(例如HEK293T)。

瞬时慢病毒颗粒生产所需的大量高质量DNA的制造是制造过程中的一个主要瓶颈，也是慢病毒颗粒在基因治疗中广泛临床应用的重大障碍。此外，存在与pDNA平台上生物生产慢病毒颗粒相关的几个缺点。GMP pDNA制造成本高昂、复杂，并且DNA产物最终可能会被哺乳动物细胞中病毒生产所不需要的细菌繁殖元件所污染。此外，真核表达盒有时可能含有在细菌中产生毒性或问题效应的基因序列，这限制了它们的扩增。例如，由于序列毒性或复杂性，一些治疗相关基因难以在细菌中繁殖(Feldman etal.(2014)The Nav channelbench series:plasmid preparation.Methods X.,1:6–11；McMahon et al.(2015)NIHPublic Access,27:320–31)。

如WO2010/086626、WO2012/017210、WO2016/132129和WO2018/033730所述(其全部内容通过引用并入本文)的合成体外扩增能够在2周内产生多克规模的GMP闭合线性DNA载体。由此产生的闭合线性DNA分子非常小，仅包含用户定义的目标序列，没有抗生素抗性基因或复制起点。此外，使用酶促DNA扩增平台来生产用于慢病毒颗粒生产的闭合DNA载体，可以实现先前与细菌繁殖系统不兼容的复杂DNA序列的慢病毒颗粒包装。因此，凭借其良好的安全性和适合大规模生产的特点，闭合线性DNA载体为用于慢病毒颗粒生产的pDNA提供了一种有前景的替代品。

Karda et al.(2019)证明，闭合线性DNA载体可用于在第二代慢病毒颗粒平台中生产慢病毒颗粒，其转基因表达在体外与pDNA衍生的慢病毒颗粒相当，并且滴度匹配的载体在体内具有相似的转基因表达。然而，观察到使用闭合线性DNA载体产生的慢病毒颗粒的感染性滴度低于pDNA衍生的LV。第二代慢病毒生产涉及使用编码Gag、Pol、Rev和Tat基因的单个包装质粒、编码VSVg的包膜质粒和转移载体，其中5'野生型LTR的转基因表达是Tat依赖性的。当将该技术转移到第三代慢病毒颗粒平台时(其中使用了修饰的LTR(5'和3')并且消除了对Tat的依赖)，申请人发现感染性产量进一步下降。事实上，尽管转染细胞中似乎有足够丰富的转染DNA(图1B)和病毒基因组RNA用于产生感染性颗粒(图1)，但这并没有导致携带转基因的感染性慢病毒颗粒的足够产量(图2)。因此，感染性颗粒的产量无法与用其他DNA载体形式获得的产量相比。为了解决这个问题，最初进行了实验以减少转染中使用的载体DNA的量。这确实具有增加总颗粒滴度的效果(图2B)。随后，进行了研究以利用减少的DNA输入量来优化构建体比率。这些研究进一步提高了总颗粒滴度，但未能挽救感染性颗粒产量的下降(图3)。因此，不受理论的束缚，发明人设想该效果与闭合线性DNA本身的性质有关。因此，发明人开发了一种新型闭合线性DNA载体，其可用于慢病毒颗粒生产，产生的感染性滴度远高于Karda et al.(2019)中描述的“标准”闭合线性DNA载体，并产生与pDNA衍生的感染性滴度相当的感染性滴度。

发明内容

本发明涉及一种新型闭合线性DNA载体，其适用于慢病毒颗粒的生产。与缺乏这种构型的闭合线性DNA载体相比，该新型载体具有允许制备更高产量的感染性慢病毒颗粒的构型。本发明进一步涉及使用本文所述的构建体产生感染性慢病毒颗粒的方法。

本发明提供了一种闭合线性DNA形式的新型慢病毒转移载体。这包含目标转基因作为RNA分子被包含在慢病毒颗粒内。

本发明提供：

一种适合用作慢病毒转移载体的闭合线性DNA载体，所述闭合线性DNA载体从5'至3'包含以下顺序的序列：

(a)杂合的5'长末端重复(LTR)序列；

(b)有效连接至转基因的启动子；

(c)3'自失活(SIN)LTR序列；

(d)poly(A)信号序列；和

(e)间隔物序列。

闭合线性DNA载体内可包含附加序列，例如额外的间隔物序列。

在载体中，启动子和转基因以及任何附加序列有效地侧接5'和3'LTR序列。

因此，本发明提供：

一种适合用作慢病毒转移载体的闭合线性DNA载体，所述闭合线性DNA载体包含：

(a)有效连接至转基因的启动子；和

(b)编码侧接启动子和转基因的杂合5'长末端重复(LTR)和3'自失活(SIN)LTR的序列；和

(c)编码位于3'SIN LTR的3'处的poly(A)信号的序列；和

(d)间隔物序列，其位于编码poly(A)信号的序列的3'处。

因此，根据本发明的任何描述的新构型包括慢病毒转移载体中位于3'SIN LTR序列的3'处的序列，以便对将转基因包含到慢病毒颗粒中进行改善。

此外，根据本发明的任何描述的闭合线性DNA载体的间隔物序列可以是任何适当长度的核苷酸序列。间隔物序列被理解为通常是非编码DNA的序列，其可以具有或不具有特定序列。间隔物序列的长度可以是至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少1100、至少1200、至少1300、至少1400或至少1500个核苷酸。任选地，间隔物序列可以是本文所公开的任何长度范围的核苷酸。优选地，间隔物的长度为至少250、至少500或最优选至少1000个核苷酸(1kb)。

包括在本文所述的闭合线性DNA载体内的LTR序列在任何方面都是由野生型LTR序列修饰的。5'LTR是杂合序列，其中所述5'LTR被修饰，任选地通过用异源启动子替换全部或部分U3区。3'LTR也被修饰，使得产生的LVP是自失活的(SIN)。这通常涉及3'LTR的全部或部分U3区域的缺失。对LTR进行此类修饰是为了提高LVP的安全性，其通过：(1)消除病毒基因组转录对病毒基因tat的要求，从而减少在生产中通过重组事件出现具有复制能力的逆转录病毒(RCR)的可能性；和(2)通过LTR增强子活性消除插入突变的风险。对LTR序列的修饰代表了第二代(野生型LTR)和第三代(修饰的LTR)慢病毒转移载体之间的差异。

此外，如本文任何方面所述的闭合线性DNA载体中编码poly(A)信号的序列(或polyA信号序列)可以用于强poly(A)信号。强poly(A)信号是一种提供有效终止转录的信号。本领域技术人员将知晓适当的poly(A)信号，例如猿病毒40(SV40)晚期poly(A)序列、牛生长激素poly(A)(bGHpA)、兔β-珠蛋白(rbGlob)或与其具有至少90％同源性的序列。

此外，如本文任一方面所述的闭合线性DNA载体中编码poly(A)信号的序列(或polyA信号序列)可以包括额外的辅助序列，任选地其中所述辅助序列是一个或多个上游序列元件(USE)。USE可用于增强poly(A)信号的效率。

此外，与野生型LTR相比，如本文任何方面所述的闭合线性DNA载体中编码3'SINLTR的序列(或3'SIN LTR序列)含有缺失。任选地，所述缺失全部或部分位于3'LTR的U3区中。任选地，与野生型3'LTR相比，3'SIN LTR在相对于转录起始位点的核苷酸位置-149至-9处含有133个核苷酸的U3缺失。3'LTR序列可以根据需要通过缺失或插入来进一步修饰。在一个优选的实施方案中，修饰的5'和3'LTR衍生自HIV-1。如果采用替代的LTR，本领域技术人员可以进行类似的缺失和插入以达到相同的效果。

此外，如本文任何方面所述的闭合线性DNA载体可包括可能有益于感染性慢病毒颗粒生产的其他元件的其他序列。这些其他元件在本文中描述，并且包括但不限于以下中的任何一个或多个：WPRE、Psi、RRE、cPPT、GAG、POL、ENV、REV或任何其他包装元件。

此外，闭合线性DNA载体可额外包含一个或多个另外的额外的间隔物序列。额外的间隔物序列优选是5'间隔物序列，例如，其位于5'LTR序列的5'处。另外的间隔物序列可以是任何适当长度的核苷酸序列。间隔物序列被理解为通常是非编码DNA的序列，其可以具有或不具有特定序列。间隔物序列的长度可以是至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少1100、至少1200、至少1300、至少1400或至少1500个核苷酸。任选地，间隔物序列可以是本文所公开的任何长度范围的核苷酸。优选地，间隔物的长度为至少250、至少500或最优选至少1000个核苷酸(1kb)。当闭合线性DNA载体包含多于一个间隔物序列时，间隔物序列可以是相同或不同的核苷酸序列，并且可以是相同或不同的长度。

如本文任何方面所述的闭合线性DNA转移载体提供在生产过程中被插入颗粒中的RNA慢病毒“基因组”的模板。因此，闭合线性DNA载体中的一些序列(例如转基因)是被包装到颗粒中的相关RNA序列的模板。DNA载体因此提供了用于RNA序列的相关编码。在这方面提及的“编码”将被理解为意指用于单链RNA(ssRNA)的闭合线性DNA载体的序列编码。因此，闭合线性DNA载体包括产生正确的单链RNA以被包含到慢病毒颗粒中的所有指令。因此，闭合线性DNA载体包括转基因序列和有效连接的启动子、RNA中的5'LTR和3'SIN LTR。

实际上，5'LTR和3'SIN LTR形成了慢病毒RNA的“侧接末端”，因此闭合线性DNA载体中这两个元件之间的序列将形成用于包装的慢病毒ssRNA。在传统的LV载体中，ssRNA随后被逆转录以产生双链DNA(dsDNA)产物，该产物随后进入被转染细胞的细胞核。因此，在这种情况下，闭合线性DNA载体包括与逆转录DNA中的启动子和转基因相同的序列。然而，较新的变体允许LV颗粒的ssRNA在转染细胞中用作mRNA。

本领域技术人员将理解，闭合线性转移载体中包含的不位于5'LTR和3'SIN LTR之间(或不侧接5'LTR和3'SIN LTR)的其他序列不包括在被插入LV颗粒的ssRNA中。因此，尽管来自闭合线性转移载体的polyA信号序列和间隔物序列在生产细胞中转录，但RNA随后被有效加工以形成用于包装的最终RNA分子，其侧接LTR。

因此，就闭合线性转移载体而言，这可以被描述为包含诸如以下一项或多项的序列：5'LTR、3'SIN LTR、转基因(也称为有效负载(payload))、启动子、polyA信号序列；间隔物序列和任何额外序列，或者它可以替代地被描述为编码此类序列，因为制造涉及将闭合线性DNA载体的序列转录成RNA分子。

本文所述的闭合线性DNA载体是慢病毒转移载体，其包括有效负载序列或转基因。然而，发明人已确定这些修饰也可应用于生产载体，这些载体是生产慢病毒颗粒所需的。

因此，如果一种或多种生产载体被改造成闭合线性DNA载体，则上述修饰也可适用于这些载体。因此，闭合线性DNA生产载体可以包括一个或多个间隔物序列。所述间隔物序列可以位于基因/终止序列/表达盒的3'处和/或所述序列的5'处。

因此，本发明包括：

一种适合用作慢病毒生产载体的闭合线性DNA载体，所述闭合线性DNA载体包含：

(a)至少一个表达盒，其包括以下一项或多项：

(i)慢病毒组特异性抗原(GAG)基因；

(ii)慢病毒聚合酶(POL)基因；

(iii)包膜基因(ENV)；和/或

(iv)慢病毒调控基因(REV)，和

(b)位于表达盒3'处的间隔物序列。

优选地，包膜基因(ENV)是水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)基因。

如本文所用，表达盒最小可以是与转基因有效连接的启动子，或者它可以包括额外序列，例如终止序列。如本文所用，终止序列可以包括polyA信号序列或使用3'SIN LTR。

因此，间隔物序列可以位于表达盒的3'和/或5'。

此外，闭合线性DNA载体的间隔物序列可以是任何适当长度的核苷酸序列。间隔物序列被理解为通常是非编码DNA的序列，其可以具有或不具有特定序列。间隔物序列的长度可以是至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少1100、至少1200、至少1300、至少1400或至少1500个核苷酸。任选地，间隔物序列可以是本文所公开的任何长度范围的核苷酸。优选地，间隔物的长度为至少250、至少500或最优选至少1000个核苷酸(1kb)。当闭合线性DNA载体包含多于一个间隔物序列时，间隔物序列可以是相同或不同的核苷酸序列，并且可以是相同或不同的长度。

优选的是，包含编码GAG/POL或REV的表达盒的慢病毒生产载体包含位于表达盒3'的间隔物序列。优选的是，用作包含编码GAG/POL或REV的表达盒的慢病毒生产载体的闭合线性DNA载体包含位于表达盒3'的间隔物序列。

任选地，本发明涉及一组适用于慢病毒颗粒生产的闭合线性DNA载体，其包含至少一种如本文所述的慢病毒转移载体和至少一种如本文所述的慢病毒生产载体。任选地，该组闭合线性DNA载体包括本文所述的慢病毒转移载体以及本文所述的至少三种慢病毒生产载体。这三种慢病毒生产载体可以分别编码GAG/POL、ENV和REV。任何或所有载体可包括本文定义的3'间隔物序列。

本发明的一种或多种闭合线性DNA载体可用于改善慢病毒颗粒的生产。闭合线性DNA转移载体至少可用于提高感染性滴度。

因此，提供了当转移(有效负载)载体是闭合线性DNA载体时改善慢病毒颗粒的感染性滴度的方法，包括将如本文任何方面所述的新型闭合线性DNA载体(也称为“闭合线性转移载体”)引入包装细胞或生产细胞。

除了本文所述的新型闭合线性DNA转移载体之外，生产慢病毒颗粒的方法还可以包括将一种或多种生产载体引入包装细胞。一种或多种生产载体编码制造慢病毒颗粒所需的病毒元件。一种或多种生产载体编码以下一项或多项：

(a)慢病毒组特异性抗原(GAG)基因；和/或

(b)慢病毒聚合酶(POL)基因；和/或

(c)包膜基因(ENV)；和/或

(d)慢病毒调控基因(REV)。

优选地，包膜基因(ENV)是水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)基因。VSV-G包膜蛋白对多种物种和细胞类型具有广泛的趋向性(tropism)。

GAG基因和POL基因可以被编码或包含在单个生产载体上。

此外，上面(a)至(d)列出的任何一种或多种基因可能不要求位于单独的生产载体上或已经存在于生产细胞中，因为该基因可以替代地在闭合线性DNA载体上提供。

此外，生产载体可以是任何合适的形式，例如闭合线性DNA载体或环状DNA载体或其混合物。

如果生产载体是闭合线性DNA，则优选的是它们包含至少一个间隔物序列。间隔物序列可优选包含在载体中于基因或表达盒的3'处。闭合线性DNA载体的间隔物序列可以是任何适当长度的核苷酸序列。间隔物序列被理解为通常是非编码DNA的序列，其可以具有或不具有特定序列。间隔物序列的长度可以是至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少1100、至少1200、至少1300、至少1400或至少1500个核苷酸。任选地，间隔物序列可以是本文所公开的任何长度范围的核苷酸。优选地，间隔物的长度为至少250、至少500或最优选至少1000个核苷酸(1kb)。或者或另外，间隔物序列可以存在于基因或表达盒的5'。

此外，包装细胞为受纳细胞(permissive cell)。任选地，包装细胞是HEK293细胞或其变体或衍生物。

此外，其中使用生产细胞，该生产细胞是表达慢病毒颗粒生产所需的辅助包装功能的稳定细胞系。

此外，闭合线性转移载体和/或生产载体可以通过任何合适的方式引入包装细胞或生产细胞，例如通过转染，任选化学转染。其中，通过化学转染将闭合线性转移载体和/或生产载体引入包装细胞或生产细胞中，转染剂可以选自磷酸钙(CaPO₄)、聚乙烯亚胺(PEI)或lipofectamine中的任一种。

此外，提供了从根据本发明的方法制备的包装细胞或生产细胞中产生和收获慢病毒颗粒的方法。该方法包括：

(a)诱导包装细胞中慢病毒颗粒的产生，所述包装细胞用至少一种适合于生产慢病毒颗粒的闭合线性DNA载体转染；和/或

(b)培养转染的包装或生产细胞；和

(c)从培养基中收获/分离产生的重组慢病毒颗粒。

所述方法还可以包括使用如本文任何地方所述的一种或多种闭合线性生产载体。因此，所述方法还可包括一种或多种闭合线性DNA生产载体的用途，所述载体包含：

(a)至少一个表达盒，其包括以下一项或多项：

(i)慢病毒组特异性抗原(GAG)基因；

(ii)慢病毒聚合酶(POL)基因；

(iii)包膜基因(ENV)；和/或

(iv)抗病毒调控基因(REV)，以及

(b)位于表达盒3'处的间隔物序列。

优选地，包膜基因(ENV)是水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)基因。

所述表达盒如前所述。

此外，生产慢病毒颗粒的方法或使用闭合线性DNA转移载体提高感染性慢病毒滴度的方法可以通过改变用于细胞转染的DNA总量，特别是通过减少用于细胞转染的DNA总量来优化。与其他DNA载体类型(例如质粒)相比，实现了这种减少。优选地，转染的总DNA小于1μg/ml、小于0.9μg/ml、小于0.8μg/ml或小于0.75μg/ml。最佳地，转染的DNA总量为0.7μg/ml或更少，例如0.6μg/ml或0.5μg/ml。

另外或可选地，生产慢病毒颗粒的方法或使用闭合线性DNA转移载体提高感染性慢病毒滴度的方法可以通过改变各种DNA构建体之间的比率来优化。因此，可以改变构建体比率，从而实现感染性慢病毒颗粒的生产增加。

当用4种DNA构建体(闭合线性转移载体、GAG/POL载体、REV载体和ENV(或VSVg)载体)转染包装细胞时，可以使用任何适当的构建体摩尔比。然而，为了获得优化的感染性滴度，构建体摩尔比优选为(写为转移：GAG/POL：REV：ENV DNA构建体)4:1:2:1、3:1:3:2、3:1:3:1.5或3:1:2:1。构建体比率可以是落在这些比率之间的任何合适的比率，例如3:1:2.5:1等。优选地，构建体比率为4:1:2:1。

还提供了用根据本发明第一方面的闭合线性转移载体转染的细胞。所述细胞可以是本文进一步定义的包装细胞或生产细胞。此外，细胞还可以用本文所述的一种或多种生产载体转染。

下文和权利要求中描述了进一步的实施方案。下面描述进一步的优点。

附图简要说明

图1A示出了用标准EF1α-eGFP-WPRE转移载体和慢病毒生产载体转染后72小时的包装细胞中的基因表达。使用探针LTR-P和eGFP对从细胞中提取的RNA进行RT-qPCR，以分别定量来源于转移载体的全长基因组RNA转录物和总RNA转录物。不含Poly(A)信号序列和间隔物的标准闭合线性DNA(dbDNA^TM)载体的转移载体基因表达与相应的质粒DNA(pDNA)相似，表明低感染性滴度并非是不足的转移载体RNA的结果。

图1B示出了通过qPCR测量的每个细胞的DNA载体拷贝，表明dbDNA载体拷贝相对于pDNA是过量的。细胞用1μg/ml总DNA转染。pDNA使用2:1:1:1的构建体质量比，dbDNA使用摩尔当量。转染后72小时进行测量。显示了每个载体的数据，并给出了质粒与闭合线性DNA水平的比较。

图2A示出了使用标准EF1α-eGFP-WPRE转移载体(不含poly(A)序列和间隔物)进行生产的滴度。这是构建体与滴度的关系图。闭合线性DNA(dbDNA^TM)转染的总病毒颗粒滴度(p24)比相应的pDNA转染低五倍。然而，dbDNA^TM转染的感染性病毒滴度低于检测限(LOD)，表明在这种情况下产生的感染性病毒颗粒非常少。关键：VP/mL是病毒颗粒/毫升，TU/mL是转导单位/毫升(感染性滴度)。

图2B示出了在指定的DNA:PEI比率下用减少的总输入量的标准闭合线性载体转染的HEK293F生产细胞中的总病毒颗粒滴度(VP/mL)。

图3示出了使用标准EF1α-eGFP-WPRE转移载体进行生产的滴度，同时尝试优化条件以改善感染性滴度(滴度与构建体的关系图)。1ug/mL质粒构建体以2:1:1:1(eGFP:Gagpol:Rev:VSVg)的质量比转染，0.5ug/mL闭合线性dbDNA^TM使用摩尔当量(Mol)或指定的比率转染。优化dbDNA^TM转染条件可完全挽救总颗粒滴度(p24)，但标准闭合线性DNA转移载体的感染性滴度仍比质粒低100倍。

图4A和4B中显示的结果(滴度与构建体的关系图)表明增加转移载体的比率并不能挽救感染性滴度(感染性滴度-图4A)。基因组滴度测定的结果(图4B)表明，与pDNA相比，将病毒基因组包装成颗粒对于闭合线性DNA载体来说效率较低，并且增加转移载体的量并不能改善这种情况。

图5示出了实施例中使用的各种闭合线性DNA载体结构。LV-eGFP包括酶Avrll 3'的限制酶识别序列至3'SIN LTR。LV-eGFP-pA在3'SIN LTR序列的3'处包含SV40晚期poly(A)信号序列。LV-eGFP-pA-FTS包括SV40晚期poly(A)信号序列和3'SIN LTR序列3'处的F区终止序列。LV-eGFP-pA-RS1包括SV40晚期poly(A)信号序列和3'SIN LTR序列3'处的1kb随机间隔物(RS)。RSV1-LV-eGFP-pA-RS1还包括1kb 5'随机间隔物(RS)间隔物。其他元件包括5'LTR、EF1α启动子、eGFP转基因、随机间隔物(RS)和WPRE元件的序列。

图6(A-C)显示了如图5所示的不同转移载体对总滴度(6A)、感染性滴度(6B)和基因组滴度(6C)的影响。图是构建体与滴度的关系。在这种情况下，将LV-eGFP与LV-eGFP-pA进行比较。此外，在仅有闭合线性DNA载体的情况下，首先使用Avrll限制性酶消化LV-eGFP，以切除3'SIN LTR下游的序列并减轻推定的通读干扰。添加SV40晚期poly(A)序列可改善质粒和闭合线性DNA生产的感染性和基因组滴度。

图7(A-C)显示了如图5所示的不同构建体对总滴度(7A)、感染性滴度(7B)和基因组滴度(7C)的影响。图是构建体与滴度的关系。在闭合线性DNA的情况下，在SV40晚期poly(A)序列下游添加F区终止序列或1kb随机间隔物序列可进一步提高感染性和基因组滴度。

图8(A-B)显示了对闭合线性DNA载体的转染条件针对与pDNA相比的感染性滴度进行进一步优化，其导致感染性滴度仅比质粒低两倍。图8A显示了相对于质粒对照，减少总输入闭合线性DNA对感染性滴度的影响，显示峰值滴度为0.7μg/mL。图8B显示了使用LV-eGFP-pA-RS1kb和优化条件进行生产的颗粒和感染性滴度。

图9(A-D)示出了实施例中使用的(A)proTLx转移载体、(B)proTLx Gag-Pol生产载体、(C)proTLx Rev生产载体和(D)proTLx VSVg生产载体的质粒图谱。(A)proTLx-K LV-eGFP-pA-RS1包括位于3'SIN LTR序列3'处的SV40晚期poly(A)信号序列，以及位于SV40晚期poly(A)信号序列的序列的3'处的1kb随机间隔物(RS)。其他元件包括5'修饰LTR、随机间隔物(RS)、HIV-1Psi、Rev响应元件(RRE)、cPPT、EF1α启动子、eGFP转基因、WPRE、5'TelRL(原核端粒酶识别位点)、卡那霉素抗性(KanR)启动子、KanR基因和pUC ori的序列。(B)proTLxGag-Pol生产载体包括Gag和Pol基因。其他元件包括随机间隔物(RS)、cPPT、RRE、β-珠蛋白poly(A)信号序列、卡那霉素抗性(KanR)启动子、KanR基因以及pUC ori和5'TelRL(原核端粒酶识别位点)的序列。(C)proTLx Rev生产载体包括Rev基因。其他元件包括3'TelRL(原核端粒酶识别位点)、随机间隔物(RS)、RSV启动子、HIV LTR poly(A)信号序列、卡那霉素抗性(KanR)启动子、KanR基因和pUC ori的序列。(D)proTLx VSVg生产载体包括VSVg包膜蛋白基因。其他元件包括3'TelRL(原核端粒酶识别位点)、随机间隔物(RS)、CMV增强子和启动子、β-珠蛋白内含子、β-珠蛋白poly(A)信号序列、卡那霉素抗性(KanR)启动子、KanR基因和pUCori的序列。

图10(A-C)显示了根据感染性滴度对使用LV-RS1-eGFP-pA-RS1转移载体的转染条件进行进一步优化。图10A显示了比较线性闭端DNA LV-eGFP-pA-RS1和LV-RS1-eGFP-pA-RS1的感染性滴度，证明使用3'RS1的感染性滴度提高了1.8倍。图10B示出了使用0.7μg/mlDNA和指定的摩尔构建体比率产生的LV的感染性滴度。使用质量比为2:1:1:1(eGFP:GagPol:Rev:VSVg)的1μg/mL质粒DNA生产的LV作为对照。图10C显示了相对于质粒，在低DNA输入下使用LV-RS1-eGFP-pA-RS1的感染性滴度。闭合线性DNA和质粒DNA分别以4:1:2:1的摩尔比和2:1:1:1的质量比进行转染。

图11A-B示出了对生产构建体中3'RS1kb的评估，其挽救了闭合线性DNA衍生的LV。图11A显示了使用摩尔构建体比率为4:1:2:1的0.7μg/mL dbDNA产生的LV的感染性滴度。LV-RS1-eGFP-pA-RS1转移载体与我们的标准辅助构建体(Std)组合使用，并且每个生产构建体重复地交换为包含3'RS1元件的等同构建体，以便每个构建体都经过独立测试并与所有其他组合。图11B显示了使用CAR19h28z转移载体、GagPol-RS1、Rev-RS1和VSVg(0.7μg/mLdbDNA，摩尔比为4:1:2:1)产生的LV的感染性滴度。误差条代表重复之间的标准偏差。

发明详述

本发明涉及一种新型闭合线性DNA载体，其适用于慢病毒颗粒的生产。最值得注意的是，与缺乏这种结构的闭合线性DNA载体相比，这适合产生更高的慢病毒感染性颗粒滴度。

慢病毒颗粒及其生产

慢病毒颗粒(LVP)是一种基于人类免疫缺陷病毒(HIV-1)的经充分研究的载体系统。其他慢病毒系统也被开发为基因转移系统，包括HIV-2、猿猴免疫缺陷病毒(SIM)和非灵长类慢病毒，如猫免疫缺陷病毒(FIV)、马传染性贫血病毒(EIAV)和山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)。可用于生产慢病毒颗粒的慢病毒组分是本领域已知的。例如，参见Zufferey etal.(1997)Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient genedelivery in vivo,Nature Biotechnology,15:871-875；以及Dull et al.(1998)Athird-generation lentivirus vector with a conditional packaging system,Journal of Virology,72(11):8463-8471；和表1。

表1-基于HIV-1的慢病毒载体的顺式作用和反式作用元件

由于HIV-1在人类中的致病性，出于安全考虑，已经开发了多代慢病毒系统来生产慢病毒颗粒。有关可用于慢病毒颗粒生产的慢病毒系统的概述，请参见Schweizer andMerten,2010,Current Gene Therapy 10(6),474-486；和Merten,Hebben and Bovolenta,2016,Molecular Therapy–Methods&Clinical Development 3,16017；doi:10.1038/mtm.2016.17。最广泛使用的用于临床、研究和开发目的的慢病毒系统是第三代四载体系统，其表达：

1)慢病毒组特异性抗原(GAG)基因和慢病毒聚合酶(POL)蛋白

2)包膜蛋白(通常是水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G))

3)病毒体蛋白(Rev)蛋白表达的HIV调控因子；和

4)含有转基因或其他编码序列的转移载体

通常，上述四种DNA载体是质粒的形式。传统上，包装细胞，例如人胚肾细胞(例如HEK293)，是作为贴壁细胞培养物用四种质粒中的每一种转染的。瞬时转染的细胞能够产生携带目标基因的慢病毒颗粒。

然而，随着对悬浮培养的兴趣增加，HEK293F的使用变得越来越广泛，因为悬浮培养更适合商业扩大化。

本发明涉及一种新型闭合线性DNA载体，其适用于根据任何适当的方法生产慢病毒颗粒。

闭合线性DNA载体

发明人开发了一种新型闭合线性DNA载体，也称为“闭合线性转移载体”，其具有某些特征，使其能够在产生感染性滴度的慢病毒颗粒方面优于现有的闭合线性DNA载体。闭合线性DNA载体可以采取任何适当的形式，具有任何类型的“闭合”末端。闭合线性DNA载体也可以称为闭合线性DNA分子。

闭合线性DNA通常被理解为在每个末端共价闭合或加帽的双链DNA。因此，DNA的双链部分或双链体部分是互补的。当变性时，闭合线性DNA可形成单链环。DNA可以在每个末端通过任何合适的结构闭合，包括十字形、发夹或发夹环，这取决于偏好。闭合线性DNA的末端可以包含非互补序列，从而迫使DNA在十字形、发夹或发夹环处形成单链构型。或者，该序列可以是互补的，使得末端形成发夹。

优选的是，末端由原核端粒酶(protelomerase)的靶序列的一部分形成。原核端粒酶靶序列是任何DNA序列，其在DNA模板中的存在允许原核端粒酶的酶活性，其切割DNA的双链部分并重新连接它们，留下共价闭合的末端。一般而言，原核端粒酶靶序列包含任何完美的回文序列，即具有两倍旋转对称性或完美的反向重复的任何双链DNA序列。闭合线性DNA可在一个末端或两个末端具有原核端粒酶靶序列的一部分。原核端粒酶靶序列可以用于每个末端相同的同源原核端粒酶，或者是用于每个末端不同的原核端粒酶的同源序列。通过各种原核端粒酶的作用构建的闭合线性DNA先前已由申请人在WO2010/086626、WO2012/017210、WO2016/132129和WO2018/033730中公开，所有这些均通过引用并入。使用体外DNA扩增然后用原核端粒酶切割构建的闭合线性DNA具有以下优点：闭合线性DNA在体外无细胞环境中产生，并且可以扩大化以用于商业生产。这些闭合线性DNA载体被称为Doggybone^TMDNA或dbDNA^TM。优选的是，闭合线性DNA载体是使用申请人的现有方法以体外无细胞的方式制备的，该方式基于具有至少一种原核端粒酶靶序列的DNA模板的基于聚合酶的扩增，以及用原核端粒酶对扩增的DNA进行加工以产生闭合线性DNA。

可以通过将具有必需的原核端粒酶靶序列的质粒转化为闭合线性DNA载体来构建闭合线性DNA，尽管这不是有效的生产方法。

其他闭合线性DNA载体已通过各种体外策略构建，包括PCR产物加帽和“极简化免疫原性定义基因表达(MIDGE)”载体。MIDGE通过以下产生：从细菌细胞中分离质粒后消化原核和真核骨架，然后将所需的DNA序列连接到发夹序列中进行末端再填充。通过此类方法制备的结构也适用于本发明的DNA载体。

基于蛋白酶的作用以体内方式在细胞培养中产生的DNA“小链(ministring)”也是适用于本发明的闭合线性DNA载体。

可能合适的闭合线性DNA的其他形式包括在末端以十字形结构闭合的DNA，其可以再次在细胞培养中或在体外酶促方法中制造。

可优选的是，闭合线性DNA在无细胞系统中制造，因为这确保了产物的纯度；另一方面，监管机构将要求对通过细胞方法制备的闭合线性DNA进行严格纯化。

闭合线性DNA载体可以被设计为最小载体，仅包括其所期望的功能和结构所必需的序列(即，它们递送的序列和编码闭合末端的序列，例如双链线性部分末端的十字形、发夹或发夹环)。可以从闭合线性DNA载体中排除的不必要的或无关的序列(例如细菌序列)可以包括细菌复制起点、细菌选择标记(例如抗生素抗性基因)和未甲基化的CpG二核苷酸。不包含此类序列使得能够创建不包含无关遗传物质的“最小”载体。当细胞用于治疗目的时，这可能是优选的，因为没有引入可能影响载体性能或引起不必要的副作用(即抗生素抗性基因)的遗传物质。

申请人此前曾在“第二代”慢病毒载体的制造中使用闭合线性DNA载体。与常用的pDNA载体相比，此类闭合线性DNA载体不包含任何进一步的修饰。如上所述的此类未修饰的闭合线性DNA载体对于慢病毒载体的生产，特别是对于第三代慢病毒方法来说是低效的转移载体，如实施例1中所证明的。因此，本发明人开发了一种新的闭合线性DNA载体，在本文中称为“闭合线性转移载体”，其设计特点使其在生产感染性滴度的慢病毒颗粒方面优于现有的闭合线性DNA载体。

一方面，本发明涉及一种适合用作慢病毒转移载体的闭合线性DNA载体，所述闭合线性DNA载体从5'至3'包含以下顺序的序列：

(a)杂合5'长末端重复(LTR)序列；

(b)有效连接至转基因的启动子；

(c)3'自失活(SIN)LTR序列；

(d)poly(A)信号序列；和

(e)间隔物序列。

闭合线性DNA载体内可包含额外的序列，例如额外的间隔物序列。

在载体中，启动子和转基因以及包含在颗粒中的任何额外序列一起，有效地侧接5'和3'LTR序列。如本文所用，侧接并不意味着5'LTR和3'SIN LTR必须紧邻启动子和转基因，而是提供待包装到LV颗粒中的RNA分子的末端。本领域技术人员将理解，LTR序列来自用于包装到LV颗粒中的单链RNA的“侧接”末端。在逆转录病毒中，被LTR侧接的序列部分转录为RNA中间体，然后逆转录为互补DNA(cDNA)，最终形成具有完整LTR的dsDNA(双链DNA)。然后，LTR通过LTR特异性整合酶介导DNA整合进宿主染色体的另一个区域。

因此，在一个方面，本发明涉及一种新型闭合线性DNA载体，本文称为“闭合线性转移载体”，其包含：

a)有效连接至转基因的启动子；

b)编码与启动子和转基因侧接的杂合5'长末端重复(LTR)和3'SIN LTR的序列；

c)编码位于3'LTR的3'处的poly(A)信号的序列；和

d)间隔物序列，其位于编码poly(A)信号的序列的3'。

这种闭合线性转移载体适合用作制造感染性慢病毒颗粒(慢病毒载体)的转移载体。

具体地，特征(c)编码poly(A)信号的序列和(d)间隔物序列提供了具有增强感染性滴度的慢病毒颗粒的生产的特征的新型闭合线性DNA载体。此类感染性颗粒含有转基因。下面更详细地描述这些特征。

如先前所解释的，闭合线性DNA转移载体中的序列可以被描述为编码RNA分子内的元件的序列，或者可以被描述为那些元件本身的序列。还将理解，由于闭合线性DNA是双链体，相关序列元件及其互补序列都将存在于载体中。

Poly(A)信号序列

信使RNA(mRNA)的合成通常需要聚腺苷酸化过程，其中RNA裂解与新形成的RNA 3'末端上的聚腺苷单磷酸(腺嘌呤碱基)的合成相结合。用于聚腺苷酸化的序列元件包括RNA序列中的聚腺苷酸化信号(poly(A)信号)。在mRNA中，添加的一段聚腺苷单磷酸称为聚腺苷酸尾(poly(A)尾)。poly(A)尾有助于提高翻译效率。

发明人发现，在用作慢病毒转移载体的闭合线性DNA分子中包含编码3'LTR的序列的3'处的编码聚腺苷酸化(poly(A))信号的序列(或“poly(A)信号序列”)增加了基因组和感染性病毒滴度(参见实施例1和图6)。Poly(A)信号序列可能位于真核蛋白编码基因的3'处。一般来说，中心序列基序AAUAAA或AUUAAA是RNA中poly(A)信号的关键元件，并且该中心序列可能需要侧接辅助元件来进行前信使RNA的3'端切割和聚腺苷酸化以及促进下游转录终止。许多poly(A)信号是本领域已知的，并且可以使用任何合适的序列。RNA中的poly(A)信号可包括序列AAUAAA，包括至少一个富含GU的序列和/或至少一个富含U的序列。

优选地，编码poly(A)信号的序列编码强poly(A)信号。因此，强poly(A)信号序列是优选的。许多强poly(A)信号是本领域已知的，并且这些可以被定义为提供有效的转录终止。转录终止是转录复合物和新生RNA均从模板DNA中释放的过程。技术人员将能够使用常规方法确定poly(A)信号是否提供有效终止。在优选的实施方案中，编码强poly(A)信号的序列选自SV40晚期polyA序列或与其具有至少90％同源性的序列、兔β-珠蛋白(rbGlob)poly(A)序列或与其具有至少90％同源性的序列、或牛生长激素poly(A)(bGHpA)或与其具有至少90％同源性的序列。这些可以被描述为“强”poly(A)信号。

编码poly(A)信号的序列还可包含上游序列元件(USE)。USE是本领域公知的，并且被认为可以提高聚腺苷酸化信号的效率。

间隔物序列

3'间隔物序列

发明人发现，在上述新型闭合线性DNA载体中包括编码poly(A)信号的序列的3'处的间隔物序列进一步增加了基因组和感染性病毒滴度(参见实施例1和图7)。新型闭合线性DNA载体中编码poly(A)信号的序列(poly(A)信号序列)的3'处的间隔物序列可以称为下游间隔物序列或3'间隔物序列。有趣的是，将相同的间隔物序列并入基于质粒的慢病毒转移载体中并不影响病毒滴度(参见实施例1和图7)，因此认为该效果取决于闭合线性载体本身的形式。间隔物序列可以是任何合适的长度和任何合适的序列。优选地，新型闭合线性转移载体的间隔物序列的长度可以是至少250个核苷酸。间隔物序列的长度可以是至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少1100、至少1200、至少1300、至少1400或至少1500个核苷酸。可优选地，间隔物的长度为至少250、至少500或最优选至少1000个核苷酸(1kb)。间隔物将编码poly(A)信号的序列与线性DNA分子的闭合末端分隔开。如果末端通过原核端粒酶序列的一部分而闭合，则间隔物序列的3'端可以与原核端粒酶序列的该部分的5'端相邻。如果末端通过发夹而闭合，则可以应用相同的概念，发夹和间隔物的序列可以是相邻的。间隔物序列可以具有任何适当的长度。由于其不存在于最终的慢病毒载体(感染性慢病毒颗粒)中，因此在确定间隔物序列的长度时不需要考虑慢病毒载体基因组的容量。

由于间隔物序列存在于双链体DNA中，因此间隔物序列可以根据碱基对长度来确定。间隔物序列任选地是非编码DNA，例如，它不编码蛋白或RNA产物。间隔物的序列可以是随机的。不希望受到理论的束缚，发明人推测当转移载体是闭合线性DNA的形式时，间隔物序列促进有效的RNA加工。发明人注意到，由于闭合线性DNA的结构，这是一个特定的要求，并且在质粒DNA中添加间隔物序列对感染性滴度没有影响(参见实施例1和图7)。

5'间隔物序列

发明人发现，在上述新型闭合线性DNA分子中包含5'长末端重复(5'LTR)的5'处的间隔物序列进一步改善了感染性病毒滴度(参见实施例2和图7B)。新型闭合线性DNA分子中5'LTR的5'处的间隔物序列可称为上游间隔物序列。间隔物序列可以是任何合适的长度和任何合适的序列。优选地，下游间隔物的序列与上游间隔物的序列不同。优选地，下游间隔物的序列可以与上游间隔物的序列不同。优选地，新型闭合线性转移载体的间隔物序列的长度可以是至少250个核苷酸。间隔物的长度可以是至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少1100、至少1200、至少1300、至少1400或至少1500个核苷酸。优选地，间隔物的长度为至少1kb。间隔物将5'LTR与线性DNA分子的闭合末端分隔开。如果末端通过原核端粒酶序列的一部分而闭合，则上游间隔物序列的5'端可以与原核端粒酶序列的该部分的3'端相邻。如果末端通过发夹而闭合，则可以应用相同的概念，发夹和间隔物的序列可以是相邻的。上游间隔物序列可以具有任何适当的长度。由于其不存在于最终的慢病毒载体(感染性慢病毒颗粒)中，因此在确定上游间隔物序列的长度时不需要考虑慢病毒载体基因组的容量。

由于上游间隔物序列存在于双链体DNA中，因此上游间隔物序列可以根据碱基对长度来确定。上游间隔物序列任选地是非编码DNA，例如，它不编码蛋白或RNA产物。上游间隔物的序列可以是随机的。该序列也可以不同于任何下游间隔物序列。

转基因

本发明任何方面的闭合线性转移载体可包含表达盒，所述表达盒包含以下或由以下组成或基本上由以下组成：与编码目标产物的序列有效连接的真核启动子。编码目标产物的序列可以称为转基因。转基因可以编码RNA产物，例如抑制性RNA(例如，microRNA或小发夹RNA(shRNA))或蛋白产物(通过信使RNA)。本发明任何方面的闭合线性转移载体优选包括与转基因有效连接的启动子或增强子。根据需要，可以使用一种或多种启动子或增强子。可以使用任何合适的启动子或增强子。这些用于在慢病毒载体已被构建并应用于所需靶向的细胞后表达转基因。

选择的转基因将取决于慢病毒载体的具体用途。转基因的说明性非限制性实例包括编码治疗性RNA的转基因(例如编码与靶RNA或DNA序列互补的反义RNA的转基因)、编码在患病受试者中缺陷或不存在的蛋白的基因治疗转基因以及用于DNA疫苗接种的疫苗转基因(即编码蛋白，其表达将诱导受体生物体针对所述蛋白进行疫苗接种)。

“启动子”是启动和调控聚核苷酸转录的核苷酸序列。启动子可包括诱导型启动子(其中有效连接至启动子的聚核苷酸序列的表达由分析物、辅因子、调控蛋白等诱导)、阻抑型启动子(其中有效连接至启动子的聚核苷酸序列的表达被分析物、辅因子、调控蛋白等诱导)和组成型启动子。术语“启动子”或“增强子”旨在包括全长启动子区域和这些区域的功能性(例如，控制转录或翻译)片段。该术语包括双向启动子。

在实施例中，EF1α(延伸因子1-α)用作启动子。这是一种组成型启动子，因此可适用于在慢病毒载体被递送后在靶细胞中表达转基因。也可以使用修饰的EF1α启动子，例如hEF1α-HTLV启动子，其是包含人EF1α核心启动子和R区段以及人T细胞白血病病毒(HTLV)1型长末端重复的U5序列(R-U5')的一部分的复合启动子。EF1α启动子表现出很强的活性，并能在体内产生长且持久的转基因表达。R-U5'已与核心启动子偶联以增强RNA的稳定性。适用于本发明的可选启动子包括但不限于：巨细胞病毒(CMV)启动子、鼠干细胞病毒(MSCV)启动子、磷酸甘油酸盐激酶1(PGK)启动子、胸苷激酶(TK)启动子、脾病灶形成病毒(SFFV)启动子、CAG启动子和聚泛素C(UBC)启动子或其转录活性片段。还可以选择启动子以允许在体内施用慢病毒载体后进行细胞特异性表达。例如，通过包含酪氨酸酶启动子或增强子片段已经实现了对黑色素瘤细胞的靶向。本领域技术人员将能够选择合适的细胞特异性启动子以用于本发明。

“有效连接(operably linked)”是指元件的布置，其中如此描述的组分被配置为执行它们的通常功能。因此，当存在适当的酶时，有效连接至核酸序列的给定启动子能够影响该序列的表达。启动子不需要与序列相连续，只要它起到指导其表达的作用即可。因此，例如，插入的非翻译但转录的序列可以存在于启动子序列和核酸序列之间，并且启动子序列仍然可以被认为是与编码序列“有效连接”。因此，术语“有效连接”旨在涵盖启动子元件和转基因的任何间隔或方向，其允许在体内通过转录复合物识别启动子元件后来启动转基因的转录。

在特定的实施方案中，多顺反子表达盒可以用于闭合线性转移载体。多顺反子表达盒包含与单个表达盒中的单个启动子有效连接的多个基因，使得能够从单个转录本翻译多个基因。多顺反子表达盒可能是理想的，因为它们能够使选择剂或标记基因共表达，允许可管理的构建体大小，能够持续产生目标基因产物，并提供机会以包含条件性细胞毒性基因作为可能发生不良临床事件情况下的安全保障。设计和产生功能性多顺反子表达盒的方法是本领域公知的，并且包括使用内部核糖体进入位点(IRES)、自切割2A肽和/或双向启动子。例如，参见Shaimardanova et al(2019)Production and Application ofMulticistronic Constructs for Various Human Disease Therapies.Pharmaceutics,11(11):580,doi:10.3390/pharmaceutics11110580；和Golding,M.&Mann,M.(2011)Abidirectional promoter architecture enhances lentiviral transgenesis inembryonic and extraembryonic stem cells.Gene Therapy,18:817–826,https://doi.org/10.1038/gt.2011.26。

LTR序列

在本发明的任何实施方案中，闭合线性转移载体包含编码与启动子和转基因侧接的5'长末端重复(LTR)和3'LTR的序列。换句话说，载体包括与启动子和转基因侧接的5'长末端重复(LTR)序列和3'LTR序列。因此顺序是：5'LTR；与转基因有效连接的启动子；3'LTR。LTR之间可以包含额外的序列。除了LTR侧接的序列之外，载体中还可以存在额外的序列。

LTR是病毒衍生的元件，其有助于将转基因整合到宿主细胞的基因组中。野生型LTR包含独特的3'(U3)区域、重复(R)区域和独特的5'(U5)区域，使得野生型5'LTR和3'LTR均具有U3-R-U5结构。在第三代慢病毒颗粒平台中，与野生型慢病毒LTR相比，编码LTR的序列被修饰，以使基于慢病毒的载体更安全地用于研究和临床环境。

本发明中使用的LTR序列可以衍生自任何慢病毒。慢病毒是逆转录病毒属，包括人免疫缺陷病毒(HIV–1至3型)。尽管基于HIV的载体构成了目前使用的慢病毒载体中的大多数，慢病毒载体也可衍生自灵长类慢病毒(HIV-2和猿猴免疫缺陷病毒(SIV))和非灵长类慢病毒(例如Maedi Visna病毒(MVV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)、Jembrana病病毒(JDV)、美洲狮慢病毒、狮子慢病毒和牛免疫缺陷病毒(BIV))。因此，LTR可以衍生自任何慢病毒，但优选衍生自HIV-1。

在本发明的任何方面，5'LTR是杂合LTR(也可以称为修饰的5'LTR)。杂合LTR表示野生型LTR的一部分已被去除，并且已插入异源序列。杂合5'LTR可以允许不依赖于Tat的转录。为了减少或消除对Tat的依赖性，可以缺失全部或部分U3区域。为了维持表达，可以使用异源启动子取代U3区的功能。这样的启动子可以是另一种病毒启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子。

杂合5'LTR的任何合适的序列都可以用于本发明，并且一些序列是本领域已知的。杂合5'LTR不是野生型病毒LTR。

在优选的实施方案中，编码5'LTR的序列被部分缺失并与异源增强子或启动子元件融合，以使得转基因的表达不依赖于Tat。因此，5'LTR序列被部分缺失并与异源增强子或启动子元件融合。

在优选的实施方案中，编码3'LTR的序列是3'自失活(SIN)LTR的序列。换句话说，载体包含3'SIN LTR序列。与野生型慢病毒3'LTR相比，3'SIN LTR具有一个或多个缺失，并且可以称为经修饰的3'LTR。在一轮逆转录后，所述一个或多个缺失被转移至5'LTR中。这种缺失会在全长病毒掺入宿主细胞后消除其转录。所述一个或多个缺失可包括启动子或增强子元件的部分或完全缺失，所述启动子或增强子元件包括TATA盒以及转录因子Sp1和NF-κB的结合位点。3'SIN LTR是本领域公知的，并且技术人员将能够确定适当的构建体。在一个优选的实施方案中，3'SIN LTR在3'LTR的U3区中包含133个核苷酸的缺失，位于相对于野生型慢病毒3'LTR的转录起始位点的核苷酸位置-149至-9处。SIN 3'LTR不是野生型病毒LTR。

除了3'LTR中的缺失之外，3'SIN LTR可以包括异源序列以赋予特定功能。因此，3'LTR也可以被描述为杂合LTR。任何异源序列元件都可以插入到3'LTR中。例如，可以插入异源调控元件。编码杂合SIN 3'LTR的任何合适的序列都可以用于本发明，并且一些序列是本领域已知的。杂合SIN 3'LTR不是野生型病毒LTR。

此外，3'SIN LTR可以包含USE-元件来代替U3区的缺失。优选地，USE-元件衍生自SV40。

本发明的闭合线性DNA载体中包含的序列优选是编码衍生自HIV-1的LTR的序列，但显然可以将类似的修饰应用于其他合适的LTR以具有类似的效果。

包括编码其他元件的序列

闭合线性转移载体可包含编码其他元件的序列，或附加元件的序列，如表1中所总结。此类元件可包括RNA包装信号Psi(Ψ)(其通常可位于5'LTR的3'处)、Rev响应元件(RRE)(其通常可位于Psi的3')和中央多嘌呤束(cPPT)(其通常可位于RRE的3')。可以编码或包括另外的额外功能序列，例如引物结合位点(PBS)或土拨鼠肝炎转录后调控元件(WPRE)，也可以有利地包括在本发明的闭合线性转移载体中，以使转基因在体内的表达更加稳定。WPRE可以增加病毒载体的转基因表达，但确切的作用机制尚不清楚。当WPRE放置在转基因下游、靠近多腺苷酸化信号时最有效。WPRE可以替代来自其他病毒的其他转录后调控元件(PRE)。认为WPRE减少了来自慢病毒3'-LTR的转录通读，并且将其用于本申请的实施例中。鉴于其存在于最初测试(修饰前)的闭合线性DNA载体中，令发明人惊讶的是，通过进行本文所述的修饰可以改善闭合线性慢病毒转移载体的性能。

制备慢病毒载体的方法

在本发明的第二方面，本文提供了生产感染性慢病毒颗粒(LVP)(也称为慢病毒载体)的方法。

在实施方案中，本文描述的方法包括用如上所述的闭合线性转移载体和一种或多种生产载体转染包装细胞。

在实施方案中，本文描述的方法包括用如上所述的闭合线性转移载体转染生产细胞。

生产载体

如本文所用，术语“生产载体”或“生产构建体”是指含有编码产生慢病毒颗粒和将目标基因(或转基因)“包装”在最终的感染性慢病毒颗粒中所必需的组分的序列的载体。这些也可以称为“包装元件”(特别是GAG、POL或REV元件)。生产载体包括表达盒，其是指载体的独特组分，并且包括待递送至转染的包装细胞中并最终由转染的包装细胞表达的一种或多种基因和调控序列。可以将一种或多种生产载体转染至包装细胞中，每种生产载体包含一个或多个表达盒。在本领域中，这些也可以被称为“附属构建体(accessory construct)”或“辅助构建体(helper construct)”。

病毒体蛋白基因表达的慢病毒调控因子(REV)基因编码一种RNA结合蛋白，该蛋白与未剪接或部分剪接转录本中的Rev响应元件(RRE)结合，以促进它们从细胞核转运到细胞质。

包膜(ENV)基因编码包膜蛋白，该蛋白对于产生的慢病毒颗粒进入宿主细胞至关重要。慢病毒颗粒可以是假型载体，包含修饰的包膜蛋白、源自不同病毒的包膜蛋白或嵌合包膜蛋白，允许转导缺乏CD4的宿主细胞。一系列不同的包膜蛋白可用于产生包膜假型慢病毒颗粒。因此，例如，ENV基因可以编码水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)蛋白，该蛋白结合LDL受体家族成员，从而允许慢病毒颗粒感染许多不同宿主物种的多种细胞类型，包括多种人类细胞。优选地，ENV基因编码VSV-G。本领域技术人员可以选择替代的包膜蛋白，包括非人逆转录病毒的包膜蛋白，例如亲嗜性(ecotropic)逆转录病毒鼠白血病病毒(MULV)、长臂猿白血病病毒(GALV)、猫内源性RD114逆转录病毒、Moloney MULV 4070A、Moloney MULV毒株10A1，以及狂犬病病毒糖蛋白、麻疹病毒血凝素和融合糖蛋白。

GAG基因编码一种聚蛋白(polyprotein)，该聚蛋白由未剪接的mRNA翻译而来，然后被病毒蛋白酶(PR)切割成基质蛋白、衣壳和核衣壳蛋白。慢病毒聚合酶(POL)基因编码酶促蛋白逆转录酶、蛋白酶和整合酶。

每个功能(或组分)可以衍生自任何合适的慢病毒。然而，在优选的实施方案中，GAG-POL和REV衍生自HIV病毒，特别是衍生自HIV-1或HIV-2。

目前，本领域认为从任何来源提供给细胞的载体的最佳总数是四种。为了最大限度地减少病毒传播的风险，这个最佳数量似乎是必要的。然而，将来可能可以使用多于或少于四种载体来生产慢病毒颗粒。例如，使用两种、三种、五种或六种载体。

在一个优选的实施方案中，包装细胞用闭合线性转移载体和至少一种生产载体转染，每种生产载体包含至少一个表达盒，该表达盒编码以下一项或多项：

1)慢病毒组特异性抗原(GAG)；

2)慢病毒聚合酶(POL)蛋白；

3)包膜蛋白(优选水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G))；或者

4)病毒体蛋白表达的HIV调控因子(Rev)蛋白

使得转染的细胞含有产生慢病毒颗粒所需的所有组分。

生产载体可以包含多于一个表达盒。GAG基因和POL基因可以包含在单个生产载体上。因此，GAG和POL可共有相同的启动子序列。

应当注意，“生产载体”在本领域中有时被称为“包装载体”。

生产载体可以以闭合线性DNA载体或环状DNA载体(例如质粒或小环(minicircle))的形式被提供给细胞。优选的是，所使用的所有DNA载体都是闭合线性DNA，或者可以使用混合的载体结构。

闭合线性生产载体

当生产载体是闭合线性DNA载体的形式时，它可以采取任何适当的形式，具有任何类型的“闭合”末端，如上所述。当生产载体是闭合线性DNA载体的形式时，它可以被称为闭合线性生产载体。

发明人发现，在闭合线性生产载体中的表达盒的3'处包含间隔物序列提供了对感染性滴度的改善(参见实施例3和4，以及图10A和12A)。

因此，本发明还涉及一种适合用作生产载体的闭合线性DNA载体(闭合线性生产载体)，所述闭合线性生产载体包含：

a)至少一个表达盒，其包括以下一项或多项：

(i)慢病毒组特异性抗原(GAG)基因；

(ii)慢病毒聚合酶(POL)基因；和/或

(iii)包膜基因(ENV)；和/或

(iv)慢病毒调控基因(REV)；和/或

b)位于表达盒的3'处的间隔物序列。

表达盒是载体DNA的独特组分，其由至少一个基因和待由转染细胞表达的调控序列(例如启动子)和终止子元件组成。终止元件可以是任何适当的元件，包括polyA序列或实际上LTR或经修饰的LTR。

闭合线性生产载体中表达盒的3'处的间隔物序列可以是任何合适的长度和任何合适的序列。优选地，闭合线性生产载体的间隔物序列的长度可以是至少250个核苷酸。间隔物的长度可以是至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少1100、至少1200、至少1300、至少1400或至少1500个核苷酸。可优选地，间隔物的长度为至少250、至少500或最优选至少1000个核苷酸(1kb)。间隔物将表达盒与线性DNA分子的闭合末端分隔开。如果末端通过原核端粒酶序列的一部分而闭合，则间隔物序列的3'端可以与原核端粒酶序列的该部分的5'端相邻。如果末端通过发夹而闭合，则可以应用相同的概念，发夹和间隔物的序列可以是相邻的。间隔物序列可以具有任何适当的长度。由于其不存在于最终的慢病毒载体(感染性慢病毒颗粒)中，因此在确定间隔物序列的长度时不需要考虑慢病毒载体基因组的容量。

由于间隔物序列存在于双链体DNA中，因此间隔物序列可以根据碱基对长度来确定。间隔物序列任选地是非编码DNA，例如，它不编码蛋白或RNA产物。间隔物的序列可以是随机的。不希望受到理论的束缚，发明人推测当转移载体是闭合线性DNA的形式时，间隔物序列促进有效的RNA加工。可优选的是，如果存在两个间隔物序列，则它们是不同的序列。

所使用的一种或多种生产载体可以具有相同的载体结构，或者可以使用混合的载体结构。换言之，可以使用具有或不具有3'间隔物序列的闭合线性DNA载体或环状DNA载体(例如质粒或小环)形式的生产载体的任何组合。

本领域技术人员可以理解，本发明的闭合线性转移载体还可以包括上述包装元件中的任意一种或多种，和/或表1中概述的元件。这些包装元件可以作为多顺反子表达盒的一部分或作为单独的表达盒存在于闭合线性转移载体中。例如，编码GAG基因的表达盒可以包含在闭合线性转移载体中。

包装细胞

如本文所用，术语“包装细胞”是指用于生产慢病毒颗粒的细胞。优选地，包装细胞是哺乳动物细胞。

用于生产慢病毒颗粒的哺乳动物细胞是本领域已知的。包装细胞的代表性实例包括人胚肾(HEK)293细胞及其衍生物或变体。例如，在一些实施方案中，可以根据其在无血清条件下悬浮生长的能力并且理想地高度受纳转染来选择293变体。这种变体的一个例子是HEK293F细胞。或者，可以根据其在贴壁细胞培养中生长的能力来选择293变体，例如HEK293T细胞。用作包装细胞的其他细胞类型包括但不限于HeLa细胞、A549细胞、KB细胞、CKT1细胞、NIH/sT3细胞、Vero细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或支持慢病毒生命周期的任何真核细胞。

包装细胞可以是组成型的或诱导型的。

包装细胞可以在根据所使用的特定细胞选择的无血清培养基中培养，并允许生产慢病毒颗粒。无血清培养基可以生产适合治疗应用的慢病毒颗粒。有关无血清培养基的综述，请参见以下：Chapter 9(Serum-Free Media)of Culture of Animal Cells:A Manualof Basic Technique；Ed.Freshen,RI,2000,Wiley-Lisps,pp.89-104和105-120。一般来说，将采用无血清培养基以增强培养物中相应细胞系的生长，其有可能包含任何以下物质：选择的分泌细胞蛋白、可扩散营养物、氨基酸、有机和/或无机盐、维生素、微量金属、糖和脂质以及可能的其他化合物，例如生长促进物质(例如细胞因子)。此类培养基是可商购的，并且本领域技术人员将能够针对哺乳动物宿主细胞选择合适的培养基。培养基可以补充有添加剂，例如非离子表面活性剂，例如用于控制悬浮培养物中剪切力的F68(Invitrogen，目录号24040-032)、抗结块剂(例如来自Invitrogen，目录号0010057AE)和L-谷氨酰胺或L-谷氨酰胺的替代物，例如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽，例如GlutaMAX^TM(Invitrogen，目录号35050-038)。本发明中使用的培养基和添加剂有利地符合GMP。例如，可用于悬浮生长293F细胞的市售无血清培养基的非限制性实例是Gibco LV-MAXProduction Media(ThermoFisher Scientific，目录号A3583401)。

或者，可以使用本领域公知的方法在贴壁系统中培养包装细胞，参见例如以下文献：Merten et al.(2011)Large-Scale Manufacture and Characterization of aLentiviral Vector Produced for Clinical Ex Vivo Gene TherapyApplication.Human Gene Therapy,22(3):343-356.http://doi.org/10.1089/hum.2010.060。

生产细胞

如本文所用，术语“生产细胞”是指用于生产慢病毒颗粒的细胞。生产细胞是稳定的细胞系，其中产生感染性慢病毒颗粒所需的全部或部分包装功能被插入到细胞基因组中，使得通过瞬时转染仅引入闭合线性转移载体。此类生产细胞是本领域已知的，参见例如美国专利号5,686,279；以及Ory etal.(1996)A stable human-derived packaging cellline for production of high titer retrovirus/vesicular stomatitis virus Gpseudotypes.PNAS USA,93:11400-11406；和Sanber et al.(2015)Construction ofstable packaging cell lines for clinical lentiviral vector production.SciRep,5:9021。

生产细胞可以是组成型的或诱导型的，并且是本领域公知的(Farson etal.(2001)A new-generation stable inducible packaging cell line for lentiviralvectors.Hum Gene Ther,12(8):981-97.doi:10.1089/104303401750195935；和Merten,O.W.,Hebben,M.&Bovolenta,C.(2016)Production of lentiviralvectors.Mol.Ther.Methods Clin.Dev.3:16017。

还开发了杂合稳定细胞系，其中一些包装功能已整合到细胞基因组中，而其他功能则通过包装载体的瞬时转染提供。因此，可以使用这些方法的组合，其中一些生产载体整合到细胞基因组中，而另一些则通过瞬时转染提供。技术人员可以理解，可以使用几种不同的方法和试剂来制备感染性慢病毒颗粒。

因此，本领域技术人员可以理解，使用本发明的新型闭合线性转移载体生产慢病毒载体的策略有多种。总体而言，引入闭合线性转移载体的包装细胞或生产细胞应具有产生功能性慢病毒颗粒所需的所有包装功能，并且这些包装功能可以通过瞬时转染的方式引入细胞中，稳定整合到细胞基因组中，或两者的组合。

转染

在本发明的方法中，用一种或多种适合生产慢病毒颗粒的载体转染包装细胞，例如在无血清条件下悬浮生长的HEK293F细胞。优选地，转染是瞬时转染。

可以通过任意数量的载体向包装细胞提供生产慢病毒颗粒所需的不同功能。特别地，这些功能可以由至少一种、两种、三种或四种载体来提供。在本发明的一个具体实施方案中，通过转染、特别是瞬时转染四种适合生产慢病毒颗粒的载体来向包装细胞提供产生慢病毒颗粒所需的不同功能，其中一种载体编码包膜蛋白(Env载体)，一种载体编码慢病毒Gag和Pol蛋白(Gag-Pol载体)，一种载体编码慢病毒Rev蛋白(Rev载体)，一种载体是本发明的闭合线性转移载体，其在编码慢病毒5'杂合LTR和3'SIN LTR的序列之间包含转基因表达盒。

或者，本发明载体的闭合线性转移载体可瞬时转染至稳定的生产细胞中，该细胞携带产生感染性慢病毒颗粒所需的包装功能补集(complementary set)的全部或部分。

可以采用本领域已知的各种技术将核酸分子引入包装细胞或生产细胞中。此类技术包括使用化合物(例如磷酸钙、阳离子脂质、阳离子聚合物)的化学促进转染、脂质体介导的转染、非化学方法例如电穿孔、粒子轰击或显微注射，以及用含有目标核酸分子的病毒进行感染(有时称为“转导”)。

然而，根据本发明的优选实施方案，使用聚乙烯亚胺(PEI)作为转染试剂进行瞬时转染。PEI是一种合成的水溶性聚合物，广泛用作转染试剂。PEI在许多细胞系中具有高的基因转移活性，同时显示出低细胞毒性，具有成本效益，因此适合工业规模生产应用。PEI可以作为线性和支化聚合物使用，具有宽范围的分子量和多分散性，这些是对有效基因转移活性至关重要的物理化学参数(Godbey W.T.et al.,J.Control Release,60,149160(1999))。在一个具体实施方案中，本发明中使用的PEI是20-25kD线性PEI。例如，在一个具体实施方案中，本发明中使用的PEI是(可从PolyPlus获得)。转染试剂是线性PEI衍生物，不含动物源成分，可提供高效且可重复的基因递送。用于转染细胞的其他PEI或与其结构相似的阳离子聚合物公开于美国专利号6,013,240和欧洲专利号0770140中。

本领域技术人员可以使转染方法适应于所实施的特定细胞培养物。

可以用本发明的闭合线性转移载体以及一种或多种生产载体转染包装细胞。生产载体可以是任何适当的形式，包括闭合线性DNA(具有或不具有本文所述的3'间隔物序列)，或环状DNA，例如质粒或小环。生产载体可以编码包装元件GAG、POL、REV和/或ENV中的一种或多种。可能更优选的是GAG和POL在单个生产载体上编码。

可以使用任何合适的构建体摩尔比，用闭合线性转移载体和一种或多种生产载体转染包装细胞。例如，其中包装细胞用4种DNA构建体(闭合线性转移载体、GagPol载体、Rev载体和ENV载体(优选VSVg载体))转染，可以使用任何合适的构建体质量比。转移:GagPol:Rev:VSVg DNA构建体的构建体质量比可以是4:1:2:1、3:1:2:1、3:1:3:1.5或3:1:3:2。

诱导

在本发明的实施方案中，其中诱导系统用于生产慢病毒颗粒，可以诱导含有本发明的闭合线性转移载体的包装细胞或生产细胞，以开始生产慢病毒颗粒。诱导系统是本领域熟知的，例如Tet-on和Tet-off系统，其基于分别添加或去除培养基中的四环素/多西环素抗生素以通过四环素响应元件触发基因转录。替代的诱导系统包括但不限于Tet-on/cumate诱导系统和蜕皮激素(ecdysone)诱导系统，

在本发明的替代实施方案中，组成型系统可用于生产慢病毒颗粒。

培养

转染后，例如将DNA和PEI的混合物添加至细胞培养物后，允许该细胞培养物生长一段时间，该时间可包括在转染后36至72小时之间，特别是48小时后。

用于培养转染的包装细胞或生产细胞的方法是本领域已知的，并且包括使用各种细胞培养基、适当的气体浓度/交换和温度控制以促进细胞生长以及将构建体整合到细胞基因组中。

在一个具体实施方案中，用于培养包装细胞或生产细胞的培养基与用于转染所述细胞的培养基相同。例如，在用PEI和载体的混合物转染的情况下，混合物可以在Gibco LV-MAX Production Media(ThermoFisher Scientific，目录号A3583401)中进行，并且细胞也可以在转染后在所述Gibco LV-MAX Production Media(ThermoFisher Scientific，目录号A3583401)中生长。

培养可以在多种培养装置中进行，例如适合悬浮细胞培养的生物反应器。生物反应器可以是单次使用(一次性)或可重复使用的生物反应器。生物反应器可以例如选自培养容器或培养袋和罐式反应器。非限制性的代表性生物反应器包括Ambr15(Sartorius)、Ambr250(Sartorius)iCELLis固定床生物反应器(Pall Life Sciences)、Scale-X hydro(Univercells)、HyPerforma Single-Use Bioreactor(ThermoScientific)。

收获

然后可以使用本领域熟知的标准技术通过一个或多个收获步骤收获(或收集)慢病毒颗粒。

总颗粒滴度、感染性滴度和基因组滴度可通过本领域已知的标准方法测定，包括但不限于以下实施例中证明的那些。

因此，本发明提供了一种适合于生产慢病毒颗粒的新型闭合线性DNA载体。本发明还涉及使用该构建体生产感染性慢病毒颗粒的方法。

现在将参考以下非限制性实施例来描述本发明。

实施例

材料和方法

质粒/闭合线性DNA克隆和制造

标准DNA慢病毒构建体(eGFP转基因、GagPol、Rev和VSG)的所有序列均从公开来源Addgene(www.addgene.org)获得，选自广泛使用的慢病毒第三代生产系统。这些序列从头合成并克隆到Touchlight的proTLx骨架中(图9A至9D)。所得质粒(pDNA)用作模板，以通过Touchlight的dbDNA制造工艺生成等同的闭合线性DNA版本(WO2010/086626)。制备的各种闭合线性DNA构建体如图4所示。

对标准eGFP转基因进行的所有修饰(以包括此处描述的新元件)也是从头合成的，并在Touchlight(Hampton，UK)经历了相同的pDNA和闭合线性DNA制造程序。

根据Sadelain实验室描述的1928z序列设计CAR-T基因(Eyquem,J.etal.Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumourrejection.Nature 543,(2017))。

慢病毒生产：细胞培养、转染和收获

对于所有慢病毒生产，按照制造商的建议，在带通气盖的Erlenmeyer烧瓶中使用LV-MAX Production Media(A3583401)以50-100mL体积在平台摇床培养箱中于37℃、8％CO₂和125rpm下培养HEK293F细胞(Gibco Viral Production Cells，A35347)。

转染前，以1x10⁶个细胞/mL的浓度建立50mL培养物。转染当天，按照制造商的关于悬浮细胞的建议，使用PEIPro(PolyPlus Transfection)作为转染试剂转染总共0.5–1μg/mL DNA，所述DNA包含4种慢病毒生产构建体(eGFP转移载体、GagPol、Rev和VSVg)。

通过将50mL培养物以1300rpm离心5分钟后过滤上清液(0.45μm)，在转染后48小时/72小时进行收获。随后将上清液等分并储存在-80℃下以供随后分析。将细胞沉淀物重悬并用50mL PBS(Sigma Aldrich，D8537)洗涤，然后用于细胞密度(Trypan Blue)，使用CytoFlex流式细胞仪(Beckman Coulter)分析细胞eGFP表达，并将细胞沉淀物于-80℃储存用于随后的基因表达分析。

DNA递送和基因表达分析

分别使用Qiagen(www.qiagen.com)的DNeasy Blood and Tissue和RNeasy PlusMini试剂盒，按照推荐方案从包装细胞沉淀物中提取总的DNA和RNA。对于DNA递送，然后使用StepOnePlus qPCR(Applied Biosystems)通过单重qPCR分析对提取的总DNA进行分析，其中在单独的反应中使用针对慢病毒靶序列的定制TaqMan引物/探针组(IDTTechnologies)以及使用足够的参考材料的拷贝数标准曲线，和用野生型HEK293F基因组DNA标准曲线与RNAseP TaqMan Copy Number Reference Assay(Applied Biosystems)来评估转染期间每个细胞递送的DNA载体拷贝数。对于基因表达分析，使用1μg RNA通过用于qRT-PCR的SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix(Thermo FisherScientific)合成cDNA。然后通过双重qPCR分析来分析cDNA，其中使用针对慢病毒靶序列和基因表达管家基因(GAPDH/18S VIC-染料内源对照)(Applied Biosystems)的定制的FAM染料TaqMan引物/探针组(IDT Technologies，https://eu.idtdna.com)，以及使用足够的参考材料的拷贝数标准曲线来评估正在生成的转录物的归一化数量。在进行这些测定之前，使用IDT的PrimerQuest在线工具(www.idtdna/primerquest)设计了每个靶标的多个TaqMan引物/探针组，然后进行测试以选择性能最佳的引物/探针组，其序列如下表所述。对于eGFP，我们使用了Applied Biosystems的经验证的TaqMan基因表达测定(FAM)(4331182，Assay ID Mr04097229_mr)。

表2–来自IDT Technologies的TaqMan引物/探针组

慢病毒样本分析：总滴度、感染性滴度和基因组滴度

为了评估稀释的慢病毒上清液的总滴度(每毫升的慢病毒颗粒，LP/mL)，按照制造商提供的说明使用慢病毒相关的p24 ELISA Kit(Cell Biolabs，VPK-107-5)。

为了测量感染性滴度(每毫升的转导单位，TU/mL)，在感染日前一天培养贴壁HEK293T(Lenti-XTM 293T，Takara，632180)并接种到6孔板中，并在感染日当天暴露于具有12μg/mL Polybrene(Santa Cruz,sc-134220)的不同稀释度的慢病毒上清液。将板在室温下以900xg离心30分钟，然后在37℃和5％CO₂下孵育72小时。感染后72小时，将细胞进行胰蛋白酶消化，用PBS洗涤，并通过Cytoflex Flow Cytometer(Beckman Coulter)分析细胞eGFP表达。使用提供5-25％的eGFP阳性细胞的上清液稀释液，使用以下公式计算感染性滴度(TU/mL)：TU/mL＝(F×C/V)×D，其中F＝GFP+细胞的频率(％GFP+细胞/100)，C＝每孔接种的用于转导的细胞数，V＝接种体积，单位为mL(0.1mL)，且D＝慢病毒稀释因子。

为了测量CAR19hCD28z LVV的感染性滴度，在感染日当天将每孔5x10⁵个THP-1细胞接种到24孔板中。用含有8ug/mL polybrene的培养基中连续稀释的LVV上清液来感染细胞，并在室温下以1000xg离心1小时。感染后48小时，洗涤细胞并用与Alexa Fluor 647缀合的抗小鼠F(ab')2片段IgG染色，并通过FACS进行分析，如上所述，以确定CAR19h28z表达。如上所述计算感染性滴度。

使用Takara的Lenti-X qRT-PCR Titration Kit(631235)计算基因组滴度(每mL的基因组颗粒，GP/mL)，其需要提取慢病毒上清液的基因组RNA，并随后通过qRT-PCR定量慢病毒基因组拷贝。

通过qRT-PCR分析基因表达

按照制造商的关于动物细胞的方案，使用RNeasy Plus Mini试剂盒(Qiagen74134)从在慢病毒收获期间收集的细胞沉淀物中提取总RNA。使用用于qRT-PCR的SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix(ThermoFisher Scientific,11752050)，从1μg总RNA中合成cDNA。从转基因构建体的dbDNA制备拷贝数标准曲线(从10⁸到10²个拷贝/孔)，将其在StepOnePlus Real-Time PCR System(Applied Biosystems，4376600)中与来自收获样品的稀释的cDNA并行运行。使用Fast Advanced Master Mix(ThermoFisher Scientific,4444556)，通过用FAM染料引物/探针组和针对真核18S rRNA内源对照的VIC染料引物/探针组(VIC/MGB探针；Applied Biosystems，4319413E)双重化来进行qPCR运行，所述FAM染料引物/探针组针对全长基因组RNA(LTR-P组：寡核苷酸MH531-5'TGTGTGCCCGTCTGTTGTGT 3'(SEQ ID NO.14)和MH532-5'GAGTCCTGCGTCGAGAGAGC 3'(SEQ IDNO.15)，以及荧光探针LRT-P(5'FAM-CAGTGGCGCCCGAACAGGGA-BHQ 3'(SEQ ID NO.13)；Integrated DNA Technologies)或来自转基因的总RNA(Enhanced GFP,FAM TaqMan Gene表达测定；Applied Biosystems,4351370,Assay ID Mr04097229_mr)。内源对照用于样品归一化，并根据拷贝数标准曲线计算每个样品的转录本拷贝数。

实施例1

结果

现有技术构建体

图1A示出了用标准EF1α-eGFP-WPRE转移载体和慢病毒包装构建体转染后72小时的生产细胞中的基因表达。使用探针LTR-P和eGFP对从细胞中提取的RNA进行RT-qPCR，以分别定量全长基因组RNA转录物和总RNA转录物。闭合线性DNA(dbDNA^TM)构建体的转移载体基因表达与相应的质粒DNA(pDNA)相似，表明低感染性滴度并不是转移载体RNA不足的结果。闭合线性DNA载体的独特结构被认为会改变生产细胞中的转染和表达，从而对滴度产生负面影响。RT-qPCR用于分析转染后72小时的生产细胞中的DNA拷贝数以及转录物丰度。这表明，与质粒相比，用闭合线性DNA转染的细胞在每个细胞中含有高3至4倍DNA拷贝数的每种构建体(图1B)。

图2示出了使用“标准”转移载体(不含poly(A)序列和间隔物)进行生产的滴度。闭合线性DNA(dbDNA)转染的总病毒滴度(p24)比相应的质粒DNA(pDNA)转染低五倍。然而，闭合线性DNA(dbDNA)转染的感染性病毒滴度低于检测限，表明在这种情况下产生的感染性病毒颗粒非常少。关键：VP/ml是每毫升的病毒颗粒，TU/ml是每毫升的转导单位(感染性滴度)。

根据这些结果，我们尝试优化闭合线性DNA转染的条件，这些实验的结果如图3所示。优化闭合线性DNA转染的条件完全挽救了总颗粒滴度(p24)，但闭合线性DNA产生的感染性滴度仍比质粒低100倍。

进行了进一步的优化工作以研究增加转基因有效负载的量是否会增加感染性滴度。图4A和4B中显示的结果表明增加转基因并不能挽救感染性滴度。基因组滴度测定的结果(图4B)表明，与pDNA相比，将病毒基因组包装到颗粒中对于闭合线性DNA而言效率较低，并且增加转移载体的量并不能改善这种情况。

新型结构

构建了图5所示的新型闭合线性DNA结构(如上所述)，并在转染实验中进行了测试(如上所述)。图6(A-C)显示了不同构建体对总颗粒滴度、感染性滴度和基因组滴度的影响。使用AvrII限制性消化切割3'LTR下游不会改善滴度，表明不存在通读干扰。然而，添加SV40p(A)可改善pDNA和闭合线性DNA两者的慢病毒载体滴度。

图7(A-C)显示向闭合线性DNA构建体添加间隔物(F区终止序列(FTS)或1kb间隔物(RS1))进一步改善单独SV40 poly(A)的感染性滴度和基因组滴度的结果。可以看出，这种效果仅在闭合线性DNA载体中可见，而在质粒中不可见。还清楚的是，该效果不依赖于间隔物的序列。

图8显示了针对相对于pDNA的感染性滴度，对闭合线性DNA载体的常规转染条件进一步优化，其导致感染性滴度仅比质粒低两倍。

实施例2

5'间隔物序列

构建了新的闭合线性DNA结构(如上所述)，并在转染实验中进行了测试(如上所述)。图10A显示了以下结果：除了3'SV40 poly(A)和3'间隔物(LV-RS1-eGFP-pA-RS1)之外，在CMV/5'LTR上游添加1kb随机间隔物序列(RS1)进一步改善了SV40 poly(A)和3'间隔物序列的感染性滴度和基因组滴度。5'间隔物序列的添加使感染性滴度进一步提高了2倍。

优化闭合线性生产载体

构建闭合线性生产载体(如上所述)，并在转染实验中进行测试(如上所述)。进行生产，其中每种生产构建体单独或成组地交换为等价附件+3'RS1kb。图11A显示了在闭合线性生产载体中包含3'间隔物序列可改善感染性滴度的结果。将RS1kb添加到GagPol或VSVg中可显著提高感染性。GagPol-RS1kb和Rev-RS1kb的组合产生了最高滴度。

实施例3–构建体比率优化

在新型转移载体结构(LV-RS1-eGFP-pA-RS1)的背景下，使用0.7μg/mL的总输入转移载体对4种DNA构建体(eGFP有效负载、GagPol、Rev和VSVg)的构建体比率进行了高通量优化。与我们之前的4:3:3:4条件相比，增加转移载体和Rev的几种条件使感染性滴度显著改善。特别是，使用3:1:2:1的比率可实现高达1.4x10⁶TU/mL的滴度(图10B)

实施例4–CAR19h28z慢病毒颗粒

产生表达CAR19h28z的慢病毒颗粒，其包括下游SV40 LpA和侧接RS1kb(LV-RS1kb-1928z-LpA-RS1kb)。将HEK293F悬浮细胞用对于dbDNA(0.7ug/mL DNA；1:3DNA:PEI)的摩尔比为4:1:2:1且对于质粒(1ug/mL DNA；1:2DNA:PEI)的质量比为2:1:1:1的LV-RS1kb-1928z-LpA-RS1kb、GagPol-RS1kb、Rev-RS1kb和VSVg共转染，在72小时后收获上清液，用于通过转导的THP1细胞的CD19 FACS进行感染性滴度分析。如图10B所示，使用完全优化的构建体套组和优化的转染条件，无论使用质粒还是dbDNA作为起始材料，LVP CAR1928z的感染性滴度都是等同的。综合这些数据表明，闭合线性DNA可用作质粒的替代起始材料来制造高滴度LV。

实施例5

优化总载体输入和构建体比率可挽救总颗粒滴度。

该实施例使用标准的现有技术闭合线性DNA构建体。然而，改进的构建体也证明了有益效果(实施例3和4)。

观察到的闭合线性DNA表达谱的差异表明，需要进一步优化转染条件和构建体比率，以实现与产业标准(质粒)相当的滴度。使用2:1:1:1的构建体比率，通过用0.5、0.75或1.0μg/mL闭合线性DNA载体转染细胞来评估总DNA输入。转染后72小时收获样品以分析转染效率和总p24滴度。随着总DNA的减少，观察到总颗粒滴度呈明显的剂量依赖性增加(图2B，表明使用最低总输入DNA时的总颗粒滴度增加了6倍)。

低感染性颗粒滴度不会随着转移载体的增加而改善。

在确定了产生高颗粒滴度的条件后，将闭合线性衍生的颗粒的感染性与质粒进行比较。在标准质粒条件(2:1:1:1；1μg/mL)以及使用质粒的摩尔当量和2个优化的比率条件(0.5:1:3:1和0.5:3:3:1)的闭合线性载体(0.5μg/mL)之间进行了可比性研究。这证实了使用优化的闭合线性比率条件的总颗粒滴度可重复地等同于质粒，但发现感染性滴度大约低100倍(图3)。低感染性滴度与低丰度的慢病毒基因组RNA(vgRNA)相关，表明颗粒可能由于转移载体不足而为空。这支持了这样的假设：闭合线性DNA衍生的LV的低感染性与低包装效率有关。

Claims

1.一种闭合线性DNA载体，适合用作慢病毒转移载体，其从5'至3'包含以下顺序的序列：

(a)杂合的5'长末端重复(LTR)序列；

(b)与转基因有效连接的启动子；

(c)3'自失活(SIN)序列；

(d)poly(A)信号序列；和

(e)间隔物序列。

2.根据权利要求1所述的闭合线性DNA载体，其中所述间隔物序列的长度为至少250个核苷酸。

3.根据权利要求1或2所述的闭合线性DNA载体，其中所述启动子和转基因的侧翼是5'和3'LTR序列。

4.根据前述权利要求中任一项所述的闭合线性DNA载体，其中所述闭合线性DNA载体还包含一个或多个另外的间隔物序列，所述另外的间隔物序列优选是位于所述杂合5'LTR序列的5'处的5'间隔物序列。

5.根据权利要求4所述的闭合线性DNA载体，其中所述5'间隔物序列的长度为至少250个核苷酸。

6.根据前述权利要求中任一项所述的闭合线性DNA载体，其中所述杂合5'LTR中的全部或部分U3区被异源启动子取代。

7.根据前述权利要求中任一项所述的闭合线性DNA载体，其中所述poly(A)信号序列包括额外的辅助序列，任选地其中所述辅助序列是一个或多个上游序列元件(USE)。

8.根据前述权利要求中任一项所述的闭合线性DNA载体，其中所述poly(A)信号是强poly(A)信号。

9.根据前述权利要求中任一项所述的闭合线性DNA载体，其中所述poly(A)信号选自SV40晚期poly(A)序列、兔β-珠蛋白poly(A)(rbGlob)或牛生长激素poly(A)(bGHpA)，或与所述序列具有至少90％同源性的序列。

10.根据前述权利要求中任一项所述的闭合线性DNA载体，其中所述3'SIN LTR与野生型LTR相比含有一个或多个缺失，任选U3区中的缺失。

11.根据权利要求10所述的闭合线性DNA载体，其中所述3'SIN LTR与野生型3'LTR相比在相对于转录起始位点的核苷酸-149至-9处含有133个核苷酸的U3缺失。

12.一种当转移载体是闭合线性DNA载体时改善慢病毒颗粒的感染性滴度的方法，包括将前述权利要求中任一项所述的闭合线性DNA载体引入包装细胞或生产细胞。

13.根据权利要求12所述的方法，进一步包括向所述包装细胞引入一种或多种生产载体，所述一种或多种生产载体编码制造慢病毒颗粒所需的病毒元件。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述一种或多种生产载体包括以下的一种或多种：

(e)慢病毒组特异性抗原(GAG)基因；和/或

(f)慢病毒聚合酶(POL)基因；和/或

(g)包膜基因(ENV)；和/或

(h)慢病毒调控基因(REV)。

15.根据权利要求14所述的方法，其中一种或多种所述生产载体是闭合线性DNA载体，其任选地包括间隔物序列。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述闭合线性DNA载体包括：

(a)至少一个表达盒，其包括以下的一种或多种：

i.慢病毒组特异性抗原(GAG)基因；

ii.慢病毒聚合酶(POL)基因；

iii.包膜基因(ENV)；和/或

iv.慢病毒调控基因(REV)，和

(b)位于表达盒的3'处的间隔物序列。

17.根据权利要求14至16中任一项所述的方法，其中所述包膜基因是水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)基因。

18.根据权利要求14至17中任一项所述的方法，其中所述GAG基因和POL基因包含在单个生产载体上。

19.根据权利要求12至18中任一项所述的方法，其中所述包装细胞是HEK293细胞或其变体或衍生物。

20.根据权利要求12至19中任一项所述的方法，其中通过转染、任选化学转染将所述载体引入包装细胞或生产细胞。

21.根据权利要求20所述的方法，其中转染剂选自磷酸钙(CaPO₄)、聚乙烯亚胺(PEI)或lipofectamine中的任一种。

22.根据权利要求15至21中任一项所述的方法，其中将所述闭合线性转移载体、编码GAG-POL的生产载体、编码REV的生产载体和编码ENV的生产载体以4:1:2:1的构建体摩尔比提供至包装细胞。

23.根据权利要求12至22中任一项所述的方法，其还包括：

(a)诱导包装细胞或生产细胞中慢病毒颗粒的产生，所述包装细胞或生产细胞用至少一种适合于生产慢病毒颗粒的闭合线性DNA载体转染；和/或

(b)培养转染的包装细胞或生产细胞；和

(c)从培养基中收获/分离产生的重组慢病毒颗粒。