JP2023513303A - レンチウイルスベクターの製造 - Google Patents

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Abstract

レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列であって、レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム中の主要スプライスドナー部位が不活性化されており、主要スプライスドナー部位に対する潜在性スプライスドナー部位３’が不活性化されている。

Description

本発明は、真核細胞におけるレンチウイルスベクターの製造に関する。より具体的には、本発明は、ベクターゲノムにおける主要スプライスドナー部位及び隣接する潜在性スプライスドナー部位の不活性化に関する。本発明は、レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列であって、レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム中の主要スプライスドナー部位が不活性化されており、主要スプライスドナー部位に対する潜在性スプライスドナー部位３’が不活性化されている、ヌクレオチド配列を提供する。そのようなヌクレオチド配列を伴う方法及び使用も本発明に包含される。
過去数十年にわたるワクチン及びヒト遺伝子治療に向けたウイルスベクターの開発及び製造は、科学雑誌及び特許において十分に文書化されている。治療効果のための導入遺伝子を送達するための操作されたウイルスの使用は広範囲である。γ－レトロウイルス及びレンチウイルス等のＲＮＡウイルス（Ｍｕｈｌｅｂａｃｈ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，１３：３４７－３７０；Ａｎｔｏｎｉｏｕ，Ｍ．Ｎ．，Ｓｋｉｐｐｅｒ，Ｋ．Ａ．＆Ａｎａｋｏｋ，Ｏ．，２０１３，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２４：３６３－３７４）、並びにアデノウイルス（Ｃａｐａｓｓｏ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｖｉｒｕｓｅｓ，６：８３２－８５５）及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）等のＤＮＡウイルス（Ｋｏｔｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ａ．＆Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｄ．Ｖ．，２０１４，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，１５：４４５－４５１）に基づく現代の遺伝子治療ベクターは、ますます多くのヒト疾患適応症において有望であることが示されている。これらには、血液学的状態の患者細胞のエクスビボ改変（Ｍｏｒｇａｎ，Ｒ．Ａ．＆Ｋａｋａｒｌａ，Ｓ．，２０１４，Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．，２０：１４５－１５０；Ｔｏｕｚｏｔ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１４：７８９－７９８）、並びに眼科（Ｂａｌａｇｇａｎ，Ｋ．Ｓ．＆Ａｌｉ，Ｒ．Ｒ．，２０１２，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１９：１４５－１５３）、心血管（Ｋａｔｚ，Ｍ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２４：９１４－９２７）、神経変性疾患（Ｃｏｕｎｅ，Ｐ．Ｇ．，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｂ．Ｌ．＆Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ，Ｐ．，２０１２，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｍｅｄ．，４：ａ００９４３１）及び腫瘍療法（Ｐａｚａｒｅｎｔｚｏｓ，Ｅ．＆Ｍａｚａｒａｋｉｓ，Ｎ．Ｄ．，２０１４，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ．，８１８：２５５－２８０）のインビボ治療が含まれる。
臨床試験におけるこれらのアプローチの成功は、規制上の承認及び商業化に向けて構築され始めているため、例えばワクチン接種及び遺伝子治療の状況で、患者へのウイルスベクターの投与に関与する安全面を考慮することが重要である。
Ｍｕｈｌｅｂａｃｈ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，１３：３４７－３７０；Ａｎｔｏｎｉｏｕ，Ｍ．Ｎ．，Ｓｋｉｐｐｅｒ，Ｋ．Ａ．＆Ａｎａｋｏｋ，Ｏ．，２０１３，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２４：３６３－３７４ Ｃａｐａｓｓｏ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｖｉｒｕｓｅｓ，６：８３２－８５５ Ｋｏｔｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ａ．＆Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｄ．Ｖ．，２０１４，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，１５：４４５－４５１ Ｍｏｒｇａｎ，Ｒ．Ａ．＆Ｋａｋａｒｌａ，Ｓ．，２０１４，Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．，２０：１４５－１５０；Ｔｏｕｚｏｔ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１４：７８９－７９８ Ｂａｌａｇｇａｎ，Ｋ．Ｓ．＆Ａｌｉ，Ｒ．Ｒ．，２０１２，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１９：１４５－１５３ Ｋａｔｚ，Ｍ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２４：９１４－９２７ Ｃｏｕｎｅ，Ｐ．Ｇ．，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｂ．Ｌ．＆Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ，Ｐ．，２０１２，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｍｅｄ．，４：ａ００９４３１ Ｐａｚａｒｅｎｔｚｏｓ，Ｅ．＆Ｍａｚａｒａｋｉｓ，Ｎ．Ｄ．，２０１４，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ．，８１８：２５５－２８０
安全性プロファイルが改善されたウイルスベクターが当技術分野で継続的に必要とされている。
本発明は、レンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域における主要スプライスドナー部位及び隣接する潜在性スプライスドナー部位の両方の不活性化に基づく。レンチウイルスベクターゲノム内に存在する主要スプライスドナー部位（ＭＳＤ）は、典型的には、ＲＮＡの５’領域に向かって高度に構造化されたＲＮＡを含有するパッケージング領域内に埋め込まれる。
レトロウイルスゲノム内のスプライスドナー部位は、産生細胞内のウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）安定性にとって重要であることが示されている。しかしながら、本発明者等は、レンチウイルスベクターゲノム発現カセット内のＭＳＤの活性は非常に乱雑であり得、典型的には＞１３５０ｂｐ下流に位置する内部発現カセット内の強力又は更には弱い潜在性スプライスアクセプタ部位に非常に効率的にスプライスすることができることを示す。驚くべきことに、ｖＲＮＡ産生を駆動する外部プロモータに由来する検出可能な細胞質ｍＲＮＡの９５％もが、内部配列に応じてスプライシングされる。
効率的なベクター産生のために、最も望ましい産物はスプライシングされていないパッケージング可能なｖＲＮＡであり、このベクター成分は、典型的には一過性及び安定なトランスフェクションベクター産生状況の両方における制限因子である。更に、この異常にスプライシングされたｍＲＮＡが目的の導入遺伝子をコードする場合（例えば、内部プロモータ－ｕｔｒ配列へのスプライシング）、このｍＲＮＡは輸送され、ベクター産生中に効率的に翻訳され得、これは、内部プロモータが弱い／サイレント（組織特異的）プロモータであるかどうかとは無関係に起こる。
更に、形質導入された（患者）細胞に送達されるベクター骨格中のＭＳＤの存在は、上流の細胞プロモータからのリードスルー転写が起こる場合（レンチウイルスベクターは活性転写部位を標的とする）、スプライシング機構によって利用されることが他によって示されており、細胞エクソンを有する潜在的に異常なスプライス産物をもたらす。したがって、レンチウイルスベクターゲノムからＭＳＤ部位を機能的に変異させることが望ましい理由はいくつかある。
他のものは、ＭＳＤ部位内に変異を有する初期世代レンチウイルスベクターを生成したが、これらのベクターは、ｖＲＮＡの転写を駆動する固有のＵ３プロモータを含み、したがってトランスで供給されるｔａｔによるトランス活性化に依存していた。第３世代レンチウイルスベクターは、Ｕ３プロモータを異種プロモータ要素で置き換え、転写のためにｔａｔを必要としない。第３世代ベクターのＵ３／ｔａｔ非依存性は、ｔａｔが細胞遺伝子のトランス活性化因子であり、腫瘍形成において役割を果たし得るため、調節因子による安全性の重要な進歩と見なされている。
一態様では、レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列であって、レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム中の主要スプライスドナー部位が不活性化されており、主要スプライスドナー部位に対する潜在性スプライスドナー部位３’が不活性化されているヌクレオチド配列を提供する。
本実施例において、レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム中の主要スプライスドナー部位及び主要スプライスドナー部位に対する潜在性スプライスドナー部位３’の両方の不活性化が、どちらか一方を単独で変異させるよりも改善をもたらすことが実証される。本実施例においても実証されるように、本発明は、標的細胞における組み込まれたレンチウイルスベクターへの転写リードスルーの低下を、例えば少なくとも２倍促進する。
一態様では、本発明によるヌクレオチド配列は、Ｕ３又はｔａｔ非依存性レンチウイルスベクターシステムで使用するためのものである。一態様では、レンチウイルスベクターシステムは、本明細書に記載の第３世代レンチウイルスベクターシステムであり得る。
潜在性スプライスドナー部位は、主要スプライスドナー部位に対する第１の潜在性スプライスドナー部位又は配列３’である。一態様では、潜在性スプライスドナー部位又は配列は、主要スプライスドナー部位の６ヌクレオチド以内にある。主要スプライスドナー部位及び潜在性スプライスドナー部位は、変異又は欠失され得る。
一態様では、本発明は、レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列を提供し、スプライス部位の不活性化前のヌクレオチド配列は、配列番号１、３、４、９、１０及び／又は１３のいずれかに記載の配列を含む。ヌクレオチド配列は、配列番号１、３、４、９、１０及び／又は１３のいずれかに記載の配列に対して変異又は欠失を有する配列を含み得る。一態様では、配列は配列番号１３を含む。
一態様では、ヌクレオチド配列は、不活性化主要スプライスドナー部位を含み、そうでなければ主要スプライスドナー領域（配列番号１３）のヌクレオチド１のすぐ上流に切断部位を有するであろう。
一態様では、ヌクレオチド配列は、不活性化された主要スプライスドナー部位と、不活性化された潜在性スプライスドナー部位と、を含み、そうでなければ、ヌクレオチド１のすぐ上流、並びに主要スプライスドナー領域（配列番号１３）のヌクレオチドに対応するヌクレオチド４～５の間に切断部位を有するであろう。
一態様において、ヌクレオチド配列は、不活性化された主要スプライスドナー部位を含み、そうでなければ配列番号１のヌクレオチド１３及び１４に対応するヌクレオチド間に切断部位を有するであろう。
別の態様では、不活性化前の主要スプライスドナー部位のヌクレオチド配列は、配列番号４に示される配列を含む。一態様では、不活性化前の潜在性スプライスドナー部位は、配列番号１０に示される配列を含む。
ヌクレオチド配列は、不活性化された潜在性スプライスドナー部位を含み得、そうでなければ配列番号１のヌクレオチド１７及び１８に対応するヌクレオチド間に切断部位を有するであろう。
一態様では、本発明によるヌクレオチド配列は、配列番号２、５、６、７、８、１１、１２及び／又は１４のいずれかに記載の配列を含む。
好ましい態様では、ヌクレオチド配列は、配列番号１４に示される配列を含む。
更なる態様では、ヌクレオチド配列は、配列番号９に示される配列を含まない。
レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムの主要スプライスドナー部位及び潜在性スプライスドナー部位からのスプライシング活性は、例えばトランスフェクト細胞又は形質導入細胞において抑制又は除去され得る。
一態様では、ヌクレオチド配列は、ベクター産生のためのＵ３又はｔａｔ非依存性システムにおけるレンチウイルスベクターでの使用に適し得る。本明細書に記載されるように、第３世代レンチウイルスベクターはＵ３／ｔａｔ非依存性であり、本発明によるヌクレオチド配列は、第３世代レンチウイルスベクターの文脈で使用され得る。本発明の一態様では、ｔａｔはレンチウイルスベクター産生システムに提供されず、例えば、ｔａｔはトランスで提供されない。一態様では、本明細書に記載の細胞又はベクター又はベクター産生システムは、ｔａｔタンパク質を含まない。本発明の一態様では、ＨＩＶ－１ Ｕ３はレンチウイルスベクター産生システムに存在せず、例えばＨＩＶ－１ Ｕ３は、ベクターゲノム発現カセットの転写を駆動するためにシスに提供されない。
一態様では、本発明は、レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列であって、レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム中の主要スプライスドナー部位が不活性化されており、主要スプライスドナー部位に対する潜在性スプライスドナー部位３’が不活性化されており、当該ヌクレオチド配列が、ｔａｔ非依存性レンチウイルスベクターで使用するためのものである、ヌクレオチド配列を提供する。
一態様では、本発明は、レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列であって、レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム中の主要スプライスドナー部位が不活性化されており、主要スプライスドナー部位に対する潜在性スプライスドナー部位３’が不活性化されており、当該ヌクレオチド配列が、ｔａｔの非存在下で産生される、ヌクレオチド配列を提供する。
一態様では、本発明は、レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列であって、レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム中の主要スプライスドナー部位が不活性化されており、主要スプライスドナー部位に対する潜在性スプライスドナー部位３’が不活性化されており、当該ヌクレオチド配列が、ｔａｔとは無関係に転写されている、ヌクレオチド配列を提供する。
一態様では、本発明は、レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列であって、レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム中の主要スプライスドナー部位が不活性化されており、主要スプライスドナー部位に対する潜在性スプライスドナー部位３’が不活性化されており、当該ヌクレオチド配列が、Ｕ３非依存性レンチウイルスベクターで使用するためのものである、ヌクレオチド配列を提供する。
一態様では、本発明は、レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列であって、レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム中の主要スプライスドナー部位が不活性化されており、主要スプライスドナー部位に対する潜在性スプライスドナー部位３’が不活性化されており、当該ヌクレオチド配列が、Ｕ３プロモータとは無関係に転写されている、ヌクレオチド配列を提供する。
一態様では、本発明は、レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列であって、レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム中の主要スプライスドナー部位が不活性化されており、主要スプライスドナー部位に対する潜在性スプライスドナー部位３’が不活性化されており、当該ヌクレオチド配列が、異種プロモータによって転写されている、ヌクレオチド配列を提供する。
一態様では、本明細書に記載のヌクレオチド配列の転写は、Ｕ３の存在に依存しない。ヌクレオチド配列は、Ｕ３非依存性転写事象に由来し得る。ヌクレオチド配列は、異種プロモータに由来し得る。本明細書に記載のヌクレオチド配列は、天然のＵ３プロモータを含まなくてもよい。
一態様では、本明細書に記載されるヌクレオチド配列は、パッケージング配列のＳＬ４ループ内の潜在性スプライスドナー部位に変異が更に含まれていてもよい。一態様では、パッケージング配列のＳＬ４ループ内の当該潜在性スプライスドナー部位のＧＴジヌクレオチドがＧＣに変異される。
一態様では、ヌクレオチド配列は、治療効果を生じ得る目的のヌクレオチドを更に含む。
更なる態様では、レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列は、ベクター導入遺伝子発現カセットである。
本発明の別の態様では、ヌクレオチド配列は、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を更に含み得、当該改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、ＭＳＤ変異レンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域内のヌクレオチド配列に結合するように改変されている。レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列は、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。一態様では、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列、例えば異なるプラスミド上にある。
別の態様では、ヌクレオチド配列はトリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ＲＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＴＲＡＰ）結合部位を更に含み、Ｋｏｚａｋ配列も含み得、当該ＴＲＡＰ結合部位はＫｏｚａｋ配列と重複するか、又は当該Ｋｏｚａｋ配列はＴＲＡＰ結合部位の一部を含む。ヌクレオチド配列はまた、マルチクローニング部位及びＫｏｚａｋ配列を更に含み得、当該マルチクローニング部位は、ＴＲＡＰ結合部位の３’ＫＡＧＮ２－３反復と重複するか、又はその下流、及びＫｏｚａｋ配列の上流に位置する。目的のヌクレオチドは、ＴＲＡＰ結合部位又はその一部に作動可能に連結され得る。
一態様では、本発明は、目的のヌクレオチド（導入遺伝子）及びトリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）結合部位を含む核酸配列であって、ＴＲＡＰ結合部位が導入遺伝子開始コドンＡＴＧと重複する、核酸配列を提供する。
Ｋｏｚａｋ配列／重複Ｋｏｚａｋ配列に関する本明細書の任意の開示は、開始コドンのＡＴＧ及びそれとの重複を指す同等の態様に（適切な場合）等しく適用可能である。
別の態様では、本発明は、目的のヌクレオチド及びＫｏｚａｋ配列を含む核酸配列であって、当該Ｋｏｚａｋ配列がトリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）結合部位の一部を含む、核酸配列を提供する。
一態様では、本発明は、目的のヌクレオチド（導入遺伝子）及びＴＲＡＰ結合部位を含む核酸配列であって、ＴＲＡＰ結合部位は導入遺伝子開始コドンＡＴＧの一部を含むか、又はその逆である核酸配列を提供する。
本発明はまた、本明細書で定義されるレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットを提供する。
本発明はまた、ｇａｇ－ｐｏｌ、ｅｎｖ、場合によりｒｅｖ及び本明細書で定義されるレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムを含むベクター成分をコードするヌクレオチド配列のセットを含むウイルスベクター産生システムを提供する。
一態様では、本発明はまた、本明細書で定義されるレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム、発現カセット又はウイルスベクター産生システムをコードするヌクレオチド配列を含む細胞を提供する。
レンチウイルスベクターを産生するための細胞は、
（ｉ）ａ）ｇａｇ－ｐｏｌ及びｅｎｖ、並びに場合によりｒｅｖを含みベクター成分をコードするヌクレオチド配列、並びに本明細書で定義されるレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム又は本明細書で定義される発現カセットをコードするヌクレオチド配列；あるいは
ｂ）本明細書で定義されるウイルスベクター産生システム；及び
（ｉｉ）場合により、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡをコードするヌクレオチド配列；及び
（ｉｉｉ）場合により、ＴＲＡＰをコードするヌクレオチド配列
を含み得る。
細胞において、レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムの主要スプライスドナー部位及び／又はスプライスドナー領域からのスプライシング活性は、例えばレンチウイルスベクター産生中に抑制又は除去され得る。一態様では、目的のヌクレオチドの翻訳は、レンチウイルスベクター産生中に抑制される。
本発明はまた、レンチウイルスベクターを製造するための方法であって、
（ｉ）
ａ）ｇａｇ－ｐｏｌ及びｅｎｖ、並びに場合によりｒｅｖを含むベクター成分をコードするヌクレオチド配列、並びに本明細書で定義されるレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム又は本明細書で定義される発現カセットをコードするヌクレオチド配列；あるいは
ｂ）本明細書で定義されるウイルスベクター産生システムを、
細胞に導入する工程と、
（ｉｉ）場合により、ベクター成分をコードする当該ヌクレオチド配列及びレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムを含む細胞を選択する工程と、
（ｉｉｉ）レンチウイルスベクターの産生に適した条件下で細胞を培養する工程と、
を含む方法を提供する。
方法は、ＴＲＡＰをコードするヌクレオチド配列を細胞に導入することを更に含み得る。
方法は、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を導入することを更に含み得る。
本発明はまた、本明細書に記載の方法のいずれかによって産生されるレンチウイルスベクターに及ぶ。
一態様では、本発明は、レンチウイルスベクターを産生するための、又はレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムの主要スプライスドナー部位及び／又はスプライスドナー領域からのスプライシング活性を抑制又は除去するための、例えばトランスフェクト細胞又は形質導入細胞における、本明細書で定義されるレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム、本明細書で定義される発現カセット、本明細書で定義されるウイルスベクター産生システム、又は本明細書で定義される細胞をコードするヌクレオチド配列の使用を提供する。
Ｕ１ ｓｎＲＮＡ分子の概略図及び本発明で使用するための標的化配列を改変する方法の例を示す図である。内因性非コードＲＮＡ、Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、イントロンスプライシングの初期段階中に、５’－（ＡＣ）ＵＵＡＣＣＵＧ－３’（灰色で強調されている）天然スプライスドナー標的化配列を介して、コンセンサスプライスドナー部位（５’－ＭＡＧＧＵＲＲ－３’）に結合する。ステムループＩは、ポリＡ抑制に重要であることが示されているＵ１Ａ－７０Ｋタンパク質に結合する。ステムループＩＩはＵ１Ａタンパク質に結合し、５’－ＡＵＵＵＧＵＧＧ－３’配列はＳｍタンパク質に結合し、これはステムループＩＶと共にＵ１ ｓｎＲＮＡプロセシングに重要である。本発明では、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、天然スプライスドナー標的化配列の部位でベクターゲノムｖＲＮＡ分子内の標的配列に相補的な異種配列を導入するように改変され、この図では、与えられた例は、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡを標準的なＨＩＶ－１レンチウイルスベクターゲノム（パッケージングシグナルの場合はＳＬ１ループ内に位置する）の１５ヌクレオチド（ベクターゲノム分子の第１のヌクレオチドに対する２５６～２７０、２５６Ｕ１）に向ける。 ＨＩＶ－１ベースのレンチウイルスベクター内の主要スプライスドナー部位（ＭＳＤ）からの異常なスプライシングの影響を示す図である。図２Ａ：パッケージングシグナルのステムループ（ＳＬ２）内に埋め込まれた機能的主要スプライスドナーを含む第３世代（自己不活性化（ＳＩＮ））レンチウイルスベクター発現カセットの典型的な構成、及びレンチウイルスベクター産生中に生成されるｍＲＮＡのタイプを示す概略図である。「標準的な」レンチウイルスベクター（ＬＶ）ＤＮＡカセット、及びＭＳＤからの乱雑な活性を抑制又は除去するＭＳＤ領域に（１又は複数の）機能変異を有するレンチウイルスベクターＤＮＡカセット（「ＭＳＤ－ＫＯ ＬＶ ＤＮＡカセット」）から生成されたｍＲＮＡの種類を示す。両方のカセットについて、全長（「非スプライシング型」）ベクターＲＮＡ（ｖＲＮＡ）は、ｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）に結合するｒｅｖの共発現から生じ、一般に、ＭＳＤからＲＲＥ配列に含まれるスプライスアクセプタ７（ｓａ７）へのスプライシングを抑制すると考えられている。標準的なレンチウイルスベクターＤＮＡカセットでは、ｒｅｖの非存在下で、全てのイントロンのスプライシングが効率的に起こる（「スプライシングされた」）と一般に考えられている。しかし、ＭＳＤがスプライスアクセプタ部位又は潜在性スプライスアクセプタ部位に非常に効率的にスプライシングし（「異常」スプライシングされた」）、典型的には、ｒｅｖがＭＳＤのこの活性に最小限の影響しか及ぼさないようにＲＲＥ含有イントロンを「見落とす」レンチウイルスベクター産生中に「異常な」スプライス産物を作製することができる。レンチウイルスベクター産生はまた、ＭＳＤ変異レンチウイルスベクターＤＮＡカセットのパッケージング領域に再指向された改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡの共発現によって行うことができる。（Ｋｅｙ：Ｐｒｏ、プロモータ；５’Ｒからｇａｇまでの領域は、パッケージング要素｛Ψ｝を含み、ｍｓｄ、主要スプライスドナー；ｃｐｐｔ、中央ポリプリントラクト；Ｉｎｔ、イントロン；ｓｄ／ｓａ、スプライスドナー／アクセプタ；ＧＯＩ、目的の遺伝子；灰色の矢印は、第３世代レンチウイルスベクター産生中に産生された非スプライシング型ｖＲＮＡの割合を評価するためのフォワード｛ｆ｝プライマー及びリバース｛ｒ｝プライマーの位置を示す。転写後調節要素｛ＰＲＥ｝は、明確にするために示されていない）。図２Ｂ：標準的な第３世代レンチウイルスベクターの産生を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で＋／－ｒｅｖで行い、産生後の細胞から全ＲＮＡを抽出した。２つのプライマーセット（Ａでマークした位置）：レンチウイルスベクター発現カセットから生成されたｆ＋ｒＴ増幅全転写物、及びｆ＋ｒＵＳ増幅非スプライシング型転写物を使用して、全ＲＮＡをｑＰＣＲ（ＳＹＢＲグリーン）に供し、したがって、非スプライシング型ｖＲＮＡ転写物対総ｖＲＮＡ転写物の割合を計算し、プロットした。データは、標準的な第３世代レンチウイルスベクター産生中の全体に対する非スプライシング型ｖＲＮＡの割合が適度であり、内部導入遺伝子カセット（この場合、異なるプロモータ及びＧＦＰ遺伝子を含有する）に従って変動することを示す。更に、この割合はｒｅｖの作用によって最小限しか増加しない。 ＨＩＶ－１ベースのレンチウイルスベクター内の主要スプライスドナー部位（ＭＳＤ）からの異常なスプライシングの影響を示す図である。図２Ａ：パッケージングシグナルのステムループ（ＳＬ２）内に埋め込まれた機能的主要スプライスドナーを含む第３世代（自己不活性化（ＳＩＮ））レンチウイルスベクター発現カセットの典型的な構成、及びレンチウイルスベクター産生中に生成されるｍＲＮＡのタイプを示す概略図である。「標準的な」レンチウイルスベクター（ＬＶ）ＤＮＡカセット、及びＭＳＤからの乱雑な活性を抑制又は除去するＭＳＤ領域に（１又は複数の）機能変異を有するレンチウイルスベクターＤＮＡカセット（「ＭＳＤ－ＫＯ ＬＶ ＤＮＡカセット」）から生成されたｍＲＮＡの種類を示す。両方のカセットについて、全長（「非スプライシング型」）ベクターＲＮＡ（ｖＲＮＡ）は、ｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）に結合するｒｅｖの共発現から生じ、一般に、ＭＳＤからＲＲＥ配列に含まれるスプライスアクセプタ７（ｓａ７）へのスプライシングを抑制すると考えられている。標準的なレンチウイルスベクターＤＮＡカセットでは、ｒｅｖの非存在下で、全てのイントロンのスプライシングが効率的に起こる（「スプライシングされた」）と一般に考えられている。しかし、ＭＳＤがスプライスアクセプタ部位又は潜在性スプライスアクセプタ部位に非常に効率的にスプライシングし（「異常」スプライシングされた」）、典型的には、ｒｅｖがＭＳＤのこの活性に最小限の影響しか及ぼさないようにＲＲＥ含有イントロンを「見落とす」レンチウイルスベクター産生中に「異常な」スプライス産物を作製することができる。レンチウイルスベクター産生はまた、ＭＳＤ変異レンチウイルスベクターＤＮＡカセットのパッケージング領域に再指向された改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡの共発現によって行うことができる。（Ｋｅｙ：Ｐｒｏ、プロモータ；５’Ｒからｇａｇまでの領域は、パッケージング要素｛Ψ｝を含み、ｍｓｄ、主要スプライスドナー；ｃｐｐｔ、中央ポリプリントラクト；Ｉｎｔ、イントロン；ｓｄ／ｓａ、スプライスドナー／アクセプタ；ＧＯＩ、目的の遺伝子；灰色の矢印は、第３世代レンチウイルスベクター産生中に産生された非スプライシング型ｖＲＮＡの割合を評価するためのフォワード｛ｆ｝プライマー及びリバース｛ｒ｝プライマーの位置を示す。転写後調節要素｛ＰＲＥ｝は、明確にするために示されていない）。図２Ｂ：標準的な第３世代レンチウイルスベクターの産生を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で＋／－ｒｅｖで行い、産生後の細胞から全ＲＮＡを抽出した。２つのプライマーセット（Ａでマークした位置）：レンチウイルスベクター発現カセットから生成されたｆ＋ｒＴ増幅全転写物、及びｆ＋ｒＵＳ増幅非スプライシング型転写物を使用して、全ＲＮＡをｑＰＣＲ（ＳＹＢＲグリーン）に供し、したがって、非スプライシング型ｖＲＮＡ転写物対総ｖＲＮＡ転写物の割合を計算し、プロットした。データは、標準的な第３世代レンチウイルスベクター産生中の全体に対する非スプライシング型ｖＲＮＡの割合が適度であり、内部導入遺伝子カセット（この場合、異なるプロモータ及びＧＦＰ遺伝子を含有する）に従って変動することを示す。更に、この割合はｒｅｖの作用によって最小限しか増加しない。 ３つの異なるプロモータ－ＧＦＰ発現カセット（ＥＦ１ａ、ＥＦＳ及びＣＭＶ）を含有するＨＩＶ－１レンチウイルスベクターゲノムを改変して、ＭＳＤを機能的に変異させ、「ＭＳＤ－２ＫＯ」レンチウイルスベクターゲノム又は骨格を得た（変異の説明については図１０Ａを参照されたい）。ベクターを標準プロトコルのもとでＨＥＫ２９３Ｔ細胞において作製し、滴定した。データは、ＭＳＤの機能変異（「ＭＳＤ－２ＫＯ」）がレンチウイルスベクターの力価の最大１００倍の減少をもたらすことを示している。 図４Ａ：標準又はＥＦ１ａ－ＧＦＰ内部発現カセットをコードするＭＳＤ変異レンチウイルスベクター発現カセットの構成、及びレンチウイルスベクター産生中に生成されるｍＲＮＡの種類を示す概略図である。（Ｋｅｙ：Ｐｒｏ、プロモータ；５’Ｒからｇａｇまでの領域は、パッケージング要素｛Ψ｝を含み、ｍｓｄ、主要スプライスドナー；ｃｐｐｔ、中央ポリプリントラクト；Ｉｎｔ、イントロン；ｓｄ／ｓａ、スプライスドナー／アクセプタ；ＧＯＩ、目的の遺伝子；灰色の矢印は、第３世代レンチウイルスベクター産生中に産生された非スプライシング型ｖＲＮＡの割合を評価するためのフォワード｛ｆ｝プライマー及びリバース｛ｒ｝プライマーの位置を示す。転写後調節要素｛ＰＲＥ｝は、明確にするために示されていない）。図４Ｂ：ｉ．標準的なレンチウイルスベクター又はＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞＋／－ｔａｔ、又は１７９Ｕ１、又は３０５Ｕ１で産生し、滴定した図である。ｉｉ．全細胞質ｍＲＮＡを産生後の細胞から抽出し、ＳＬ２スプライシング領域ＳＬ２スプライシング領域からＥＦ１ａスプライスアクセプタまでの主要な「異常な」スプライス産物を検出することができるプライマー（ｆ＋ｒＧ）を使用してＲＴ－ＰＣＲ／ゲル電気泳動によって分析した図である。データは、ＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターゲノム（ｖＲＮＡ）の５’パッケージング領域に再指向された改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡが、標準及びＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターの両方の力価を、ｔａｔと同様の様式で増加させることができたことを示す。ＭＳＤ－２ＫＯ変異は、ＳＬ２スプライシング領域からＥＦ１ａスプライスアクセプタまでである「異常な」スプライス産物の検出を無効にした（図４Ａ参照）。重要なことに、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡによる力価の増加は、ｔａｔの使用とは対照的に、実質的に検出不能な「異常な」スプライシング産物の維持を伴った。 図４Ａ：標準又はＥＦ１ａ－ＧＦＰ内部発現カセットをコードするＭＳＤ変異レンチウイルスベクター発現カセットの構成、及びレンチウイルスベクター産生中に生成されるｍＲＮＡの種類を示す概略図である。（Ｋｅｙ：Ｐｒｏ、プロモータ；５’Ｒからｇａｇまでの領域は、パッケージング要素｛Ψ｝を含み、ｍｓｄ、主要スプライスドナー；ｃｐｐｔ、中央ポリプリントラクト；Ｉｎｔ、イントロン；ｓｄ／ｓａ、スプライスドナー／アクセプタ；ＧＯＩ、目的の遺伝子；灰色の矢印は、第３世代レンチウイルスベクター産生中に産生された非スプライシング型ｖＲＮＡの割合を評価するためのフォワード｛ｆ｝プライマー及びリバース｛ｒ｝プライマーの位置を示す。転写後調節要素｛ＰＲＥ｝は、明確にするために示されていない）。図４Ｂ：ｉ．標準的なレンチウイルスベクター又はＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞＋／－ｔａｔ、又は１７９Ｕ１、又は３０５Ｕ１で産生し、滴定した図である。ｉｉ．全細胞質ｍＲＮＡを産生後の細胞から抽出し、ＳＬ２スプライシング領域ＳＬ２スプライシング領域からＥＦ１ａスプライスアクセプタまでの主要な「異常な」スプライス産物を検出することができるプライマー（ｆ＋ｒＧ）を使用してＲＴ－ＰＣＲ／ゲル電気泳動によって分析した図である。データは、ＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターゲノム（ｖＲＮＡ）の５’パッケージング領域に再指向された改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡが、標準及びＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターの両方の力価を、ｔａｔと同様の様式で増加させることができたことを示す。ＭＳＤ－２ＫＯ変異は、ＳＬ２スプライシング領域からＥＦ１ａスプライスアクセプタまでである「異常な」スプライス産物の検出を無効にした（図４Ａ参照）。重要なことに、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡによる力価の増加は、ｔａｔの使用とは対照的に、実質的に検出不能な「異常な」スプライシング産物の維持を伴った。 ＥＦ１ａ、ＥＦＳ又はＣＭＶプロモータによって駆動されるＧＦＰ内部カセットをコードする標準的なレンチウイルスベクター又はＭＳＤ変異レンチウイルスベクターを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞＋／－２５６Ｕ１において産生し、滴定した図である。５’パッケージング領域に再指向された改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡの使用による増強されたレンチウイルスベクターの力価は、導入遺伝子カセット内で使用されるプロモータとは無関係である。データは、大部分において、ＭＳＤ－２ＫＯ変異の減弱表現型が改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡの共発現によって救済され、したがって、これは、標準的なレンチウイルスベクターゲノムと比較して不均衡にＭＳＤ変異レンチウイルスベクターゲノムの力価を驚くほど高めることを示す。 ５’パッケージング領域に再指向された改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡの使用によるＭＳＤ変異レンチウイルスベクター力価の増強は、５’ＬＴＲ内の５’ポリＡシグナルの潜在的活性の抑制に関連していないことを示す図である。以前の報告は、ＭＳＤの変異がＨＩＶ－１プロウイルス及び「ミニレポータ」カセットの５’ＬＴＲの５’Ｒ配列内のポリＡシグナルを活性化し、転写の早期終結をもたらすことができることを示しており、内因性Ｕ１ ｓｎＲＮＡ及び更には再指向されたＵ１ ｓｎＲＮＡの結合は、このポリＡ活性を阻止することができた。図６Ａ：ＧＦＰ－ポリＡ－Ｇルシフェラーゼレポータカセットを設計して、ＨＩＶ－１ポリＡ部位の転写リードスルーに対する２つのポリＡシグナル変異体（ｐＡＭ１＝ＡＡＵＡＡＡ＞ＡＡＣＡＡＡ；ｐＡＫＯ＝ＡＡＵＡＡＡの欠失）及び野生型ポリＡシグナル（ｗｔ ｐＡ＝ＡＡＵＡＡＡ）の影響を評価した図である。ＨＩＶ－１ポリＡシグナルのリードスルーは、ルシフェラーゼ活性によって測定可能であり、これをＧＦＰ発現によって正規化した。図６Ｂ：改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡが同様の様式で作用しているかどうかを試験するために、５’ポリＡシグナルにおける機能変異（ｐＡｍ１）を、ＥＦ１ａ－ＧＦＰ又はＣＭＶ－ＧＦＰ発現カセットを有するＭＳＤ変異レンチウイルスベクターゲノムに導入した図である。ＥＦ１ａ－ＧＦＰ又はＣＭＶ－ＧＦＰ発現カセットを有する標準的な及びＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターゲノムも使用した。レンチウイルスベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞＋／－３０５Ｕ１中で産生し、滴定した。データは、５’ｐｏｌｙＡシグナルの機能的除去は、レンチウイルスベクターの力価の非常にわずかな増加しかもたらさなかったことを示しており、したがって、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡによってもたらされるレンチウイルスベクターの力価の観察された増加、特にＭＳＤ－２ＫＯ／ポリＡ変異レンチウイルスベクターゲノムの増加は、５’ｐｏｌｙＡ活性の抑制に起因するものではなかった。 ベクターゲノムのＳＬ１に結合するＵ１－７０Ｋタンパク質、ＳＬ２に結合するＵ１Ａタンパク質又はＳＬ４に／ＳＬ４の近くに結合するＳｍタンパク質を除去させることが知られているいくつかの変異を３０５Ｕ１及び２５６Ｕ１改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡに導入した図である。標準又はＥＦ１ａ－ＧＦＰ内部カセットをコードするＭＳＤ変異レンチウイルスベクターを、これらの変異改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡの存在下で産生し、滴定し、滴定値を、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡなしで産生された標準レンチウイルスベクターに対して正規化した。データは、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡによるＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターの力価の増強がＵ１－７０Ｋタンパク質又はＵ１Ａタンパク質結合に依存せず、Ｓｍタンパク質結合部位に依存することを示す。したがって、５’パッケージング領域に再標的化された改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡの使用によるＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターの力価の増強は、Ｕ１ ｓｎＲＮＡのいかなる既知の機能にも関連しない。 様々な長さの標的化配列を含有する改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡの使用によるＭＳＤ変異レンチウイルスベクター力価の増強を示す図である。ＥＦ１ａ－ＧＦＰカセットを含むＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターを、「３０５」領域を標的化する改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡの存在下でＨＥＫ２９３Ｔ細胞において産生し、各改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、相補性の異なる長さの再標的化配列を含んでいた。７～１５ヌクレオチドの相補性長を含む改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡを使用した場合、力価の増加が観察され、１０ヌクレオチド以上で最大の効果が観察された。 改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡをベクターゲノムＲＮＡのパッケージング領域に標的化する場合、ＭＳＤ変異レンチウイルスベクターの最大力価回復／ブーストが観察される図である。ＥＦ１－ＧＦＰカセットを含有するＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターを、１５ヌクレオチド長の相補性（又は示される場合は９ヌクレオチド）を含むベクターゲノムｖＲＮＡ分子の５’末端の長さに沿った部位へのターゲティング配列を有する改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡの存在下で産生した。改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、ベクターゲノムｖＲＮＡ分子の５’末端の長さに沿った標的化配列部位の最初のヌクレオチドに従って命名される。各改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡのデータバーを、ベクターゲノムｖＲＮＡの５’末端内の各既知の機能配列のおおよその標識位置の下に整列させる（縮尺通りではない）。 機能的主要スプライスドナー変異、レンチウイルスベクターの力価に対するそれらの影響、及び改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡによる回収の説明の図である。図１０Ａ：ＨＩＶ－１のステムループ２（ＳＬ２）領域の「野生型」配列（ＮＬ４－３；現在のレンチウイルスベクターゲノム内の「標準」配列）が上部に示されている。配列は、主要スプライスドナー部位（ＭＳＤ：コンセンサス＝ＣＴＧＧＴ）及び潜在性スプライスドナー部位（ＭＳＤ部位がそれ自身で変異する場合に使用される）（ｃｒＳＤ：コンセンサス＝ＴＧＡＧＴ）を含む。スプライスドナー部位を使用する場合のスプライシング位置のヌクレオチドは、太字及び矢印で特定される。ＭＳＤ及びｃｒＳＤ部位スプライシング活性の両方を除去させる４つの機能的ＭＳＤ変異が記載されている。ＭＳＤ及びｃｒＳＤ部位からの２つの「ＧＴ」モチーフを変異させるＭＳＤ－２ＫＯ（及びほとんどの実施例で広く使用されている）、ＭＳＤ部位及びｃｒＳＤ部位の両方を除去させる変異も含むＭＳＤ－２ＫＯｖ２、スプライスドナー部位を全く欠く全く新しいステムループ構造を導入するＭＳＤ－２ＫＯｍ５、並びにＳＬ２配列を完全に削除するΔＳＬ２である。ＭＳＤ－２ＫＯ、ＭＳＤ－２ＫＯｖ２及びＭＳＤ－２ＫＯｍ５変異におけるＳＬ２配列に導入された置換は、小文字のイタリック体で示されている。図１０Ｂ：機能的ＭＳＤ変異（図１０Ａに記載）を含む４つのレンチウイルスベクターゲノムバリアントをＥＦＳ－ＧＦＰ内部カセットでクローニングし、ＭＳＤ－２ＫＯ又はＭＳＤ－２ＫＯｍ５バリアントをＥＦ１ａ－、ＣＭＶ－又はｈｕＰＧＫ－ＧＦＰ内部カセットで更にクローニングした。標準及びＭＳＤ変異ＬＶをＨＥＫ２９３Ｔ細胞＋／－２５６Ｕ１において産生し、滴定した。データは、レンチウイルスベクター力価の弱毒化の程度が特定の変異に従って変化し得ること、及びＭＳＤ－２ＫＯｍ５バリアントが一般に弱毒化の低い表現型を産生したことを示している。改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、産生中に共発現された場合、機能的ＭＳＤ変異を含む４つのレンチウイルスベクターゲノムバリアントのレンチウイルスベクター力価を増加させることができた。力価の増加は、２５６Ｕ１がＭＳＤ－２ＫＯｍ５配列を有するＭＳＤ変異ＬＶゲノムと共に発現された場合に最大であった。 改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡ発現カセットは、一過性トランスフェクションプロトコルでの使用を容易にするためにレンチウイルスベクターゲノムプラスミド骨格に配置することができることを示す図である。実施例の多くは、レンチウイルスベクターの産生においてレンチウイルスベクター成分プラスミドとのコトランスフェクションにおいて別個の改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡ発現プラスミドを使用する。レンチウイルスベクターゲノムプラスミド骨格上の「許容」部位を同定して、一過性トランスフェクション中にシスに改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡカセットを提供できるようにするために、３つのバリアントをクローニングした。図１１Ａ：一過性トランスフェクション中にシスに改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡカセットを提供するレンチウイルスベクターゲノムバリアントの概略図である。バージョン１（「［ｃｉｓ］ｖｅｒ１」）及びバージョン３（「［ｃｉｓ］ｖｅｒ３」）は、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡカセットがレンチウイルスベクターゲノムカセットに対して反転するように（耐性マーカーの向きがｖｅｒ１とｖｅｒ３とで異なる）、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡカセットを耐性マーカーと複製起点との間に配置し、バージョン２（「［ｃｉｓ］ｖｅｒ２」）は、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡカセットをレンチウイルスベクターゲノムカセットの上流に同じ向きに配置した。（Ｋｅｙ：Ｐｒｏ、プロモータ；５’Ｒからｇａｇまでの領域は、パッケージング要素｛Ψ｝を含み；ｍｓｄ、主要スプライスドナー｛ここではＭＳＤ－２ＫＯとして示されている｝；ＲＲＥ、ｒｅｖ応答素子；ｃｐｐｔ、中央ポリプリントラクト；治療用ペイロードを含むトランスジェニック異種配列；Ｕ１－Ｐｒｏ、Ｕ１プロモータ；用語［３’ボックス］、Ｕ１転写ターミネータ）。図１１Ｂ：ＥＦ１ａ－ＧＦＰカセットを含有するＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターゲノムプラスミドの３つの「シス」バージョンを使用して、「トランス」アプローチと並行してＨＥＫ２９３Ｔ細胞でレンチウイルスベクターを産生し、同じＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターゲノム（骨格に改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡカセットを挿入せず）を、別個のプラスミドを用いたコトランスフェクションによって供給される＋／－改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡを産生した。データは、別個の改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡをコードするプラスミドのコトランスフェクションと同様に、ＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクター力価を「シス」レンチウイルスベクターゲノムの使用によって増加させることができることを示している。 改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡ発現カセットは、一過性トランスフェクションプロトコルでの使用を容易にするためにレンチウイルスベクターゲノムプラスミド骨格に配置することができることを示す図である。実施例の多くは、レンチウイルスベクターの産生においてレンチウイルスベクター成分プラスミドとのコトランスフェクションにおいて別個の改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡ発現プラスミドを使用する。レンチウイルスベクターゲノムプラスミド骨格上の「許容」部位を同定して、一過性トランスフェクション中にシスに改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡカセットを提供できるようにするために、３つのバリアントをクローニングした。図１１Ａ：一過性トランスフェクション中にシスに改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡカセットを提供するレンチウイルスベクターゲノムバリアントの概略図である。バージョン１（「［ｃｉｓ］ｖｅｒ１」）及びバージョン３（「［ｃｉｓ］ｖｅｒ３」）は、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡカセットがレンチウイルスベクターゲノムカセットに対して反転するように（耐性マーカーの向きがｖｅｒ１とｖｅｒ３とで異なる）、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡカセットを耐性マーカーと複製起点との間に配置し、バージョン２（「［ｃｉｓ］ｖｅｒ２」）は、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡカセットをレンチウイルスベクターゲノムカセットの上流に同じ向きに配置した。（Ｋｅｙ：Ｐｒｏ、プロモータ；５’Ｒからｇａｇまでの領域は、パッケージング要素｛Ψ｝を含み；ｍｓｄ、主要スプライスドナー｛ここではＭＳＤ－２ＫＯとして示されている｝；ＲＲＥ、ｒｅｖ応答素子；ｃｐｐｔ、中央ポリプリントラクト；治療用ペイロードを含むトランスジェニック異種配列；Ｕ１－Ｐｒｏ、Ｕ１プロモータ；用語［３’ボックス］、Ｕ１転写ターミネータ）。図１１Ｂ：ＥＦ１ａ－ＧＦＰカセットを含有するＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターゲノムプラスミドの３つの「シス」バージョンを使用して、「トランス」アプローチと並行してＨＥＫ２９３Ｔ細胞でレンチウイルスベクターを産生し、同じＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターゲノム（骨格に改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡカセットを挿入せず）を、別個のプラスミドを用いたコトランスフェクションによって供給される＋／－改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡを産生した。データは、別個の改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡをコードするプラスミドのコトランスフェクションと同様に、ＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクター力価を「シス」レンチウイルスベクターゲノムの使用によって増加させることができることを示している。 レンチウイルスベクター産生中に導入遺伝子を発現する異常にスプライシングされたｍＲＮＡは、ＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターでは除去し、ＴＲｉＰシステムを利用する場合にＴＲＡＰによって標的化されるのに必要な導入遺伝子ｍＲＮＡの量が減少する。図１２Ａ：ＥＦ１ａ－ＧＦＰ導入遺伝子カセットをコードする「ＴＲｉＰ」レンチウイルスベクターゲノムの概略図であって、ＴＲＡＰ結合部位（ｔｂｓ）がカセットの５’ＵＴＲ内に配置されている（ベクター産生中のＴＲＡＰの供給は導入遺伝子発現レベルを低下させる）。ＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターの産生中、全長のスプライシングされていないパッケージング可能なｖＲＮＡ及び導入遺伝子ｍＲＮＡは、レンチウイルスベクターカセット（ｉ）から産生されるＲＮＡの主な形態である（導入遺伝子プロモータが産生中に活性である場合）。しかし、標準的なレンチウイルスベクターゲノムにおけるＭＳＤの乱雑な活性は、導入遺伝子（ｉｉ）をコードし得る更なる「異常な」スプライス生成物をもたらし、これは、内部導入遺伝子プロモータ、すなわち組織特異的プロモータとは無関係に起こり得る。（Ｋｅｙ：Ｐｒｏ、プロモータ；５’Ｒからｇａｇまでの領域は、パッケージング要素｛Ψ｝を含み、ｍｓｄ、主要スプライスドナー；ｃｐｐｔ、中央ポリプリントラクト；Ｉｎｔ、イントロン；ｓｄ／ｓａ、スプライスドナー／アクセプタ；ＧＯＩ、目的の遺伝子；灰色の矢印は、第３世代レンチウイルスベクター産生中に産生された非スプライシング型ｖＲＮＡの割合を評価するためのフォワード｛ｆ｝プライマー及びリバース｛ｒ｝プライマーの位置を示す。転写後調節要素｛ＰＲＥ｝は、明確にするために示されていない）。図１２Ｂ：ＥＦ１ａ－ＧＦＰカセットを含有する標準又はＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターゲノムプラスミドを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてレンチウイルスベクターを産生し、ＧＦＰ発現スコアを生成した（％ＧＦＰ×ＭＦＩ）。標準的なレンチウイルスベクター産生中に培養物中で産生されたＧＦＰの総量に対して、ＭＳＤ－２ＫＯは、ＴＲＡＰの非存在下であっても産生されたＧＦＰの量を減少させる実質的な効果を有した。したがって、ＴＲＡＰの抑制効果は、ＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターゲノムの使用によって増強され、培養物中のはるかに低いレベルのＧＦＰをもたらした。 レンチウイルスベクター産生中に導入遺伝子を発現する異常にスプライシングされたｍＲＮＡは、ＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターでは除去し、ＴＲｉＰシステムを利用する場合にＴＲＡＰによって標的化されるのに必要な導入遺伝子ｍＲＮＡの量が減少する。図１２Ａ：ＥＦ１ａ－ＧＦＰ導入遺伝子カセットをコードする「ＴＲｉＰ」レンチウイルスベクターゲノムの概略図であって、ＴＲＡＰ結合部位（ｔｂｓ）がカセットの５’ＵＴＲ内に配置されている（ベクター産生中のＴＲＡＰの供給は導入遺伝子発現レベルを低下させる）。ＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターの産生中、全長のスプライシングされていないパッケージング可能なｖＲＮＡ及び導入遺伝子ｍＲＮＡは、レンチウイルスベクターカセット（ｉ）から産生されるＲＮＡの主な形態である（導入遺伝子プロモータが産生中に活性である場合）。しかし、標準的なレンチウイルスベクターゲノムにおけるＭＳＤの乱雑な活性は、導入遺伝子（ｉｉ）をコードし得る更なる「異常な」スプライス生成物をもたらし、これは、内部導入遺伝子プロモータ、すなわち組織特異的プロモータとは無関係に起こり得る。（Ｋｅｙ：Ｐｒｏ、プロモータ；５’Ｒからｇａｇまでの領域は、パッケージング要素｛Ψ｝を含み、ｍｓｄ、主要スプライスドナー；ｃｐｐｔ、中央ポリプリントラクト；Ｉｎｔ、イントロン；ｓｄ／ｓａ、スプライスドナー／アクセプタ；ＧＯＩ、目的の遺伝子；灰色の矢印は、第３世代レンチウイルスベクター産生中に産生された非スプライシング型ｖＲＮＡの割合を評価するためのフォワード｛ｆ｝プライマー及びリバース｛ｒ｝プライマーの位置を示す。転写後調節要素｛ＰＲＥ｝は、明確にするために示されていない）。図１２Ｂ：ＥＦ１ａ－ＧＦＰカセットを含有する標準又はＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターゲノムプラスミドを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてレンチウイルスベクターを産生し、ＧＦＰ発現スコアを生成した（％ＧＦＰ×ＭＦＩ）。標準的なレンチウイルスベクター産生中に培養物中で産生されたＧＦＰの総量に対して、ＭＳＤ－２ＫＯは、ＴＲＡＰの非存在下であっても産生されたＧＦＰの量を減少させる実質的な効果を有した。したがって、ＴＲＡＰの抑制効果は、ＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターゲノムの使用によって増強され、培養物中のはるかに低いレベルのＧＦＰをもたらした。 標準又はＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターの増加を可能にする改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡを安定に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の単離の成功が、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡカセットをレンチウイルスベクターパッケージング及びプロデューサ細胞株に導入できることを実証していることを示す図である。ＥＦＳ－ＧＦＰカセットを含有する標準又はＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターゲノムを、ＨＥＫ２９３Ｔ又はＨＥＫ２９３Ｔ．３０５Ｕ１（９ｎｔバリアント）細胞＋／－追加の３０５Ｕ１プラスミド中で産生した。データは、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡを発現する安定なカセットが毒性なしに細胞に導入され得ることを示している。 ｔｂｓをＡＴＧ開始コドンにより近く配置するための、導入遺伝子５’ＵＴＲ内のｔｂｓの３’末端と重複する最適なＫｏｚａｋ配列の同定の図である。図１４Ａ：コアコンセンサス「ＲＶＶＡＴＧ」及びより広いコンセンサス「ＧＮＮＲＶＶＡＴＧ」に適合する操作されたバリアント中のＫｏｚａｋ配列の位置及び配列を示す概略図であって、（１又は複数の）ＫＡＧＮＮ反復が維持されるようにＫｏｚａｋがｔｂｓの３’末端と重複するように配置される。これにより、ｔｂｓをＡＴＧ開始コドンの近くに配置して、ＴＲＡＰ－ｔｂｓ複合体内のＡＴＧ開始コドンを「隠す」ことによって導入遺伝子抑制レベル（＋ＴＲＡＰ）の改善を可能にするｔｂｓ－Ｋｏｚａｋ接合バリアントを同定することができる。コンセンサスＫｏｚａｋ配列の維持は、導入遺伝子非抑制レベル（ＴＲＡＰなし）を高レベルで保持することを可能にする（すなわち、ベクターを形質導入された細胞における発現のモデル化）。図１４Ｂ：レポータを、それぞれＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（ＴＲＡＰなし）又はｐＥＦ１α－ＴＲＡＰ（ＴＲＡＰ）のいずれかによるレポータプラスミドのコトランスフェクションによって、ＧＦＰ発現の非抑制又は抑制レベルについて試験した。トランスフェクト細胞をトランスフェクションの２日後にフローサイトメトリによって分析し、ＧＦＰ発現スコア（％ＧＦＰｘ蛍光強度中央値）を生成し、ｌｏｇ－１０形質転換した。全てのｔｂｓ－Ｋｏｚａｋ接合バリアントレポータは、元の構成と比較して同じ非抑制ＧＦＰレベルを維持した。バリアント「０」、「２」及び「３」は、元の構成と比較して抑制レベルの改善を示した（標準偏差バー、ｎ＝３）。 重複するｔｂｓ－Ｋｏｚａｋバリアントを使用することによるＡＡＶベクターゲノムプラスミドにおける導入遺伝子抑制の改善の図である。２つの「ｔｂｓ－Ｋｏｚａｋバリアント（０及び３）は、ＥＦＳ又はｈｕＰＧＫプロモータＧＦＰレポータカセットのいずれかにクローニングされ、更にＬ３３又はＬ１２改善リーダ配列のいずれかを含有していた。非重複ｔｂｓ／Ｋｏｚａｋバリアントも、ＥＦＳ／ｈｕＰＧＫ－Ｌ３３カセットにクローニングされ、これらはｔｂｓ－Ｋｏｚａｋ領域（オリジナル＝［ｔｂｓ］－ＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧ；ＨｐａＩバリアント＝［ｔｂｓ－ＧＡＧＴＴ］ＡＡＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧ）においてのみ異なっていた。レポータを、それぞれｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（ＴＲＡＰなし）又はｐＥＦ１α－ＴＲＡＰ（ＴＲＡＰ）のいずれかによるレポータプラスミドのコトランスフェクションによって、ＧＦＰ発現の非抑制又は抑制レベルについて試験した。トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞（懸濁液、無血清）をトランスフェクションの２日後にフローサイトメトリによって分析し、ＧＦＰ発現スコア（％ＧＦＰｘ蛍光強度中央値）を生成し、ｌｏｇ－１０形質転換した。データは、ｔｂｓをＫｏｚａｋ配列と重複させることにより、非重複ｔｂｓ／Ｋｏｚａｋバリアントと比較して、ＴＲＡＰによる導入遺伝子発現の改善された抑制が可能になることを実証している。（標準偏差バー、ｎ＝３）。 全長ＥＦ１ａプロモータに関連したＴＲＡＰ媒介導入遺伝子抑制の改善を示す図である。図１６Ａ：３つの「ｔｂｓ－Ｋｏｚａｋ」バリアント（０、２及び３）をＥＦ１ａプロモータＧＦＰレポータカセットにクローニングした。スプライシング後、リーダ配列は、Ｌ３３配列（エクソン１）及びｔｂｓのすぐ上流のエクソン２からの短い１２ｎｔ配列を含む。図１６Ｂ：レポータを、それぞれｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（ＴＲＡＰなし）又はｐＥＦ１α－ＴＲＡＰ（ＴＲＡＰ）のいずれかによるレポータプラスミドのコトランスフェクションによって、ＧＦＰ発現の非抑制又は抑制レベルについて試験した。トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞（懸濁液、無血清）をトランスフェクションの２日後にフローサイトメトリによって分析し、ＧＦＰ発現スコア（％ＧＦＰｘ蛍光強度中央値）を生成し、ｌｏｇ－１０形質転換した。図１６Ｃ：ＧＦＰ導入遺伝子カセットをＨＩＶ－１レンチウイルスベクターゲノムにクローニングし、Ｂに記載されるようにＧＦＰ発現の非抑制又は抑制レベルについて試験した。データは、ｔｂｓをＫｏｚａｋ配列と重複させることにより、ＴＲＡＰによる導入遺伝子発現の改善された抑制が可能になることを実証している。（標準偏差バー、ｎ＝３）。 全長ＥＦ１ａプロモータに関連したＴＲＡＰ媒介導入遺伝子抑制の改善を示す図である。図１６Ａ：３つの「ｔｂｓ－Ｋｏｚａｋ」バリアント（０、２及び３）をＥＦ１ａプロモータＧＦＰレポータカセットにクローニングした。スプライシング後、リーダ配列は、Ｌ３３配列（エクソン１）及びｔｂｓのすぐ上流のエクソン２からの短い１２ｎｔ配列を含む。図１６Ｂ：レポータを、それぞれｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（ＴＲＡＰなし）又はｐＥＦ１α－ＴＲＡＰ（ＴＲＡＰ）のいずれかによるレポータプラスミドのコトランスフェクションによって、ＧＦＰ発現の非抑制又は抑制レベルについて試験した。トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞（懸濁液、無血清）をトランスフェクションの２日後にフローサイトメトリによって分析し、ＧＦＰ発現スコア（％ＧＦＰｘ蛍光強度中央値）を生成し、ｌｏｇ－１０形質転換した。図１６Ｃ：ＧＦＰ導入遺伝子カセットをＨＩＶ－１レンチウイルスベクターゲノムにクローニングし、Ｂに記載されるようにＧＦＰ発現の非抑制又は抑制レベルについて試験した。データは、ｔｂｓをＫｏｚａｋ配列と重複させることにより、ＴＲＡＰによる導入遺伝子発現の改善された抑制が可能になることを実証している。（標準偏差バー、ｎ＝３）。 懸濁液（無血清）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における重複ｔｂｓ－ＫｏｚａｋバリアントのＴＲＡＰ媒介導入遺伝子抑制の試験の図である。表ＩＶの重複するｔｂｓ－ＫｏｚａｋバリアントをｐＥＦ１ａ－ＧＦＰレポータプラスミドにクローニングし、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞＋／－ｐＴＲＡＰにトランスフェクトし、トランスフェクションの２日後にフローサイトメトリを行った。図１７Ａ：ＧＦＰ発現スコア（％ＧＦＰ陽性×ＭＦＩ）を生成し、＋／－ＴＲＡＰ及びｆｏｌｄ抑制値を生成し、プロットした。バリアントをｘ軸に沿って示し、３’ｔｂｓのＫＡＧＮＮ反復及びコアＫｏｚａｋ配列（「オーバーラップ群」－ＫＡＧａｔｇ、ＫＡＧＮａｔｇ）、ＫＡＧＮＮａｔｇ）の相対的重複に従ってグループ分けする。ＫＡＧＮＮは黒丸で示され、コアＫｏｚａｋヌクレオチドは灰色の線で示される。以下の重複群を比較して統計分析を実施した（重複群内の等しい分散がＦ検定によって確認された）：抑制倍数は、ＫＡＧＮａｔｇよりもＫＡＧａｔｇの方が統計的に大きかった（＊ｐ＝０．０２９３）。ＫＡＧＮＮａｔｇに対するＫＡＧＮａｔｇについて（＊＊ｐ＝０．０００００４８２）；及び非重複ｔｂｓに対するＫＡＧＮＮａｔｇ（＊＊＊ｐ＝０．０００２５９）については、ｔｗｏ－ｔａｉｌ Ｔ検定を用いる。図１７Ｂ：非抑制ＧＦＰ発現スコアを最高から最低（左から右）にプロットし、２つのＫＡＧａｔｇオーバーラップ群バリアントｔｂｓｋｚｋＶ０．Ｇ及びｔｂｓｋｚｋＶ０．Ｔ（Ａの全てのバリアントの最大抑制を示す）を強調して、「Ｇ」バリアントが「Ｔ」バリアントよりも好ましいことを示し、これは前者がより良好な「ＯＮ」（非抑制）レベルを有するためである。 懸濁液（無血清）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における重複ｔｂｓ－ＫｏｚａｋバリアントのＴＲＡＰ媒介導入遺伝子抑制の試験の図である。表ＩＶの重複するｔｂｓ－ＫｏｚａｋバリアントをｐＥＦ１ａ－ＧＦＰレポータプラスミドにクローニングし、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞＋／－ｐＴＲＡＰにトランスフェクトし、トランスフェクションの２日後にフローサイトメトリを行った。図１７Ａ：ＧＦＰ発現スコア（％ＧＦＰ陽性×ＭＦＩ）を生成し、＋／－ＴＲＡＰ及びｆｏｌｄ抑制値を生成し、プロットした。バリアントをｘ軸に沿って示し、３’ｔｂｓのＫＡＧＮＮ反復及びコアＫｏｚａｋ配列（「オーバーラップ群」－ＫＡＧａｔｇ、ＫＡＧＮａｔｇ）、ＫＡＧＮＮａｔｇ）の相対的重複に従ってグループ分けする。ＫＡＧＮＮは黒丸で示され、コアＫｏｚａｋヌクレオチドは灰色の線で示される。以下の重複群を比較して統計分析を実施した（重複群内の等しい分散がＦ検定によって確認された）：抑制倍数は、ＫＡＧＮａｔｇよりもＫＡＧａｔｇの方が統計的に大きかった（＊ｐ＝０．０２９３）。ＫＡＧＮＮａｔｇに対するＫＡＧＮａｔｇについて（＊＊ｐ＝０．０００００４８２）；及び非重複ｔｂｓに対するＫＡＧＮＮａｔｇ（＊＊＊ｐ＝０．０００２５９）については、ｔｗｏ－ｔａｉｌ Ｔ検定を用いる。図１７Ｂ：非抑制ＧＦＰ発現スコアを最高から最低（左から右）にプロットし、２つのＫＡＧａｔｇオーバーラップ群バリアントｔｂｓｋｚｋＶ０．Ｇ及びｔｂｓｋｚｋＶ０．Ｔ（Ａの全てのバリアントの最大抑制を示す）を強調して、「Ｇ」バリアントが「Ｔ」バリアントよりも好ましいことを示し、これは前者がより良好な「ＯＮ」（非抑制）レベルを有するためである。 最適な重複ｔｂｓ－Ｋｏｚａｋバリアントを用いたイントロン含有プロモータの改善された抑制。図１８Ａ：非重複ｔｂｓ－Ｋｏｚａｋバリアントと比較して重複するｔｂｓ－Ｋｏｚａｋバリアントの使用を例示するために使用される発現カセットの概略図である。広く使用されているＥＦ１ａプロモータ配列は、広く使用されているＣＡＧプロモータと同様に、それ自体のイントロンを含有する（図１０及び実施例５参照）。ＣＡＧプロモータは、ＣＭＶエンハンサ、コアプロモータ及びニワトリβ－アクチン遺伝子由来のエクソン１／イントロン配列及びウサギβ－グロビン遺伝子由来のスプライスアクセプタ／エクソン配列を含む非常に強力な人工プロモータである。この研究では、ＥＦ１ａプロモータ（エクソン１［Ｌ３３］を含む）由来の「ＥＦ１ａ－ＩＮＴ」配列、ＥＦ１ａイントロン及びスプライスアクセプタの全て、及びＥＦ１ａエクソン２由来の１２ヌクレオチドをＣＡＧプロモータにクローニングし、ＣＡＧエクソン／イントロン配列を置き換えた。「ＥＦ１ａ－ＩＮＴ」配列もＣＭＶプロモータ構築物にクローニングした。図１８Ｂ：構築物を、ウイルスベクター産生中の導入遺伝子発現をモデル化するために、懸濁液（無血清）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＧＦＰ発現及びＴＲＡＰによる抑制について評価した。ＧＦＰ発現スコア（％ＧＦＰ×ＭＦＩ）を生成し、プロットし、同様にまた、倍抑制スコアをＴＲＡＰの存在下において示した。 最適な重複ｔｂｓ－Ｋｏｚａｋバリアントを用いたイントロン含有プロモータの改善された抑制。図１８Ａ：非重複ｔｂｓ－Ｋｏｚａｋバリアントと比較して重複するｔｂｓ－Ｋｏｚａｋバリアントの使用を例示するために使用される発現カセットの概略図である。広く使用されているＥＦ１ａプロモータ配列は、広く使用されているＣＡＧプロモータと同様に、それ自体のイントロンを含有する（図１０及び実施例５参照）。ＣＡＧプロモータは、ＣＭＶエンハンサ、コアプロモータ及びニワトリβ－アクチン遺伝子由来のエクソン１／イントロン配列及びウサギβ－グロビン遺伝子由来のスプライスアクセプタ／エクソン配列を含む非常に強力な人工プロモータである。この研究では、ＥＦ１ａプロモータ（エクソン１［Ｌ３３］を含む）由来の「ＥＦ１ａ－ＩＮＴ」配列、ＥＦ１ａイントロン及びスプライスアクセプタの全て、及びＥＦ１ａエクソン２由来の１２ヌクレオチドをＣＡＧプロモータにクローニングし、ＣＡＧエクソン／イントロン配列を置き換えた。「ＥＦ１ａ－ＩＮＴ」配列もＣＭＶプロモータ構築物にクローニングした。図１８Ｂ：構築物を、ウイルスベクター産生中の導入遺伝子発現をモデル化するために、懸濁液（無血清）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＧＦＰ発現及びＴＲＡＰによる抑制について評価した。ＧＦＰ発現スコア（％ＧＦＰ×ＭＦＩ）を生成し、プロットし、同様にまた、倍抑制スコアをＴＲＡＰの存在下において示した。 ｔｂｓの下流の５’ＵＴＲ配列に対する改善の概要である。図１９Ａ：マルチクローニング部位（ＭＣＳ）が導入遺伝子のｔｂｓと開始コドンとの間に挿入されているＴＲＡＰ－ｔｂｓ抑制性導入遺伝子カセットの５’ＵＴＲコード領域のＤＮＡ発現カセットを示すための概略図（ＴＲＡＰはドーナツ形状によって示される）。本発明は、ｔｂｓの末端ＫＡＧＮＮ反復で／その上で始まり、導入遺伝子開始コドンの上流に最大５つのクローニング部位を含む、好ましい重複制限酵素部位を記載する。図１９Ｂ：導入遺伝子のＫｏｚａｋ配列が、どのように配置されて、ｔｂｓの３’ＫＡＧＮＮ反復と大部分又は部分的に重複し得るかを示すための概略図であり、そうすることにより、ＴＲＡＰ－ｔｂｓ複合体内の主要な開始コドンを効果的に「隠す」ことができ、翻訳機構に更にアクセスしにくくなり、導入遺伝子発現の更に低い「抑制された」レベルがもたらされる。図１９Ｃ：好ましい重複ｔｂｓ及びＫｏｚａｋコンセンサス配列を要約する表である。ｔｂｓの３’ＫＡＧＮＮ反復を四角で示し、コアＫｏｚａｋ配列を太字で示す。 図２０Ａ：レンチウイルスベクターのＨＩＶ－１パッケージング領域におけるスプライスドナー部位の変異を更に例示するために使用されるＤＮＡ配列である。パッケージング配列のＳＬ２ループ領域（ＭＳＤ及びｃｒＳＤ１を含む）は、ＳＬ４ループ（２つの更なる小さい潜在性スプライスドナー部位、ｃｒＳＤ２及びｃｒＳＤ３を含有する）と同様にボックスに入れられる。重要なことは、「ｗｔ ＳＬ２－ＭＳＤ－ＳＬ４（ＳＴＤ）」のように、捕捉された配列が野生型である（又はそれと整列している）ことであり、これはまた、スプライスドナーヌクレオチドを太字の黒色で示している。「ＧＴ」ジヌクレオチド（機能的スプライスドナー部位に重要であると考えられる）は、存在する場合、太字の灰色である。破線は、配列内のギャップを表すのではなく、より明確にするために整列した配列を区切るために使用される。前方の斜線は、ＳＬ２ループとＳＬ４ループとの間に表示されない配列を表す（そして全て「欠損」配列は野生型ＨＩＶ－１由来である）。下線が引かれた配列は、ＳＬのステム内のヌクレオチドを示す。小文字のイタリック体配列は改変配列である。「１／２／３／４ＫＯ」は、各バリアントにおいて変異したスプライスドナーの数を示す。図２０Ｂ：標準的なレンチウイルスベクターゲノムＲＮＡにおける野生型主要スプライスドナー部位、並びに「ＭＳＤ－２ＫＯ」及び「ＭＳＤ－２ＫＯｍ５」バリアントに対する内因性Ｕ１ ｓｎＲＮＡの予測アニーリングを示す概略図である。「ＭＳＤ－２ＫＯｍ５」バリアントは、依然としてスプライスドナー部位で機能的に変異しているが、「ＭＳＤ－２ＫＯ」（又は実際には野生型）よりも高い安定性（より高い相補性）で内因性Ｕ１ ｓｎＲＮＡにアニールするように設計されている。更に、「ＭＳＤ－２ＫＯｍ５」は、パッケージング二次構造への影響を最小限に抑えるためにステムループを形成することを可能にするために隣接配列を含む（Ａ参照）。図２０Ｃ：ＥＦ１ａ－ＧＦＰ導入遺伝子カセット及び標準（ＳＴＤ）ＭＳＤ領域（野生型配列）を有するパッケージング領域をコードするレンチウイルスベクターゲノム、又はＭＳＤのみ（ＭＳＤ－１ＫＯ）若しくはＭＳＤ／ｃｒＳｄ１（ＭＳＤ－２ＫＯ）の変異を構築した図である。ＬＶは、トランスで供給される２５６Ｕ１改変されたｓｎＲＮＡの有無にかかわらず、一過性トランスフェクションによって懸濁（無血清）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で産生された。ＭＳＤの上流及びＥＦ１ａスプライスの下流のプライマーを使用して、ＭＳＤ領域からの異常なスプライシングにおける全体的な影響を同定するために、産生後の細胞からポリＡ選択総ｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ＰＣＲ／アガロースゲル分析にかけた（プライマー位置については図２３を参照されたい）。ゲル画像は、ＳＬ２／ＳＬ４領域からＥＦ１ａスプライスアクセプタまでの異常なスプライス産物の位置／種類を示す（スプライス接合の配列決定によって確認された［データは示さず］）。図２０Ｄ：ＭＳＤ－１ＫＯ ＬＶ及びＭＳＤ－２ＫＯ ＬＶの両方のレンチウイルスベクターの力価は標準ＬＶと比較して減少したが、これらは変異ＬＶのパッケージング領域を標的とする改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡの使用によって救済された（ｌｏｇ１０スケールのＹ軸）。 図２０Ａ：レンチウイルスベクターのＨＩＶ－１パッケージング領域におけるスプライスドナー部位の変異を更に例示するために使用されるＤＮＡ配列である。パッケージング配列のＳＬ２ループ領域（ＭＳＤ及びｃｒＳＤ１を含む）は、ＳＬ４ループ（２つの更なる小さい潜在性スプライスドナー部位、ｃｒＳＤ２及びｃｒＳＤ３を含有する）と同様にボックスに入れられる。重要なことは、「ｗｔ ＳＬ２－ＭＳＤ－ＳＬ４（ＳＴＤ）」のように、捕捉された配列が野生型である（又はそれと整列している）ことであり、これはまた、スプライスドナーヌクレオチドを太字の黒色で示している。「ＧＴ」ジヌクレオチド（機能的スプライスドナー部位に重要であると考えられる）は、存在する場合、太字の灰色である。破線は、配列内のギャップを表すのではなく、より明確にするために整列した配列を区切るために使用される。前方の斜線は、ＳＬ２ループとＳＬ４ループとの間に表示されない配列を表す（そして全て「欠損」配列は野生型ＨＩＶ－１由来である）。下線が引かれた配列は、ＳＬのステム内のヌクレオチドを示す。小文字のイタリック体配列は改変配列である。「１／２／３／４ＫＯ」は、各バリアントにおいて変異したスプライスドナーの数を示す。図２０Ｂ：標準的なレンチウイルスベクターゲノムＲＮＡにおける野生型主要スプライスドナー部位、並びに「ＭＳＤ－２ＫＯ」及び「ＭＳＤ－２ＫＯｍ５」バリアントに対する内因性Ｕ１ ｓｎＲＮＡの予測アニーリングを示す概略図である。「ＭＳＤ－２ＫＯｍ５」バリアントは、依然としてスプライスドナー部位で機能的に変異しているが、「ＭＳＤ－２ＫＯ」（又は実際には野生型）よりも高い安定性（より高い相補性）で内因性Ｕ１ ｓｎＲＮＡにアニールするように設計されている。更に、「ＭＳＤ－２ＫＯｍ５」は、パッケージング二次構造への影響を最小限に抑えるためにステムループを形成することを可能にするために隣接配列を含む（Ａ参照）。図２０Ｃ：ＥＦ１ａ－ＧＦＰ導入遺伝子カセット及び標準（ＳＴＤ）ＭＳＤ領域（野生型配列）を有するパッケージング領域をコードするレンチウイルスベクターゲノム、又はＭＳＤのみ（ＭＳＤ－１ＫＯ）若しくはＭＳＤ／ｃｒＳｄ１（ＭＳＤ－２ＫＯ）の変異を構築した図である。ＬＶは、トランスで供給される２５６Ｕ１改変されたｓｎＲＮＡの有無にかかわらず、一過性トランスフェクションによって懸濁（無血清）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で産生された。ＭＳＤの上流及びＥＦ１ａスプライスの下流のプライマーを使用して、ＭＳＤ領域からの異常なスプライシングにおける全体的な影響を同定するために、産生後の細胞からポリＡ選択総ｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ＰＣＲ／アガロースゲル分析にかけた（プライマー位置については図２３を参照されたい）。ゲル画像は、ＳＬ２／ＳＬ４領域からＥＦ１ａスプライスアクセプタまでの異常なスプライス産物の位置／種類を示す（スプライス接合の配列決定によって確認された［データは示さず］）。図２０Ｄ：ＭＳＤ－１ＫＯ ＬＶ及びＭＳＤ－２ＫＯ ＬＶの両方のレンチウイルスベクターの力価は標準ＬＶと比較して減少したが、これらは変異ＬＶのパッケージング領域を標的とする改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡの使用によって救済された（ｌｏｇ１０スケールのＹ軸）。 パッケージング配列のＳＬ４におけるｃｒＳＤ２部位から異常なスプライシングを排除するための更なる変異を、ＳＬ２におけるＭＳＤ－２ＫＯ又はＭＳＤ－２ＫＯｍ５変異のいずれかを有するＬＶゲノムに加えた（図２０参照）。ＬＶは、トランスで供給される２５６Ｕ１改変されたｓｎＲＮＡの有無にかかわらず、一過性トランスフェクションによって懸濁（無血清）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で産生された。図２１Ａ：ＭＳＤの上流及びＥＦ１ａスプライスアクセプタの下流のプライマーを使用して、ＳＬ２及びＳＬ４のＭＳＤ領域からの異常なスプライシングにおける全体的な影響を同定するために、産生後の細胞からポリＡ選択総ｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ＰＣＲ／アガロースゲル分析にかけた（プライマー位置については図２３を参照されたい）。ゲル画像は、ＳＬ２／ＳＬ４領域からＥＦ１ａスプライスアクセプタまでの異常なスプライス産物の位置／種類を示す（スプライス接合の配列決定によって確認された［データは示さず］）。図２１Ｂ：全てのＭＳＤ－１／２／３／４ＫＯゲノムのレンチウイルスベクターの力価は標準ＬＶと比較して減少したが、これらは変異ＬＶのパッケージング領域を標的とする改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡの使用によって救済された（ｌｏｇ１０スケールのＹ軸）。 統合ＭＳＤ変異ＬＶは、標準ＬＶと比較して、転写リードスルー事象の割合が低い。レンチウイルスベクターは、転写的に活性な遺伝子を優先して標的細胞ＤＮＡに半ランダムに挿入する。これは、典型的には、組み込まれたベクターが細胞遺伝子転写ユニットの内側に位置することを意味する。組み込まれたＬＶが細胞プロモータの下流に存在する場合、ＬＶユニットに何らかの転写リードスルー（「リードイン」）が起こり得る。現在の標準的な第３世代ＬＶは、インタクトなＭＳＤを含有し、理論的には、５’ＬＴＲ及びパッケージング領域への任意のリードインは、ＲＮＡへの内因性Ｕ１ ｓｎＲＮＡの動員を可能にし得る。そのような状況では、動員されたＵ１ ｓｎＲＮＡが５’ｐｏｌｙＡ部位でのポリアデニル化を抑制し、ＬＶ単位への更なる伸長をもたらすと考えられる。更に、ＭＳＤからのスプライシングは、ＬＶユニット内の下流スプライスアクセプタに、又はトランススプライシングによって細胞転写物にさえ起こり得る。ＭＳＤ変異ＬＶの使用は、スプライシングコンピテント前駆体をもたらす内因性Ｕ１ ｓｎＲＮＡを動員することができないと予想され、そのため、５’ｐｏｌｙＡ部位でのポリアデニル化を抑制することができる可能性がより低い。したがって、この新しいタイプのベクターでは、転写リードインが少なくなると予想される。組み込まれたＬＶカセットの上流からのリードイン転写を評価するために、形質導入細胞から抽出された全ＲＮＡのＲＴ－ｑＰＣＲに使用されるフォワードプライマー（ｆ）及びリバースプライマー（ｒ）の位置を灰色の矢印で示す。 統合ＭＳＤ変異ＬＶは、標準ＬＶと比較して、転写リードスルー事象の割合が低い証拠を示す図である。実施例Ｓ２で生成された標準ＬＶベクター及びＭＳＤ変異バリアントベクターを使用して、一致したＭＯＩでＨＥＫ２９３Ｔ細胞又は初代細胞９２ＢＲのいずれかを形質導入した。標準的なＬＶゲノム調製物に匹敵する力価を与えたため、２５６Ｕ１の存在下で産生されたＭＳＤ変異ベクター調製物のみを使用した。（図２１Ｂ参照）。形質導入された細胞を１０日間継代して、非組込み型ｃＤＮＡを除去し、非組込み型ベクターｃＤＮＡから発現された可能性のある任意のベクターＲＮＡのシグナルを低減させた。ＲＴ－ｑＰＣＲ分析の前に宿主細胞ＲＮＡを抽出し、ＤＮＡｓｅ処理して、リードイン転写物を検出した（プライマー位置については図２２を参照）。検出されたＨＩＶ Ｐｓｉ ＲＮＡコピーを、ＧＡＰＤＨシグナル（ローディング）及び組み込まれたベクターのＤＮＡコピー数の検出に対して正規化し、これを別々に行った。２５６Ｕ１なしで作製した標準ＬＶの検出されたＨＩＶ Ｐｓｉ ＤＮＡコピーを１に設定し、これに対して他の全てのデータ点を設定した。全てのＭＳＤ変異バリアントベクターと標準ベクターとの統計的比較を行った。Ｆ検定（ｃｒｉｔｉｃａｌ ｏｎｅ－ｔａｉｌ）による平均分散の評価後のｔ検定（等分散［ＨＥＫ２９３Ｔ］又は不等分散［９２ＢＲ］を仮定したｃｒｉｔｉｃａｌ ｔｗｏ－ｔａｉｌ）を実施し、２群間の有意差を明らかにした（＊ｐ＝０．０００１２及び＊＊ｐ＝０．００００７３）。
ＲＮＡスプライシング
本明細書に記載されるように、本発明は、レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列であって、レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム中の主要スプライスドナー部位が不活性化されており、主要スプライスドナー部位に対する潜在性スプライスドナー部位３’が不活性化されているヌクレオチド配列を提供する。
ＲＮＡスプライシングは、５つの小さな核リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ）で構成されるスプライソソームと呼ばれる大きなＲＮＡ－タンパク質複合体によって触媒される。イントロンとエクソンとの間の境界は、プレｍＲＮＡ内の特定のヌクレオチド配列によってマークされ、スプライシングが起こる場所を描写する。このような境界を「スプライス部位」と呼ぶ。「スプライス部位」という用語は、別のスプライス部位に切断及び／又は連結されるのに適していると真核細胞のスプライシング機構によって認識され得るポリヌクレオチドを指す。
スプライス部位は、プレｍＲＮＡ転写物中に存在するイントロンの切除を可能にする。典型的には、５’スプライス境界は、「スプライスドナー部位」又は「５’スプライス部位、」と呼ばれ、３’スプライス境界は、「スプライスアクセプタ部位」又は「３’スプライス部位」と呼ばれる。スプライス部位としては、例えば、天然に存在するスプライス部位、人工又は合成スプライス部位、カノニカル又はコンセンサススプライス部位、及び／又は非カノニカルスプライス部位、例えば潜在性スプライス部位が挙げられる。
スプライスアクセプタ部位は、一般に、３つの別個の配列要素：分岐点又は分岐部位、ポリピリミジン経路及びアクセプタコンセンサス配列からなる。真核生物における分岐点コンセンサス配列は、ＹＮＹＴＲＡＣ（式中、Ｙはピリミジンであり、Ｎは任意のヌクレオチドであり、Ｒはプリンである）である。３’アクセプタスプライス部位コンセンサス配列は、ＹＡＧ（Ｙはピリミジンである）である（例えば、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｍｏｄｅｒｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００２）を参照されたい）。３’スプライスアクセプタ部位は、典型的にはイントロンの３’末端に位置する。
「カノニカルスプライス部位」又は「コンセンサススプライス部位」という用語は互換的に使用され得、種を越えて保存されているスプライス部位を指す。
真核生物ＲＮＡスプライシングで使用される５’ドナースプライス部位及び３’アクセプタスプライス部位のコンセンサス配列は、当技術分野で周知である。これらのコンセンサス配列は、イントロンの各末端にほぼ不変のジヌクレオチド：イントロンの５’末端にＧＴ、及びイントロンの３’末端にＡＧを含む。
カノニカルスプライスドナー部位コンセンサス配列は、（ＤＮＡの場合）ＡＧ／ＧＴＲＡＧＴ（式中、Ａはアデノシンであり、Ｔはチミンであり、Ｇはグアニンであり、Ｃはシトシンであり、Ｒはプリンであり、「／」は切断部位を示す）であり得る。これは、本明細書に記載のより一般的なスプライスドナーコンセンサス配列ＭＡＧＧＵＲＲに従う。スプライスドナーが、特に、例えばｖＲＮＡパッケージング領域内の二次構造等の他の制約が同じ配列に関係するウイルスゲノムにおいて、このコンセンサスから逸脱し得ることは当技術分野で周知である。非カノニカルスプライス部位も当技術分野で周知であるが、それらはカノニカルスプライスドナーコンセンサス配列と比較して稀にしか生じない。
「主要スプライスドナー部位」とは、典型的にはウイルスベクターヌクレオチド配列の５’領域に位置する天然ウイルスＲＮＡパッケージング配列内にコードされ組み込まれた、ウイルスベクターゲノム内の最初の（優勢な）スプライスドナー部位を意味する。
一態様では、ヌクレオチド配列は、活性な主要スプライスドナー部位を含まず、すなわち、スプライシングは、当該ヌクレオチド配列中の主要スプライスドナー部位から生じず、主要スプライスドナー部位からのスプライシング活性は除去される。
主要スプライスドナー部位は、レンチウイルスゲノムの５’パッケージング領域に位置する。
ＨＩＶ－１ウイルスの場合、主要スプライスドナーコンセンサス配列は（ＤＮＡの場合）ＴＧ／ＧＴＲＡＧＴ（式中、Ａはアデノシンであり、Ｔはチミンであり、Ｇはグアニンであり、Ｃはシトシンであり、Ｒはプリンであり、「／」は切断部位を示す）である。
本発明の一態様では、スプライスドナー領域、すなわち変異前の主要スプライスドナー部位を含むベクターゲノムの領域は、以下の配列を有し得る。
ＧＧＧＧＣＧＧＣＧＡＣＴＧＧＴＧＡＧＴＡＣＧＣＣＡＡＡＡＡＴ（配列番号１）
本発明の一態様では、変異スプライスドナー領域は、以下の配列を含み得る。
ＧＧＧＧＣＧＧＣＧＡＣＴＧＣＡＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＡＡＡＴ（配列番号２－ＭＳＤ－２ＫＯ）
本発明の一態様では、変異スプライスドナー領域は、以下の配列を含み得る。
ＧＧＧＧＣＧＧＣＧＡＧＴＧＧＡＧＡＣＴＡＣＧＣＣＡＡＡＡＡＴ（配列番号１１－ＭＳＤ－２ＫＯｖ２）
本発明の一態様では、変異スプライスドナー領域は、以下の配列を含み得る。
ＧＧＧＧＡＡＧＧＣＡＡＣＡＧＡＴＡＡＡＴＡＴＧＣＣＴＴＡＡＡＡＴ（配列番号１２－ＭＳＤ－２ＫＯｍ５）
本発明の一態様では、改変前に、スプライスドナー領域は、以下の配列を含み得る。
ＧＧＣＧＡＣＴＧＧＴＧＡＧＴＡＣＧＣＣ（配列番号９）
この配列は、本明細書では「ステムループ２」領域（ＳＬ２）とも呼ばれる。この配列は、ベクターゲノムのスプライスドナー領域にステムループ構造を形成し得る。本発明の一態様では、この配列（ＳＬ２）は、本明細書に記載の本発明によるヌクレオチド配列から欠失されていてもよい。
したがって、本発明は、ＳＬ２を含まないヌクレオチド配列を包含する。本発明は、配列番号９による配列を含まないヌクレオチド配列を包含する。
本発明の一態様では、主要スプライスドナー部位は、以下のコンセンサス配列を有し得、ここで、Ｒはプリンであり、「／」は切断部位である。
ＴＧ／ＧＴＲＡＧＴ（配列番号３）
一態様では、Ｒはグアニン（Ｇ）であり得る。
本発明の一態様では、主要スプライスドナー及び潜在性スプライスドナー領域は、以下のコア配列を有していてもよく、「／」は、主要スプライスドナー及び潜在性スプライスドナー部位の切断部位である。
／ＧＴＧＡ／ＧＴＡ（配列番号：１３）。
本発明の一態様において、ＭＳＤ変異ベクターゲノムは、主要スプライスドナー及び潜在性スプライスドナーの「領域」（配列番号１３）に少なくとも２つの変異を有し得、第１及び第２の「ＧＴ」ヌクレオチドは、それぞれ主要スプライスドナー及び潜在性スプライスドナーのヌクレオチドの直後の３’である。
本発明の一態様では、主要スプライスドナーコンセンサス配列はＣＴＧＧＴ（配列番号４）である。主要スプライスドナー部位は、配列ＣＴＧＧＴを含み得る。
一態様では、ヌクレオチド配列は、スプライス部位の不活性化の前に、配列番号１、３、４、９、１０及び／又は１３のいずれかに記載の配列を含む。
一態様において、ヌクレオチド配列は、不活性化された主要スプライスドナー部位を含み、そうでなければ配列番号１のヌクレオチド１３及び１４に対応するヌクレオチド間に切断部位を有するであろう。
本明細書に記載の本発明によれば、ヌクレオチド配列はまた、不活性な潜在性スプライスドナー部位を含む。一態様では、ヌクレオチド配列は、主要スプライスドナー部位（の３’）に隣接する活性潜在性スプライスドナー部位を含まず、すなわち、隣接する潜在性スプライスドナー部位からスプライシングが起こらず、潜在性スプライスドナー部位からのスプライシングが除去される。
「潜在性スプライスドナー部位」という用語は、通常はスプライスドナー部位として機能しないか、又は隣接配列の状況（例えば、近くの「好ましい」スプライスドナーの存在）のためにスプライスドナー部位としてあまり効率的に利用されないが、隣接配列の変異によって（例えば、近くの「好ましい」スプライスドナーの変異）より効率的に機能するスプライスドナー部位になるように活性化され得る核酸配列を指す。
一態様では、潜在性スプライスドナー部位は、主要スプライスドナーの第１の潜在性スプライスドナー部位３’である。
一態様では、潜在性スプライスドナー部位は、主要スプライスドナー部位の３’側の主要スプライスドナー部位の６ヌクレオチド以内にある。好ましくは、潜在性スプライスドナー部位は、主要スプライスドナー切断部位の４又は５、好ましくは４ヌクレオチド以内にある。
本発明の一態様では、潜在性スプライスドナー部位は、コンセンサス配列ＴＧＡＧＴ（配列番号１０）を有する。
一態様において、ヌクレオチド配列は、不活性化された潜在性スプライスドナー部位を含み、そうでなければ配列番号１のヌクレオチド１７及び１８に対応するヌクレオチド間に切断部位を有するであろう。
本発明の一態様では、主要スプライスドナー部位及び／又は隣接する潜在性スプライスドナー部位は、「ＧＴ」モチーフを含有する。本発明の一態様では、主要スプライスドナー部位及び隣接する潜在性スプライスドナー部位の両方が、変異している「ＧＴ」モチーフを含有する。変異したＧＴモチーフは、主要スプライスドナー部位及び隣接する潜在性スプライスドナー部位の両方からのスプライス活性を不活性化し得る。そのような変異の例は、本明細書では「ＭＳＤ－２ＫＯ」と呼ばれる。
一態様では、スプライスドナー領域は、以下の配列を含み得る。
ＣＡＧＡＣＡ（配列番号５）
例えば、一態様では、変異スプライスドナー領域は以下の配列を含み得る。
ＧＧＣＧＡＣＴＧＣＡＧＡＣＡＡＣＧＣＣ（配列番号６）
不活性化変異の更なる例は、本明細書では「ＭＳＤ－２ＫＯｖ２」と呼ばれる。
一態様では、変異スプライスドナー領域は以下の配列を含み得る。
ＧＴＧＧＡＧＡＣＴ（配列番号７）
例えば、一態様では、変異スプライスドナー領域は以下の配列を含み得る。
ＧＧＣＧＡＧＴＧＧＡＧＡＣＴＡＣＧＣＣ（配列番号８）
例えば、一態様では、変異スプライスドナー領域は以下の配列を含み得る。
ＡＡＧＧＣＡＡＣＡＧＡＴＡＡＡＴＡＴＧＣＣＴＴ（配列番号１４）
一態様では、上記のステムループ２領域をスプライスドナー領域から欠失させて、主要スプライスドナー部位及び隣接する潜在性スプライスドナー部位の両方を不活性化することができる。そのような欠失は、本明細書では「ΔＳＬ２」と呼ばれる。
主要スプライスドナー部位及び隣接する潜在性スプライスドナー部位を不活性化するために、様々な異なるタイプの変異を核酸配列に導入することができる。
一態様では、変異は、スプライス領域におけるスプライシング活性を除去又は抑制する機能変異である。本明細書に記載のヌクレオチド配列は、配列番号１、３、４、９、１０及び／又は１３のいずれかのヌクレオチドのいずれかに変異又は欠失を含み得る。適切な変異は当業者に公知であり、本明細書に記載されている。
例えば、核酸配列に点変異を導入することができる。本明細書で使用される「点変異」という用語は、単一ヌクレオチドへの任意の変化を指す。点変異には、例えば、欠失、転移及び転換が含まれ、これらは、タンパク質コード配列内に存在する場合、ノンセンス変異、ミスセンス変異、又はサイレント変異として分類することができる。「ノンセンス」変異は終止コドンを生成する。「ミスセンス」変異は、異なるアミノ酸をコードするコドンを生成する。「無音」変異は、タンパク質の機能を変化させない同じアミノ酸又は異なるアミノ酸のいずれかをコードするコドンを生成する。潜在性スプライスドナー部位を含む核酸配列に１又は複数の点変異を導入することができる。例えば、潜在性スプライス部位を含む核酸配列は、その中に２つ以上の点変異を導入することによって変異させることができる。
少なくとも２つの点変異を、主要スプライスドナー及び潜在性スプライスドナー部位を含む核酸配列内のいくつかの位置に導入して、スプライスドナー領域からのスプライシングの減衰を達成することができる。一態様では、変異は、スプライスドナー切断部位の４つのヌクレオチド内にあり得、カノニカルスプライスドナーコンセンサス配列では、これはＡ１Ｇ２／Ｇ３Ｔ４であり、「／」は切断部位である。スプライスドナー切断部位が、特に、例えばｖＲＮＡパッケージング領域内の二次構造等の他の制約が同じ配列に関係するウイルスゲノムにおいて、このコンセンサスから逸脱し得ることは当技術分野で周知である。Ｇ３Ｔ４ジヌクレオチドは、一般に、カノニカルスプライスドナーコンセンサス配列内の最小可変配列であり、Ｇ３及び／又はＴ４への変異が最大の減衰効果を達成する可能性が最も高いことは周知である。例えば、ＨＩＶ－１ウイルスベクターゲノムの主要スプライスドナー部位について、これはＴ１Ｇ２／Ｇ３Ｔ４であり得、「／」は切断部位である。例えば、ＨＩＶ－１ウイルスベクターゲノムの潜在性スプライスドナー部位について、これはＧ１Ａ２／Ｇ３Ｔ４であり得、「／」は切断部位である。更に、（１又は複数の）点変異は、スプライスドナー部位に隣接して導入することができる。例えば、点変異は、スプライスドナー部位の上流又は下流に導入することができる。主要及び／又は潜在性スプライスドナー部位を含む核酸配列が、複数の点変異をそこに導入することによって変異される実施形態では、点変異は、潜在性スプライスドナー部位の上流及び／又は下流に導入することができる。
本明細書に記載されるように、及び実施例に示されるように、本発明によるレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列は、パッケージング配列のＳＬ４ループ内の潜在性スプライスドナー部位に変異が更に含まれていてもよい。一態様では、パッケージング配列のＳＬ４ループ内の当該潜在性スプライスドナー部位のＧＴジヌクレオチドがＧＣに変異される。
スプライス部位変異体の構築
本発明のスプライス部位変異体は、様々な技術を用いて構築することができる。例えば、変異は、天然配列の断片へのライゲーションを可能にする制限部位に隣接する変異配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成することによって、特定の遺伝子座に導入され得る。ライゲーション後、得られた再構築配列は、所望のヌクレオチド挿入、置換又は欠失を有する誘導体を含む。
ＤＮＡ配列の変更を可能にする他の公知の技術には、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ、Ｇｏｌｄｅｎ－ｇａｔｅクローニング及びＩｎ－ｆｕｓｉｏｎ等の組換えアプローチが含まれる。
あるいは、オリゴヌクレオチド指向部位特異的（又はセグメント特異的）変異誘発手順を用いて、必要とされる置換、欠失又は挿入に従って変更された配列を提供することができる。スプライス部位変異体の欠失又は切断誘導体はまた、所望の欠失に隣接する便利な制限エンドヌクレアーゼ部位を利用することによって構築することができる。
制限に続いて、オーバーハングが埋められ、ＤＮＡが再連結され得る。
上記の変更を行う例示的な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）によって開示されている。
スプライス部位変異体はまた、ＰＣＲ変異誘発、化学変異誘発、強制的ヌクレオチド誤組込み（例えばＬｉａｏ及びＷｉｓｅ，１９９０）による化学変異誘発（Ｄｒｉｎｋｗａｔｅｒ及びＫｌｉｎｅｄｉｎｓｔ，１９８６）、又はランダム変異オリゴヌクレオチド（Ｈｏｒｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８９）の使用による化学変異誘発の技術を利用して構築され得る。
本発明はまた、レンチウイルスベクターヌクレオチド配列を生成する方法であって、
（ｉ）本明細書に記載のレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列を提供する工程と、
（ｉｉ）当該ヌクレオチド配列中の本明細書に記載の主要スプライスドナー部位及び潜在性スプライスドナー部位を変異させる工程と、
を含む、方法を提供する。
ベクター／発現カセット
ベクトルは、ある環境から別の環境へのエンティティの転送を可能にする、又は容易にするツールである。本発明によれば、及び例として、組換え核酸技術で使用されるいくつかのベクターは、核酸のセグメント（例えば異種ＤＮＡセグメント、例えば異種ｃＤＮＡセグメント）等の実体が標的細胞に移入され、標的細胞によって発現されることを可能にする。ベクターは、ウイルスベクター成分をコードするヌクレオチド配列及び標的細胞内でのその発現を維持するために、ウイルスベクター成分をコードするヌクレオチド配列のインテグレーションを促進し得る。
ベクターは、発現カセット（発現構築物とも呼ばれる）であり得るか、又はそれを含み得る。本明細書に記載の発現カセットは、転写され得る核酸含有配列の領域を含む。したがって、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｒＲＮＡをコードする配列は、この定義内に含まれる。
ベクターは、１又は複数の選択マーカー遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子）及び／又は（１又は複数の）追跡可能なマーカー遺伝子（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子）を含み得る。ベクターは、例えば、標的細胞に感染及び／又は形質導入するために使用され得る。ベクターは、ベクターが問題の宿主細胞において複製することを可能にするヌクレオチド配列、例えば条件付きで複製する腫瘍細胞崩壊性ベクターを更に含み得る。
「カセット」という用語は、「コンジュゲート」、「構築物」及び「ハイブリッド」等の用語と同義であり、プロモータに直接又は間接的に結合したポリヌクレオチド配列を含む。本発明で使用するための発現カセットは、ウイルスベクター成分をコードするヌクレオチド配列の発現のためのプロモータを含み、ウイルスベクター成分をコードするヌクレオチド配列の調節因子が含まれていてもよい。好ましくは、カセットは、プロモータに作動可能に連結された少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む。
発現カセット、例えばプラスミド、コスミド、ウイルス又はファージベクターの選択は、導入される宿主細胞に依存することが多い。発現カセットは、ＤＮＡプラスミド（スーパーコイル状、ニック入り又は線状化）、ミニサークルＤＮＡ（線状又はスーパーコイル状）、制限酵素消化及び精製によるプラスミド骨格の除去によって目的の領域のみを含有するプラスミドＤＮＡ、酵素ＤＮＡ増幅プラットフォーム、例えば、使用される最終ＤＮＡが閉環形態であるか、又は開放切断端を有するように調製されている（例えば、制限酵素消化）ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ ＤＮＡ（ｄｂＤＮＡ（商標））を使用して生成されたＤＮＡであり得る。
レンチウイルスベクター産生システム及び細胞
レンチウイルスベクター産生システムは、レンチウイルスベクターの産生に必要な成分をコードするヌクレオチド配列のセットを含む。したがって、ベクター作製系は、レンチウイルスベクター粒子を作製するために必要なウイルスベクター成分をコードするヌクレオチド配列のセットを含む。
「ウイルスベクター産生システム」又は「ベクター産生システム」又は「産生システム」は、レンチウイルスベクター産生に必要な成分を含む系として理解されるべきである。
一実施形態において、ウイルスベクター産生システムは、Ｇａｇ及びＧａｇ／Ｐｏｌタンパク質、並びにＥｎｖタンパク質及びベクターゲノム配列をコードするヌクレオチド配列を含む。産生システムは、場合により、Ｒｅｖタンパク質又はその機能的置換物をコードするヌクレオチド配列を含み得る。
一実施形態では、ウイルスベクター産生システムは、モジュール式核酸構築物（モジュール式構築物）を含む。モジュール構築物は、レンチウイルスベクターの産生に使用される２つ以上の核酸を含むＤＮＡ発現構築物である。モジュール構築物は、レンチウイルスベクターの産生に使用される２つ以上の核酸を含むＤＮＡプラスミドであり得る。プラスミドは細菌プラスミドであり得る。核酸は、例えば、ｇａｇ－ｐｏｌ、ｒｅｖ、ｅｎｖ、ベクターゲノムをコードし得る。更に、パッケージング細胞株及びプロデューサ細胞株の作製のために設計されたモジュール構築物は、転写調節タンパク質（例えば、ＴｅｔＲ、ＣｙｍＲ）及び／又は翻訳抑制タンパク質（例えば、ＴＲＡＰ）並びに選択マーカー（例えば、Ｚｅｏｃｉｎ（商標）、ハイグロマイシン、ブラストサイジン、ピューロマイシン、ネオマイシン耐性遺伝子）をコードすることを更に必要とし得る。本発明での使用に適したモジュール式構築物は、欧州特許第３５０２２６０号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明に従って使用するためのモジュール式構築物は、１つの構築物に２つ以上のレトロウイルス成分をコードする核酸配列を含むため、これらのモジュール式構築物の安全性プロファイルが考慮されており、更なる安全性の特徴が構築物に直接操作されている。これらの特徴には、レトロウイルスベクター成分の複数のオープンリーディングフレームのための絶縁体の使用、並びに／あるいはモジュール式構築物におけるレトロウイルス遺伝子の特異的な配向及び配置が含まれる。これらの特徴を使用することにより、複製可能なウイルス粒子を生成するための直接的なリードスルーが防止されると考えられる。
ウイルスベクター成分をコードする核酸配列は、モジュール構築物において逆及び／又は交互の転写配向であり得る。したがって、ウイルスベクター成分をコードする核酸配列は、同じ５’から３’方向に提示されず、その結果、ウイルスベクター成分は、同じｍＲＮＡ分子から産生することができない。逆向きとは、異なるベクター成分に対する少なくとも２つのコード配列が、「ｈｅａｄ－ｔｏ－ｈｅａｄ」及び「ｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ」転写向きで提示されることを意味し得る。これは、モジュール構築物の一方の鎖上の１つのベクター成分、例えばｅｎｖに対するコード配列及び反対側の鎖上の別のベクター成分、例えばｒｅｖに対するコード配列を提供することによって達成され得る。好ましくは、３つ以上のベクター成分のコード配列がモジュール式構築物中に存在する場合、コード配列の少なくとも２つは逆転写配向で存在する。したがって、モジュール式構築物中に３つ以上のベクター成分のコード配列が存在する場合、各成分は、それが隣接する他のベクター成分の全ての（１又は複数の）隣接コード配列に対して反対の５’から３’方向に存在するように配向され得、すなわち、各コード配列に対して交互の５’から３’（又は転写）方向が使用され得る。
本発明に従って使用するためのモジュール式構築物は、以下のベクター成分：ｇａｇ－ｐｏｌ、ｒｅｖ、ｅｎｖ、ベクターゲノムのうちの２つ以上をコードする核酸配列を含み得る。モジュール構築物は、ベクター成分の任意の組合わせをコードする核酸配列を含み得る。一実施形態では、モジュール構築物は、以下のもの、
ｉ）レトロウイルスベクターのＲＮＡゲノム及びｒｅｖ、又はその機能的置換物；
ｉｉ）レトロウイルスベクターのＲＮＡゲノム及びｇａｇ－ｐｏｌ；
ｉｉｉ）レトロウイルスベクター及びｅｎｖのＲＮＡゲノム；
ｉｖ）ｇａｇ－ｐｏｌ及びｒｅｖ、又はその機能的代用物；
ｖ）ｇａｇ－ｐｏｌ及びｅｎｖ；
ｖｉ）ｅｎｖ及びｒｅｖ、又はその機能的置換体；
ｖｉｉ）レトロウイルスベクターのＲＮＡゲノム、ｒｅｖ又はその機能的置換物、及びｇａｇ－ｐｏｌ；
ｖｉｉｉ）レトロウイルスベクターのＲＮＡゲノム、ｒｅｖ又はその機能的置換物、及びｅｎｖ；
ｉｘ）レトロウイルスベクターのＲＮＡゲノム、ｇａｇ－ｐｏｌ及びｅｎｖ；あるいは
ｘ）ｇａｇ－ｐｏｌ、ｒｅｖ、又はそれらの機能的代用物、及びｅｎｖ、
をコードする核酸配列を含み得、
当該核酸配列は、逆向き及び／又は交互向きである。
一実施形態では、レトロウイルスベクターを産生するための細胞は、上記ｉ）～ｘ）の組合わせのいずれか１つをコードする核酸配列を含み得、核酸配列は、同じ遺伝子座に位置し、逆向き及び／又は交互の向きにある。同じ遺伝子座は、細胞内の単一の染色体外遺伝子座、例えば単一のプラスミド、又は細胞のゲノム内の単一の遺伝子座（すなわち、単一の挿入部位）を指し得る。細胞は、レトロウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターを産生するための安定細胞又は一過性細胞であり得る。一態様では、細胞は、ｔａｔを含まない。
ＤＮＡ発現構築物は、ＤＮＡプラスミド（スーパーコイル状、ニック入り又は線状化）、ミニサークルＤＮＡ（線状又はスーパーコイル状）、制限酵素消化及び精製によるプラスミド骨格の除去によって目的の領域のみを含有するプラスミドＤＮＡ、酵素ＤＮＡ増幅プラットフォーム、例えば、使用される最終ＤＮＡが閉環形態であるか、又は開放切断端を有するように調製されている（例えば、制限酵素消化）ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ ＤＮＡ（ｄｂＤＮＡ（商標））を使用して生成されたＤＮＡであり得る。
一実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶ又はビスナレンチウイルスに由来する。
「ウイルスベクター産生細胞」、「ベクター産生細胞」、又は「産生細胞」は、レンチウイルスベクター又はレンチウイルスベクター粒子を産生することができる細胞として理解されるべきである。レンチウイルスベクター産生細胞は、「プロデューサ細胞」又は「パッケージング細胞」であり得る。ウイルスベクターシステムの１又は複数のＤＮＡ構築物は、ウイルスベクター産生細胞内に安定に組み込まれるか、又はエピソーム的に維持され得るかのいずれかである。あるいは、ウイルスベクター系の全てのＤＮＡ成分をウイルスベクター産生細胞に一過性にトランスフェクトしてもよい。更に別の代替法では、成分のいくつかを安定に発現する産生細胞を、ベクター産生に必要な残りの成分で一過性にトランスフェクトすることができる。
本明細書で使用される場合、「パッケージング細胞」という用語は、レンチウイルスベクター粒子の産生に必要な要素を含むが、ベクターゲノムを欠く細胞を指す。そのようなパッケージング細胞には、ウイルス構造タンパク質（例えば、ｇａｇ、ｇａｇ／ｐｏｌ及びｅｎｖ）を発現することができる１又は複数の発現カセットが含まれていてもよい。
プロデューサ細胞／パッケージング細胞は、任意の適切な細胞型であり得る。プロデューサ細胞は一般に哺乳動物細胞であるが、例えば昆虫細胞であり得る。
本明細書で使用される場合、「プロデューサ／産生細胞」又は「ベクター産生／産生細胞」という用語は、レンチウイルスベクター粒子の産生に必要な全ての要素を含む細胞を指す。プロデューサ細胞は、安定なプロデューサ細胞株であるか、又は一過性に誘導されるか、又はレトロウイルスゲノムが一過性に発現される安定なパッケージング細胞であり得る。
本発明の方法において、ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである場合、ベクター成分は、ｇａｇ、ｅｎｖ、ｒｅｖ及び／又はレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムを含み得る。ベクター成分をコードするヌクレオチド配列は、同時に又は任意の順序で連続的に細胞に導入され得る。
ベクター産生細胞は、組織培養細胞株等のインビトロで培養された細胞であり得る。本発明の方法及び使用のいくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターを産生するための適切な産生細胞又は細胞は、適切な条件下で培養した場合にウイルスベクター又はウイルスベクター粒子を産生することができる細胞である。したがって、細胞は、典型的には、ｇａｇ、ｅｎｖ、ｒｅｖ及びレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムを含み得るベクター成分をコードするヌクレオチド配列を含む。適切な細胞株には、マウス線維芽細胞由来細胞株又はヒト細胞株等の哺乳動物細胞が含まれるが、これらに限定されない。それらは、一般に、ヒト細胞、例えばＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３、ＣＡＰ、ＣＡＰ－Ｔ又はＣＨＯ細胞を含む哺乳動物であるが、例えばＳＦ９細胞等の昆虫細胞であり得る。好ましくは、ベクター産生細胞はヒト細胞株に由来する。したがって、そのような適切な産生細胞は、本発明の方法又は使用のいずれかにおいて使用され得る。
ヌクレオチド配列を細胞に導入する方法は当技術分野で周知であり、以前に記載されている。したがって、分子生物学及び細胞生物学における従来の技術を使用した、レンチウイルスベクターのｇａｇ、ｅｎｖ、ｒｅｖ及びＲＮＡゲノムを含むベクター成分をコードするヌクレオチド配列の細胞への導入は、当業者の能力の範囲内である。
安定な産生細胞は、パッケージング又はプロデューサ細胞であり得る。パッケージング細胞からプロデューサ細胞を作製するために、ベクターゲノムＤＮＡ構築物を安定に、又は一過性に導入することができる。パッケージング／プロデューサ細胞は、国際公開第２００４／０２２７６１号に記載されているように、ベクターの成分の１つ、すなわちゲノム、ｇａｇ－ｐｏｌ成分及びエンベロープを発現するレトロウイルスベクターを適切な細胞株に形質導入することによって作製することができる。
あるいは、ヌクレオチド配列を細胞にトランスフェクトすることができ、次いで産生細胞ゲノムへの組込みが稀にかつランダムに起こる。トランスフェクション方法は、当技術分野で周知の方法を使用して実施することができる。例えば、安定なトランスフェクションプロセスは、コンカテマー化を助けるように操作された構築物を使用し得る。別の例では、トランスフェクションプロセスは、リン酸カルシウム又はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００ＣＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ若しくはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）等の市販の製剤を使用して実施することができる。あるいは、ヌクレオチド配列は、エレクトロポレーションを介して産生細胞に導入され得る。当業者は、ヌクレオチド配列の産生細胞への組込みを促進する方法を承知しているであろう。例えば、核酸構築物を線形化することは、それが天然に環状である場合に役立ち得る。よりランダムでない組込み方法論は、内因性ゲノム内の選択された部位への組込みを誘導するために、哺乳動物宿主細胞の内因性染色体と相同性の共有領域を含む核酸構築物を含み得る。更に、組換え部位が構築物上に存在する場合、これらを標的化組換えに使用することができる。例えば、核酸構築物は、Ｃｒｅリコンビナーゼと組み合わせた場合（すなわち、Ｐ１バクテリオファージ由来のＣｒｅ／ｌｏｘ系を使用する）に標的化された組み込みを可能にするｌｏｘＰ部位を含み得る。代替において、又は、加えて、組換え部位は、ラムダインテグラーゼの存在下での部位特異的インテグレーションを可能にするａｔｔ部位（例えばλファージから）である。これにより、レンチウイルス遺伝子を、高い及び／又は安定な発現を可能にする宿主細胞ゲノム内の遺伝子座に標的化することが可能になる。
標的化インテグレーションの他の方法は、当技術分野で周知である。例えば、ゲノムＤＮＡの標的化切断を誘導する方法を使用して、選択された染色体遺伝子座での標的化組換えを促進することができる。これらの方法は、二本鎖切断（ＤＳＢ）、例えば、内因性ゲノムにおけるニックを誘導して、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）等の生理学的機構による切断の修復を誘導するための方法又はシステムの使用を含むことが多い。切断は、操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）等の特異的ヌクレアーゼの使用、特異的切断をガイドするための操作されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒ ＲＮＡ（「単一ガイドＲＮＡ」）を有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの使用、及び／又はアルゴノート系に基づくヌクレアーゼ（例えば、Ｔ．サーモフィラス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）から）の使用によって起こり得る。
パッケージング／プロデューサ細胞株は、レンチウイルス形質導入のみ若しくは核酸トランスフェクションのみ、又は両方の組合わせの方法を使用してヌクレオチド配列のインテグレーションによって作製することができる。
産生細胞からレトロウイルスベクターを作製するための方法、特にレトロウイルスベクターの処理は、国際公開第２００９／１５３５６３号に記載されている。
一実施形態では、産生細胞は、ＲＮＡ結合タンパク質（例えばトリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質、ＴＲＡＰ）及び／又はＴｅｔ抑制因子（ＴｅｔＲ）タンパク質若しくは代替的な調節タンパク質（例えば、ＣｙｍＲ）を含み得る。
産生細胞からのレンチウイルスベクターの産生は、トランスフェクション法によるもの、誘導工程（例えばドキシサイクリン誘導）を含み得る安定な細胞株からの産生によるもの、又は両方の組合わせによるものであり得る。トランスフェクション方法は、当技術分野で周知の方法を使用して実施することができ、例は以前に記載されている。
パッケージング細胞株若しくはプロデューサ細胞株、又はレンチウイルスベクターをコードする成分で一過性にトランスフェクトされた産生細胞を培養して、細胞数及びウイルス数並びに／あるいはウイルス力価を増加させる。細胞の培養は、本発明による目的のウイルスベクターを代謝及び／又は成長及び／又は分裂及び／又は産生することを可能にするために行われる。これは、当業者に周知の方法によって達成することができ、例えば適切な培養培地中で細胞に栄養素を提供することを含むが、これに限定されない。方法は、表面に接着する成長、懸濁液中での成長、又はそれらの組合わせを含み得る。培養は、例えば、バッチ、フェドバッチ、連続システム等を使用して、組織培養フラスコ、組織培養マルチウェルプレート、皿、ローラーボトル、ウェーブバッグ又はバイオリアクタで行うことができる。細胞培養によってウイルスベクターの大規模生産を達成するために、当技術分野では、懸濁状態で増殖することができる細胞を有することが好ましい。細胞を培養するための好適な条件は公知である（例えば、Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｋｒｕｓｅ ａｎｄ Ｐａｔｅｒｓｏｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ（１９７３），ａｎｄ Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌｓ：Ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｂａｓｉｃ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｆｏｕｒｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ Ｉｎｃ．，２０００，ＩＳＢＮ ０－４７１－３４８８９－９を参照されたい）。
好ましくは、細胞は、最初に組織培養フラスコ又はバイオリアクタで「バルクアップ」され、続いて多層培養容器又は大型バイオリアクタ（５０Ｌ超）で増殖させて、本発明で使用するためのベクター産生細胞を生成する。
好ましくは、細胞は、懸濁モードで増殖されて、本発明で使用するためのベクター産生細胞を生成する。
レンチウイルスベクター
レンチウイルスは、レトロウイルスのより大きな群の一部である。レンチウイルスの詳細なリストは、Ｃｏｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ（１９９７）’’Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ’’Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ Ｅｄｓ：ＪＭ Ｃｏｆｆｉｎ，ＳＭ Ｈｕｇｈｅｓ，ＨＥ Ｖａｒｍｕｓ ｐｐ ７５８－７６３）に見出すことができる。手短に言えば、レンチウイルスを霊長類群及び非霊長類群に分けることができる。霊長類レンチウイルスの例には、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒト自己免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因物質、及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が含まれるが、これらに限定されない。非霊長類レンチウイルス群には、プロトタイプ型「スローウイルス」ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）、並びに関連するヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、マエディビスナウイルス（ＭＶＶ）及びウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）が含まれる。一実施形態では、レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶ又はビスナレンチウイルスに由来する。
レンチウイルス科は、レンチウイルスが分裂細胞及び非分裂細胞の両方に感染する能力を有するという点でレトロウイルスとは異なる（Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ １１（８）：３０５３－３０５８ ａｎｄ Ｌｅｗｉｓ ａｎｄ Ｅｍｅｒｍａｎ（１９９４）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６８（１）：５１０－５１６）。対照的に、ＭＬＶ等の他のレトロウイルスは、例えば筋肉、脳、肺及び肝臓組織を構成する細胞等の非分裂細胞又はゆっくりと分裂する細胞に感染することができない。
レンチウイルスベクターは、本明細書で使用される場合、レンチウイルスから誘導可能な少なくとも１つの成分部分を含むベクターである。好ましくは、その成分部分は、ベクターが標的細胞に感染又は形質導入し、ＮＯＩを発現する生物学的機構に関与する。
レンチウイルスベクターは、インビトロで適合性の標的細胞においてＮＯＩを複製するために使用され得る。したがって、本明細書には、本発明のベクターを適合する標的細胞にインビトロで導入し、ＮＯＩの発現をもたらす条件下で標的細胞を増殖させることによってインビトロでタンパク質を作製する方法が記載される。タンパク質及びＮＯＩは、当技術分野で周知の方法によって標的細胞から回収され得る。適切な標的細胞には、哺乳動物細胞株及び他の真核細胞株が含まれる。
いくつかの態様では、ベクターは、プロモータとエンハンサとの間の相互作用を遮断し、隣接遺伝子からのリードスルーを減少させるバリアとして作用する「インシュレーター」－遺伝子配列を有し得る。
一実施形態では、隣接遺伝子からのプロモータ干渉及びリードスルーを防ぐために、絶縁体がレンチウイルス核酸配列の１又は複数の間に存在する。１又は複数のレンチウイルス核酸配列の間のベクター中に絶縁体が存在する場合、これらの絶縁された遺伝子のそれぞれは、個々の発現単位として配置され得る。
レトロウイルスゲノム及びレンチウイルスゲノムの基本構造は、ゲノムをパッケージングすることを可能にするパッケージングシグナル、プライマー結合部位、標的細胞ゲノムへの組込みを可能にする組込み部位、並びにパッケージング成分をコードするｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子及びｅｎｖ遺伝子（これらはウイルス粒子の集合に必要なポリペプチドである）の間又はその中に位置する５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲ等の多くの共通の特徴を共有する。レンチウイルスは、ＨＩＶ中のｒｅｖ遺伝子及びＲＲＥ配列等の更なる特徴を有し、核から、感染した標的細胞の細胞質への組み込みプロウイルスのＲＮＡ転写物の効率的な輸送を可能にする。
プロウイルスでは、これらの遺伝子は、長い末端反復（ＬＴＲ）と呼ばれる領域に両端で挟まれている。ＬＴＲは、プロウイルスの組込み及び転写を担う。ＬＴＲはエンハンサプロモータ配列としても機能し、ウイルス遺伝子の発現を制御することができる。
ＬＴＲ自体は、Ｕ３、Ｒ及びＵ５と呼ばれる３つの要素に分けることができる同一の配列である。Ｕ３は、ＲＮＡの３’末端に固有の配列に由来する。ＲはＲＮＡの両端で繰り返される配列に由来し、Ｕ５はＲＮＡの５’末端に固有の配列に由来する。３つの要素のサイズは、異なるレトロウイルス間でかなり異なり得る。
本明細書に記載の典型的なレンチウイルスベクターでは、複製に不可欠な１又は複数のタンパク質コード領域の少なくとも一部をウイルスから除去することができ、例えば、ｇａｇ／ｐｏｌ及びｅｎｖは存在しなくてもよく、又は機能しなくてもよい。これにより、ウイルスベクターの複製が欠損する。
レンチウイルスベクターは、霊長類レンチウイルス（例えばＨＩＶ－１）又は非霊長類レンチウイルス（例えばＥＩＡＶ）のいずれかに由来し得る。
一般的に言えば、典型的なレトロウイルスベクター産生システムは、必須のウイルスパッケージング機能からのウイルスゲノムの分離を含む。これらのウイルスベクター成分は、通常、別個のＤＮＡ発現カセット（あるいは、プラスミド、発現プラスミド、ＤＮＡ構築物又は発現構築物として知られる）上で産生細胞に提供される。
ベクターゲノムは、ＮＯＩを含む。ベクターゲノムは、典型的には、ＮＯＩを有する内部発現カセットであるパッケージングシグナル（ψ）、（場合により）転写後要素（ＰＲＥ）、典型的には中央ポリプリントラクト（ｃｐｐｔ）、３’－ｐｐｕ及び自己不活性化（ＳＩＮ）ＬＴＲを必要とする。Ｒ－Ｕ５領域は、ベクターゲノムＲＮＡ及びＮＯＩ ｍＲＮＡの両方の正しいポリアデニル化、並びに逆転写のプロセスに必要である。ベクターゲノムは、国際公開第２００３／０６４６６５号に記載されているように、ｒｅｖの非存在下でのベクター産生を可能にするオープンリーディングフレームが含まれていてもよい。
パッケージング機能には、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子及びｅｎｖ遺伝子が含まれる。これらは、産生細胞によるベクター粒子の製造に必要である。これらの機能をゲノムに対してトランスで提供することにより、複製欠損ウイルスベクターの産生が容易になる。
ガンマレトロウイルスベクターの生産系は、典型的には、ゲノム、ｇａｇ／ｐｏｌ及びｅｎｖ発現構築物を必要とする３成分系である。ＨＩＶ－１ベースのレンチウイルスベクターの製造システムは、更に、アクセサリー遺伝子ｒｅｖが提供され、ベクターゲノムがｒｅｖ応答配列（ＲＲＥ）を含むことを必要とし得る。ＥＩＡＶベースのレンチウイルスベクターは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）がゲノム内に存在する場合、ｒｅｖがトランスで提供されることを必要としない（国際公開第２００３／０６４６６５号を参照されたい）。
通常、ベクターゲノムカセット内にコードされる「外部」プロモータ（ベクターゲノムカセットを駆動する）及び「内部」プロモータ（ＮＯＩカセットを駆動する）の両方は、他のベクター系成分を駆動するものと同様に、強力な真核生物又はウイルスプロモータである。そのようなプロモータの例としては、ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ、ＴＫ、ＳＶ４０及びユビキチンプロモータが挙げられる。ＤＮＡライブラリーによって生成されるもの等の強力な「合成」プロモータ（例えばＪｅＴプロモータ）もまた、転写を駆動するために使用され得る。あるいは、組織特異的プロモータ、例えば、ロドプシン（Ｒｈｏ）、ロドプシンキナーゼ（ＲｈｏＫ）、コーンロッドホメオボックス含有遺伝子（ＣＲＸ）、神経網膜特異的ロイシンジッパータンパク質（ＮＲＬ）、卵黄様黄斑変性症２（ＶＭＤ２）、チロシンヒドロキシラーゼ、ニューロン特異的ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモータ、星状膠原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモータ、ヒトα１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモータ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）、肝臓脂肪酸結合タンパク質プロモータ、Ｆｌｔ－１プロモータ、ＩＮＦ－βプロモータ、Ｍｂプロモータ、ＳＰ－Ｂプロモータ、ＳＹＮ１プロモータ、ＷＡＳＰプロモータ、ＳＶ４０／ｈＡｌｂプロモータ、ＳＶ４０／ＣＤ４３、ＳＶ４０／ＣＤ４５、ＮＳＥ／ＲＵ５’プロモータ、ＩＣＡＭ－２プロモータ、ＧＰＩＩｂプロモータ、ＧＦＡＰプロモータ、フィブロネクチンプロモータ、エンドグリンプロモータ、エラスターゼ－１プロモータ、デスミンプロモータ、ＣＤ６８プロモータ、ＣＤ１４プロモータ及びＢ２９プロモータを使用して転写を駆動することができる。
レトロウイルスベクターの産生は、産生細胞とこれらのＤＮＡ成分との一過性コトランスフェクション、又は全ての成分が産生細胞ゲノム内に安定に組み込まれている安定な産生細胞株の使用（例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ ＨＪ、Ｆｏｎｇ－Ｗｏｎｇ Ｌ、Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ Ｉ、Ｃｈｉｐｃｈａｓｅ Ｄ、Ｋｅｌｌｅｈｅｒ Ｍ、Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ Ｌ、Ｔｈｏｒｅｅ Ｖ、ＭｃＣａｒｔｈｙ Ｊ、Ｒａｌｐｈ ＧＳ、Ｍｉｔｒｏｐｈａｎｏｕｓ ＫＡ及びＲａｄｃｌｉｆｆｅ ＰＡ。（２０１１）。Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ。３月；２２（３）：３５７－６９）を含む。別のアプローチは、安定なパッケージング細胞（パッケージング成分が安定に組み込まれている）を使用し、次いで必要に応じてベクターゲノムプラスミドに一過性にトランスフェクトすることである（例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｈ．Ｊ．，Ｍ．Ａ．Ｌｅｒｏｕｘ－Ｃａｒｌｕｃｃｉ，Ｃ．Ｊ．Ｓｉｏｎ，Ｋ．Ａ．Ｍｉｔｒｏｐｈａｎｏｕｓ及びＰ．Ａ．Ｒａｄｃｌｉｆｆｅ（２００９）。Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ。６月；１６（６）：８０５－１４）。完全ではない代替的なパッケージング細胞株を作製し（ただ１つ又は２つのパッケージング成分が細胞株に安定に組み込まれる）、ベクターを作製するために、欠損成分を一過性にトランスフェクトすることも可能である。産生細胞はまた、転写調節因子のｔｅｔ抑制因子（ＴｅｔＲ）タンパク質群のメンバ（例えば、Ｔ－Ｒｅｘ、Ｔｅｔ－Ｏｎ、及びＴｅｔ－Ｏｆｆ）、転写調節因子のクメート誘導性スイッチ系群のメンバ（例えば、クマート抑制因子（ＣｙｍＲ）タンパク質）、又はＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＴＲＡＰ－トリプトファン活性化ＲＮＡ結合タンパク質）等の調節タンパク質を発現し得る。
本発明の一実施形態では、ウイルスベクターはＥＩＡＶに由来する。ＥＩＡＶは、レンチウイルスの最も単純なゲノム構造を有し、本発明での使用に特に好ましい。ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子及びｅｎｖ遺伝子に加えて、ＥＩＡＶは３つの他の遺伝子、ｔａｔ、ｒｅｖ及びＳ２をコードする。ＴａｔはウイルスＬＴＲの転写活性化因子として作用し（Ｄｅｒｓｅ及びＮｅｗｂｏｌｄ（１９９３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９４（２）：５３０－５３６ ａｎｄ Ｍａｕｒｙ ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００（２）：６３２－６４２）、ｒｅｖはｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）を介してウイルス遺伝子の発現を調節及び調整する（Ｍａｒｔａｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６８（５）：３１０２－３１１１）。これらの２つのタンパク質の作用機序は、霊長類ウイルスにおける類似の機序と広く類似していると考えられている（Ｍａｒｔａｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６８（５）：３１０２－３１１１）。Ｓ２の機能は未知である。更に、膜貫通タンパク質の開始時にｅｎｖコード配列にスプライシングされたｔａｔの第１のエクソンによってコードされるＥＩＡＶタンパク質、Ｔｔｍが同定されている。本発明の代替実施形態では、ウイルスベクターはＨＩＶに由来する。ＨＩＶは、Ｓ２をコードしないが、ＥＩＡＶとは異なり、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ及びｎｅｆをコードする点でＥＩＡＶとは異なる。
「組換えレトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクター（ＲＲＶ）」という用語は、パッケージング成分の存在下で、標的細胞を形質導入することができるウイルス粒子へのＲＮＡゲノムのパッケージングを可能にするのに十分なレトロウイルス遺伝情報を有するベクターを指す。標的細胞の形質導入は、逆転写及び標的細胞ゲノムへの組込みを含み得る。ＲＲＶは、ベクターによって標的細胞に送達される非ウイルスコード配列を担持する。ＲＲＶは、独立した複製ができず、標的細胞内に感染性レトロウイルス粒子を産生することができない。通常、ＲＲＶは、機能的ｇａｇ／ｐｏｌ及び／又はｅｎｖ遺伝子、並びに／あるいは複製に必須の他の遺伝子を欠く。
好ましくは、本発明のＲＲＶベクターは、最小のウイルスゲノムを有する。
本明細書で使用される場合、「最小ウイルスゲノム」という用語は、標的細胞にＮＯＩを感染させ、形質導入し、送達するのに必要な機能を提供するのに必須の要素を保持しながら、非必須要素を除去するようにウイルスベクターが操作されていることを意味する。この戦略の更なる詳細は、国際公開第１９９８／１７８１５号及び国際公開第９９／３２６４６号に見出すことができる。最小のＥＩＡＶベクターは、ｔａｔ、ｒｅｖ及びＳ２遺伝子を欠き、これらの遺伝子は、産生システムにおいてトランスで提供されない。最小ＨＩＶベクターは、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｔａｔ及びｎｅｆを欠く。
産生細胞内でベクターゲノムを産生するために使用される発現プラスミドは、産生細胞／パッケージング細胞におけるゲノムの転写を指示するために、レトロウイルスゲノムに作動可能に連結された転写調節制御配列を含み得る。全ての第３世代レンチウイルスベクターは、５’Ｕ３エンハンサ－プロモータ領域において欠失されており、ベクターゲノムＲＮＡの転写は、後述するように、別のウイルスプロモータ、例えばＣＭＶプロモータ等の異種プロモータによって駆動される。この特徴は、ｔａｔとは無関係にベクター産生を可能にする。一部のレンチウイルスベクターゲノムは、効率的なウイルス産生のために追加の配列を必要とする。例えば、特にＨＩＶの場合、ＲＲＥ配列が含まれ得る。しかし、（別個の）ＧａｇＰｏｌカセットに対するＲＲＥの必要性（及びトランスで提供されるｒｅｖへの依存性）は、ＧａｇＰｏｌ ＯＲＦのコドン最適化によって低減又は排除され得る。この戦略の更なる詳細は、国際公開第２００１／７９５１８号に見出すことができる。
ｒｅｖ／ＲＲＥ系と同じ機能を果たす別の配列も知られている。例えば、ｒｅｖ／ＲＲＥ系の機能的類似体は、マソン・ファイザー・サルウイルスに見出される。これは構成的輸送要素（ＣＴＥ）として知られており、感染細胞中の因子と相互作用すると考えられるゲノム中のＲＲＥ型配列を含む。細胞因子は、ｒｅｖ類似体と考えることができる。したがって、ＣＴＥは、ｒｅｖ／ＲＲＥシステムの代替として使用することができる。公知であるか又は利用可能になるＲｅｖタンパク質の任意の他の機能的等価物が本発明に関連し得る。例えば、ＨＴＬＶ－ＩのＲｅｘタンパク質がＨＩＶ－１のＲｅｖタンパク質を機能的に置換し得ることも知られている。Ｒｅｖ及びＲＲＥは、本発明の方法で使用するためのベクター中に存在しなくてもよく、又は非機能的であってもよく、代替的なｒｅｖ及びＲＲＥ、又は機能的に等価なシステムが存在してもよい。
本明細書で使用される場合、「機能的置換物」という用語は、別のタンパク質又は配列と同じ機能を果たす代替配列を有するタンパク質又は配列を意味する。「機能的代替物」という用語は、本明細書では同じ意味で「機能的等価物」及び「機能的類似物」と互換的に使用される。
ＳＩＮベクター
本明細書に記載のレンチウイルスベクターは、ウイルスエンハンサ及びプロモータ配列が欠失した自己不活性化（ＳＩＮ）配置で使用され得る。ＳＩＮベクターを作製し、非ＳＩＮベクターの有効性と同様の有効性で、インビボ、エクスビボ又はインビトロで非分裂標的細胞に形質導入することができる。ＳＩＮプロウイルスにおける長い末端反復配列（ＬＴＲ）の転写不活性化は、ｖＲＮＡの動員を防止すべきであり、複製能ウイルスの形成の可能性を更に低下させる特徴である。これはまた、いずれかのＬＴＲのシス作用効果を排除することによって、内部プロモータからの遺伝子の調節された発現を可能にするはずである。
例として、自己不活性化レトロウイルスベクター系は、３’ＬＴＲのＵ３領域内の転写エンハンサ又はエンハンサ及びプロモータを欠失させることによって構築されている。一連のベクター逆転写及び組込みの後、これらの変化は、転写的に不活性なプロウイルスを産生する５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲの両方にコピーされる。しかし、そのようなベクター中のＬＴＲの内部の任意の（１又は複数の）プロモータは依然として転写活性である。この戦略は、内部に配置された遺伝子からの転写に対するウイルスＬＴＲのエンハンサ及びプロモータの影響を排除するために使用されている。そのような効果には、転写の増加又は転写の抑制が含まれる。この戦略はまた、３’ＬＴＲからゲノムＤＮＡへの下流転写を排除するために使用され得る。これは、内因性癌遺伝子の偶発的活性化を防ぐことが重要であるヒト遺伝子治療において特に懸念される。Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）ＰＮＡＳ ８３：３１９４－９８；Ｍａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ７２：８８５－７；Ｎａｖｉａｕｘ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５７０１－５；Ｉｗａｋｕｍａ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｖｉｒｏｌ．２６１：１２０－３２；Ｄｅｇｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：１７９－９０。ＳＩＮレンチウイルスベクターは、米国特許第６，９２４，１２３号及び米国特許第７，０５６，６９９号に記載されている。
複製欠損レンチウイルスベクター
複製欠損レンチウイルスベクターのゲノムにおいて、ｇａｇ／ｐｏｌ及び／又はｅｎｖの配列は、変異していてもよく、並びに／あるいは機能していなくてもよい。
本明細書に記載の典型的なレンチウイルスベクターでは、ウイルス複製に必須のタンパク質の１又は複数のコード領域の少なくとも一部をベクターから除去することができる。これにより、ウイルスベクターの複製が欠損する。非分裂標的細胞に形質導入すること、及び／又はそのゲノムを標的細胞ゲノムに組み込むことができるＮＯＩを含むベクターを作製するために、ウイルスゲノムの一部をＮＯＩで置き換えることもできる。
一実施形態では、レンチウイルスベクターは、国際公開第２００６／０１０８３４号及び国際公開第２００７／０７１９９４号に記載されているような非組込み型ベクターである。
更なる実施形態では、ベクターは、ウイルスＲＮＡがないか、又は欠く配列を送達する能力を有する。更なる実施形態では、送達されるＲＮＡ上に位置する異種結合ドメイン（ｇａｇに対して異種）及びＧａｇ又はＧａｇＰｏｌ上の同族結合ドメインを使用して、送達されるＲＮＡのパッケージングを確実にすることができる。これらのベクターの両方は、国際公開第２００７／０７２０５６号に記載されている。
ＮＯＩ及びポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡを含み得る。それらは一本鎖又は二本鎖であり得る。多数の異なるポリヌクレオチドが、遺伝暗号の縮退の結果として同じポリペプチドをコードすることができることが当業者によって理解されるであろう。更に、当業者は、日常的な技術を使用して、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を行って、本発明のポリペプチドが発現される任意の特定の宿主生物のコドン使用頻度を反映することができることを理解されたい。
ポリヌクレオチドは、当技術分野で利用可能な任意の方法によって改変され得る。そのような改変は、本発明のポリヌクレオチドのインビボ活性又は寿命を増強するために行われ得る。
ＤＮＡポリヌクレオチド等のポリヌクレオチドは、組換え的に、合成的に、又は当業者に利用可能な任意の手段によって作製され得る。それらはまた、標準的な技術によってクローニングされ得る。
より長いポリヌクレオチドが、一般に、組換え手段を使用して、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）クローニング技術を使用して作製されるであろう。これは、クローニングすることが望まれる標的配列に隣接するプライマー対（例えば、約１５～３０ヌクレオチド）を作製することと、プライマーを動物又はヒト細胞から得られたｍＲＮＡ又はｃＤＮＡと接触させることと、所望の領域の増幅をもたらす条件下でＰＣＲを行うことと、増幅された断片を（例えば、反応混合物をアガロースゲルで精製することによって）単離することと、増幅されたＤＮＡを回収することと、を含む。プライマーは、適切な制限酵素認識部位を含んで、増幅されたＤＮＡを適切なベクターにクローニングするように設計され得る。
一般的なレトロウイルスベクター要素
プロモータ及びエンハンサ
ＮＯＩ及びポリヌクレオチドの発現は、制御配列、例えば、プロモータ、エンハンサ及び他の発現制御シグナル（例えば、ｔｅｔ抑制因子（ＴｅｔＲ）系）を含む転写制御要素又は翻訳抑制要素、あるいはベクター産生細胞系（ＴＲｉＰ）における導入遺伝子抑制又は本明細書に記載のＮＯＩの他の調節因子を使用して制御され得る。
真核細胞において機能的な原核生物プロモータ及びプロモータを使用することができる。組織特異的又は刺激特異的プロモータが使用され得る。２つ以上の異なるプロモータ由来の配列要素を含むキメラプロモータも使用され得る。
適切な促進配列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レトロウイルス及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスのゲノムに由来するもの、又はアクチンプロモータ、ＥＦ１α、ＣＡＧ、ＴＫ、ＳＶ４０、ユビキチン、ＰＧＫ若しくはリボソームタンパク質プロモータ等の異種哺乳動物プロモータに由来するものを含む強力なプロモータである。あるいは、組織特異的プロモータ、例えば、ロドプシン（Ｒｈｏ）、ロドプシンキナーゼ（ＲｈｏＫ）、コーンロッドホメオボックス含有遺伝子（ＣＲＸ）、神経網膜特異的ロイシンジッパータンパク質（ＮＲＬ）、卵黄様黄斑変性症２（ＶＭＤ２）、チロシンヒドロキシラーゼ、ニューロン特異的ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモータ、星状膠原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモータ、ヒトα１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモータ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）、肝臓脂肪酸結合タンパク質プロモータ、Ｆｌｔ－１プロモータ、ＩＮＦ－βプロモータ、Ｍｂプロモータ、ＳＰ－Ｂプロモータ、ＳＹＮ１プロモータ、ＷＡＳＰプロモータ、ＳＶ４０／ｈＡｌｂプロモータ、ＳＶ４０／ＣＤ４３、ＳＶ４０／ＣＤ４５、ＮＳＥ／ＲＵ５’プロモータ、ＩＣＡＭ－２プロモータ、ＧＰＩＩｂプロモータ、ＧＦＡＰプロモータ、フィブロネクチンプロモータ、エンドグリンプロモータ、エラスターゼ－１プロモータ、デスミンプロモータ、ＣＤ６８プロモータ、ＣＤ１４プロモータ及びＢ２９プロモータを使用して転写を駆動することができる。
ＮＯＩの転写は、エンハンサ配列をベクターに挿入することによって更に増加させることができる。エンハンサは、相対的に配向及び位置に依存しないが、ＳＶ４０エンハンサ及びＣＭＶ初期プロモータエンハンサ等の真核細胞ウイルス由来のエンハンサを使用してもよい。エンハンサは、プロモータに対して５’又は３’の位置でベクターにスプライシングされ得るが、好ましくはプロモータから５’の部位に位置する。
プロモータは、適切な標的細胞における発現を確実にするか又は増加させるための特徴を更に含み得る。例えば、特徴は、保存領域、例えば、プリブノーボックス又はＴＡＴＡボックスであり得る。プロモータは、ヌクレオチド配列の発現レベルに影響を及ぼす（例えば、維持する、増強する、又は減少させる）他の配列を含み得る。適切な他の配列には、Ｓｈ１－イントロン又はＡＤＨイントロンが含まれる。他の配列は、温度、化学的、光又は応力誘導性要素等の誘導性要素を含む。また、転写又は翻訳を増強するための適切な要素が存在し得る。
ＮＯＩのレギュレータ
レトロウイルスパッケージング／プロデューサ細胞株及びレトロウイルスベクター産生の生成における複雑な要因は、特定のレトロウイルスベクター成分及びＮＯＩの構成的発現が細胞傷害性であり、これらの成分を発現する細胞の死をもたらし、したがってベクターを産生することができないことである。したがって、これらの成分（例えば、ｇａｇ－ｐｏｌ及びエンベロープタンパク質、例えばＶＳＶ－Ｇ）の発現を調節することができる。他の非細胞傷害性ベクター成分、例えばｒｅｖの発現も、細胞に対する代謝負荷を最小化するように調節することができる。本明細書に記載のモジュール式構築物及び／又は細胞は、少なくとも１つの調節要素に関連する細胞傷害性及び／又は非細胞傷害性ベクター成分を含み得る。本明細書で使用される場合、「調節要素」という用語は、関連する遺伝子又はタンパク質の発現に影響を及ぼす、増加又は減少させることができる任意の要素を指す。調節要素は、遺伝子スイッチ系、転写調節要素及び翻訳抑制要素を含む。
哺乳動物細胞において遺伝子スイッチを生成するために、多数の原核生物調節システムが適合されている。多くのレトロウイルスパッケージング及びプロデューサ細胞株は、遺伝子スイッチシステム（例えば、テトラサイクリン及びクメート誘導スイッチシステム）を使用して制御されており、したがって、ベクター産生時に１又は複数のレトロウイルスベクター成分の発現をオンにすることができる。遺伝子スイッチ系には、転写調節因子の（ＴｅｔＲ）タンパク質群のもの（例えば、Ｔ－Ｒｅｘ、Ｔｅｔ－Ｏｎ、及びＴｅｔ－Ｏｆｆ）、転写調節因子のクメート誘導性スイッチ系群のもの（例えばＣｙｍＲタンパク質）、及びＲＮＡ結合タンパク質を含むもの（例えば、ＴＲＡＰ）が含まれる。
そのようなテトラサイクリン誘導性系の１つは、Ｔ－ＲＥｘ（商標）系に基づくテトラサイクリン抑制因子（ＴｅｔＲ）系である。例として、このような系では、テトラサイクリンオペレーター（ＴｅｔＯ２）は、最初のヌクレオチドがヒトサイトメガロウイルス主要前初期プロモータ（ｈＣＭＶｐ）のＴＡＴＡＴＡＡ要素の最後のヌクレオチドの３’末端から１０ｂｐになるような位置に配置され、次いでＴｅｔＲ単独で抑制因子として作用することができる（Ｙａｏ Ｆ，Ｓｖｅｎｓｊｏ Ｔ，Ｗｉｎｋｌｅｒ Ｔ，Ｌｕ Ｍ，Ｅｒｉｋｓｓｏｎ Ｃ，Ｅｒｉｋｓｓｏｎ Ｅ．Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ，ｔｅｔＲ，ｒａｔｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｔｅｔＲ－ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｆｕｓｉｏｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．１９９８．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ；９：１９３９－１９５０）。このような系では、ＮＯＩの発現は、２コピーのＴｅｔＯ２配列がタンデムに挿入されたＣＭＶプロモータによって制御することができる。ＴｅｔＲホモ二量体は、誘導剤（テトラサイクリン又はその類似体ドキシサイクリン［ｄｏｘ］）の非存在下で、ＴｅｔＯ２配列に結合し、上流ＣＭＶプロモータからの転写を物理的に遮断する。存在する場合、誘導剤はＴｅｔＲホモ二量体に結合し、それがもはやＴｅｔＯ２配列に結合できないようなアロステリック変化を引き起こし、遺伝子発現をもたらす。ＴｅｔＲ遺伝子は、翻訳効率を改善し、ＴｅｔＯ２制御遺伝子発現のより厳密な制御をもたらし得るため、コドン最適化され得る。
ＴＲｉＰ系は、国際公開第２０１５／０９２４４０号に記載されており、ベクター産生中の産生細胞におけるＮＯＩの発現を抑制する別の方法を提供する。ＴＲＡＰ結合配列（例えばＴＲＡＰ－ｔｂｓ）相互作用は、組織特異的プロモータを含む構成的及び／又は強力なプロモータが導入遺伝子を駆動することが望ましい場合、特に、産生細胞における導入遺伝子タンパク質の発現が、ベクターの力価の低下をもたらし、及び／又は導入遺伝子由来タンパク質のウイルスベクター送達に起因してインビボで免疫応答を誘発する場合、レトロウイルスベクターの産生のための導入遺伝子タンパク質抑制系の基礎を形成する（Ｍａｕｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．（２０１７）Ｍａｒ ２７；８）。
簡潔には、ＴＲＡＰ－ｔｂｓ相互作用は翻訳ブロックを形成し、導入遺伝子タンパク質の翻訳を抑制する（Ｍａｕｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．（２０１７）Ｍａｒ ２７；８）。翻訳ブロックは、産生細胞においてのみ有効であり、したがって、ＤＮＡ又はＲＮＡに基づくベクター系を妨げない。ＴＲｉＰシステムは、導入遺伝子タンパク質が、単一又は複数のシストロン性ｍＲＮＡ由来の組織特異的プロモータを含む構成的及び／又は強力なプロモータから発現される場合、翻訳を抑制することができる。導入遺伝子タンパク質の調節されない発現は、ベクターの力価を低下させ、ベクター産物の品質に影響を及ぼし得ることが実証されている。一過性及び安定なＰａＣＬ／ＰＣＬベクター産生システムの両方に対する導入遺伝子タンパク質の抑制は、ベクターの力価の低下を防ぐために産生細胞にとって有益であり、ここで、毒性又は分子量の問題が細胞ストレスにつながる可能性があり、導入遺伝子タンパク質は、導入遺伝子由来タンパク質のウイルスベクター送達に起因してインビボで免疫応答を誘発し、遺伝子編集導入遺伝子の使用は、オン／オフ標的影響をもたらし得、導入遺伝子タンパク質は、ベクター及び／又はエンベロープ糖タンパク質の排除に影響を及ぼし得る。
エンベロープ及びシュードタイピング
１つの好ましい態様では、本明細書に記載のレンチウイルスベクターはシュードタイプ化されている。これに関して、シュードタイピングは１又は複数の利点を与えることができる。例えば、ＨＩＶベースのベクターのｅｎｖ遺伝子産物は、ＣＤ４と呼ばれるタンパク質を発現する細胞のみに感染するようにこれらのベクターを制限するであろう。しかし、これらのベクター中のｅｎｖ遺伝子が他のエンベロープウイルス由来のｅｎｖ配列で置換されている場合、それらはより広い感染スペクトルを有し得る（Ｖｅｒｍａ ａｎｄ Ｓｏｍｉａ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８９（６６４８）：２３９－２４２）。例として、作業者は、ＶＳＶ由来の糖タンパク質を有するＨＩＶベースのベクターをシュードタイプ化した（Ｖｅｒｍａ ａｎｄ Ｓｏｍｉａ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８９（６６４８）：２３９－２４２）。
別の代替では、Ｅｎｖタンパク質は、変異Ｅｎｖタンパク質又は操作されたＥｎｖタンパク質等の改変Ｅｎｖタンパク質であり得る。改変は、標的化能力を導入するために、又は毒性を低減するために、又は別の目的のために作製又は選択され得る（Ｖａｌｓｅｓｉａ－Ｗｉｔｔｍａｎ ｅｔ ａｌ １９９６Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７０：２０５６－６４；Ｎｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ３（４）：２８０－２８６；及びＦｉｅｌｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｂｌｏｏｄ ９１（５）：１８０２－１８０９及びそこに引用されている参考文献）。
ベクターは、選択された任意の分子でシュードタイプ化され得る。
本明細書で使用される場合、「ｅｎｖ」は、本明細書に記載の内因性レンチウイルスエンベロープ又は異種エンベロープを意味するものとする。
ＶＳＶ－Ｇ
ラブドウイルスである水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のエンベロープ糖タンパク質（Ｇ）は、特定のエンベロープウイルス及びウイルスベクタービリオンをシュードタイピングすることができることが示されているエンベロープタンパク質である。
レトロウイルスエンベロープタンパク質の非存在下でのシュードタイプＭｏＭＬＶベースのレトロウイルスベクターに対するその能力は、Ｅｍｉ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６５：１２０２－１２０７．によって最初に示された。国際公開第１９９４／２９４４４０号は、レトロウイルスベクターがＶＳＶ－Ｇで首尾よくシュードタイプ化され得ることを教示している。これらのシュードタイプ化ＶＳＶ－Ｇベクターは、広範囲の哺乳動物細胞を形質導入するために使用され得る。より最近では、Ａｂｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２（８）６３５６－６３６１は、ＶＳＶ－Ｇの添加によって非感染性レトロウイルス粒子を感染性にすることができることを教示している。
Ｂｕｒｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：８０３３－７は、ＶＳＶ－Ｇを有するレトロウイルスＭＬＶのシュードタイプ化に成功し、これにより、その天然型のＭＬＶと比較して宿主域が変化したベクターが得られた。ＶＳＶ－Ｇシュードタイプ化ベクターは、哺乳動物細胞だけでなく、魚、爬虫類及び昆虫に由来する細胞株にも感染することが示されている（Ｂｕｒｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）ｉｂｉｄ）。それらはまた、様々な細胞株に対して従来のアンホトロピックエンベロープよりも効率的であることが示されている（Ｙｅｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：９５６４－９５６８，Ｅｍｉ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６５：１２０２－１２０７）。ＶＳＶ－Ｇタンパク質は、その細胞質尾部がレトロウイルスコアと相互作用することができるため、特定のレトロウイルスをシュードタイプするために使用することができる。
ＶＳＶ－Ｇタンパク質等の非レトロウイルスシュードタイピングエンベロープの提供は、感染性を失うことなくベクター粒子を高力価に濃縮できるという利点をもたらす（Ａｋｋｉｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：２５８１－５）。レトロウイルスエンベロープタンパク質は、おそらく２つの非共有結合的に連結されたサブユニットからなるため、超遠心分離中の剪断力に明らかに耐えることができない。サブユニット間の相互作用は、遠心分離によって破壊され得る。比較すると、ＶＳＶ糖タンパク質は単一単位から構成される。したがって、ＶＳＶ－Ｇタンパク質シュードタイピングは、効率的な標的細胞感染／形質導入及び製造プロセス中の両方に潜在的な利点を提供することができる。
国際公開第２０００／５２１８８号は、膜結合型ウイルスエンベロープタンパク質として水疱性口内炎ウイルス－Ｇタンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）を有する、安定したプロデューサ細胞株からのシュードタイプ化レトロウイルスベクターの作製を記載しており、ＶＳＶ－Ｇタンパク質の遺伝子配列を提供している。
ロスリバーウイルス
ロスリバーウイルスエンベロープは、非霊長類レンチウイルスベクター（ＦＩＶ）をシュードタイプ化するために使用されており、全身投与後に主に肝臓を形質導入した（Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７６：９３７８－９３８８）。効率は、ＶＳＶ－Ｇシュードタイプ化ベクターで得られたものよりも２０倍大きく、肝毒性を示唆する肝酵素の血清レベルによって測定されるように、細胞傷害性をあまり引き起こさなかったことが報告された。
バキュロウイルスＧＰ６４
バキュロウイルスＧＰ６４タンパク質は、臨床用途及び商業用途に必要な高力価ウイルスの大規模生産に使用されるウイルスベクターのＶＳＶ－Ｇの代替物であることが示されている（Ｋｕｍａｒ Ｍ，Ｂｒａｄｏｗ ＢＰ，Ｚｉｍｍｅｒｂｅｒｇ Ｊ（２００３）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１４（１）：６７－７７）。ＶＳＶ－Ｇ－シュードタイプ化ベクターと比較して、ＧＰ６４シュードタイプ化ベクターは、類似の広範な親和性及び類似の天然の力価を有する。ＧＰ６４発現は細胞を死滅させないため、ＧＰ６４を構成的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ系細胞株を作製することができる。
代替エンベロープ
シュードタイプＥＩＡＶに使用した場合に妥当な力価を与える他のエンベロープとしては、モコラ、狂犬病、エボラ及びＬＣＭＶ（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス）が挙げられる。４０７０Ａでシュードタイプ化されたレンチウイルスのマウスへの静脈内注入は、肝臓における最大の遺伝子発現をもたらした。
パッケージング配列
本発明の文脈内で利用される場合、「パッケージング配列」又は「ｐｓｉ」と互換的に呼ばれる「パッケージングシグナル」という用語は、ウイルス粒子形成中のレトロウイルスＲＮＡ鎖のカプシド形成に必要な非コードシス作用配列に関して使用される。ＨＩＶ－１では、この配列は、主要スプライスドナー部位（ＳＤ）の上流から少なくともｇａｇ開始コドンまで延在する遺伝子座にマッピングされている（ｇａｇのヌクレオチド６８８に対する５’配列の一部又は全部が含まれ得る）。ＥＩＡＶにおいて、パッケージングシグナルは、Ｇａｇの５’コーディング領域へのＲ領域を含む。
本明細書で使用される場合、「伸長パッケージングシグナル」又は「伸長パッケージング配列」という用語は、ｇａｇ遺伝子内に更に伸長するｐｓｉ配列の周りの配列の使用を指す。これらの追加のパッケージング配列を含めることにより、ウイルス粒子へのベクターＲＮＡの挿入効率を高めることができる。
ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ＲＮＡキャプシド形成決定基は、ゲノムｍＲＮＡの５’末端の一方の領域（Ｒ－Ｕ５）及びｇａｇの近位３１１ ｎｔ内にマッピングされたもう一方の領域を含む別個かつ非連続的であることが示されている（Ｋａｙｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．Ｏｃｔ；６９（１０）：６５８８－９２（１９９５）。
内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）
ＩＲＥＳ要素の挿入は、単一のプロモータからの複数のコード領域の発現を可能にする（Ａｄａｍ ｅｔ ａｌ（ａｓ ａｂｏｖｅ）；Ｋｏｏ ｅｔ ａｌ（１９９２）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８６：６６９－６７５；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ １９９３ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６７：２１４２－２１４８）。ＩＲＥＳ要素は、ウイルスタンパク質のキャップ非依存性翻訳を促進するピコルナウイルスの非翻訳５’末端に最初に見出された（Ｊａｎｇ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｅｎｚｙｍｅ ４４：２９２－３０９）。ＲＮＡ中のオープンリーディングフレームの間に位置する場合、ＩＲＥＳ要素は、ＩＲＥＳ要素におけるリボソームの進入を促進し、続いて翻訳の下流開始を促進することによって、下流のオープンリーディングフレームの効率的な翻訳を可能にする。
ＩＲＥＳに関する総説が、Ｍｏｕｎｔｆｏｒｄ及びＳｍｉｔｈによって提示される（ＴＩＧ Ｍａｙ １９９５ ｖｏｌ １１，Ｎｏ ５：１７９－１８４）。脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）由来のもの（Ｇｈａｔｔａｓ，Ｉ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１：５８４８－５８５９（１９９１）；ＢｉＰ ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｍａｃｅｊａｋ ａｎｄ Ｓａｒｎｏｗ，Ｎａｔｕｒｅ ３５３：９１（１９９１）］；ｔｈｅ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ（ｅｘｏｎｓ ｄ ａｎｄ ｅ）［Ｏｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，６：１６４３－１６５３（１９９２）］並びにポリオウイルス（ＰＶ）［Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ａｎｄ Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：３２０－３２５（１９８８）；Ｍｏｕｎｔｆｏｒｄ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，ＴＩＧ １１，１７９－１８４（１９８５））を含む多数の異なるＩＲＥＳ配列が知られている。
ＰＶ、ＥＭＣＶ及び豚水疱性疾患ウイルス由来のＩＲＥＳ要素は、レトロウイルスベクターにおいて以前から使用されている（上記のＣｏｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ）。
「ＩＲＥＳ」という用語は、ＩＲＥＳとして機能するか又はＩＲＥＳの機能を改善する任意の配列又は配列の組合わせを含む。（１又は複数の）ＩＲＥＳは、ウイルス起源（例えばＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、ＰＶ ＩＲＥＳ、又はＦＭＤＶ ２Ａ様配列）又は細胞起源（例えば、ＦＧＦ２ ＩＲＥＳ、ＮＲＦ ＩＲＥＳ、Ｎｏｔｃｈ ２ ＩＲＥＳ又はＥＩＦ４ ＩＲＥＳ）であり得る。
ＩＲＥＳが各ポリヌクレオチドの翻訳を開始することができるようにするために、ＩＲＥＳは、モジュール構築物中のポリヌクレオチドの間又はポリヌクレオチドの前に配置されるべきである。
安定な細胞株の開発のために利用されるヌクレオチド配列は、安定な組み込みが起こった細胞を選択するための選択マーカーの添加を必要とする。これらの選択マーカーは、ヌクレオチド配列内の単一の転写単位として発現させることができるか、又はＩＲＥＳ要素を使用してポリシストロニックなメッセージで選択マーカーの翻訳を開始することが好ましい場合がある（Ａｄａｍ ｅｔ ａｌ １９９１ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５，４９８５）。
遺伝子配向及び絶縁体
核酸が指向性であり、これが最終的に細胞における転写及び複製等の機構に影響を及ぼすことは周知である。したがって、遺伝子は、同じ核酸構築物の一部である場合、互いに対して相対的な向きを有することができる。
本発明の特定の実施形態では、細胞又は構築物中の同じ遺伝子座に存在する少なくとも２つの核酸配列は、逆向き及び／又は交互の向きであり得る。換言すれば、この特定の遺伝子座における本発明の特定の実施形態では、一対の連続する遺伝子は同じ向きを有さない。これは、領域が宿主細胞の同じ物理的位置内で発現される場合、転写及び翻訳の両方のリードスルーを防止するのに役立ち得る。
交互の向きを有することは、ベクター産生に必要な核酸が細胞内の同じ遺伝子座に基づく場合、レトロウイルスベクター産生に利益をもたらす。これはまた、結果として生じる構築物の安全性を、複製可能なレトロウイルスベクターの生成の防止において改善することができる。
核酸配列が逆向き及び／又は交互の向きにある場合、絶縁体の使用は、その遺伝的周囲からのＮＯＩの不適切な発現又はサイレンシングを防止することができる。
「絶縁体」という用語は、絶縁体結合タンパク質に結合したときに、周囲の調節シグナルから遺伝子を保護する能力を有するＤＮＡ配列要素のクラスを指す。２つのタイプの絶縁体：エンハンサブロッキング機能及びクロマチンバリア機能が存在する。絶縁体がプロモータとエンハンサとの間に位置する場合、絶縁体のエンハンサ遮断機能は、プロモータをエンハンサの転写促進作用から遮蔽する（Ｇｅｙｅｒ ａｎｄ Ｃｏｒｃｅｓ １９９２；Ｋｅｌｌｕｍ ａｎｄ Ｓｃｈｅｄｌ １９９２）。クロマチンバリアインシュレーターは、転写的に不活性なクロマチン領域に変わる転写的に活性なクロマチン領域をもたらし、遺伝子発現のサイレンシングをもたらす近くの凝縮したクロマチンの進行を妨げることによって機能する。ヘテロクロマチンの拡散、したがって遺伝子サイレンシングを阻害する絶縁体は、ヒストン改変に関与する酵素を動員してこのプロセスを防止する（Ｙａｎｇ Ｊ，Ｃｏｒｃｅｓ ＶＧ．２０１１；１１０：４３－７６；Ｈｕａｎｇ，Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２００７；Ｄｈｉｌｌｏｎ，Ｒａａｂ ｅｔ ａｌ．２００９）。絶縁体はこれらの機能の一方又は両方を有することができ、ニワトリβグロビン絶縁体（ｃＨＳ４）はそのような例の１つである。この絶縁体は、最も広く研究されている脊椎動物絶縁体であり、Ｇ＋Ｃが非常に豊富であり、エンハンサ遮断機能及びヘテロクロマティックバリア機能の両方を有する（Ｃｈｕｎｇ Ｊ Ｈ、Ｗｈｉｔｅｌｙ Ｍ、Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄ Ｇ．Ｃｅｌｌ。１９９３；７４：５０５－５１４）。エンハンサ遮断機能を有する他のそのような絶縁体は限定されないが、以下のもの、ヒトβ－グロビン絶縁体５（ＨＳ５）、ヒトβ－グロビン絶縁体１（ＨＳ１）、及びニワトリβ－グロビン絶縁体（ｃＨＳ３）が挙げられる（Ｆａｒｒｅｌｌ ＣＭ１，Ｗｅｓｔ ＡＧ，Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄ Ｇ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００２ Ｊｕｎ；２２（１１）：３８２０－３１；Ｊ Ｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ．１９９６ Ｆｅｂ １；１５（３）：５６２－５６８）。望ましくない遠位相互作用を減少させることに加えて、絶縁体はまた、隣接するレトロウイルス核酸配列間のプロモータ干渉（すなわち、１つの転写単位由来のプロモータが隣接する転写単位の発現を損なう場合）を防止するのに役立つ。レトロウイルスベクター核酸配列のそれぞれの間に絶縁体が使用される場合、直接リードスルーの減少は、複製可能なレトロウイルスベクター粒子の形成の防止に役立つであろう。
インシュレーターは、レトロウイルス核酸配列のそれぞれの間に存在し得る。一実施形態では、インシュレーターの使用は、ベクター成分をコードするヌクレオチド配列中の別のＮＯＩ発現カセットと相互作用する１つのＮＯＩ発現カセットからのプロモータ－エンハンサ相互作用を防止する。
ベクターゲノムとｇａｇ－ｐｏｌ配列との間に絶縁体が存在し得る。したがって、これは、複製可能なレトロウイルスベクター及び「野生型」様ＲＮＡ転写物の産生の可能性を制限し、構築物の安全性プロファイルを改善する。安定に組み込まれた多重遺伝子ベクターの発現を改善するための絶縁体要素の使用は、Ｍｏｒｉａｒｉｔｙ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３ Ａｐｒ；４１（８）：ｅ９２に記載されている。
ベクター力価
当業者は、レンチウイルスベクターの力価を決定する多数の異なる方法があることを理解するであろう。力価は、しばしば、形質導入単位／ｍＬ（ＴＵ／ｍＬ）として記載される。力価は、ベクター粒子の数を増加させることによって、及びベクター調製物の比活性を増加させることによって増加させ得る。
治療的使用
本明細書に記載のレンチウイルスベクターあるいは本明細書に記載のレンチウイルスベクターで形質導入された細胞又は組織は、医学で使用され得る。
更に、本明細書に記載のレンチウイルスベクター、本発明の産生細胞、あるいは本明細書に記載のレンチウイルスベクターで形質導入された細胞又は組織は、目的のヌクレオチドをそれを必要とする標的部位に送達するための医薬の調製に使用され得る。本発明のレンチウイルスベクター又は形質導入細胞のそのような使用は、前述のように、治療目的又は診断目的のためであり得る。
したがって、本明細書に記載のレンチウイルスベクターによって形質導入された細胞が提供される。
「ウイルスベクター粒子によって形質導入された細胞」は、ウイルスベクター粒子によって担持された核酸が移入された細胞、特に標的細胞として理解されるべきである。
本発明の一実施形態において、目的のヌクレオチドは、ＴＲＡＰを欠く標的細胞において翻訳される。
「標的細胞」は、ＮＯＩを発現することが望ましい細胞として理解されるべきである。ＮＯＩは、本発明のウイルスベクターを用いて標的細胞に導入することができる。標的細胞への送達は、インビボ、エクスビボ又はインビトロで行われ得る。
好ましい実施形態では、目的のヌクレオチドは治療効果をもたらす。
ＮＯＩは、治療的又は診断的用途を有し得る。適切なＮＯＩには、酵素、補助因子、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、抗体、抗酸化分子、操作された免疫グロブリン様分子、一本鎖抗体、融合タンパク質、免疫共刺激分子、免疫調節分子、キメラ抗原受容体、標的タンパク質のトランスドメインネガティブ変異体、毒素、コンディショナル毒素、抗原、転写因子、構造タンパク質、レポータタンパク質、細胞内局在化シグナル、腫瘍抑制タンパク質、成長因子、膜タンパク質、受容体、血管活性タンパク質及びペプチド、抗ウイルスタンパク質及びリボザイム、並びにそれらの誘導体（関連レポータ基を有する誘導体等）をコードする配列が含まれるが、これらに限定されない。ＮＯＩはまた、マイクロＲＮＡをコードし得る。理論に拘束されることを望むものではないが、マイクロＲＮＡのプロセシングはＴＲＡＰによって阻害されると考えられる。
一実施形態では、ＮＯＩは、神経変性障害の治療に有用であり得る。
別の実施形態では、ＮＯＩはパーキンソン病の治療に有用であり得る。
別の実施形態では、ＮＯＩは、ドーパミン合成に関与する１又は複数の酵素をコードし得る。例えば、酵素は、以下のもの、チロシンヒドロキシラーゼ、ＧＴＰ－シクロヒドロラーゼＩ及び／又は芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼのうちの１又は複数であり得る。３つ全ての遺伝子の配列が利用可能である（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号はそれぞれ、Ｘ０５２９０、Ｕ１９５２３及びＭ７６１８０）。
別の実施形態では、ＮＯＩは、小胞モノアミントランスポーター２（ＶＭＡＴ２）をコードし得る。代替の実施形態では、ウイルスゲノムは、芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼをコードするＮＯＩ及びＶＭＡＴ２をコードするＮＯＩを含み得る。そのようなゲノムは、パーキンソン病の治療において、特にＬ－ＤＯＰＡの末梢投与と併せて使用され得る。
別の実施形態では、ＮＯＩは、治療用タンパク質又は治療用タンパク質の組合わせをコードし得る。
別の実施形態では、ＮＯＩは、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、インターロイキン－１β（ＩＬ－１β）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）、インスリン増殖因子－２、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ／ＶＥＧＦ－２、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ－Ｅ、ＰＤＧＦ－Ａ、ＰＤＧＦ－Ｂ、ＰＤＦＧ－Ａ及びＰＤＦＧ－Ｂのヘテロ二量体及びホモ二量体からなる群から選択される１又は複数のタンパク質をコードし得る。
別の実施形態では、ＮＯＩは、アンジオスタチン、エンドスタチン、血小板因子４、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、胎盤成長因子、レスチン、インターフェロン－α、インターフェロン誘導性タンパク質、ｇｒｏ－β及びｔｕｂｅｄｏｗｎ－１、インターロイキン（ＩＬ）－１、ＩＬ－１２、レチノイン酸、抗ＶＥＧＦ抗体又はその断片／バリアント、例えばアフリベルセプト、トロンボスポンジン、ＶＥＧＦ受容体タンパク質、例えば米国特許第５，９５２，１９９号及び米国特許第６，１００，０７１号に記載されているもの、並びに抗ＶＥＧＦ受容体抗体からなる群から選択される１又は複数の抗血管新生タンパク質をコードし得る。
別の実施形態では、ＮＯＩは、ＮＦ－ｋＢ阻害剤、ＩＬ１β阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤、ＩＬ－６阻害剤、ＩＬ－２３阻害剤、ＩＬ－１８阻害剤、腫瘍壊死因子α及び腫瘍壊死因子β、リンホトキシンα及びリンホトキシンβ、ＬＩＧＨＴ阻害剤、αシヌクレイン阻害剤、タウ阻害剤、βアミロイド阻害剤、ＩＬ－１７阻害剤からなる群から選択される、抗炎症性タンパク質、抗体あるいはタンパク質又は抗体の断片／バリアントをコードし得る。
別の実施形態では、ＮＯＩは、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）をコードし得る。
別の実施形態では、ＮＯＩは、眼細胞において通常発現されるタンパク質をコードし得る。
別の実施形態では、ＮＯＩは、光受容細胞及び／又は網膜色素上皮細胞において通常発現されるタンパク質をコードし得る。
別の実施形態では、ＮＯＩは、ＲＰＥ６５、アリール炭化水素相互作用受容体タンパク質様１（ＡＩＰＬ１）、ＣＲＢ１、レシチンレチナールアセチルトランスフェラーゼ（ＬＲＡＴ）、光受容体特異的ホメオボックス（ＣＲＸ）、レチナールグアニレートシクリース（ＧＵＣＹ２Ｄ）、ＲＰＧＲ相互作用タンパク質１（ＲＰＧＲＩＰ１）、ＬＣＡ２、ＬＣＡ３、ＬＣＡ５、ジストロフィン、ＰＲＰＨ２、ＣＮＴＦ、ＡＢＣＲ／ＡＢＣＡ４、ＥＭＰ１、ＴＩＭＰ３、ＭＥＲＴＫ、ＥＬＯＶＬ４、ＭＹＯ７Ａ、ＵＳＨ２Ａ、ＶＭＤ２、ＲＬＢＰ１、ＣＯＸ－２、ＦＰＲ、ハーモニン、Ｒａｂエスコートタンパク質１、ＣＮＧＢ２、ＣＮＧＡ３、ＣＥＰ２９０、ＲＰＧＲ、ＲＳ１、ＲＰ１、ＰＲＥＬＰ、グルタチオン経路酵素及びオプチシンを含む群から選択されるタンパク質をコードし得る。
他の実施形態では、ＮＯＩは、ヒト凝固第ＶＩＩＩ因子又は第ＩＸ因子をコードし得る。
他の実施形態では、ＮＯＩは、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、イソバレリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、３メチルクロトニルＣｏＡカルボキシラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、カルバモイル－リン酸シンターゼアンモニア、オルニチントランスカルバアミラーゼ、グルコシルセラミダーゼβ、αガラクトシダーゼＡ、グルコシルセラミダーゼβ、シスチノシン、グルコサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼ、Ｎ－アセチル－α－グルコサミニダーゼ、Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ、ガラクトサミン－６スルファターゼ、アリールスルファターゼＡ、シトクロムＢ－２４５β、ＡＢＣＤ１、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ、アルギニノコハク酸シンターゼ、アルギニノコハク酸リアーゼ、アルギナーゼ１、アラニングリコキシレートアミノトランスフェラーゼ、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリＢメンバを含む群から選択される代謝に関与する１又は複数のタンパク質をコードし得る。
他の実施形態では、ＮＯＩは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードし得る。一実施形態では、ＣＡＲは抗５Ｔ４ ＣＡＲである。他の実施形態では、ＮＯＩは、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＣＤ１３８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ７０、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ルイスＹ抗原（ＬｅＹ）、チロシン－プロテインキナーゼ膜貫通受容体（ＲＯＲ１）、ムチン１、細胞表面結合（Ｍｕｃ１）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、内皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、インスリン、タンパク質チロシンホスファターゼ、非受容体型２２、インターロイキン２受容体、α、ヘリカーゼＣドメイン１で誘導されたインターフェロン、ヒト上皮増殖因子受容体（ＨＥＲ２）、グリピカン３（ＧＰＣ３）、ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）、メシオテリン、小胞内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）をコードし得る。
他の実施形態では、ＮＯＩは、ＵＬＢＰ１、２及び３、Ｈ６０、Ｒａｅ－１ａ、ｂ、ｇ、ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢを含む群から選択されるＮＫＧ２Ｄリガンドに対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし得る。
更なる実施形態では、ＮＯＩは、ＳＧＳＨ、ＳＵＭＦ１、ＧＡＡ、共通ガンマ鎖（ＣＤ１３２）、アデノシンデアミナーゼ、ＷＡＳタンパク質、グロビン、αガラクトシダーゼＡ、δ－アミノレブリン酸（ＡＬＡ）シンターゼ、δ－アミノレブリン酸デヒドラターゼ（ＡＬＡＤ）、ヒドロキシメチルビラン（ＨＭＢ）シンターゼ、ウロポルフィリノーゲン（ＵＲＯ）シンターゼ、ウロポルフィリノーゲン（ＵＲＯ）デカルボキシラーゼ、コプロポルフィリノーゲン（ＣＯＰＲＯ）オキシダーゼ、プロトポルフィリノーゲン（ＰＲＯＴＯ）オキシダーゼ、フェロケラターゼ、α－Ｌ－イズロニダーゼ、イズロン酸スルファターゼ、ヘパランスルファミダーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、ヘパリン－α－グルコサミニドＮ－アセチルトランスフェラーゼ、３Ｎ－アセチルグルコサミン６－スルファターゼ、ガラクトース－６－硫酸スルファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼ、β－グルクロニダーゼ及びヒアルロニダーゼをコードし得る。
ＮＯＩに加えて、ベクターはまた、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又は調節ｓｈＲＮＡを含むか、又はコードし得る。（Ｄｉｃｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３７：１２８９－１２９５，Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３７：１２８１－１２８８）。
適応症
本発明によるレトロウイルスベクター及びＡＡＶベクターを含むベクターは、国際公開第１９９８／０５６３５号、国際公開第１９９８／０７８５９号、国際公開第１９９８／０９９８５号に列挙されている障害の治療に有用な（１又は複数の）ＮＯＩを送達するために使用することができる。目的のヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。そのような疾患の例を以下に示す。
サイトカイン及び細胞増殖／分化活性に応答する障害；免疫抑制剤又は免疫刺激活性（例えば、ヒト免疫不全ウイルスによる感染を含む免疫不全を治療するため、リンパ球増殖の調節；癌及び多くの自己免疫疾患を治療すること、並びに移植拒絶を防止すること、又は腫瘍免疫を誘導すること）；造血（例えば骨髄性又はリンパ性疾患の治療）の調節；骨、軟骨、腱、靭帯及び神経組織の成長の促進（例えば創傷治癒、熱傷、潰瘍及び歯周疾患並びに神経変性の治療のために）；卵胞刺激ホルモンの阻害又は活性化（生殖力の調節）；走化性／走化性活性（例えば、特定の細胞型を損傷又は感染の部位に動員するために）；止血及び血栓溶解活性（例えば、血友病及び脳卒中を治療するために）；抗炎症活性（例えば、敗血症性ショック又はクローン病を治療するために）；マクロファージ阻害活性及び／又はＴ細胞阻害活性、したがって抗炎症活性；抗免疫活性（すなわち、炎症に関連しない応答を含む、細胞性及び／又は体液性免疫応答に対する阻害効果）；マクロファージ及びＴ細胞が細胞外マトリックス成分及びフィブロネクチンに接着する能力の阻害、並びにＴ細胞におけるｆａｓ受容体発現の上方制御。
癌、白血病、良性及び悪性腫瘍の成長、浸潤及び広がり、血管新生、転移、腹水症及び癌性胸水を含む悪性障害。
関節リウマチを含む関節炎、過敏症、アレルギー反応、喘息、全身性エリテマトーデス、コラーゲン疾患及び他の疾患を含む自己免疫疾患。
動脈硬化症、アテローム硬化性心疾患、再灌流傷害、心停止、心筋梗塞、血管炎症性障害、呼吸窮迫症候群、心血管作用、末梢血管疾患、片頭痛及びアスピリン依存性抗血栓症、脳卒中、脳虚血、虚血性心疾患又は他の疾患を含む血管疾患。
消化性潰瘍、潰瘍性大腸炎、クローン病及び他の疾患を含む胃腸管の疾患。
肝線維症、肝硬変を含む肝疾患。
フェニルケトン尿症ＰＫＵ、ウィルソン病、有機酸血症、尿素サイクル障害、胆汁うっ滞、及び他の疾患を含む遺伝性代謝障害。
甲状腺炎又は他の腺疾患、糸球体腎炎又は他の疾患を含む腎臓及び泌尿器の疾患。
耳炎又は他の耳鼻咽頭疾患を含む耳、鼻及び喉の障害、皮膚炎又は他の皮膚疾患。
歯周疾患、歯周炎、歯肉炎又は他の歯／口腔疾患を含む歯及び口腔障害。
精巣炎又は精巣精巣上体炎、不妊症、精巣外傷又は他の精巣疾患を含む精巣疾患。
胎盤機能障害、胎盤機能不全、習慣性流産、子癇、妊娠子癇、子宮内膜症及び他の婦人科疾患を含む婦人科疾患。
眼科学的障害、例えば、ＬＣＡ１０を含むレーバー先天黒内障（ＬＣＡ）、後部ブドウ膜炎、中間部ブドウ膜炎、前部ブドウ膜炎、結膜炎、脈絡網膜炎、網膜ブドウ膜炎、視神経炎、緑内障（開放隅角緑内障及び若年性先天緑内障を含む）、眼内炎症、例えば網膜炎又は嚢胞様黄斑浮腫、交感性眼炎、強膜炎、網膜色素変性、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）を含む黄斑変性、及びベスト病を含む若年性黄斑変性、ベスト病、ベスト卵黄様黄斑変性、シュタルガルト病、アッシャー症候群、ドイン蜂巣状網膜ジストロフィー、ソービー黄斑ジストロフィー、若年性網膜分離症、錐体杆体ジストロフィー、角膜ジストロフィー、角膜ジストロフィー、フックスジストロフィー、レーバー先天黒内障、レーバー遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）、アディ－症候群、小口病、変性眼底疾患、眼外傷、感染によって引き起こされる眼炎症、増殖性硝子体網膜症、急性虚血性視神経症、例えば緑内障濾過手術後の過度の瘢痕化、眼移植片拒絶反応、並びに糖尿病性黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症、ＲＬＢＰ１関連網膜ジストロフィー、全脈絡膜萎縮及び色覚異常等の他の眼疾患。
パーキンソン病、パーキンソン病の治療による合併症及び／又は副作用、ＡＩＤＳ関連認知症複合ＨＩＶ関連脳症、デビック病、シデナム舞踏病、アルツハイマー病及び他の変性疾患、ＣＮＳの状態又は障害、脳卒中、ポリオ後症候群、精神障害、脊髄炎、脳炎、亜急性硬化性全脳炎、脳脊髄炎、急性ニューロパシー、亜急性ニューロパシー、慢性ニューロパシー、ファブリー病、ゴーシェ病、シスチン症、ポンペ病、異染性白質ジストロフィー、ウィスコット・アルドリッチ症候群、副腎白質ジストロフィー、ベータサラセミア、鎌状赤血球症、Ｇｕｉｌｌａｉｍ－Ｂａｒｒｅ症候群、シデナム舞踏病、重症筋無力症、偽脳腫瘍、ダウン症候群、ハンチントン病、ＣＮＳ圧迫又はＣＮＳ外傷又はＣＮＳ感染、筋萎縮症及びジストロフィー、中枢及び末梢神経系の疾患、状態又は障害、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、脊髄及び裂離損傷を含む運動ニューロン疾患。
嚢胞性線維症、Ｓａｎｆｉｌｉｐｏ症候群Ａ、Ｓａｎｆｉｌｉｐｏ症候群Ｂ、Ｓａｎｆｉｌｉｐｏ症候群Ｃ、Ｓａｎｆｉｌｉｐｏ症候群Ｄ、ハンター症候群、Ｈｕｒｌｅｒ－Ｓｃｈｅｉｅ症候群、モルキオ症候群を含むムコ多糖症、ＡＤＡ－ＳＣＩＤ、Ｘ連鎖ＳＣＩＤ、Ｘ連鎖慢性肉芽腫性疾患、ポルフィリン症、血友病Ａ、血友病Ｂ、外傷後炎症、出血、凝固及び急性期反応、悪液質、食欲不振、急性感染、敗血症性ショック、感染性疾患、糖尿病、手術の合併症又は副作用、骨髄移植又は他の移植合併症及び／又は副作用、例えばウイルス担体による感染に起因する遺伝子治療の合併症及び副作用、あるいはＡＩＤＳ等の他の疾患及び状態、体液性及び／又は細胞性免疫応答を抑制又は阻害するための、天然細胞又は人工細胞の移植の場合における移植片拒絶の予防及び／又は治療のための、角膜、骨髄、器官、レンズ、ペースメーカ、天然又は人工皮膚組織等の組織及び器官。
ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏ－ＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ
特定の他の実施形態では、ＮＯＩはマイクロＲＮＡを含む。マイクロＲＮＡは、生物において天然に産生される小さなＲＮＡの非常に大きな群であり、その少なくとも一部は標的遺伝子の発現を調節する。マイクロＲＮＡファミリの形成メンバはｌｅｔ－７及びｌｉｎ－４である。ｌｅｔ－７遺伝子は、蠕虫発達中に内因性タンパク質コード遺伝子の発現を調節する、小さく高度に保存されたＲＮＡ種をコードする。活性ＲＮＡ種は最初に約７０ｎｔの前駆体として転写され、これは転写後に成熟約２１ｎｔ形態に処理される。ｌｅｔ－７及びｌｉｎ－４の両方は、Ｄｉｃｅｒ酵素によってそれらの成熟形態にプロセシングされるヘアピンＲＮＡ前駆体として転写される。
ＮＯＩに加えて、ベクターはまた、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又は調節ｓｈＲＮＡを含むか又はコードし得る（Ｄｉｃｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３７：１２８９－１２９５，Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３７：１２８１－１２８８）。
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって媒介される転写後遺伝子サイレンシング（Ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ：ＰＴＧＳ）は、外来遺伝子の発現を制御するための保存された細胞防御機構である。トランスポゾン又はウイルス等の要素のランダムな組込みは、相同な一本鎖ｍＲＮＡ又はウイルスゲノムＲＮＡの配列特異的分解を活性化するｄｓＲＮＡの発現を引き起こすと考えられる。サイレンシング効果は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られている（Ｒａｌｐｈ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １１：４２９－４３３）。ＲＮＡｉの機構は、長いｄｓＲＮＡを約２１～２５ヌクレオチド（ｎｔ）ＲＮＡの二重鎖にプロセシングすることを含む。これらの産物は、ｍＲＮＡ分解の配列特異的メディエータである低分子干渉ＲＮＡ又はサイレンシングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる。分化した哺乳動物細胞では、３０ｂｐ超のｄｓＲＮＡがインターフェロン応答を活性化し、タンパク質合成及び非特異的ｍＲＮＡ分解のシャットダウンをもたらすことが見出されている（Ｓｔａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６７：２２７－６４（１９９８））。しかしながら、この応答は、培養哺乳動物細胞において遺伝子機能を分析することを可能にする２１ｎｔのｓｉＲＮＡ二重鎖を使用することによって回避することができる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．Ｄｅｃ ３；２０（２３）：６８７７－８８（２００１），Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．Ａｕｇ ３，２９３（５５３１）：８３４－８．Ｅｕｐｕｂ Ｊｕｌ １２（２００１））。
医薬組成物
本開示は、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤と組み合わせて、本明細書に記載のレンチウイルスベクター又は本明細書に記載のウイルスベクターで形質導入された細胞若しくは組織を含む医薬組成物を提供する。
本開示は、遺伝子療法によって個体を治療するための医薬組成物であって、治療有効量のレンチウイルスベクターを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、ヒト又は動物の使用のためのものであり得る。
組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤又はアジュバントを含み得る。薬学的担体、賦形剤又は希釈剤の選択は、意図された投与経路及び標準的な製薬実務に関して行うことができる。医薬組成物は、担体、賦形剤又は希釈剤に加えて、任意の適切な（１又は複数の）結合剤、（１又は複数の）潤滑剤、（１又は複数の）懸濁化剤、（１又は複数の）コーティング剤、（１又は複数の）可溶化剤、及び標的部位（例えば、脂質送達系等）へのベクターの進入を補助又は増加させることができる他の担体剤を含んでもよい。
適切な場合、組成物は、任意の１又は複数の吸入によって；坐剤又は膣坐剤の形態で；ローション、溶液、クリーム、軟膏又は粉剤の形態で局所的に；皮膚貼付剤の使用によって；デンプン若しくはラクトース等の賦形剤を含有する錠剤の形態で経口的に、又は単独で若しくは賦形剤と混合したカプセル若しくは卵の形態で、又は香味料若しくは着色剤を含有するエリキシル剤、溶液若しくは懸濁液の形態で投与することができるか；あるいは非経口的に、例えば、陰茎海綿体内、静脈内、筋肉内、頭蓋内、眼内、腹腔内、又は皮下に注射することができる。非経口投与の場合、組成物は、他の物質、例えば溶液を血液と等張にするのに十分な塩又は単糖類を含有し得る滅菌水溶液の形態で最もよく使用され得る。頬側又は舌下投与の場合、組成物は、従来の様式で製剤化することができる錠剤又はトローチ剤の形態で投与することができる。
本明細書に記載されるレンチウイルスベクターはまた、標的細胞又は組織を必要とする患者に当該標的細胞又は組織を移入する前に、エクスビボで標的細胞又は組織を形質導入するために使用され得る。そのような細胞の一例は自己Ｔ細胞であり得、そのような組織の例はドナー角膜であり得る。
バリアント、誘導体、類似体、ホモログ及び断片
本明細書で言及される特定のタンパク質及びヌクレオチドに加えて、本発明はまた、それらのバリアント、誘導体、類似体、ホモログ及び断片の使用を包含する。
本発明の文脈において、任意の所与の配列のバリアントは、残基の特定の配列（アミノ酸残基又は核酸残基にかかわらず）が、問題のポリペプチド又はポリヌクレオチドがその内因性機能の少なくとも１つを保持するように改変されている配列である。バリアント配列は、天然に存在するタンパク質中に存在する少なくとも１つの残基の付加、欠失、置換、改変、置換え及び／又は変異によって得ることができる。
本発明のタンパク質又はポリペプチドに関して本明細書で使用される「誘導体」という用語は、得られるタンパク質又はポリペプチドがその内因性機能の少なくとも１つを保持することを条件として、配列からの又は配列への１つ（又は複数）のアミノ酸残基の任意の置換、変異、改変、置換え、欠失及び／又は付加を含む。
ポリペプチド又はポリヌクレオチドに関して本明細書で使用される「類似体」という用語は、それが模倣するポリペプチド又はポリヌクレオチドの内因性機能の少なくとも１つを有する任意の模倣物、すなわち、化学化合物を含む。
典型的には、改変された配列が必要な活性又は能力を保持する限り、アミノ酸置換、例えば１、２又は３～１０又は２０個の置換が行われ得る。アミノ酸置換は、天然に存在しない類似体の使用を含み得る。
本発明で使用されるタンパク質はまた、サイレント変化を生成し、機能的に等価なタンパク質をもたらすアミノ酸残基の欠失、挿入又は置換を有し得る。意図的なアミノ酸置換は、内因性機能が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性及び／又は両親媒性の性質の類似性に基づいて行われ得る。例えば、負に帯電したアミノ酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられ、正に荷電したアミノ酸としては、リジン及びアルギニンが挙げられ、同様の親水性値を有する非荷電極性頭部基を有するアミノ酸としては、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン及びチロシンが挙げられる。
保存的置換は、例えば以下の表に従って行うことができる。第２のカラム内の同じブロック内の、好ましくは第３のカラム内の同じライン内のアミノ酸は、互いに置換されてもよい。
Figure 2023513303000001
「ホモログ」という用語は、野生型アミノ酸配列及び野生型ヌクレオチド配列と一定の相同性を有する実体を意味する。「相同性」という用語は、「同一性」と同一視することができる。
本文脈において、相同配列は、対象配列と少なくとも５０％、５５％、６５％、７５％、８５％又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５％、９７又は９９％同一であり得るアミノ酸配列を含むと解釈される。典型的には、ホモログは、対象のアミノ酸配列と同じ活性部位等を含むであろう。相同性は類似性（すなわち、類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）に関しても考慮することができるが、本発明の文脈では、配列同一性に関して相同性を表現することが好ましい。
本文脈において、相同配列は、対象配列と少なくとも５０％、５５％、６５％、７５％、８５％又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５％、９７％、９８％又は９９％同一であり得るヌクレオチド配列を含むと解釈される。相同性は類似性の観点から考えることもできるが、本発明の文脈では、配列同一性の観点から相同性を表現することが好ましい。
相同性比較は、眼によって、又はより一般的には、容易に利用可能な配列比較プログラムの助けを借りて行うことができる。これらの市販のコンピュータプログラムは、２つ以上の配列間の相同性又は同一性のパーセンテージを計算することができる。
相同性パーセントは、連続した配列にわたって計算することができ、すなわち、一方の配列を他方の配列と整列させ、一方の配列中の各アミノ酸を他方の配列中の対応するアミノ酸と一度に１残基ずつ直接比較する。これは「非ギャップ」アライメントと呼ばれる。典型的には、そのような非ギャップ整列は、比較的少数の残基にわたってのみ行われる。
これは非常に単純で一貫した方法であるが、例えば、他の点では同一の配列対において、ヌクレオチド配列における１つの挿入又は欠失が、以下のコドンをアラインメントから外し得ることを考慮に入れることができず、したがって、全体的なアラインメントが行われるとき、相同性パーセントの大きな低下をもたらす可能性がある。その結果、ほとんどの配列比較方法は、全体的な相同性スコアを過度に不利にすることなく、可能性のある挿入及び欠失を考慮した最適なアラインメントを生成するように設計される。これは、局所相同性を最大化しようとするために配列アラインメントに「ギャップ」を挿入することによって達成される。
しかしながら、これらのより複雑な方法は、アライメントにおいて生じる各ギャップに「ギャップペナルティ」を割り当て、それにより、同じ数の同一のアミノ酸について、２つの比較される配列間のより高い関連性を反映して、可能な限り少ないギャップを有する配列アライメントが、多くのギャップを有する配列よりも高いスコアを達成する。「アフィン・ギャップ・コスト」は、典型的には、ギャップの存在に対して比較的高いコストを入れ、ギャップ内の各後続残基に対してより小さいペナルティを入れる。これは、最も一般的に使用されるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティは、当然ながら、より少ないギャップで最適化されたアライメントを生成する。ほとんどのアライメントプログラムは、ギャップペナルティを修正することを可能にする。しかしながら、配列比較のためにそのようなソフトウェアを使用する場合、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを使用する場合、アミノ酸配列のデフォルトのギャップペナルティは、ギャップに対して－１２、各伸長に対して－４である。
したがって、最大パーセンテージの相同性の計算は、ギャップペナルティを考慮して、最適なアラインメントの生成を最初に必要とする。そのようなアライメントを実施するための適切なコンピュータプログラムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ．；Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７）である。配列比較を実行することができる他のソフトウェアの例には、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９９）ｉｂｉｄ－Ｃｈ．１８を参照されたい）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３－４１０）及びＧＥＮＥＷＯＲＫＳ比較ツール一式が含まれるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡの両方は、オフライン及びオンライン検索に利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９９）ｉｂｉｄ，ｐａｇｅｓ ７－５８ ｔｏ ７－６０を参照されたい）。しかしながら、いくつかの用途では、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。ＢＬＡＳＴ ２配列と呼ばれる別のツールもまた、タンパク質及びヌクレオチド配列を比較するために利用可能である（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ（１９９９）１７４（２）：２４７－５０；ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ（１９９９）１７７（１）：１８７－８を参照されたい）。
最終的な相同性パーセントは、同一性に関して測定することができるが、整列プロセス自体は、典型的には、全か無かの対の比較に基づいていない。代わりに、化学的類似性又は進化的距離に基づいて各対比較にスコアを割り当てるスケーリングされた類似性スコアマトリックスが一般に使用される。一般的に使用されるそのようなマトリックスの例は、ＢＬＡＳＴプログラム一式のデフォルトマトリックスであるＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスである。ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、一般に、提供される場合、パブリックデフォルト値又はカスタムシンボル比較表のいずれかを使用する（更なる詳細についてはユーザマニュアルを参照されたい）。いくつかの用途では、ＧＣＧパッケージのパブリックデフォルト値、又は他のソフトウェアの場合はＢＬＯＳＵＭ６２等のデフォルトマトリックスを使用することが好ましい。
ソフトウェアが最適なアラインメントを生成したら、相同性パーセント、好ましくは配列同一性パーセントを計算することが可能である。ソフトウェアは通常、配列比較の一部としてこれを行い、数値結果を生成する。
「断片」もまたバリアントであり、この用語は、典型的には、機能的に又は例えばアッセイにおいて対象のポリペプチド又はポリヌクレオチドの選択された領域を指す。したがって、「断片」は、全長ポリペプチド又はポリヌクレオチドの一部であるアミノ酸又は核酸配列を指す。
そのようなバリアントは、部位定方向突然変異誘発等の標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して調製され得る。挿入が行われる場合、挿入部位の両側の天然に存在する配列に対応する５’及び３’フランキング領域と共に挿入をコードする合成ＤＮＡが作製され得る。フランキング領域は、配列が適切な（１又は複数の）酵素で切断され、合成ＤＮＡが断裂に連結されるように、天然に存在する配列の部位に対応する便利な制限部位を含む。次いで、ＤＮＡを本発明に従って発現させて、コードされたタンパク質を作製する。これらの方法は、ＤＮＡ配列の操作のための当技術分野で公知の多数の標準的な技術の例示にすぎず、他の公知の技術も使用することができる。
本発明の細胞及び／又はモジュール式構築物における使用に適した調節タンパク質の全てのバリアント、断片又はホモログは、ＮＯＩの同族結合部位に結合する能力を保持して、ＮＯＩの翻訳がウイルスベクター産生細胞において抑制又は防止される。
結合部位の全てのバリアント断片又はホモログは、同族ＲＮＡ結合タンパク質に結合する能力を保持して、ＮＯＩの翻訳がウイルスベクター産生細胞において抑制又は防止される。
コドン最適化
本発明で使用されるポリヌクレオチド（ベクター産生システムのＮＯＩ及び／又は成分を含む）は、コドン最適化され得る。コドン最適化は、国際公開第１９９９／４１３９７号及び国際公開第２００１／７９５１８号に以前に記載されている。異なる細胞は、特定のコドンの使用が異なる。このコドンバイアスは、細胞型における特定のｔＲＮＡの相対的存在量におけるバイアスに対応する。対応するｔＲＮＡの相対的存在量と一致するように調整されるように配列中のコドンを変化させることによって、発現を増加させることが可能である。同様に、対応するｔＲＮＡが特定の細胞型において稀であることが知られているコドンを意図的に選択することによって、発現を減少させることが可能である。したがって、更なる翻訳制御が利用可能である。
レトロウイルスを含む多くのウイルスは、多数の稀少コドンを使用し、これらを一般的に使用される哺乳動物コドンに対応するように変化させ、目的の遺伝子、例えばＮＯＩの発現又は哺乳動物産生細胞中のパッケージング成分の増加を達成することができる。コドン使用頻度表は、哺乳動物細胞及び様々な他の生物について当技術分野で公知である。
ウイルスベクター成分のコドン最適化には、多数の他の利点がある。それらの配列の変化により、プロデューサ細胞／パッケージング細胞におけるウイルス粒子の集合に必要なウイルス粒子のパッケージング成分をコードするヌクレオチド配列は、それらから除去されたＲＮＡ不安定性配列（ＩＮＳ）を有する。同時に、パッケージング成分のアミノ酸配列コード配列は、配列によってコードされるウイルス成分が同じままであるか、又はパッケージング成分の機能が損なわれないように少なくとも十分に類似するように保持される。レンチウイルスベクターでは、コドン最適化はまた、エクスポートのためのＲｅｖ／ＲＲＥ要件を克服し、最適化された配列をＲｅｖ非依存性にする。コドン最適化はまた、ベクター系内の異なる構築物間（例えば、ｇａｇ－ｐｏｌ及びｅｎｖオープンリーディングフレームにおける重複領域間）の相同組換えを減少させる。したがって、コドン最適化の全体的な効果は、ウイルス力価の顕著な増加及び安全性の改善である。
一実施形態では、ＩＮＳに関連するコドンのみがコドン最適化される。しかしながら、はるかにより好ましい実用的な実施形態では、配列は、いくつかの例外を除いて、例えば、ｇａｇ－ｐｏｌのフレームシフト部位を包含する配列（下記参照）を除いて、それらの全体がコドン最適化される。
レンチウイルスベクターのｇａｇ－ｐｏｌ遺伝子は、ｇａｇ－ｐｏｌタンパク質をコードする２つの重複する読み枠を含む。両方のタンパク質の発現は、翻訳中のフレームシフトに依存する。このフレームシフトは、翻訳中のリボソーム「スリップ」の結果として起こる。このスリップは、少なくとも部分的にはリボソーム失速ＲＮＡ二次構造によって引き起こされると考えられる。このような二次構造は、ｇａｇ－ｐｏｌ遺伝子のフレームシフト部位の下流に存在する。ＨＩＶの場合、重複領域は、ｇａｇの始まりの下流のヌクレオチド１２２２（ヌクレオチド１はｇａｇ ＡＴＧのＡである）からｇａｇの終わり（ｎｔ １５０３）まで延在する。その結果、フレームシフト部位及び２つの読み枠の重複領域にまたがる２８１ ｂｐ断片は、好ましくはコドン最適化されない。この断片を保持することにより、Ｇａｇ－Ｐｏｌタンパク質のより効率的な発現が可能になるであろう。ＥＩＡＶの場合、重複の開始はｎｔ １２６２（ヌクレオチド１はｇａｇ ＡＴＧのＡである）であると解釈され、重複の終了はｎｔ １４６１であると解釈されている。フレームシフト部位及びｇａｇ－ｐｏｌオーバーラップが保存されることを確実にするために、野生型配列はｎｔ １１５６～１４６５に保持されている。
最適なコドン使用頻度からの誘導体が、例えば、好都合な制限部位に適応するために作製される場合があり、保存的なアミノ酸変化がＧａｇ－Ｐｏｌタンパク質に導入される場合がある。
一実施形態では、コドン最適化は、低発現哺乳動物遺伝子に基づく。第３の塩基、場合によっては第２の塩基及び第３の塩基を変更することができる。
遺伝暗号の縮重性に起因して、多数のｇａｇ－ｐｏｌ配列が当業者によって達成され得ることが理解されるであろう。また、コドン最適化されたｇａｇ－ｐｏｌ配列を作製するための出発点として使用することができる多くのレトロウイルスバリアントが記載されている。レンチウイルスのゲノムは非常に多様であり得る。例えば、依然として機能的であるＨＩＶ－１の多くの準種が存在する。これはＥＩＡＶにも当てはまる。これらのバリアントは、形質導入プロセスの特定の部分を強化するために使用され得る。ＨＩＶ－１バリアントの例は、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｅｃｕｒｉｔｙ，ＬＬＣによって運営されているＨＩＶ Ｄａｔａｂａｓｅのｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ－ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖに見出すことができる。ＥＩＡＶクローンの詳細は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖのＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）データベースで見出すことができる。
コドン最適化されたｇａｇ－ｐｏｌ配列に対する戦略は、任意のレトロウイルスに関して使用され得る。これは、ＥＩＡＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＣＡＥＶ、ＶＭＲ、ＳＩＶ、ＨＩＶ－１及びＨＩＶ－２を含む全てのレンチウイルスに適用されるであろう。更に、この方法は、ＨＴＬＶ－１、ＨＴＬＶ－２、ＨＦＶ、ＨＳＲＶ及びヒト内因性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）、ＭＬＶ及び他のレトロウイルス由来の遺伝子の発現を増加させるために使用することができる。
コドン最適化は、ｇａｇ－ｐｏｌ発現をＲｅｖ非依存性にすることができる。しかしながら、レンチウイルスベクターにおける抗ｒｅｖ因子又はＲＲＥ因子の使用を可能にするためには、ウイルスベクター生成系を完全にＲｅｖ／ＲＲＥ非依存性にすることが必要であろう。したがって、ゲノムも改変される必要がある。これは、ベクターゲノム成分を最適化することによって達成される。有利なことには、これらの改変はまた、産生細胞及び形質導入細胞の両方に全ての追加のタンパク質が存在しない、より安全な系の産生をもたらす。
ベクター力価を改善するための改変Ｕ１との組合わせ
ＭＳＤ変異レンチウイルスベクターは、ＬＶ産生中及び標的細胞の両方で異常なスプライシング事象に関与する能力が低下しているため、遺伝子治療ベクターとして使用するために現在の標準的なレンチウイルスベクターよりも好ましい。しかしながら、本発明まで、ＭＳＤ変異ベクターの産生は、ＨＩＶ－１ｔａｔタンパク質（第１及び第２世代のＵ３依存性レンチウイルスベクター）の供給に依存しているか、又は（第３世代ベクターにおいて）ベクターＲＮＡレベルに対するＭＳＤの変異の非安定化効果のために効率が低かった。安全上の理由から、現在の第３世代のＵ３非依存性ＬＶシステムに「再導入」ｔａｔを戻すことを望むことも正当化することもなく、その結果、現在のところ、臨床使用を意図したＭＳＤ変異ベクターの産生力価の低下に対する解決策はない。
本発明者等は、ＭＳＤ変異した第３世代（すなわち、Ｕ３／ｔａｔ非依存性）ＬＶが、産生中にベクターゲノムＲＮＡの５’パッケージング領域に結合するように向けられた改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡの共発現によって高力価に産生され得ることを示す。驚くべきことに、これらの改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、５’Ｒ領域内の５’ｐｏｌｙＡシグナルの存在とは無関係の様式でＭＳＤ変異ＬＶの産生力価を増強できることが示されており、ポリアデニル化を抑制するための改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡの他の使用に対する新規な機構を示している（いわゆるＵ１干渉、［Ｕｉ］）。驚くべきことに、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡをパッケージング領域の重要な配列に標的化すると、ＭＳＤ変異ＬＶ力価が最大に増強されることが示されている。本発明者等はまた、ＭＳＤ変異ＬＶの力価の減少があまり顕著でなく、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡによるそのようなＭＳＤ変異ＬＶバリアントの力価の増強が最大であるような、主要スプライスドナー領域内の新規配列変異を開示する。
本発明者等は、驚くべきことに、内在性配列（スプライスドナー部位）をもはや標的とせず、今やｖＲＮＡ分子内の配列を標的とするように改変されたＵ１ ｓｎＲＮＡに基づく非コードＲＮＡを共発現させることによって、レンチウイルスベクターの出力力価を増強できることを見出した。本実施例で実証されるように、本発明者等は、当該改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡによる主要スプライスドナー領域（主要スプライスドナー及び潜在性スプライスドナー部位を含む）内の変異の減衰を有するレンチウイルスベクターの出力力価の相対的増強が、非変異主要スプライスドナー領域を含む標準レンチウイルスベクターよりも大きいことを示す。
本実施例で実証されるように、減少した力価をもたらす主要スプライスドナー領域（点変異、領域欠失、及び配列置換）内の広範囲の変異型を有するベクターゲノムを、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡと組み合わせて使用することができる。このアプローチは、ベクター産生中に他のベクター成分と共に改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡを共発現させることを含み得る。改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、コンセンサスプライスドナー部位への結合が、ベクターゲノムｖＲＮＡ内の標的配列に相補的な異種配列で置換することによって除去されるように設計される。本発明は、標的配列及び相補性長、発現の設計及び様式を含む、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡの様々な適用様式及び最適な特徴を記載する。
本明細書に記載される本発明の一態様では、ベクターは改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡと組み合わせて使用され得る。これについては以下で更に説明する。
改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡ分子の存在／存在量は、全ＲＮＡの抽出、続いてＤＮＡプライマーを使用したＲＴ－ＰＣＲ又はＲＴ－ｑＰＣＲ（定量的）によって、ベクター産生細胞抽出物又はベクタービリオン内で定量することができる。重要なことに、フォワードプライマーは、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡのみがｑＰＣＲ中に増幅され、内因性Ｕ１ ｓｎＲＮＡは増幅されないように、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡ分子の標的化配列に対して相補性を有するように設計される。
一態様では、本発明は、本明細書に記載の本発明による改変Ｕ１を含むベクタービリオンを提供する。
スプライシング及びポリアデニル化は、特に大部分のタンパク質コード転写物が複数のイントロンを含む高等真核生物において、ｍＲＮＡ成熟のための重要なプロセスである。スプライシングに必要なプレｍＲＮＡ内の要素には、５’スプライスドナーシグナル、分岐点を取り囲む配列及び３’スプライスアクセプタシグナルが含まれる。これらの３つの要素と相互作用するのはスプライソソームであり、これは、Ｕ１ ｓｎＲＮＡを含む５つの小核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）及び関連核タンパク質（ｓｎＲＮＰ）によって形成される。Ｕ１ ｓｎＲＮＡはポリメラーゼＩＩプロモータによって発現され、ほとんどの真核細胞に存在する（Ｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：２０１３－２０２１）。ヒトＵ１ ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）は１６４ｎｔ長であり、４つのステムループからなる明確に定義された構造を有する（Ｗｅｓｔ，Ｓ．，２０１２，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，４０：８４６－８４９）。Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、その５’末端に、エクソン－イントロン接合の５’スプライスドナー部位に広く相補的な短い配列を含む。Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、５’スプライスドナー部位への塩基対形成によって、スプライス部位選択及びスプライソソームアセンブリに関与する。スプライシング外のＵ１ ｓｎＲＮＡの既知の機能は、３’末端ｍＲＮＡプロセシングの調節にある。それは、初期ポリＡシグナル（特にイントロン内）で早期ポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）を抑制する。
ヒトＵ１ ｓｎＲＮＡ（低分子核ＲＮＡ）は１６４ｎｔ長であり、４つのステムループからなる明確に定義された構造を有する（図１参照）。内因性非コードＲＮＡ、Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、イントロンスプライシングの初期段階中に、天然スプライスドナーアニーリング配列（例えば５’－ＡＣＵＵＡＣＣＵＧ－３’）を介してコンセンサス５’スプライスドナー部位（例えば、ＭがＡ又はＣであり、ＲがＡ又はＧである５’－ＭＡＧＧＵＲＲ－３’）に結合する。ステムループＩは、ポリＡ抑制に重要であることが示されているＵ１Ａ－７０Ｋタンパク質に結合する。ステムループＩＩはＵ１Ａタンパク質に結合し、５’－ＡＵＵＵＧＵＧＧ－３’配列はＳｍタンパク質に結合し、これはステムループＩＶと共にＵ１ ｓｎＲＮＡプロセシングに重要である。本明細書で定義されるように、本発明に従って使用するための改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、天然スプライスドナー標的化／アニーリング配列の部位でベクターゲノムｖＲＮＡ分子内の標的配列に相補的な異種配列を導入するように改変される（図１参照）。
本明細書で使用される場合、「改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡ」、「再指向Ｕ１ ｓｎＲＮＡ」、「再標的化Ｕ１ ｓｎＲＮＡ」、「再目的化Ｕ１ ｓｎＲＮＡ」及び「変異Ｕ１ ｓｎＲＮＡ」という用語は、標的遺伝子のスプライシングプロセスを開始するために使用されるコンセンサス５’スプライスドナー部位配列（例えば５’－ＭＡＧＧＵＲＲ－３’）にもはや相補的でないように改変されたＵ１ ｓｎＲＮＡを意味する。したがって、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、スプライスドナー部位配列（例えば５’－ＭＡＧＧＵＲＲ－３’）にもはや相補的でないように改変されたＵ１ ｓｎＲＮＡである。代わりに、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、ＭＳＤ変異レンチウイルスベクターゲノム分子（標的部位）のパッケージング領域内に固有のＲＮＡ配列を有するヌクレオチド配列、すなわちｖＲＮＡのスプライシングに無関係な配列を標的とするか、又はそれに相補的であるように設計される。ＭＳＤ変異レンチウイルスベクターゲノム分子のパッケージング領域内のヌクレオチド配列は、予め選択することができる。したがって、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、その５’末端がＭＳＤ変異レンチウイルスベクターゲノム分子のパッケージング領域内のヌクレオチド配列に相補的であるように改変されたＵ１ ｓｎＲＮＡである。結果として、理論に拘束されることを望むものではないが、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡの５’末端の短い配列との標的部位配列の相補性に基づいて標的部位配列に結合し、したがって、ｖＲＮＡを安定化して、ＭＳＤ変異レンチウイルスベクターの出力ベクター力価を増加させると考えられる。
本明細書で使用される場合、「天然スプライスドナーアニーリング配列」及び「天然スプライスドナーターゲティング配列」という用語は、イントロンのコンセンサス５’スプライスドナー部位に広く相補的な内因性Ｕ１ ｓｎＲＮＡの５’末端の短い配列を意味する。天然スプライスドナーのアニーリング配列は、５’－ＡＣＵＵＡＣＣＵＧ－３’であり得る。
本明細書で使用される場合、「コンセンサス５’スプライスドナー部位」という用語は、スプライス部位選択で使用されるイントロンの５’末端のコンセンサスＲＮＡ配列、例えば配列５’－ＭＡＧＧＵＲＲ－３’を有するコンセンサスＲＮＡ配列を意味する。
本明細書で使用される場合、「ＭＳＤ変異レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列」、「標的配列」及び「標的部位」という用語は、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡを結合／アニーリングするための標的部位として予め選択されたＭＳＤ変異レンチウイルスベクターゲノム分子のパッケージング領域内に特定のＲＮＡ配列を有する部位を意味する。
本明細書で使用される場合、「ＭＳＤ変異レンチウイルスベクターゲノム分子のパッケージング領域」及び「ＭＳＤ変異レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域」という用語は、５’ Ｕ５ドメインの先頭からｇａｇ遺伝子に由来する配列の末端までのＭＳＤ変異レンチウイルスベクターゲノムの５’末端の領域を意味する。したがって、ＭＳＤ変異レンチウイルスベクターゲノム分子のパッケージング領域は、５’ Ｕ５ドメイン、ＰＢＳ要素、ステムループ（ＳＬ）１要素、ＳＬ２要素、ＳＬ３ψ要素、ＳＬ４要素及びｇａｇ遺伝子に由来する配列を含む。レンチウイルスベクター産生中に完全なｇａｇ遺伝子をゲノムにトランスで提供して、複製欠損ウイルスベクター粒子の産生を可能にすることは当技術分野で一般的である。トランスで提供されるｇａｇ遺伝子のヌクレオチド配列は、野生型ヌクレオチドによってコードされる必要はなく、コドン最適化されていてもよく、重要なことに、トランスで提供されるｇａｇ遺伝子の主な属性は、ｇａｇ及びｇａｇｐｏｌタンパク質をコードし、その発現を指示することである。したがって、レンチウイルスベクター産生中に完全なｇａｇ遺伝子がトランスで提供される場合、「レンチウイルスベクターゲノム分子のパッケージング領域」という用語は、５’ Ｕ５ドメインの開始からＳＬ３ψ要素の「コア」パッケージングシグナルまでのＭＳＤ変異レンチウイルスベクターゲノム分子の５’末端の領域、及びＡＴＧコドン（ＳＬ４内に存在する）からベクターゲノム上に存在する残りのｇａｇヌクレオチド配列の末端までの天然ｇａｇヌクレオチド配列を意味し得ることが当業者によって理解されるであろう。
本明細書で使用される場合、「ｇａｇ遺伝子に由来する配列」という用語は、ベクターゲノムに存在し得る、例えば残存し得る、ＡＴＧコドン～ヌクレオチド６８８に由来するｇａｇ遺伝子の任意の天然配列を意味する（Ｋｈａｒｙｔｏｎｃｈｙｋ，Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，２０１８，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４３０：２０６６－７９）。
本明細書で使用される場合、「天然スプライスドナーアニーリング配列を包含するＵ１ ｓｎＲＮＡの最初の１１ヌクレオチド内に異種配列を導入すること」、「当該異種配列を３～１１位の９つのヌクレオチド内に導入すること」及び「Ｕ１ ｓｎＲＮＡの５’末端の最初の１１ヌクレオチド内に異種配列を導入すること」という用語は、Ｕ１ ｓｎＲＮＡの最初の１１ヌクレオチド又は３～１１位の９つのヌクレオチドを、当該異種配列で全部又は一部置換すること、あるいはＵ１ ｓｎＲＮＡの最初の１１ヌクレオチド又は３～１１位の９つのヌクレオチドを改変して、当該異種配列と同じ配列を有すること、を含む。
本明細書で使用される場合、「天然スプライスドナーアニーリング配列内に異種配列を導入すること」及び「Ｕ１ ｓｎＲＮＡの５’末端の天然スプライスドナーアニーリング配列内に異種配列を導入すること」という用語は、天然スプライスドナーアニーリング配列の全部又は一部を、当該異種配列と置き換えること、あるいは天然スプライスドナーアニーリング配列を改変して、当該異種配列と同じ配列を有すること、を含む。
本明細書で使用される場合、「レンチウイルスベクターの力価を増強する」という用語は、「レンチウイルスベクターの力価を増加させる」、「レンチウイルスベクターの力価を回復させる」、及び「レンチウイルスベクターの力価を改善する」を含む。
したがって、一実施形態では、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、ＭＳＤ変異レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列に結合するように改変されている。
いくつかの実施形態では、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、内因性Ｕ１ ｓｎＲＮＡに対して５’末端で改変されて、ＭＳＤ変異レンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域内のヌクレオチド配列に相補的な異種配列を導入する。
いくつかの実施形態では、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、内因性Ｕ１ ｓｎＲＮＡに対して５’末端が改変されて、ＭＳＤ変異レンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域内のヌクレオチド配列に相補的な異種配列を天然スプライスドナーアニーリング配列内に導入する。
改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、内因性Ｕ１ ｓｎＲＮＡに対して５’末端で改変されて、天然スプライスドナーアニーリング配列を包含する配列を、当該ヌクレオチド配列に相補的な異種配列で置換し得る。
改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡバリアントであり得る。本発明に従って改変されるＵ１ ｓｎＲＮＡバリアントは、天然に存在するＵ１ ｓｎＲＮＡバリアント、Ｕ１－７０Ｋタンパク質結合を除去するステムループＩ領域内の変異を含むＵ１ ｓｎＲＮＡバリアント、又はＵ１Ａタンパク質結合を除去するステムループＩＩ領域内の変異を含むＵ１ ｓｎＲＮＡバリアントであり得る。Ｕ１－７０Ｋタンパク質結合を除去するステムループＩ領域内の変異を含むＵ１ ｓｎＲＮＡバリアントは、Ｕ１＿ｍ１又はＵ１＿ｍ２、好ましくはＵ１Ａ＿ｍ１又はＵ１Ａ＿ｍ２であり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、本明細書に記載のＵ１＿２５６配列の主要Ｕ１ ｓｎＲＮＡ配列［クローバーリーフ］（ｎｔ ４１０～５６２）と少なくとも７０％の同一性（適切な少なくとも７５％、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明の改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、本明細書に記載のＵ１＿２５６配列の主なＵ１ ｓｎＲＮＡ配列［クローバーリーフ］（ｎｔ ４１０～５６２）を含む。Ｕ１＿２５６配列（配列番号１５）の主要なＵ１ ｓｎＲＮＡ配列［クローバーリーフ］（ｎｔ ４１０－５６２）は以下の通りである。
ＧＣＡＧＧＧＧＡＧＡＴＡＣＣＡＴＧＡＴＣＡＣＧＡＡＧＧＴＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＧＧＣＧＡＧＧＣＴＴＡＴＣＣＡＴＴＧＣＡＣＴＣＣＧＧＡＴＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＣＴＧＣＧＡＴＴＴＣＣＣＣＡＡＡＴＧＴＧＧＧＡＡＡＣＴＣＧＡＣＴＧＣＡＴＡＡＴＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧＧＧＧＧＡＣＴＧＣＧＴＴＣＧＣＧＣＴＴＴＣＣＣＣＴＧ．（配列番号６６）
いくつかの好ましい実施形態では、天然スプライスドナーアニーリング配列を包含するＵ１ ｓｎＲＮＡの最初の１１ヌクレオチドは、ＭＳＤ変異レンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域内のヌクレオチド配列に相補的な異種配列で全部又は一部置換され得る。適切には、１～１１（好適には、２～１１、３～１１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１）、Ｕ１ ｓｎＲＮＡの最初の１１ヌクレオチドの核酸は、ＭＳＤ変異レンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域内のヌクレオチド配列に相補的な異種配列で置き換えられる。
いくつかの実施形態では、天然スプライスドナーアニーリング配列は、ＭＳＤ変異レンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域内のヌクレオチド配列に相補的な異種配列で全部又は一部置換され得る。適切には、１～１１（好適には、２～１１、３～１１、５～１１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１）、天然スプライスドナーアニーリング配列の核酸は、ＭＳＤ変異レンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域内のヌクレオチド配列に相補的な異種配列で置き換えられる。好ましい実施形態では、天然スプライスドナーアニーリング配列全体が、ＭＳＤ変異レンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域内のヌクレオチド配列に相補的な異種配列で置き換えられ、すなわち、天然スプライスドナーアニーリング配列（例えば５’－ＡＣＵＵＡＣＣＵＧ－３’）は、本明細書に記載の異種配列で完全に置き換えられる。
いくつかの実施形態では、ＭＳＤ変異レンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域内のヌクレオチド配列に相補的な異種配列は、当該ヌクレオチド配列に対して相補性の少なくとも７ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＤ変異レンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域内のヌクレオチド配列に相補的な異種配列は、当該ヌクレオチド配列に対して相補性の少なくとも９ヌクレオチドを含む。好ましくは、本発明で使用するための異種配列は、当該ヌクレオチド配列に対して相補性の１５個のヌクレオチドを含む。
適切には、本発明で使用するための異種配列は、７～２５（好適には、７～２０、７～１５、９～１５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５）ヌクレオチドを含み得る。
適切には、本発明で使用するための異種配列は、２５ヌクレオチドを含み得る。
いくつかの実施形態では、ＭＳＤ変異レンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域内のヌクレオチド配列は、５’ Ｕ５ドメイン、ＰＢＳ要素、ＳＬ１要素、ＳＬ２要素、ＳＬ３ψ要素、ＳＬ４要素及び／又はｇａｇ遺伝子に由来する配列内に位置する。適切には、ＭＳＤ変異レンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域内のヌクレオチド配列は、（１又は複数の）ＳＬ１、ＳＬ２及び／又はＳＬ３ψ要素内に位置する。いくつかの好ましい実施形態では、ＭＳＤ変異レンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域内のヌクレオチド配列は、（１又は複数の）ＳＬ１及び／又はＳＬ２要素内に位置する。いくつかの特定の好ましい実施形態では、ＭＳＤ変異レンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域内のヌクレオチド配列は、ＳＬ１内に位置する。
いくつかの実施形態では、ＭＳＤ変異レンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域内のヌクレオチド配列は、少なくとも７ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＭＳＤ変異レンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域内のヌクレオチド配列は、少なくとも９ヌクレオチドを含む。適切には、ＭＳＤ変異レンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域内のヌクレオチド配列は、７～２５（適切には、７～２０、７～１５、９～１５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５）ヌクレオチドを含む。
好ましくは、ＭＳＤ変異レンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域内のヌクレオチド配列は、１５ヌクレオチドを含む。
ＭＳＤ変異レンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域内のヌクレオチド配列への本明細書に記載の改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡの結合は、本明細書に記載の改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡの非存在下でのレンチウイルスベクター産生と比較して、レンチウイルスベクター産生中のレンチウイルスベクターの力価を増強し得る。したがって、本明細書に記載の改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡの存在下でのレンチウイルスベクターの産生は、本明細書に記載の改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡの非存在下でのレンチウイルスベクター産生と比較してレンチウイルスベクターの力価を高める。レンチウイルスベクター力価の測定に適したアッセイは、本明細書に記載の通りである。適切には、レンチウイルスベクターの産生は、当該改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡと、ｇａｇ、ｅｎｖ、ｒｅｖ及びレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムを含むベクター成分との同時発現を含む。レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムは、ＭＳＤ－２ＫＯ ＲＮＡゲノムであり得る。いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクター力価の増強は、機能的５’ＬＴＲポリＡ部位の存在下又は非存在下において起こる。いくつかの実施形態では、本発明の改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡによって媒介されるレンチウイルスベクター力価の増強は、ベクターゲノムの５’ＬＴＲにおけるポリＡ部位抑制とは無関係である。
いくつかの実施形態では、ＭＳＤ変異レンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域内のヌクレオチド配列への本明細書に記載の改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡの結合は、レンチウイルスベクター産生中のレンチウイルスベクターの力価を、本明細書に記載の改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡの非存在下でのレンチウイルスベクター産生と比較して少なくとも３０％増加させ得る。適切には、ＭＳＤ変異レンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域内のヌクレオチド配列への本明細書に記載の改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡの結合は、本明細書に記載の改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡの非存在下でのＭＳＤ変異レンチウイルスベクター産生と比較して、製造中のＭＳＤ変異レンチウイルスベクターの力価を少なくとも３５％（適切には、少なくとも４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、５５０％、６００％、６５０％、７００％、７５０％、８００％、８５０％、９００％、９５０％、１，０００％、２，０００％、５，０００％、又は１００００％）増加させ得る。
本明細書に記載の改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、（ａ）改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡに結合するためのＭＳＤ変異レンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域内の標的部位（予め選択されたヌクレオチド部位）を選択することと、（ｂ）天然スプライスドナーアニーリング配列（例えば５’－ＡＣＵＵＡＣＣＵＧ－３’）内で、Ｕ１ ｓｎＲＮＡの５’末端に、工程（ａ）で選択された予め選択されたヌクレオチド部位に相補的な異種配列を導入することと、とによって設計され得る。
分子生物学における従来の技術を使用した内因性Ｕ１ ｓｎＲＮＡの５’末端における天然スプライスドナーアニーリング配列（例えば５’－ＡＣＵＵＡＣＣＵＧ－３’）内の、又はその代わりの標的部位に相補的な異種配列の導入は、当業者の能力の範囲内である。一般的に言えば、適切な日常的方法には、相同組換えによる定方向突然変異誘発又は置換が含まれる。
分子生物学における従来の技術を使用して、標的部位に相補的な異種配列と同じ配列を有するように内因性Ｕ１ ｓｎＲＮＡの５’末端の天然スプライスドナーアニーリング配列（例えば５’－ＡＣＵＵＡＣＣＵＧ－３’）を改変することは、当業者の能力の範囲内である。例えば、適切な方法には、定方向突然変異誘発又はランダム変異誘発とそれに続く本明細書に記載の改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡを提供する変異の選択が含まれる。
本明細書に記載の改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、当技術分野で一般的に公知の方法に従って製造することができる。例えば、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、化学合成又は組換えＤＮＡ／ＲＮＡ技術によって製造することができる。
一態様では、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、異なるヌクレオチド配列上、例えば異なるプラスミド上にあり得る。
従来の分子生物学技術及び細胞生物学技術を使用して、本明細書に記載の改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を細胞に導入することは、当業者の能力の範囲内である。
改善されたＴＲＡＰ結合部位及びＫｏｚａｋ配列の組合せ
上述のように、ＴＲＩＰシステムは、国際公開第２０１５／０９２４４０号に記載されており、ベクター産生中に産生細胞におけるＮＯＩの発現を抑制する方法を提供する。ＴＲＡＰ結合配列（例えばＴＲＡＰ－ｔｂｓ）相互作用は、組織特異的プロモータを含む構成的及び／又は強力なプロモータが導入遺伝子を駆動することが望ましい場合、特に、産生細胞における導入遺伝子タンパク質の発現が、ベクターの力価の低下をもたらし、及び／又は導入遺伝子由来タンパク質のウイルスベクター送達に起因してインビボで免疫応答を誘発する場合、レトロウイルスベクターの産生のための導入遺伝子タンパク質抑制系の基礎を形成する（Ｍａｕｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．（２０１７）Ｍａｒ ２７；８）。
一実施形態では、ヌクレオチド配列は、トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）結合部位又はその一部を更に含む。
一態様では、本発明は、目的のヌクレオチド（導入遺伝子）及びトリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）結合部位を含む核酸配列であって、ＴＲＡＰ結合部位が導入遺伝子開始コドンＡＴＧと重複する、核酸配列を提供する。
Ｋｏｚａｋ配列／重複Ｋｏｚａｋ配列に関する本明細書の任意の開示は、開始コドンのＡＴＧ及びそれとの重複を指す同等の態様に（適切な場合）等しく適用可能である。
別の態様では、本発明は、目的のヌクレオチド及びＫｏｚａｋ配列を含む核酸配列であって、当該Ｋｏｚａｋ配列がトリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）結合部位の一部を含む、核酸配列を提供する。
一態様では、本発明は、目的のヌクレオチド（導入遺伝子）及びＴＲＡＰ結合部位を含む核酸配列であって、ＴＲＡＰ結合部位は導入遺伝子開始コドンＡＴＧの一部を含むか、又はその逆である核酸配列を提供する。
一実施形態では、ヌクレオチド配列は、本明細書に記載のｔｂｓ又はその一部、マルチクローニング部位（ＭＣＳ）及び本明細書に記載のＫｏｚａｋ配列を更に含み、当該ＭＣＳは、ｔｂｓ又はその一部の下流かつＫｏｚａｋ配列の上流に位置する。好適には、ｔｂｓ又はその一部及びＫｏｚａｋ配列は重複しない。
本発明のいくつかの実施形態では、目的のヌクレオチドは、ｔｂｓ又はその一部に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、目的のヌクレオチドは、ＴＲＡＰを欠く標的細胞において翻訳される。
ｔｂｓ又はその一部は、目的のヌクレオチドの翻訳がウイルスベクター産生細胞において抑制又は防止されるように、ＴＲＡＰと相互作用することができる。
したがって、ウイルスベクター産生細胞においてＮＯＩの翻訳を抑制する方法であって、本発明のヌクレオチド配列及びＴＲＡＰをコードする核酸配列をウイルスベクター産生細胞に導入することを含み、ＴＲＡＰがＴＲＡＰ結合部位又はその一部に結合し、それによりＮＯＩの翻訳を抑制する、方法が提供される。
表１は、本発明で使用され得る配列を示し、ＫはＴ又はＧであり得、「Ｒ」は、配列中のその位置にプリン（すなわち、Ａ又はＧ）を指定すると理解されるべきであり、「Ｖ」は、Ｇ、Ａ、又はＣから任意のヌクレオチドを指定すると理解されるべきであり、「Ｎ」は、配列中のその位置に任意のヌクレオチドを指定すると理解されるべきである。例えば、これはＧ、Ａ、Ｔ、Ｃ又はＵであり得る。ＴＲＡＰ結合部位（ｔｂｓ）配列又は３’ｔｂｓ配列はイタリック体で示され、マルチクローニング部位（ＭＣＳ）は下線で示され、Ｋｏｚａｋ配列は太字で示される。
Figure 2023513303000002
Figure 2023513303000003
Figure 2023513303000004
Figure 2023513303000005
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Figure 2023513303000007
Figure 2023513303000008
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Figure 2023513303000010
Figure 2023513303000011
トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）は、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）において広く特徴付けられている細菌タンパク質である。ＴＲＡＰは、国際公開第２０１５／０９２４４０号に記載されている。
細菌遺伝子配列は哺乳動物細胞での発現に最適でない可能性が高いため、ＴＲＡＰオープンリーディングフレームは哺乳動物（例えばホモサピエンス）細胞での発現にコドン最適化され得る。配列はまた、潜在的な不安定な配列及びスプライシング部位を除去することによって最適化され得る。ＴＲＡＰタンパク質上にＣ末端発現されたＨＩＳタグの使用は、翻訳抑制に関して利益をもたらすようであり、使用されていてもよい。このＣ末端ＨＩＳタグは、真核細胞内のＴＲＡＰの溶解性又は安定性を改善し得るが、改善された機能的利益を排除することはできない。それにもかかわらず、ＨＩＳタグ付き及び非タグ付きＴＲＡＰの両方が、導入遺伝子発現の堅固な抑制を可能にした。ＴＲＡＰ転写ユニット内の特定のシス作用性配列も最適化され得、例えば、ＥＦ１αプロモータ駆動構築物は、一過性トランスフェクションの状況においてＣＭＶプロモータ駆動構築物と比較して、ＴＲＡＰプラスミドの低投入でより良好な抑制を可能にする。
一実施形態では、本発明で使用するためのＴＲＡＰは細菌に由来する。
本発明の一実施形態では、ＴＲＡＰは、バチルス種、例えばバチルス・スブチリスに由来する。例えば、ＴＲＡＰは、配列番号９４に示される配列を含み得る。
本発明の好ましい実施形態では、配列番号９４は、６つのヒスチジンアミノ酸（ＨＩＳｘ６タグ）でＣ末端タグ付けされている。
代替の実施形態では、ＴＲＡＰはアミノモナス・パウシボランス（Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）に由来する。例えば、ＴＲＡＰは、配列番号９５に示される配列を含み得る。
代替的な実施形態では、ＴＲＡＰは、デスルホトマキュラム・ヒドロサーマレに由来する。例えば、ＴＲＡＰは、配列番号９６に示される配列を含み得る。
代替的な実施形態では、ＴＲＡＰはＢ．ステアロサーモフィルスに由来する。例えば、ＴＲＡＰは、配列番号９７に示される配列を含み得る。
代替的な実施形態では、ＴＲＡＰはＢ．ステアロサーモフィルスＳ７２Ｎに由来する。例えば、ＴＲＡＰは、配列番号９８に示される配列を含み得る。
代替の実施形態では、ＴＲＡＰはＢ．ハロデュランスに由来する。例えば、ＴＲＡＰは、配列番号９９に示される配列を含み得る。
代替的な実施形態では、ＴＲＡＰは、カルボキシドータームス・ハイドロゲンフォルマンに由来する。例えば、ＴＲＡＰは、配列番号１００に示される配列を含み得る。
一実施形態では、ＴＲＡＰは、トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質遺伝子ファミリｍｔｒＢ（例えばＮＣＢＩ保存ドメインデータベース＃ｃｌ０３４３７を有するＴｒｐＢＰスーパーファミリ）によってコードされる。
好ましい実施形態では、ＴＲＡＰは、６つのヒスチジンアミノ酸（ＨＩＳｘ６タグ）でＣ末端タグ付けされている。
好ましい実施形態では、ＴＲＡＰは、配列番号９４～１００のいずれかと５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％又は１００％の同一性を有し、ＲＮＡ結合部位と相互作用して、作動可能に連結されたＮＯＩの発現がウイルスベクター産生細胞において改変される、例えば抑制又は防止され得る、アミノ酸配列を含む。
好ましい実施形態では、ＴＲＡＰは、配列番号９４～１００のいずれかと少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％の同一性を有し、ＲＮＡ結合部位と相互作用して、作動可能に連結されたＮＯＩの発現がウイルスベクター産生細胞において改変される、例えば抑制又は防止され得る、アミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、ＴＲＡＰは、ＲＮＡ結合部位と相互作用して、作動可能に連結されたＮＯＩの発現がウイルスベクター産生細胞において改変される、例えば抑制又は防止され得る、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされ得る。例えば、ＴＲＡＰは、配列番号９４～１００のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされ得る。
本発明で使用するためのＴＲＡＰの全てのバリアント、断片又はホモログは、ＮＯＩ（マーカー遺伝子であり得る）の翻訳がウイルスベクター産生細胞において抑制又は防止されるように、本明細書に記載のＴＲＡＰ結合部位に結合する能力を保持する。
ＴＲＡＰ結合部位
「結合部位」という用語は、特定のタンパク質と相互作用することができる核酸配列として理解されるべきである。
ＴＲＡＰに結合することができるコンセンサスＴＲＡＰ結合部位配列が複数回繰り返される（例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２回以上）［ＫＡＧＮＮ］であり、そのような配列は天然のｔｒｐオペロンに見出される。天然の状況では、時折、ＡＡＧＮＮが許容され、時折、更なる「スペーシング」Ｎヌクレオチドが機能的配列をもたらす。インビトロ実験は、ＴＲＡＰ－ＲＮＡ結合のために少なくとも６回以上のコンセンサス反復が必要であることを実証している（Ｂａｂｉｔｚｋｅ Ｐ，Ｙ．Ｊ．，Ｃａｍｐａｎｅｌｌｉ Ｄ．（１９９６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７８（１７）：５１５９－５１６３）。したがって、好ましくは、一実施形態では、ｔｂｓ内に６つ以上の連続した［ＫＡＧＮ≧２］配列が存在し、ＫはＤＮＡ中のＴ又はＧ及びＲＮＡ中のＵ又はＧであり得る。
ＲＮＡ結合タンパク質としてのＴＲＡＰの場合、好ましくは、ＴＲＩＰ系は、少なくとも８回のＫＡＧＮＮ反復を含有するｔｂｓ配列と最大限に機能するが、７回の反復を使用して、依然として強固な導入遺伝子抑制を得ることができ、６回の反復を使用して、ベクターの力価を救済することができるレベルまで導入遺伝子を十分に抑制することができる。ＫＡＧＮＮコンセンサス配列は、ＴＲＡＰ媒介抑制を維持するために変更され得るが、好ましくは、選択された正確な配列は、非抑制状態において高レベルの翻訳を確実にするために最適化され得る。例えば、ｔｂｓ配列は、ＴＲＡＰの非存在下で（すなわち、標的細胞において）ｍＲＮＡの翻訳効率を妨害し得るスプライシング部位、不安定な配列又はステムループを除去することによって最適化され得る。所与のｔｂｓのＫＡＧＮＮ反復の構成に関して、ＫＡＧ反復間のＮ個の「間隔」ヌクレオチドの数は、好ましくは２である。しかし、少なくとも２つのＫＡＧ反復の間に３つ以上のＮスペーサを含むｔｂｓは許容され得る（インビトロ結合試験によって判断されるように、３つのＮを含有する反復の５０％もの数が、機能的ｔｂｓをもたらし得る；Ｂａｂｉｔｚｋｅ Ｐ，Ｙ．Ｊ．，Ｃａｍｐａｎｅｌｌｉ Ｄ．（１９９６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７８（１７）：５１５９－５１６３）。実際、１１ｘ ＫＡＧＮＮ ｔｂｓ配列は、ＫＡＧＮＮＮ反復との最大３回の置換を許容し、依然としてＴＲＡＰ結合と連携していくつかの潜在的に有用な翻訳阻止活性を保持し得ることが示されている。
本発明の一実施形態において、ＴＲＡＰ結合部位又はその一部は、配列ＫＡＧＮ≧２（例えば、ＫＡＧＮ２－３）を含む。したがって、誤解を避けるために、このｔｂｓ又はその一部は、例えば、以下の反復配列：ＵＡＧＮＮ、ＧＡＧＮＮ、ＴＡＧＮＮ、ＵＡＧＮＮＮ、ＧＡＧＮＮＮ、又はＴＡＧＮＮＮのいずれかを含む。
「Ｎ」は、配列中のその位置の任意のヌクレオチドを指定すると理解されるべきである。例えば、これはＧ、Ａ、Ｔ、Ｃ又はＵであり得る。そのようなヌクレオチドの数は、好ましくは２であるが、最大３個、例えば１、２又は３個であり、１１ｘ反復ｔｂｓのＫＡＧ反復又はその一部は、３個の間隔のヌクレオチドによって分離され得、依然として翻訳抑制をもたらすいくらかのＴＲＡＰ結合活性を保持し得る。好ましくは、翻訳抑制をもたらす最大ＴＲＡＰ結合活性を保持するために、１１ｘ反復ｔｂｓ又はその一部において１つ以下のＮ３スペーサが使用されるであろう。
別の実施形態では、ｔｂｓ又はその一部は、ＫＡＧＮ≧２の複数の反復（例えば、ＫＡＧＮ２－３の複数の反復）を含む。
別の実施形態では、ｔｂｓ又はその一部は、配列ＫＡＧＮ２の複数の反復を含む。
別の実施形態では、ｔｂｓ又はその一部は、ＫＡＧＮ≧２の少なくとも６回の反復（例えば、ＫＡＧＮ２－３の少なくとも６回の反復）を含む。
別の実施形態では、ｔｂｓ又はその一部は、ＫＡＧＮ２の少なくとも６回の反復を含む。例えば、ｔｂｓ又はその一部は、ＫＡＧＮ２の６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回又はそれを超える反復を含み得る。例えば、ｔｂｓ又はその一部は、配列番号１２５～１３６又は１３９のいずれか１つを含み得る。
別の実施形態では、ｔｂｓ又はその一部は、ＫＡＧＮ≧２の少なくとも８回の反復（例えば、ＫＡＧＮ２－３の少なくとも８回の反復）を含む。例えば、ｔｂｓ又はその一部は、配列番号１２５、１２６、１３１～１３４、１３７～２４のいずれか１つを含み得る。
好ましくは、ｔｂｓ又はその一部に存在するＫＡＧＮＮＮ反復の数は１以下である。例えば、ｔｂｓ又はその一部は、配列番号１２５、１２６、１３１～１３４、１３６～１４１のいずれか１つを含み得る。
別の実施形態では、ｔｂｓ又はその一部は、ＫＡＧＮ≧２の１１回の反復（例えば、ＫＡＧＮ２－３の１１回の反復）を含む。好ましくは、このｔｂｓ又はその一部に存在するＫＡＧＮＮＮ反復の数は３以下である。例えば、ｔｂｓ又はその一部は、配列番号１２５、１２６、１３１、１３７～１３９のいずれか１つを含み得る。
別の実施形態では、ｔｂｓ又はその一部は、ＫＡＧＮ≧２の１２回の反復（例えば、ＫＡＧＮ２－３の１２回の反復）を含む。
好ましい実施形態では、ｔｂｓ又はその一部は、ＫＡＧＮ２の８～１１反復（例えば、ＫＡＧＮ２の８回、９回、１０回又は１１回の反復）を含む。例えば、ｔｂｓ又はその一部は、配列番号１２５、１２６、１３１～１３４、１３７～１４１のいずれか１つを含み得る。
一実施形態において、ＴＲＡＰ結合部位又はその一部は、配列番号１２５～１４１のいずれかを含み得る。
例えば、ＴＲＡＰ結合部位又はその一部は、配列番号１２５又は配列番号１２６に示される配列を含み得る。
「ＫＡＧＮ≧２の反復」とは、一般的なＫＡＧＮ≧２（例えば、ＫＡＧＮ２－３）モチーフが繰り返されるとして理解される。このモチーフの基準を満たす異なるＫＡＧＮ≧２配列を連結して、ｔｂｓ又はその一部を構成してもよい。この可能性は定義に含まれるが、得られたｔｂｓ又はその一部が、このモチーフの要件を満たすただ１つの配列の反復に限定されることは意図されていない。例えば、「ＫＡＧＮ≧２の６反復」には、配列番号１２７～１３０に示される配列が含まれるが、これらに限定されない。
１つのＫＡＧＮＮＮ反復及び７つのＫＡＧＮＮ反復を含む８反復ｔｂｓ又はその一部は、ＴＲＡＰ媒介抑制活性を保持する。１又は複数のＫＡＧＮＮＮ反復を含む８未満反復ｔｂｓ配列又はその一部（例えば７又は６反復ｔｂｓ配列又はその一部）は、より低いＴＲＡＰ媒介抑制活性を有し得る。したがって、８未満の反復が存在する場合、ｔｂｓ又はその一部がＫＡＧＮＮ反復のみを含むことが好ましい。
ＫＡＧＮＮ反復コンセンサスにおいて使用するための好ましいヌクレオチドは、ＮＮスペーサ位置、第１のＮＮスペーサ位置のピリミジン、ＮＮスペーサ位置の両方のピリミジン、Ｋ位置のＧの少なくとも１つにおけるピリミジンである。
また、ＮＮスペーサ位置がＡＡ（すなわち、ＴＡＧＡＡはコンセンサス配列中の反復として使用されないことが好ましい）である場合、ＧはＫ位置で用いられることが好ましい。
「相互作用することができる」とは、核酸結合部位（例えば、ｔｂｓ又はその一部）が、細胞、例えば真核生物ウイルスベクター産生細胞において遭遇する条件下で、タンパク質、例えばＴＲＡＰに結合することができると理解されるべきである。ＴＲＡＰ等のＲＮＡ結合タンパク質とのそのような相互作用は、核酸結合部位（例えば、ｔｂｓ又はその一部）が作動可能に連結されているＮＯＩの翻訳の抑制又は防止をもたらす。
「作動可能に連結された」とは、記載された構成要素が意図された方法で機能することを可能にする関係にあることを理解されたい。したがって、ＮＯＩに作動可能に連結された本発明で使用するためのｔｂｓ又はその一部は、ＴＲＡＰがｔｂｓ又はその一部に結合したときにＮＯＩの翻訳が改変されるように配置される。
所与のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のＮＯＩ翻訳開始コドンの上流にＴＲＡＰと相互作用することができるｔｂｓ又はその一部を配置することにより、そのＯＲＦに由来するｍＲＮＡの特異的翻訳抑制が可能になる。ｔｂｓ又はその一部と翻訳開始コドンとを分離するヌクレオチドの数は、抑制の程度に影響を及ぼすことなく、例えば０～３４ヌクレオチドで変動し得る。更なる例として、０～１３ヌクレオチドを使用して、ＴＲＡＰ結合部位又はその一部と翻訳開始コドンとを分離することができる。
ｔｂｓ又はその一部は、マルチシストロニックｍＲＮＡにおけるＮＯＩの翻訳を抑制するために、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の下流に配置され得る。実際、これは、ｔｂｓ結合ＴＲＡＰが４０Ｓリボソームの通過を阻止し得るという更なる証拠を提供し、ＩＲＥＳ要素は、完全な翻訳複合体が形成される前に、ＣＡＰ非依存的様式で４０ＳリボソームサブユニットをｍＲＮＡに隔離するように機能する（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｓ．（２０１２）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０（１１）：５５８－５６６を参照）。したがって、ＴＲＩＰシステムは、ウイルスベクターゲノムから発現された単一ｍＲＮＡから複数のオープンリーディングフレームを抑制することが可能である。これは、特に全ての導入遺伝子産物がベクターの力価にある程度悪影響を及ぼし得る場合に、複数の治療遺伝子をコードするベクターを作製するときのＴＲＩＰシステムの有用な特徴となる。
一実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＩＲＥＳとｔｂｓ又はその一部との間にスペーサ配列を含む。ＩＲＥＳは、「内部リボソーム進入部位」という小見出しの下で本明細書に記載されるＩＲＥＳであり得る。スペーサ配列は、０～３０ヌクレオチド長、好ましくは１５ヌクレオチド長であり得る。スペーサは、配列番号１５１～１５７のいずれか１つで定義された配列を含み得、好ましくは、スペーサは、配列番号１５１で定義された配列を含む。
一実施形態では、ＩＲＥＳとｔｂｓ又はその一部との間のスペーサ配列は、ｔｂｓ又はその一部の３’末端及びＮＯＩの下流開始コドンから３又は９ヌクレオチドである。
一実施形態では、ｔｂｓ又はその一部は、ＩＩ型制限酵素部位を欠く。好ましい実施形態では、ｔｂｓ又はその一部は、ＳａｐＩ制限酵素部位を欠く。
いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＲＲＥ配列又はその機能的置換体を更に含む。
重複するＫｏｚａｋ配列及びＴＲＡＰ結合部位配列
本発明者等は、驚くべきことに、非重複ｔｂｓ及びＫｏｚａｋ配列の使用と比較して、ｔｂｓ又はその一部の３’末端内にＫｏｚａｋ配列を「隠す」ことによって、抑制レベルの改善が達成され得ることを見出した（重複ｔｂｓ及びＫｏｚａｋ配列の使用；図１９Ｂ及び図１９Ｃを参照されたい）。更に、試験した重複Ｋｏｚａｋ及びｔｂｓ配列の全てが予想外に効率的なレベルの翻訳開始をもたらし、すなわち、試験した重複配列は、ＴＲＡＰの非存在下で非重複Ｋｏｚａｋ及びｔｂｓ配列と同様のレベルの導入遺伝子発現を提供した。理論に拘束されることを望むものではないが、抑制レベルの改善は、ｔｂｓ又はその一部がＫｏｚａｋ配列と重複する場合のＴＲＡＰ－ｔｂｓ複合体による導入遺伝子開始コドンの閉塞の改善に起因し得る。
「Ｋｏｚａｋ配列」という用語は、翻訳開始部位としてリボソームによって認識される真核生物ｍＲＮＡのコンセンサス配列として理解されるべきである。Ｋｏｚａｋ配列は、ＤＮＡ中のＡＴＧ開始コドン（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｃｏｄｏｎ、ｓｔａｒｔ ｃｏｄｏｎ）（ｍＲＮＡ中のＡＵＧ）を含む。真核生物ｍＲＮＡに存在する正確なＫｏｚａｋ配列は翻訳開始の効率を決定する、すなわち特定のＫｏｚａｋ配列は効率的な翻訳開始をもたらさない。
完全Ｋｏｚａｋ配列は、典型的には、ＤＮＡのコンセンサス配列（ｇｃｃ）ｇｃｃＲｃｃＡＴＧＧ及びＲＮＡのコンセンサス配列（ｇｃｃ）ｇｃｃＲｃｃＡＵＧＧを有すると理解され、ここで小文字は、この位置の塩基が変化し得る位置の最も一般的な塩基を示し、大文字は、この位置における高度に保存された塩基を示し、「Ｒ」は、プリン（すなわち、Ａ又はＧ）が典型的にはこの位置で最適であることを示し、括弧（ｇｃｃ）内の配列は不確かな意味である。Ｔ／Ｕは、一般に、開始コドンの上流にあるＫｏｚａｋ配列コンセンサスの全ての位置で最も好ましくないヌクレオチドである。
完全なＫｏｚａｋ配列の最初の３つの塩基は不確かな重要性であるため、Ｋｏｚａｋ配列は、本明細書で「拡張Ｋｏｚａｋ配列」と呼ばれるコンセンサス配列、ＤＮＡのＧＮＮＲＶＶＡＴＧＧ（配列番号１０３）及びＲＮＡのＧＮＮＲＶＶＡＵＧＧを有すると理解することもでき、「Ｒ」は配列中のその位置にプリン（すなわち、Ａ又はＧ）を指定すると理解されるべきであり、「Ｖ」はＧ、Ａ、又はＣから任意のヌクレオチドを指定すると理解されるべきであり、「Ｎ」は配列中のその位置に任意のヌクレオチドを指定すると理解されるべきである。例えば、「Ｎ」は、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ又はＵであり得る。位置－１及び「Ｇ」及び位置＋３（ＡＴＧの「Ａ」が位置０であるのに対して）の「Ｒ」は、Ｋｏｚａｋ強度の観点から最も重要な位置と考えられることに留意されたい。しかし、導入遺伝子配列中の＋３位における「Ｇ」の存在は、コードされているＯＲＦに依存するため、本明細書の目的のために、＋３位は「コア」Ｋｏｚａｋ配列の一部としては見なされていない。
フルＫｏｚａｋ配列の最初の６つの位置に見出される塩基は、それらの位置に任意の塩基を見出すことができるように変化する（上記（ｇｃｃ）ｇｃｃで示される）。したがって、フルＫｏｚａｋコンセンサス配列は、上記ＲｃｃＡＵＧで示される、変動性が低下したフルＫｏｚａｋ配列の一部からなる「コア」Ｋｏｚａｋ配列を含むと見なすことができる。「コア」Ｋｏｚａｋコンセンサス配列は、本明細書では、ｍＲＮＡについてはＲＶＶＡＵＧ、ＤＮＡについてはＲＶＶＡＴＧとして規定され、ここで「Ｒ」は配列中のその位置にプリン（すなわち、Ａ又はＧ）を指定すると理解されるべきであり、「Ｖ」はＧ、Ａ、又はＣからの任意のヌクレオチドを指定すると理解されるべきである。
本発明の１つの好ましい実施形態において、Ｋｏｚａｋ配列は、配列ＲＶＶＡＴＧ（配列番号１０４）を含み、式中、「Ｒ」は、配列中のその位置でプリン（すなわち、Ａ又はＧ）を指定すると理解されるべきであり、「Ｖ」は、Ｇ、Ａ、又はＣからの任意のヌクレオチドを指定すると理解されるべきである。
本発明の一実施形態では、Ｋｏｚａｋ配列は、配列ＲＮＮＡＴＧを含み、式中、「Ｒ」は、配列中のその位置でプリン（すなわち、Ａ又はＧ）を特定すると理解されるべきであり、「Ｎ」は、「Ｔ／Ｕ」の使用がＴＲＡＰの非存在下で発現レベルの低下をもたらし得ることを認識して、Ｇ、Ａ、Ｔ／Ｕ又はＣからの任意のヌクレオチドを特定すると理解されるべきである。
いくつかの実施形態において、Ｋｏｚａｋ配列は、ＴＲＡＰ結合部位又はその一部の３’末端ＫＡＧＮＮ反復と重複する。したがって、コアＫｏｚａｋ配列は、ＴＲＡＰ結合部位又はその一部の３’末端ＫＡＧＮＮ反復と重複し得る。
好ましい重複ｔｂｓ及びＫｏｚａｋコンセンサス配列の要約を図１９Ｃに提供する。
好ましい実施形態では、ＴＲＡＰ結合部位又はその一部の３’末端ＫＡＧＮＮ反復は、コアＫｏｚａｋ配列内のＡＴＧトリプレットの少なくとも最初の、又は最初の２つのヌクレオチドと重複する。
本明細書に記載されるように、本発明の一態様では、ＴＲＡＰ結合部位又はその一部の３’末端ＫＡＧＮＮ反復は、目的のヌクレオチド（導入遺伝子ＯＲＦ）のＡＴＧ開始コドンと重複する。一態様において、ＴＲＡＰ結合部位又はその一部の３’末端ＫＡＧＮＮ反復は、目的のヌクレオチド（導入遺伝子ＯＲＦ）のＡＴＧ開始コドンの最初の１つ又は２つのヌクレオチドと重複する。
一態様では、重複ｔｂｓ－Ｋｏｚａｋ配列は、コンセンサス配列ＫＡＧＮＮＧ（配列番号１１３）を有し得、「ＮＮ」は、Ｋｏｚａｋ配列のＡＴＧトリプレット内の最初の２つのヌクレオチドである。
コンセンサス配列は、ＫＡＧＡＴＧ（配列番号１１４）であり得、式中、「Ｋ」はＧ又はＴ／Ｕのいずれかである。
一態様では、重複ｔｂｓ－Ｋｏｚａｋ配列は、図１９Ｃに示すようにＧＡＧＡＴＧ（配列番号１４２）であり得る。
一実施形態において、ＴＲＡＰ結合部位又はその一部の３’末端ＫＡＧＮＮ反復は、目的のヌクレオチド内のＡＴＧトリプレットの第１のヌクレオチドと重複する。
一態様では、配列は配列ＫＡＧＮＮＴＧ（配列番号１１５）を含み得、第２の「Ｎ」はＡＴＧトリプレット内の第１のヌクレオチドである。コンセンサス配列は、ＫＡＧＮＡＴＧ（配列番号１１６）であり、式中、「Ｋ」は、配列中のその位置でＧ又はＴ／Ｕを指定すると理解されるべきであり、「Ｎ」は、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｕ又はＣから、好ましくは「Ｖ」、すなわちＧ、Ａ又はＣからの任意のヌクレオチドを指定すると理解されるべきである。例えば、重複配列は、図１９Ｃに示すようにＫＡＧＶＡＴＧ（配列番号１４３）であり得る。
一実施形態において、本発明において使用するための重複するＫｏｚａｋ配列及びＴＲＡＰ結合部位又はその一部は、配列番号１４２～１４６に示される配列を含む。
一実施形態では、本発明のヌクレオチド配列は、配列番号１４２～１４６に示される配列を含む。一態様では、本発明の配列は配列ＫＡＧＡＴＧを含む。
本発明の核酸に使用するための好ましい重複ｔｂｓ又はその一部及びコンセンサス配列ＧＡＧＡＴＧ（配列番号１４２）、ＫＡＧＶＡＴＧ（配列番号１４３）及びＫＡＧＶＶＡＴＧ（配列番号１４４）に対応するコアＫｏｚａｋ配列は、本明細書で定義されるＫＡＧＮＮのコンセンサスｔｂｓ反復配列及び本明細書で定義されるコンセンサス「コア」Ｋｏｚａｋ配列ＲＶＶＡＴＧに基づき、配列番号１４２及び６９～９２に示される配列を包含する。
いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１４７～１５０に示される配列を含む。好ましくは、ヌクレオチド配列は、配列番号１４７又は配列番号１４８に示される配列を含む。
好ましい実施形態では、本発明のヌクレオチド配列は、配列番号１０６に示される重複ｔｂｓ及びＫｏｚａｋ配列を含む。
ＴＲＩＰシステムの取り扱い性を改善するために、いくつかの異なる制限酵素（ＲＥ）の選択肢を介してプロモータ－５’ＵＴＲ－ｔｂｓ配列を含む発現カセットにＮＯＩを直接クローニングする能力、すなわち、ｔｂｓ配列とＫｏｚａｋ配列との間にマルチクローニング部位（ＭＣＳ）を組み込む能力を有することが望ましい（図１９Ａ参照）。本発明者等は、いくつかの異なるＭＣＳがＴＲＩＰシステムによって許容され得ること、すなわちＭＣＳが使用されるときに導入遺伝子抑制が依然として得られることを実証した。これは、５’ＵＴＲリーダ配列がＴＲＡＰ媒介抑制の程度を調節することができること、ｔｂｓのＡＴＧ開始コドンへの近接が重要であること、及び効率的な翻訳開始を確実にするために効率的なＫｏｚａｋ配列がＭＣＳ及びＮＯＩの開始コドンと共に又はそれらの間で維持されなければならないことを考えると予想外であった。加えて、ＴＲＡＰ媒介抑制を維持しながら使用され得るＲＥ部位の数及び／又は組合わせを予測することができなかった。
このように、ＲＶＶＡＴＧの効率的なコアＫｏｚａｋ配列も維持しながら、いくつかの（重複する）ＲＥ部位をｔｂｓからＡＴＧ開始コドンまで可能な限り短い距離で組み込むことができるように（ｔｂｓのＡＴＧへの近接性を保持するため）、配列「圧縮」が必要であった。
一実施形態では、ヌクレオチド配列は、本明細書に記載のｔｂｓ又はその一部、マルチクローニング部位（ＭＣＳ）及び本明細書に記載のＫｏｚａｋ配列を更に含み、当該ＭＣＳは、ｔｂｓ又はその一部の下流かつＫｏｚａｋ配列の上流に位置する。好適には、ｔｂｓ又はその一部及びＫｏｚａｋ配列は重複しない。
本明細書で使用される場合、「マルチクローニング部位」は、互いに非常に近接したいくつかの制限酵素認識部位（制限酵素部位）を含むＤＮＡ領域として理解されるべきである。一実施形態では、ＲＥサイトは、本発明で使用するＭＣＳにおいて重複していてもよい。
本明細書で使用される場合、「制限酵素部位」又は「制限酵素認識部位」は、制限酵素によって認識される４～８ヌクレオチド長のヌクレオチドの特定の配列を含むＤＮＡ分子上の位置である。制限酵素は、特定のＲＥ部位（すなわち、特定の配列）を認識し、ＲＥ部位内又はその近傍のＤＮＡ分子を切断する。
一実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１５８～１７１に示される配列を含む。
一実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１６５～１７１に示される配列を含む。
一実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１６５、１６８又は１７１に示される配列を含む。
好ましい実施形態では、本発明のヌクレオチド配列は、配列番号１０７に示される重複ｔｂｓ－ＭＣＳ－Ｋｏｚａｋ配列を含む。
一実施形態では、Ｋｏｚａｋ配列は、配列ＲＮＮＡＴＧを含み、式中、「Ｒ」は、配列中のその位置でプリン（すなわち、Ａ又はＧ）を指定すると理解されるべきであり、「Ｎ」は、Ｇ、Ａ、Ｔ／Ｕ又はＣからの任意のヌクレオチドを指定すると理解されるべきである。
ＮＯＩの翻訳の抑制又は防止は、同等の時点で本発明のヌクレオチド配列の非存在下で発現される量と比較して、ウイルスベクター産生中に翻訳されるＮＯＩの産物（例えばタンパク質）の量の変化として理解されるべきである。このような翻訳の変化は、結果として、ＮＯＩによってコードされるタンパク質の発現の抑制又は防止をもたらす。
一実施形態において、本発明のヌクレオチド配列は、対象のヌクレオチドの翻訳がウイルスベクター産生細胞において抑制又は防止されるように、ＴＲＡＰと相互作用することができる。
ベクター作製中の任意の所与の時点でのＮＯＩの翻訳は、ベクター作製中の同じ時点で本発明のヌクレオチド配列の非存在下で翻訳される量の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％又は０．１％に減少し得る。
ベクター作製中の任意の所与の時点でのＮＯＩの翻訳は、ベクター作製中の同じ時点で本発明のヌクレオチド配列の非存在下で翻訳される量の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％又は０．１％未満に減少し得る。
本発明の文脈において、ベクター作製中の任意の所与の時点でのＮＯＩの翻訳は、ベクター作製中の同じ時点で非重複Ｋｏｚａｋ配列及びｔｂｓ配列（本発明のヌクレオチド配列とは対照的に）を含む核酸配列の存在下で翻訳される量の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％又は０．１％に減少し得る。
本発明の文脈において、ベクター作製中の任意の所与の時点でのＮＯＩの翻訳は、ベクター作製中の同じ時点で非重複Ｋｏｚａｋ配列及びｔｂｓ配列（本発明のヌクレオチド配列とは対照的に）を含む核酸配列の存在下で翻訳される量の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％又は０．１％未満に減少し得る。
ＮＯＩの翻訳を防止することは、翻訳量を実質的に０に減少させることとして理解されるべきである。
ベクター作製中の任意の所与の時点でのＮＯＩからのタンパク質の発現は、ベクター作製中の同じ時点で本発明のヌクレオチド配列の非存在下で発現される量の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％又は０．１％に減少し得る。
ベクター作製中の任意の所与の時点でのＮＯＩからのタンパク質の発現は、ベクター作製中の同じ時点で本発明のヌクレオチド配列の非存在下で発現される量の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％又は０．１％未満に減少し得る。
本発明の文脈において、ベクター作製中の任意の所与の時点でのＮＯＩからのタンパク質の発現は、ベクター作製中の同じ時点で非重複Ｋｏｚａｋ配列及びｔｂｓ配列（本発明のヌクレオチド配列とは対照的に）を含む核酸配列の存在下で発現される量の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％又は０．１％に減少し得る。
本発明の文脈において、ベクター作製中の任意の所与の時点でのＮＯＩからのタンパク質の発現は、ベクター作製中の同じ時点で非重複Ｋｏｚａｋ配列及びｔｂｓ配列（本発明のヌクレオチド配列とは対照的に）を含む核酸配列の存在下で発現される量の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％又は０．１％未満に減少し得る。
ＮＯＩからのタンパク質の発現を防止することは、発現されるタンパク質の量を実質的に０に減少させることとして理解されるべきである。
ＮＯＩの翻訳の分析及び／又は定量のための方法は、当技術分野で周知である。
溶解された細胞からのタンパク質産物は、クーマシー又は銀染色による可視化を伴うＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析等の方法を使用して分析され得る。あるいは、タンパク質産物を、タンパク質産物に結合する抗体プローブを用いたウエスタンブロッティング又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して分析することができる。インタクトな細胞中のタンパク質産物は、免疫蛍光によって分析され得る。
一実施形態では、プロモータの転写開始部位／末端からｔｂｓ又はその一部の開始までの距離は、３４ヌクレオチド未満である。
一実施形態では、プロモータの転写開始部位／末端からｔｂｓ又はその一部の開始までの距離は、１３ヌクレオチド未満である。
一実施形態では、ヌクレオチド配列はベクター導入遺伝子発現カセットである。
一実施形態では、本発明の核酸配列は、プロモータを更に含む。典型的には、プロモータの転写は、得られたｍＲＮＡ転写物にコードされる５’ＵＴＲをもたらす。プロモータは、当技術分野で公知であり、目的のヌクレオチドの発現を制御するのに適した任意のプロモータであり得る。例えば、プロモータは、ＥＦ１α、ＥＦＳ、ＣＭＶ又はＣＡＧであり得る。
好ましい実施形態では、本明細書に記載の重複するｔｂｓ及びＫｏｚａｋ配列は、プロモータの５’ＵＴＲ内に位置し、５’ＵＴＲは、関連するプロモータ由来の天然配列を含み得るか、又はより好ましくは、５’ＵＴＲは、本明細書に記載の５’ＵＴＲ配列からなる。
好ましい実施形態では、本明細書に記載のｔｂｓ配列とＫｏｚａｋ配列との間に圧縮／重複ＭＣＳを含む配列は、当該５’ＵＴＲ内に位置する。
本明細書に記載の重複するｔｂｓ及びＫｏｚａｋ配列、又は本明細書に記載のｔｂｓとＫｏｚａｋ配列との間に圧縮／重複ＭＣＳを含む配列は、当該５’ＵＴＲの３’末端に位置し得る。
好ましくは、５’ＵＴＲは、以下の配列：配列番号２９～３７、４５～５８、６９～９２及び１０８～１１６のうちの１つを含む。より好ましくは、５’ＵＴＲは、配列番号２９又は配列番号１０８を含む。更により好ましくは、５’ＵＴＲは配列番号２９を含む。
プロモータ－５’ＵＴＲ領域はイントロンを含み得る。イントロンは、天然イントロン又は異種イントロンであり得る。例えば、プロモータは、ＥＦ１α又はＣＡＧであり得る。
プロモータは、イントロンを含まないウイルスベクターゲノム、例えばＣＭＶで典型的に使用されるプロモータであり得る。
好ましい実施形態では、プロモータ－５’ＵＴＲ領域は、異種イントロンを含む人工５’ＵＴＲを含むように操作されている。したがって、プロモータ－５’ＵＴＲ領域は、異種エクソン－イントロン－エクソン配列を含有するように操作されており、ｍＲＮＡ転写物内にコードされる成熟５’ＵＴＲは、イントロンのスプライシングアウトから生じる。プロモータ－５’ＵＴＲ配列は、当技術分野で公知の方法を使用して操作することができる。例えば、プロモータは、本明細書に記載されるように操作され得る。
好ましくは、イントロン又は異種イントロンのスプライシングアウトから生じるその成熟ｍＲＮＡからの導入遺伝子タンパク質の発現は、ＴＲＡＰによって効率的に抑制される。適切には、イントロン又は異種イントロンは、配列番号１２２によるＥＦ１αイントロン配列であり得る。
イントロン又は異種イントロンは、本明細書に記載の重複するｔｂｓ及びＫｏｚａｋ配列又は本明細書に記載のｔｂｓとＫｏｚａｋ配列との間にＭＣＳを含む配列の上流、すなわち５’に位置し得る。
５’ＵＴＲは、以下の配列（ニワトリβ－アクチン／ウサギβ－グロビンキメラ５’ＵＴＲ－イントロン、太字のエクソン配列（一緒にスプライシングされて５’ＵＴＲリーダになる））を含み得る。
５’ＵＴＲは、配列番号１２１に示される配列を含み得る。
５’ＵＴＲは、配列番号１２２に示される配列を含み得る。
一実施形態では、プロモータは、配列番号１２３に示される配列を含む。
一実施形態では、プロモータは、配列番号１２４に示される配列を含む。
一実施形態では、プロモータは、配列番号１１７に示される配列を含む。
一実施形態では、プロモータは、配列番号１１８に示される配列を含む。
配列番号１１７に対応するスプライシングされた配列は、配列番号１１９に示されている。
配列番号１１８に対応するスプライシングされた配列は、配列番号１２０に示されている。
改善されたリーダ配列
ＴＲＩＰシステムを異なるプロモータ（異なる長さ及び組成の異なる天然の５’ＵＴＲを含有する）に適用する場合、ＴＲＡＰを伴わずに良好なレベルの発現も維持しながら、プロモータ－ＵＴＲの状況内でｔｂｓ配列を単純に適用して、ＴＲＡＰによる効率的な抑制をもたらすことができることが望ましい。この研究の開始時から、ｔｂｓが様々な構成的プロモータの天然のＵＴＲに挿入されるとき、ＴＲＡＰ－ｔｂｓによって媒介される抑制の達成可能なレベルがどの程度であるかは知られていなかった。理想的には、天然の５’ＵＴＲ配列によって誘導され得る抑制レベルの潜在的な変動性のいずれかを回避するために、選択されたプロモータを改変する場合、ｔｂｓと共に単一の保存された５’ＵＴＲリーダ配列を供給することができることが有利であろう。驚くべきことに、ＥＦ１αプロモータの第１のエクソン（配列番号１０１）は、天然のリーダ配列を含む５’ＵＴＲリーダと比較して、ＴＲＡＰによる一貫して良好なレベルの導入遺伝子抑制を提供し、このリーダはまた、ＴＲＡＰの非存在下で良好なレベルの導入遺伝子発現を提供することが見出された。
いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ｔｂｓ又はその一部の上流に５’リーダ配列を含む。リーダ配列は、ＴＲＡＰ結合部位又はその一部のすぐ上流にあり得、すなわち、リーダ配列とＴＲＡＰ結合部位又はその一部とを分離する更なる配列は存在し得ない。５’リーダがスプライシング事象に由来する場合、エクソン／エクソン接合からｔｂｓまでの配列を最小長（好ましくは≦１２ｎｔ）に保つべきである。リーダ配列は、非コードＥＦ１αエクソン１領域に由来する配列を含み得る。好ましい実施形態では、リーダ配列は、配列番号１０１、配列番号１０２又は配列番号９３で定義される配列を含む。
例示的なヌクレオチド配列
本発明の例示的なヌクレオチド配列を以下に示す。
配列番号１７２－Ｌ３３改善されたリーダ、最適な（重複する）ｔｂｓ（［ＫＡＧＮＮ］８）－Ｋｏｚａｋ接合を含有する例示的なヌクレオチド配列１
ＣＴＴＴＴＴＣＧＣＡＡＣＧＧＧＴＴＴＧＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＧＧＡＧＴＴＴＡＧＣＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＧＣＣＧＡＧＡＴＧ
配列番号１７３－Ｌ３３改善されたリーダ、最適な（重複する）ｔｂｓ（［ＫＡＧＮＮ］１１）－Ｋｏｚａｋ接合を含有する例示的なヌクレオチド配列２
ＣＴＴＴＴＴＣＧＣＡＡＣＧＧＧＴＴＴＧＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＧＧＡＧＴＴＴＡＧＣＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＧＣＣＴＡＧＣＡＧＡＧＡＣＧＡＧＣＣＧＡＧＡＴＧ
配列番号１７４－Ｌ１２改善されたリーダ、最適な（重複する）ｔｂｓ（［ＫＡＧＮＮ］１１）－Ｋｏｚａｋを含有する例示的なヌクレオチド配列３
ＣＴＴＴＴＴＣＧＣＡＡＣＧＡＧＴＴＴＡＧＣＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＧＣＣＴＡＧＣＡＧＡＧＡＣＧＡＧＣＣＧＡＧＡＴＧ
配列番号１７５－Ｌ３３、最適な（重複する）ｔｂｓ（［ＫＡＧＮＮ］１１）－Ｋｏｚａｋ接合を含有するスプライシングされたリーダをもたらす、イントロン含有５’ＵＴＲの例示的なヌクレオチド配列４
ＣＴＴＴＴＴＣＧＣＡＡＣＧＧＧＴＴＴＧＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＧＧＴＧＴＣＧＴＧＡＡＡＡＧＡＧＴＴＴＡＧＣＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＧＣＣＴＡＧＣＡＧＡＧＡＣＧＡＧＣＣＧＡＧＡＴＧ
配列番号１７６－改善されたスペーサ、最適な（重複する）ｔｂｓ（［ＫＡＧＮＮ］８）－Ｋｏｚａｋ接合を含有する例示的なヌクレオチド配列５
ＡＴＡＧＣＡＧＡＧＡＣＧＧＣＴＧＡＧＴＴＴＡＧＣＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＧＣＣＧＡＧＡＴＧ
配列番号１７７－Ｌ３３改善されたリーダｔｂｓ（［ＫＡＧＮＮ］１１）－ＭＣＳ－Ｋｏｚａｋを含有する例示的なヌクレオチド配列６
ＣＴＴＴＴＴＣＧＣＡＡＣＧＧＧＴＴＴＧＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＧＧＡＧＴＴＴＡＧＣＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＧＣＣＴＡＧＣＡＧＡＧＡＣＧＡＧＡＡＧＡＧＣＴＣＴＡＧＡＣＣＡＴＧ
配列番号１７８－改善されたスペーサ、ｔｂｓ（［ＫＡＧＮＮ］１１）－ＭＣＳ－Ｋｏｚａｋを含有する例示的なヌクレオチド配列７
ＡＴＡＧＣＡＧＡＧＡＣＧＧＣＴＧＡＧＴＴＴＡＧＣＧＧＡＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＧＣＣＴＡＧＣＡＧＡＧＡＣＧＡＧＡＡＧＡＧＣＴＣＴＡＧＡＣＣＡＴＧ
一実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１７２～１７８のいずれか１つを含む。
一実施形態では、ヌクレオチド配列は、
（ａ）（ｉ）配列番号１０１又は１０２、及び／又は
（ｉｉ）配列番号１５１～１５７のいずれか１つ、
（ｂ）配列番号１２７～１３０、１３２～１３６、１４０、１４１のいずれか１つ、及び
（ｃ）（ｉ）配列番号１４２～１４９のいずれか１つ、好ましくは配列番号１４７～１４９のいずれか１つ、又は
（ｉｉ）配列番号１５８～１７１のいずれか１つ、好ましくは配列番号１６５～１７１のいずれか１つ、
を含む。
一実施形態では、ヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号１０１又は１０２、
（ｂ）配列番号１２７～１３０、１３３～１３６、１４０、１４１のいずれか１つ、及び
（ｃ）配列番号１４２～１４９のいずれか１つ、好ましくは配列番号１４７～１４９のいずれか１つ、
を含む。
一実施形態では、ヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号１５１～１５７のいずれか１つ、
（ｂ）配列番号１２７～１３０、１３３～１３６、１４０、１４１のいずれか１つ、及び
（ｃ）配列番号１４２～１４９のいずれか１つ、好ましくは配列番号１４７～１４９のいずれか１つ、
を含む。
一実施形態では、ヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号１０１又は１０２、
（ｂ）配列番号１２７～１３０、１３２～１３６、１４０、１４１のいずれか１つ、及び
（ｃ）配列番号１５７～１７１のいずれか１つ、好ましくは配列番号１６５～１７１のいずれか１つ、
を含む。
一実施形態では、ヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号１５１～１５７のいずれか１つ、
（ｂ）配列番号１２７～１３０、１３２～１３６、１４０、１４１のいずれか１つ、及び
（ｃ）配列番号１５７～１７１のいずれか１つ、好ましくは配列番号１６５～１７１のいずれか１つ、
を含む。
本発明の実施は、特に明記しない限り、当業者の能力の範囲内である化学、分子生物学、微生物学及び免疫学の従来の技術を使用する。そのような技術は文献で説明されている。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｏｏｋｓ １－３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９５ ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．９，１３，ａｎｄ １６，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｂ．Ｒｏｅ，Ｊ．Ｃｒａｂｔｒｅｅ，ａｎｄ Ａ．Ｋａｈｎ（１９９６）ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；Ｊ．Ｍ．Ｐｏｌａｋ ａｎｄ Ｊａｍｅｓ Ｏ’Ｄ．ＭｃＧｅｅ（１９９０）Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ；Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（ｅｄ．）（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；ａｎｄ，Ｄ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ ａｎｄ Ｊ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅｒｇ（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐａｒｔ Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ．を参照されたい。これらの一般的なテキストの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、本明細書に開示される例示的な方法及び材料によって限定されず、本明細書に記載されるものと同様又は同等の任意の方法及び材料を、本開示の実施形態の実施又は試験に使用することができる。数値範囲は、範囲を定義する数を含む。別段示されない限り、任意の核酸配列は、５’から３’方向に左から右に書かれ、アミノ酸配列は、それぞれアミノからカルボキシへの配向で左から右に書かれている。
値の範囲が提供される場合、文脈上明確に指示されない限り、その範囲の上限と下限との間の、下限の単位の１０分の１までの各介在値も具体的に開示されることが理解される。記載された範囲内の任意の記載された値又は介在する値と、その記載された範囲内の任意の他の記載された値又は介在する値との間のより小さい各範囲は、本開示内に包含される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立して範囲に含まれても除外されてもよく、記載された範囲内の任意の具体的に除外された限界を条件として、上限及び下限のいずれかがより小さい範囲に含まれるか、どちらも含まれないか、又はその両方が含まれる各範囲も本開示内に包含される。記載された範囲が限界の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限界の一方又は両方を除外した範囲も本開示に含まれる。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。
本明細書で使用される場合、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「から構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｏｆ）」という用語は、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、又は「含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」と同義であり、包括的又はオープンエンドであり、追加の列挙されていない部材、要素又は方法工程を排除しない。「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「から構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｏｆ）」という用語は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」も含む。
本明細書で論じられる刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示のためにのみ提供される。本明細書のいかなるものも、そのような刊行物が添付の特許請求の範囲に対する先行技術を構成することの承認として解釈されるべきではない。
ここで、本発明を実施例によって更に説明するが、これらは当業者が本発明を実施するのを助けるのに役立つことを意図しており、決して本発明の範囲を限定することを意図していない。
［実施例］
一般的な分子／細胞生物学技術及びアッセイ
改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡ発現構築物
改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡのためのＤＮＡベースの発現構築物は、２５６Ｕ１（Ｕ１＿２５６とも呼ばれる）ｓｎＲＮＡの非限定的な例において以下に強調される、ＲＮＡの転写及び終結を駆動する内因性Ｕ１ ｓｎＲＮＡ遺伝子における保存された配列を含む：
ＴＡＡＧＧＡＣＣＡＧＣＴＴＣＴＴＴＧＧＧＡＧＡＧＡＡＣＡＧＡＣＧＣＡＧＧＧＧＣＧＧＧＡＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＡＧＡＧＧＣＡＧＡＣＧＴＣＡＣＴＴＣＣＣＣＴＴＧＧＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＡＧＣＡＧＡＴＴＧＧＴＣＧＧＴＴＧＡＧＴＧＧＣＡＧＡＡＡＧＧＣＡＧＡＣＧＧＧＧＡＣＴＧＧＧＣＡＡＧＧＣＡＣＴＧＴＣＧＧＴＧＡＣＡＴＣＡＣＧＧＡＣＡＧＧＧＣＧＡＣＴＴＣＴＡＴＧＴＡＧＡＴＧＡＧＧＣＡＧＣＧＣＡＧＡＧＧＣＴＧＣＴＧＣＴＴＣＧＣＣＡＣＴＴＧＣＴＧＣＴＴＣＡＣＣＡＣＧＡＡＧＧＡＧＴＴＣＣＣＧＴＧＣＣＣＴＧＧＧＡＧＣＧＧＧＴＴＣＡＧＧＡＣＣＧＣＴＧＡＴＣＧＧＡＡＧＴＧＡＧＡＡＴＣＣＣＡＧＣＴＧＴＧＴＧＴＣＡＧＧＧＣＴＧＧＡＡＡＧＧＧＣＴＣＧＧＧＡＧＴＧＣＧＣＧＧＧＧＣＡＡＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＧＴＧＴＡＡＡＧＡＧＴＧＡＧＧＣＧＴＡＴＧＡＧＧＣＴＧＴＧＴＣＧＧＧＧＣＡＧＡＧＧＣＣＣＡＡＧＡＴＣＴＣａｔｔｔｇｃｃｇｔｇｃｇｃｇｃｔｔＧＣＡＧＧＧＧＡＧＡＴＡＣＣＡＴＧＡＴＣＡＣＧＡＡＧＧＴＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＧＧＣＧＡＧＧＣＴＴＡＴＣＣＡＴＴＧＣＡＣＴＣＣＧＧＡＴＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＣＴＧＣＧＡＴＴＴＣＣＣＣＡＡＡＴＧＴＧＧＧＡＡＡＣＴＣＧＡＣＴＧＣＡＴＡＡＴＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＧＧＧＧＧＡＣＴＧＣＧＴＴＣＧＣＧＣＴＴＴＣＣＣＣＴＧＧＴＴＴＣＡＡＡＡＧＴＡＧＡＣＴＧＴＡＣＧＣＴＡＡＧＧＧＴＣＡＴＡＴＣＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＧＧＴＴＴＧＴＧＴＣＴＴＧＧＴＴＧＧＣＧＴＣＴＴＡＡＡＴＧＴＴＡＡ（配列番号１５）
Ｋｅｙ：大文字のみ＝Ｕ１ ＰｏｌＩＩプロモータ（ｎｔ１－３９２）；小文字＝リターゲティング領域（ｎｔ３９３－４０９）；小文字太字＝リターゲティング配列［この例では野生型ＨＩＶ－１パッケージングシグナルのｎｔ２５６－２７０をターゲティングする］（ｎｔ３９５－４０９）；大文字イタリック体＝主Ｕ１ ｓｎＲＮＡ配列［クローバーリーフ］（ｎｔ４１０－５６２）；大文字下線＝転写終結領域（ｎｔ５６３－６５２）。
研究で使用した初期改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡ及び対照の要約を以下の表に示し、新しいアニーリング配列及び標的部位配列（配列は５’から３’方向に表される）を示す。
表Ｉ．試験改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡ及び対照Ｕ１ ｓｎＲＮＡ内の標的アニーリング配列（標的配列に相補的な異種配列）、並びに初期試験で使用したそれらの標的配列を記載する配列のリスト。ヌクレオチドは、「リターゲティング領域」でそれぞれの発現カセット内にコードされるため、ＤＮＡとして提示される。（ＡＴ）モチーフは、いずれの場合もＵ１ ｓｎＲＮＡ分子の最初の２つのヌクレオチドを形成する全ての初期構築物に存在した。この研究におけるレンチウイルスベクターゲノムが、これらの２つの高度に保存された株（本研究で使用したパッケージング配列は、ＧｅｎＢａｎｋ：ＭＨ７８２４７５．１のベクター配列に最も類似している）から構成されるハイブリッドパッケージングシグナルを含有したため、標的配列番号は、示される、ＨＩＶ－１のＮＬ４－３（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｍ１９９２１．２）又はＨＸＢ２（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｋ０３４５５．１）株における標的を指す。
Figure 2023513303000012
Figure 2023513303000013
接着性細胞培養、トランスフェクション及びレンチウイルスベクター産生
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、完全培地（１０％熱不活性化（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｓｉｇｍａ）及び１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）（Ｓｉｇｍａ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ））中、３７℃、５％ＣＯ２で維持した。
付着様式でのＨＩＶ－１ベクターの標準的な規模の産生は、以下の条件下で１０ｃｍディッシュであった（全ての条件は、他の形式で実施した場合に面積でスケーリングした）。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０ｍＬ完全培地に３．５ｘ１０５細胞／ｍｌで播種し、およそ２４時間後、１０ｃｍプレート当たりのプラスミドの以下の質量比を使用して細胞をトランスフェクトした。４．５μｇのゲノム、１．４μｇのＧａｇ－Ｐｏｌ、１．１μｇのＲｅｖ、０．７μｇのＶＳＶ－Ｇ及び０．０１μｇ～２μｇの改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡプラスミド。
トランスフェクションは、製造業者のプロトコル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従ってＯｐｔｉ－ＭＥＭ中でＤＮＡをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ＣＤと混合することによって媒介した。酪酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を約１８時間後に１０ｍＭの最終濃度まで５～６時間添加した後、１０ｍｌの新鮮な無血清培地をトランスフェクション培地と交換した。典型的には、ベクター上清を２０～２４時間後に回収し、次いで、濾過し（０．２２μｍ）、－２０／－８０℃で凍結した。ヌクレアーゼ処理の陽性対照として、典型的にはＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）を濾過前に５Ｕ／ｍＬで１時間回収物に添加した。
懸濁細胞培養、トランスフェクション及びレンチウイルスベクター産生
ＨＥＫ２９３Ｔ．１－６５ｓ懸濁細胞を、振盪インキュベータ（１９０ＲＰＭに設定された２５ｍｍ軌道）中、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ＋０．１％ＣＬＣ（Ｇｉｂｃｏ）中、３７℃、５％ＣＯ２で増殖させた。懸濁液を使用した全てのベクター産生は、２４ウェルプレート（振盪プラットフォーム上の１ｍＬ体積）、２５ｍＬ振盪フラスコ又はバイオリアクタ（≦５Ｌ）で行った。ＨＥＫ２９３Ｔｓ細胞を無血清培地中に８×１０５細胞／ｍｌで播種し、ベクター産生全体にわたって、振盪しながら５％ＣＯ２中３７℃でインキュベートした。播種の約２４時間後、トランスフェクション時の有効最終培養体積当たりのプラスミドの質量比：０．９５μｇ／ｍＬのＧｅｎｏｍｅ、０．１μｇ／ｍＬのＧａｇ－Ｐｏｌ、０．６μｇ／ｍＬのＲｅｖ、０．７μｇ／ｍＬのＶＳＶ－Ｇ、及び０．０１～０．２μｇ／ｍＬの改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡプラスミドを用いて細胞をトランスフェクトした。
トランスフェクションは、製造業者のプロトコル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従ってＯｐｔｉ－ＭＥＭ中でＤＮＡをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ＣＤと混合することによって媒介した。酪酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を約１８時間後に１０ｍＭの最終濃度まで添加した。典型的には、ベクター上清を２０～２４時間後に回収し、次いで、濾過し（０．２２μｍ）、－２０／－８０℃で凍結した。ヌクレアーゼ処理の陽性対照として、典型的にはＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）を濾過前に５Ｕ／ｍＬで１時間回収物に添加した。
レンチウイルスベクター滴定アッセイ
ＧＦＰマーカー含有カセットによるレンチウイルスベクター滴定のために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレートに１．２×１０４細胞／ウェルで播種した。ＧＦＰをコードするウイルスベクターを使用して、８ｍｇ／ｍｌのポリブレン及び１ｘペニシリンストレプトマイシンを含有する完全培地中で細胞に形質導入し、およそ５～６時間後に新鮮培地を添加した。形質導入された細胞を、５％ＣＯ２中、３７℃で２日間インキュベートした。次いで、Ａｔｔｕｎｅ－ＮｘＴ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いてフローサイトメトリのために培養物を調製した。形質導入時の２×１０４細胞の予測細胞数（典型的な増殖速度に基づく）、ベクター試料の希釈係数、陽性ＧＦＰ集団の割合及び形質導入時の総体積を用いて、ＧＦＰ発現百分率を測定し、ベクターの力価を計算した。
組込み力価によるレンチウイルスベクターの滴定のために、０．５ｍＬ容量のニート～１：５希釈ベクター上清を使用して、８μｇ／ｍＬポリブレンの存在下で１２ウェルスケールで１ｘ１０５のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質導入した。培養物を１０日間（２～３日毎に１：５分割）継代した後、宿主ＤＮＡを１ｘ１０６個の細胞ペレットから抽出した。二重定量ＰＣＲを、ＨＩＶパッケージングシグナル（ψ）及びＲＲＰ１に設定したＦＡＭプライマー／プローブセットを使用して行い、ベクターの力価（ＴＵ／ｍＬ）を、以下の因子を使用して計算した。形質導入体積、ベクター希釈、反応当たりに検出されたＲＲＰ１正規化ＨＩＶ－１ψコピー。
ＬＶ形質導入細胞の転写リードスルー（「リードイン」）分析
示されているＨＩＶベクターは、２４ウェルプレートスケールでの２５６＿Ｕ１ ｓｎＲＮＡの存在下又は非存在下での懸濁モード１．６５ｓ細胞の一過性トランスフェクションによって産生された。上清を２日後に回収した後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてフローサイトメトリを使用してＧＦＰ発現によって滴定した。その後、ＧＦＰ力価を、１の感染多重度（ＭＯＩ）で４．５ｘ１０４個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞又は９２ＢＲ細胞（ロバ初代線維芽細胞）を形質導入するために適宜使用した。形質導入された細胞を、採取される前に１０日間にわたって３回継代し、２つの一定分量に分割した。１つは全ＲＮＡ抽出のために処理し、１つはゲノムＤＮＡ抽出のために処理した。２００ｎｇ（２９３Ｔ）又は８０ｎｇ（９２ＢＲ）の総ＲＮＡをＤＮＡｓｅ Ｉ処理し、ＳＳＩＶ ＶＩＬＯ ＲＴシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＲＴ－ＰＣＲに供した。ｃＤＮＡを１ｎｇ／ｕｌに希釈し、５ｕｌをＨＩＶ Ｐｓｉ及び細胞ＧＡＰＤＨに指向するプライマーセットを用いてＳＹＢＲ ｑＰＣＲに供した。サンプル間の発現スコアを生成するために、Ｄｅｌｔａ Ｃｔ法を使用してＨＩＶ ＰｓｉコピーをＧＡＰＤＨコピーに正規化した。ゲノムＤＮＡ抽出物を、Ｑｉａｃｕｂｅ抽出システム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して調製し、５ｕｌの溶出ＤＮＡを、ｑＰＣＲを使用したＨＩＶベクターインテグレーションアッセイに供した。細胞当たりの組み込まれたベクターゲノムの平均を計算するために、ＨＩＶ Ｐｓｉコピーを細胞標的ＲＰＰＨ１に対して正規化した。次いで、形質導入効率を説明するために、試料のＨＩＶ ＲＮＡ発現スコアを細胞当たりの組み込まれたベクターコピー数に対して正規化した。この最終値は相対的ＨＩＶ Ｐｓｉ ＲＮＡ発現スコアであり、試験した各細胞株について、全ての値を２５６＿Ｕ１ ｓｎＲＮＡの非存在下で作製した標準ベクター（インタクトＭＳＤ及びｃｒＳＤ）に対して正規化した。
［実施例１］
ＭＳＤからのプロスキューススプライシング、ＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターの力価の低下、及び再指向Ｕ１ ｓｎＲＮＡによる回収／ブーストの力価。
レンチウイルスベクターゲノムの一般的な構造は、３世代のベクター系の全てにわたって一貫したままであり（Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ：ｂａｓｉｃ ｔｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ．Ｔｏｓｈｉｅ ＳＡＫＵＭＡ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ａ．ＢＡＲＲＹ ａｎｄ Ｙａｓｕｈｉｒｏ ＩＫＥＤＡ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（２０１２）４４３，６０３－６１８）、導入遺伝子カセットの上流のパッケージング配列及びＲＲＥの位置を含むＨＩＶ－１プロウイルスの５’領域が維持されているが、他の態様では異なっており、後の世代は３’ＬＴＲにおいてｔａｔ非依存性になり、自己不活性化し、ｃｐｐｔ及びｗＰＲＥの使用を組み込む。５’パッケージング配列の操作における例の明らかな欠如は、ＨＩＶ－１複製の多くの態様、すなわち転写、スプライシングのバランス、ＧａｇＰｏｌの翻訳、ゲノム二量体化、アセンブリ、逆転写及び組込みに必要なその複雑な構造及びその中にコードされる凝縮情報に起因する可能性が高い。この複合体領域内で、主要スプライスドナー（ＭＳＤ）は、ＳＬ１（二量体化ループ）とＳＬ３（Ｇａｇへの結合）との間のステムループ２（ＳＬ２）領域内に埋め込まれている。レンチウイルスベクターゲノムにおけるパッケージング領域のすぐ下流へのＲＲＥ配列（及びエンベロープ領域内の関連するスプライスアクセプタ７（ｓａ７））の再配置は、ｒｅｖの非存在下でＭＳＤにスプライスアクセプタ（ｓａ７）を「提供する」と考えられた。レンチウイルスベクターの産生中に、ｒｅｖの供給により、ｒｅｖがＲＲＥに結合し、ｓａ７へのＭＳＤスプライシングが抑制され、その結果、スプライシングされていない完全長レンチウイルスベクターゲノムｖＲＮＡが産生されると考えられた（図２Ａ）。しかし、本発明者等（図４Ｂｉｉ）及び他の発明者等（例えば、Ｃｕｉ ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：６１７１－６１７６）は、トランスジェニック配列内のＭＳＤからスプライスアクセプタ部位への異常なスプライシングが実質的であり得、ベクタービリオンへのパッケージングに利用可能な（全体に対する－図２Ｂを参照）非スプライシング型ｖＲＮＡの比較的中程度のレベル、場合によっては５％未満をもたらし得ることを示す。
パッケージングのためのｖＲＮＡを生成する際の非効率性は、細胞への多数のベクターゲノムプラスミドの送達のために、一過性トランスフェクション法で産生されたレンチウイルスベクターの力価において常に直接観察されるとは限らず、１ｘ１０７ＴＵ／ｍＬを超える標準的な第３世代ベクターの力価は、このタイプの異常なスプライシングが生じていても、日常的に可能である。しかし、本発明者等は、はるかに少ない数の組み込まれたベクターゲノムカセットが存在し得る安定したプロデューサ細胞株の開発のために、異常なスプライシングの問題が実行においてより実質的である可能性が高いと予想している。実際、本発明者等は、典型的には、ゲノム成分が安定な産生クローンにおいて制限的であり、ＭＳＤ活性がこの制限に実質的に寄与し得ると仮定する。
ＭＳＤから生じる異常にスプライシングされたｍＲＮＡを導入遺伝子カセットに生成すること、（増加した）産生中の導入遺伝子カセットの発現には、更におそらくあまり明白でない結果がある。以前に、レンチウイルスベクター産生中の導入遺伝子発現を抑制するためにＴＲｉＰシステムが開発され（国際公開第２０１５／０９２４４０号に記載されている）、これは、ベクター産生に対する特定の導入遺伝子タンパク質の負の効果に比例して連結されるベクターの力価における回復を可能にする。本発明者等は、効率的な異常なスプライシング（例えば、ＥＦ１ａ駆動カセットを含む標準的なレンチウイルスベクターにおいて、図４及び図１２を参照）が、典型的には導入遺伝子をコードするｍＲＮＡを生成することを見出した。理論に束縛されることを望まないが、ＥＦ１ａ駆動カセットの場合、ＭＳＤは強力なＥＦ１ａスプライスアクセプタにスプライスするが、他のプロモータ－ＵＴＲ配列の場合、ｒｅｖの存在下であっても、ＭＳＤはより弱い潜在性スプライスアクセプタを「選択」する。ＭＳＤは、ベクターゲノムに対してより中心的な他の部位、すなわち導入遺伝子プロモータ領域を優先して、ＲＲＥ－ｓａ７配列を「通り過ぎて」見える。野生型ＨＩＶ－１では、ＭＳＤは典型的には、ゲノムの中央及び３’末端に配置されたスプライスアクセプタにスプライスするので、これはＨＩＶ－１ ５’パッケージング領域の「残留」特性であり得る。ＭＳＤは下流のベクター配列内の多くの場所で異常にスプライシングするが、ノンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構（すなわち、それらは、タンパク質［導入遺伝子タンパク質］をコードするため、正当なｍＲＮＡであると思われる）を通過するｍＲＮＡのみが細胞質に輸送され（及び／又は細胞質内で安定である）、そこで翻訳される可能性がある。これは、ｍＲＮＡをコードする導入遺伝子の抑制を維持するためにＴＲｉＰシステムに更なる負荷をもたらし、ｍＲＮＡのより大きなプールに対する抑制性制御をより少なくする（図１２を参照）。更に、（レンチウイルスベクター産生中の導入遺伝子発現を部分的に回避するための）組織特異的プロモータの使用は、この異常なスプライシングの機構による導入遺伝子をコードする翻訳可能なｍＲＮＡの細胞質出現によって「取り消される」可能性がある。本質的に、導入遺伝子は、ベクターゲノムｖＲＮＡの発現を駆動している（典型的には強力な）構成的プロモータによって発現される。
したがって、ＭＳＤ変異レンチウイルスベクターを作製する多くの理由があり、実際に、他の者は、ｔａｔ非依存性レンチウイルスベクターでそれを試みたが成功しなかった。本発明者等は、ＨＩＶ－１ｔａｔ非依存性第３世代ベクターにおけるＭＳＤの変異がＳＬ２内の隣接する潜在性スプライスドナー部位を活性化し、実質的なレベルのスプライシングをもたらすことを見出した。この理由のために、本発明者等は、ＭＳＤ及び近くの潜在性スパイスドナー（ｃｒＳＤ）の両方に変異を採用しており（図１０参照）、この改変を「ＭＳＤ－２ＫＯ」又は「ＭＳＤ２ＫＯ」又は「ＭＳＤの機能的改変」と呼ぶ。この二重変異は、レンチウイルスベクター産生中のＳＬ２のスプライシング領域（ＭＳＤ及びｃｒＳＤの両方を含む）から強力なＥＦ１ａスプライスアクセプタへの異常なスプライシングの除去に極めて有効であることが図４に示されている。３つの異なるプロモータ－ＧＦＰ導入遺伝子カセットを含有するＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターゲノムは、他の者によって同様に報告されているように、ベクターの力価の減少をもたらすことも示されている（図３）。図４Ｂｉでは、トランスでのＨＩＶ－１ｔａｔの提供は、ＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターゲノムの力価の観察された減少を救済することができるが、「異常な」スプライス産物（ＳＬ４のマイナー潜在性スプライスドナー由来）の量は増加することも実証されている（図４Ｂｉｉ）。重要なことに、ベクターパッケージングシグナルの異なる領域に再指向された改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、マイナースプライス産物の存在を増加させることなく、ＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターゲノム力価を増加させることが示されている（図４）。
［実施例２］
ＭＳＤ変異レンチウイルスベクター力価の増強は、ベクターゲノムカセット内の５’ポリＡ部位の抑制によるものではない
本発明が５’ポリＡ部位を抑制するように作用しているかどうかを評価するために、ＥＦ１ａ又はＣＭＶ駆動ＧＦＰ導入遺伝子カセットのいずれかを含有するＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターゲノム内に５’ポリＡ部位への機能変異を導入し（図６）、「ｐＡｍ１」ポリＡ変異の説明は、ポリアデニル化活性の完全な消滅を実証する図６Ａにある。驚くべきことに、本発明者等は、５’ｐｏｌｙＡシグナルの変異が、ＥＦ１ａ－ＧＦＰ含有ＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターゲノム中の力価を部分的にしか増加させず、ＣＭＶ－ＧＦＰ ＭＳＤ２ＫＯレンチウイルスベクターゲノム中に実質的に影響を及ぼさないことを見出したが、これはＭＳＤ－２ＫＯ変異の減衰効果の程度に見合っているように思われた（ＥＦ１ａ含有ゲノムでは、ＭＳＤ２ＫＯ変異はあまり顕著ではない）。重要なことに、この実験における３０５Ｕ１分子の供給は、標準的なレンチウイルスベクターゲノム（内因性Ｕ１ ｓｎＲＮＡが潜在的な残留５’ポリＡ活性をおそらく完全に抑制することができる）及び可能性のある５’ポリＡ活性を有さないＭＳＤ２ＫＯ／ｐＡｍ１レンチウイルスベクターゲノムの両方の力価を増加させた。これは、ＭＳＤ変異レンチウイルスベクターの力価を回復するために供給された改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡが、以前に記載されていない転写後工程で作用しているという説得力のある証拠を提供する。
次いで、本発明者等は、これがＭＳＤ２ＫＯレンチウイルスベクターゲノムの力価の観察された増加に影響を与えるかどうかを評価するために、３０５Ｕ１及び２５６Ｕ１の７０Ｋ及びＵ１Ａ結合ループを変異させようとした。図７は、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡ内のＳＬ１又はＳＬ２の機能変異が、産生中に共発現された場合にＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターの力価を増強するこれらの分子の能力に影響を及ぼさないことを実証し、Ｓｍタンパク質結合変異のみがこの活性を遮断した。これは、ポリＡ活性を抑制する際の再指向Ｕ１ ｓｎＲＮＡの以前は不可避であった７０Ｋ結合特性が本発明において重要ではないことを示し、ＭＳＤ変異レンチウイルスベクターの力価を増加させるために使用される改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡが新規な機構によって機能しているという更なる証拠を提供する。
ＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターに適用した場合の改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡによって媒介される力価の増加が、標準的なレンチウイルスベクターと比較して、それらの「好ましい」標的部位が異なるかどうかを評価するために、ＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターゲノムの５’領域に沿った異なる部位を標的とする改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡのパネル（表Ｉ参照）をスクリーニングした（図９）。この画面は、場合によってはＳＬ３内の「ホットスポット」を用いて、パッケージング領域へのターゲティングが好ましいことを示している（ＳＬ１－３）。本発明者等が標準的なレンチウイルスベクターについて以前に実証したように、標的部位に対して１５ヌクレオチド（又は９ヌクレオチドが示される）の相補性を有する改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡを用いてスクリーニングを実施し、９ヌクレオチドを超える相補性長を使用すると、力価の増加はより堅牢であり得る。実際、本発明者等は、ＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターについて、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡ（「３０５」配列を標的とする）で観察される力価ブーストは、わずか７ヌクレオチドの相補性で観察され得るが、好ましい使用では、力価ブーストの増加に起因して１０～１５ヌクレオチドの相補性を使用することがより良好であり（図８）、また、これは改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡによるあらゆる可能な「オフターゲット」効果を最小限に抑えるためであることを示す。
［実施例３］
改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡによるＭＳＤ変異レンチウイルスベクター力価の増強はスプライスドナー変異のタイプに依存しない
図１０Ａは、ＭＳＤ及び下流に位置する潜在性スプライスドナーの両方を変異させる、ＭＳＤ変異レンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域の「ＭＳＤ－２ＫＯ」バリアントのＳＬ２ループに対する遺伝子改変を示す（ＭＳＤ－２ＫＯバリアントは、本明細書の非限定的な例の多くで利用されている）。改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡの使用による力価のブーストにおける効果が、ＭＳＤ－２ＫＯバリアントに対してなされた特定の変化にいずれにせよ依存的であったかどうかを評価するために、本発明者等は、３つの他のスプライスドナー領域変異体、［１］「ＭＳＤ２ＫＯｖ２」（これはまた、ＭＳＤ及び潜在性ドナー配列内に２つの特定の変化を導入した）、［３］「ＭＳＤ－２ＫＯｍ５」（これは、ＳＬ２ループ全体を人工ステムループで置き換える）、及び［３］完全なＳＬ２欠失（したがって、スプライスドナー領域全体を除去する（スプライシング領域とも呼ばれる）を作製した。次いで、本発明者等は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞＋／－改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡ（２５６Ｕ１）及び滴定されたベクター上清中に標準的又はＭＳＤ変異レンチウイルスベクターバリアント（ＥＦＳ－ＧＦＰ発現カセットを含む）を産生した（図１０Ｂ）。結果は、４つ全てのＭＳＤ変異レンチウイルスベクターバリアントが標準ベクターと比較して弱毒化されたが、レンチウイルスベクター産生中に供給された改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡの使用によって４つ全てを増強することができたことを示し、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡによるスプライスドナー領域変異の特異的配列依存性がないことを示している。興味深いことに、ＭＳＤ－２ＫＯｍ５バリアントは最も減衰が少なく、２５６Ｕ１分子の存在下で生成された場合、使用される内部プロモータの同一性に関係なく、出力力価の最大の増加をもたらした（ＥＦＳ、ＥＦ１ａ、ＣＭＶ及びヒトＰＧＫプロモータの比較）。
［実施例４］
シスのレンチウイルスベクターゲノムプラスミドＤＮＡ骨格内にコードされた改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡカセットの使用。
本明細書の以前の例は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞とレンチウイルスベクター成分プラスミド及びプラスミドをコードする改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡとの一過性コトランスフェクションによる、レンチウイルスベクター産生中のトランスでの改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡ分子の使用を開示している。ＭＳＤ変異レンチウイルスベクターゲノムカセット及び改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡカセットが同じプラスミドＤＮＡ分子内に適切にコードされ得るかどうかを評価するために、３つのバリアント構築物をクローニングした（図１１Ａ）。ＭＳＤ変異レンチウイルスベクターゲノムカセット（ＭＳＤ－２ＫＯバリアント）を、２５６Ｕ１発現カセットがレンチウイルスベクターゲノムカセット及び／又は機能性プラスミド骨格配列に対して３つの異なる構成で挿入されるように改変した。これらの「シス」バージョンのプラスミドを使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＭＳＤ変異レンチウイルスベクターを作製し、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡプラスミドを非改変ＭＳＤ変異レンチウイルスベクターゲノムとコトランスフェクトした「トランス」モードと比較した（図１１Ｂ）。結果は、これらの「シス」バージョンのプラスミドの力価が、コトランスフェクションで供給された未改変ＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターゲノム＋２５６Ｕ１と類似していたことを示している。
［実施例５］
標準的又はＭＳＤ変異レンチウイルスベクターの両方の産生を増強するための改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡを安定に発現する細胞株の使用
３０５Ｕ１発現カセットをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に安定に組み込み、一過性トランスフェクション＋／－更なる３０５Ｕ１プラスミドＤＮＡによって、標準又はＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターを作製した。安定な細胞の成功した生成は、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡが細胞毒性効果なしに細胞内で内因的に発現され得ることを初めて明らかにし、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡがＵ１ ｓｎＲＮＡ合成又はスプライソソームのいずれかに関与する細胞因子を滴定しないこと、及びオフターゲティングが起こらないこと、又はオフターゲティング効果が正常な細胞生存率に影響を及ぼさないことのいずれかを示す。レンチウイルスベクターの出力力価は、標準及びＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクターの両方で改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡによって媒介される力価の増加が、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡの安定な提供において可能であることを実証している（図１３）。これにより、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡをレンチウイルスベクターパッケージング及びプロデューサ細胞株に容易に組み込むことが可能になる。
［実施例６］
ＭＳＤ変異レンチウイルスベクターが産生中に産生する導入遺伝子タンパク質が少ない
レンチウイルスベクター産生中の異常なスプライシングを除去する更なる利点は、導入遺伝子タンパク質産生をもたらす導入遺伝子コードｍＲＮＡの量を減少させることである。導入遺伝子発現はレンチウイルスベクター産生に実質的に影響を及ぼし得、これにより、ウイルスベクター産生中の導入遺伝子翻訳を抑制するためのＴＲｉＰシステムを以前に開発した（国際公開第２０１５／０９２４４０号に記載）。手短に言えば、細菌タンパク質「ＴＲＡＰ」は、ベクター産生中に共発現され、５’ＵＴＲ内の導入遺伝子ＯＲＦの上流に挿入されたその「ＴＲＡＰ結合配列」（ｔｂｓ）に結合し、したがって走査型リボソームをブロックする。
この研究の過程で、本発明者等は、予想外にも、ＳＬ２の主要ドナースプライス領域から内部スプライスアクセプタ部位へのスプライシングアウトにより、ベクターゲノムカセットを駆動する「外部」（ＣＭＶ）プロモータから導入遺伝子コードｍＲＮＡが効果的に産生されることを見出した。これが起こる程度は、ｃｐｐｔと導入遺伝子ＯＲＦ（すなわち、プロモータ－５’ＵＴＲ配列）との間の内部配列に依存する。導入遺伝子カセットにおけるＥＦ１ａプロモータ（非常に強いスプライスアクセプタを含有する）の使用は、外部プロモータに由来する全転写物の９５％超においてＭＳＤからの異常なスプライシングをもたらす（図２参照）。標準又はＭＳＤ－２ＫＯレンチウイルスベクター産生培養物における総ＧＦＰ発現を比較することにより（図１２Ｂ）、本発明者等は、産生中に発現される導入遺伝子タンパク質の最大８０％が異常なスプライス産物に由来することを示す。本発明者等は、ＭＳＤ－２ＫＯ遺伝子型をＴＲｉＰシステムと組み合わせると、産生される導入遺伝子タンパク質の減少が増大することを見出した。
［実施例７］
ｔｂｓ－Ｋｏｚａｋ接合の最適化。
４つのｔｂｓ－Ｋｏｚａｋバリアントを設計し（表ＩＩ－パネルＩ参照）、図１４Ａに示すようにＧＦＰレポータ構築物にクローニングした。バリアント０、１及び２は、（コンセンサスＧＮＮＲＶＶＡＴＧに適合する）伸長Ｋｏｚａｋ配列が最後の２つのｔｂｓ反復配列と重複するが、バリアント３は最後のｔｂｓ反復配列のみと重複するように設計した。これらのバリアントを、Ｋｏｚａｋ配列が最終ｔｂｓ反復配列の３ヌクレオチド下流にある元のレポータ（すなわち、オーバーラップなし）と共に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞＋／－ＴＲＡＰ発現プラスミドに個々にコトランスフェクトし、ＧＦＰ発現をトランスフェクションの２日後にフローサイトメトリによって測定した。ＧＦＰ発現スコア（％ＧＦＰ陽性細胞×ＭＦＩ）をフローサイトメトリデータから生成し、プロットした（図１４Ｂ）。
これらのｔｂｓ－Ｋｏｚａｋバリアントのうちの２つを、ｓｃＡＡＶ２ベクターゲノム発現カセット内の２つの異なるプロモータ（ＥＦＳ及びｈｕＰＧＫ）と併せて試験し、重複するｔｂｓ／Ｋｏｚａｋ配列を有さないｔｂｓ含有カセットと比較した。これらのＧＦＰレポータベクターゲノムプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞＋／－ＴＲＡＰ発現プラスミドに個々にコトランスフェクトし、ＧＦＰ発現をトランスフェクションの２日後にフローサイトメトリによって測定した。ＧＦＰ発現スコア（％ＧＦＰ陽性細胞×ＭＦＩ）をフローサイトメトリデータから生成し、プロットした（図１５）。非重複ｔｂｓ／Ｋｏｚａｋバリアント（元のバリアント及びｔｂｓとＫｏｚａｋとの間にＨｐａＩ部位を含む第２のバリアント）は、５０倍～１００倍抑制することができたが、新しいｔｂｓ－Ｋｏｚａｋバリアント（ｔｂｓ＿Ｖ０及びｔｂｓ＿Ｖ３）は、これの少なくとも１０倍（５００倍～３５００倍）抑制された。これらのｔｂｓ－Ｋｏｚａｋバリアントは、Ｌ３３又はＬ１２改良リーダをＥＦＳ又はｈｕＰＧＫプロモータカセットのいずれかに使用した場合にも同様に機能した。重要なことに、新規バリアントの「ＯＮ」レベル（ＴＲＡＰなし）は、非重複ｔｂｓ／Ｋｏｚａｋバリアントと同様であり、新規バリアント内のＫｏｚａｋ配列が効率的な翻訳を指示するのに有効であることを示した。
データは、ｔｂｓ－Ｋｏｚａｋバリアントの全てが同様のレベルの「ＯＮ」導入遺伝子発現が可能であったことを示しており、Ｋｏｚａｋ配列が効率的なレベルの翻訳開始を指示したことを示している。バリアント１は、元のレポータ構成と比較した場合、ＴＲＡＰによる抑制が不十分であった（ＴＲＡＰの存在下でのＧＦＰ発現レベルが１０倍高かった）。しかし、驚くべきことに、バリアント０、２及び３は、元の構成と比較してより低いレベルに抑制された。
Figure 2023513303000014
表ＩＩ：最適な３’ｔｂｓ－Ｋｏｚａｋ接合配列
［パネルＩ］上流ｔｂｓ配列の３’末端と重複するように設計されたバリアントＫｏｚａｋ配列。主導入遺伝子ＡＴＧ開始コドンがｔｂｓの３’末端ＫＡＧＮＮ反復の９ヌクレオチド下流に配置されるように、すなわち重複が存在しないように、伸長Ｋｏｚａｋ配列を配置した。主要導入遺伝子ＡＴＧ開始コドンを上流ｔｂｓにより近づけるために、４つのバリアントを、効率的な伸長Ｋｏｚａｋコンセンサス配列（本明細書ではＧＮＮＲＶＶＡＴＧと定義する）も維持しながら、３’末端ｔｂｓ反復のコンセンサスＫＡＧＮＮ反復が維持されるように設計した。ＫＡＧＮＮ反復配列は括弧内にあり、Ｋｏｚａｋ配列は太字である。
［実施例８］
改良された重複ｔｂｓ－Ｋｏｚａｋバリアントを全長イントロン含有ＥＦ１ａプロモータに組み込む。
先の実施例は、重複しているｔｂｓ－Ｋｏｚａｋバリアントが、重複していないｔｂｓ／Ｋｏｚａｋバリアントと比較して抑制を改善することを示し、これは、ＥＦＳプロモータ（その組み込まれたイントロンを除去することによって切断されたＥＦ１ａプロモータ）との関連で実証された。ｔｂｓ－Ｋｏｚａｋバリアントが完全長ＥＦ１ａプロモータ（すなわち、イントロンのスプライシングアウト後）内で同様に「機能する」かどうかを評価するために、３つのｔｂｓ－Ｋｏｚａｋバリアント（０、２、３）を、ＥＦ１ａプロモータを含むＧＦＰレポータカセットにクローニングした（図１６Ａ）。スプライシング後、５’ＵＴＲは、エクソン１（すなわち、Ｌ３３改良リーダ）、エクソン２の最初のヌクレオチドを含む短い１２ｎｔ配列、次いでｔｂｓ－Ｋｏｚａｋバリアント配列（配列番号１０６）を含む。これらのＧＦＰレポータプラスミドを、ｔｂｓを含有しないレポータと共に、懸濁液、無血清ＨＥＫ２９３Ｔ細胞＋／－ＴＲＡＰ発現プラスミドに個々にコトランスフェクトし、ＧＦＰ発現をトランスフェクションの２日後にフローサイトメトリによって測定した。ＧＦＰ発現スコア（％ＧＦＰ陽性細胞×ＭＦＩ）をフローサイトメトリデータから生成し、プロットした（図１６Ｂ）。更に、これらのｔｂｓ含有ＧＦＰ発現カセットをＨＩＶ－１ベースのレンチウイルスベクターゲノムプラスミド（ＭＳＤ及びｃｒＳＤは不活性化された（）下記参照））にクローニングし、同様の実験を懸濁液、無血清ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で実施して、ＧＦＰ発現スコアを得た（図１６Ｃ）。データは、実際に、重複するｔｂｓ－Ｋｏｚａｋバリアントは、使用した非重複のｔｂｓ／Ｋｏｚａｋバリアントと比較して、導入遺伝子抑制を改善することができたことを示す。
［実施例９］
ｔｂｓの３’末端ＫＡＧＮＮ反復によるコアＫｏｚａｋ配列の漸進的により多くのオクルージョンは、ＴＲＡＰによる漸進的により大きな導入遺伝子抑制をもたらす。
実施例７では、限定された数の重複するｔｂｓ－Ｋｏｚａｋバリアントを生成し、非イントロン含有プロモータＥＦＳ及びｈｕＰＧＫとの関連で試験した。次いで、これらのバリアントを、実施例５においてイントロンを含有する完全なＥＦ１ａプロモータにおいても試験し、この抑制困難なプロモータが、重複するｔｂｓ－Ｋｏｚａｋバリアントを使用することによって抑制され得ることを示した。
ｔｂｓの３’末端ＫＡＧＮＮ反復内にコアＫｏｚａｋ配列を「隠す」ことによる改善されたＴＲＡＰ抑制の原理を更に例示するために、新しいバリアントのパネルを設計した（表ＩＶ参照）。これらは、３つの「オーバーラップグループ」、ＫＡＧａｔｇ（ＫＡＧＮＮコンセンサスは、コアＫｏｚａｋのＡＴＧと可能な限り重複し、すなわちコアＫｏｚａｋのＡＴＧの最初の２ヌクレオチドと重複する）、ＫＡＧＮａｔｇ（ＫＡＧＮＮコンセンサスがコアＫｏｚａｋのＡＴＧの第１のヌクレオチドと重複する）及びＫＡＧＮＮａｔｇ（ＫＡＧＮＮコンセンサスがコアＫｏｚａｋのＡＴＧと重複しない）によって符号化された全ての可能なバリアントに基づいている。（実施例３及び５の初期バリアントｔｂｓ－ｋｚｋＶ０、ｔｂｓ－ｋｚｋＶ１及びｔｂｓ－ｋｚｋＶ２は、これらの定義された群に含まれる）。「ＧＴ」ジヌクレオチドを生成したこれらの群内のバリアントは、これらが潜在性スプライスドナー部位を生成し得るという望ましくない可能性のために生成／評価されなかった。
表ＩＩＩ：更なる例示のために作製した重複ｔｂｓ－Ｋｏｚａｋバリアント
望ましくない（潜在的な）スプライスドナー部位を生成し得る「ＧＴ」ジヌクレオチドを生じるものを除いて、ＫＡＧａｔｇ又はＫＡＧＮａｔｇ又はＫＡＧＮＮａｔｇのコンセンサスに関連する「オーバーラップ群」を表す全ての可能なバリアントを生成した。最初の１０回のＫＡＧＮＮ反復は、ここでは明確にするためにコンセンサスとして提示されているが、主に配列番号８の最初の４８ヌクレオチドであった。３’末端ｔｂｓのＫＡＧＮＮは、各バリアントにおいてコードされたものとして提示されており（イタリック体及び括弧）、コアＫｏｚａｋコンセンサスは太字であり、より広い拡張Ｋｏｚａｋコンセンサスの一部であるとして示される任意のヌクレオチドに下線が引かれている。
Figure 2023513303000015
一般に、ほとんどのバリアントは、ＲＶＶＡＴＧの好ましいコアＫｏｚａｋコンセンサスに適合し、同時に、示されたＫＡＧＮＮ ｔｂｓコンセンサスを含むことに制限される。これらのバリアントをｐＥＦ１ａ－ＧＦＰレポータプラスミドにクローニングしたので、５’ＵＴＲは（そのイントロンのスプライシング後に）Ｌ３３リーダ（エクソン１）に加えてエクソン２からの短い１２ｎｔ配列を含有し、これは重複するｔｂｓ－Ｋｏｚａｋバリアントを使用しない限りＴＲＡＰによって抑制性が低いことが実施例５で以前に示された。懸濁液（無血清）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、典型的にはレンチウイルスベクター（ＬＶ）のトランスフェクション／産生を反映する条件下（例えば、酪酸ナトリウム誘導の包含）で、ＴＲＡＰ発現プラスミドの有無にかかわらずこれらのバリアントで個別にトランスフェクトし、典型的なＬＶ回収時間（トランスフェクションの２日後）でフローサイトメトリを行った。全体的なＧＦＰ発現スコアを、＋／－ＴＲＡＰ条件について生成し（ＧＦＰ×ＭＦＩ％；ＡｒｂＵ）、次いで、倍抑制値を生成し、図１７Ａにプロットした。結果は、コアＫｏｚａｋコンセンサス配列が３’末端ＫＡＧＮＮ ｔｂｓ反復とより多く重複するほど、ＴＲＡＰ抑制のレベルがより良好であることを実証している。各重複群の倍数差の統計分析（Ｔ検定）は、コアＫｏｚａｋが３’末端ＫＡＧＮＮ ｔｂｓ反復とより多く重複したほど抑制の有意な増加を実証し、最良の抑制スコアは、開始コドンの２／３がＫＡＧＮＮ反復の一部を形成するＫＡＧａｔｇ群に由来する。全ての重複バリアントは、非重複ｔｂｓバリアントと比較して、ＴＲＡＰによる統計的により大きな導入遺伝子抑制をもたらした。
データを図１７Ｂで更に層別化し、非抑制「オン」導入遺伝子レベルを最高から最低まで表示した。ＫＡＧａｔｇオーバーラップ群からの２つのバリアントは、ＴＲＡＰ抑制に関してこれらの２つの最良性能バリアントについて、ＧＡＧａｔｇバリアント（ｔｂｓｋｚｋＶ０．Ｇ）が最も高い「オン」レベルを与えたことを示すために強調されており、これはおそらくこれがＲＶＶＡＴＧのコアＫｏｚａｋコンセンサスに適合するのに対して、ＴＡＧａｔｇ（ｔｂｓｋｚｋＶ０．Ｔ）は適合しないからである。
これらのデータは全て、重複しているｔｂｓ－Ｋｏｚａｋバリアントは、重複していないｔｂｓバリアントと比較して、ＴＲＡＰ抑制の媒介においてより効果的であり、好ましくは、ｔｂｓ－Ｋｏｚａｋ重複は、ベクターを形質導入された標的細胞における良好な「ＯＮ」導入遺伝子発現を確実にするために、ＲＶＶＡＴＧのコアＫｏｚａｋコンセンサスに従うという一般原理を裏付けている。したがって、これらの新規ｔｂｓ－Ｋｏｚａｋバリアントの使用は、ウイルスベクター産生中のより効率的な導入遺伝子抑制を可能にし、当該導入遺伝子タンパク質活性がウイルスベクターの力価及び／又は活性に有害である場合、ウイルスベクターの力価の増加を潜在的にもたらす。
［実施例１０］
イントロンを有する一般的なプロモータのＴＲＡＰ媒介抑制を改善するための最適な重複ｔｂｓ－Ｋｏｚａｋバリアントの更なる使用。
実施例８では、重複するｔｂｓ－Ｋｏｚａｋバリアントの使用は、イントロンを含む全長ＥＦ１ａプロモータを使用した場合にＴＲＡＰ媒介抑制を改善することが示された。遺伝子治療のためにウイルスベクターゲノムで広く使用されている類似のプロモータ、例えばＣＡＧプロモータの場合、組み込まれたエクソン／イントロン配列の存在は、ＴＲＡＰ媒介抑制の程度が「天然」エクソン配列内の配列によって影響され得ることを意味する。ＴＲＡＰ媒介抑制を改善するという観点から、特にこれらがスプライシング増強に関与する場合、エクソン配列を変化させることは明白でないか、又は実現可能でない可能性がある（例えば、スプライスドナー部位に近いスプライスエンハンサ要素）。広く使用されているＣＡＧプロモータは、ＣＭＶエンハンサ要素、コアニワトリβ－アクチン遺伝子プロモータ－エクソン１－イントロン配列、及びウサギβ－グロビン遺伝子由来のスプライスアクセプタ－エクソン配列を含む。本発明の他の箇所では、驚くべきことに、ＥＦ１ａプロモータ（Ｌ３３）由来のエクソン１を全てのタイプのｔｂｓバリアントの上流で使用して、ＴＲＡＰ媒介抑制を改善することができ、おそらく、安定なＴＲＡＰ－ｔｂｓ複合体の形成を支援するための良好な配列状況を提供して、効率的な翻訳阻害を可能にすることができることが見出された。重複するｔｂｓ－Ｋｏｚａｋバリアントは、ＥＦ１ａ（イントロン含有）及びイントロンを欠くいくつかの他のプロモータの両方においてＴＲＡＰ媒介抑制を助けることが示された。
この実施例（図１８Ａ参照）では、［ａ］ｔｂｓｋｚｋＶ０．Ｇバリアント（他の実施例ではバリアント「０」とも呼ばれる）をＣＡＧプロモータの「天然」５’ＵＴＲ領域内に配置し（配列番号１１７）、［ｂ］「天然」イントロン含有５’ＵＴＲ領域全体を、ｔｂｓｋｚｋＶ０．Ｇバリアントを有するＥＦ１ａ ５’ＵＴＲ－イントロン領域と交換する（配列番号１１８）ことによって、両方の特徴をＣＡＧプロモータからのＴＲＡＰ媒介抑制の改善に適用した。対応するスプライシングされた配列を、それぞれ配列番号１１９及び配列番号１２０として示す。加えて、ウイルスベクターゲノムにおいてイントロンなしで典型的に使用されるプロモータ（この場合はＣＭＶ）に、異種イントロンを含有する人工５’ＵＴＲを付加することができ、その発現はＴＲＡＰによって効率的に抑制されることが以前に示されていた。具体的には、ｔｂｓｋｚｋＶ０．Ｇバリアント（配列番号１１８）を有するＥＦ１ａ ５’ＵＴＲ－イントロン領域を有する５’ＵＴＲをＣＭＶプロモータ状況で使用した。
これらのレポータ構築物（ＧＦＰをコードする）を、ウイルスベクター産生シナリオをモデル化して、懸濁（無血清）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における「ＯＮ」発現レベル及びＴＲＡＰ媒介抑制の両方について評価した。細胞をＧＦＰレポータプラスミド＋／－ｐＴＲＡＰでトランスフェクトし、トランスフェクション後に酪酸ナトリウムで培養物を誘導し（典型的なウイルスベクター産生による）、トランスフェクションの約２日後（すなわち、典型的なウイルスベクター採取点）にＧＦＰ発現について細胞を分析した。ＧＦＰ発現スコア（ＧＦＰ陽性×ＭＦＩ％；ＡｒｂＵ）を作成し、プロットし（図１８Ｂ）、ＴＲＡＰ抑制スコアを表示した。これらのデータは、典型的なウイルスベクター産生細胞におけるＴＲＡＰ媒介発現が、ｔｂｓｋｚｋＶ０．Ｇバリアントを使用してＣＡＧプロモータから３倍～３０倍改善され得ることを示す。更に、データは、異なるプロモータ由来の「天然」５’ＵＴＲ領域配列を、ｔｂｓＫｚｋＶ０．Ｇバリアントを有するイントロン含有ＥＦ１ａ ５’ＵＴＲで置き換えることができ、実質的に改善されたＴＲＡＰ媒介抑制（３０～４０倍～１００倍未満）及びＴＲＡＰの非存在下での高遺伝子発現の維持（すなわち、ウイルスベクターを形質導入された標的細胞における発現のモデル化）の両方をもたらすことを示す。したがって、新規ＥＦ１ａ－５’ＵＴＲ－イントロン－ｔｂｓｋｚｋＶ０．Ｇ配列は、標的細胞のイントロンによって与えられる既知の利点（すなわち、遺伝子発現の増加）を異種プロモータに提供するのに有用であり得るが、ウイルスベクター産生中の導入遺伝子タンパク質の効率的な抑制も可能にし、当該導入遺伝子タンパク質活性がウイルスベクターの力価に有害である場合、ウイルスベクターの力価の増加を潜在的にもたらす。これは、他の重複ｔｂｓ－Ｋｏｚａｋ配列とのＥＦ１ａ－５’ＵＴＲ－イントロン配列の使用にも当てはまる。
［実施例１１］
異常なスプライス、ベクターの力価及び改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡに対する応答に対する、主要スプライスドナーの変異単独、又は隣接する潜在性スプライスドナー部位の更なる変異と組み合わせた変異の影響の評価。
主要スプライスドナー部位変異単独の影響、又は潜在性スプライスドナー（ｃｒＳＤ；ここでは「ｃｒＳＤ１」とも呼ばれる。）変異（ＭＳＤ－２ＫＯに存在）と組み合わせて評価するために、「ＭＳＤ－１ＫＯ」と命名した別のバリアントをクローニングした（図２０Ａ）。このバリアントは、ＭＳＤ部位にＧＴ＞ＣＡ変異のみを有していた。標準ＬＶゲノム及びＭＳＤ－２ＫＯゲノム（全てＥＦ１ａ－ＧＦＰ導入遺伝子カセットを含有する）と共にＭＳＤ－１ＫＯバリアントゲノムを使用して、ｖＲＮＡのパッケージング領域（２５６Ｕ１）を標的とする改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡの有無にかかわらず、懸濁液（無血清）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによってＬＶ－ＧＦＰ粗収穫材料を生産した。ＬＶ－ＧＦＰ力価が図２０Ｄに示されており、ＭＳＤ部位のみにおける変異がＬＶ力価を低下させるのに十分であり、これらの力価がＭＳＤ－２ＫＯベクターについて観察されるのと同じレベルまで回復可能であることを示す。ＳＬ２ループ内のＭＳＤ領域からの異常なスプライシングの産生後の細胞分析を、非スプライシング産物又は異常なスプライシング産物の両方の検出を可能にするプライマーを使用したＲＴ－ＰＣＲによって、抽出されたポリＡ選択ｍＲＮＡに対して行った（図２０Ｃ；プライマーの位置については図２３を参照されたい）。データは、ＭＳＤの変異のみが潜在性スプライスドナー（ｃｒＳＤ［１］）をすぐ下流で活性化することを示す。分析はまた、ＳＬ２中のＭＳＤ領域からの異常なスプライシングが、「ＭＳＤ－２ＫＯ」バリアント中に存在するＭＳＤと隣接潜在性スプライスドナー（ｃｒＳＤ［１］）の両方の変異によって完全に除去するが、これがパッケージング配列の更に下流のＳＬ４ループ（ｃｒＳＤ２）内に存在する別のマイナースプライスドナー部位を活性化することも明らかにした。（これは前の例でも明らかであった－図４Ｂｉｉ参照）。
［実施例１２］
ＳＬ２中の主要スプライスドナー及び潜在性スプライスドナー部位の変異と組み合わせたパッケージング配列のＳＬ４ループ中の潜在性スプライスドナーの変異の影響の評価。
実施例１１では、ＭＳＤ及びｃｒＳＤ１の両方の変異がパッケージングシグナルのＳＬ２領域から異常なスプライシングを完全に排除するが、これがＳＬ４ループ内の更なる潜在性スプライスドナーを活性化することが示された（図２０Ａ、「ｃｒＳＤ２」を参照されたい）。ＳＬ４のｃｒＳＤ２部位を変異させて活性を失わせることができるかどうかを評価するために、またパッケージング配列への更なる改変が効率的なパッケージングに必要なＲＮＡのフォールディングを損なう可能性があることに留意して、ＭＳＤ－３ＫＯ＿１及びＭＳＤ－３ＫＯ＿２バリアントを設計した。これらは、ＳＬ２にＭＳＤ－２ＫＯ変異を含み、ｃｒＳＤ２部位に「ＧＴ」ジヌクレオチドの単一ヌクレオチド変異を含んでいた（図２０Ａ参照）。ＭＳＤ－３ＫＯ＿１はＧＴジヌクレオチドのＧを「Ｃ」に変異させたが、ＭＳＤ－３ＫＯ＿２変異はＧＴジヌクレオチドのＴ＞Ｃ変異であった。Ｔ＞Ｃ変異は、ＳＬ４ループにおいて、またより広いパッケージング配列の三次モデルにおいても良好な塩基対形成を予測することに留意されたい（Ｋｅａｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１５ Ｍａｙ ２２；３４８（６２３７）：９１７－９２１））。これらの改変を含有するＬＶ－ＥＦ１ａ－ＧＦＰベクターを、産生後の細胞からのベクターＲＮＡの分析（図２１Ａ）及び得られたベクターハーベストの滴定（図２１Ｂ）を含めて、実施例１１に記載されるように製造した。ＭＳＤ－３ＫＯ＿１バリアントにおける異常なスプライシングは除去しているようには見えず、ＲＴ－ＰＣＲ産物のエクソン－エクソン接合の配列決定で、この産物が別の潜在性スプライスドナー部位（ｃｒＳＤ３）に由来することが見出され、１０ヌクレオチド下流で活性化された（ｃｒＳＤ３の配列については図２１Ａレーン７及び８、並びに図２０Ａを参照されたい）。ＭＳＤ－４ＫＯ＿１及びＭＳＤ－４ＫＯ＿２の構築及び試験は、ｃｒＳＤ３からの異常なスプライシングが実際にｃｒＳＤ２のＧ＞Ｃ変異によって活性化されることを実証したが、これは、ｃｒＳＤ３の変異によって廃止されたからである（図２１Ａ；レーン１１～１４）。しかし、驚くべきことに、ＭＳＤ－３ＫＯ＿２バリアントでは、ｃｒＳＤ２からの異常なスプライシングが除去しただけでなく、ｃｒＳＤ３部位が活性化されず（図２１Ａ；レーン９、１０）、ｃｒＳＤ３に対する潜在性スプライシングエンハンサも、ＳＬ４ループ内のＭＳＤ－３ＫＯ＿２の単一のＴ＞Ｃ変異によって除去したこと示している。
より驚くべきことに、ｃｒＳＤ２又はｃｒＳＤ３からの潜在性スプライシングに対するＭＳＤ－２ＫＯｍ５変異の影響があった。先の実施例では、ＭＳＤ－２ＫＯｍ５バリアントは、他のＭＳＤ－２ＫＯスプライスドナー変異体よりも弱毒化が少なく、これは、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡによる力価回復において更なる利益をもたらし得ることが示された。理論に拘束されることを望むものではないが、ＭＳＤ－２ＫＯｍ５バリアントは、ｖＲＮＡによるＵ１ ｓｎＲＮＡの動員が（ＳＬ１ループを標的とする改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡの使用とは別に及びそれに加えて）安定性に有益であり得るという仮説に基づいて、内因性Ｕ１ ｓｎＲＮＡとの最大アニーリングが（機能的スプライスドナーなし）起こり得るように設計した。図２０Ｂは、変異ゲノムがスプライスドナー部位を含まないにもかかわらず、どのように標準、ＭＳＤ－２ＫＯ及びＭＳＤ－２ＫＯｍ５ベクターゲノムｖＲＮＡが内因性Ｕ１ ｓｎＲＮＡとアニーリングすると予測されるかを示す。ＭＳＤ－２ＫＯｍ５バリアントは、理論上、ＭＳＤ－２ＫＯバリアントよりも安定性が高く（すなわち、より多数の水素結合が塩基対合で分裂する）、おそらく標準的なＬＶゲノムよりも大きな程度であるが、スプライシング事象を引き起こすことなく極めて重要に内因性Ｕ１ ｓｎＲＮＡを動員することができる。更に、ＭＳＤ－２ＫＯｍ５は、安定したＳＬ２ループが形成できることを確実にするように設計されたが、これは、パッケージング配列のフォールディングにとって重要であり得るからである。ＭＳＤ－２ＫＯｍ５（及び関連するＭＳＤ－３ＫＯ＿２及びＭＳＤ－４ＫＯ＿２バリアント）について同じ分析を行った際、驚くべきことに、ＳＬ４内のｃｒＳＤ２又はｃｒＳＤ３から異常なスプライシングが起こらないことが見出された。更に、理論に束縛されるものではないが、ＳＬ２ループへの内因性Ｕ１ ｓｎＲＮＡの動員の近接は、ＳＬ４ループ内の潜在性スプライス部位の認識を妨げ得ることが提案される。
この更なる研究で作製された全てのスプライスドナー変異体ベクターは、減少した力価を有していた（ＭＳＤ－２ＫＯｍ５が最も弱毒化されていなかった）が、全てトランスの改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡの供給によって実質的に増強された（図２１Ｂ）。
全体として、これは、ＭＳＤ部位及びｃｒＳＤ１部位の両方の機能的除去をもたらす小さな変異が、パッケージング配列からの一般的な異常なスプライシングの堅固な減少をもたらすが、ＳＬ４ループのｃｒＳＤ２／３部位の補助変異は、それを完全に排除するために必要とされ得ることを示している。ＭＳＤ及びｃｒＳＤ１部位からの異常なスプライシングの機能的除去をもたらす好ましい改変は、ＭＳＤ－２ＫＯｍ５バリアントによって記載されるようなより実質的な改変であり、これはまた、下流のＳＬ４ループ中の小さな潜在性スプライスドナー部位の活性化を可能にしないという驚くべき効果を有し、この改変を有するベクターは、そのパッケージング領域を標的とする改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡの存在下で最高の力価にすることができるからである。
［実施例１３］
スプライスドナー変異ＬＶゲノムは、標的細胞における上流の細胞プロモータによる転写「リードスルー」事象をより少なくする。
標的細胞へのレンチウイルスベクターの組込みは半ランダムであり、ＬＶは転写的に活性な細胞遺伝子への組込みの優先性を示す。上流の細胞プロモータからの組込みＬＶへの転写リードスルー又は「リードイン」が起こり得、ＬＶゲノム内の配列と可動化／相互作用し得ることが他によって示されている（例えば、Ｍｏｉａｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１２ Ｍａｙ １；１２２（５）：１６５３－１６６６を参照されたい）。本発明については、ＭＳＤ変異ＬＶの更なる利点が、標的細胞の染色体内に組み込まれたＬＶの効果に関する患者の安全性の改善であることが予想される。野生型ＨＩＶ－１については、主要スプライスドナーへの内因性Ｕ１ ｓｎＲＮＡの動員が５’ＬＴＲポリアデニル化シグナルの抑制をもたらすことが実証されているため、リードイン中に標準的ＬＶにおいて生じる同様の機構が、Ｕ１ ｓｎＲＮＡの動員に起因してこれを悪化させると考えられ得る。したがって、ＬＶパッケージングシグナル内のＭＳＤ（及び潜在性ＳＤ）の除去は、５’－ＳＩＮＬＴＲによりコードされるポリＡシグナルの使用の増加に起因して、転写リードインの減少をもたらし得る（図２２を参照されたい）。
これを試験するために、ＭＳＤ変異ＬＶベクター及び実施例１２で産生された標準ＬＶベクター（図２１Ｂ参照）を使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及び９２ＢＲ初代細胞（ロバ線維芽細胞）に、一致したＭＯＩで形質導入した（これらは標準ベクター調製物と同様の力価を有するため、２５６Ｕ１の存在下で作製されたＭＳＤ変異ＬＶベクター調製物のみを使用した）。形質導入された細胞培養物を１０日間継代して、未統合ＬＶ ｃＤＮＡ及びそれらから生成された潜在性ＲＮＡの両方を喪失させ、次いで、細胞ＲＮＡを抽出し、ＤＮＡｓｅ処理し、ＬＶのパッケージング領域に対するプライマーを使用してＲＴ－ｑＰＣＲ分析を経た（プライマーの位置については図２２を参照されたい）。検出されたＨＩＶパッケージングＲＮＡのコピーをＧＡＰＤＨ ＲＮＡシグナル（ＲＮＡローディング対照）に対して正規化し、次いで統合ＬＶ ＤＮＡコピー数に対して正規化した。標準ＬＶベクター（２５６Ｕ１なしで作製）について検出されたＨＩＶパッケージングＲＮＡの総正規化コピーを各細胞型について１に設定し、これに対して他の全ての関連する正規化コピー数を設定した。図２３は、この分析の結果を示しており、実際、ＬＶゲノム内に変異ＭＳＤ及び潜在性ＳＤを有するという特徴が、転写リードイン事象の２～５倍の減少をもたらしたことを示している。これらのデータは全て、ＭＳＤ／ｃｒＳＤ変異ＬＶが、形質導入細胞において標準ＬＶよりも良好な安全性プロファイルをもたらし、ＬＶ骨格動員及び／又はＬＶ配列との相互作用を可能にする傾向がより低いことを示している。

Claims (54)

  1. レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列であって、前記レンチウイルスベクターの前記ＲＮＡゲノム中の主要スプライスドナー部位は不活性化されており、前記主要スプライスドナー部位に対する潜在性スプライスドナー部位３’は不活性化されている、レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列。
  2. 前記レンチウイルスベクターが第３世代レンチウイルスベクターである、請求項１に記載のレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列。
  3. レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列であって、前記レンチウイルスベクターの前記ＲＮＡゲノム中の前記主要スプライスドナー部位が不活性化されており、前記主要スプライスドナー部位に対する前記潜在性スプライスドナー部位３’が不活性化されており、前記ヌクレオチド配列が、ｔａｔ非依存性レンチウイルスベクターで使用するためのものである、レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列。
  4. レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列であって、前記レンチウイルスベクターの前記ＲＮＡゲノム中の前記主要スプライスドナー部位が不活性化されており、前記主要スプライスドナー部位に対する前記潜在性スプライスドナー部位３’が不活性化されており、前記ヌクレオチド配列が、ｔａｔの非存在下で産生される、レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列。
  5. レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列であって、前記レンチウイルスベクターの前記ＲＮＡゲノム中の前記主要スプライスドナー部位が不活性化されており、前記主要スプライスドナー部位に対する前記潜在性スプライスドナー部位３’が不活性化されており、前記ヌクレオチド配列が、ｔａｔとは無関係に転写されている、レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列。
  6. レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列であって、前記レンチウイルスベクターの前記ＲＮＡゲノム中の前記主要スプライスドナー部位が不活性化されており、前記主要スプライスドナー部位に対する前記潜在性スプライスドナー部位３’が不活性化されており、前記ヌクレオチド配列が、Ｕ３非依存性レンチウイルスベクターで使用するためのものである、レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列。
  7. レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列であって、前記レンチウイルスベクターの前記ＲＮＡゲノム中の前記主要スプライスドナー部位が不活性化されており、前記主要スプライスドナー部位に対する前記潜在性スプライスドナー部位３’が不活性化されており、前記ヌクレオチド配列が、前記Ｕ３プロモータとは無関係に転写されている、レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列。
  8. レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列であって、前記レンチウイルスベクターの前記ＲＮＡゲノム中の前記主要スプライスドナー部位が不活性化されており、前記主要スプライスドナー部位に対する前記潜在性スプライスドナー部位３’が不活性化されており、前記ヌクレオチド配列が、異種プロモータによって転写されている、レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列。
  9. 前記潜在性スプライスドナー部位が、前記主要スプライスドナー部位に対する前記第１の潜在性スプライスドナー部位３’である、請求項１～８のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列。
  10. 前記潜在性スプライスドナー部位が前記主要スプライスドナー部位の６ヌクレオチド以内にある、請求項１～９のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列。
  11. 前記主要スプライスドナー部位及び潜在性スプライスドナー部位が変異又は欠失されている、請求項１～１０のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列。
  12. 前記スプライス部位の不活性化前のヌクレオチド配列が、配列番号１、３、４、９、１０及び／又は１３のいずれかに記載の配列を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列。
  13. 前記ヌクレオチド配列が、配列番号１、３、４、９、１０及び／又は１３のいずれかに記載の配列と比較して変異又は欠失を有する配列を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列。
  14. 前記ヌクレオチド配列が、不活性化された主要スプライスドナー部位を含み、そうでなければ配列番号１のヌクレオチド１３及び１４に対応するヌクレオチド間に切断部位を有する、請求項１～１３のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列。
  15. 不活性化前の前記主要スプライスドナー部位の前記ヌクレオチド配列が、配列番号４に示される配列を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列。
  16. 不活性化前の前記潜在性スプライスドナー部位の前記ヌクレオチド配列が、配列番号１０に示される配列を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列。
  17. 前記ヌクレオチド配列が、不活性化された潜在性スプライスドナー部位を含み、そうでなければ配列番号１のヌクレオチド１７及び１８に対応するヌクレオチド間に切断部位を有する、請求項１～１６のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列。
  18. 前記ヌクレオチド配列が、配列番号２、５、６、７、８、１１、１２及び／又は１４のいずれかに記載の配列を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列。
  19. 前記ヌクレオチド配列が、配列番号９に示される配列を含まない、請求項１～１８のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列。
  20. 前記レンチウイルスベクターの前記ＲＮＡゲノムの前記主要スプライスドナー部位及び潜在性スプライスドナー部位からのスプライシング活性が抑制又は除去されている、請求項１～１９のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列。
  21. 前記レンチウイルスベクターの前記ＲＮＡゲノムの前記主要スプライスドナー部位及び潜在性スプライスドナー部位からのスプライシング活性が、トランスフェクト細胞又は形質導入細胞において、抑制又は除去されている、請求項１～２０のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列。
  22. 前記ヌクレオチド配列が、前記パッケージング配列のＳＬ４ループ内の潜在性スプライスドナー部位に変異を更に含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列。
  23. 前記パッケージング配列の前記ＳＬ４ループ内の前記潜在性スプライスドナー部位のＧＴジヌクレオチドがＧＣに変異している、請求項２２に記載のレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列。
  24. 前記ヌクレオチド配列が、目的のヌクレオチドを更に含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列。
  25. 前記目的のヌクレオチドが治療効果をもたらす、請求項２４に記載のレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列。
  26. 前記レンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列がベクター導入遺伝子発現カセットである、請求項１～２５のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列。
  27. 前記ヌクレオチド配列が、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を更に含み、前記改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡが、ＭＳＤ変異レンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域内のヌクレオチド配列に結合するように改変されている、請求項１～２６のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列。
  28. 前記レンチウイルスベクターの前記ＲＮＡゲノムをコードする前記ヌクレオチド配列が、前記改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、請求項２７に記載のレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列。
  29. 前記ヌクレオチド配列が、トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）結合部位を更に含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列。
  30. 前記ヌクレオチド配列が目的のヌクレオチドを含み、（ｉ）前記ＴＲＡＰ結合部位が前記目的のヌクレオチドの開始コドンＡＴＧと重複し、及び／又は前記核酸配列がＫｏｚａｋ配列も含み、前記ＴＲＡＰ結合部位が前記Ｋｏｚａｋ配列と重複する、請求項２７に記載のレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列。
  31. 前記ヌクレオチド配列が目的のヌクレオチドを含み、（ｉ）前記ＴＲＡＰ結合部位が前記目的のヌクレオチドの前記開始コドンＡＴＧの一部を含むか、又は前記ＡＴＧ開始コドンが前記ＴＲＡＰ結合部位の一部を含み、及び／又は前記ヌクレオチド配列がＫｏｚａｋ配列を更に含み、前記Ｋｏｚａｋ配列が前記ＴＲＡＰ結合部位の一部を含む、請求項２９に記載のレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列。
  32. 前記ヌクレオチド配列が、マルチクローニング部位及びＫｏｚａｋ配列を更に含み、前記マルチクローニング部位が、前記ＴＲＡＰ結合部位の３’ＫＡＧＮ２－３反復と重複するか、又は前記ＴＲＡＰ結合部位の３’ＫＡＧＮ２－３反復の下流及び前記Ｋｏｚａｋ配列の上流に位置する、請求項２９に記載のレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列。
  33. 前記ＴＲＡＰ結合部位又はその一部の前記３’末端ＫＡＧＮＮ反復が、少なくとも前記開始コドンＡＴＧの第１のヌクレオチドと重複する、請求項２９～３２のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列。
  34. 前記ＴＲＡＰ結合部位又はその一部の前記３’末端ＫＡＧＮＮ反復が、前記開始コドンＡＴＧの最初の２つのヌクレオチドと重複する、請求項２９～３３のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列。
  35. 前記ＴＲＡＰ結合部位又はその一部の前記３’末端ＫＡＧＮＮ反復が、コアＫｏｚａｋ配列内の前記開始コドンＡＴＧの第１のヌクレオチドと重複する、請求項２９～３４のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードする核酸配列。
  36. 前記核酸配列が、配列番号１１４又は配列番号１１６で定義される配列を含む、請求項２９～３５のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードする核酸配列。
  37. 前記目的のヌクレオチドが前記ＴＲＡＰ結合部位又はその一部に作動可能に連結されている、請求項２９～３６のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列。
  38. 請求項１～３７のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列を含む発現カセット。
  39. 前記ヌクレオチド配列が、請求項１～３８のいずれか一項で定義される、ｇａｇ－ｐｏｌ、ｅｎｖ、場合によりｒｅｖ及びレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムを含むベクター成分をコードする、ヌクレオチド配列のセットを含むウイルスベクター産生システム。
  40. 請求項１～３７のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列を含む細胞、請求項３６に記載の発現カセット又は請求項３９に記載のウイルスベクター産生システム。
  41. レンチウイルスベクターを産生するための細胞であって、
    （ｉｖ）ａ）ｇａｇ－ｐｏｌ及びｅｎｖ、並びに場合によりｒｅｖを含むベクター成分をコードするヌクレオチド配列、並びに請求項１～３７のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム又は請求項３８に記載の発現カセットをコードするヌクレオチド配列；又は
    ｂ）請求項３９に記載のウイルスベクター産生システム；及び
    （ｖ）場合により、改変Ｕ１ ｓｎＲＮＡをコードするヌクレオチド配列及び／又は場合によりＴＲＡＰをコードするヌクレオチド配列、
    を含む、レンチウイルスベクターを産生するための細胞。
  42. 前記レンチウイルスベクターの前記ＲＮＡゲノムの前記主要スプライスドナー部位及び／又はスプライスドナー領域からのスプライシング活性が抑制又は除去される、請求項４０又は４１に記載の細胞。
  43. 前記レンチウイルスベクターの前記ＲＮＡゲノムの前記主要スプライスドナー部位及び／又はスプライスドナー領域からのスプライシング活性が、レンチウイルスベクター産生中に抑制又は除去される、請求項４２に記載の細胞。
  44. 前記目的のヌクレオチドの翻訳がレンチウイルスベクター産生中に抑制される、請求項４０～４３のいずれか一項に記載の細胞。
  45. レンチウイルスベクターの製造方法であって、
    （ｉｖ）
    ａ）ｇａｇ－ｐｏｌ及びｅｎｖ、並びに場合によりｒｅｖを含むベクター成分をコードするヌクレオチド配列、並びに請求項１～３７のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム又は請求項３８に記載の発現カセットをコードするヌクレオチド配列；又は
    ｂ）請求項３９に記載のウイルスベクター産生システムを、
    細胞に導入する工程と、
    （ｖ）場合により、ベクター成分をコードする前記ヌクレオチド配列及び前記レンチウイルスベクターの前記ＲＮＡゲノムを含む細胞を選択する工程と、
    （ｖｉ）前記レンチウイルスベクターの産生に適した条件下で前記細胞を培養する工程と、
    を含む、レンチウイルスベクターの製造方法。
  46. 工程（ｉ）が、ＴＲＡＰをコードするヌクレオチド配列を前記細胞に導入することを更に含む、請求項４５に記載の方法。
  47. 工程（ｉ）が、改変ｕ１ ｓｎＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を導入することを更に含む、請求項４５又は請求項４６に記載の方法。
  48. 請求項４５～４７のいずれか一項に記載の方法によって産生されたレンチウイルスベクター。
  49. 前記レンチウイルスベクターが、請求項１～３７のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムを含む、請求項４８に記載のレンチウイルスベクター。
  50. レンチウイルスベクターを産生するための、請求項１～３７のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列、請求項３８に記載の発現カセット、請求項３９に記載のウイルスベクター産生システム、又は請求項４０～４４のいずれか一項に記載の細胞の使用。
  51. 前記レンチウイルスベクターの前記ＲＮＡゲノムの前記主要スプライスドナー部位及び／又はスプライスドナー領域からのスプライシング活性を抑制又は除去するための、請求項１～３７のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列、請求項３８に記載の発現カセット、請求項３９に記載のウイルスベクター産生システム、又は請求項４０～４４のいずれか一項に記載の細胞の使用。
  52. 前記レンチウイルスベクターの前記ＲＮＡゲノムの前記主要スプライスドナー部位及び／又はスプライスドナー領域からのスプライシング活性が、トランスフェクト細胞又は形質導入細胞において抑制又は除去される、請求項４８に記載の使用。
  53. 前記目的のヌクレオチドの翻訳を抑制するための、請求項１～３７のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムをコードするヌクレオチド配列、請求項３８に記載の発現カセット、請求項３９に記載のウイルスベクター産生システム、又は請求項４０～４４のいずれか一項に記載の細胞の使用。
  54. 請求項１～３７のいずれか一項に記載のＲＮＡゲノムを含むレンチウイルスベクター。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB202114534D0 (en) 2021-10-12 2021-11-24 Oxford Biomedica Ltd Novel viral regulatory elements
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GB202114532D0 (en) 2021-10-12 2021-11-24 Oxford Biomedica Ltd Lentiviral Vectors
US20230346977A1 (en) 2022-04-13 2023-11-02 Universitat Autònoma De Barcelona Treatment of neuromuscular diseases via gene therapy that expresses klotho protein
GB202211935D0 (en) 2022-08-16 2022-09-28 Oxford Biomedica Ltd envelope proteins

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5512421A (en) 1991-02-19 1996-04-30 The Regents Of The University Of California Generation, concentration and efficient transfer of VSV-G pseudotyped retroviral vectors
US5723315A (en) 1996-08-23 1998-03-03 Genetics Institute, Inc. Secreted proteins and polynucleotides encoding them
US6100071A (en) 1996-05-07 2000-08-08 Genentech, Inc. Receptors as novel inhibitors of vascular endothelial growth factor activity and processes for their production
JP2000517297A (ja) 1996-08-07 2000-12-26 ダーウィン・ディスカバリー・リミテッド Ｍｍｐとｔｎｆの抑制活性を有するヒドロキサム酸誘導体およびカルボン酸誘導体
US6126939A (en) 1996-09-03 2000-10-03 Yeda Research And Development Co. Ltd. Anti-inflammatory dipeptide and pharmaceutical composition thereof
WO1998017815A1 (en) 1996-10-17 1998-04-30 Oxford Biomedica (Uk) Limited Retroviral vectors
US6924123B2 (en) 1996-10-29 2005-08-02 Oxford Biomedica (Uk) Limited Lentiviral LTR-deleted vector
WO2000000600A2 (en) * 1997-09-22 2000-01-06 Chang Lung Ji Lentiviral vectors, comprising modified major donor splice sites and major packaging signals
CN1322137C (zh) 1997-12-22 2007-06-20 牛津生物医学（英国）有限公司 基于马传染性贫血病毒(eiav)的逆转录病毒载体
GB9803351D0 (en) 1998-02-17 1998-04-15 Oxford Biomedica Ltd Anti-viral vectors
EP1082447A2 (en) * 1998-05-26 2001-03-14 Lung-Ji Chang Lentiviral vectors, comprising modified major donor splice sites and major packaging singals
GB9904905D0 (en) 1999-03-03 1999-04-28 Oxford Biomedica Ltd Cells
GB0009760D0 (en) 2000-04-19 2000-06-07 Oxford Biomedica Ltd Method
JP4598398B2 (ja) 2002-02-01 2010-12-15 オックスフォード バイオメディカ （ユーケー） リミテッド ウイルスベクター
JP4992032B2 (ja) 2002-09-03 2012-08-08 オックスフォード バイオメディカ（ユーケー）リミテッド レトロウイルスベクター
FR2872170B1 (fr) 2004-06-25 2006-11-10 Centre Nat Rech Scient Cnrse Lentivirus non interactif et non replicatif, preparation et utilisations
GB0526211D0 (en) 2005-12-22 2006-02-01 Oxford Biomedica Ltd Viral vectors
GB0526210D0 (en) 2005-12-22 2006-02-01 Oxford Biomedica Ltd Vectors
JP5615271B2 (ja) 2008-06-18 2014-10-29 オックスフォード バイオメディカ（ユーケー）リミテッド ウイルス精製法
WO2012156839A2 (en) * 2011-05-19 2012-11-22 Ospedale San Raffaele S.R.L. New generation of splice-less lentiviral vectors for safer gene therapy applications
GB201322798D0 (en) 2013-12-20 2014-02-05 Oxford Biomedica Ltd Production system
EP3696272A1 (en) 2017-12-22 2020-08-19 Oxford BioMedica (UK) Limited Retroviral vector

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