CN115667533A - 慢病毒载体的生产 - Google Patents

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CN115667533A CN202180020935.4A CN202180020935A CN115667533A CN 115667533 A CN115667533 A CN 115667533A CN 202180020935 A CN202180020935 A CN 202180020935A CN 115667533 A CN115667533 A CN 115667533A
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Abstract

一种编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中慢病毒载体的RNA基因组中的主要剪接供体位点失活，并且其中主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活。

Description

慢病毒载体的生产
技术领域
本发明涉及在真核细胞中生产慢病毒载体。更具体地，本发明涉及载体基因组中的主要剪接供体位点和相邻的隐蔽剪接供体位点的失活。本发明提供了一种编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中慢病毒载体的RNA基因组中的主要剪接供体位点失活，并且其中位于主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活。本发明还包括涉及这种核苷酸序列的方法和用途。
背景技术
在过去的几十年中，在科学期刊和专利中详细记载了用于疫苗和人类基因治疗的病毒载体的开发和制造。使用工程改造的病毒递送转基因以达到治疗效果的用途十分广泛。基于RNA病毒和DNA病毒的现代基因治疗载体已经在越来越多的人类疾病适应症中显示出前景，其中RNA病毒例如为γ-逆转录病毒和慢病毒(Muhlebach,M.D.et al.,2010,Retroviruses:Molecular Biology,Genomics and Pathogenesis,13:347-370；Antoniou,M.N.,Skipper,K.A.&Anakok,O.,2013,Hum.Gene Ther.,24:363-374)，而DNA病毒例如为腺病毒(Capasso,C.et al.,2014,Viruses,6:832-855)和腺相关病毒(AAV)(Kotterman,M.A.&Schaffer,D.V.,2014,Nat.Rev.Genet.,15:445-451)。这些方法包括针对血液病对患者细胞进行的离体修饰(Morgan,R.A.&Kakarla,S.,2014,Cancer J.,20:145-150；Touzot,F.et al.,2014,Expert Opin.Biol.Ther.,14:789-798)以及针对眼科(Balaggan,K.S.&Ali,R.R.,2012,Gene Ther.,19:145-153)、心血管(Katz,M.G.et al.,2013,Hum.GeneTher.,24:914-927)、神经退行性疾病(Coune,P.G.,Schneider,B.L.&Aebischer,P.,2012,Cold Spring Harb.Perspect.Med.,4:a009431)进行的体内治疗、以及肿瘤疗法(Pazarentzos,E.&Mazarakis,N.D.,2014,Adv.Exp.Med Biol.,818:255-280)。
随着这些方法在临床试验中的成功开始朝着监管批准和商业化方向发展，考虑向患者施用病毒载体时(例如在疫苗接种和基因治疗的情况下)所涉及的安全方面变得十分重要。
本领域持续需要具有改进的安全性的病毒载体。
发明内容
本发明基于在慢病毒载体基因组的包装区域中的主要剪接供体位点和相邻的隐蔽剪接供体位点的失活。慢病毒载体基因组中存在的主要剪接供体位点(MSD)通常嵌入含有高度结构化RNA的包装区域内，朝向RNA的5'区域。
逆转录病毒基因组内的剪接供体位点已被证明对生产细胞内的病毒RNA(vRNA)稳定性很重要。然而，本发明人表明，慢病毒载体基因组表达盒内的MSD的活性可能是高度混杂的，并且可以非常有效地剪接内部表达盒内的强或甚至弱的隐蔽剪接受体位点，这些位点通常位于下游>1350bp处。令人惊讶的是，根据内部序列，多达95％的源自驱动vRNA生产的外部启动子的可检测细胞质mRNA被剪接。
对于高效的载体生产，未剪接的可包装vRNA是最理想的产物，这种载体的组分通常是瞬时和稳定转染载体生产设置的限制因素。此外，如果这种异常剪接的mRNA编码目的转基因(例如剪接到内部启动子-utr序列中)，则该mRNA将被输出并能够在载体生产过程中被有效翻译；这将独立于内部启动子是否是弱/沉默(组织特异性)启动子而发生。
此外，当来自上游细胞启动子的通读转录发生时(慢病毒载体靶向活性转录位点)，其他人已证明了在转导(患者)细胞中递送的载体骨架中存在MSD可被剪接机制利用，导致出现具有细胞外显子的潜在异常剪接产物。因此，有几个原因表明为什么需要对慢病毒载体基因组中的MSD位点进行功能性突变。
其他人已经生产了在MSD位点内含有突变的早期慢病毒载体，但这些载体含有固有的U3启动子以驱动vRNA的转录，因此依赖于以反式提供的tat进行反式激活。第三代慢病毒载体用异源启动子元件替换了U3启动子，并且不需要tat进行转录。监管机构将第三代载体的U3/tat独立性视为安全性的重要进步，因为tat是细胞基因的反式激活因子，并且可以在肿瘤发生中发挥作用。
在一个方面中，本发明提供了编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中慢病毒载体的RNA基因组中的主要剪接供体位点失活，并且位于主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活。
在本发明实施例中证明，慢病毒载体的RNA基因组中的主要剪接供体位点和位于主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点的失活提供了对单独突变的改进。还如在本发明实施例中所证明的，本发明有助于减少靶细胞中的整合慢病毒载体中的转录通读，例如减少至少2倍。
在一个方面中，根据本发明的核苷酸序列用于不依赖U3或tat的慢病毒载体系统。在一个方面中，慢病毒载体系统可以是如本文所述的第三代慢病毒载体系统。
隐蔽剪接供体位点是位于主要剪接供体位点3'的第一个隐蔽剪接供体位点或序列。在一个方面中，隐蔽剪接供体位点或序列在主要剪接供体位点的6个核苷酸内。主要剪接供体位点和隐蔽剪接供体位点可能会发生突变或被删除。
在一个方面中，本发明提供了编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中该核苷酸序列在剪接位点失活前包括如SEQ ID NO:1、3、4、9、10和/或13中任一个所示的序列。核苷酸序列可包括相对于SEQ ID NO:1、3、4、9、10和/或13中任一个所示的序列具有突变或删除的序列。在一个方面中，序列包括SEQ ID NO:13。
在一个方面中，核苷酸序列包含失活的主要剪接供体位点，否则该核苷酸序列将在主要剪接供体区域(SEQ ID NO:13)的核苷酸1的紧邻上游具有切割位点。
在一个方面中，核苷酸序列包含失活的主要剪接供体位点和失活的隐蔽剪接供体位点，否则该核苷酸序列将在主要剪接供体区域(SEQ ID NO:13)的核苷酸1的紧邻上游、以及对应于核苷酸的核苷酸4和5之间具有切割位点。
在一个方面中，核苷酸序列包含失活的主要剪接供体位点，否则该核苷酸序列将在对应于SEQ ID NO:1的核苷酸13和14的核苷酸之间具有切割位点。
在另一方面中，主要剪接供体位点失活前的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:4中所示的序列。在一个方面中，隐蔽剪接供体位点失活前的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:10中所示的序列。
核苷酸序列可以包含失活的隐蔽剪接供体位点，否则该核苷酸序列将具有对应于SEQ ID NO:1的核苷酸17和18的核苷酸之间的切割位点。
在一个方面中，根据本发明的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:2、5、6、7、8、11、12和/或14中任一个所示的序列。
在优选的方面中，核苷酸序列包括如SEQ ID NO:14所示的序列。
在另个一方面中，核苷酸序列不包括如SEQ ID NO:9所示的序列。
例如在转染细胞或转导细胞中，慢病毒载体的RNA基因组的主要剪接供体位点和隐蔽剪接供体位点的剪接活性可以被抑制或去除。
在一个方面中，核苷酸序列可适用于在用于载体生产的不依赖U3或tat的系统中的慢病毒载体。如本文所述，第三代慢病毒载体不依赖U3/tat，因此根据本发明的核苷酸序列可用于第三代慢病毒载体的情况中。在本发明的一个方面中，慢病毒载体生产系统中不提供tat，例如不以反式提供tat。在一个方面中，如本文所述的细胞或载体或载体生产系统不包含tat蛋白。在本发明的一个方面中，慢病毒载体生产系统中不存在HIV-1U3，例如不以顺式形式提供HIV-1U3以驱动载体基因组表达盒的转录。
在一个方面中，本发明提供了一种编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中慢病毒载体的RNA基因组中的主要剪接供体位点失活，并且其中位于主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活，其中所述核苷酸序列用于不依赖于tat的慢病毒载体。
在一个方面中，本发明提供了编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中慢病毒载体的RNA基因组中的主要剪接供体位点失活，并且其中位于主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活，其中所述核苷酸序列是在不存在tat的情况下产生的。
在一个方面中，本发明提供了编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中慢病毒载体的RNA基因组中的主要剪接供体位点失活，并且其中位于主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活，其中所述核苷酸序列已经独立于tat而转录。
在一个方面中，本发明提供了编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中慢病毒载体的RNA基因组中的主要剪接供体位点失活，并且其中位于主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活，其中所述核苷酸序列用于不依赖U3的慢病毒载体。
在一个方面中，本发明提供了编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中慢病毒载体的RNA基因组中的主要剪接供体位点失活，并且其中位于主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活，其中所述核苷酸序列已经独立于U3启动子而转录。
在一个方面中，本发明提供了编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中慢病毒载体的RNA基因组中的主要剪接供体位点失活，并且其中位于主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活，其中所述核苷酸序列已被异源启动子转录。
在一个方面中，如本文所述的核苷酸序列的转录不依赖于U3的存在。核苷酸序列可以源自不依赖U3的转录事件。核苷酸序列可以源自异源启动子。如本文所述的核苷酸序列可不包含天然U3启动子。
在一个方面中，如本文所述的核苷酸序列可任选地进一步包括在包装序列的SL4环内的隐蔽剪接供体位点中的突变。在一个方面中，包装序列的SL4环内的所述隐蔽剪接供体位点中的GT二核苷酸突变为GC。
在一个方面中，核苷酸序列进一步包括可以产生治疗效果的目的核苷酸。
在另个一方面中，编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列是载体转基因表达盒。
在另一个方面中，本发明的核苷酸序列可以进一步包含编码经修饰的U1 snRNA的核苷酸序列，其中所述经修饰的U1 snRNA已经被修饰以结合MSD突变的慢病毒载体基因组的包装区域内的核苷酸序列。编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列可以能够连接至编码经修饰的U1 snRNA的核苷酸序列。在一个方面中，编码经修饰的U1 snRNA的核苷酸序列与编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列位于不同的核苷酸序列上，例如在不同的质粒上。
在另一个方面中，核苷酸序列进一步包含色氨酸RNA结合衰减蛋白(TRAP)结合位点，并且还可以包含Kozak序列，其中所述TRAP结合位点与Kozak序列重叠，或其中所述Kozak序列包含TRAP结合位点的一部分。核苷酸序列还可以进一步包含多克隆位点和Kozak序列，其中所述多克隆位点与TRAP结合位点的3'KAGN2-3重复序列重叠或位于其下游和Kozak序列上游。目的核苷酸可以能够连接到TRAP结合位点或其部分。
在一个方面中，本发明提供了一种核酸序列，其包含目的核苷酸(转基因)和色氨酸RNA结合衰减蛋白(TRAP)结合位点，其中TRAP结合位点与转基因起始密码子ATG重叠。
本文中与Kozak序列/重叠Kozak序列有关的任何公开内容同样适用于(在适当的情况下)涉及起始密码子的ATG以及与其重叠的等效方面。
在另一个方面中，本发明提供了包含目的核苷酸和Kozak序列的核酸序列，其中所述Kozak序列包含色氨酸RNA结合衰减蛋白(TRAP)结合位点的一部分。
在一个方面中，本发明提供了包含目的核苷酸(转基因)和TRAP结合位点的核酸序列，其中TRAP结合位点包含转基因起始密码子ATG的一部分，反之亦然。
本发明还提供了一种表达盒，其包含如本文定义的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列。
本发明还提供了包含一组核苷酸序列的病毒载体生产系统，其中所述核苷酸序列编码载体组分，载体部分包括gag-pol、env、任选的rev和本文定义的慢病毒载体的RNA基因组。
在一个方面中，本发明还提供了一种细胞，其包含如本文定义的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列、表达盒或病毒载体生产系统。
一种用于生产慢病毒载体的细胞可以包括：
(i)a)编码载体组分的核苷酸序列，所述载体组分包括gag-pol和env，以及任选的rev，以及如本文定义的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列或如本文定义的表达盒；或者
b)如本文定义的病毒载体生产系统；和
(ii)任选地编码经修饰的U1 snRNA的核苷酸序列；和
(iii)任选地编码TRAP的核苷酸序列。
例如在慢病毒载体生产期间，在细胞中，来自慢病毒载体的RNA基因组的主要剪接供体位点和/或剪接供体区域的剪接活性可以被抑制或消除。在一个方面中，目标核苷酸的翻译在慢病毒载体生产过程中被抑制。
本发明还提供了一种生产慢病毒载体的方法，包括以下步骤：
(i)将以下引入细胞中：
a)编码载体组分的核苷酸序列，载体组分包括gag-pol和env，以及任选的rev，以及如本文定义的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列或如本文定义的表达盒；或者
b)如本文定义的病毒载体生产系统；
(ii)任选地选择包含所述编码载体组分和慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列的细胞；
(iii)在适合生产慢病毒载体的条件下培养细胞。
该方法还可以包括将编码TRAP的核苷酸序列引入细胞中。
该方法可以另外包括引入编码经修饰的U1 snRNA的核苷酸序列。
本发明还扩展至通过如本文定义的任何方法生产的慢病毒载体。
在一个方面中，本发明提供了如本文定义的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列、如本文定义的表达盒、如本文定义的病毒载体生产系统或如本文定义的细胞用于生产慢病毒载体的用途，或用于例如在转染细胞或转导细胞中，抑制或消除来自慢病毒载体的RNA基因组的主要剪接供体位点和/或剪接供体区域的剪接活性的用途。
附图说明
图1：U1 snRNA分子的示意图以及如何修饰用于本发明的靶向序列的实例。内源性非编码RNA U1 snRNA在内含子剪接的早期阶段中通过5'-(AC)UUACCUG-3'(灰色突出显示)天然剪接供体靶向序列与共有剪接供体位点(5'-MAGGURR-3')结合。茎环I与U1A-70K蛋白结合，该蛋白已被证明对polyA抑制很重要。茎环II与U1A蛋白结合，并且5'-AUUUGUGG-3'序列与茎环IV一起与Sm蛋白结合，Sm蛋白对U1 snRNA加工很重要。在本发明中，经修饰的U1snRNA被修饰以在天然剪接供体靶向序列的位点处引入与载体基因组vRNA分子内的靶序列互补的异源序列；在该图中，给出的实例将经修饰的U1 snRNA定向至标准HIV-1慢病毒载体基因组的15个核苷酸(相对于载体基因组分子的第一个核苷酸为256-270，256U1)(如果是包装信号，则位于SL1环中)。
图2：基于HIV-1的慢病毒载体内主要剪接供体位点(MSD)的异常剪接的影响。A.示出第三代(自失活(SIN))慢病毒载体表达盒的典型构造以及在慢病毒载体生产过程中产生的mRNA类型的示意图，该表达盒包含嵌入包装信号的茎环(SL2)内的功能性主要剪接供体。图中示出由“标准”慢病毒载体(LV)DNA盒和(a)在MSD区域具有抑制或去除来自MSD的混杂活性的功能性突变的慢病毒载体DNA盒(“MSD-KO LV DNA盒”)产生的mRNA的类型。对于这两个盒，全长(“未剪接的”)载体RNA(vRNA)由与rev应答元件(RRE)结合的rev的共表达产生，并且通常认为抑制MSD对RRE序列内包括的剪接受体7(sa7)的剪接。对于标准慢病毒载体DNA盒，在不存在rev的情况下，通常认为所有内含子的剪出都能有效地发生(“经剪接的”)。然而，在慢病毒载体生产过程中可能产生“异常”剪接产物，其中MSD高效地剪接剪接受体位点或隐蔽剪接受体位点(经“异常”剪接的)，通常“忽略”含有RRE的内含子，使得rev对MSD的这种活性的影响最小。也可以通过重新定向到MSD突变的慢病毒载体DNA盒的包装区域的经修饰的U1 snRNA的共表达进行慢病毒载体的生产。(图例：Pro，启动子；从5'R到gag的区域包含包装元件{Ψ}；msd，主要剪接供体；cppt，中央多嘌呤束；Int，内含子；sd/sa，剪接供体/受体；GOI，目的基因；灰色箭头指示用来评估在第三代慢病毒载体生产过程中产生的未剪接的vRNA的占比的正向{f}和反向{r}引物的位置。为清楚起见，未显示转录后调节元件{PRE})。B.在+/-rev的HEK293T细胞中进行标准第三代慢病毒载体生产，并从生产后的细胞中提取的总RNA。使用两个引物组(A中标记的位置)对总RNA进行qPCR(SYBR绿色)：f+rT扩增了由慢病毒载体表达盒产生的总转录物，并且f+rUS扩增了未剪接的转录物；因此，计算了未剪接的vRNA转录物在总vRNA转录物中的占比并进行了绘制。数据表明在标准第三代慢病毒载体生产过程中未剪接的vRNA相对于总数的占比是适中的，并且根据内部转基因盒(在该例中包含不同的启动子和GFP基因)而变化；此外，这个占比在rev的作用下只是最低限度地增加。
图3：包含三种不同启动子-GFP表达盒(EF1a、EFS和CMV)的HIV-1慢病毒载体基因组被修饰以在功能上突变MSD，从而产生“MSD-2KO”慢病毒载体基因组或骨架(用于突变的描述参见图10A)。在标准方案下在HEK293T细胞中产生载体并进行滴定。数据显示MSD的功能性突变(“MSD-2KO”)导致慢病毒载体滴度降低100倍。
图4：A示出编码EF1a-GFP内部表达盒的标准慢病毒载体表达盒或MSD突变的慢病毒载体表达盒的构造以及慢病毒载体生产过程中生产的mRNA类型的示意图。(图例：Pro，启动子；从5'R到gag的区域包含包装元件{Ψ}；msd，主要剪接供体；cppt，中央多嘌呤束；Int，内含子；sd/sa，剪接供体/受体；GOI，目的基因；灰色箭头指示用于评估在第三代慢病毒载体生产过程中产生的未剪接的vRNA的占比的正向{f}和反向{r}引物的位置。为清楚起见，未显示转录后调节元件{PRE})。B i在+/-tat、或179U1或305U1的HEK293T细胞中生产标准慢病毒载体或MSD-2KO慢病毒载体，并进行滴定。ii从生产后的细胞中提取总细胞质mRNA并通过RT-PCR/凝胶电泳使用引物(f+rG)进行分析，该引物可以检测从SL2剪接区域到EF1a剪接受体的主要“异常”剪接产物。数据表明，重新定向至MSD-2KO慢病毒载体基因组(vRNA)的5'包装区域的经修饰的U1 snRNA能够以类似于tat的方式增加标准慢病毒载体和MSD-2KO慢病毒载体的滴度。MSD-2KO突变消除了对从SL2剪接区域到EF1a剪接受体的“异常”剪接产物的检测(参见图4A)。重要的是，与使用tat相比，通过经修饰的U1 snRNA产生的滴度的增加伴随着维持几乎检测不到的“异常”剪接产物。
图5：在+/-256U1的HEK293T细胞中生产编码由EF1a、EFS或CMV启动子驱动的GFP内部盒的标准慢病毒载体或MSD突变的慢病毒载体，并进行滴定。通过使用重新定向到5'包装区域的经修饰的U1 snRNA得到的加强的慢病毒载体滴度与转基因盒中采用的启动子无关。数据表明，MSD-2KO突变的减毒表型在很大程度上被经修饰的U1 snRNA的共表达所挽救，因此，与标准慢病毒载体基因组相比，这令人惊讶地以不成比例的方式提高了MSD突变的慢病毒载体基因组的滴度。
图6：通过使用重新定向到5'包装区域的经修饰的U1 snRNA得到的MSD突变的慢病毒载体滴度的加强与5'LTR内5'polyA信号的潜在活性的抑制无关。先前的报道表明，MSD的突变能够激活HIV-1原病毒的5'LTR的5'R序列内的polyA信号和“迷你报告基因”盒，从而导致转录过早终止；内源性U1 snRNA以及甚至重新定向的U1 snRNA的结合可以阻断这种polyA活性。A将GFP-polyA-GLuciferase报告基因盒设计为用于评估两种polyA信号突变体(pAM1＝AAUAAA>AACAAA；pAKO＝AAUAAA删除)和野生型polyA信号(wt pA＝AAUAAA)对转录通读HIV-1polyA位点的影响。通过荧光素酶活性可测定通读HIV-1polyA信号，荧光素酶活性能够通过GFP表达进行标准化。B为了测试经修饰的U1 snRNA是否以类似方式起作用，将5'polyA信号中的功能性突变(pAm1)引入到携带EF1a-GFP或CMV-GFP表达盒的MSD突变的慢病毒载体基因组中。还使用了携带EF1a-GFP或CMV-GFP表达盒的标准慢病毒载体基因组和MSD-2KO的慢病毒载体基因组。在+/-305U1的HEK293T细胞中生产慢病毒载体，并进行滴定。数据显示5'polyA信号的功能性去除仅引起慢病毒载体滴度的不太多的增加，因此观察到的由经修饰的U1 snRNA、特别是MSD-2KO/polyA-突变的慢病毒载体基因组提供的慢病毒载体滴度的增加不能归因于5'polyA活性的抑制。
图7：在305U1和256U1经修饰的U1 snRNA中引入了几个突变，已知这些突变会去除U1-70K蛋白与SL1的结合、U1A蛋白与SL2的结合或Sm蛋白与载体基因组的SL4的结合/接近。在这些突变的经修饰的U1 snRNA存在下生产编码EF1a-GFP内部盒的标准慢病毒载体或MSD突变的慢病毒载体，并进行滴定，并且相对于不使用经修饰的U1 snRNA生产的标准慢病毒载体对滴度值进行标准化处理。数据表明，通过经修饰的U1 snRNA得到的MSD-2KO慢病毒载体滴度的提高不取决于U1-70K蛋白或U1A蛋白结合，而是取决于Sm蛋白结合位点。因此，通过使用重新定向到5'包装区域的经修饰的U1 snRNA得到的MSD-2KO慢病毒载体滴度的加强与U1 snRNA的任何已知功能无关。
图8：通过使用含有不同长度靶向序列的经修饰的U1 snRNA提高MSD突变的慢病毒载体滴度。在存在靶向“305”区域的经修饰的U1 snRNA的情况下，在HEK293T细胞中生产含有EF1a-GFP盒的MSD-2KO慢病毒载体，其中经修饰的各U1 snRNA包含具有不同互补性长度的重新靶向序列。当使用含有7到15个核苷酸的互补性长度的经修饰的U1 snRNA时观察到滴度增加，在10个或更多核苷酸时观察到最大效果。
图9：当将经修饰的U1 snRNA靶向载体基因组RNA的包装区域时，观察到MSD突变的慢病毒载体的最大滴度恢复/增长。在存在经修饰的U1 snRNA的情况下生产包含EF1-GFP盒的MSD-2KO慢病毒载体，其中该经修饰的U1 snRNA具有结合沿着载体基因组vRNA分子的5'端长度的位点的靶向序列，该靶向序列包括15个核苷酸(或所述的9个核苷酸)长度的互补性。根据沿着载体基因组vRNA分子的5'端长度的靶向序列位点的第一个核苷酸命名经修饰的U1 snRNA。每个经修饰的U1 snRNA的数据条在载体基因组vRNA的5'端内每个已知功能性序列的大致标记位置下方对齐(不是按比例的)。
图10：关于功能性主要剪接供体突变、它们对慢病毒载体滴度的影响以及经修饰的U1 snRNA的回收的描述。A在顶部示出了“野生型”HIV-1的茎环2(SL2)区域的序列(NL4-3；当前慢病毒载体基因组中的“标准”序列)。该序列包括主要剪接供体位点(MSD：共有序列＝CTGGT)和隐蔽剪接供体位点(当MSD位点自身发生突变时使用(crSD：共有序列＝TGAGT)。当使用剪接供体位点时剪接位置的核苷酸以粗体和箭头标识。描述了四种功能性MSD突变，它们去除了MSD和crSD位点这两者的剪接活性：MSD-2KO，其使来自MSD和crSD位点的两个“GT”基序发生突变(并且广泛用于大多数实施例中)；MSD-2KOv2，其也包括去除MSD和crSD位点的突变；MSD-2KOm5，其引入了一种全新的没有任何剪接供体位点的茎环结构；和ΔSL2，其完全删除了SL2序列。在MSD-2KO、MSD-2KOv2和MSD-2KOm5突变体的SL2序列中引入的置换碱基以小写斜体显示。B用EFS-GFP内部盒克隆四种包含功能性MSD突变的慢病毒载体基因组变体(在图10A中描述)，并且另外用EF1a-、CMV-或huPGK-GFP内部盒克隆MSD-2KO或MSD-2KOm5变体。在+/-256U1的HEK293T细胞中生产标准LV和MSD突变LV，并进行滴定。数据表明，慢病毒载体滴度的减弱程度可根据具体突变而变化，并且MSD-2KOm5变体通常产生减弱程度较低的表型。当在生产过程中共表达时，经修饰的U1 snRNA能够增加四种包括功能性MSD突变的慢病毒载体基因组变体的慢病毒载体滴度。当256U1与携带MSD-2KOm5序列的MSD突变的LV基因组一起表达时，滴度增加最大。
图11：经修饰的U1 snRNA表达盒可以位于慢病毒载体基因组质粒骨架上，以便于在瞬时转染方案中使用。在慢病毒载体的生产中，许多实施例使用单独的经修饰的U1snRNA表达质粒与慢病毒载体组分质粒共转染。为了识别慢病毒载体基因组质粒骨架上的“许可”位点，以便能够在瞬时转染期间以顺式提供经修饰的U1 snRNA盒，克隆了三种变体。A慢病毒载体基因组变体示意图，该慢病毒载体基因组在瞬时转染过程中以顺式(cis)提供经修饰的U1 snRNA盒。版本1(“[cis]ver1”)和版本3(“[cis]ver3”)将经修饰的U1 snRNA盒放置在抗性标记和复制起点之间，这样经修饰的U1 snRNA盒相对于慢病毒载体基因组盒是反向的(ver1和ver3之间的抗性标记方向不同)，而版本2(“[cis]ver2”)将经修饰的U1snRNA盒置于慢病毒载体基因组盒的上游且处于相同的方向。(图例：Pro，启动子；从5'R到gag的区域包含包装元件{Ψ}；msd，主要剪接供体{此处显示为MSD-2KO}；RRE，rev应答元件；cppt，中央多嘌呤束；转基因，包含治疗有效载荷的异源序列；U1-Pro，U1启动子；Term[3'box]，U1转录终止子)。B在HEK293T细胞中三个“顺式”版本的包含EF1a-GFP盒的MSD-2KO慢病毒载体基因组质粒用于与“反式”版本平行的方法生产慢病毒载体，其中在供应或不供应经修饰的U1snRNA的情况下，通过与单独的质粒共转染生产相同的MSD-2KO慢病毒载体基因组(在骨架中没有插入经修饰的U1 snRNA盒)。数据表明，与单独的编码质粒的经修饰的U1 snRNA共转染类似，可以通过使用“顺式”慢病毒载体基因组增加MSD-2KO慢病毒载体滴度。
图12：在MSD-2KO慢病毒载体中去除了慢病毒载体生产过程中表达转基因的经异常剪接的mRNA，从而减少了在利用TRiP系统时被TRAP靶向所需的转基因mRNA的量。A编码EF1a-GFP转基因盒的“TRiP”慢病毒载体基因组示意图，其中TRAP结合位点(tbs)位于盒的5'UTR内(在载体生产期间提供TRAP降低了转基因表达水平)。在MSD-2KO慢病毒载体的生产过程中，全长、未剪接的可包装vRNA和转基因mRNA是由慢病毒载体盒产生的主要RNA形式(i)(当在生产过程中转基因启动子处于活性状态时)。然而，标准慢病毒载体基因组中MSD的混杂活性导致额外的经“异常”剪接的产物，这些产物可能会编码转基因(ii)；这可以独立于内部转基因启动子(即，组织特异性启动子)发生。(图例：Pro，启动子；从5'R到gag的区域包含包装元件{Ψ}；msd，主要剪接供体；cppt，中央多嘌呤束；Int，内含子；sd/sa，剪接供体/受体；GOI，目的基因；灰色箭头指示用于评估在第三代慢病毒载体生产过程中产生的未剪接vRNA的占比的正向{f}和反向{r}引物的位置。为清楚起见，未显示转录后调节元件{PRE})。B在HEK293T细胞中使用包含EF1a-GFP盒的标准慢病毒载体基因组质粒或MSD-2KO慢病毒载体基因组质粒生产慢病毒载体，并生成GFP表达评分(％GFP x MFI)。相对于标准慢病毒载体生产过程中培养物中产生的GFP总量，即使在不存在TRAP的情况下，MSD-2KO也具有降低产生的GFP的量的显著效果。因此，通过使用MSD-2KO慢病毒载体基因组增强了TRAP的阻遏效果，使得培养物中GFP的水平低得多。
图13：稳定地表达能够增加标准慢病毒载体或MSD-2KO慢病毒载体的经修饰的U1snRNA的HEK293T细胞的成功分离表明，可以将经修饰的U1 snRNA盒引入慢病毒载体包装和生产者细胞系。在HEK293T或HEK293T.305U1(9nt变体)细胞+/-额外的305U1质粒中生产包含EFS-GFP盒的标准慢病毒载体基因组或MSD-2KO慢病毒载体基因组。数据显示，表达经修饰的U1 snRNA的稳定盒能够无毒性地被引入细胞。
图14.鉴定与转基因5'UTR内tbs的3'端重叠的最佳Kozak序列，以便将tbs定位在更靠近ATG起始密码子的位置。
A.示意图表示符合核心共有序列(consensus)“RVVATG”和更广的共有序列“GNNRVVATG”的工程变体中Kozak序列的位置和序列，其定位方式是Kozak与tbs的3'端重叠，因此保持KAGNN重复序列。这使得能够将tbs定位在更靠近ATG起始密码子的位置，以识别tbs-Kozak连接变体，该连接变体通过“隐藏”TRAP-tbs复合物中的ATG起始密码子来提高转基因抑制水平(+TRAP)。共有Kozak序列的维持使转基因非抑制水平(无TRAP)能够保持在高水平(即在载体转导的细胞中建模表达)。
B.通过将报告基因质粒与pBlueScript(无TRAP)或pEF1α-TRAP(TRAP)分别共转染到HEK293T细胞中，测试报告基因GFP的非抑制或抑制表达水平。转染后两天通过流式细胞术分析转染的细胞，生成GFP表达评分(％GFP x中值荧光强度)并进行log-10转换。与原始配置相比，所有tbs-Kozak连接变体报告基因都保持相同的非抑制GFP水平。与原始配置相比，变体“0”、“2”和“3”显示出改进的抑制水平(标准偏差条，n＝3)。
图15.通过使用重叠tbs-Kozak变体改善AAV载体基因组质粒中的转基因抑制。将两个“tbs-Kozak”变体(0和3)克隆到EFS或huPGK启动子GFP报告基因盒中，另外还包含L33或L12改进的前导序列。还将非重叠tbs/Kozak变体也克隆到EFS/huPGK-L33盒中；这些仅在tbs-Kozak区域有所不同(原始＝[tbs]-ACAGCCACCATG；HpaI变体＝[tbs-GAGTT]AACGCCACCATG)。通过分别与pBlueScript(无TRAP)或pEF1α-TRAP(TRAP)共转染报告基因质粒来测试报告基因GFP的非抑制或抑制表达水平。转染后两天通过流式细胞术分析转染的HEK293T细胞(悬浮液，无血清)，生成GFP表达评分(％GFP x中值荧光强度)并进行log-10转换。数据表明，与非重叠tbs/Kozak变体相比，将tbs与Kozak序列重叠可以改善TRAP对转基因表达的抑制。(标准偏差条，n＝3)。
图16.全长EF1a启动子中TRAP介导的转基因抑制的改善。
A.将三个“tbs-Kozak”变体(0、2和3)克隆到EF1a启动子GFP报告基因盒中。剪接后，前导序列包括L33序列(外显子1)和来自外显子2的短的12nt序列，紧邻tbs上游。
B.通过分别与pBlueScript(无TRAP)或pEF1α-TRAP(TRAP)共转染报告基因质粒，测试报告基因GFP的非抑制或抑制表达水平。转染后两天通过流式细胞术分析转染的HEK293T细胞(悬浮液，无血清)，生成GFP表达评分(％GFP x中值荧光强度)并进行log-10转换。
C.将GFP转基因盒克隆到HIV-1慢病毒载体基因组中，并按B中所述测试GFP的非抑制或抑制表达水平。数据表明，将tbs与Kozak序列重叠可以改善TRAP对转基因表达的抑制。(标准偏差条，n＝3)。
图17.测试悬浮(无血清)HEK293T细胞中重叠tbs-Kozak变体的TRAP介导的转基因抑制。
将表IV中重叠tbs-Kozak变体克隆到pEF1a-GFP报告基因质粒中并转染到+/-pTRAP的HEK293T细胞中，并在转染后2天进行流式细胞术。A.生成GFP表达评分(％GFP阳性xMFI)+/-TRAP，生成并绘制倍数抑制值。变体沿x轴表示，根据3'tbs KAGNN重复序列和核心Kozak序列的相对重叠进行分组(“重叠组”-KAGatg、KAGNatg、KAGNNatg)；KAGNN用黑括号表示，核心Kozak核苷酸用灰线表示。进行了比较以下重叠组的统计学分析(重叠组内的相等方差通过F-检验确认)：KAGatg的倍数抑制在统计学上大于KAGNatg(*p＝0.0293)；KAGNatg的倍数抑制在统计学上大于KAGNNatg(**p＝0.00000482)；KAGNNatg的倍数抑制在统计学上大于非重叠tbs(***p＝0.000259)，使用双尾T检验。B.从最高到最低(从左到右)绘制未抑制的GFP表达评分，两个KAGatg重叠组变体tbskzkV0.G和tbskzkV0.T(显示A中所有变体的最大抑制)突出显示“G”变体优于“T”变体，因为前者具有更好的“ON”(无抑制)水平。
图18.使用最佳重叠tbs-Kozak变体改进了对含内含子启动子的抑制。
A.用于举例说明使用重叠tbs-Kozak变体与非重叠tbs-Kozak变体相比的表达盒示意图。广泛使用的EF1a启动子序列包含其自己的内含子(参见图10和实施例5)，广泛使用的CAG启动子也是如此。CAG启动子是一种非常强的人工启动子，包含CMV增强子、核心启动子和来自鸡β-肌动蛋白基因的外显子1/内含子序列和来自兔β-珠蛋白基因的剪接受体/外显子序列。在这项工作中，来自EF1a启动子的“EF1a-INT”序列(包含外显子1[L33])、所有EF1a内含子和剪接受体以及来自EF1a外显子2的12个核苷酸，被克隆到CAG启动子中，取代了CAG外显子/内含子序列。“EF1a-INT”序列也被克隆到CMV启动子构建体中。B.通过TRAP在悬浮(无血清)HEK293T细胞中评估构建体的GFP表达和抑制，以模拟病毒载体生产期间的转基因表达。生成并进行绘制了GFP表达评分(％GFP x MFI)，以及在存在TRAP时表示的倍数抑制分数。
图19.tbs下游5'UTR序列改进概述。
A.示意图示出了TRAP-tbs可抑制转基因盒的5'UTR编码区的DNA表达盒，其中多克隆位点(MCS)插入在tbs和转基因的起始密码子之间(TRAP由甜甜圈形状表示)。本发明描述了优选的重叠限制酶位点，该位点开始于/在tbs的末端KAGNN重复序列上，并且在转基因起始密码子上游包含多达五个克隆位点。
B.示意图示出了如何定位转基因的Kozak序列，使其大部分或部分与tbs的3'KAGNN重复序列重叠；这样做可以有效地“隐藏”TRAP-tbs复合物中的主要起始密码子，使其更不易被翻译机制访问，从而导致转基因表达的“抑制”水平更低。
C.总结了优选的tbs和Kozak共有序列重叠的表格。tbs的3'KAGNN重复序列以方框显示，核心Kozak序列以粗体显示。
图20：A.用于进一步举例说明慢病毒载体的HIV-1包装区域中剪接供体位点突变的DNA序列。包装序列的SL2环区域(包含MSD和crSD1)以及SL4环(包含另外两个较小的隐蔽剪接供体位点；crSD2和crSD3)被加框。图例-大写的序列是野生型本身“wt SL2-MSD-SL4(STD)”(或与其对齐)，也用粗体黑色标示出了剪接供体核苷酸。“GT”二核苷酸(认为对功能性剪接供体位点至关重要)在存在时以粗体灰色显示。虚线不代表序列中的空位，而是用于分隔对齐的序列以提高清楚性；正斜杠表示在SL2和SL4环之间未显示的序列(并且都是来自野生型HIV-1的“缺失”序列)。带下划线的序列表示SL茎中的核苷酸。小写斜体序列是经修饰的序列。“1/2/3/4KO”表示每个变体中突变的剪接供体的数量。B.显示内源性U1 snRNA与标准慢病毒载体基因组RNA中的野生型主要剪接供体位点以及“MSD-2KO”和“MSD-2KOm5”变体的预测退火的示意图。将“MSD-2KOm5”变体设计成与内源性U1 snRNA退火比“MSD-2KO”(或实际上是野生型)具有更高的稳定性(更具互补性)，同时在剪接供体位点仍存在功能性突变。此外，“MSD-2KOm5”包含侧翼序列，使其能够形成茎环，从而最大限度地减少对包装二级结构的影响(参见A)。C.构建了编码EF1a-GFP转基因盒和包含标准(STD)MSD区域(野生型序列)、或仅在MSD(MSD-1KO)或MSD/crSd1(MSD-2KO)中具有突变的包装区域的慢病毒载体基因组。在存在或不存在以反式提供的经256U1修饰的snRNA的情况下，通过在悬浮(无血清)HEK293T细胞中瞬时转染产生LV。从生产后的细胞中提取PolyA选择的总mRNA并进行RT-PCR/琼脂糖凝胶分析，以使用MSD上游和EF1a剪接受体下游的引物鉴定MSD区域异常剪接产生的总体影响(参见图23的引物位置)。凝胶图像标明了从SL2/SL4区域到EF1a剪接受体的异常剪接产物的位置/类型(通过剪接点的测序确认[数据未显示])。D.与标准LV相比，MSD-1KO LV和MSD-2KO LV的慢病毒载体滴度降低，但通过使用靶向突变的LV包装区域的经修饰的U1 snRNA挽救了载体滴度的降低(Y轴为log10标度)。
图21：在SL2中含有MSD-2KO或MSD-2KOm5突变的LV基因组中增加了进一步的突变，以消除包装序列的SL4中crSD2位点的异常剪接(参见图20)。在存在或不存在以反式提供的经256U1修饰的snRNA的情况下，通过在悬浮(无血清)HEK293T细胞中瞬时转染产生LV。A.从生产后的细胞中提取PolyA选择的总mRNA并进行RT-PCR/琼脂糖凝胶分析，以使用MSD上游和EF1a剪接受体下游的引物鉴定SL2以及SL4中的MSD区域异常剪接产生的总体影响(参见图23的引物位置)。凝胶图像标明了从SL2/SL4区域到EF1a剪接受体的异常剪接产物的位置/类型(通过剪接点的测序确认[数据未显示])。B.与标准LV相比，所有MSD-1/2/3/4KO基因组的慢病毒载体滴度降低，但通过使用靶向突变的LV包装区域的经修饰的U1 snRNA挽救了载体滴度的降低(Y轴为log10标度)。
图22：与标准LV相比，整合的MSD突变的LV的转录通读事件发生率较低。慢病毒载体半随机插入靶细胞DNA，优先选择转录活性基因。这通常意味着整合的载体将位于细胞基因转录单位内。如果整合的LV位于细胞启动子的下游，那么一些转录通读(“读入”)可能会发生在LV单元中。当前标准的第三代LV包含完整的MSD，理论上，对5'LTR和包装区域的任何读入都可能允许将内源性U1 snRNA募集到RNA。在这种情况下，可以想象募集的U1 snRNA会抑制5'polyA位点的多聚腺苷酸化，导致进一步伸长到LV单元。此外，来自MSD的剪接可能发生在LV单元中的下游剪接受体中，甚至通过反式剪接发生在细胞转录物中。使用MSD突变的LV预计无法募集内源性U1 snRNA，从而产生具有剪接能力的前体，因此可能无法抑制5'polyA位点的多聚腺苷酸化。因此，预计这种新类型的转录读入较少。用于从转导细胞中提取的总RNA的RT-qPCR的正向(f)和反向引物(r)的位置用来评估从整合的LV盒上游的读入转录，该位置由灰色箭头显示。
图23：与标准LV相比，整合的MSD突变的LV的转录通读事件发生率较低的证据。实施例S2中产生的标准LV载体和MSD突变体变体载体用于以匹配的MOI转导HEK293T细胞或原代细胞92BR。仅使用在256U1存在下产生的MSD突变载体制备物，因为这些制备物的滴度与标准LV基因组制备物相当(参见图21B)。将转导的细胞传代10天以去除未整合的cDNA，并减少可能从未整合的载体cDNA中表达的任何载体RNA的信号。在RT-qPCR分析之前提取宿主细胞RNA并进行DNAse处理以检测读入转录物(参见图22的引物位置)。将检测到的HIV PsiRNA拷贝数标准化为GAPDH信号检测结果(上样)和整合载体的DNA拷贝数，这是单独进行的。将未使用256U1制成的标准LV的检测到的HIV Psi DNA拷贝设置为1，并且所有其他数据点都相对于该点设置。将所有MSD突变的变体载体与标准载体进行了统计比较；在通过F检验(临界单尾)评估平均方差后进行t检验(假设等方差[HEK293T]或不等方差[92BR]的临界双尾)，显示两组之间存在显著差异(*p＝0.00012和**p＝0.000073)。
具体实施方式
RNA剪接
如本文所述，本发明提供了编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中慢病毒载体的RNA基因组中的主要剪接供体位点失活，并且其中位于主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活。
RNA剪接由被称为剪接体的大型RNA蛋白质复合物催化，剪接体由五个小核核糖核蛋白(snRNP)组成。内含子和外显子之间的边界由前体mRNA内的特定核苷酸序列标记，它描述了剪接发生的位置。这种边界被称为“剪接位点”。术语“剪接位点”是指能够被真核细胞的剪接机制识别为适合切割和/或连接到另一个剪接位点的多核苷酸。
剪接位点允许切除存在于前体mRNA转录物中的内含子。通常，5'剪接边界被称为“剪接供体位点”或“5'剪接位点”，3'剪接边界被称为“剪接受体位点”或“3'剪接位点”。剪接位点包括(例如)天然存在的剪接位点、工程改造或合成的剪接位点、典型剪接位点或共有剪接位点和/或非典型剪接位点，例如，隐蔽剪接位点。
剪接受体位点通常由三个独立的序列元件组成：分支点或分支位点、聚嘧啶束和受体共有序列。真核生物中的分支点共有序列是YNYTRAC(其中Y是嘧啶，N是任意核苷酸，R是嘌呤)。3'受体剪接位点共有序列是YAG(其中Y是嘧啶)(参见例如Griffiths et al.,eds.,Modern Genetic Analysis,2nd edition,W.H.Freeman and Company,New York(2002))。3'剪接受体位点通常位于内含子的3'端。
术语“典型剪接位点”或“共有剪接位点”可以互换使用，指的是跨物种保守的剪接位点。
用于真核RNA剪接的5'供体剪接位点和3'受体剪接位点的共有序列是本领域公知的。这些共有序列在内含子的每一端包括几乎不变的二核苷酸：内含子的5'端的GT以及内含子3'端的AG。
典型剪接供体位点共有序列可以是(对于DNA)AG/GTRAGT(其中A是腺苷，T是胸腺嘧啶，G是鸟嘌呤，C是胞嘧啶，R是嘌呤以及“/”表示切割位点)。这符合本文所述的更通用的剪接供体共有序列MAGGURR。本领域众所周知，剪接供体序列可能偏离该共有序列，尤其是在病毒基因组中，其中其他限制因素影响同一序列，例如在vRNA包装区域内的二级结构。非典型剪接位点在本领域中也是众所周知的，尽管与典型剪接供体共有序列相比，它们很少出现。
“主要剪接供体位点”是指病毒载体基因组中的第一个(显性)剪接供体位点，其编码并嵌入通常位于病毒载体核苷酸序列的5'区域的天然病毒RNA包装序列中。
在一个方面中，核苷酸序列不包含活性主要剪接供体位点，即所述核苷酸序列中的主要剪接供体位点不发生剪接，并且去除了主要剪接供体位点的剪接活性。
主要剪接供体位点位于慢病毒基因组的5'包装区域。
对于HIV-1病毒，主要的剪接供体共有序列是(对于DNA)TG/GTRAGT(其中A是腺苷，T是胸腺嘧啶，G是鸟嘌呤，C是胞嘧啶，R是嘌呤并且“/”表示切割位点)。
在本发明的一个方面中，剪接供体区域，即突变前的包含主要剪接供体位点的载体基因组区域可以具有以下序列：
GGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAAT(SEQ ID NO:1)
在本发明的一个方面中，突变的剪接供体区域可包含以下序列：
GGGGCGGCGACTGCAGACAACGCCAAAAAT(SEQ ID NO:2-MSD-2KO)
在本发明的一个方面中，突变的剪接供体区域可包含以下序列：
GGGGCGGCGAGTGGAGACTACGCCAAAAAT(SEQ ID NO:11-MSD-2KOv2)
在本发明的一个方面中，突变的剪接供体区域可包含以下序列：
GGGGAAGGCAACAGATAAATATGCCTTAAAAT(SEQ ID NO:12-MSD-2KOm5)
在本发明的一个方面中，剪接供体区域在修饰之前可以包含以下序列：
GGCGACTGGTGAGTACGCC(SEQ ID NO:9)
该序列在本文中也称为“茎环2”区(SL2)。该序列可在载体基因组的剪接供体区域形成茎环结构。在本发明的一个方面中，该序列(SL2)可能已经从如本文所述的本发明的核苷酸序列中删除。
因此，本发明涵盖不包含SL2的核苷酸序列。本发明涵盖不包含根据SEQ ID NO:9的序列的核苷酸序列。
在本发明的一个方面中，主要剪接供体位点可以具有以下共有序列，其中R是嘌呤，并且“/”是切割位点：
TG/GTRAGT(SEQ ID NO:3)
在一个方面中，R可以是鸟嘌呤(G)。
在本发明的一个方面中，主要剪接供体和隐蔽剪接供体区域可具有以下核心序列，其中“/”是主要剪接供体和隐蔽剪接供体位点处的切割位点：
/GTGA/GTA(SEQ ID NO:13)。
在本发明的一个方面中，MSD突变的载体基因组可以在主要剪接供体和隐蔽剪接供体“区域”(SEQ ID NO:13)中具有至少两个突变，其中第一个和第二个“GT”核苷酸分别紧邻主要剪接供体和隐蔽剪接供体核苷酸的3'端。
在本发明的一个方面中，主要剪接供体共有序列是CTGGT(SEQ ID NO:4)。主要剪接供体位点可能包含序列CTGGT。
在一个方面中，核苷酸序列在剪接位点失活之前包括如SEQ ID NO:1、3、4、9、10和/或13中的任一者所示的序列。
在一个方面中，核苷酸序列包含失活的主要剪接供体位点，否则该核苷酸序列将在对应于SEQ ID NO:1的核苷酸13和14的核苷酸之间具有切割位点。
根据本文所述的本发明，核苷酸序列还包含无活性的隐蔽剪接供体位点。在一个方面中，核苷酸序列不包含与主要剪接供体位点(3')相邻的活性隐蔽剪接供体位点，也就是说，不从相邻的隐蔽剪接供体位点发生剪接，并且去除了从隐蔽剪接供体位点的剪接。
术语“隐蔽剪接供体位点”是指这样的核酸序列，该核酸序列通常不作为剪接供体位点发挥作用或由于相邻序列的情况(例如，附近存在“优选的”剪接供体)而作为剪接供体位点利用效率较低，但可以通过相邻序列的突变(例如，附近“优选的”剪接供体的突变)而被激活，从而变成更有效的功能性剪接供体位点。
在一个方面中，隐蔽剪接供体位点是主要剪接供体3'的第一个隐蔽剪接供体位点。
在一个方面中，隐蔽剪接供体位点在主要剪接供体位点3'侧的主要剪接供体位点的6个核苷酸内。优选地，隐蔽剪接供体位点在主要剪接供体切割位点的4或5个核苷酸以内，优选4个核苷酸以内。
在本发明的一个方面中，隐蔽剪接供体位点具有共有序列TGAGT(SEQ ID NO:10)。
在一个方面中，核苷酸序列包含失活的隐蔽剪接供体位点，否则该核苷酸序列将在对应于SEQ ID NO:1的核苷酸17和18的核苷酸之间具有切割位点。
在本发明的一个方面中，主要剪接供体位点和/或相邻的隐蔽剪接供体位点包含“GT”基序。在本发明的一个方面中，主要剪接供体位点和相邻的隐蔽剪接供体位点均含有突变的“GT”基序。突变的GT基序可能会使主要剪接供体位点和相邻的隐蔽剪接供体位点的剪接活性失活。这种突变的一个实例在本文中称为“MSD-2KO”。
在一个方面中，剪接供体区域可包含以下序列：
CAGACA(SEQ ID NO:5)
例如，在一个方面中，突变的剪接供体区域可以包含以下序列：
GGCGACTGCAGACAACGCC(SEQ ID NO:6)
失活突变的另一个实例在本文中称为“MSD-2KOv2”。
在一个方面中，突变的剪接供体区域可包含以下序列：
GTGGAGACT(SEQ ID NO:7)
例如，在一个方面中，突变的剪接供体区域可以包含以下序列：
GGCGAGTGGAGACTACGCC(SEQ ID NO:8)
例如，在一个方面中，突变的剪接供体区域可以包含以下序列：
AAGGCAACAGATAAATATGCCTT(SEQ ID NO:14)
在一个方面中，如上所述的茎环2区域可以从剪接供体区域中删除，从而引起主要剪接供体位点和相邻的隐蔽剪接供体位点的失活。这种删除在本文中称为“ΔSL2”。
可以将多种不同类型的突变引入核酸序列，以使主要剪接供体位点和相邻的隐蔽剪接供体位点失活。
在一个方面中，突变是去除或抑制剪接区域中的剪接活性的功能性突变。如本文所述的核苷酸序列可以在SEQ ID NO:1、3、4、9、10和/或13任一者中的任何核苷酸中包含突变或删除。适宜的突变是本领域技术人员已知的，并在此进行了描述。
例如，可以在核酸序列中引入点突变。如本文所用，术语“点突变”是指对单个核苷酸的任何改变。点突变包括例如删除、转变和颠换；当存在于蛋白质编码序列中时，这些突变可以被分类为无义突变、错义突变或沉默突变。“无义”突变产生终止密码子。“错义”突变产生编码不同氨基酸的密码子。“沉默”突变产生的密码子编码相同的氨基酸、或不改变蛋白质功能的不同氨基酸。可以将一个或以上点突变引入包含隐蔽剪接供体位点的核酸序列。例如，包含隐蔽剪接位点的核酸序列可以通过在其中引入两个或以上点突变来产生突变。
可以在包含主要剪接供体和隐蔽剪接供体位点的核酸序列内的几个位置中引入至少两个点突变，以实现剪接供体区域剪接的减弱。在一个方面中，突变可以在剪接供体切割位点的四个核苷酸内；在典型剪接供体共有序列中，这是A1G2/G3T4，其中“/”是切割位点。本领域众所周知，剪接供体切割位点可能偏离这种共有，尤其是在病毒基因组中，其中其他限制对同一序列产生影响，例如在vRNA包装区域内的二级结构。众所周知，G3T4二核苷酸通常是典型剪接供体共有序列中可变性最小的序列，因而对G3和/或T4的突变最有可能实现最大的减弱效果。例如，对于HIV-1病毒载体基因组中的主要剪接供体位点，这可以是T1G2/G3T4，其中“/”是切割位点。例如，对于HIV-1病毒载体基因组中的隐蔽剪接供体位点，这可以是G1A2/G3T4，其中“/”是切割位点。此外，可以在剪接供体位点附近引入一个或多个点突变。例如，可以在剪接供体位点的上游或下游引入点突变。在核酸序列包含通过在其中引入多个点突变来产生突变的主要和/或隐蔽剪接供体位点的实施方案中，可以将点突变引入隐蔽剪接供体位点的上游和/或下游。
如本文所述并且如实施例中所示，根据本发明的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列可以任选地进一步包含位于包装序列的SL4环内的隐蔽剪接供体位点中的突变。在一个方面中，包装序列的SL4环内的所述隐蔽剪接供体位点中的GT二核苷酸突变为GC。
剪接位点突变体的构建
可以使用多种技术构建本发明的剪接位点突变体。例如，可以通过合成含有突变序列的寡核苷酸从而在特定基因座处引入突变，突变序列的侧翼是能够与天然序列的片段连接的限制性位点。连接后，所得的重建序列包含具有所需核苷酸插入、置换或删除的衍生物。
允许改变DNA序列的其他已知技术包括重组方法，例如Gibson组装、Golden-gate克隆和In-fusion。
或者，可以使用寡核苷酸定向的位点特异性(或区段特异性)诱变程序来根据所需的置换、删除或插入提供改变的序列。也可以通过利用与所需删除相邻的方便的限制性内切核酸酶位点来构建剪接位点突变体的删除或截短衍生物。
在限制之后，可以填充突出端，并重新连接DNA。
Sambrook等人公开了进行上述改变的示例性方法。(Molecular cloning:ALaboratory Manual,2d Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)。
剪接位点突变体也可以利用PCR诱变、化学诱变、通过强制核苷酸错误掺入(例如，Liao和Wise，1990)或通过使用随机诱变的寡核苷酸(Horwitz等，1989)的化学诱变(Drinkwater和Klinedinst，1986)技术进行构建。
本发明还提供了一种用于生产慢病毒载体核苷酸序列的方法，包括以下步骤：
(i)提供编码如本文所述的慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列；和
(ii)使所述核苷酸序列中的如本文所述的主要剪接供体位点和隐蔽剪接供体位点突变。
载体/表达盒
载体是一种工具，其允许或促进实体从一种环境转移到另一种环境。根据本发明，并以举例的方式，在重组核酸技术中使用的一些载体使得实体，如核酸区段(例如，异源性DNA区段，如异源性cDNA区段)，转移到靶细胞中并由靶细胞表达。载体可促进整合编码病毒载体组分的核苷酸序列，以维持编码病毒载体组分的核苷酸序列和其在靶细胞内的表达。
载体可以是表达盒或可以包括表达盒(也称为表达构建体)。如本文所述的表达盒包含含有能够被转录的序列的核酸区域。因此，编码mRNA、tRNA和rRNA的序列包括在该定义中。
载体可包含一种或以上可选择的标记基因(例如，新霉素抗性基因)和/或可追踪的标记基因(例如，编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因)。载体可用于例如感染和/或转导靶细胞。载体还可包含使载体能够在所讨论的宿主细胞中复制的核苷酸序列，例如有条件复制的溶瘤载体。
术语“盒”，与诸如“偶联物”、“构建体”和“杂交体”之类的术语同义，包括直接或间接连接到启动子的多核苷酸序列。用于本发明的表达盒包含用于表达编码病毒载体组分的核苷酸序列的启动子和任选的编码病毒载体组分的核苷酸序列的调节子。优选地，所述盒至少包含能够连接至启动子的多核苷酸序列。
表达盒(例如质粒、粘粒、病毒或噬菌体载体)的选择通常取决于待引入的宿主细胞。表达盒可以是DNA质粒(超螺旋、切口或线形化)、小环DNA(线形或超螺旋)、通过限制酶消化和纯化去除质粒骨架而仅包含目的区域的质粒DNA、使用酶促DNA扩增平台生成的DNA，例如doggybone DNA(dbDNATM)，其中使用的最终DNA处于闭合连接形式，或该DNA已被制备(例如限制酶消化)成具有开放切割末端。
慢病毒载体生产系统和细胞
慢病毒载体生产系统包含一组核苷酸序列，其编码生产慢病毒载体所需的组分。因此，载体生产系统包含一组核苷酸序列，其编码产生慢病毒载体颗粒所必需的病毒载体组分。
“病毒载体生产系统”或“载体生产系统”或“生产系统”应理解为包含慢病毒载体生产所需组分的系统。
在一个实施方案中，病毒载体生产系统包含编码Gag和Gag/Pol蛋白以及Env蛋白和载体基因组序列的核苷酸序列。生产系统可任选地包含编码Rev蛋白或其功能替代物的核苷酸序列。
在一个实施方案中，病毒载体生产系统包含模块化核酸构建体(模块化构建体)。模块化构建体是包含两个或以上用于生产慢病毒载体的核酸的DNA表达构建体。模块化构建体可以是包含两个或以上用于生产慢病毒载体的核酸的DNA质粒。质粒可以是细菌质粒。核酸可以编码例如gag-pol、rev、env、载体基因组。此外，设计用于生成包装和生产者细胞系的模块化构建体可能还需要编码转录调节蛋白(例如TetR、CymR)和/或翻译阻遏蛋白(例如，TRAP)和可选择的标记(例如，ZeocinTM、潮霉素、杀稻瘟素、嘌呤霉素、新霉素抗性基因)。用于本发明的适宜的模块化构建体在EP 3502260中进行了描述，该专利的全部内容通过引用并入本文。
由于根据本发明使用的模块化构建体包含在一个构建体上编码两个或以上逆转录病毒组分的核酸序列，因此考虑了这些模块化构建体的安全性，并将额外的安全特征直接设计到构建体中。这些特征包括将绝缘子用于逆转录病毒载体组分的多个开放阅读框和/或在模块化构建体中使用逆转录病毒基因的特定方向和排列。据信，通过使用这些特征，将防止直接通读以生成具有复制能力的病毒颗粒。
在模块化构建体中，编码病毒载体组分的核酸序列可以处于反向和/或交互的转录方向。因此，编码病毒载体组分的核酸序列不是以相同的5'到3'方向呈现，使得病毒载体组分不能由相同的mRNA分子产生。反向可能意味着不同载体组分的至少两个编码序列以“头对头”和“尾对尾”转录方向存在。这可以通过在模块化构建体的一条链上提供一个载体组分(例如env)的编码序列并在模块化构建体的另一条链上提供另一个载体组分(例如rev)的编码序列来实现。优选地，当模块化构建体中存在多于两个载体组分的编码序列时，至少两个编码序列以逆转录方向存在。因此，当模块化构建体中存在多于两个载体组分的编码序列时，每个组分可以定向为使得它以与相邻的其他载体组分的所有相邻编码序列相反的5'到3'方向存在，即每个编码序列可采用交互的5'到3'(或转录)方向。
根据本发明使用的模块化构建体可以包含编码以下载体组分中的两种或以上的核酸序列：gag-pol、rev、env、载体基因组。模块化构建体可以包含编码载体组分的任何组合的核酸序列。在一个实施方案中，模块化构建体可以包含编码以下组分的核酸序列：
i)逆转录病毒载体的RNA基因组和rev或其功能替代物；
ii)逆转录病毒载体的RNA基因组和gag-pol；
iii)逆转录病毒载体的RNA基因组和env；
iv)gag-pol和rev或其功能替代物；
v)gag-pol和env；
vi)env和rev或其功能替代物；
vii)逆转录病毒载体的RNA基因组、rev或其功能替代物以及gag-pol；
viii)逆转录病毒载体的RNA基因组、rev或其功能替代物以及env；
ix)逆转录病毒载体的RNA基因组、gag-pol和env；或者
x)gag-pol、rev或其功能替代物以及env，
其中核酸序列处于反向和/或交互方向。
在一个实施方案中，用于生产逆转录病毒载体的细胞可包含编码上述i)至x)组合中任一种的核酸序列，其中所述核酸序列位于同一遗传基因座并处于反向和/或交互方向。同一遗传基因座可以指细胞中的单个染色体外基因座，例如细胞基因组中的单个质粒或单个基因座(即单个插入位点)。细胞可以是用于生产逆转录病毒载体(例如，慢病毒载体)的稳定或瞬时细胞。在一个方面中，细胞不包含tat。
DNA表达构建体可以是DNA质粒(超螺旋、切口或线形化)、小环DNA(线形或超螺旋)、通过限制酶消化和纯化去除质粒骨架而仅包含目的区域的质粒DNA、使用酶促DNA扩增平台产生的DNA，例如doggybone DNA(dbDNATM)，其中使用的最终DNA处于闭合连接形式，或者该DNA已被制备(例如限制酶消化)成具有开放切割末端。
在一个实施方案中，慢病毒载体源自HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、BIV、EIAV、CAEV或维斯纳慢病毒(Visna lentivirus)。
“病毒载体生产细胞”、“载体生产细胞”或“生产细胞”应理解为能够生产慢病毒载体或慢病毒载体颗粒的细胞。慢病毒载体生产细胞可以是“生产者细胞”或“包装细胞”。病毒载体系统的一种或以上DNA构建体可以稳定整合或以游离体保持在病毒载体生产细胞内。或者，可以将病毒载体系统的所有DNA组分瞬时转染到病毒载体生产细胞中。在另一个替代方案中，稳定表达一些组分的生产细胞可用载体生产所需的剩余组分瞬时转染。
如本文所用，术语“包装细胞”是指含有生产慢病毒载体颗粒所必需的元件但缺乏载体基因组的细胞。任选地，此类包装细胞含有一种或以上能够表达病毒结构蛋白(例如gag、gag/pol和env)的表达盒。
生产者细胞/包装细胞可以是任何适宜的细胞类型。生产者细胞通常是哺乳动物细胞，但也可以是(例如)昆虫细胞。
如本文所用，术语“生产者/生产细胞”或“载体生产(producing)/生产(production)细胞”是指包含生产慢病毒载体颗粒所需的所有元件的细胞。生产者细胞可以是稳定生产者细胞系或瞬时衍生的，或者可以是稳定的包装细胞，其中逆转录病毒基因组是瞬时表达的。
在本发明的方法中，当病毒载体是慢病毒载体时，载体组分可以包括gag、env、rev和/或慢病毒载体的RNA基因组。编码载体组分的核苷酸序列可以同时或以任何顺序依次引入细胞。
载体生产细胞可以是体外培养的细胞，例如组织培养细胞系。在本发明的方法和用途的一些实施方案中，适宜的生产细胞或用于生产慢病毒载体的细胞是在适当条件下培养时能够生产病毒载体或病毒载体颗粒的那些细胞。因此，细胞通常包含编码载体组分的核苷酸序列，载体组分可包括gag、env、rev和慢病毒载体的RNA基因组。适宜的细胞系包括但不限于哺乳动物细胞，例如鼠成纤维细胞衍生的细胞系或人类细胞系。它们通常是哺乳类细胞，包括人类细胞，例如HEK293T、HEK293、CAP、CAP-T或CHO细胞，但也可以是(例如)昆虫细胞，例如SF9细胞。优选地，载体生产细胞源自人类细胞系。因此，此类适宜的生产细胞可用于本发明的任何方法或用途中。
将核苷酸序列引入细胞的方法是本领域众所周知的并且之前已经描述过。因此，使用在本领域技术人员能力范围内的分子和细胞生物学中的常规技术，将编码包括gag、env、rev和慢病毒载体的RNA基因组的载体组分的核苷酸序列引入细胞中。
稳定生产细胞可以是包装细胞或生产者细胞。为了从包装细胞产生生产者细胞，可以稳定地或瞬时地引入载体基因组DNA构建体。可以通过用逆转录病毒载体转导适宜的细胞系，从而产生包装细胞/生产者细胞，所述逆转录病毒载体表达载体组分(即基因组、gag-pol组分和包膜)之一，如WO 2004/022761中所述。
可选地，可以将核苷酸序列转染到细胞中，然后偶尔随机地整合到生产细胞基因组中。转染方法可以使用本领域公知的方法进行。例如，稳定的转染过程可以使用已经被工程改造以帮助串联(concatemerisation)的构建体。在另一个例子中，转染过程可以使用磷酸钙或市售可得的制剂如LipofectamineTM2000CD(Invitrogen，CA)、
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HD或聚乙烯亚胺(PEI)。或者，可以通过电穿孔将核苷酸序列引入生产细胞。技术人员将知晓促进核苷酸序列整合到生产细胞中的方法。例如，如果核酸构建体是天然环状的，则将该核酸构建体线形化可能会有所帮助。较少随机整合的方法可能涉及这样的核酸构建体，该核酸构建体包含与哺乳动物宿主细胞的内源性染色体具有共享同源性的区域，以指导整合到内源性基因组内的选定位点。此外，如果构建体上存在重组位点，则这些位点可用于靶向重组。例如，核酸构建体可包含loxP位点，当与Cre重组酶结合时(即，使用源自P1噬菌体的Cre/lox系统)，该位点允许进行靶向整合。可选地或另外地，重组位点是att位点(例如，来自λ噬菌体)，其中att位点允许在存在λ整合酶的情况下进行位点定向整合。这将允许逆转录病毒基因靶向宿主细胞基因组内的基因座，从而允许较高和/或稳定的表达。
靶向整合的其他方法是本领域公知的。例如，诱导基因组DNA靶向切割的方法可用于促进在选定的染色体基因座处的靶向重组。这些方法通常涉及使用方法或系统来诱导双链断裂(DSB)，例如，在内源性基因组中的切口，以通过非同源端连接(NHEJ)等生理机制诱导断裂修复。可以通过使用特异性核酸酶，如工程改造的锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)，使用利用工程改造的crRNA/tracr RNA(“单向导RNA”)以引导特异性切割的CRISPR/Cas9系统，和/或使用基于Argonaute系统的核酸酶(例如，来自嗜热链球菌(T.thermophilus))进行切割。
可以通过使用仅慢病毒转导或仅核酸转染的方法整合核苷酸序列，或者使用两者的组合，从而产生包装细胞系/生产者细胞系。
WO 2009/153563中描述了从生产细胞产生逆转录病毒载体的方法，特别是逆转录病毒载体的加工。
在一个实施方案中，生产细胞可包含RNA结合蛋白(例如色氨酸RNA结合衰减蛋白，TRAP)和/或Tet阻遏蛋白(TetR)蛋白或其他调节蛋白(例如，CymR)。
从生产细胞生产慢病毒载体可以通过转染方法，从稳定细胞系生产可以包括诱导步骤(例如强力霉素诱导)或通过两者的组合。可以使用本领域公知的方法进行转染方法，并且此前已经描述了实例。
生产细胞，无论是包装细胞系或生产者细胞系，还是用慢病毒载体编码组分瞬时转染的细胞，都可以进行培养以增加细胞和病毒数量和/或病毒滴度。进行细胞培养以使其能够代谢、和/或生长和/或分裂和/或生产根据本发明的目的病毒载体。这可以通过本领域技术人员公知的方法完成，包括但不限于例如在适当的培养基中为细胞提供营养。所述方法可包括贴壁于表面上生长、悬浮生长或它们的组合。例如，可以使用分批、补料分批、连续系统等在组织培养瓶、组织培养多孔板、培养皿、滚瓶、波浪袋或生物反应器中进行培养。为了通过细胞培养实现病毒载体的大规模生产，本领域优选具有能够悬浮生长的细胞。培养细胞的适宜条件是已知的(参见例如Tissue Culture,Academic Press,Kruse andPaterson,editors(1973),和R.I.Freshney,Culture of animal cells:A manual ofbasic technique,fourth edition(Wiley-Liss Inc.,2000,ISBN 0-471-34889-9))。
优选地，细胞最初在组织培养瓶或生物反应器中“堆积”并且随后在多层培养容器或大型生物反应器(大于50L)中生长，以产生本发明中使用的载体生产细胞。
优选地，细胞以悬浮模式生长，以产生本发明的载体生产细胞。
慢病毒载体
慢病毒是较大一类的逆转录病毒的一部分。慢病毒的详细列表可以参见Coffin等(1997)(“Retroviruses”Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds:JM Coffin,SMHughes,HE Varmus pp 758-763)。简言之，慢病毒可以分为灵长类动物类和非灵长类动物类。灵长类动物慢病毒的实例包括，但不限于：人类免疫缺陷病毒(HIV)，即人类自身免疫缺陷综合征(AIDS)的病原体，和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。非灵长类动物慢病毒类包括原型“慢病毒”绵羊脱髓鞘性脑白质炎/羊慢性进行性肺炎病毒(VMV)，以及相关的山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血症病毒(EIAV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、梅迪维斯纳病病毒(Maedi Visna virus，MVV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)。在一个实施方案中，慢病毒载体源自HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、BIV、EIAV、CAEV或维斯纳慢病毒。
慢病毒科和逆转录病毒之间的区别是慢病毒具有感染分裂和非分裂细胞这两者的能力(Lewis et al(1992)EMBO J 11(8):3053-3058和Lewis and Emerman(1994)JVirol 68(1):510-516)。相反，其它逆转录病毒(如MLV)不能感染非分裂的或缓慢分裂的细胞，例如组成诸如肌肉、脑、肺和肝组织的那些细胞。
如本文所用，慢病毒载体是包含至少一个可源自慢病毒的组成部分的载体。优选地，该组成部分参与载体感染或转导靶细胞以及表达NOI(目的核苷酸)的生物学机制。
慢病毒载体可用于在体外的相容靶细胞中复制NOI。因此，本文描述了通过将本发明的载体引入体外相容的靶细胞，并在引起NOI表达的条件下使靶细胞生长以体外制备蛋白质的方法。可以通过本领域公知的方法从靶细胞回收蛋白质和NOI。适宜的靶细胞包括哺乳动物细胞系和其他真核细胞系。
在一些方面中，载体可以具有“绝缘子”，即，阻断启动子和增强子之间的相互作用并充当屏障以减少从相邻基因通读的基因序列。
在一个实施方案中，绝缘子存在于一个或以上慢病毒核酸序列之间以防止启动子干扰和从相邻基因通读。如果绝缘子存在于一个或以上慢病毒核酸序列之间的载体中，则这些绝缘基因中的每一个都可以排列为单独的表达单位。
逆转录病毒和慢病毒基因组的基本结构具有许多共同特征，如5'LTR和3'LTR，在它们之间或内部具有使基因组能够被包装的包装信号、引物结合位点、使得能够整合到靶细胞基因组中的整合位点、和编码包装组分的gag/pol和env基因，所述包装组分是病毒颗粒组装所需的多肽。慢病毒具有其他的特征，如HIV中的rev基因和RRE序列，它们使得整合的原病毒的RNA转录物能够有效地从受感染靶细胞的细胞核输出到细胞质。
在原病毒中，这些基因的两端的侧翼是称作长末端重复序列(LTR)的区域。LTR负责原病毒整合和转录。LTR也作为增强子-启动子序列，并且能够控制病毒基因的表达。
LTR自身是可以被分为三种元件的相同的序列，称作U3、R和U5。U3源自RNA的3'端特有的序列。R源自在RNA的两端重复的序列，并且U5源自RNA的5'端特有的序列。在不同的逆转录病毒中，三种元件的大小可以显著不同。
在如本文所述的典型逆转录病毒载体中，可以从病毒中除去一种或以上编码复制所必需的区域的蛋白的至少一部分；例如，可以不存在gag/pol和env基因或者这些基因是功能丧失的。这使病毒载体成为复制缺陷型病毒。
慢病毒载体可以源自灵长类慢病毒(例如HIV-1)或非灵长类慢病毒(例如EIAV)。
一般地，典型的逆转录病毒载体生产系统涉及从必要的病毒包装功能体中分离病毒基因组。这些病毒载体组分通常以单独的DNA表达盒(或者被称为质粒、表达质粒、DNA构建体或表达构建体)的方式被提供给生产细胞。
载体基因组包含NOI。载体基因组通常需要包装信号(ψ)、含有NOI的内部表达盒、(任选的)后转录元件(PRE)、常规的中央多嘌呤束(cppt)、3'-ppu和自失活(SIN)LTR。R-U5区域是载体基因组RNA和NOI mRNA进行正确的多腺苷酸化、以及逆转录加工所必需的。载体基因组可选地包括开放阅读框，如在WO2003/064665中有所描述，这允许在没有rev的情况下生产载体。
包装功能体包括gag/pol和env基因。这些基因是生产细胞产生载体颗粒所必需的。以反式向基因组提供这些功能体有利于产生复制缺陷型病毒载体。
γ逆转录病毒载体的生产系统通常是需要基因组、gag/pol和env表达构建体的3组分系统。基于HIV-1的慢病毒载体的生产系统可能另外需要提供辅助基因rev，并且对于载体基因组而言，要包括rev-应答元件(RRE)。如果基因组中存在开放阅读框(ORF)，则不需要以反式向基于EIAV的慢病毒载体提供rev(参见WO 2003/064665)。
通常来说，在载体基因组盒内编码的“外部”启动子(其驱动载体基因组盒)和“内部”启动子(其驱动NOI盒)是强的真核或病毒启动子，就像驱动其他载体系统组分的那些启动子一样。这类启动子的实例包括CMV、EF1α、PGK、CAG、TK、SV40和泛素启动子。强“合成”启动子，如由DNA文库产生的那些启动子(例如，JeT启动子)，还可以用于驱动转录。或者，可以使用组织特异性启动子来驱动转录，这些启动子例如视紫红质(Rho)、视紫红质激酶(RhoK)、含视锥-视杆同源框基因(CRX)、神经视网膜特异性亮氨酸拉链蛋白(NRL)、卵黄样黄斑营养不良2(VMD2)、酪氨酸羟化酶、神经元特异性烯醇酶(NSE)启动子、星形细胞特异性神经胶质纤维性酸性蛋白(GFAP)启动子、人α1抗胰蛋白酶(hAAT)启动子、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)、肝脏脂肪酸结合蛋白启动子、Flt-1启动子、INF-β启动子、Mb启动子、SP-B启动子、SYN1启动子、WASP启动子、SV40/hAlb启动子、SV40/CD43、SV40/CD45、NSE/RU5'启动子、ICAM-2启动子、GPIIb启动子、GFAP启动子、纤连蛋白启动子、内皮糖蛋白启动子、弹性蛋白酶-1启动子、结蛋白启动子、CD68启动子、CD14启动子和B29启动子。
逆转录病毒载体的生产涉及利用这些DNA组分对生产细胞的瞬时共转染，或者稳定生产细胞系的使用，其中所有这些组分稳定整合到生产细胞基因组内(例如，StewartHJ,Fong-Wong L,Strickland I,Chipchase D,Kelleher M,Stevenson L,Thoree V,McCarthy J,Ralph GS,Mitrophanous KA and Radcliffe PA.(2011).Hum GeneTher.Mar；22(3):357-69)。可替代的途径是使用稳定的包装细胞(其中已经稳定地整合有包装组分)，然后根据需要在载体基因组质粒中进行瞬时转染(例如，Stewart,H.J.,M.A.Leroux-Carlucci,C.J.Sion,K.A.Mitrophanous and P.A.Radcliffe(2009).GeneTher.Jun；16(6):805-14)。可以产生可供选择的、不完整的包装细胞系(仅将一个或两个包装组分稳定整合至细胞系中)，并将所产生的缺失组分的载体瞬时转染，这也是可行的。生产细胞还可以表达调节蛋白，如转录调节子的tet阻遏物(TetR)蛋白组的成员(例如，T-Rex、Tet-On和Tet-Off)、转录调节子的4-异丙基苯甲酸(cumate)诱导型开关系统组的成员(例如，4-异丙基苯甲酸阻遏物(CymR)蛋白)或者RNA结合蛋白(例如，TRAP-色氨酸激活的RNA结合蛋白)。
在本发明的一个实施方案中，病毒载体源自EIAV。EIAV具有慢病毒的最简单的基因组结构，因此特别优选用于本发明。除了gag/pol和env基因之外，EIAV还编码其他三种基因：tat、rev和S2。Tat充当病毒LTR的转录激活物(Derse and Newbold(1993)Virology194(2):530-536和Maury et al(1994)Virology 200(2):632-642)，以及rev通过rev-应答元件(RRE)调节和协调病毒基因的表达(Martarano et al.(1994)J Virol 68(5):3102-3111)。据认为这两种蛋白质的作用机制大体上相似于灵长类动物病毒中的类似机制(Martarano et al.(1994)J Virol 68(5):3102-3111)。S2的功能未知。另外，已鉴定了称为Ttm的EIAV蛋白，它由在跨膜蛋白起始处被剪接到env编码序列的tat的第一个外显子编码。在本发明一个可选的实施方案中，病毒载体源自HIV：HIV与EIAV的差异在于它不编码S2，但是与EIAV不同，它编码vif、vpr、vpu和nef。
术语“重组逆转录病毒或慢病毒载体”(RRV)指这样的载体，其具有足够的逆转录病毒遗传信息，以让RNA基因组在包装组分的存在下得以包装到能够转导靶细胞的病毒颗粒中。靶细胞的转导可包括逆转录、以及整合到靶细胞基因组中。RRV携带着要通过载体递送到靶细胞的非病毒编码序列。RRV不能够进行独立复制以在靶细胞中产生感染性逆转录病毒颗粒。通常，RRV缺乏复制所必需的功能性gag/pol基因和/或env基因和/或其他基因。
优选地，本发明的RRV载体具有最低限度的病毒基因组。
本文所用的术语“最低限度的病毒基因组”意指病毒载体已经过操作，从而去除非必需元件而保留必需元件，以提供感染、转导和递送NOI到靶细胞所需的功能性。这个策略的更多细节可参见WO 1998/17815和WO 99/32646。最低限度EIAV载体缺少tat、rev和S2基因，并且这些基因也都没有以反式出现在生产系统中。最低限度HIV载体缺少vif、vpr、vpu、tat和nef。
用于在生产细胞内生产载体基因组的表达质粒可包括能够连接于逆转录病毒基因组的转录调控序列，从而在生产细胞/包装细胞内直接转录基因组。所有第3代慢病毒载体都在5'U3增强子-启动子区域中被删除，并且载体基因组RNA的转录由例如另一个病毒启动子等的异源启动子驱动，例如CMV启动子，如下所述。此特征能够使载体生产不依赖tat。一些慢病毒载体基因组为了有效的产生病毒，因此需要额外的序列。例如，特别在HIV的情况中，可以包括RRE序列。然而，可以通过GagPol ORF的密码子优化以减少或消除(独立的)GagPol盒对于RRE的需求(以及对以反式提供的rev的依赖性)。这一策略的进一步细节可以参见WO 2001/79518。
与rev/RRE系统执行相同功能的可替代的序列也是已知的。例如，在Mason Pfizer猴病毒中发现了rev/RRE系统的功能性类似物。这被称为组成型转运元件(CTE)，并且在基因组内包括据信与被感染的细胞中的因子相互作用的RRE型序列。细胞因子可以被认为是rev类似物。因此，CTE可被用作rev/RRE系统的替代。Rev蛋白的任何已知的或者可获得的其他功能性等价物都可以与本发明相关。例如，还已知，HTLV-I的Rex蛋白能够功能性地代替HIV-1的Rev蛋白。在本发明方法中使用的载体中，Rev和RRE可以不存在或者是无功能的；在可替代的方案中，可以存在rev和RRE或功能性等价系统。
如本文所用，术语“功能性替代物”是指具有替代序列的蛋白质或序列，该替代序列执行与另一蛋白质或序列相同的功能。术语“功能性替代物”在本文中与具有相同含义的“功能性等价物”和“功能性类似物”可互换使用。
SIN载体
如本文所使用的慢病毒载体可用于自失活(SIN)结构中，其中已经删除了病毒增强子和启动子序列。SIN载体可以在体内、离体或体外以类似于非SIN载体的效率产生并转导非分裂靶细胞。SIN原病毒的长末端重复序列(LTR)的转录失活将会抑制vRNA的调动，并且是进一步降低形成具有复制能力的病毒的可能性的特征。这通过去除LTR的任意顺式作用效果，还能够调节由内部启动子启动的基因表达。
举例来说，自失活的逆转录病毒载体系统已经被构建为删除了转录增强子或3'LTR的U3区域内的增强子或启动子。在载体逆转录和整合一轮之后，这些变化将被拷贝到产生无转录活性的“原病毒”的5'LTR和3'LTR中。然而，在这种载体中的LTR的任意内部启动子将仍然保持转录活性。这一策略已被用来去除病毒LTR内的增强子和启动子对由内部放置的基因的转录的影响。这些影响包括增加转录或抑制转录。这种策略也可用于去除从3'LTR下游转录成基因组DNA。在人类基因治疗中，这是受到特别关注的，在该治疗中，重要的是防止任何内源致癌基因的外来激活。Yu et al.,(1986)PNAS 83:3194-98；Marty et al.,(1990)Biochimie 72:885-7；Naviaux et al.,(1996)J.Virol.70:5701-5；Iwakuma etal.,(1999)Virol.261:120-32；Deglon et al.,(2000)Human Gene Therapy 11:179-90。SIN慢病毒载体在US 6,924,123和US 7,056,699中有所描述。
复制缺陷型慢病毒载体
在复制缺陷型慢病毒载体的基因组中，gag/pol和/或env的序列可以突变和/或没有功能。
在如本文所述的典型慢病毒载体中，可以从载体中除去病毒复制所必需的蛋白质的一个或以上编码区的至少一部分。这使得病毒载体为复制缺陷型。病毒基因组的部分也可以由NOI替换，以产生包含NOI的载体，该NOI能够转导非分裂靶细胞和/或将它的基因组整合到靶细胞基因组中。
在一个实施方案中，如WO 2006/010834和WO 2007/071994中所描述的那样，慢病毒载体是非整合型载体。
在另一实施方案中，载体具有递送没有或缺少病毒RNA序列的能力。在另一实施方案中，位于待递送的RNA上的异源结合域(与gag异源)和位于Gag或GagPol上的同源结合域可以被用来确保待递送RNA的包装。这些载体在WO 2007/072056中有所描述。
NOI和多核苷酸
本发明的多核苷酸可包含DNA或RNA。它们可以是单链的或双链的。技术人员会理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的多核苷酸可以编码同一多肽。另外，应理解，技术人员可使用常规技术进行核苷酸置换，以反映在其中表达本发明多肽的任何具体宿主生物体的密码子使用，该置换不会影响由本发明的多核苷酸所编码的多肽序列。
多核苷酸可通过本领域可获得的任何方法进行修饰。可进行这种修饰以提高本发明的多核苷酸的体内活性或寿命。
多核苷酸如DNA多核苷酸可用重组法产生、合成法产生或本领域技术人员可获得的任何方法产生。它们还可通过标准的技术进行克隆。
通常使用重组方法来产生较长的多核苷酸，例如使用聚合酶链反应(PCR)克隆技术。这涉及到制备一对能侧接于需要克隆的靶序列的引物(例如约15至30个核苷酸)，使引物与从动物细胞或人细胞获得的mRNA或cDNA接触，在能引起所需区域扩增的条件下进行PCR，分离扩增的片段(例如通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物)并回收扩增的DNA。可将引物设计成含有适宜的限制酶识别位点，使得扩增的DNA可被克隆到适宜的载体中。
常见的逆转录病毒载体元件
启动子和增强子
可以使用控制序列控制NOI和多核苷酸的表达，所述控制序列例如为转录调节元件或翻译阻遏元件，包括启动子、增强子和其他表达调节信号(例如tet阻遏物(TetR)系统)或载体生产细胞中的转基因阻遏系统(TRiP)或本文描述的NOI的其他调节子。
可以使用原核生物启动子和在真核细胞中发挥功能的启动子。可以使用组织特异性启动子或刺激特异性启动子。还可使用包含来自两种或以上不同启动子的序列元件的嵌合启动子。
适宜的启动序列是强启动子，包括那些源自病毒(如多瘤病毒、腺病毒、禽痘病毒、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒(CMV)、逆转录病毒和猿猴病毒40(SV40))的基因组的启动子，或者源自异源哺乳动物启动子(如肌动蛋白启动子、EF1α、CAG、TK、SV40、泛素、PGK或核糖体蛋白启动子)的启动子。可选地，可以使用以下组织特异性启动子来驱动转录，如视紫红质(Rho)、视紫红质激酶(RhoK)、含视锥-视杆同源框基因(CRX)、神经视网膜特异性亮氨酸拉链蛋白(NRL)、卵黄样黄斑营养不良2(VMD2)、酪氨酸羟化酶、神经元特异性烯醇酶(NSE)启动子、星形细胞特异性神经胶质纤维性酸性蛋白(GFAP)启动子、人α1抗胰蛋白酶(hAAT)启动子、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)、肝脏脂肪酸结合蛋白启动子、Flt-1启动子、INF-β启动子、Mb启动子、SP-B启动子、SYN1启动子、WASP启动子、SV40/hAlb启动子、SV40/CD43、SV40/CD45、NSE/RU5'启动子、ICAM-2启动子、GPIIb启动子、GFAP启动子、纤连蛋白启动子、内皮糖蛋白启动子、弹性蛋白酶-1启动子、结蛋白启动子、CD68启动子、CD14启动子和B29启动子。
可通过将增强子序列插入到载体中进一步提高NOI的转录。增强子相对地不依赖于取向和位置；但是，可以采用来自真核细胞病毒的增强子，如SV40增强子和CMV早期启动子增强子。增强子可在相对于启动子的5'或3'的位置处、但优选位于相对于启动子的5'位点被剪接到载体中。
启动子可另外包括用以确保或提高在适宜的靶细胞中表达的特征。例如，所述特征可以是保守区域，例如Pribnow框或TATA框。启动子可含有用以影响(如维持、提高或降低)核苷酸序列的表达水平的其他序列。适宜的其他序列包括Sh1内含子或ADH内含子。其他序列包括可诱导元件，如温度、化学、光和应激可诱导元件。还可存在用以提高转录或翻译的适宜元件。
NOI的调节子
在产生逆转录病毒包装/生产者细胞系和逆转录病毒载体生产中的复杂因素是某些逆转录病毒载体组分和NOI的组成型表达具有细胞毒性从而导致表达这些组分的细胞的死亡，因而不能生产载体。因此，必须调节这些组分(例如，gag-pol和包膜蛋白，如VSV-G)的表达。还可以调节其他非细胞毒性载体组分(例如rev)的表达以使细胞的代谢负担最小化。如本文所述的模块化构建体和/或细胞可以包含与至少一种调节元件结合的细胞毒性载体组分和/或非细胞毒性载体组分。如本文所用，术语“调节元件”指能够影响(增加或减少)相关基因或蛋白的表达的任何元件。调节元件包括基因开关系统、转录调节元件和翻译阻遏元件。
很多原核调节系统已被用于在哺乳动物细胞中产生基因开关。很多逆转录病毒包装和生产者细胞系已使用基因开关系统(例如，四环素和4-异丙基苯甲酸诱导型开关系统)进行控制，因此能够在载体生产时开启一种或以上逆转录病毒载体组分的表达。基因开关系统包括转录调节子(TetR)蛋白组的那些(例如，T-Rex、Tet-On和Tet-Off)、转录调节子的4-异丙基苯甲酸诱导型开关系统组的那些(例如，CymR蛋白)和涉及RNA结合蛋白的那些(例如，TRAP)。
一种此类四环素诱导型系统是基于T-RExTM系统的四环素阻遏物(TetR)系统。举例来说，在此类系统中，将四环素操纵子(TetO2)置于这样的位置，以使得第一个核苷酸距离人巨细胞病毒主要即时早期启动子(hCMVp)的TATATAA元件最后一个核苷酸的3'端10bp，如此TetR能够独自作为阻遏物起作用(Yao F,Svensjo T,Winkler T,Lu M,Eriksson C,Eriksson E.Tetracycline repressor,tetR,rather than the tetR-mammalian celltranscription factor fusion derivatives,regulates inducible gene expressionin mammalian cells.1998.Hum Gene Ther；9:1939-1950)。在此类系统中，NOI的表达能够由CMV启动子控制，CMV启动子已串联插入TetO2序列的两个拷贝。在缺乏诱导剂(四环素或其类似物多西环素[dox])的情况下，TetR同型二聚体与TetO2序列结合并物理阻断来自上游CMV启动子的转录。当存在诱导剂时，诱导剂与TetR同型二聚体结合，引起变构变化，使其不再与TetO2序列结合，从而引起基因表达。TetR基因可以进行密码子优化，因为这可以改进翻译效率，从而可以更严格地控制TetO2控制的基因表达。
在WO 2015/092440中描述了TRiP系统，并提供了在载体生产期间阻遏NOI在生产细胞中表达的另一种方法。当需要组成型和/或强启动子(包括组织特异性启动子)驱动转基因时，且特别地当在生产细胞中表达转基因蛋白导致载体滴度降低和/或由于转基因来源蛋白的病毒载体递送在体内激发免疫应答时，TRAP结合序列(例如，TRAP-tbs)相互作用形成用于生产逆转录病毒载体的转基因蛋白阻遏系统的基础(Maunder et al,NatCommun.(2017)Mar 27；8)。
简言之，TRAP-tbs相互作用形成了翻译阻断，从而阻遏转基因蛋白的翻译(Maunder et al,Nat Commun.(2017)Mar 27；8)。翻译阻断仅在生产细胞中有效，因此不会阻碍基于DNA或RNA的载体系统。当从组成型和/或强启动子，包括来自单顺反子或多顺反子mRNA的组织特异性启动子表达转基因蛋白时，TRiP系统能够阻遏翻译。已经证明，转基因蛋白的表达不能调节会降低载体滴度并影响载体产品质量。对于瞬时和稳定的PaCL/PCL载体生产系统，在下述情况下，转基因蛋白的阻遏对于生产细胞防止载体滴度降低是有利的：当毒性或分子负荷问题可能导致细胞应激时；由于转基因来源蛋白的病毒载体递送，使转基因蛋白在体内激发免疫应答时；使用基因编辑转基因可能导致影响靶点开/关时；转基因蛋白可能会影响载体和/或包膜糖蛋白排斥时。
包膜和假型化
在一个优选的方面，如本文所述的慢病毒载体已经被假型化。在这一点上，假型化可以赋予一个或以上优点。例如，基于HIV的载体的env基因产物将限制这些载体，使其仅仅感染表达称作CD4的蛋白的细胞。但如果这些载体中的env基因被来自其他有包膜病毒的env序列置换，那么它们可能具有更宽的感染谱(Verma and Somia(1997)Nature 389(6648):239-242)。举例来说，工作者已经用来自VSV的糖蛋白对基于HIV的载体进行了假型化(Verma and Somia(1997)Nature 389(6648):239-242)。
在另一种可选的方案中，Env蛋白可以是经修饰的Env蛋白，如突变的或工程改造的Env蛋白。可以进行修饰或对修饰进行选择，以引入靶向能力或减少毒性或用于其他它目的(Valsesia-Wittman et al 1996 J Virol 70:2056-64；Nilson et al(1996)Gene Ther3(4):280-286；和Fielding et al(1998)Blood 91(5):1802-1809；及其中引用的参考文献)。
可以用任何选择的分子使载体假型化。
如本文所用，“env”应指如本文所述的内源性慢病毒包膜或异源包膜。
VSV-G
水疱性口腔炎病毒(VSV，一种棒状病毒)的包膜糖蛋白(G)是已被证实能够对某些包膜病毒和病毒载体病毒颗粒进行假型化的包膜蛋白。
Emi et al.(1991)Journal of Virology 65:1202-1207首先证明了在不存在任何逆转录病毒包膜蛋白的情况下，它对基于MoMLV的逆转录病毒载体进行假型化的能力。WO1994/294440教导了逆转录病毒载体可成功地用VSV-G进行假型化。这些经假型化的VSV-G载体可用于转导广范围的哺乳动物细胞。最近，Abe et al.(1998)J Virol 72(8)6356-6361教导了可通过添加VSV-G使非感染性逆转录病毒颗粒变成感染性。
Burns et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8033-7成功地用VSV-G对逆转录病毒MLV进行假型化，这产生了与天然形式的MLV相比改变了宿主范围的载体。已经证实VSV-G假型化的载体不仅感染哺乳动物细胞，而且还感染源自鱼类、爬行动物和昆虫的细胞系(Burns et al.(1993)，出处同上)。还证实了它们对于多种细胞系而言比传统的兼嗜性包膜更有效(Yee et al.,(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:9564-9568；Emi et al.(1991)Journal of Virology 65:1202-1207)。VSV-G蛋白可用于对某些逆转录病毒进行假型化，因为它的胞质尾巴能够与逆转录病毒核心发生相互作用。
提供非逆转录病毒假型化包膜(如VSV-G蛋白)可产生这样的优点，即载体颗粒能被浓缩至高滴度而不损失感染性(Akkina et al.(1996)J.Virol.70:2581-5)。逆转录病毒包膜蛋白显然不能够承受超离心过程中的剪切力，这很可能是因为它们由两个非共价连接的亚单位组成。离心可破坏亚单位之间的相互作用。相比之下，VSV糖蛋白由单一单位组成。因此，VSV-G蛋白假型化可以为有效的靶细胞感染/转导和制造过程提供潜在的优势。
WO 2000/52188描述了由具有水疱性口腔炎病毒G蛋白(VSV-G)作为膜结合性病毒包膜蛋白的稳定生产者细胞系产生假型化的逆转录病毒载体，并提供了VSV-G蛋白的基因序列。
罗斯河病毒
用罗斯河病毒包膜对非灵长类动物慢病毒载体(FIV)进行假型化，随后为主要转导肝的系统施用(Kang et al.,2002,J.Virol.,76:9378-9388)。据报道，效率比用VSV-G假型化载体获得的效率高20倍，并且通过测量提示肝中毒的肝酶血清水平得知，所产生的毒性更低。
杆状病毒GP64
已经证明了杆状病毒GP64蛋白是VSV-G的替代物，其用于在临床和商业应用所需的高滴度病毒的大规模生产中使用的病毒载体(Kumar M,Bradow BP,Zimmerberg J(2003)Hum Gene Ther.14(1):67-77)。与VSV-G假型化载体相比，GP64假型化载体具有相似的广泛嗜性和相似的天然滴度。由于GP64的表达不杀死细胞，因此可以生成组成型表达GP64的基于HEK293T的细胞系。
可供选择的包膜
当用于假型化EIAV时，提供适宜的滴度的其他包膜包括莫科拉病毒、狂犬病毒、埃博拉病毒和LCMV(淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒)。向小鼠体内静脉输注利用4070A进行假型化的慢病毒引起在肝脏内具有最大的基因表达。
包装序列
在本发明的语境中所使用的术语“包装信号”可与“包装序列”或“psi”互换使用，其用来指在病毒颗粒形成期间逆转录病毒RNA链的衣壳化作用所需的非编码、顺式作用序列。在HIV-1中，该序列已被定位于从主要剪接供体位点(SD)上游至少延伸到gag起始密码子(可以包括部分或全部gag到核苷酸688的5'序列)的基因座。在EIAV中，包装信号包括R区域到Gag的5'编码区域。
本文所使用的术语“扩展的包装信号”或“扩展的包装序列”指在psi序列的周围使用进一步延伸到gag基因中的序列。包含这些额外的包装序列可增加载体RNA插入到病毒颗粒中的效率。
已经证明猫免疫缺陷病毒(FIV)RNA的衣壳化作用决定簇是离散的、非连续的，其包括位于基因组mRNA的5'端的一个区域(R-U5)和定位在gag的大约311nt中的另一个区域(Kaye et al.,J Virol.Oct；69(10):6588-92(1995))。
内部核糖体进入位点(IRES)
RES元件的插入允许由单一启动子启动多个编码区域的表达(Adam et al(同上)；Koo et al(1992)Virology 186:669-675；Chen et al 1993J.Virol 67:2142-2148)。IRES元件首次发现于小核糖核酸病毒的非翻译5'端，在此它们促进病毒蛋白的不依赖于帽的翻译(Jang et al(1990)Enzyme 44:292-309)。当在RNA中位于开放阅读框之间时，IRES元件通过促进在IRES元件处的核糖体进入，随后启动下游翻译，从而允许下游开放阅读框的有效翻译。
Mountford和Smith介绍了关于IRES的综述(TIG May 1995 vol 11,No 5:179-184)。许多不同的IRES序列是已知的，包括来自脑心肌炎病毒(EMCV)(Ghattas,I.R.,etal.,Mol.Cell.Biol.,11:5848-5859(1991))；BiP蛋白[Macejak and Sarnow,Nature 353:91(1991)]；果蝇触角足基因(外显子d和e)[Oh,et al.,Genes&Development,6:1643-1653(1992)]的那些，以及在脊髓灰质炎病毒(PV)[Pelletier and Sonenberg,Nature 334:320-325(1988)；还参见Mountford and Smith,TIG 11,179-184(1985)]中的那些序列。
来自PV、EMCV和猪水疱病病毒的IRES元件之前被用于逆转录病毒载体中(Coffin等，如上述)。
术语“IRES”包括发挥IRES功能或改进IRES功能的任何序列或序列的组合。IRES可以是病毒来源的(如EMCV IRES、PV IRES或FMDV 2A样序列)或细胞来源的(如FGF2 IRES、NRF IRES、Notch 2 IRES或EIF4 IRES)。
为了使IRES能够启动每个多核苷酸的翻译，它应该位于模块化构建体中的多核苷酸之间或之前。
用于开发稳定细胞系的核苷酸序列需要添加选择性标记物，以选择发生稳定整合的细胞。这些选择性标记物可以表达为核苷酸序列中的单个转录单位，或者可能更优选的是使用IRES元件启动多顺反子信息中选择性标记物的翻译(Adam et al 1991J.Virol.65,4985)。
基因方向和绝缘子
众所周知，核酸是有方向性的，这最终会影响细胞中诸如转录和复制等的机制。因此，当作为同一核酸构建体的一部分时，基因可以相对于彼此具有相对的方向。
在本发明的某些实施方案中，存在于细胞或构建体中相同基因座上的至少两个核酸序列可以处于反向和/或交互方向。换言之，在本发明的某些实施方案中，在这个特定基因座上，连续基因对将不具有相同方向。当该区域在宿主细胞的同一物理位置内表达时，这可以帮助防止转录和翻译通读。
当载体生产所需的核酸是基于细胞内相同的遗传基因座时，交互方向有利于逆转录病毒载体的生产。这转而也能够改进所得构建体的安全性，以防止产生具有复制能力的逆转录病毒载体。
当核酸序列处于相反和/或交互方向时，使用绝缘子能够防止NOI在其遗传环境中表达不当或沉默。
术语“绝缘子”是指当与绝缘子结合蛋白结合时具有保护基因免受周围调节子信号影响能力的一类DNA序列元件。有两种类型的绝缘子：增强子阻断功能和染色质屏障功能。当绝缘子位于启动子和增强子之间时，绝缘子的增强子阻断功能使启动子免受增强子的加强转录的影响(Geyer和Corces 1992；Kellum和Schedl 1992)。染色质屏障绝缘子通过阻止附近浓缩染色质的前进而起作用，其会引起转录活性染色质区域变成转录无效染色质区域并导致基因表达沉默。抑制异染色质扩散从而抑制基因沉默的绝缘子会募集参与组蛋白修饰的酶，以阻止这一过程(Yang J,Corces VG.2011；110:43-76；Huang,Li etal.2007；Dhillon,Raab et al.2009)。绝缘子可以具有这两种功能中的一种或两种，并且鸡β-珠蛋白绝缘子(cHS4)就是一个这样的实例。这种绝缘子是研究最广泛的脊椎动物绝缘子，富含G+C，并且具有增强子阻断和异染色质屏障功能(Chung J H,Whitely M,Felsenfeld G.Cell.1993；74:505–514)。具有增强子阻断功能的其他此类绝缘子不限于但包括下述：人β-珠蛋白绝缘子5(HS5)、人β-珠蛋白绝缘子1(HS1)和鸡β-珠蛋白绝缘子(cHS3)(Farrell CM1,West AG,Felsenfeld G.,Mol Cell Biol.2002 Jun；22(11):3820-31；J Ellis et al.EMBO J.1996 Feb 1；15(3):562–568)。除了减少不需要的远端相互作用以外，绝缘子还有助于防止临近逆转录病毒核酸序列之间的启动子干扰(即，来自一个转录单位的启动子损害相邻转录单位的表达)。如果在每个逆转录病毒载体核酸序列之间使用绝缘子，则直接通读的减少将有助于防止具有复制能力的逆转录病毒载体颗粒的形成。
绝缘子可以存在于每个逆转录病毒核酸序列之间。在一个实施方案中，使用绝缘子可以防止来自一个NOI表达盒的启动子-增强子相互作用与编码载体组分的核苷酸序列中的另一个NOI表达盒发生相互作用。
载体基因组和gag-pol序列之间可以存在绝缘子。因此，这限制了产生具有复制能力的逆转录病毒载体和类似“野生型”DNA转录物的可能性，从而改进了构建体的安全性性质。Moriarity et al,Nucleic Acids Res.2013 Apr；41(8):e92中引用了使用绝缘子元件改进稳定整合的多基因载体表达的方法。
载体滴度
技术人员将理解的是，存在很多不同的确定病毒载体滴度的方法。通常将滴度描述为转导单位/mL(TU/mL)。可以通过增加载体颗粒的数量和通过增加载体制备物的比活性来增加滴度。
治疗用途
如本文所述的慢病毒载体或用如本文所述的慢病毒载体转导的细胞或组织可用于医药。
此外，本文所述的慢病毒载体、本发明的生产细胞或用本文所述的慢病毒载体转导的细胞或组织可用于制备药物，以将目的核苷酸递送至有此需要的靶位点。如前所述，本发明的慢病毒载体或转导细胞的此类用途可用于治疗或诊断目的。
因此，提供了由如本文所述的慢病毒载体转导的细胞。
“由病毒载体颗粒转导的细胞”应理解为是一种已经转入了由病毒载体颗粒携带的核酸的细胞，特别是靶细胞。
在本发明的一个实施方案中，目的核苷酸在缺乏TRAP的靶细胞中被翻译。
“靶细胞”应理解为是这样的细胞，期望的是其能表达NOI。利用本发明的病毒载体将NOI引入到靶细胞中。递送至靶细胞可以在体内、离体(ex vivo)或体外进行。
在优选的实施方案中，目的核苷酸产生治疗效果。
NOI可具有治疗或诊断应用。适宜的NOI包括但不限于编码以下物质的序列：酶、辅因子、细胞因子、趋化因子、激素、抗体、抗氧化剂分子、工程改造的免疫球蛋白样分子、单链抗体、融合蛋白、免疫共刺激分子、免疫调节分子、嵌合抗原受体、靶蛋白的跨结构域负突变体、毒素、条件性毒素、抗原、转录因子、结构蛋白、报告蛋白、亚细胞定位信号、肿瘤抑制蛋白、生长因子、膜蛋白、受体、血管活性蛋白和肽、抗病毒蛋白和核酶，以及它们的衍生物(如带有相关报告基团的衍生物)。NOI还可以编码微RNA。不愿受到理论的束缚，认为微RNA的加工受到TRAP的抑制。
在一个实施方案中，NOI可用于治疗神经退行性疾病。
在另一个实施方案中，NOI可用于治疗帕金森病。
在另一个实施方案中，NOI可以编码一种或多种参与多巴胺合成的酶。例如，该酶可以是以下之一者或多者：酪氨酸羟化酶、GTP环式水解酶I和/或芳族氨基酸多巴脱羧酶。所有这三个基因的序列是可得的(
Figure BDA0003843317840000481
登录号分别是X05290、U19523和M76180)。
在另一个实施方案中，NOI可以编码囊泡单胺转运子2(VMAT2)。在一个可选的实施方案中，病毒基因组可以包含编码芳族氨基酸多巴脱羧酶的NOI和编码VMAT2的NOI。这种基因组可用于治疗帕金森病，特别是联合外周施用L-DOPA。
在另一个实施方案中，NOI可以编码治疗性蛋白或治疗性蛋白的组合。
在另一个实施方案中，NOI可以编码选自由以下组成的组中的一种或多种蛋白：神经胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF)、脑衍生的神经营养因子(BDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)、神经营养因子-3(NT-3)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、胰岛素生长因子-2、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C/VEGF-2、VEGF-D、VEGF-E、PDGF-A、PDGF-B、PDFG-A和PDFG-B的异源二聚体和同源二聚体。
在另一个实施方案中，NOI可以编码选自由以下组成的组中的一种或多种抗血管生成蛋白：血管生成抑制素、内皮抑素、血小板因子4、色素上皮衍生因子(PEDF)、胎盘生长因子、列斯蛋白(restin)、干扰素-α、干扰素诱导蛋白、gro-β和tubedown-1、白细胞介素-1(IL-1)、IL-12、视黄酸、抗VEGF抗体或其片段/变体、例如阿柏西普、血小板反应蛋白、VEGF受体蛋白(如US 5,952,199和US 6,100,071中描述的那些)和抗VEGF受体抗体。
在另一个实施方案中，NOI可以编码选自由以下组成的组中的抗炎蛋白、抗体或蛋白质或抗体的片段/变体：NF-kB抑制剂、IL1β抑制剂、TGFβ抑制剂、IL-6抑制剂、IL-23抑制剂、IL-18抑制剂、肿瘤坏死因子α和肿瘤坏死因子β、淋巴毒素α和淋巴毒素β、LIGHT抑制剂、α突触核蛋白抑制剂、Tau抑制剂，β淀粉样蛋白抑制剂、IL-17抑制剂。
在另一个实施方案中，NOI可以编码囊性纤维化跨膜传导调节子(CFTR)。
在另一个实施方案中，NOI可以编码通常在视觉细胞中表达的蛋白。
在另一个实施方案中，NOI可以编码通常在光感受器细胞和/或视网膜色素上皮细胞中表达的蛋白。
在另一个实施方案中，NOI可以编码选自包含以下物质的组中的蛋白质：RPE65、芳基烃相互作用受体蛋白样1(AIPL1)、CRB1、卵磷脂视网膜乙酰转移酶(LRAT)、光受体特异性同源盒(CRX)、视网膜鸟苷酸环化酶(GUCY2D)、RPGR相互作用蛋白1(RPGRIP1)、LCA2、LCA3、LCA5、抗肌萎缩蛋白、PRPH2、CNTF、ABCR/ABCA4、EMP1、TIMP3、MERTK、ELOVL4、MYO7A、USH2A、VMD2、RLBP1、COX-2、FPR、harmonin、Rab护卫蛋白1、CNGB2、CNGA3、CEP 290、RPGR、RS1、RP1、PRELP、谷胱甘肽途径酶和opticin。
在其他实施方案中，NOI可以编码人凝血因子VIII或因子IX。
在其他实施方案中，NOI可以编码一种或多种参与代谢的蛋白质，选自包括以下物质的组：苯丙氨酸羟化酶(PAH)、甲基丙二酰辅酶A变位酶、丙酰辅酶A羧化酶、异戊酰辅酶A脱氢酶、支链酮酸脱氢酶复合物、戊二酰辅酶A脱氢酶、乙酰辅酶A羧化酶、丙酰辅酶A羧化酶、3甲基巴豆酰辅酶A羧化酶、丙酮酸羧化酶、氨甲酰磷酸合成酶氨、鸟氨酸转氨甲酰酶、葡糖神经酰胺酶β、α半乳糖苷酶A、葡糖神经酰胺酶β、胱氨酸、葡萄糖胺(N-乙酰基)-6-硫酸酯酶、N-乙酰基-α-氨基葡萄糖苷酶、N-磺基氨基葡萄糖磺基水解酶、半乳糖胺-6硫酸酯酶、芳基硫酸酯酶A、细胞色素B-245β、ABCD1、鸟氨酸氨基甲酰基转移酶、精氨琥珀酸合酶、精氨琥珀酸裂解酶、精氨酸酶1、丙氨酸乙醇酸氨基转移酶(alanine glycoxhylate aminotransferase)、ATP结合盒和亚族B成员。
在其他实施方案中，NOI可以编码嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。在一个实施方案中，CAR是抗5T4 CAR。在其他实施方案中，NOI可以编码B细胞成熟抗原(BCMA)、CD19、CD22、CD20、CD138、CD30、CD33、CD123、CD70、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、Lewis Y抗原(LeY)、酪氨酸蛋白激酶跨膜受体(ROR1)、粘蛋白1、细胞表面相关蛋白(Muc1)、上皮细胞贴壁分子(EpCAM)、内皮生长因子受体(EGFR)、胰岛素、蛋白酪氨酸磷酸酶、非受体型22、白细胞介素2受体α、解旋酶C结构域1诱导的干扰素、人表皮生长因子受体(HER2)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、二唾液酸神经节苷脂(GD2)、间皮素(mesiothelin)、囊泡内皮生长因子受体2(VEGFR2)。
在其他实施方案中，NOI可以编码针对NKG2D配体的嵌合抗原受体(CAR)，NKG2D配体选自由ULBP1、ULBP2、ULBP3、H60、Rae-1a、Rae-1b、Rae-1g、Rae-1d、MICA、MICB组成的组。
在另一实施方案中，NOI可以编码SGSH、SUMF1、GAA、常见的γ链(CD132)、腺苷脱氨酶、WAS蛋白、球蛋白、α半乳糖苷酶A，δ-氨基乙酰丙酸(ALA)合酶、δ-氨基乙酰丙酸脱水酶(ALAD)、羟甲基胆色烷(HMB)合酶、尿卟啉原(URO)合酶、尿卟啉原(URO)脱羧酶、粪卟啉原(COPRO)氧化酶、原卟啉原(PROTO)氧化酶、亚铁螯合酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、乙酰肝素磺酰胺酶、N-乙酰葡糖胺糖苷酶、乙酰肝素-α-氨基葡糖苷N-乙酰转移酶、3N-乙酰基葡萄糖胺-6-硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸酯硫酸酯酶、β-半乳糖苷酶、N-乙酰基半乳糖胺-4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶和透明质酸酶。
除了NOI以外，载体还可包含或编码siRNA、shRNA或者经调节的shRNA(Dickins etal.(2005)Nature Genetics 37:1289-1295；Silva et al.(2005)Nature Genetics 37:1281-1288)。
适应症
根据本发明的载体(包括逆转录病毒和AAV载体)可用于递送一种或以上可用于治疗WO 1998/05635、WO 1998/07859、WO 1998/09985中列举的疾病的NOI。目的核苷酸可以是DNA或RNA。这类疾病的例子给出如下：
能对以下作出响应的疾病：细胞因子和细胞增殖/分化活性；免疫抑制或免疫刺激活性(例如，用于治疗包括感染人免疫缺陷病毒之类的免疫缺陷；调节淋巴细胞生长；治疗癌症和许多自身免疫疾病，和预防移植排斥或诱导肿瘤免疫性)；造血作用的调节(例如骨髓或淋巴疾病的治疗)；促进骨、软骨、腱、韧带和神经组织的生长(例如用于愈合伤口，治疗烧伤、溃疡和牙周疾病，以及神经退化)；卵泡刺激激素的抑制或激活(生育力的调节)；趋化性/化学促进活性(例如用于将特定细胞类型调动到损伤或感染部位)；止血和溶栓活性(例如用于治疗血友病和中风)；抗炎活性(用于治疗例如脓毒性休克或克罗恩病)；巨噬细胞抑制活性和/或T细胞抑制活性、以及由此而来的抗炎活性；抗免疫活性(即，对细胞和/或体液免疫应答、包括与炎症不相关的应答的抑制作用)；抑制巨噬细胞和T细胞贴壁于胞外基质组分和纤连蛋白的能力，以及T细胞中的上调的fas受体表达。
恶性疾病，包括癌症；白血病；良性和恶性肿瘤生长、侵入和扩散、血管生成、转移；腹水和恶性胸腔积液。
自身免疫性疾病，包括关节炎(包括类风湿性关节炎)、过敏症、变态反应、哮喘、系统性红斑狼疮、胶原疾病和其他疾病。
血管疾病，包括动脉硬化症、动脉硬化性心脏病、再灌注损伤、心脏停搏、心肌梗塞、血管炎性疾病、呼吸窘迫综合征、心血管效应、外周血管病、偏头痛和阿斯匹林依赖性抗血栓形成症、中风、大脑局部缺血、缺血性心脏病或其他疾病。
胃肠道的疾病，包括消化性溃疡、溃疡性结肠炎、克罗恩病和其他疾病。
肝病，包括肝纤维化、肝硬化。
遗传性代谢障碍，包括苯丙酮尿症PKU、威尔逊病、有机酸血症、尿素循环障碍、胆汁淤积和其他疾病。
肾病和泌尿疾病，包括甲状腺炎或其他腺体疾病、血管球性肾炎或其他疾病。
耳、鼻和喉疾病，包括耳炎或其他耳鼻喉疾病、皮炎或其他皮肤疾病。
牙齿和口腔疾病，包括牙周病、牙周炎、齿龈炎或其他牙齿/口腔疾病。
睾丸疾病，包括睾丸炎或附睾-睾丸炎、不育症、睾丸创伤或其他睾丸疾病。
妇科疾病，包括胎盘功能障碍、胎盘功能不全、习惯性流产、子痫、子痫前期、子宫内膜异位和其他妇科疾病。
眼科疾病，例如包括LCA10等的莱伯先天性黑蒙(LCA)；后葡萄膜炎；中间葡萄膜炎；前葡萄膜炎；结膜炎；脉络视网膜炎；葡萄膜视网膜炎；视神经炎；青光眼，包括开角型青光眼和青少年先天性青光眼；眼内炎症，例如视网膜炎或囊样黄斑水肿；交感性眼炎；巩膜炎；色素性视网膜炎；黄斑变性，包括年龄相关性黄斑变性(AMD)和青少年黄斑变性，包括贝斯特病、贝斯特卵黄样黄斑变性、斯特格氏病；尤塞氏综合征；多恩氏蜂窝状视网膜营养失调；Sorby黄斑营养失调；青年性视网膜劈裂症；视锥-视杆营养失调；角膜营养失调；Fuch营养失调；莱伯氏先天性黑内障；莱伯氏遗传性视神经病变(LHON)；艾迪综合征；小口氏病；退行性眼底病；视觉损伤；由感染引起的眼睛炎症；增殖性玻璃体-视网膜病变；急性局部缺血性视神经病变；过度疤痕，例如在青光眼滤过手术后，对眼睛植入物的反应、角膜移植物移植排斥；和其他眼科疾病，例如糖尿病黄斑性水肿、视网膜静脉阻塞、RLBP1相关的视网膜营养失调、无脉络膜和色盲。
神经疾病和神经退行性疾病，包括帕金森病、治疗帕金森病引起的并发症和/或副作用、AIDS相关痴呆综合症、HIV相关脑病、德维克病、西德纳姆舞蹈病、阿尔兹海默病和其他退行性疾病、CNS的病症或失调、中风、脊髓灰质炎后综合征、精神疾病、脊髓炎、脑炎、亚急性硬化性全脑炎、脑脊髓炎、急性神经病、亚急性神经病、慢性神经病、法布里病、戈谢病、胱氨酸病、庞贝氏病、异染性脑白质营养不良、Wiscott Aldrich综合征、肾上腺脑白质营养不良、β-地中海贫血、镰状细胞贫血病、格林-巴利综合征、西德纳姆舞蹈病、重症肌无力、大脑假性肿瘤、唐氏综合征、亨廷顿舞蹈病、CNS压缩或CNS创伤或CNS的感染、肌肉萎缩和营养失调、中枢神经系统和外周神经系统的疾病、病症或失调、运动神经元疾病，包括肌萎缩性侧索硬化、脊髓性肌萎缩症、脊髓和撕裂损伤。
其他的疾病和病症，例如囊性纤维化；粘多糖贮积症，包括Sanfilipo综合征A、Sanfilipo综合征B、Sanfilipo综合征C、Sanfilipo综合征D、亨特综合征、Hurler-Scheie综合征、莫尔丘综合征；ADA-SCID；X相关的SCID；X相关的慢性肉芽肿病；卟啉症；血友病A；血友病B；外伤后炎症、出血、血凝固和急性期应答；恶病质；厌食症；急性感染；脓毒性休克；传染性疾病；糖尿病；手术的并发症或副作用；骨髓移植或其他移植并发症和/或副作用；基因治疗的并发症和副作用，例如由于感染病毒载体、或者AIDS，以压制或抑制体液和/或细胞免疫应答，从而在天然或人工细胞、组织和器官如角膜、骨髓、器官、晶状体、起搏器、天然或人工皮肤组织的移植的情况中用于预防和/或治疗移植排斥。
siRNA、微RNA和shRNA
在某些其他的实施方案中，NOI包含微RNA。微RNA是生物体中天然产生的非常大的一组小RNA，其中至少一些能调节靶基因的表达。微RNA家族的基础成员是let-7和lin-4。let-7基因编码小的、高度保守的RNA种类，该RNA种类在蠕虫发育过程中调节内源蛋白编码基因的表达。该活性RNA种类最初被转录为约70nt的前体，该前体在转录后被加工为成熟的约21nt的形式。let-7和lin-4两者都被转录成发夹RNA前体，所述前体由Dicer酶加工成它们的成熟形式。
除了NOI之外，所述载体还可包含或编码siRNA、shRNA或者经调节的shRNA(Dickins et al.(2005)Nature Genetics 37:1289-1295；Silva et al.(2005)NatureGenetics 37:1281-1288)。
由双链RNA(dsRNA)介导的转录后基因沉默(PTGS)是控制外来基因表达的保守的细胞防御机制。据认为，元件(例如转座子)或病毒的随机整合会引起dsRNA的表达，该dsRNA能激活同源单链mRNA或病毒基因组RNA的序列特异性降解。这种沉默作用称为RNA干扰(RNAi)(Ralph et al.(2005)Nature Medicine 11:429-433)。RNAi的机制涉及将长的dsRNA加工成大约21至25个核苷酸(nt)的RNA的双链体。这些产物称为小干扰RNA或沉默RNA(siRNA)，它们是mRNA降解的序列特异性媒介物。在分化的哺乳动物细胞中，已发现＞30bp的dsRNA能激活干扰素应答，从而导致蛋白质合成的停止和非特异性的mRNA降解(Stark etal.,Annu Rev Biochem 67:227-64(1998))。但是，可用21nt siRNA双链体来绕过该应答(Elbashir et al.,EMBO J.Dec 3；20(23):6877-88(2001)；Hutvagner et al.,Science.Aug 3,293(5531):834-8.Eupub Jul 12(2001))，使得可以在培养的哺乳动物细胞中分析基因功能。
药物组合物
本公开提供了一种药物组合物，其包括本文所述的慢病毒载体或者用本文所述的病毒载体转导的细胞或组织，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本公开提供了用于通过基因疗法治疗个体的药物组合物，其中所述组合物包含治疗有效量的慢病毒载体。该药物组合物可用于人或动物用途。
所述组合物可以包含药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或佐剂。药用载体、赋形剂或稀释剂的选择可以根据预定的施用途径和标准的药物实践来进行。所述药物组合物可以包含、或除了载体、赋形剂或稀释剂之外还包含：任何适宜的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂、增溶剂和可以辅助或增加载体进入靶位点的其他载体试剂(诸如脂质递送系统)。
在适宜的情况下，所述组合物可以通过以下任何一种或以上方式施用：吸入；栓剂或阴道栓剂形式；以洗剂、溶液剂、乳膏、软膏或撒布粉剂(dusting powder)形式局部施用；通过使用皮肤贴剂；口服，为含赋形剂(诸如淀粉或乳糖)的片剂形式、或单独的或与赋形剂混合的胶囊剂或胚珠剂(ovule)形式、或含调味剂或着色剂的酏剂、溶液剂或悬浮剂形式；或它们可以胃肠外注射，例如经阴茎海绵体内、静脉内、肌内、颅内、眼内、腹腔内或皮下注射。对于胃肠外施用，所述组合物最好以无菌水溶液形式使用，所述无菌水溶液可以含有其他物质，例如足够的盐或单糖，从而使得溶液与血液等渗。对于口腔或舌下施用，所述组合物可以用常规方法配制的片剂或锭剂形式施用。
本文所述的慢病毒载体可用于离体转导靶细胞或靶组织，然后将所述靶细胞或靶组织转移到需要治疗的患者体内。这种细胞的实例可以为自体T细胞，并且这种组织的实例可以是供体角膜。
变体、衍生物、类似物、同源物和片段
除了本文提到的具体蛋白质和核苷酸之外，本发明还涵盖使用它们的变体、衍生物、类似物、同源物和片段。
在本发明的情况中，任何给定序列的变体是这样的序列，其中残基(无论是氨基酸残基还是核酸残基)的特定序列以这样的方式进行了修饰：所涉及的多肽或多核苷酸保持了其内源功能中的至少一种。可通过对天然蛋白质中存在的至少一个残基进行添加、删除、置换、修饰、替换和/或改变，来获得变体序列。
与本发明的蛋白质或多肽相关的本文所用的术语“衍生物”包括对序列的一个(或以上)氨基酸残基进行的任何置换、改变、修饰、替换、删除和/或添加，只要所产生的蛋白质或多肽能保持其内源功能中的至少一种即可。
与多肽或多核苷酸相关的本文所用的术语“类似物”包括任何模仿物，即这样的化合物，它具有其所模仿的多肽或多核苷酸的内源功能中的至少一种。
通常，可进行(例如)1、2或3至10或20个置换以进行氨基酸置换，只要被修饰的序列能保持所需的活性或能力即可。氨基酸置换可包括非天然类似物的使用。
用于本发明的蛋白质还可具有这样的氨基酸残基删除、插入或置换，即删除、插入或置换能产生沉默的变化并产生功能上等同的蛋白质。还可在残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性的性质相似性的基础上做出谨慎的氨基酸置换，只要内源功能得以保持即可。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值的含有无电荷极性头部基团的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。
例如可按照下表做出保守置换。第二列同一格中的氨基酸、优选第三列同一行中的氨基酸可互相置换：
Figure BDA0003843317840000561
术语“同源物”意指与野生型氨基酸序列和野生型核苷酸序列具有特定同源性的实体。术语“同源性”可以与“同一性”等同。
在本文中，同源序列包括可与题述序列具有至少50％、55％、65％、75％、85％或90％同一性的氨基酸序列，优选与题述序列具有至少95％、97％或99％的同一性。通常，同源性包括与题述氨基酸序列相同的活性位点等。虽然还可根据相似性(即具有相似化学特性/功能的氨基酸残基)来考虑同源性，但在本发明的情况中，优选根据序列同一性来表示同源性。
在本发明的情况中，同源序列包括可与题述序列具有至少50％、55％、65％、75％、85％或90％同一性的核苷酸序列，优选与题述序列具有至少95％、97％、98％或99％的同一性。虽然还可根据相似性来考虑同源性，但在本文中，优选根据序列同一性来表示同源性。
同源性比较可以借助眼睛来进行，或更通常借助于容易获得的序列比较程序来进行。这些市售可得的计算机程序可以计算出两个或以上序列之间的同源性或同一性百分率。
同源性百分率可以对连续的序列进行计算，即将一个序列与另一序列比对，并且将一个序列中的每个氨基酸直接与另一序列中的相应氨基酸进行比较，每次比较一个残基。这称为“没有空位的(ungapped)”比对。通常，这种没有空位的比对仅对相对短数目的残基进行。
虽然这是一种非常简单而相容的方法，但它没有考虑到例如在其他方面相同的一对序列中，核苷酸序列中的一个插入或删除将引起随后的密码子不能对齐，从而当进行全序列比对时，潜在地导致同源性百分率大大降低。因此，大多数的序列比较方法被设计为产生最佳比对，最佳比对考虑到可能的插入和删除，而不会过多地扣除整体同源性分值。通过在序列比对中插入“空位”以尝试使局部同源性最大化，来实现这一点。
然而，这些更为复杂的方法为在比对中发生的每个空位指定“空位处罚”，使得对于相同数目的相同氨基酸而言，具有尽可能少的空位并反映出两个比较序列之间较高相关性的序列比对将获得比具有许多空位的序列比对更高的分值。“Affine空位罚分”通常用来对存在空位处以相对高的罚分，而对该空位中的每种后来残基的处罚较低。这是最常用的空位打分系统。当然，高的空位处罚会产生具有较少空位的最佳比对。大多数的比对程序允许对空位处罚进行修改。然而，当使用这类软件进行序列比较时，最好使用默认值。例如，当使用GCG Wisconsin Bestfit软件包时，氨基酸序列的默认空位处罚为：一个空位为-12，每个延长为-4。
因此，最大同源性百分率的计算首先需要考虑空位处罚，产生最佳比对。用于进行这种比对的适宜计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit软件包(University ofWisconsin,U.S.A.；Devereux et al.(1984)Nucleic Acids Research 12:387)。可以进行序列比较的其他软件的实例包括但不限于BLAST软件包(参见Ausubel et al.(1999)出处同上–Ch.18)、FASTA(Atschul et al.(1990)J.Mol.Biol.403-410)和GENEWORKS比较工具程序组。BLAST和FASTA都可用于线下和在线搜索(参见Ausubel et al.(1999)，出处同上，第7-58页至第7-60页)。然而，对于一些应用而言，优选使用GCG Bestfit程序。另一种称为BLAST 2序列的工具也可用来比较蛋白质和核苷酸序列(参见FEMS Microbiol Lett(1999)174(2):247-50；FEMS Microbiol Lett(1999)177(1):187-8)。
虽然可以根据同一性测量最终的同源性百分率，但比对过程本身通常不基于全或无的成对比较。而是，通常用绘制的相似性分值矩阵，该分值矩阵根据化学相似性或进化距离，为每个成对比较指定分值。常用的这种矩阵的一个实例是BLOSUM62矩阵-BLAST程序组的默认矩阵。GCG Wisconsin程序一般或者使用公共默认值，或者使用用户符号比较表(如果提供的话)(有关进一步的细节，参见用户手册)。对于一些应用，优选使用GCG软件包的公共默认值，或在其他软件的情况中，使用默认矩阵，例如BLOSUM62。
一旦软件产生了最佳比对，则可以计算出同源性百分率，优选序列同一性百分率。软件通常将此作为序列比较的一部分来进行，并且产生数值结果。
“片段”也是变体，并且这个术语通常指在功能上或者在(例如)试验中感兴趣的多肽或多核苷酸的选定区域。因此“片段”指属于全长多肽或多核苷酸的一部分的氨基酸或核酸序列。
这类变体可用标准的重组DNA技术如定点诱变来制备。在要进行插入的情况中，可以制备合成DNA，其编码该插入以及对应于该插入位点任一侧的天然序列的5'和3'侧翼区域。所述侧翼区域含有对应于天然序列中的位点的便利的限制位点，使得该序列可用适宜的酶进行切割，并且所述合成DNA可连接到该切口中。然后按照本发明表达DNA以制备所编码的蛋白质。这些方法仅仅是举例说明许多本领域已知的用于操作DNA序列的标准技术，其他已知的技术也可使用。
适合用于本发明的细胞和/或模块化构建体的调节蛋白的所有变体、片段或同源物将保留结合NOI的同源结合位点的能力，从而在病毒载体生产细胞中阻遏或阻止NOI的翻译。
结合位点的全部变体、片段或同源物将保留结合同源RNA结合蛋白的能力，从而在病毒载体生产细胞中阻遏或阻止NOI的翻译。
密码子优化
本发明中所用的多核苷酸(包括NOI和/或载体生产系统的组分)可经过密码子优化。之前，密码子优化在WO 1999/41397和WO 2001/79518中已有描述。不同的细胞在它们对具体密码子的使用上存在差异。这种密码子偏好对应于特定tRNA在该细胞类型中的相对丰度的偏好。通过改变序列中的密码子，将它们定制成匹配相应的tRNA的相对丰度，可以增加表达。同样地，通过有意选择相应的tRNA已知在特定细胞类型中稀有的密码子，可以减少表达。因此，可以更大程度地进行翻译控制。
许多病毒(包括逆转录病毒)使用大量的稀有密码子，并且通过改变这些密码子以对应于常用的哺乳动物密码子，可实现目的基因(例如NOI或包装组分)在哺乳动物生产细胞中的表达增加。本领域已知哺乳动物细胞以及多种其他生物的密码子用法表。
病毒载体组分的密码子优化具有许多其他优点。对于编码在生产者细胞/包装细胞中病毒颗粒的组装所必需的病毒颗粒包装组分的核苷酸序列，由于它们的序列的改变，可使RNA不稳定性序列(INS)从中去除。同时，保留了包装组分的氨基酸序列编码序列，从而使得由所述序列编码的病毒组分保持相同或至少充分相似，从而使包装组分的功能不受损害。在慢病毒载体中，密码子优化还能克服输出对Rev/RRE的需要，从而使得经优化的序列不依赖于Rev。密码子优化还能减少载体系统中的不同构建体之间(例如gag-pol开放阅读框和env开放阅读框的重叠区域之间)的同源重组。因此，密码子优化的总体效果是病毒滴度明显增加和安全性改进。
在一个实施方案中，仅对与INS相关的密码子进行密码子优化。然而，在更为优选和实用的实施方案中，对序列全部都进行密码子优化，但有一些例外，例如包含gag-pol的移码位点的序列(参见下文)。
慢病毒载体的gag-pol基因包含编码gag-pol蛋白的两个重叠阅读框。两种蛋白质的表达都依赖于翻译过程中的移码。该移码是因为核糖体在翻译过程中“滑动”而产生的。这个滑动据认为至少部分地由核糖体停靠RNA二级结构造成。这种二级结构存在于gag-pol基因中的移码位点的下游。对于HIV，重叠区域从gag起始端下游的核苷酸1222(其中核苷酸1为gag ATG的A)延伸至gag的末端(nt 1503)。因此，横跨两个阅读框的移码位点和重叠区域的281bp片段优选不进行密码子优化。保留此片段将使得能够更有效地表达Gag-Pol蛋白。对于EIAV，据认为重叠的起始端是nt 1262(其中核苷酸1为gag ATG的A)，并且重叠的末端是nt 1461。为了确保保留移码位点和gag-pol重叠，已保留了野生型序列的nt 1156至1465。
可作出与最优密码子用法的偏差以(例如)适应便利的限制位点，并且可将保守氨基酸变化引入到Gag-Pol蛋白中。
在一个实施方案中，密码子优化基于轻表达的(lightly expressed)哺乳动物基因。可改变第三个碱基，有时可改变第二和第三个碱基。
由于遗传密码的简并性，应理解，技术人员可获得许多种gag-pol序列。另外，有许多所描述的逆转录病毒变体可用作用于产生经密码子优化的gag-pol序列的起始点。慢病毒基因组可以是十分可变的。例如，存在着许多仍能发挥功能的HIV-1类似物质。对于EIAV情况也是一样。这些变体可用于增强转导过程的特定部分。HIV-1变体的例子可在LosAlamos National Security公司运营的HIV数据库(http://hiv-web.lanl.gov)中找到。有关EIAV克隆的细节可在地址为http://www.ncbi.nlm.nih.gov的美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中找到。
用于经密码子优化的gag-pol序列的策略可针对任意逆转录病毒使用。这将适用于所有的慢病毒，包括EIAV、FIV、BIV、CAEV、VMR、SIV、HIV-1和HIV-2。另外，这个方法可用于增加来自HTLV-1、HTLV-2、HFV、HSRV和人内源逆转录病毒(HERV)、MLV及其他逆转录病毒的基因的表达。
密码子优化可使gag-pol表达不依赖于Rev。但是，为了使得能够在慢病毒载体中使用抗rev或RRE因子，有必要使病毒载体生产系统完全不依赖于Rev/RRE。因此，基因组还需要加以修饰。这通过优化载体基因组组分来实现。有利地，这些修饰还导致在生产者细胞和被转导的细胞中产生了不存在所有额外蛋白的更安全的系统。
与经修饰的U1组合以改进载体滴度
由于MSD突变的慢病毒载体在LV生产期间和在靶细胞中这两种情况下参与异常剪接事件的能力降低，因此MSD突变的慢病毒载体比目前的标准慢病毒载体更优选用作基因治疗载体。然而，在本发明之前，MSD突变载体的生产要么依赖于HIV-1 tat蛋白(第一代和第二代U3依赖型慢病毒载体)的供应，要么由于突变MSD对载体RNA水平的不稳定影响而效率较低(在第三代载体中)。出于安全原因，不希望或没有理由将tat“重新引入”当代第三代U3依赖型LV系统中，因此目前没有解决方案来降低用于临床使用的MSD突变载体的生产滴度。
本发明人证明，MSD突变的第三代(即不依赖U3/tat的)LV可以通过在生产期间通过共表达定向于结合载体基因组RNA的5'包装区域的经修饰的U1 snRNA而产生高滴度。令人惊讶的是，证明了这些经修饰的U1 snRNA可以以独立于5'R区域内5'polyA信号存在的方式增强MSD突变的LV的生产滴度，表明这是一种新的机制，而不是其他人的使用经修饰的U1snRNA以抑制多聚腺苷酸化(所谓的U1干扰，[Ui])。令人惊讶的是，证明了将经修饰的U1snRNA靶向包装区域的关键序列可最大程度地增强MSD突变的LV滴度。本发明人还公开了主要剪接供体区域内的新序列突变，使得MSD突变的LV滴度的降低不太明显，并且经修饰的U1snRNA对这种MSD突变的LV变体的滴度增强最大。
令人惊讶的是，本发明人发现慢病毒载体的输出滴度可以通过共表达基于U1snRNAs的非编码RNAs来增强，U1 snRNAs已经过修饰，使其不再靶向内源序列(剪接供体位点)，而现在靶向vRNA分子内的序列。如在本申请的实施例中所证明的，本发明人表明了，在主要剪接供体区域(包含主要剪接供体和隐蔽剪接供体位点)内具有减毒突变的慢病毒载体通过所述经修饰的U1 snRNA对输出滴度的相对增强大于包含非突变主要剪接供体区域的标准慢病毒载体。
如本申请的实施例中所证明的，在导致滴度降低的主要剪接供体区域内具有广泛的突变类型(点突变、区域删除和序列替换)的载体基因组可以与经修饰的U1 snRNA组合使用。该方法可以包括在载体生产过程中经修饰的U1 snRNA与其他载体成分一起的共表达。将经修饰的U1 snRNA设计为结合共有剪接供体位点，该共有剪接供体位点已通过用与载体基因组vRNA内的靶序列互补的异源序列替换而被消除。本发明描述了经修饰的U1 snRNA的各种应用模式和最佳特性，包括靶序列和互补长度、设计和表达模式。
在如本文所述的本发明的一个方面，载体可以与经修饰的U1 snRNA组合使用。这将在下面进一步讨论。
通过提取总RNA，然后使用DNA引物进行RT-PCR或RT-qPCR(定量)，可以在载体生产细胞提取物或载体病毒颗粒中量化经修饰的U1 snRNA分子的存在/丰度。重要的是，将正向引物设计成使其与经修饰的U1 snRNA分子的靶向序列具有互补性，因此在qPCR期间仅扩增经修饰的U1 snRNA而不是内源性U1 snRNA。
在一个方面中，本发明提供了包含如本文所述的根据本发明的经修饰的U1的载体病毒体。
剪接和聚腺苷酸化是mRNA成熟的关键过程，特别是在大多数蛋白质编码转录物含有多个内含子的高等真核生物中。剪接所需的前体mRNA内元件包括5'剪接供体信号、分支点周围的序列和3'剪接受体信号。与这三个元件相互作用的是剪接体，它由五种小核RNA(snRNA)形成，包括U1 snRNA和相关的核蛋白(snRNP)。U1 snRNA由聚合酶II启动子表达，并且存在于大多数真核细胞中(Lund et al.,1984,J.Biol.Chem.,259:2013-2021)。人U1snRNA(小核RNA)长164nt，具有由四个茎环构成的明确结构(West,S.,2012,BiochemicalSociety Transactions,40:846-849)。U1 snRNA在其5'端包含一个短序列，其与外显子-内含子连接处的5'剪接供体位点广泛互补。U1 snRNA通过与5'剪接供体位点的碱基配对参与剪接位点选择和剪接体组装。除剪接之外，U1 snRNA的一个已知功能是调节3'端mRNA加工：它响应于早期聚腺苷酸化(polyA)信号(特别是在内含子内)以抑制过早的polyA。
人U1 snRNA(小核RNA)长164nt，具有由四个茎环组成的明确结构(参见图1)。内源性非编码RNA(U1 snRNA)通过天然剪接供体退火序列(例如，5'-ACUUACCUG-3')在内含子剪接的早期阶段与共有5'剪接供体位点(例如，5'-MAGGURR-3'，其中M为A或C并且R为A或G)结合。茎环I与U1A-70K蛋白结合，该蛋白已被证明对polyA抑制很重要。茎环II与U1A蛋白结合，并且5'-AUUUGUGG-3'序列与茎环IV一起与Sm蛋白结合，Sm蛋白对U1 snRNA加工很重要。如本文所述，根据本发明使用的经修饰的U1 snRNA被修饰以在天然剪接供体靶向序列的位点处引入与载体基因组vRNA分子内的靶序列互补的异源序列(参见图1)。
如本文所用，术语“经修饰的U1 snRNA”、“重新定向的U1 snRNA”、“重新靶向的U1snRNA”、“重新设计的U1 snRNA”和“突变的U1 snRNA”是指已经对U1 snRNA进行修饰使其不再与用于启动靶基因的剪接过程的共有5'剪接供体位点序列(例如5'-MAGGURR-3')互补。因此，经修饰的U1 snRNA是经过修饰后不再与剪接供体位点序列(例如5'-MAGGURR-3')互补的U1 snRNA。相反，经修饰的U1 snRNA被设计为靶向在MSD突变的慢病毒载体基因组分子(靶位点)的包装区域内具有独特RNA序列的核苷酸序列(即与vRNA的剪接无关的序列)或与所述核苷酸序列互补。可以预先选择MSD突变的慢病毒载体基因组分子包装区域内的核苷酸序列。因此，经修饰的U1 snRNA是这样一种U1 snRNA，它已经被修饰，使得其5'端与MSD突变的慢病毒载体基因组分子的包装区域内的核苷酸序列互补。结果，并且不希望受理论束缚，基于靶位点序列与经修饰的U1 snRNA 5'端的短序列的互补性，认为经修饰的U1 snRNA与靶位点序列结合，从而稳定vRNA，使得MSD突变的慢病毒载体的输出载体滴度增加。
如本文所用，术语“天然剪接供体退火序列”和“天然剪接供体靶向序列”是指内源性U1 snRNA的5'端的短序列，其与内含子的共有5'剪接供体位点广泛互补。天然剪接供体退火序列可以为5'-ACUUACCUG-3'。
如本文所用，术语“共有5'剪接供体位点”是指用于剪接位点选择的内含子5'端的共有RNA序列，例如具有序列5'-MAGGURR-3'。
如本文所用，术语“MSD突变的慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列”、“靶序列”和“靶位点”是指具有在MSD突变的慢病毒载体基因组分子的包装区域内的特定RNA序列的位点，其被预选为结合/退火经修饰的U1 snRNA的靶位点。
如本文所用，术语“MSD突变的慢病毒载体基因组分子的包装区域”和“MSD突变的慢病毒载体基因组序列的包装区域”是指MSD突变的慢病毒载体基因组的5'端的从5'U5结构域开始到源自gag基因的序列的末端的区域。因此，MSD突变的慢病毒载体基因组分子的包装区域包括5'U5结构域、PBS元件、茎环(SL)1元件、SL2元件、SL3ψ元件、SL4元件和源自gag基因的序列。在本领域中，在慢病毒载体生产期间向基因组以反式提供完整的gag基因以能够生产复制缺陷型病毒载体颗粒是常见的。以反式提供的gag基因的核苷酸序列不需要由野生型核苷酸编码，但可以是密码子优化的；重要的是，以反式提供的gag基因的主要特性是它编码并定向gag和gagpol蛋白的表达。因此，本领域技术人员将理解，如果在慢病毒载体生产期间以反式提供完整的gag基因，则术语“慢病毒载体基因组分子的包装区域”可以指MSD突变的慢病毒载体基因组分子的5'端的从5'U5结构域开始、通过SL3ψ元件处的“核心”包装信号以及来自ATG密码子(存在于SL4中)的天然gag核苷酸序列、到存在于载体基因组上的保留的gag核苷酸序列的末端的区域。
如本文所用，术语“源自gag基因的序列”是指可能存在于(例如保留在)载体基因组中的源自ATG密码子的gag基因至核苷酸688的任何天然序列(Kharytonchyk,S.et.al.,2018,J.Mol.Biol.,430:2066-79)。
如本文所用，术语“在包含天然剪接供体退火序列的U1 snRNA的前11个核苷酸内引入异源序列”、“在位置3至11处的九个核苷酸内引入所述异源序列”和“在U1 snRNA的5'端的前11个核苷酸内引入异源序列”包括用所述异源序列替换U1 snRNA的前11个核苷酸或位置3至11处的九个核苷酸的全部或一部分，或对U1 snRNA的前11个核苷酸或位置3至11处的九个核苷酸进行修饰以使其具有与所述异源序列相同的序列。
如本文所用，术语“在天然剪接供体退火序列中引入异源序列”和“在U1 snRNA的5'端的天然剪接供体退火序列中引入异源序列”包括用所述异源序列替换天然剪接供体退火序列的全部或一部分，或修饰天然剪接供体退火序列以使其具有与所述异源序列相同的序列。
如本文所用，术语“提高慢病毒载体滴度”包括“增加慢病毒载体滴度”、“恢复慢病毒载体滴度”和“改进慢病毒载体滴度”。
因此，在一个实施方案中，经修饰的U1 snRNA已被修饰以结合MSD突变的慢病毒载体基因组序列的包装区域内的核苷酸序列。
在一些实施方案中，经修饰的U1 snRNA在相对于内源性U1 snRNA的5'端被修饰，以引入与MSD突变的慢病毒载体基因组的包装区域内的核苷酸序列互补的异源序列。
在一些实施方案中，经修饰的U1 snRNA在相对于内源性U1 snRNA的5'端被修饰，以在天然剪接供体退火序列内引入与MSD突变的慢病毒载体基因组的包装区域内的核苷酸序列互补的异源序列。
经修饰的U1 snRNA可以在相对于内源性U1 snRNA的5'端被修饰，以用与所述核苷酸序列互补的异源序列替换包含天然剪接供体退火序列的序列。
经修饰的U1 snRNA可以是经修饰的U1 snRNA变体。根据本发明的经修饰的U1snRNA变体可以是天然存在的U1 snRNA变体、在茎环I区域内包含去除U1-70K蛋白结合的突变的U1 snRNA变体、或在茎环II区域内包含去除U1A蛋白结合的突变的U1 snRNA变体。在茎环I区域内包含去除U1-70K蛋白结合的突变的U1 snRNA变体可以是U1_m1或U1_m2，优选U1A_m1或U1A_m2。
在一些实施方案中，本文所述的经修饰的U1 snRNA包含与如本文所述的U1_256序列的主要U1 snRNA序列[三叶草叶](nt 410-562)具有至少70％同一性(适宜地为至少75％、至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性)的核苷酸序列。在一些实施方案中，本发明的经修饰的U1 snRNA包含如本文所述的U1_256序列的主要U1 snRNA序列[三叶草叶](nt 410-562)。U1_256序列(SEQ ID NO:15)的主要U1snRNA序列[三叶草叶](nt 410-562)如下：
Figure BDA0003843317840000661
在一些优选的实施方案中，包含天然剪接供体退火序列的U1 snRNA的前11个核苷酸可以全部或部分被替换为与MSD突变的慢病毒载体基因组的包装区域内的核苷酸序列互补的异源序列。适宜地，U1 snRNA的前11个核苷酸的核酸1至11(适宜地为2至11、3至11、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11)被替换为与MSD突变的慢病毒载体基因组的包装区域内的核苷酸序列互补的异源序列。
在一些实施方案中，天然剪接供体退火序列可以全部或部分被异源序列替换，该异源序列与MSD突变的慢病毒载体基因组的包装区域内的核苷酸序列互补。适宜地，天然剪接供体退火序列的核酸1至11(适宜地为2至11、3至11、5至11、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11)被替换为与MSD突变的慢病毒载体基因组的包装区域内的核苷酸序列互补的异源序列。在一个优选的实施方案中，整个天然剪接供体退火序列被替换为与MSD突变的慢病毒载体基因组的包装区域内的核苷酸序列互补的异源序列，即根据本文所述的异源序列完全替换了天然剪接供体退火序列(例如5'-ACUUACCUG-3')。
在一些实施方案中，与MSD突变的慢病毒载体基因组的包装区域内的核苷酸序列互补的异源序列包含与所述核苷酸序列互补的至少7个核苷酸。在一些实施方案中，与MSD突变的慢病毒载体基因组的包装区域内的核苷酸序列互补的异源序列包含与所述核苷酸序列互补的至少9个核苷酸。优选地，用于本发明的异源序列包含与所述核苷酸序列互补的15个核苷酸。
适宜地，用于本发明的异源序列可以包含7至25(适宜地7至20、7至15、9至15、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25)个核苷酸。
适宜地，用于本发明的异源序列可以包含25个核苷酸。
在一些实施方案中，MSD突变的慢病毒载体基因组的包装区域内的核苷酸序列位于5'U5结构域、PBS元件、SL1元件、SL2元件、SL3ψ元件、SL4元件和/或源自gag基因的序列内。适宜地，MSD突变的慢病毒载体基因组的包装区域内的核苷酸序列位于SL1、SL2和/或SL3ψ元件内。在一些优选的实施方案中，MSD突变的慢病毒载体基因组的包装区域内的核苷酸序列位于SL1和/或SL2元件内。在一些特别优选的实施方案中，MSD突变的慢病毒载体基因组的包装区域内的核苷酸序列位于SL1元件内。
在一些实施方案中，MSD突变的慢病毒载体基因组的包装区域内的核苷酸序列包括至少7个核苷酸。在一些实施方案中，MSD突变的慢病毒载体基因组的包装区域内的核苷酸序列包括至少9个核苷酸。适宜地，MSD突变的慢病毒载体基因组的包装区域内的核苷酸序列包括7至25(适宜地为7至20、7至15、9至15、7、8、9、10、11、12、13、14或15)个核苷酸。
优选地，MSD突变的慢病毒载体基因组的包装区域内的核苷酸序列包含15个核苷酸。
相对于在不存在本文所述的经修饰的U1 snRNA的情况下的慢病毒载体生产，本文所述的经修饰的U1 snRNA与MSD突变的慢病毒载体基因组的包装区域内的核苷酸序列的结合可以在慢病毒载体生产过程中提高慢病毒载体滴度。因此，相对于在不存在本文所述的经修饰的U1 snRNA的情况下的慢病毒载体生产，在本文所述的经修饰的U1 snRNA存在下生产慢病毒载体提高了慢病毒载体滴度。用于测量慢病毒载体滴度的适宜的试验方法如本文所述。适宜地，慢病毒载体生产涉及所述经修饰的U1 snRNA与包括gag、env、rev和慢病毒载体的RNA基因组的载体组分的共表达。慢病毒载体的RNA基因组可以是MSD-2KO RNA基因组。在一些实施方案中，慢病毒载体滴度的提高发生在功能性5'LTR polyA位点存在或不存在的情况下。在一些实施方案中，由本发明的经修饰的U1 snRNA介导的慢病毒载体滴度的提高与载体基因组的5'LTR中的polyA位点抑制无关。
在一些实施方案中，相对于在不存在本文所述的经修饰的U1 snRNA的情况下的慢病毒载体生产，本文所述的经修饰的U1 snRNA与MSD突变的慢病毒载体基因组的包装区域内的核苷酸序列的结合可在慢病毒载体生产期间使慢病毒载体滴度增加至少30％。适宜地，相对于在不存在本文所述的经修饰的U1 snRNA的情况下的MSD突变的慢病毒载体生产，本文所述的经修饰的U1 snRNA与MSD突变的慢病毒载体基因组的包装区域内的核苷酸序列的结合可在生产期间使MSD突变的慢病毒载体滴度增加至少35％(适宜地为至少40％、45％、50％、60％、70％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％、600％、650％、700％、750％、800％、850％、900％、950％、1,000％、2,000％、5,000％或10,000％)。
本文所述的经修饰的U1 snRNA可以通过以下步骤进行设计：(a)在MSD突变的慢病毒载体基因组的包装区域中选择用于结合经修饰的U1 snRNA的靶位点(预选核苷酸位点)；以及(b)在U1 snRNA的5'端的天然剪接供体退火序列(例如5'-ACUUACCUG-3')中引入异源序列，该异源序列与在步骤(a)中选择的预选核苷酸位点互补。
使用分子生物学中的常规技术在内源性U1 snRNA的5'端的天然剪接供体退火序列(例如5'-ACUUACCUG-3')中引入与靶位点互补的异源序列、或用与靶位点互补的异源序列代替天然剪接供体退火序列(例如5'-ACUUACCUG-3')在本领域普通技术人员的能力范围内。一般而言，适宜的常规方法包括定向诱变或经由同源重组进行替换。
使用分子生物学中的常规技术在内源性U1 snRNA的5'端修饰天然剪接供体退火序列(例如5'-ACUUACCUG-3')，使其具有与靶位点互补的异源序列相同的序列在本领域普通技术人员的能力范围内。例如，适宜的方法包括定向诱变或随机诱变，然后选择提供根据本文所述的经修饰的U1 snRNA的突变。
本文所述的经修饰的U1 snRNA可以根据本领域公知的方法制造。例如，经修饰的U1 snRNA可以通过化学合成或重组DNA/RNA技术制造。
在一个方面中，编码经修饰的U1 snRNA的核苷酸序列可以在不同的核苷酸序列上，例如在不同的质粒上。
使用常规分子和细胞生物学技术将编码本文所述的经修饰的U1 snRNA的核苷酸序列引入细胞在本领域普通技术人员的能力范围内。
与改进的TRAP结合位点和Kozak序列的组合
如上述所讨论的，在WO 2015/092440中描述了TRIP系统，并提供了一种在载体生产过程中抑制生产细胞中NOI表达的方式。当需要组成型和/或强启动子(包括组织特异性启动子)驱动转基因时，且特别地当在生产细胞中表达转基因蛋白导致载体滴度降低和/或由于转基因来源蛋白的病毒载体递送在体内激发免疫应答时，TRAP结合序列(例如，TRAP-tbs)相互作用形成用于生产逆转录病毒载体的转基因蛋白阻遏系统的基础(Maunder etal,Nat Commun.(2017)Mar 27；8)。
在一个实施方案中，核苷酸序列进一步包含色氨酸RNA结合衰减蛋白(TRAP)结合位点或其部分。
在一个方面中，本发明提供了一种包含目的核苷酸(转基因)和色氨酸RNA结合衰减蛋白(TRAP)结合位点的核酸序列，其中TRAP结合位点与转基因起始密码子ATG重叠。
本文中与Kozak序列/重叠Kozak序列有关的任何公开内容同样适用于(在适当的情况下)涉及起始密码子ATG以及与其重叠的等效方面。
在另一个方面中，本发明提供了一种包含目的核苷酸和Kozak序列的核酸序列，其中所述Kozak序列包含色氨酸RNA结合衰减蛋白(TRAP)结合位点的一部分。
在一个方面中，本发明提供了一种包含目的核苷酸(转基因)和TRAP结合位点的核酸序列，其中TRAP结合位点包含转基因起始密码子ATG的一部分，反之亦然。
在一个实施方案中，核苷酸序列进一步包含如本文所述的tbs或其部分、多克隆位点(MCS)和如本文所述的Kozak序列，其中所述MCS位于tbs或其部分的下游和Kozak序列的上游。适宜地，tbs或其部分与Kozak序列不重叠。
在本发明的一些实施方案中，目的核苷酸能够连接到tbs或其部分。在一些实施方案中，目的核苷酸在缺乏TRAP的靶细胞中被翻译。
tbs或其部分可能能够与TRAP相互作用，从而在病毒载体生产细胞中抑制或阻止目的核苷酸的翻译。
因此，提供了一种在病毒载体生产细胞中抑制NOI翻译的方法，该方法包括将本发明的核苷酸序列和编码TRAP的核酸序列引入病毒载体生产细胞中，其中TRAP结合至TRAP结合位点或其部分，从而抑制NOI的翻译。
表1示出了可以在本发明中使用的序列：其中K可以是T或G，“R”应理解为指定在序列中的该位置处为嘌呤(即A或G)，“V”应理解为指定来自G、A或C的任何核苷酸，“N”应理解为指定在序列中的该位置处为任何核苷酸。例如，这可以是G、A、T、C或U。TRAP结合位点(tbs)序列或3'tbs序列以斜体显示，多克隆位点(MCS)显示为下划线，并且Kozak序列以粗体显示。
表1:
Figure BDA0003843317840000711
Figure BDA0003843317840000721
Figure BDA0003843317840000731
Figure BDA0003843317840000741
Figure BDA0003843317840000751
Figure BDA0003843317840000761
Figure BDA0003843317840000771
Figure BDA0003843317840000781
Figure BDA0003843317840000791
Figure BDA0003843317840000801
Figure BDA0003843317840000811
Figure BDA0003843317840000821
色氨酸RNA结合衰减蛋白(TRAP)是一种细菌蛋白，已在枯草芽孢杆菌中得到广泛表征。TRAP描述于WO 2015/092440。
TRAP开放阅读框可以针对在哺乳动物(例如，人)细胞中的表达进行密码子优化，因为细菌基因序列对于在哺乳动物细胞中的表达可能不是最佳的。还可以通过去除潜在不稳定的序列和剪接位点来优化序列。使用在TRAP蛋白C末端表达的HIS标签似乎在翻译抑制方面提供了益处，并且可以任选地使用。该C末端HIS标签可以提高真核细胞内TRAP的可溶性或稳定性，尽管不能排除改进的功能性益处。尽管如此，具有HIS标签和不具有HIS标签的TRAP都可以有效抑制转基因表达。TRAP转录单元内的某些顺式作用序列也可以优化；例如，在瞬时转染的情况下，与CMV启动子驱动的构建体相比，EF1α启动子驱动的构建体能够以低输入的TRAP质粒实现更好的抑制。
在一个实施方案中，本发明中使用的TRAP源自细菌。
在本发明的一个实施方案中，TRAP源自芽孢杆菌属(Bacillus species)物种，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。例如，TRAP可包含如SEQ ID NO:94所示的序列。
在本发明优选的实施方案中，SEQ ID NO:94在C末端具有六个组氨酸标签(HISx6标签)。
在一个可选的实施方案中，TRAP源自寡食胺单胞菌(Aminomonas paucivorans)。例如，TRAP可以包含如SEQ ID NO:95所示的序列。
在一个可选的实施方案中，TRAP源自热液口脱硫肠杆菌(Desulfotomaculumhydrothermale)。例如，TRAP可以包含如SEQ ID NO:96所示的序列。
在一个可选的实施方案中，TRAP源自嗜热脂肪芽胞杆菌(B.stearothermophilus)。例如，TRAP可以包含以如SEQ ID NO:97所示的序列。
在一个可选的实施方案中，TRAP源自嗜热脂肪芽胞杆菌(B.stearothermophilus)S72N。例如，TRAP可以包含如SEQ ID NO:98所示的序列。
在一个可选的实施方案中，TRAP源自耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)。例如，TRAP可以包含如SEQ ID NO:99所示的序列。
在一个可选的实施方案中，TRAP源自生氢氧化碳嗜热菌(Carboxydothermushydrogenoformans)。例如，TRAP可以包含如SEQ ID NO:100所示的序列。
在一个实施方案中，TRAP由色氨酸RNA结合衰减蛋白基因家族mtrB(TrpBP超家族，例如，NCBI保藏域数据库#cl03437)编码。
在优选的实施方案中，TRAP在C末端具有6个组氨酸标签(HISx6标签)。
在优选的实施方案中，TRAP包含与SEQ ID NO:94至SEQ ID NO:100中任一者具有50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列，并且能够与RNA-结合位点相互作用，从而在病毒载体生产细胞中使能够连接的NOI的表达改变，例如抑制或阻止。
在优选的实施方案中，TRAP包含与SEQ ID NO:94至SEQ ID NO:100中任一者具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性的氨基酸序列，并且能够与RNA-结合位点相互作用，从而在病毒载体生产细胞中使能够连接的NOI的表达改变，例如抑制或阻止。
在另一个实施方案中，TRAP可以由包含这样的核苷酸序列的多核苷酸编码，所述核苷酸序列编码能够与RNA结合位点相互作用的蛋白，从而在病毒载体生产细胞中使能够连接的NOI的表达改变，例如抑制或阻止。例如，TRAP可以由包含编码SEQ ID NO:94至SEQID NO:100的蛋白的核苷酸序列的多核苷酸编码。
用于本发明的TRAP的所有变体、片段或同源物将保留结合如本文所述TRAP结合位点的能力，从而在病毒载体生产细胞中抑制或阻止NOI(其可以是标记基因)的翻译。
TRAP结合位点
术语“结合位点”应理解为能够与某种蛋白相互作用的核酸序列。
一种能够结合TRAP的共有TRAP结合位点序列是重复多次(例如6、7、8、9、10、11、12或更多次)的[KAGNN]；这种序列存在于天然的trp操纵子中。在天然环境中，偶尔的AAGNN是能够被容许的，有时额外的“间隔”N核苷酸会产生功能序列。体外实验表明，TRAP-RNA结合需要至少6个或更多个共有重复序列(Babitzke P,Y.J.,Campanelli D.(1996)Journal ofBacteriology 178(17):5159-5163)。因此，在一个实施方案中，优选的是在tbs内存在6个或更多个连续的[KAGN≥2]序列，其中K在DNA中可以是T或G，在RNA中可以是U或G。
对于作为RNA结合蛋白的TRAP，优选地，TRIP系统最大程度地使用包含至少8个KAGNN重复序列的tbs序列，尽管可以使用7个重复序列仍然能获得强大的转基因抑制，并且可以使用6个重复序列也能够充分抑制转基因到可以挽救载体滴度的水平。虽然可以改变KAGNN共有序列以维持TRAP介导的抑制，但优选地，可以优化选择的精确序列以确保在非抑制状态下的高水平翻译。例如，可以通过去除在没有TRAP的情况下(即在靶细胞中)可能会阻碍mRNA的翻译效率的剪接位点、不稳定序列或茎环来优化tbs序列。关于给定tbs的KAGNN重复序列的构型，KAG重复序列之间的N个“间隔”核苷酸的数量优选为两个。然而，在至少两个KAG重复序列之间包含两个以上N间隔的tbs是可以容忍的(根据体外结合研究的判断，多达50％的包含三个N的重复序列可能获得功能性tbs；Babitzke P,Y.J.,Campanelli D.(1996)Journal of Bacteriology 178(17):5159-5163)。事实上，已经证明了11x KAGNNtbs序列可以容忍多达三个KAGNNN重复序列的替换，并且仍然保留一些与TRAP结合合作的潜在有用的翻译阻断活性。
在本发明的一个实施方案中，TRAP结合位点或其部分包含序列KAGN≥2(例如KAGN2-3)。因此，为了避免产生疑问，该tbs或其部分包括例如以下任何重复序列：UAGNN、GAGNN、TAGNN、UAGNNN、GAGNNN或TAGNNN。
“N”应理解为序列中位于该位置的任意核苷酸。例如，这可以是G、A、T、C或U。此类核苷酸的数量优选为2，但最多为3个，例如1、2或3，11x重复tbs或其部分的KAG重复序列可以被3个间隔核苷酸隔开，并且仍然保留一些导致翻译抑制的TRAP结合活性。优选地，在11x重复tbs或其部分中将使用不超过一个N3间隔子以保持导致翻译抑制的最大TRAP结合活性。
在另一个实施方案中，tbs或其部分包含多个KAGN≥2重复序列(例如KAGN2-3的多个重复序列)。
在另一个实施方案中，tbs或其部分包含多个序列KAGN2的重复序列。
在另一个实施方案中，tbs或其部分包含至少6个KAGN≥2重复序列(例如至少6个KAGN2-3重复序列)。
在另一个实施方案中，tbs或其部分包含至少6个KAGN2重复序列。例如，tbs或其部分可以包含6、7、8、9、10、11、12或更多个KAGN2重复序列。例如，tbs或其部分可包含SEQ IDNO:125-136或139中的任一者。
在另一个实施方案中，tbs或其部分包含至少8个KAGN≥2重复序列(例如至少8个KAGN2-3重复序列)。例如，tbs或其部分可以包含SEQ ID NO:125、126、131-134、137-24中的任一者。
优选地，存在于tbs或其部分中的KAGNNN重复序列的数量为1个或更少。例如，tbs或其部分可以包含SEQ ID NO:125、126、131-134、136-141中的任一者。
在另一个实施方案中，tbs或其部分包含11个KAGN≥2重复序列(例如11个KAGN2-3重复序列)。优选地，存在于该tbs或其部分中的KAGNNN重复序列的数量为3个或更少。例如，tbs或其部分可以包含SEQ ID NO:125、126、131、137-139中的任一者。
在另一个实施方案中，tbs或其部分包含12个KAGN≥2重复序列(例如12个KAGN2-3重复序列)。
在一个优选的实施方案中，tbs或其部分包含8至11个KAGN2重复序列(例如8、9、10或11个KAGN2重复序列)。例如，tbs或其部分可以包含SEQ ID NO:125、126、131-134、137-141中的任一者。
在一个实施方案中，TRAP结合位点或其部分可以包含SEQ ID NO:125-141中的任一者。
例如，TRAP结合位点或其部分可包含如SEQ ID NO:125或SEQ ID NO:126所示的序列。
“KAGN≥2重复序列”应理解为通用KAGN≥2(例如KAGN2-3)基序被重复。可以连接满足该基序标准的不同KAGN≥2序列以构成tbs或其部分。并非意在将所得的tbs或其部分限制为仅满足该基序要求的一个序列的重复序列，然而这种可能性包括在定义中。例如，“6个KAGN≥2重复序列”包括但不限于如SEQ ID NO:127-130所示的序列。
包含一个KAGNNN重复序列和七个KAGNN重复序列的8次重复的tbs或其部分保留了TRAP介导的抑制活性。含有一个或以上KAGNNN重复序列的少于8次重复的tbs序列或其部分(例如7次重复或6次重复的tbs序列或其部分)可能具有较低的TRAP介导的抑制活性。因此，当存在少于8次重复时，优选tbs或其部分仅包含KAGNN重复序列。
用于KAGNN重复共有序列的优选核苷酸是在至少一个NN间隔位置处的嘧啶；在第一个NN间隔位置处的嘧啶；在两个NN间隔位置处的嘧啶；在K位置的G。
当NN间隔位置处为AA时，还优选在K位置使用G(即，优选TAGAA不用作共有序列中的重复序列)。
“能够相互作用”应理解为，在细胞(例如真核病毒载体生产细胞)中相遇的情况下，核酸结合位点(例如tbs或其部分)能够与蛋白(例如TRAP)结合。这种与诸如TRAP的RNA结合蛋白的相互作用导致抑制或阻止与核酸结合位点(例如，tbs或其部分)能够连接的NOI的翻译。
“能够连接”应理解为，所描述的元件处于允许它们以其预期的方式发挥功能的关系。因此，用于本发明的能够连接到NOI的tbs或其部分以这样的方式定位，即当TRAP与tbs或其部分结合时，改变NOI的翻译。
在给定开放阅读框(ORF)的NOI翻译起始密码子上游放置能够与TRAP相互作用的tbs或其部分使来自该ORF的mRNA受到特异性的翻译抑制。将tbs或其部分和翻译起始密码子隔开的核苷酸数目可以变化，例如从0到34个核苷酸，而不影响抑制程度。作为另一个例子，可以用0至13个核苷酸将TRAP结合位点或其部分与翻译起始密码子隔开。
tbs或其部分可置于内部核糖体进入位点(IRES)的下游，以抑制mRNA多顺反子中NOI的翻译。事实上，这提供了进一步的证据，证明tbs结合的TRAP可能会阻止40S核糖体的通过；在完整的翻译复合物形成之前，IRES元件用于以不依赖CAP的方式将核糖体40S亚基与mRNA隔离(参见Thompson,S.(2012)Trends in Microbiology 20(11):558-566中有关IRES翻译起始的评论)。因此，TRIP系统有可能抑制来自病毒载体基因组表达的单个mRNA的多个开放阅读框。当生产编码多个治疗基因的载体时，特别是当所有的转基因产物可能会对载滴度具有一定程度的负面影响时，TRIP系统的这一特征将会是有用的。
在一个实施方案中，核苷酸序列包含位于IRES和tbs或其部分之间的间隔子序列。IRES可以是如本文在小标题“内部核糖体进入位点”下描述的IRES。间隔子序列的长度可以在0到30个核苷酸之间，优选地，长度为15个核苷酸。间隔子可包含如SEQ ID NO:151-157中的任一者所示的序列，优选地，间隔子包含如SEQ ID NO:151所示的序列。
在一个实施方案中，IRES和tbs或其部分之间的间隔子序列距tbs或其部分以及下游NOI起始密码子的3'端的距离为3或9个核苷酸。
在一个实施方案中，tbs或其部分缺乏II型限制酶位点。在一个优选的实施方案中，tbs或其部分缺乏SapI限制酶位点。
在一些实施方案中，核酸序列进一步包含RRE序列或其功能替代物。
重叠Kozak序列和TRAP结合位点序列
本发明人意想不到地发现，与使用不重叠tbs和Kozak序列相比，可以通过将Kozak序列“隐藏”在tbs或其部分的3'端内(使用重叠tbs和Kozak序列；参见图19B和19C)来实现改进的抑制水平。此外，所有测试的重叠tbs和Kozak序列出乎意料地指导有效水平的翻译起始，即测试的重叠序列在没有TRAP的情况下提供了与非重叠Kozak和tbs序列相似水平的转基因表达。不希望受理论束缚，抑制水平的提高可归因于当tbs或其部分与Kozak序列重叠时TRAP-tbs复合物对转基因起始密码子的封堵提高。
术语“Kozak序列”应理解为真核mRNA中的共有序列，其被核糖体识别为翻译起始位点。Kozak序列包括DNA中的ATG起始(启动)密码子(mRNA中为AUG)。真核mRNA中存在的确切Kozak序列决定了翻译起始的效率，即某些Kozak序列不会引起有效的翻译起始。
完整的Kozak序列通常被理解为具有用于DNA的共有序列(gcc)gccRccATGG和用于RNA的共有序列(gcc)gccRccAUGG，其中：小写字母表示此位置处是最常见的碱基，该位置的碱基可以变化；大写字母表示该位置是高度保守的碱基；“R”表示通常在该位置嘌呤(即A或G)是最佳的；括号中的序列(gcc)具有不确定的意义。T/U通常是起始密码子上游的Kozak序列共有的所有位置上最不优选的核苷酸。
由于完整Kozak序列的前三个碱基具有不确定的意义，Kozak序列也可以理解为具有共有序列，本文称为“扩展的Kozak序列”，即对于DNA为GNNRVVATGG(SEQ ID NO:103)并且对于RNA为GNNRVVAUGG，其中“R”应理解为指定在序列中的该位置处为嘌呤(即A或G)，“V”应理解为指定来自G、A或C的任意核苷酸，并且“N”应理解为指定在序列中的该位置处为任意核苷酸。例如，“N”可以是G、A、T、C或U。需要注意的是，“R”在位置-1和“G”在位置+3(相对于ATG中位置为0的“A”而言)被认为是Kozak实力最重要的位置。然而，转基因序列中位置+3处的“G”的存在取决于待编码的ORF，因此出于本说明书的目的，位置+3并未被视为“核心”Kozak序列的一部分。
在完整Kozak序列的前六个位置发现的碱基会有所不同，因此可以在这些位置找到任何碱基(上面表示为(gcc)gcc)。因此，完整的Kozak共有序列可以被认为包含“核心”Kozak序列，该序列由完整的Kozak序列的具有降低的可变性的部分组成，如上所示的RccAUG。“核心”Kozak共有序列在本文中定义为：对于mRNA为RVVAUG，对于DNA为RVVATG，其中“R”应理解为指定在序列中的该位置处为嘌呤(即A或G)，“V”应理解为指定来自G、A或C的任意核苷酸。
在本发明的一个优选实施方案中，Kozak序列包括序列RVVATG(SEQ ID NO:104)；其中“R”应理解为指定在序列中的该位置处为嘌呤(即A或G)，“V”应理解为指定来自G、A或C的任意核苷酸。
在本发明的一个实施方案中，Kozak序列包含序列RNNATG；其中“R”应理解为指定在序列中的该位置处为嘌呤(即A或G)，并且“N”应理解为指定来自G、A、T/U或C的任意核苷酸，认识到在没有TRAP的情况下使用“T/U”可能会降低表达水平。
在一些实施方案中，Kozak序列与TRAP结合位点或其部分的3'端KAGNN重复序列重叠。因此，核心Kozak序列可能与TRAP结合位点或其部分的3'端KAGNN重复序列重叠。
图19C中概括了优选的重叠tbs和Kozak共有序列。
在一个优选的实施方案中，TRAP结合位点或其部分的3'端KAGNN重复序列与核心Kozak序列内ATG三联体的至少第一个或前两个核苷酸重叠。
如本文所述，在本发明的一个方面中，TRAP结合位点或其部分的3'端KAGNN重复序列与目的核苷酸(转基因ORF)的ATG起始密码子重叠。在一个方面中，TRAP结合位点或其部分的3'端KAGNN重复序列与目的核苷酸(转基因ORF)的ATG起始密码子的第一个或前两个核苷酸重叠。
在一个方面中，重叠tbs-Kozak序列可以具有共有序列KAGNNG(SEQ ID NO:113)，其中“NN”是Kozak序列的ATG三联体中的前两个核苷酸。
共有序列可以是KAGATG(SEQ ID NO:114)；其中“K”是G或T/U。
在一个方面中，重叠tbs-Kozak序列可以是GAGATG(SEQ ID NO:142)，如图19C所示。
在一个实施方案中，TRAP结合位点或其部分的3'端KAGNN重复序列与目的核苷酸内的ATG三联体的第一个核苷酸重叠。
在一个方面，该序列可以包含序列KAGNNTG(SEQ ID NO:115)，其中第二个“N”是ATG三联体中的第一个核苷酸。共有序列为KAGNATG(SEQ ID NO:116)；其中“K”应理解为指定在序列中的该位置处为G或T/U，“N”应理解为指定来自G、A、T、U或C的任意核苷酸，但优选为“V”，即来自G、A或C。例如，重叠序列可以是KAGVATG(SEQ ID NO:143)，如图19C所示。
在一个实施方案中，用于本发明的重叠Kozak序列和TRAP结合位点或其部分包含如SEQ ID NO:142-146所示的序列。
在一个实施方案中，本发明的核苷酸序列包含如SEQ ID NO:142-146所示的序列。在一个方面中，本发明的序列包含序列KAGATG。
用于本发明的核酸的对应于共有序列GAGATG(SEQ ID NO:142)、KAGVATG(SEQ IDNO:143)和KAGVVATG(SEQ ID NO:144)的优选的重叠tbs或其部分和核心Kozak序列(基于本文定义的KAGNN的共有tbs重复序列和本文定义的共有“核心”Kozak序列RVVATG)包括如SEQID NO:142和SEQ ID NO:69-92所示的序列。
在一些实施方案中，核苷酸序列包含如SEQ ID NO:147-150所示的序列。优选地，核苷酸序列包含如SEQ ID NO:147或SEQ ID NO:148所示的序列。
在一个优选的实施方案中，本发明的核苷酸序列包含如SEQ ID NO:106所示的重叠tbs和Kozak序列
为了提高TRIP系统的易处理性，希望能够具有通过选择几种不同的限制酶(RE)将NOI直接克隆到包含启动子-5'UTR-tbs序列的表达盒中的能力，即在tbs和Kozak序列之间引入多克隆位点(MCS)(参见图19A)。本发明的发明人已经证明了几种不同的MCS可以被TRIP系统耐受，即，当使用MCS时仍然获得转基因抑制。这是出乎意料的，因为5'UTR前导序列可以调节TRAP介导的抑制的程度，tbs与ATG起始密码子的紧密接近性很重要，并且必须与MCS和NOI的起始密码子或在MCS和NOI的起始密码子之间维持有效的Kozak序列，以确保有效的翻译起始。此外，无法预测在维持TRAP介导的抑制的同时可以使用的RE位点的数量和/或组合。
因此，需要“压缩”序列，以便可以在从tbs到ATG起始密码子的尽可能短的距离内引入若干(重叠)RE位点(以保持tbs与ATG的接近性)，同时还保持有效的核心Kozak序列RVVATG。
在一个实施方案中，核苷酸序列进一步包括如本文所述的tbs或其部分、多克隆位点(MCS)和如本文所述的Kozak序列，其中所述MCS位于tbs或其部分的下游和Kozak序列的上游。适宜地，tbs或其部分与Kozak序列不重叠。
如本文所用，“多克隆位点”应理解为包含若干彼此非常接近的限制酶识别位点(限制酶位点)的DNA区域。在一个实施方案中，RE位点可以在用于本发明的MCS中重叠。
如本文所用，“限制酶位点”或“限制酶识别位点”是DNA分子上的一个位置，其是被限制性酶识别的包含长度为4至8个核苷酸的特定核苷酸序列。限制酶识别特定的RE位点(即，特定序列)并在RE位点内或附近切割DNA分子。
在一个实施方案中，核苷酸序列包含如SEQ ID NO:158-171中所示的序列。
在一个实施方案中，核苷酸序列包含如SEQ ID NO:165-171中所示的序列。
在一个实施方案中，核苷酸序列包含如SEQ ID NO:165、168或171中所示的序列。
在一个优选的实施方案中，本发明的核苷酸序列包含如SEQ ID NO:107所示的重叠tbs-MCS-Kozak序列。
在一个实施方案中，Kozak序列包含序列RNNATG；其中“R”应理解为指定在序列中的该位置处为嘌呤(即A或G)，并且“N”应理解为指定来自G、A、T/U或C的任意核苷酸。
抑制或阻止NOI的翻译应理解为，与在相同的时间点、在不存在本发明的核苷酸序列的情况下表达的量相比，在病毒载体生产期间翻译的NOI产物(例如蛋白质)的量的改变。这种翻译的改变导致相应地抑制或阻止由NOI编码的蛋白质的表达。
在一个实施方案中，本发明的核苷酸序列能够与TRAP相互作用，从而在病毒载体生产细胞中抑制或阻止目的核苷酸的翻译。
在载体生产过程中的任意给定时间，NOI的翻译可以降低至在不存在本发明的核苷酸序列的情况下，在载体生产过程中相同时间点翻译量的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％。
在载体生产过程中的任意给定时间，NOI的翻译可以降低至低于在不存在本发明的核苷酸序列的情况下，在载体生产过程中相同时间点翻译量的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％。
在本发明的上下文中，在载体生产过程中的任意给定时间，NOI的翻译可以降低至在存在包含非重叠Kozak和tbs序列的核酸序列(与本发明的核苷酸序列相反)的情况下、在载体生产过程中相同时间点翻译量的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％。
在本发明的上下文中，在载体生产过程中的任意给定时间，NOI的翻译可以降低至低于在存在包含非重叠Kozak和tbs序列的核酸序列(与本发明的核苷酸序列相反)的情况下、在载体生产过程中相同时间点翻译量的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％。
阻止NOI的翻译应理解为将翻译量基本上降为零。
在载体生产过程中的任意给定时间，由NOI的蛋白质表达可以降低至在不存在本发明的核苷酸序列的情况下，载体生产过程中相同时间点表达量的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％。
在载体生产过程中的任意给定时间，由NOI的蛋白质表达可以降低至低于在不存在本发明的核苷酸序列的情况下，载体生产过程中相同时间点表达量的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％。
在本发明的上下文中，在载体生产过程中的任意给定时间，由NOI的蛋白质表达可以降低至在存在包含非重叠Kozak和tbs序列的核酸序列(与本发明的核苷酸序列相反)的情况下、在载体生产过程中相同时间点表达量的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％。
在本发明的上下文中，在载体生产过程中的任意给定时间，由NOI的蛋白质表达可以降低至低于在存在包含非重叠Kozak和tbs序列的核酸序列(与本发明的核苷酸序列相反)的情况下、在载体生产过程中相同时间点表达量的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％。
阻止由NOI的蛋白质表达应理解为将蛋白质的表达量基本上降为零。
用于NOI翻译的分析和/或定量的方法在本领域中是公知的。
来自裂解细胞的蛋白质产物可使用如SDS-PAGE分析并通过考马斯或银染色可视化等方法来进行分析。可选地，蛋白质产物可利用与蛋白质产物结合的抗体探针用免疫印迹或酶联免疫吸附测定(ELISA)进行分析。在完整细胞中的蛋白质产物可通过免疫荧光进行分析。
在一些实施方案中，转录起始位点/启动子末端与tbs或其部分的起点之间的距离小于34个核苷酸。
在一些实施方案中，转录起始位点/启动子末端与tbs或其部分的起点之间的距离小于13个核苷酸。
在一个实施方案中，核苷酸序列是载体转基因表达盒。
在一个实施方案中，本发明的核酸序列进一步包含启动子。通常，启动子的转录会产生在所得的mRNA转录物中编码的5'UTR。启动子可以是本领域已知的任何启动子，并且适用于控制目的核苷酸的表达。例如，启动子可以是EF1α、EFS、CMV或CAG。
在一个优选的实施方案中，如本文所述的重叠tbs和Kozak序列位于启动子的5'UTR内，其中5'UTR可以包含来自相关启动子的天然序列，或更优选地，所述5'UTR由本文所述的5'UTR序列组成。
在一个优选的实施方案中，包含如本文所述的tbs和Kozak序列之间的压缩/重叠MCS的序列位于所述5'UTR内。
如本文所述的重叠tbs和Kozak序列或包含如本文所述的tbs和Kozak序列之间的压缩/重叠MCS的序列可以位于所述5'UTR的3'端。
优选地，5'UTR包含以下序列之一：SEQ ID NO:29-37、45-58、69-92和108-116。更优选地，5'UTR包含SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:108。甚至更优选地，5'UTR包含SEQ ID NO:29。
启动子-5'UTR区域可以包含内含子。所述内含子可以是天然内含子或异源内含子。例如，启动子可以是EF1α或CAG。
启动子可以是通常用于没有内含子的病毒载体基因组的启动子，例如CMV。
在一个优选的实施方案中，启动子-5'UTR区域已被工程改造为包含含有异源内含子的人工5'UTR。因此，启动子-5'UTR区域已被设计为包含异源外显子-内含子-外显子序列，其中在mRNA转录物中编码的成熟5'UTR是由内含子的剪接产生的。可以使用本领域已知的方法对启动子-5'UTR序列进行工程化改造。例如，可以如本文所述对启动子进行工程改造。
优选地，来自其成熟mRNA的转基因蛋白的表达(由内含子或异源内含子的剪接产生)被TRAP有效地抑制。适宜地，内含子或异源内含子可以是根据SEQ ID NO:122的EF1α内含子序列。
内含子或异源内含子可以位于如本文所述的重叠tbs和Kozak序列的上游，或位于如本文所述的在tbs和Kozak序列之间包含MCS的序列的上游，即5'。
5'UTR可包含以下序列(鸡β-肌动蛋白/兔β-珠蛋白嵌合5'UTR-内含子，外显子序列为粗体(剪接在一起成为5'UTR前导序列))：
5'UTR可以包含如SEQ ID NO:121所示的序列。
5'UTR可以包含如SEQ ID NO:122所示的序列。
在一个实施方案中，启动子包含如SEQ ID NO:123所示的序列。
在一个实施方案中，启动子包含如SEQ ID NO:124所示的序列。
在一个实施方案中，启动子包含如SEQ ID NO:117所示的序列。
在一个实施方案中，启动子包含如SEQ ID NO:118所示的序列。
对应于SEQ ID NO:117的剪接序列在SEQ ID NO:119中列出。
对应于SEQ ID NO:118的剪接序列在SEQ ID NO:120中列出。
改进的前导序列
在将TRIP系统应用于不同的启动子(包含不同长度和组成的不同天然5'UTR)时，希望能够在启动子-UTR环境中简单地应用tbs序列，以通过TRAP提供有效的抑制，同时在没有TRAP的情况下也能保持良好的表达水平。从这项工作开始，当tbs插入各种组成型启动子的天然UTR中时，不知道由TRAP-tbs介导的可实现的抑制水平是多少。理想情况下，在改变选择的启动子时能够提供单个保守的5'UTR前导序列以及tbs是有利的，以避免可能由天然5'UTR序列指导的抑制水平的任何潜在变化。令人惊讶的是，与包含天然前导序列的5'UTR前导序列相比，发现EF1α启动子(SEQ ID NO:101)的第一个外显子通过TRAP提供了持续良好水平的转基因抑制，并且在没有TRAP的情况下，该前导序列也提供了良好水平的转基因表达。
在一些实施方案中，核苷酸序列包含tbs或其部分上游的5'前导序列。所述前导序列可以紧邻TRAP结合位点或其部分的上游，即可能没有其他序列将前导序列和TRAP结合位点或其部分隔开。如果该5'前导序列来自剪接事件，则从外显子/外显子接头到tbs的序列应保持最小长度(优选≤12nt)。前导序列可以包含来自非编码EF1α外显子1区的序列。在一个优选的实施方案中，前导序列包含如SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102或SEQ ID NO:93中定义的序列。
示例性核苷酸序列
本发明的示例性核苷酸序列如下所示。
SEQ ID NO:172-示例性核苷酸序列1，包含L33改进的前导序列，最佳(重叠)tbs([KAGNN]8)-Kozak接头
Figure BDA0003843317840000961
SEQ ID NO:173-示例性核苷酸序列2，包含L33改进的前导序列，最佳(重叠)tbs([KAGNN]11)-Kozak接头
Figure BDA0003843317840000962
SEQ ID NO:174-示例性核苷酸序列3，包含L12改进的前导序列，最佳(重叠)tbs([KAGNN]11-Kozak
Figure BDA0003843317840000963
SEQ ID NO:175-用于含有内含子的5'UTR的示例性核苷酸序列4，产生包含L33的剪接前导序列，最佳(重叠)tbs([KAGNN]11)-Kozak接头
Figure BDA0003843317840000971
SEQ ID NO:176-示例性核苷酸序列5，包含改进的间隔子，最佳(重叠)tbs([KAGNN]8)-Kozak接头
Figure BDA0003843317840000972
SEQ ID NO:177-示例性核苷酸序列6，包含L33改进的前导序列tbs([KAGNN]11)-MCS-Kozak
Figure BDA0003843317840000973
SEQ ID NO:178-示例性核苷酸序列7，包含改进的间隔子，tbs([KAGNN]11)-MCS-Kozak
Figure BDA0003843317840000974
在一个实施方案中，核苷酸序列包含SEQ ID NO:172-178中的任一者。
在一个实施方案中，核苷酸序列包括：
(a)(i)SEQ ID NO:101或102；和/或
(ii)SEQ ID NO:151-157中的任一者；
(b)SEQ ID NO:127-130、132-136、140、141中的任一者；和
(c)(i)SEQ ID NO:142-149中的任一者，优选SEQ ID NO:147-149中的任一者；或者
(ii)SEQ ID NO:158-171中的任一者，优选SEQ ID NO:165-171中的任一者。
在一个实施方案中，核苷酸序列包括：
(a)SEQ ID NO:101或102；
(b)SEQ ID NO:127-130、133-136、140、141中的任一者；和
(c)SEQ ID NO:142-149中的任一者，优选SEQ ID NO:147-149中的任一者。
在一个实施方案中，核苷酸序列包括：
(a)SEQ ID NO:151-157中的任一者；
(b)SEQ ID NO:127-130、133-136、140、141中的任一者；和
(c)SEQ ID NO:142-149中的任一者，优选SEQ ID NO:147-149中的任一者。
在一个实施方案中，核苷酸序列包括：
(a)SEQ ID NO:101或102；
(b)SEQ ID NO:127-130、132-136、140、141中的任一者；和
(c)SEQ ID NO:157-171中的任一者，优选SEQ ID NO:165-171中的任一者。
在一个实施方案中，核苷酸序列包括：
(a)SEQ ID NO:151-157中的任一者；
(b)SEQ ID NO:127-130、132-136、140、141中的任一者；和
(c)SEQ ID NO:151-157中的任一者，优选SEQ ID NO:165-171中的任一者。
除非另有说明，本发明的实施将使用化学、分子生物学、微生物学免疫学的常规技术，这些技术在本领域技术人员的能力范围内。所述技术在文献中解释。参见，例如，“J.Sambrook,E.F.Fritsch,and T.Maniatis(1989)Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Second Edition,Books 1-3,Cold Spring Harbor Laboratory Press”；“Ausubel,F.M.et al.(1995and periodic supplements)Current Protocols inMolecular Biology,Ch.9,13,and 16,John Wiley&Sons,New York,NY”；“B.Roe,J.Crabtree,and A.Kahn(1996)DNA Isolation and Sequencing:Essential Techniques,John Wiley&Sons”；“J.M.Polak and James O'D.McGee(1990)In Situ Hybridization:Principles and Practice；Oxford University Press”；“M.J.Gait(ed.)(1984)Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,IRL Press”；和“D.M.J.Lilley andJ.E.Dahlberg(1992)Methods of Enzymology:DNA Structure Part A:Synthesis andPhysical Analysis of DNA Methods in Enzymology,Academic Press”。这些文献的全部内容以引用方式并入本文。
本公开不受本文公开的示例性方法和材料的限制，与本文描述的方法和材料相似或等效的任何方法和材料可以用于本公开的实施方案的实践或测试中。数字范围包括定义范围的数字。除非另有说明，否则任何核酸序列均以5'到3'方向从左到右书写；氨基酸序列分别以氨基到羧基的方向从左到右书写。
应当理解，在提供数值范围的情况下，除非上下文另有明确说明，否则该区间也具体公开了该范围的上限和下限之间的各中间值，直至下限单位的十分之一。任何规定值或规定范围内的中间值与该规定范围内的任何其他规定或中间值之间的每个较小范围都包含在本公开的内容中。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括或排除在该范围内，并且在较小范围内包括任何一个限值或包括或不包括两个限值的各个范围也都包括在在本公开内容内，但受限于所述范围内的任何明确排除的限值。在规定范围包括限值之一或两者的情况下，排除那些包括的限值之一或两者的范围也包括在本公开中。
必须注意，除非上下文另有明确规定，否则如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指代物。
如本文所用的术语“包含(comprising、comprises、comprised of)”、与“包括(including、includes)”或“含有(containing、contains)”同义，并且是包含式的或开放式的，因此不排除额外的、非列举的构件、元件或方法步骤。术语“包含(comprising、comprises、comprised of)”还包括术语“由……组成(consisting of)”。
提供本文讨论的出版物仅为它们在本申请的申请日之前的公开内容。本文中的任何内容均不应被解释为承认此类出版物构成所附权利要求的现有技术。
现在将通过实施例进一步描述本发明，这些实施例旨在帮助本领域的普通技术人员实施本发明而不以任何方式限制本发明的范围。
实施例
一般分子/细胞生物学技术和试验
经修饰的U1 snRNA表达构建体
用于经修饰的U1 snRNA的基于DNA的表达构建体包含驱动RNA转录和终止的内源性U1 snRNA基因中的保守序列，在以下256U1(也称为U1_256)snRNA的非限制性实例中突出显示：
Figure BDA0003843317840001001
图例：仅大写＝U1 PolII启动子(nt1-392)；小写＝重新定向区域(nt393-409)；小写粗体＝重新定向序列[在本例中针对野生型HIV-1包装信号的nt256-270](nt395-409)；大写斜体＝主要U1 snRNA序列[三叶草叶](nt410-562)；大写下划线＝转录终止区域(nt563-652)
下表列出了研究中使用的初始经修饰的U1 snRNA和对照的小结，指出了新的退火序列和靶位点序列(序列以5'到3'方向表示)。
表I.描述测试用经修饰的U1 snRNA和对照U1 snRNA中的靶退火序列(与靶序列互补的异源序列)，以及在初始研究中使用的它们的靶序列的序列列表。核苷酸以DNA形式呈现，因为它们将在“重新定向区域”的各自表达盒中进行编码。(AT)基序存在于所有初始构建体中，在每种情况下形成U1 snRNA分子的前两个核苷酸。靶序列号指的是HIV-1的NL4-3(GenBank：M19921.2)或HXB2(GenBank：K03455.1)菌株中指出的靶，因为本研究中的慢病毒载体基因组包含由这两个高度保守的菌株组成的混合包装信号(本研究中使用的包装序列与GenBank：MH782475.1中的载体序列最相似)。
Figure BDA0003843317840001011
Figure BDA0003843317840001021
*相对于载体基因组RNA序列编号
**小写靶序列用于(HXB2)，下划线靶序列是gag ORF(U1 376)中的AA>CGCG移码。
贴壁细胞培养、转染和慢病毒载体生产
使HEK293T细胞保持在37℃、5％CO2条件下的完全培养基(Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)(Sigma)，该培养基补充有10％热灭活(FBS)(Gibco)、2mM L-谷氨酰胺(Sigma)和1％非必需氨基酸(NEAA)(Sigma))中。
在以下条件下在10cm培养皿中进行贴壁模式的HIV-1载体的标准规模生产(在以其他规格进行时，所有条件均按面积缩放)：HEK293T细胞以3.5×105细胞/mL接种在10mL完全培养基中，并且约24小时后，使用以下质粒/10cm板的质量比转染细胞：4.5μg基因组、1.4μg Gag-Pol、1.1μg Rev、0.7μg VSV-G以及0.01μg和2μg之间的经修饰的snRNA质粒。
根据制造商的方案(Life Technologies)，通过在Opti-MEM中将DNA与Lipofectamine 2000CD混合来介导转染。约18小时后，添加丁酸钠(Sigma)至终浓度为10mM，保持5至6小时，然后使用10ml新鲜无血清培养基替换转染培养基。通常，20至24小时后收获载体上清液，然后过滤(0.22μm)并在-20/-80℃冷冻。作为核酸酶处理的阳性对照，通常在过滤前1小时将
Figure BDA0003843317840001031
以5U/mL添加到收获物中。
悬浮细胞培养、转染和慢病毒载体生产
使HEK293T.1-65s悬浮细胞在37℃、5％CO2条件下于Freestyle+0.1％CLC(Gibco)中在振荡培养箱(25mm轨道设置为190RPM)中生长。所有使用悬浮液的载体生产均在24孔板(1mL体积，在振动平台上)、25mL摇瓶或生物反应器(≤5L)中进行。HEK293Ts细胞以8×105个细胞/ml接种在无血清培养基中，并在整个载体生产过程中在37℃、5％CO2中振荡培养。接种后约24小时，使用以下质粒质量/转染时有效最终培养体积之比来转染细胞：0.95μg/mL基因组、0.1μg/mL Gag-Pol、0.6μg/mL Rev、0.7μg/mL VSV-G，以及0.01μg/mL至0.2μg/mL之间的经修饰的U1 snRNA质粒。
根据制造商的方案(Life Technologies)，通过在Opti-MEM中将DNA与Lipofectamine 2000CD混合来介导转染。约18小时后，添加丁酸钠(Sigma)至终浓度为10mM。通常，20至24小时后收获载体上清液，然后过滤(0.22μm)并在-20/-80℃冷冻。作为核酸酶处理的阳性对照，通常在过滤前1小时将
Figure BDA0003843317840001032
以5U/mL添加到收获物中。
慢病毒载体滴定试验
对于通过含有GFP标记的盒进行慢病毒载体滴定，HEK293T细胞以1.2×104个细胞/孔接种在96孔板中。使用编码GFP的病毒载体在含有8mg/ml聚凝胺和1x青霉素链霉素的完全培养基中转导细胞约5至6小时，然后添加新鲜培养基。将转导的细胞在37℃、5％CO2中培养2天。然后使用Attune-NxT(Thermofisher)为流式细胞术准备培养物。测定GFP表达百分率，并使用转导时2×104个细胞的预测细胞计数(基于典型的生长速率)、载体样品的稀释倍数、阳性GFP群体百分率和转导时的总体积计算载体滴度。
对于通过整合滴度进行慢病毒载体滴定，在8μg/mL聚凝胺存在下，使用0.5mL体积的纯载体上清液至1:5稀释的载体上清液以12孔规模转导1×105HEK293T细胞。将培养物传代10天(每2至3天1:5分裂)，然后从1×106细胞团中提取宿主DNA。使用设置为HIV包装信号(ψ)和RRP1的FAM引物/探针进行双重定量PCR，并使用以下因素计算载体滴度(TU/mL)：转导体积、载体稀释度、每个反应检测到的RRP1标准化的HIV-1ψ拷贝。
LV转导细胞的转录通读(“读入”)分析
所示的HIV载体是通过在24孔板规模、存在或不存在256_U1snRNA的情况下瞬时转染悬浮模式1.65s细胞产生的。两天后收集上清液，然后使用流式细胞术在HEK293T细胞上通过GFP表达进行滴定。然后相应地使用GFP滴度以感染复数(MOI)1转导4.5x104HEK293T或92BR细胞(驴原代成纤维细胞)。转导的细胞在收获前10天内传代3次并分成2等份；一份经处理用于总RNA提取，另一份经处理用于基因组DNA提取。将200ng(293T)或80ng(92BR)的总RNA用DNAse I处理，并使用SSIV VILO RT系统(Life Technologies)进行RT-PCR。将cDNA稀释至1ng/μl，并使用针对HIV Psi和细胞GAPDH的5μl引物组进行SYBR qPCR。Delta Ct方法用于将HIV Psi拷贝数标准化为GAPDH拷贝数，以生成样本之间的表达评分。使用Qiacube提取系统(Qiagen)制备基因组DNA提取物，并使用qPCR对5μl洗脱的DNA进行HIV载体整合分析。将HIV Psi拷贝数标准化为细胞靶RPPH1，以计算每个细胞的整合载体基因组的平均值。然后将样品的HIV RNA表达评分标准化为每个细胞的整合载体拷贝数，以说明转导效率。这个最终值是相对的HIV Psi RNA表达评分，对于每个测试的细胞系，所有值都标准化为在没有256_U1 snRNA的情况下制作的标准载体(完整的MSD和crSD)。
实施例1-来自MSD的混杂剪接、MSD-2KO慢病毒载体滴度的降低以及通过重新定向的U1 snRNA的滴度恢复/提高。
慢病毒载体基因组的一般结构在所有的三代载体系统中都保持一致(Lentiviralvectors:basic to translational.Toshie SAKUMA,Michael A.BARRY and YasuhiroIKEDA.Biochem.J.(2012)443,603–618)，保留了HIV-1前病毒的5'区域，其中包含包装序列和转基因盒上游RRE的位置，但在其他方面与后代不同，变得独立于tat，在3'LTR中自失活，并结合使用cppt和wPRE。在5'包装序列的工程改造中明显缺乏实例可能是由于其复杂的结构和其中编码的密集信息对于HIV-1复制的许多方面是必需的：转录、剪接平衡、GagPol的翻译、基因组二聚化、组装、逆转录和整合。在这个复杂区域内，主要剪接供体(MSD)嵌入介于SL1(二聚化环)和SL3(与Gag结合)之间的茎环2(SL2)区域。据认为，在慢病毒载体基因组中，将RRE序列(和在包膜区域内相关的剪接受体7(sa7))重新定位到紧邻包装区域的下游，从而在不存在rev的情况下为剪接受体(sa7)“提供”MSD。假设在慢病毒载体生产期间，rev的供应导致rev与RRE结合并抑制MSD对sa7的剪接，并因此产生未剪接的全长慢病毒载体基因组vRNA(图2A)。然而，本发明人(图4Bii)和其他人(例如Cui et al.(1999),J.Virol.,73:6171-6176)表明，来自MSD对转基因序列内的剪接受体位点的异常剪接可能是大量的，从而产生可用于包装成载体病毒颗粒的相对合适水平的未剪接vRNA(相对于总量-参见图2B)，在一些情况下低于5％。
由于大量载体基因组质粒递送至细胞，因此在瞬时转染方法中生产的慢病毒载体滴度中，并不总是直接观察到产生用于包装的vRNA的低效率；标准第3代载体的滴度通常可以高于1x107TU/mL，即使发生这种类型的异常剪接也是如此。然而，本发明人预计，为了开发稳定的生产者细胞系，其中可能存在的整合载体基因组盒的数量少得多，异常剪接的问题实际上可能会更加严重。实际上，本发明人通常发现基因组组分在稳定的生产者克隆中受到限制，因此假设MSD活性可能对这种限制有很大贡献。
将MSD产生的异常剪接的mRNA生成到转基因盒中还有一个可能不太明显的后果：在生产过程中转基因盒的(增加的)表达。此前，开发了TRiP系统以阻遏慢病毒载体生产过程中的转基因表达(描述于WO 2015/092440)，这使得载体滴度的恢复与特定转基因蛋白对载体生产的负面影响成比例相关。本发明人已发现有效的异常剪接(例如在包含EF1a驱动盒的标准慢病毒载体中，参见图4和图12)产生通常编码转基因的mRNA。不希望受理论束缚，对于EF1a驱动的盒，MSD剪接强EF1a剪接受体，但对于其他启动子-UTR序列，MSD“选择”较弱的隐蔽剪接受体，即使存在rev亦是如此。MSD似乎“越过”RRE-sa7序列，而偏向于载体基因组的更中央的其他位点(即，在转基因启动子区域中)。这可能是HIV-1的5'包装区域的“残留”特性，因为在野生型HIV-1中，MSD通常剪接位于基因组中央和3'端的剪接受体。MSD可能在载体序列下游中的许多位置异常剪接，但只有通过无义介导的衰变规则的mRNA(即，它们似乎是合理的mRNA，因为它们编码蛋白[转基因蛋白])被运输到细胞质(和/或在细胞质中稳定)，然后在细胞质中被翻译。为了维持对编码转基因的mRNA的阻遏给TRiP系统带来了额外的负担，从而导致对更大的mRNA池的阻遏性控制较弱(参见图12)。此外，组织特异性启动子的使用(部分是为了避免慢病毒载体生产过程中的转基因表达)可能会被这种异常剪接机制带来的编码转基因的可翻译mRNA的细胞质外观“扰乱”。本质上，将由驱动载体基因组vRNA表达的(通常是强大的)组成型启动子驱动转基因表达。
因此，产生MSD突变的慢病毒载体的原因有很多，并且事实上，其他人已经尝试在tat独立型慢病毒载体中这样做，但没有成功。本发明人已经发现，HIV-1tat-独立型第三代载体中MSD的突变激活了SL2内相邻的隐蔽剪接供体位点，从而引起显著水平的剪接。为此，本发明人在MSD和附近的隐蔽剪接供体(crSD)中都采用了突变(参见图10)，并将这种修饰称为“MSD-2KO”或“MSD2KO”或“MSD的功能修饰”。如图4所示，这种双突变在去除慢病毒载体生产过程中SL2的剪接区(包括MSD和crSD)对强EF1a剪接受体的异常剪接方面极为有效。图中还示出了包含三个不同的启动子-GFP转基因盒的MSD-2KO慢病毒载体基因组导致载体滴度降低(图3)，这与其他人报道的类似。在图4Bi中，还证明了以反式提供HIV-1tat能够挽救观察到的MSD-2KO慢病毒载体基因组的滴度降低，尽管“异常”剪接产物(来自SL4中的次要隐蔽剪接供体)的量增加(图4Bii)。重要的是，图中示出了重新定向到载体包装信号的不同区域的经修饰的U1 snRNA增加了MSD-2KO慢病毒载体基因组滴度，并且没有增加次要剪接产物(图4)。
实施例2-MSD突变的慢病毒载体滴度的提高不是由于载体基因组盒内5'polyA位点的抑制
为了评估本发明是否起到抑制5'polyA位点的作用，在包含EF1a或CMV驱动的GFP转基因盒的MSD-2KO慢病毒载体基因组中引入了5'polyA位点的功能性突变(图6)；图6A示出了“pAm1”polyA突变，图中显示出完全去除了聚腺苷酸化活性。令人惊讶的是，本发明人发现5'polyA信号的突变仅部分增加了含有EF1a-GFP的MSD-2KO慢病毒载体基因组的滴度，而对CMV-GFP MSD2KO慢病毒载体基因组几乎没有影响，这似乎与MSD-2KO突变的减弱效果程度相称(对于含有EF1a的基因组，MSD2KO突变不太明显)。重要的是，本实验中305U1分子的供应增加了标准慢病毒载体基因组(其中内源性U1 snRNA可能能够完全抑制任何潜在残留的5'polyA活性)和MSD2KO/pAm1慢病毒载体基因组的滴度，后者没有可能具有5'polyA活性。这提供了令人信服的证据，证明所提供的用于恢复MSD突变的慢病毒载体的滴度的经修饰的U1 snRNA在转录后的步骤中发生了作用，这在先前未曾报道过。
本发明人随后试图突变305U1和256U1的70K和U1A结合环，以评估这些突变是否影响观察到的MSD2KO慢病毒载体基因组的滴度的增加。图7表明，当在生产过程中共表达时，经修饰的U1 snRNA中SL1或SL2的功能性突变对这些分子增强MSD-2KO慢病毒载体滴度的能力没有影响；只有Sm蛋白结合突变阻止了这种活性。这表明在抑制polyA活性的过程中，重新定向的U1 snRNA的之前必要的70K结合特性在本发明中并不重要，并提供了进一步的证据，证明用于增加MSD突变的慢病毒载体滴度的经修饰的U1 snRNA正在通过一种新机制发挥作用。
为了评估当应用于MSD-2KO慢病毒载体时，与标准慢病毒载体相比，经修饰的U1snRNA介导的滴度增加是否在其“优选的”靶位点方面有所不同，筛选了一组靶向沿着MSD-2KO慢病毒载体基因组的5'区域的不同位点(参见表I)的经修饰的U1 snRNA(图9)。该筛选表明，靶向包装区域是优选的(SL1-3)，可能在SL3内有一个“热点”。筛选是用经修饰的U1snRNA进行的，该经修饰的U1snRNA具有15个与靶位点互补的核苷酸(或如所述的9个核苷酸)，正如我们之前对标准慢病毒载体所证明的那样，当使用大于9个核苷酸的互补长度时，滴度的增加可能更加明显。事实上，我们表明对于MSD-2KO慢病毒载体，使用经修饰的U1snRNA(靶向“305”序列)观察到的滴度提高仅可在7个核苷酸的互补性下观察到，但在优选使用中，使用10到15个核苷酸的互补性会更好，因为滴度提高有所增加(图8)，并且还因为这会使经修饰的U1 snRNA的任何可能的“脱靶”效应最小化。
实施例3-经修饰的U1 snRNA对MSD突变的慢病毒载体滴度的提高不依赖于剪接供体突变的类型
图10A展示了对MSD突变的慢病毒载体基因组包装区域的“MSD-2KO”变体的SL2环的遗传修饰，该修饰使MSD和位于下游的隐蔽剪接供体这两者发生突变(本文中的许多非限制性的实例中已经使用了MSD-2KO变体)。为了评估使用经修饰的U1 snRNA提高滴度的效果是否无论如何都取决于对MSD-2KO变体所做的特定变化，我们制作了三种其他的剪接供体区域突变体：[1]“MSD2KOv2”，其在MSD和隐蔽供体序列内还引入了两个特定改变；[2]“MSD-2KOm5”，其用人工茎环代替整个SL2环；以及[3]完整的SL2删除，从而去除了整个剪接供体区域(也称为剪接区域)。然后我们在+/-经修饰的U1 snRNA(256U1)的HEK293T细胞中生产标准的或MSD突变的慢病毒载体变体(包含EFS-GFP表达盒)，并滴定载体上清液(图10B)。结果表明，与标准载体相比，所有四种MSD突变的慢病毒载体变体都减弱了，但所有四种MSD突变的慢病毒载体都可以通过使用慢病毒载体生产期间提供的经修饰的U1 snRNA而加强，从而表明由经修饰的U1 snRNA的剪接供体区域突变没有特定的序列依赖性。有趣的是，MSD-2KOm5变体的减弱程度最低，并且当在256U1分子存在的情况下生产时，输出滴度的增加最大，这与所采用的内部启动子的同一性无关(比较了EFS、EF1a、CMV和人PGK启动子)。
实施例4-在慢病毒载体基因组质粒DNA骨架内顺式编码的经修饰的U1 snRNA盒的用途。
本文之前的实施例已经公开了在用慢病毒载体组分质粒和经修饰的U1 snRNA编码质粒瞬时共转染HEK293T细胞中，在慢病毒载体生产过程中使用反式的经修饰的U1snRNA分子。为了评估MSD突变的慢病毒载体基因组盒和经修饰的U1 snRNA盒是否可以在同一质粒DNA分子内适当编码，克隆了三种变体构建体(图11A)。对MSD突变的慢病毒载体基因组盒(MSD-2KO变体)进行修饰，使得相对于慢病毒载体基因组盒和/或功能性质粒骨架序列，256U1表达盒以三种不同的构造插入。这些“顺式”版本质粒用于在HEK293T细胞中制造MSD突变的慢病毒载体，并与“反式”模式进行比较，其中经修饰的U1 snRNA质粒与未经修饰的MSD突变的慢病毒载体基因组共转染(图11B)。结果表明，这些“顺式”版本的质粒的滴度与共转染中提供的未经修饰的MSD 2KO慢病毒载体基因组+256U1相似。
实施例5-使用稳定表达经修饰的U1 snRNA的细胞系改善标准慢病毒载体或MSD突变的慢病毒载体的生产
将305U1表达盒稳定地整合到HEK293T细胞中，并且通过瞬时转染+/-额外305U1质粒DNA生产标准慢病毒载体或MSD-2KO慢病毒载体。稳定细胞的成功产生首次揭示了经修饰的U1 snRNA可以在细胞内进行内源性表达而没有细胞毒性作用，从而表明经修饰的U1snRNA不会滴定出(titrate-out)参与U1 snRNA合成或剪接体的细胞因子，或者没有发生脱靶或脱靶效应不影响正常细胞活性。慢病毒载体的输出滴度表明，对于标准慢病毒载体和MSD-2KO慢病毒载体两者，在经修饰的U1 snRNA的稳定供应下，由经修饰的U1 snRNA介导的滴度增加都是可能的(图13)。这将使经修饰的U1 snRNA能够轻松整合到慢病毒载体包装和生产者细胞系中。
实施例6-MSD突变的慢病毒载体在生产过程中产生较少的转基因蛋白
在慢病毒载体生产过程中去除异常剪接的另一个优点是减少导致转基因蛋白生产的编码转基因的mRNA的数量。转基因表达可以显著影响慢病毒载体的生产，这使得我们之前开发了TRiP系统来抑制病毒载体生产过程中的转基因翻译(描述于WO 2015/092440)。简言之，细菌蛋白“TRAP”在载体生产过程中共表达，并与插入5'UTR内的转基因ORF上游的“TRAP结合序列”(tbs)结合，从而阻断核糖体扫描。
在这项工作的过程中，我们意外地发现，由于从SL2的主要供体剪接区域到内部剪接受体位点的剪接，驱动载体基因组盒的“外部”(CMV)启动子有效地产生了编码转基因的mRNA。这种情况发生的程度取决于cppt和转基因ORF之间的内部序列(即，启动子-5'UTR序列)。在转基因盒中使用EF1a启动子(包含非常强的剪接受体)，导致超过95％的来自外部启动子的总转录物中出现来自MSD的异常剪接(参见图2)。通过比较标准的或MSD-2KO慢病毒载体生产培养物中的总GFP表达(图12B)，我们示出了在生产过程中表达的转基因蛋白中高达80％来自异常剪接产物。我们发现将MSD-2KO基因型与TRiP系统组合加强了所产生的转基因蛋白的减少。
实施例7：优化tbs-Kozak接头
设计了四个tbs-Kozak变体(参见表II-组I)并克隆到GFP报告基因构建体中，如图14A所示。设计变体0、1和2使得扩展的Kozak序列(符合共有序列GNNRVVATG)与最后的两个tbs重复序列重叠，而变体3仅与最后的tbs重复序列重叠。这些变体，连同其中Kozak序列位于最终tbs重复序列下游3个核苷酸(即不重叠)的原始报告基因，被单独共转染到HEK293T细胞+/-TRAP表达质粒中，并在转染后两天通过流式细胞术测量GFP表达。GFP表达评分(％GFP阳性细胞x MFI)由流式细胞仪数据生成并进行绘制(图14B)。
这些tbs-Kozak变体中的两个与scAAV2载体基因组表达盒内的两个不同启动子(EFS和huPGK)一起进行了测试，并与不具有重叠tbs/Kozak序列的包含tbs的盒进行了比较。这些GFP报告载体基因组质粒单独共转染到HEK293T细胞+/-TRAP表达质粒中，转染后两天通过流式细胞术测定GFP表达。GFP表达评分(％GFP阳性细胞x MFI)由流式细胞仪数据生成并进行绘制(图15)。非重叠tbs/Kozak变体(在tbs和Kozak之间包含HpaI位点的原始变体和第二变体)能够具有50到100倍的抑制，而新的tbs-Kozak变体(tbs_V0和tbs_V3)的抑制至少是该值的10倍(500到3500倍)。当在EFS或huPGK启动子盒中使用L33或L12改进的前导序列时，这些tbs-Kozak变体也有类似的表现。重要的是，新变体的“ON”水平(无TRAP)与非重叠tbs/Kozak变体相似，表明新变体中的Kozak序列可有效指导高效翻译。
数据表明所有tbs-Kozak变体都能够具有相似的“ON”转基因表达水平，表明Kozak序列指导有效水平的翻译起始。与原始报告基因配置相比，TRAP对变体1的抑制较差(在存在TRAP的情况下GFP表达水平变为10倍)。然而，令人惊讶的是，与原始配置相比，变体0、2和3被抑制到更低的水平。
表II：最佳3'tbs-Kozak接头序列
Figure BDA0003843317840001111
[组I]变体Kozak序列设计为与上游tbs序列的3'端重叠。这样放置扩展的Kozak序列，使得将主要转基因ATG起始密码子放置在tbs的3'末端KAGNN重复序列下游9个核苷酸处，即没有重叠。为了将主要转基因ATG起始密码子定位在更靠近上游tbs的位置，设计了四种变体，以保持3'末端tbs重复序列的共有KAGNN重复序列，同时还保持有效的扩展Kozak共有序列(本文定义为GNNRVVATG)。KAGNN重复序列在括号内，Kozak序列为粗体大写字母。
实施例8：将改进的重叠tbs-Kozak变体引入全长、含内含子的EF1a启动子中。
前面的实施例表明，与非重叠tbs/Kozak变体相比，重叠tbs-Kozak变体改善了抑制，这在EFS启动子(通过去除其嵌入的内含子而截短的EF1a启动子)的情况下得到了证明。为了评估tbs-Kozak变体在全长EF1a启动子(即，后剪接内含子)内是否“表现”相似，将三个tbs-Kozak变体(0、2和3)克隆到含有EF1a启动子的GFP报告基因盒中(图16A)。剪接后，5'UTR包含外显子1(即L33改进的前导序列)、包含外显子2的第一个核苷酸的12nt短序列、然后是tbs-Kozak变体序列(SEQ ID NO:106)。这些GFP报告基因质粒，连同不含tbs的报告基因，单独共转染到悬浮液(无血清HEK293T细胞+/-TRAP表达质粒)中，转染后两天通过流式细胞术测定GFP表达。GFP表达评分由流式细胞仪数据生成并进行绘制(％GFP阳性细胞xMFI)(图16B)。此外，将这些含有tbs的GFP表达盒克隆到基于HIV-1的慢病毒载体基因组质粒中(其中MSD和crSD被失活，见下文)，并在无血清HEK293T细胞悬浮液中进行了类似的实验，产生GFP表达评分(图16C)。数据显示，与使用的非重叠tbs/Kozak变体相比，重叠tbs-Kozak变体确实能够改善转基因抑制。
实施例9：tbs的3'末端KAGNN重复序列逐渐封堵更多的核心Kozak序列，导致由TRAP介导的转基因抑制作用逐渐增强。
在实施例7中，产生了有限数量的重叠tbs-Kozak变体，并在不含内含子的启动子EFS和huPGK的情况下进行了测试。然后还在实施例5中包含内含子的全长EF1a启动子中测试了这些变体，表明可以通过使用重叠tbs-Kozak变体来抑制这种难以抑制的启动子。
为了进一步举例说明通过在tbs的3'末端KAGNN重复序列中“隐藏”核心Kozak序列来改善TRAP抑制的原理，设计了一组新变体(见表IV)。这些是基于三个“重叠组”编码的所有可能的变体；KAGatg(其中KAGNN共有序列与核心Kozak的ATG尽可能重叠，即与核心Kozak的ATG的前两个核苷酸重叠)，KAGNatg(其中KAGNN共有序列与核心Kozak的ATG的第一个核苷酸重叠)和KAGNNatg(其中KAGNN共有序列不与核心Kozak的ATG重叠)。(实施例3和5中的初始变体tbs-kzkV0、tbs-kzkV1和tbs-kzkV2落入这些定义的组内)。这些组中产生“GT”二核苷酸的任何变体都没有产生/评估，因为这些变体可能会产生隐蔽的剪接供体位点的不希望的可能性。
表III：为进一步举例说明而生成的重叠tbs-Kozak变体
生成了代表与KAGatg或KAGNatg或KAGNNatg的共有序列有关的“重叠组”的所有可能变体，除了那些导致可能产生不需要的(隐蔽)剪接供体位点的“GT”二核苷酸的变体。为了清楚起见，前10个KAGNN重复序列在此作为共有序列呈现，但主要是SEQ ID NO:8的前48个核苷酸。3'末端tbs KAGNN以每个变体中编码的形式呈现(斜体和括号)；核心Kozak共有序列以粗体显示，并且任何作为更广泛、扩展的Kozak共有序列的一部分出现的核苷酸都带有下划线。
Figure BDA0003843317840001141
通常，大多数变体符合优选核心Kozak共有序列RVVATG，同时仅限于包含标示的KAGNN tbs共有序列。将这些变体克隆到pEF1a-GFP报告基因质粒中，因此5'UTR包含(在剪接其内含子后)L33前导序列(外显子1)加上来自外显子2的短12nt序列，这在之前的实施例5中已经表明除非使用重叠tbs-Kozak变体，否则TRAP的抑制性会降低。悬浮(无血清)HEK293T细胞在通常反映慢病毒载体(LV)转染/生产(例如包含丁酸钠诱导)的条件下，在有或没有TRAP表达质粒的情况下，用这些变体单独转染，在通常的LV收获时间(转染后2天)进行流式细胞术。对于+/-TRAP条件生成整体GFP表达评分(％GFP x MFI；ArbU)，然后生成倍数抑制值并将其绘制在图17A中。结果证明，核心Kozak共有序列与3'末端KAGNN tbs重复序列的重叠越多，TRAP抑制水平越好。每个重叠组的倍数差异的统计学分析(T检验)证明，随着更多核心Kozak与3'末端KAGNN tbs重复序列重叠，抑制显著增加，最佳抑制评分来自KAGatg组，其中起始密码子的第2/3位构成KAGNN重复序列的一部分。与非重叠tbs变体相比，所有重叠变体通过TRAP产生了统计学上更高的转基因抑制。
数据在图17B中进一步分层(stratified)，其中非抑制的“ON”转基因水平从最高到最低显示。突出显示来自KAGatg重叠组的两个变体，以示出对于这两个在TRAP抑制方面表现最好的变体，GAGatg变体(tbskzkV0.G)给出了最高的“ON”水平，大概是因为它符合核心Kozak共有序列RVVATG，而TAGatg(tbskzkV0.T)没有。
所有这些数据都支持这样一个普遍原则，即与非重叠tbs变体相比，重叠tbs-Kozak变体在介导TRAP抑制方面更有效，并且优选tbs-Kozak重叠符合核心Kozak共有序列RVVATG，以确保在载体转导的靶细胞中良好的“ON”转基因表达。因此，采用这些新的tbs-Kozak变体将能够在病毒载体生产期间实现更有效的转基因抑制，如果所述转基因蛋白活性对病毒载体滴度和/或活性有害，则可能使病毒载体滴度增加。
实施例10：进一步使用最佳重叠tbs-Kozak变体来改善TRAP介导的对含有内含子的常见启动子的抑制。
在实施例8中，当使用包含内含子的全长EF1a启动子时，表明重叠tbs-Kozak变体的使用改善了TRAP介导的抑制。对于在病毒载体基因组中广泛用于基因治疗的类似启动子(例如CAG启动子)，嵌入的外显子/内含子序列的存在意味着TRAP介导的抑制程度可能受到“天然”外显子序列中的序列的影响。从改善TRAP介导的抑制的角度来看，改变外显子序列可能并不显而易见或不可行，特别是如果这些外显子序列涉及剪接增强(例如，剪接增强子元件靠近剪接供体位点)。广泛使用的CAG启动子包括CMV增强子元件、核心鸡β-肌动蛋白基因启动子-外显子1-内含子序列和来自兔β-珠蛋白基因的剪接受体-外显子序列。在本发明的其他地方，令人惊讶地发现来自EF1a启动子(L33)的外显子1可用于所有类型tbs变体的上游以改善TRAP介导的抑制，可能提供良好的序列背景以支持形成稳定的TRAP-tbs复合物，从而实现有效的翻译抑制。重叠tbs-Kozak变体显示有助于在EF1a(含内含子)和若干其他缺乏内含子的启动子中由TRAP介导的抑制。
在该实施例中(参见图18A)，两个特征都被应用于通过以下方式改善来自CAG启动子的TRAP介导的抑制：[a]将tbskzkV0.G变体(在其他实施例中也称为变体“0”)置于CAG启动子的“天然”5'UTR区域内(SEQ ID NO:117)；和[b]用含有tbskzkV0.G变体的EF1a 5'UTR-内含子区域替换整个含有“天然”内含子的5'UTR区域(SEQ ID NO:118)。相应的剪接序列分别显示为SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:120。此外，举例说明，病毒载体基因组中通常使用的没有内含子的启动子(在这种情况下为CMV)可以附加含有异源内含子的人工5'UTR，之前已证明其表达能通过TRAP被有效抑制。具体而言，在CMV启动子情况下使用具有含tbskzkV0.G变体的EF1a5'UTR-内含子区域的5'UTR(SEQ ID NO:118)。
对这些报告基因构建体(编码GFP)在悬浮(无血清)HEK293T细胞中的“ON”表达水平和TRAP介导的抑制进行了评估，模拟了病毒载体生产场景。用GFP报告基因质粒+/-pTRAP转染细胞，转染后用丁酸钠诱导培养物(根据典型的病毒载体生产)，转染后约2天(即在典型的病毒载体收获点)分析细胞的GFP表达。生成并进行绘制了GFP表达评分(％GFP阳性xMFI；ArbU)(图18B)，并显示了TRAP抑制评分。这些数据表明，使用tbskzkV0.G变体可以从CAG启动子提高典型病毒载体生产细胞中TRAP介导的表达，从3倍提高到30倍。此外，数据显示来自不同启动子的“天然”5'UTR区域序列可以被含有tbsKzkV0.G变体的包含内含子的EF1a 5'UTR替换，从而显著改善TRAP介导的抑制(30-40倍至>100倍)并在没有TRAP的情况下保持高基因表达(即模拟病毒载体转导的靶细胞中的表达)。因此，新的EF1a-5'UTR-内含子-tbskzkV0.G序列可用于为异源启动子提供靶细胞中内含子所赋予的已知益处(即增加基因表达)，同时还能够在病毒载体生产期间有效抑制转基因蛋白，如果所述转基因蛋白活性对病毒载体滴度不利，则可以使病毒载体滴度增加。这也适用于将EF1a-5'UTR-内含子序列与其他重叠tbs-Kozak序列一起使用。
实施例11–评估主要剪接供体单独突变或与相邻的隐蔽剪接供体位点的额外突变相结合，对异常剪接、载体滴度和对经修饰的U1snRNA的反应的影响。
为了评估主要剪接供体位点单独突变或与隐蔽剪接供体(crSD；现在也称为“crSD1”)突变(存在于MSD-2KO中)组合的影响，克隆了另一个变体，命名为“MSD-1KO”(图20A)。该变体在MSD位点仅包含GT>CA突变。MSD-1KO变体基因组以及标准LV基因组和MSD-2KO基因组(均包含EF1a-GFP转基因盒)用于通过在存在或不存在针对vRNA(256U1)的包装区域的经修饰的U1 snRNA的情况下，瞬时转染悬浮(无血清)HEK293T细胞以产生LV-GFP粗收获物。在图20D中示出了LV-GFP滴度，图中表明仅MSD位点的突变就足以降低LV滴度，并且这些滴度可恢复到与MSD-2KO载体观察到的相同水平。使用允许检测未剪接或异常剪接产物的引物，通过RT-PCR对提取的polyA选择的mRNA进行SL2环内MSD区域异常剪接的生产后细胞分析(图20C；引物位置参见图23)。数据显示，仅MSD的突变就会立即激活下游的隐蔽剪接供体(crSD[1])。分析还揭示，SL2中MSD区域的异常剪接完全被“MSD-2KO”变体中存在的MSD和相邻的隐蔽剪接供体(crSD[1])的突变所消除，但这激活了存在于包装序列下游的SL4环(crSD2)中的另一个次要剪接供体位点(这在前面的实施例中也很明显-参见图4Bii)。
实施例12-评估包装序列的SL4环中隐蔽剪接供体突变与SL2中主要剪接供体和隐蔽剪接供体位点突变相组合的影响。
在实施例11中，表明MSD和crSD1的突变完全消除了来自包装信号的SL2区域的异常剪接，但这激活了SL4环中的另一个隐蔽剪接供体(参见图20A；“crSD2”)。为了评估SL4中的crSD2位点是否可以突变以消除活性(并注意对包装序列的进一步修改可能会损害有效包装所需的RNA折叠)，设计了MSD-3KO_1和MSD-3KO_2变体。这些变体包含SL2中的MSD-2KO突变，以及crSD2位点中“GT”二核苷酸的单核苷酸突变(参见图20A)。MSD-3KO_1将GT二核苷酸的G突变为“C”，而MSD-3KO_2突变是GT二核苷酸的T>C突变。请注意，T>C突变预测SL4环中更好的碱基配对以及更广泛包装序列的三级模型(Keane et al.Science.2015 May 22；348(6237):917–921))。如实施例11所述制造含有这些修饰的LV-EF1a-GFP载体，包括分析来自生产后细胞的载体RNA(图21A)和滴定所得载体收获物(图21B)。MSD-3KO_1变体中的异常剪接似乎没有被消除，并且在对RT-PCR产物的外显子-外显子接头进行测序时，发现该产物来自另一个隐蔽剪接供体位点(crSD3)，激活了下游10个核苷酸(参见图21A泳道7和8，以及crSD3的序列参见图20A)。MSD-4KO_1和MSD-4KO_2的构建和测试表明crSD3的异常剪接确实是由crSD2中的G>C突变激活的，因为crSD3的突变消除了这一点(图21A；泳道11至14)。然而，对于MSD-3KO_2变体来说，令人惊讶的是，不仅crSD2的异常剪接被消除，而且crSD3位点也没有被激活(图21A；泳道9和10)，这表明crSD3的一种隐蔽剪接增强子也已被SL4环中MSD-3KO_2的单T>C突变所消除。
更令人惊讶的是MSD-2KOm5突变对来自crSD2或crSD3的隐蔽剪接的影响。在前面的实施例中，示出了MSD-2KOm5变体的减毒程度低于其他MSD-2KO剪接供体突变体，这可能引起经修饰的U1snRNA在滴度恢复方面的进一步好处。不希望受理论束缚，基于vRNA募集U1snRNA可能有利于稳定性的假设(单独和另外使用针对SL1环的经修饰的U1 snRNA)，对MSD-2KOm5变体进行设计，使得可能发生与内源性U1 snRNA的最大退火(不成为功能性剪接供体)。图20B显示了如何预测标准、MSD-2KO和MSD-2KOm5载体基因组vRNA与内源性U1snRNA退火，然而突变的基因组不包含剪接供体位点。理论上，MSD-2KOm5变体可以募集内源性U1snRNA，比MSD-2KO变体更稳定(即，参与碱基配对的氢键数量更多)，并且可能比标准LV基因组更大，但关键是没有引起剪接事件。此外，MSD-2KOm5旨在确保形成稳定的SL2环，因为这对于正确折叠包装序列可能很重要。当对MSD-2KOm5(以及相关的MSD-3KO_2和MSD-4KO_2变体)进行相同的分析时，令人惊讶地发现SL4中的crSD2或crSD3没有发生异常剪接。再次，不受理论束缚，提出内源性U1 snRNA募集到SL2环的附近可能会阻碍对SL4环中隐蔽剪接位点的识别。
在该进一步研究中产生的所有剪接供体突变载体都具有降低的滴度(MSD-2KOm5的减毒最少)，但都通过以反式提供经修饰的U1 snRNA而得到显著提高(图21B)。
总之，这表明导致MSD和crSD1位点功能性消除的微小突变引起包装序列的一般异常剪接大幅减少，但可能需要SL4环的crSD2/3位点中的辅助突变来完全消除它。引起MSD和crSD1位点异常剪接的功能性消除的优选修饰是MSD-2KOm5变体所描述的更实质性的修饰，因为这还具有不允许激活下游SL4环中较小的隐蔽剪接供体位点的令人惊讶的效果，并且在存在靶向其包装区域的经修饰的U1 snRNA的情况下，可以使具有这种修饰的载体达到最高滴度。
实施例13-剪接供体突变的LV基因组引起靶细胞中上游细胞启动子的转录“通读”事件减少。
慢病毒载体整合到靶细胞是半随机的，LV表现出整合到转录活性细胞基因中的偏好。其他人已经表明，可以发生从上游细胞启动子到整合LV的转录通读或“读入”，并调动LV基因组内的序列/与LV基因组内的序列相互作用(参见例如Moiani et al.J ClinInvest.2012May 1；122(5):1653-1666)。对于本发明，预期MSD突变的LV的进一步益处是提高患者关于靶细胞染色体内整合LV的影响的安全性。由于已经证明对于野生型HIV-1，向主要剪接供体募集内源性U1 snRNA会导致5'LTR多聚腺苷酸化信号的抑制，因此在读入期间，标准LV中发生的类似机制可能会因为招募U1 snRNA而加剧这种情况。因此，由于5'-SINLTR编码的polyA信号的使用增加，消除LV包装信号内的MSD(和隐蔽SD)可能会引起转录读入减少(参见图22)。
为了测试这一点，使用实施例12中产生的MSD突变的LV载体和标准LV载体(参见图21B)以匹配的MOI(仅使用在存在256U1时制造的MSD突变的LV载体制备物，因为它们与标准载体制备物具有相似的滴度)转导HEK293T细胞和92BR原代细胞(驴成纤维细胞)。将转导的细胞培养物传代10天，以使未整合的LV cDNA和由它们产生的潜在RNA丢失，然后提取细胞RNA，用DNA酶处理，并使用LV包装区域的引物进行RT-qPCR分析(关于引物的位置，参见图22)。将检测到的HIV包装RNA的拷贝数标准化为GAPDH RNA信号(RNA上样对照)，然后用于整合的LV DNA拷贝数。对于每种细胞类型，将标准LV载体(不含256U1制造的)的检测到的HIV包装RNA的总标准化拷贝数设置为1，并且所有其他相关的标准化拷贝数设置都与此相关。图23显示了该分析的结果，表明确实在LV基因组中具有突变的MSD和隐蔽SD的特征引起转录读入事件减少了2到5倍。所有这些数据表明，MSD/crSD突变的LV在转导细胞中产生比标准LV更好的安全性，更不容易允许LV骨架调动和/或与LV序列相互作用。

Claims (54)

1.一种编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述慢病毒载体的RNA基因组中的主要剪接供体位点失活，并且其中位于所述主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活。
2.根据权利要求1所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述慢病毒载体是第三代慢病毒载体。
3.一种编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述慢病毒载体的RNA基因组中的主要剪接供体位点失活，并且其中位于所述主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活，其中所述核苷酸序列用于不依赖tat的慢病毒载体。
4.一种编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述慢病毒载体的RNA基因组中的主要剪接供体位点失活，并且其中位于所述主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活，其中所述核苷酸序列是在不存在tat的情况下产生的。
5.一种编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述慢病毒载体的RNA基因组中的主要剪接供体位点失活，并且其中位于所述主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活，其中所述核苷酸序列独立于tat转录。
6.一种编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述慢病毒载体的RNA基因组中的主要剪接供体位点失活，并且其中位于所述主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活，其中所述核苷酸序列用于不依赖U3的慢病毒载体。
7.一种编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述慢病毒载体的RNA基因组中的主要剪接供体位点失活，并且其中位于所述主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活，其中所述核苷酸序列独立于U3启动子转录。
8.一种编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述慢病毒载体的RNA基因组中的主要剪接供体位点失活，并且其中位于所述主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活，其中所述核苷酸序列由异源启动子转录。
9.根据前述权利要求中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述隐蔽剪接供体位点是位于所述主要剪接供体位点3'的第一个隐蔽剪接供体位点。
10.根据前述权利要求中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述隐蔽剪接供体位点在所述主要剪接供体位点的6个核苷酸内。
11.根据前述权利要求中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述主要剪接供体位点和所述隐蔽剪接供体位点具有突变或被删除。
12.根据前述权利要求中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中在所述剪接位点失活之前的核苷酸序列包含如SEQ ID NO:1、3、4、9、10和/或13中任一者所示的序列。
13.根据前述权利要求中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含相对于如SEQ ID NO:1、3、4、9、10和/或13中任一者所示的序列具有突变或被删除的序列。
14.根据前述权利要求中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含失活的主要剪接供体位点，否则所述核苷酸序列将在对应于SEQ IDNO:1的核苷酸13和14的核苷酸之间具有切割位点。
15.根据前述权利要求中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中在所述主要剪接供体位点失活之前的核苷酸序列包含如SEQ ID NO:4所示的序列。
16.根据前述权利要求中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中在所述隐蔽剪接供体位点失活之前的核苷酸序列包含如SEQ ID NO:10所示的序列。
17.根据前述权利要求中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含失活的隐蔽剪接供体位点，否则所述核苷酸序列将在对应于SEQ IDNO:1的核苷酸17和18的核苷酸之间具有切割位点。
18.根据前述权利要求中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含如SEQ ID NO:2、5、6、7、8、11、12和/或14中任一者所示的序列。
19.根据前述权利要求中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列不包含如SEQ ID NO:9所示的序列。
20.根据前述权利要求中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中来自所述慢病毒载体的RNA基因组的主要剪接供体位点和隐蔽剪接供体位点的剪接活性被抑制或被消除。
21.根据前述权利要求中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中在转染细胞或转导细胞中，来自所述慢病毒载体的RNA基因组的主要剪接供体位点和隐蔽剪接供体位点的剪接活性被抑制或被消除。
22.根据前述权利要求中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列进一步包含位于包装序列的SL4环内的隐蔽剪接供体位点中的突变。
23.根据权利要求22所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中位于所述包装序列的SL4环内的所述隐蔽剪接供体位点中的GT二核苷酸突变为GC。
24.根据前述权利要求中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列还包含目的核苷酸。
25.根据权利要求24所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述目的核苷酸产生治疗效果。
26.根据前述权利要求中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列是载体转基因表达盒。
27.根据前述权利要求中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列进一步包含编码经修饰的U1snRNA的核苷酸序列，其中所述经修饰的U1snRNA已被修饰以结合MSD突变的慢病毒载体基因组的包装区域内的核苷酸序列。
28.根据权利要求27所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列能够与编码经修饰的U1 snRNA的核苷酸序列连接。
29.根据前述权利要求中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列进一步包含色氨酸RNA结合衰减蛋白(TRAP)结合位点。
30.根据权利要求27所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含目的核苷酸，并且其中(i)所述TRAP结合位点与所述目的核苷酸的起始密码子ATG重叠；并且/或所述核酸序列还包含Kozak序列，其中所述TRAP结合位点与Kozak序列重叠。
31.根据权利要求29所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含目的核苷酸并且其中(i)所述TRAP结合位点包含所述目的核苷酸的起始密码子ATG的一部分或其中ATG起始密码子包含TRAP结合位点的一部分；并且/或所述核苷酸序列进一步包含Kozak序列，其中所述Kozak序列包含TRAP结合位点的一部分。
32.根据权利要求29所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列还包含多克隆位点和Kozak序列，其中所述多克隆位点与TRAP结合位点的3'KAGN2-3重复序列重叠或位于其下游和Kozak序列上游。
33.根据权利要求29至32中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述TRAP结合位点或其部分的3'末端KAGNN重复序列至少与起始密码子ATG的第一个核苷酸重叠。
34.根据权利要求29至33中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述TRAP结合位点或其部分的3'末端KAGNN重复序列与起始密码子ATG的前两个核苷酸重叠。
35.根据权利要求29至34中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核酸序列，其中所述TRAP结合位点或其部分的3'末端KAGNN重复序列与在核心Kozak序列内的起始密码子ATG的第一个核苷酸重叠。
36.根据权利要求29至35中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核酸序列，其中所述核酸序列包含如SEQ ID NO:114或SEQ ID NO:116所定义的序列。
37.根据权利要求29至36中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述目的核苷酸能够与所述TRAP结合位点或其部分连接。
38.一种表达盒，其包含根据前述权利要求中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列。
39.一种病毒载体生产系统，其包含一组核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码载体组分，所述载体组分包括gag-pol、env、任选的rev，以及如前述权利要求中任一项所定义的慢病毒载体的RNA基因组。
40.一种细胞，其包含根据权利要求1至37中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列、根据权利要求36所述的表达盒或根据权利要求39所述的病毒载体生产系统。
41.一种用于产生慢病毒载体的细胞，包括：
(iv)a)编码载体组分的核苷酸序列，所述载体组分包括gag-pol和env，以及任选的rev，以及根据权利要求1至37中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列或根据权利要求38所述的表达盒；或者
b)根据权利要求39所述的病毒载体生产系统；和
(v)任选的编码经修饰的U1 snRNA的核苷酸序列和/或任选的编码TRAP的核苷酸序列。
42.根据权利要求40或41所述的细胞，其中来自慢病毒载体的RNA基因组的主要剪接供体位点和/或剪接供体区域的剪接活性被抑制或被消除。
43.根据权利要求42所述的细胞，其中来自慢病毒载体的RNA基因组的主要剪接供体位点和/或剪接供体区域的剪接活性在慢病毒载体生产期间被抑制或被消除。
44.根据权利要求40至43中任一项所述的细胞，其中目的核苷酸的翻译在慢病毒载体生产期间受到抑制。
45.一种生产慢病毒载体的方法，包括以下步骤：
(iv)将以下a)和b)引入细胞：
a)编码载体组分的核苷酸序列，所述载体组分包括gag-pol和env，以及任选的rev，以及根据权利要求1至37中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列或根据权利要求38所述的表达盒；或者
b)根据权利要求39所述的病毒载体生产系统；
(v)任选地选择包含所述编码载体组分和慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列的细胞；
(vi)在适合生产慢病毒载体的条件下培养所述细胞。
46.根据权利要求45所述的方法，其中步骤(i)还包括将编码TRAP的核苷酸序列引入细胞中。
47.根据权利要求45或权利要求46所述的方法，其中步骤(i)另外包括引入编码经修饰的u1 snRNA的核苷酸序列。
48.根据权利要求45至47中任一项所述的方法生产的慢病毒载体。
49.根据权利要求48所述的慢病毒载体，其中所述慢病毒载体包含根据权利要求1至37中任一项所定义的慢病毒载体的RNA基因组。
50.根据权利要求1至37中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列、根据权利要求38所述的表达盒、根据权利要求39所述的病毒载体生产系统或根据权利要求40至44中任一项所述的细胞，用于生产慢病毒载体的用途。
51.根据权利要求1至37中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列、根据权利要求38所述的表达盒、根据权利要求39所述的病毒载体生产系统或根据权利要求40至44中任一项所述的细胞，用于抑制或消除来自慢病毒载体的RNA基因组的主要剪接供体位点和/或剪接供体区域的剪接活性的用途。
52.根据权利要求48所述的用途，其中来自慢病毒载体的RNA基因组的主要剪接供体位点和/或剪接供体区域的剪接活性在转染细胞或转导细胞中被抑制或被消除。
53.根据权利要求1至37中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列、根据权利要求38所述的表达盒、根据权利要求39所述的病毒载体生产系统或根据权利要求40至44中任一项所述的细胞，用于抑制目的核苷酸的翻译的用途。
54.一种慢病毒载体，包含根据权利要求1至37中任一项所定义的RNA基因组。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB202114528D0 (en) 2021-10-12 2021-11-24 Oxford Biomedica Ltd Lentiviral vectors
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GB202114530D0 (en) 2021-10-12 2021-11-24 Oxford Biomedica Ltd Retroviral vectors
US20230346977A1 (en) 2022-04-13 2023-11-02 Universitat Autònoma De Barcelona Treatment of neuromuscular diseases via gene therapy that expresses klotho protein
GB202211935D0 (en) 2022-08-16 2022-09-28 Oxford Biomedica Ltd envelope proteins

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5512421A (en) 1991-02-19 1996-04-30 The Regents Of The University Of California Generation, concentration and efficient transfer of VSV-G pseudotyped retroviral vectors
US5723315A (en) 1996-08-23 1998-03-03 Genetics Institute, Inc. Secreted proteins and polynucleotides encoding them
US6100071A (en) 1996-05-07 2000-08-08 Genentech, Inc. Receptors as novel inhibitors of vascular endothelial growth factor activity and processes for their production
CZ297278B6 (cs) 1996-08-07 2006-10-11 Darwin Discovery Limited Deriváty hydroxamové a karboxylové kyseliny a jejich pouzití
US6126939A (en) 1996-09-03 2000-10-03 Yeda Research And Development Co. Ltd. Anti-inflammatory dipeptide and pharmaceutical composition thereof
IL129017A0 (en) 1996-10-17 2000-02-17 Oxford Biomedica Ltd Retroviral vectors
US6924123B2 (en) 1996-10-29 2005-08-02 Oxford Biomedica (Uk) Limited Lentiviral LTR-deleted vector
WO2000000600A2 (en) * 1997-09-22 2000-01-06 Chang Lung Ji Lentiviral vectors, comprising modified major donor splice sites and major packaging signals
CA2315269A1 (en) 1997-12-22 1999-07-01 Oxford Biomedica (Uk) Limited Equine infectious anaemia virus (eiav) based
GB9803351D0 (en) 1998-02-17 1998-04-15 Oxford Biomedica Ltd Anti-viral vectors
EP1082447A2 (en) * 1998-05-26 2001-03-14 Lung-Ji Chang Lentiviral vectors, comprising modified major donor splice sites and major packaging singals
GB9904905D0 (en) 1999-03-03 1999-04-28 Oxford Biomedica Ltd Cells
GB0009760D0 (en) 2000-04-19 2000-06-07 Oxford Biomedica Ltd Method
ES2634424T3 (es) 2002-02-01 2017-09-27 Oxford Biomedica (Uk) Limited Vector multicistrónico lentivírico
AU2003260769A1 (en) 2002-09-03 2004-03-29 Oxford Biomedica (Uk) Limited Retroviral vector and stable packaging cell lines
FR2872170B1 (fr) 2004-06-25 2006-11-10 Centre Nat Rech Scient Cnrse Lentivirus non interactif et non replicatif, preparation et utilisations
GB0526211D0 (en) 2005-12-22 2006-02-01 Oxford Biomedica Ltd Viral vectors
GB0526210D0 (en) 2005-12-22 2006-02-01 Oxford Biomedica Ltd Vectors
ES2762864T3 (es) 2008-06-18 2020-05-26 Oxford Biomedica Ltd Purificación de virus
WO2012156839A2 (en) * 2011-05-19 2012-11-22 Ospedale San Raffaele S.R.L. New generation of splice-less lentiviral vectors for safer gene therapy applications
GB201322798D0 (en) 2013-12-20 2014-02-05 Oxford Biomedica Ltd Production system
FI3633040T3 (fi) 2017-12-22 2023-08-03 Oxford Biomedica Ltd Retrovirusvektori

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