CN102229963A

CN102229963A - 一种慢病毒载体系统及其制备方法

Info

Publication number: CN102229963A
Application number: CN201110120701.5A
Authority: CN
Inventors: 潘建治; 于福先; 朱志伟; 陈晓宇
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2011-05-11
Filing date: 2011-05-11
Publication date: 2011-11-02
Anticipated expiration: 2031-05-11
Also published as: CN102229963B

Abstract

一种慢病毒载体系统及其制备方法，属于生物技术领域。一种慢病毒载体系统包括穿梭质粒CSⅡ-EF-MCS-IRES2-Venus，包装质粒pCAG-HIVgp和包膜蛋白质粒pVSV-G-RSV-Rev，将载体系统中的穿梭质粒CSⅡ-EF-MCS-IRES2-Venus，包装质粒pCAG-HIVgp和包膜蛋白质粒pVSV-G-RSV-Rev共同转染宿主细胞后，即在宿主细胞中包装获得慢病毒载体系统。本发明与现有技术比较具有以下特点：1）成本低，以转染10皿10-cm的细胞为例，推荐使用的脂质体2000体积为600μl（60μl×10）价格约为1500元，而使用本方法的成本可降至0.62元，成本可大幅降低；2）转染效率高，转染率可达到80%以上；3）病毒效价高，可达到5.75×109。

Description

一种慢病毒载体系统及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种慢病毒载体系统及其制备方法。

背景技术

慢病毒（Lentivirus）属于逆转录病毒科（Retrovidae）慢病毒属，为RNA病毒。慢病毒载体（Lentivirus vector, LV）是以HIV-1（人类免疫缺陷病）病毒为基础，通过缺失部分基因组基因而发展起来的应用于基因治疗和基因转移的一种载体（An DS 等，J Virol, 2001. 75(8): 3547-3555.）。慢病毒载体与普通的逆转录病毒载体相比具有诸多优势，如它具有广泛的感染宿主域，可感染分裂期和非分裂期的细胞（Naldini L等，Science, 1996, 272(5259): 263-267），甚至于可以感染G0期的细胞（Korin YD等, J Virol, 1998. 72(4): 3161-3168.）；对多种类型的细胞表现出较高的转染效率；它可以将目的基因高效率的整合到宿主基因组中，长期进行表达；转染胚胎后能够有效避免发育过程中部分基因的沉默现象等。因此慢病毒载体已成为目前制备转基因动物最为有效的一种工具（Robl JM等, Theriogenology 2007, 67(1):127-133.）。

慢病毒的效价是决定其应用性能的重要指标，不同的应用目的对慢病毒的感染剂量具有不同的要求，高效价的慢病毒可适用于广泛的应用目的。特别是在动物转基因领域中，受精卵可接纳载体溶液的容积仅为pl级别，因此，慢病毒效价的高低将直接影响转基因的可行性。目前，慢病毒的包装主要以脂质体法转染293T细胞为主，脂质体的转染效率较高，但它本身也存在着不足之处，譬如它对细胞可产生毒性、价格较昂贵等。另外，在包装后的病毒纯化方面，目前常用的几种方法主要有：超速离心法、PEG沉淀法以及使用成本较高的慢病毒纯化试剂盒等。慢病毒制备中现有的包装及纯化方法存在生产成本高、花费时间长的缺点。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种慢病毒载体系统及其制备方法的技术方案，该制备方法具有低成本、高效率等特点。

所述的一种慢病毒载体系统，其特征在于包括穿梭质粒CSⅡ-EF-MCS-IRES2-Venus，包装质粒pCAG-HIVgp和包膜蛋白质粒pVSV-G-RSV-Rev，将载体系统中的穿梭质粒CSⅡ-EF-MCS-IRES2-Venus，包装质粒pCAG-HIVgp和包膜蛋白质粒pVSV-G-RSV-Rev共同转染宿主细胞后，即在宿主细胞中包装获得慢病毒载体系统。

所述的一种慢病毒载体系统，其特征在于所述的宿主细胞为293T细胞。

所述的一种慢病毒载体系统的制备方法，其特征在于包括以下工艺步骤：

1）宿主细胞培养：将293T宿主细胞接种至DMEM完全培养基中生长，培养环境为37℃，5%的CO₂培养箱，当转染质粒前2天时，调整培养箱中CO₂浓度为10%；

2）质粒提取：分别提取穿梭质粒CSⅡ-EF-MCS-IRES2-Venus，包装质粒pCAG-HIVgp和包膜蛋白质粒pVSV-G-RSV-Rev作为慢病毒载体系统，提取后测定各质粒的含量；

3）宿主细胞接种：将步骤1）培养的293T宿主细胞稀释后接种于含有Poly-L-Lysine试剂的细胞培养皿中，在培养环境为37℃，5%的CO₂培养箱中培养18-24小时；

4）质粒转染：当宿主细胞的汇合率为65-75%时，取穿梭质粒CSⅡ-EF-MCS-IRES2-Venus，包装质粒pCAG-HIVgp和包膜蛋白质粒pVSV-G-RSV-Rev，进行磷酸钙法进行质粒转染，质粒转染时，调整培养箱中CO₂浓度至3%，培养12-16小时；

5）病毒收集：取步骤4）得到的培养液，加入预热的含有Forskolin的完全培养基，并在37℃，10% CO₂的培养箱中培养45-50小时，吸取含有包装出的病毒颗粒的培养液，用0.45 μm的滤器过滤后，收集病毒悬液，置于4℃保存；然后在步骤4）得到的细胞培养皿中再加入预热的含有Forskolin的完全培养基，继续培养45-50h，收集上清用0.45 μm的滤器过滤，收集病毒悬液，置于4℃保存；

6）病毒纯化：将收集的病毒悬液装入超速离心管中，20℃，50,000g离心2h，弃去上清液，沉淀用HBSS重悬，将重悬的病毒悬液加入超滤管中14,000g离心25min，弃去下层滤液，超滤管中加入HBSS洗涤两次，倒置超滤管，1,000g离心2min，收集病毒悬液， -80℃低温冰箱中保存备用，即得到慢病毒载体系统。

所述的一种慢病毒载体系统的制备方法，其特征在于其特征在于所述的步骤1）中DMEM完全培养基中含有10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。

所述的一种慢病毒载体系统的制备方法，其特征在于其特征在于所述的步骤2）中采用无内毒质粒提取试剂盒提取，使用紫外分光光度计测定质粒的含量，测定吸光值OD值时，OD260的光密度值应在0.1-1.0之间，OD260/OD280的光密度值应在1.8-2.0之间。

所述的一种慢病毒载体系统的制备方法，其特征在于所述的步骤3）中将步骤1）培养的293T宿主细胞稀释成5×10⁵个细胞/ml后接种于含有Poly-L-Lysine试剂的细胞培养皿中。

所述的一种慢病毒载体系统的制备方法，其特征在于所述的步骤4）磷酸钙法进行质粒转染时，先在质粒中加入2.5M的CaCl₂，充分混匀后，逐滴加入2×BBS，2×BBS 含有50mM BES、280 mM NaCl和1.5 mM Na2HPO4，pH6.95。

所述的一种慢病毒载体系统的制备方法，其特征在于所述的步骤5）含有Forskolin的完全培养基中含有10μM的Forskolin试剂。

本发明中采用的穿梭质粒CSⅡ-EF-MCS-IRES2-Venus，包装质粒pCAG-HIVgp和包膜蛋白质粒pVSV-G-RSV-Rev均由RIKEN BRC DNA BANK 提供，网址为http://dna.brc.riken.jp/。

本发明采用的试剂均购自Sigma。

本发明细胞培养期间采用不同的CO₂浓度，pH值的变化对质粒的转染效果将产生较大影响。当细胞培养至汇合率达70%左右时进行质粒转染，使得细胞的转染效率达到最高；收集病毒时，在细胞培养液中加入10μM Forskolin，增加转染效率；使用超速离心和超滤管过滤的两步法进行病毒的浓缩和纯化，可除去可溶性的杂蛋白及部分蛋白分子量小于100kD的不溶性的杂蛋白，提高病毒的纯度，也可根据要求浓缩至需要的体积，增加病毒效价。

本发明与现有技术比较具有以下特点：1）成本低，以转染10皿10-cm的细胞为例，推荐使用的脂质体2000体积为600μl（60μl×10）价格约为1500元，而使用本方法的成本可降至0.62元，成本可大幅降低；2）转染效率高，转染率可达到80%以上；3）病毒效价高，可达到5.75×109。

附图说明

图1为病毒包装纯化操作流程图；

图2为磷酸钙法转染效果的观测；

图3为包装纯化后的慢病毒感染效果的观测；

图4为流式细胞仪测定细胞中表达荧光蛋白的比率。

图2中A：荧光显微镜下绿色荧光观测；B：荧光显微镜下红色荧光观测；C：明场下细胞观测；D：明场和绿色荧光叠加图；E：明场和红色荧光叠加图；F：红色荧光和绿色荧光叠加图。

图3中A：荧光显微镜下绿色荧光观测；B：荧光显微镜下红色荧光观测；C：明场下细胞观测；D：红色荧光和绿色荧光叠加图。

图4中A：对照组；B：病毒10-3稀释表达荧光阳性细胞比例；C：病毒10-4稀释表达荧光阳性细胞比例；D：病毒10-5稀释表达荧光阳性细胞比例；E：病毒10-6稀释表达荧光阳性细胞比例；F：病毒10-7稀释表达荧光阳性细胞比例。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，本发明病毒包装纯化操作流程可参照图1所示。

实施例1：双荧光慢病毒表达载体的制备

引物合成和序列测定由上海生工生物工程有限公司完成

1）以载体pDsRed1-N1中红色荧光蛋白基因设计引物，并在基因的两端引入NotⅠ和BamHⅠ酶切位点，引物序列如下：

DsRed-F：GCGGCCGCCGCCACCATGGTGCGCTC

DsRed-R：GGATCCCTACAGGAACAGGTGGTGG

2）以质粒pDsRed1-N1为模板，PCR扩增红色荧光蛋白基因（DsRed），扩增产物连接入T载体，酶切及测序鉴定后， NotⅠ和BamHⅠ双酶切，凝胶回收试剂盒（天根生化）回收DsRed基因片段。

3）将慢病毒载体CSⅡ-EF-MCS-IRES2-Venus 用NotⅠ和BamHⅠ双酶切后，回收酶切后的产物，应用T4 DNA连接酶（Takara）将载体片段和外源基因DsRed进行连接。连接产物（CSⅡ-EF-DsRed-IRES2-Venus）转入感受态细胞进行扩增，提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序鉴定。

4）用无内毒素质粒大提试剂盒（天根生化）提取穿梭质粒CSⅡ-EF-DsRed-IRES2-Venus、包装质粒pCAG-HIVgp和包膜蛋白质粒pVSV-G-RSV-Rev，使用分光光度计测定质粒的浓度（Beckman Coulter Du730），OD260的光密度值应在0.1-1.0之间，OD260/OD280的光密度值应在1.8-2.0之间。

5）取培养的293T细胞（约两个细胞培养皿），胰酶消化液消化细胞，细胞分散后，加入约2 ml的完全培养基（10%胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素），计数。

6）取10个细胞培养皿，个培养皿加入3 ml用PBS 5倍稀释的Poly-L-Lysine（Sigma, P4832），孵育10 min后吸出，Poly-L-Lysine可重复使用。

7）每孔接入5×10⁵个细胞。取10ml接种于10 cm的细胞培养皿中，37℃，10% CO₂的培养箱中培养约24h，此时细胞的汇合率约为70%。

8）准备用于转染的质粒，每孔转染时需要质粒CSⅡ-EF-DsRed-IRES2-Venus 17μg，包装质粒pCAG-HIVgp和包膜蛋白质粒pVSV-G-RSV-Rev各10μg。

9）在50 ml离心管中加入所需的质粒（170μg、100μg、100μg），混匀，用细胞级的超纯水定容至4.5 ml，充分混匀，加入500μl 2.5M的CaCl₂，充分混匀。

10）向离心管中加入5 ml 2×BBS（50mM BES，280 mM NaCl，1.5 mM Na₂HPO₄，pH6.95），边加边混匀，室温孵育20 min，此时溶液呈白雾状，并有少量的白色沉淀。

11）将离心管液体轻轻混匀后，取1 ml逐滴加入到过夜培养的细胞培养皿中，边加边混匀。将细胞置于37℃，3% CO₂的培养箱中进行培养。

12）16小时后（荧光显微镜下观测质粒的转染效果，如图2所示），弃去细胞皿中的培养液，加入7.5ml预热至37℃的含有10μM Forskolin（Sigma, F3917）的完全培养基。37℃，10% CO₂的培养箱中培养48h。

13）吸出含有包装出的病毒颗粒的培养液，用0.45 μm的滤器过滤后，置于4℃保存。

14）在细胞培养皿中再加入7.5ml预热的含有10 μM Forskolin的完全培养基，继续培养48h，收集上清用0.45 μm的滤器过滤，收集病毒悬液，两次收集的病毒悬液约为150 ml。

15）将收集的病毒悬液装入超速离心管中，20℃，50,000g离心2h。弃去上清液，沉淀用0.5ml HBSS（Hanks Balanced Salt Solution, GIBCO）重悬。

16）将重悬的病毒悬液加入0.5ml的超滤管中（Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Devices YM-100）14,000g离心25min，弃去下层滤液，超滤管中加入400μl HBSS洗涤两次，倒置超滤管，1,000g离心2min，收集病毒悬液，纯化浓缩后的病毒悬液约为80 μl，分装后，-80℃低温冰箱中保存备用。

17）取两个6孔细胞培养板，用稀释过的多聚赖氨酸进行包被，按5×10⁵个细胞/孔进行接种，37℃，5% CO₂的培养箱中培养24h，取其中一个6孔板进行细胞计数，所计细胞数为9.5×10⁵/ml。

18）取1μl纯化后的病毒悬液用含有8μg/ml Polybrene DMEM的完全培养基100倍稀释后，再按10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5进行稀释。

19）将6孔板中的细胞培养液取出，其中5个孔分别加入1ml的病毒稀释液，1孔加入1 ml含有Polybrene的完全培养基作为对照。

20）37℃，5% CO₂的培养箱中培养20h后换成含2%血清的DMEM完全培养基，48 h后再换2%血清的DMEM完全培养基（此时，荧光显微镜下观测病毒的感染效果，如图3所示）。

21）第4d胰酶消化液消化成单细胞后，用PBS重悬细胞，流式细胞仪测定细胞中表达绿色荧光的阳性率（如图4所示）。取阳性率在1-20%的病毒稀释倍数，计算病毒效价。

表1不同稀释位数阳性细胞比例

稀释倍数	对照	10³	10⁴	10⁵	10⁶	10⁷
							阳性细胞比例	0%	83%	24.9%	2.5%	0.3%	0%

浓缩后病毒效价为={(测定的阳性细胞百分比×感染细胞时的细胞总数) /接种病毒体积} ×稀释倍数={（2.5%×9.5×10⁵/1 ml）}×10⁵=2.38×10⁹。

实施例2：

穿梭质粒更换为CSⅡ-EF-MCS-IRES2-Venus

其余实验步骤如实施例1，质粒转染细胞皿的数量为50皿，相应试剂按比例增加，效价测定时，接种病毒前细胞的数量为6.7×10⁵。

表2不同稀释位数阳性细胞比例

稀释倍数	对照	10³	10⁴	10⁵	10⁶	10⁷
							阳性细胞比例	0%	89%	47.09%	8.58%	1.41%	0.19%

浓缩后病毒效价为={(测定的阳性细胞百分比×感染细胞时的细胞总数) /接种病毒体积} ×稀释倍数={（8.58%×6.7×105/1 ml）}×105=5.75×10⁹。

<110> 浙江省农业科学院

<120> 一种慢病毒载体系统及其制备方法

<130> 001

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gcggccgccg ccaccatggt gcgctc 26

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ggatccctac aggaacaggt ggtgg 25

Claims

1.一种慢病毒载体系统，其特征在于包括穿梭质粒CSⅡ-EF-MCS-IRES2-Venus，包装质粒pCAG-HIVgp和包膜蛋白质粒pVSV-G-RSV-Rev，将载体系统中的穿梭质粒CSⅡ-EF-MCS-IRES2-Venus，包装质粒pCAG-HIVgp和包膜蛋白质粒pVSV-G-RSV-Rev共同转染宿主细胞后，即在宿主细胞中包装获得慢病毒载体系统。

2.如权利要求1所述的一种慢病毒载体系统，其特征在于所述的宿主细胞为293T细胞。

3.一种慢病毒载体系统的制备方法，其特征在于包括以下工艺步骤：

3）宿主细胞接种：将步骤1）培养的293T宿主细胞稀释后接种于含有Poly-L-Lysine试剂的细胞培养皿中，在培养环境为37℃，10%的CO₂培养箱中培养18-24小时；

4）质粒转染：当宿主细胞的汇合率为65-75%时，取穿梭质粒CSⅡ-EF-MCS-IRES2-Venus，包装质粒pCAG-HIVgp和包膜蛋白质粒pVSV-G-RSV-Rev，使用磷酸钙法进行质粒转染，质粒转染时，调整培养箱中CO₂浓度至3%，培养12-16小时；

6）病毒纯化：将上述收集的病毒悬液装入超速离心管中，20℃，50,000g离心2h，弃去上清液，沉淀用HBSS重悬，将重悬的病毒悬液加入超滤管中14,000g离心25min，弃去下层滤液，超滤管中加入HBSS洗涤两次，倒置超滤管，1,000g离心2min，收集病毒悬液， -80℃低温冰箱中保存备用，即得到慢病毒载体系统。

4.如权利要求3所述的一种慢病毒载体系统的制备方法，其特征在于所述的步骤1）中DMEM完全培养基中含有10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。

5.如权利要求3所述的一种慢病毒载体系统的制备方法，其特征在于所述的步骤2）中采用无内毒质粒提取试剂盒提取，使用紫外分光光度计测定质粒的含量，测定吸光值OD值时，OD260的光密度值应在0.1-1.0之间，OD260/OD280的光密度值应在1.8-2.0之间。

6.如权利要求3所述的一种慢病毒载体系统的制备方法，其特征在于所述的步骤3）中将步骤1）培养的293T宿主细胞稀释成5×10⁵个细胞/ml后接种于含有Poly-L-Lysine试剂的细胞培养皿中。

7.如权利要求3所述的一种慢病毒载体系统的制备方法，其特征在于其所述的步骤4）磷酸钙法进行质粒转染时，先在质粒中加入2.5M的CaCl₂，充分混匀后，逐滴加入2×BBS，2×BBS 含有50mM BES、280 mM NaCl和1.5 mM Na2HPO4，pH6.95。

8.如权利要求3所述的一种慢病毒载体系统的制备方法，其特征在于其特征在于所述的步骤5）含有Forskolin的完全培养基中含有10μM的Forskolin试剂。