CN1871356B - 用于递送干扰性rna的逆转录病毒载体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及逆转录病毒载体和慢病毒载体，其包含用于RNA聚合酶的启动子、多接头和编码目标基因特异的小发夹RNA(shRNA)的核酸。将所述shRNA导入细胞后，通过RNA干扰诱导目标基因信使RNA的降解。

Description

用于递送干扰性RNA的逆转录病毒载体 

发明领域

本发明总体上涉及用于将干扰性RNA递送入细胞的逆转录病毒载体。 

发明背景 

RNA干扰(RNAi)指的是这样一种现象，即由于存在的双链RNA(dsRNA)具有与目标基因的一部分相同或十分相似的序列，导致了从该目标基因转录的信使RNA(mRNA)的降解(Sharp 2001)。Fjose等人提出了RNA干扰的机制[Fjose等人，RNA Interference：Mechanisms and Applications(RNA干扰：机制和应用)。Biotechnology Annual Review(生物技术年鉴)，Vol.7，pp.10-57(2001)]。起先，由一条有义链(sense strand)和一条反义链(antisensestrand)构成一条双链RNA(dsRNA)序列，其中该有义链与目标基因相同或十分相似，且与该目标基因转录产生的mRNA互补；该反义链则与该有义链互补。因此，该反义链具有与该目标基因转录产生的mRNA的一部分相同或十分相似的序列。 

然后，RNAi核酸酶将该dsRNA切割为长度介于18-25个核苷酸之间的短的dsRNA，并与自目标基因转录产生的mRNA结合。此后，具有解旋酶(helicase)活性的RNAi酶催化短的dsRNA与mRNA之间的交换，使得该dsRNA的反义链与mRNA退火，置换了该dsRNA的“反义链”，而且使mRNA在其末端被切断。结果，该mRNA被破坏，而且未发生该mRNA分子的翻译过程。此外，该短dsRNA的有义链继续保持与RNAi核酸酶的结合，作为产生新反义链的模板而形成新的dsRNA分子，用于破坏自目标基因转录产生的另一mRNA。如此，RNAi显示了催化活性(Id.)。 

RNAi特异性敲低(knock-down)目标基因表达的能力具有明显的益处。 例如，RNAi可用于产生这样的动物，所述动物模拟真正基因“剔除”的动物，以便研究基因的作用。另外，RNAi可用于治疗由于某一特定基因或一组基因的异常表达、或由于某一发生突变或多态现象的基因的表达而引起的疾病或病症。例如，它可以抑制某些导致癌症的基因(例如癌基因)。此外，还可以抑制某些病毒基因，以及某些导致遗传疾病如肌强直性营养不良(myotonic dystrophy)、囊肿性纤维化(cystic fibrosis)、阿尔茨海默氏症(Alzheimer’s Disease)和帕金森氏症(Parkinson’s Disease)等疾病的突变基因。其对于环加氧酶(cyclooxygenase)或细胞因子(cytokines)等基因的抑制作用也可应用于治疗炎症，例如关节炎。 

因此，为了利用干扰性RNA来调节尤其是向下调节细胞内特定目标基因的表达，需要有一种能将异源RNA递送入细胞的载体。 

本文中关于任何参考资料的引述，不应被解释为是承认这些参考资料是本申请的“现有技术”。 

发明概述 

本发明提供了一种有用的、前所未知的逆转录病毒载体，该载体可将异源RNA递送入细胞，利用RNA的干扰作用调节特定蛋白的表达。 

广义地说，本发明可延伸至将目标基因特异性插入片段导入细胞从而调节目标基因表达的逆转录病毒载体。本发明的逆转录病毒载体含有启动子、多接头(polylinker)、以及含有双链RNA的目标基因特异性插入片段，其中该双链RNA包括有义部分和反义部分，其中该有义部分与目标基因反义链的一部分互补，该反义部分则与该有义部分互补。如此，双链RNA的有义部分和反义部分退火，而且该双链RNA折回自身。 

许多启动子都可应用于本发明的逆转录病毒载体。应用于本发明的逆转录病毒载体的启动子的一个具体例子是U6启动子，其序列为： 

ttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagtttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttgcctttatatatcttgt ggaaaggacgaaacaccg(SEQ ID NO：7). 

应用于本发明的逆转录病毒载体的另一启动子区域是H1启动子，其核苷酸序列为： 

-1 

ccctttctcaccagagtatgtcttgaatattctaagggtttaggtttctgtaaagtgcaaataccactaaagggtcttgtgtatcgctgtacgtttataa-100(SEQ ID NO：14). 

同样地，也有许多多接头可方便地应用于本发明的逆转录病毒载体。应用于本发明的逆转录病毒载体的多接头的例子为： 

(a)aattc gactggcacagcctccagg ttcaagaga cctggaggctgtgccagtc ttttt ggaa a(SEQ ID NO：1)； 

(b)aattc gctgggactcctttgcatg ttcaagaga catgcaaaggagtcccagc ttttt ggaa a(SEQ ID NO：2)； 

(c)gatcc gactggcacagcctccagg ttcaagaga cctggaggctgtgccagtc ttttt ggaa a(SEQ ID NO：3)； 

(d)gatcc gctgggactcctttgcatg ttcaagaga catgcaaaggagtcccagc ttttt ggaa a(SEQ ID NO：4)； 

(e)aattc gactccagtggtaatctac ttcaagaga gtagattaccactggagtc ttttt ggaa a(SEQ ID NO：5)；以及 

(F)gatcc  gactccagtggtaatctac ttcaagaga  gtagattaccactggagtc ttttt  ggaa  a(SEQ ID NO：6). 

对于本发明的慢病毒(Lentivirus)逆转录病毒载体来说，该多接头序列可含有AgeI限制性位点和EcoRI限制性位点，从而可插入如下所示的目标基因插入片段： 

AgeI    +1                       茎环终          止子    EcoRI 

CCGGT    G(20个或20个以上碱基)TTCAAGAGA(21个碱基)TTTTT GGAA G 

A        C(20个或20个以上碱基)AAGTTCTCT(21个碱基)AAAAA CCTT CTTAA 

该插入片段含有AgeI和EcoRI这两个限制性位点。上述“20个或20个以上碱基”可以是目标基因插入片段之双链核苷酸序列的反义链或有义链。自 然，“21个碱基”也可以是有义链或反义链。但关键的是，这两条链互补并退火而使得该双链RNA折回自身。此外，上述插入片段中之9碱基茎环仅是一个例子，其它大小的茎环也可方便地应用于本发明。 

此外，在本发明的逆转录病毒载体中，目标基因特异性插入片段中双链RNA的有义部分和反义部分之长度可以变化。例如，这些部分的长度可以是19-30个核苷酸，特别地是19-25个核苷酸，更特别地是19-23个核苷酸。 

自然，许多基因都可以是本发明的逆转录病毒载体的目标基因。目标基因的具体例子可以是与某种具体疾病或病症相关的基因，例如p53、Mat8等致癌基因。目标基因也可以是神经退化性疾病或病症的相关基因，例如与阿尔茨海默氏症相关的突变型淀粉样蛋白前体(mutated amyloidprecursor protein)基因或突变型早老蛋白(presenilin)基因。目标基因还可以是编码离子通道蛋白的基因或编码激素的基因等。实际上，人们欲阻断其表达的任何基因都可以作为本发明的逆转录病毒载体的目标基因。在下述的具体例子中，目标基因是p38。 

许多逆转录病毒都可应用于本发明的逆转录病毒载体。例如，本发明的逆转录病毒载体可由下列逆转录病毒构建而成：HIV、MoMuLV(莫洛尼鼠白血病病毒)、MSV(莫洛尼鼠肉瘤病毒)、HaSV(哈威肉瘤病毒)、SNV(脾坏死病毒)、RSV(劳氏肉瘤病毒)、弗兰德(Friend)病毒、鼠干细胞病毒(MSCV)、慢病毒、或如WO95/02697专利所公开的缺陷型逆转录病毒载体。以上仅是举几个例子。具体应用于本发明的一种逆转录病毒是鼠干细胞病毒(MSCV)。另一种是经修饰的慢病毒，其中，(a)内源性CMV启动子已被去除；(b)与REV应答元件(RRE)结合的REV元件被插入该病毒。 

此外，本发明的逆转录病毒载体还可含有报告基因，如hrGFP、Blasti、Hygro、Puro和eGFP-Puro融合蛋白等。 

在另一实施方案中，本发明可延伸至被本发明的逆转录病毒载体感染的细胞。这种感染可以发生在体外(in vitro)、体内(in vivo)，或取体内细胞经体外感染后再输回体内(ex vivo)。 

本发明可进一步延伸至将双链RNA导入细胞以改变目标基因表达的经修饰的慢病毒载体，其中： 

(a)该慢病毒的内源性CMV启动子已被去除，该经修饰的慢病毒载体含有以下部分： 

(i)与REV应答元件(RRE)结合的插入REV元件； 

(ii)U6启动子序列： 

ttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagtttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttgcctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccg(SEQ ID NO：7)；以及 

(iii)多接头区域； 

(iv)含有上述双链RNA的目标基因插入片段， 

其中该双链RNA包括有义部分和反义部分，其中该有义部分与目标基因反义链的一部分互补，该反义部分则与该有义部分互补。如此，双链RNA的有义部分和反义部分退火，而且该双链RNA折回自身。 

许多的多接头区域都可应用于本发明的经修饰的慢病毒载体。具体例子包括，但当然不仅限于如下序列： 

(a)aattc gactggcacagcctccagg ttcaagaga cctggaggctgtgccagtc ttttt ggaa a(SEQ ID NO：1) 

(b)aattc gctgggactcctttgcatg ttcaagaga catgcaaaggagtcccagc ttttt ggaa a(SEQ ID NO：2)； 

(c)gatcc gactggcacagcctccagg ttcaagaga cctggaggctgtgccagtc ttttt ggaa a(SEQ ID NO：3)； 

(d)gatcc gctgggactcctttgcatg ttcaagaga catgcaaaggagtcccagc ttttt ggaa a(SEQ ID NO：4) 

(e)aattc gactccagtggtaatctac ttcaagaga gtagattaccactggagtc ttttt ggaa a(SEQ ID NO：5)；以及 

(f)gatcc gactccagtggtaatctac ttcaagaga gtagattaccactggagtc ttttt ggaa a (SEQ ID NO：6)，以上仅是举几个例子。 

在本发明的经修饰的慢病毒逆转录病毒载体中，该多接头序列可含有AgeI限制性位点和EcoRI限制性位点，从而可插入如下所示的目标基因插入片段： 

AgeI      +1                      茎环             终止子  EcoRI 

CCGGT     G(20个或20个以上碱基)TTCAAGAGA(21个碱基)TTTTT GGAA G 

A C(20个或20个以上碱基)AAGTTCTCT(21个碱基)AAAAA CCTT CTTAA 

该插入片段含有AgeI和EcoRI这两个限制性位点。上述“20个或20个以上碱基”可以是目标基因插入片段之双链核苷酸序列的反义链或有义链。自然，“21个碱基”也可以是有义链或反义链。但关键的是，这两条链互补并退火而使得该双链RNA折回自身。此外，上述插入片段中之9碱基茎环仅是一个例子，其它大小的茎环也可方便地应用于本发明。 

此外，本发明的经修饰的慢病毒可任选地包括报告基因，如Blasti、hrGFP、萤光素酶等。 

本发明专利申请书所述之经修饰的慢病毒的具体例子是： 

(a)pLenti-U6-Blasti，它含有SEQ ID NO：8的核苷酸序列(图1)；以及 

(b)pLenti-U6-hrGFP，它含有SEQ ID NO：9的核苷酸序列(图2)。 

此外，本发明可延伸至一种调节细胞中目标基因的表达的方法，包括用本发明的逆转录病毒载体来感染细胞。在本发明的逆转录病毒载体中，基因插入片段之双链RNA的有义区域与该目标基因的反义链互补，目标基因插入片段之双链RNA的反义区域与双链RNA的有义区域互补，使得该双链RNA的有义区域和反义区域退火，而且该双链RNA折回自身。 

本发明还可延伸至将双链RNA导入细胞以改变目标基因的表达的鼠干细胞病毒(MSCV)载体。该载体含有： 

(a)启动子； 

(b)多接头区域； 

(c)含有双链RNA的目标基因插入片段，该双链RNA包括有义部分和反义部分，其中该有义部分与目标基因反义链的一部分互补，该反义部分 与有义部分互补，使得该有义部分和反义部分退火，而且该双链RNA折回自身。 

许多启动子序列都可应用于本发明的MSCV逆转录病毒载体。这类启动子序列的一个具体例子是如下的U6启动子序列： 

ttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagtttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttgcctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccg(SEQ ID NO：7). 

另一个应用于本发明的启动子是H1启动子(SEQ ID NO：14)。 

此外，许多的多接头区域都可应用于本发明的MSCV逆转录病毒载体。具体例子包括，但当然不仅限于如下序列： 

(a)aattc gactggcacagcctccagg ttcaagaga cctggaggctgtgccagtc ttttt ggaa a(SEQ ID NO：1) 

(b)aattc gctgggactcctttgcatg ttcaagaga catgcaaaggagtcccagc ttttt ggaa a(SEQ ID NO：2)； 

(c)gatcc gactggcacagcctccagg ttcaagaga cctggaggctgtgccagtc ttttt ggaa a(SEQ ID NO：3)； 

(d)gatcc gctgggactcctttgcatg ttcaagaga catgcaaaggagtcccagc ttttt ggaa a(SEQ ID NO：4) 

(e)aattc gactccagtggtaatctac ttcaagaga gtagattaccactggagtc ttttt ggaa a(SEQ ID NO：5)；以及 

(f)gatcc gactccagtggtaatctac ttcaagaga gtagattaccactggagtc ttttt ggaa a(SEQ ID NO：6)， 

以上仅是举几个例子。 

本发明的MSCV逆转录病毒载体还可任选地包含报告基因，如Hygro、Puro、hrGFP、萤光素酶或eGFP-Puro融合蛋白。 

本发明的MSCV逆转录病毒载体的具体例子包括： 

(a)MSCV-U6-Hygro，它含有SEQ ID NO：10的核苷酸序列(图3)； 

(b)MSCV-U6-Puro，它含有SEQ ID NO：11的核苷酸序列(图4)；以及 

(c)MSCV-U6-hrGFP，它含有SEQ ID NO：12的核苷酸序列(图5)；以上仅是举几个例子。 

因此，本发明的一个方面是：提供一种具有基因目标插入片段的逆转录病毒载体，该插入片段可以折回自身而形成一双链体，其中该双链体的一条链是有义链，另一条链是反义链。当在细胞中加工该逆转录病毒载体时，该双链体从载体上被切下，而形成短的dsRNA，该短的dsRNA可作为干扰性RNA来调节目标基因的表达。 

本发明的另一个方面是提供一种逆转录病毒载体，其中目标基因插入片段之有义链与目标基因相同或高度同源，而该目标基因与某种具体疾病或病症相关。这种逆转录病毒载体可方便地用于治疗与该目标基因的表达相关的疾病或病症。 

本发明的又一个方面是提供一种被本发明的逆转录病毒载体感染的细胞。这种感染可以发生在体外(in vitro)、体内(in vivo)，或取体内细胞经体外感染后再输回体内(ex vivo)。这种感染的结果是，细胞基因组中目标基因的表达受到了调节，尤其是向下调节。 

本发明还有一个方面是提供一种用干扰性RNA调节细胞中目标基因的表达的方法。在这一方法中，细胞被本发明的逆转录病毒载体感染，所述载体含有目标基因插入片段，而该插入片段具有与目标基因相同或高度同源的有义链。 

通过参考下列附图和本发明的详细说明，将能更好地理解本发明的这些方面和其它方面。 

附图简述： 

图1：本发明的经修饰的慢病毒载体pLenti-U6-Blasti的核苷酸序列，它含有Blasti报告基因和U6启动子序列。在细胞被该病毒载体感染之前，可将调节特定基因的目标基因插入片段容易地插入此病毒载体的多接头。 

图2：本发明的经修饰的慢病毒载体pLenti-U6-hrGFP的核苷酸序列，它含有hrGFP报告基因和U6启动子序列。在细胞被病毒载体感染之前，可将调节特定基因的目标基因插入片段容易地插入此病毒载体的多接头。

图3：本发明的MSCV病毒载体MSCV-U6-Hygro的核苷酸序列，它含有Hygro报告基因和U6启动子序列。在细胞被病毒载体感染之前，可将调节特定基因的目标基因插入片段容易地插入此病毒载体的多接头。 

图4：本发明的MSCV病毒载体MSCV-U6-Puro的核苷酸序列，它含有Puro报告基因和U6启动子序列。在细胞被病毒载体感染之前，可将调节特定基因的目标基因插入片段容易地插入此病毒载体的多接头。 

图5：本发明的MSCV病毒载体MSCV-U6-hrGFP的核苷酸序列，它含有hrGFP报告基因和U6启动子序列。在细胞被病毒载体感染之前，可将调节特定基因的目标基因插入片段容易地插入此病毒载体的多接头。 

图6：本发明的含有GFP报告基因的经修饰的慢病毒示意图。(1)是目标基因插入片段，即折回自身的双链RNA。 

图7：将使用缺乏目标基因插入片段的本发明经修饰的慢病毒感染的细胞中p38的表达(对照)与具有这样的目标基因插入片段的本发明经修饰的慢病毒感染的细胞中p38的表达进行比较的Western印迹，其中所述目标基因插入片段设计为与该细胞之内源性p38基因的一部分互补。这一印迹结果清楚地显示，相对于在对照中的表达，本发明经修饰的慢病毒降低了p38的表达。 

发明详述： 

如上所解释，本发明可广义地延伸至一有用的、前所未知的逆转录病毒载体。它可用于将干扰性RNA递送入细胞，从而调节尤其是向下调节特定目标基因的表达。本发明的这一逆转录病毒载体包括： 

(a)启动子， 

(b)多接头区域，以及 

(c)含有双链RNA的目标基因特异性插入片段，该双链RNA包括有义部分和反义部分，其中该有义部分与目标基因反义链的一部分互补，该 反义部分则与该有义部分互补，使得该有义部分与反义部分退火，而且该双链RNA折回自身。 

在细胞内，折回自身的目标基因特异性插入片段被加工成短的dsRNA双链体，其有义链可用作干扰性RNA。所述干扰性RNA可调节、尤其是向下调节目标基因的表达。令人惊讶和出乎意料的是，用于感染细胞的本发明的逆转录病毒载体能在细胞终生向下调节目标基因的表达；与其相反的是，仅仅将裸siRNA插入细胞，裸siRNA通常只能在5-6天内向下调节目标基因的表达。 

由于本发明的逆转录病毒载体能够向下调节目标基因的表达，该逆转录病毒载体可用于治疗多种与特定目标基因的表达有关、或与含有突变或多态现象的特定目标基因的表达有关的疾病或病症。 

按照本发明，可以采用本技术领域内常规的分子生物学、微生物学，以及重组核酸分子技术。这类技术在文献中有详细的说明。例如，可参阅Sambrook，Fritsch&Maniatis，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，Second Edition(1989)Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(herein″Sambrook等人，，1989″)；DNA Cloning：APracticalApproach(DNA克隆：实用方法)，Volumes I and II(D.N.Glover ed.1985)；Oligonucleotide Synthesis(寡核苷酸合成)(M.J.Gait ed.1984)；Nucleic Acis  Hybridization(核酸杂交)[B.D.Hames&S.J.Higgins编著(1985)]；Transcription And Translation(转录与翻译)[B.D.Hames&S.J.Higgins，编著(1984)]；Animal Cell Culture(动物细胞培养)[R.I.Freshney，ed.(1986)]；Immobiliz ed Cells And Enzymes(固定的细胞和酶)[IRL Press，(1986)]；B.Perbal，APractical Guide ToMolecular Cloning(分子克隆实用指南)(1984)；F.M.Ausubel等人(编著)，Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学最新方法)，John Wiley&Sons，Inc.(1994). 

因此，以下术语若在本文中出现时将具有下述定义。 

“载体(vector)”是一种媒介，例如质粒、噬菌体、病毒或粘粒，用 于将基因材料导入细胞或有机体。 

“异源”核酸分子指的是非天然存在于细胞内、或细胞内染色体位点上的核酸分子。 

“核酸分子”或“核苷酸序列”可以互换使用，指的是核糖核苷(腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脱氧核糖核苷(脱氧酰苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或脱氧胞苷；“DNA分子”)的磷酸酯聚合物，或其任何磷酸酯类似物，例如硫代磷酸酯和硫酯，可以是单链的形式，也可以是双链螺旋的形式。双链DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋的形式也是可能的。 

在适当的温度和溶液离子强度条件下，当一单链形式的核酸分子退火至另一核酸分子上时(参阅上述Sambrook等)，则核酸分子“可杂交”至另一核酸分子，例如cDNA、基因组DNA、或RNA。该温度和离子强度条件决定了杂交的“严格度”。对于同源核酸分子的初步筛选，可使用对应于T_m为55℃的低严格杂交条件，例如，5x SSC，0.1％SDS，0.25％牛奶，而且无甲酰胺；或30％甲酰胺，5x SSC，0.5％SDS。中等严格杂交条件对应于较高的T_m，例如，40％甲酰胺和5x或6x SSC。高严格杂交条件对应于最高的T_m，例如，50％甲酰胺、5x或6x SSC。杂交要求两条核酸分子含有互补的序列，尽管取决于杂交的严格度，碱基之间不配对的情况还是可能的。核酸分子杂交的适当严格度取决于核酸分子的长度和互补程度，以及本技术领域内众所周知的变数。这两条核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高，含有这些序列的核酸杂交物的T_m值也就越大。核酸杂交的相对稳定性(对应于较高的T_m)按以下顺序递减：RNA:RNA，DNA:RNA，DNA:DNA。对于长度大于100个核苷酸的杂交物，已推导出了计算T_m的方程(参阅上述Sambrook等，9.50-0.51)。对于与较短的核酸分子即寡核苷酸的杂交，不配对的位置变得更为重要，而且寡核苷酸的长度决定了其特异性(参阅上述Sambrook等，11.7-11.8)。可杂交核酸分子的最短长度至少为约15个核苷酸；尤其是至少为约40个核苷酸；更特别地是至少为约30个核苷酸；更特别地是至少为约60个核苷酸，甚至更特别地是至少为100个核苷酸。 

此外，如本文中所用，术语“标准杂交条件”指的是T_m为55℃，同时 使用上述条件。在一优选的实施方案中，T_m为60℃；在一更优选的实施方案中，T_m为65℃。 

核酸分子“编码序列”或“有义链”是指真核基因组DNA分子中的核酸分子或其部分，它用一正确读框内遗传密码的密码子来编码多肽或多肽的一部分。在本技术领域内众所周知，下列密码子可互换使用以编码各种特定的氨基酸： 

苯丙氨酸(Phe或F)UUU或UUC 

亮氨酸(Leu或L)UUA或UUG或CUU或CUC或CUA或CUG 

异亮氨酸(Ile或I)AUU或AUC或AUA 

蛋氨酸(Met或M)AUG 

缬氨酸(Val或V)GUU或GUA的GUC或GUG 

丝氨酸(Ser或S)UCU或UCC或UCA或UCG或AGU或AGC 

脯氨酸(Pro或P)CCU或CCC或CCA或CCG 

苏氨酸(Thr或T)ACU或ACC或ACA或ACG 

丙氨酸(ALA或A)GCU或GCG或GCA或GCG 

酪氨酸(Tyr或Y)UAU或UAC 

组氨酸(His或H)CAU或CAC 

谷氨酰胺(Gln或Q)CAA或CAG 

天冬酰胺(Asn或N)AAU或AAC 

赖氨酸(Lys或K)AAA或AAG 

天冬氨酸(Asp或D)GAU或GAC 

谷氨酸(Glu或E)GAA或GAG 

半胱氨酸(Cys或C)UGU或UGC 

精氨酸(Arg或R)CGU或CGC或CGA或CGG或AGA或AGG 

甘氨酸(Gly或G)GGU或GGC或GGA或GGG 

色氨酸(Trp或W)UGG 

终止密码子UAA(赭石密码子)或UAG(琥珀密码子)或UGA(乳白密码子) 

应该理解的是，以上所定义的是RNA序列的密码子。其对应的DNA密码子含有取代U的T。 

如本文中所用，与核苷酸序列有关的术语“一部分”指的是上述序列的一部分，其长度至少为19个相邻的核苷酸，但比整个核苷酸序列的长度短。 

“启动子序列”或“启动子”是核酸分子的一个调控区域，它能在细胞内结合RNA聚合酶并启动下游(3’方向)编码序列的转录。在启动子序列内能发现转录启动位点(例如，可通过核酸酶S1作图法而方便地定义)，以及负责结合RNA聚合酶的蛋白质结合域(共有序列)。应用于本发明的一个具体启动子序列包括具有以下核苷酸序列的U6启动子序列： 

ttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagtttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttgcctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccg(SEQ ID NO：7) 

可用于本发明载体的启动子序列的另一例子是H1启动子(SEQ ID NO：14)。 

如本文中所用，术语“多接头”或“多接头区域”可互换使用，指的是被插入本发明的逆转录病毒载体的核苷酸序列，且含有多个针对特定限制酶的限制位点。因此，通过使用特定的限制酶，可将核苷酸序列插入本发明的病毒载体。可用于本发明的病毒载体的多接头的具体例子包括，但绝不限于： 

(a)aattc gactggcacagcctccagg ttcaagaga cctggaggctgtgccagtc ttttt ggaaa(SEQ ID NO：1) 

(b)aattc gctgggactcctttgcatg ttcaagaga catgcaaaggagtcccagc ttttt ggaaa(SEQ ID NO：2)； 

(c)gatcc gactggcacagcctccagg ttcaagaga cctggaggctgtgccagtc ttttt ggaa a(SEQ ID NO：3)； 

(d)gatcc gctgggactcctttgcatg ttcaagaga catgcaaaggagtcccagc ttttt ggaaa(SEQ ID NO：4) 

(e)aattc gactccagtggtaatctac ttcaagaga gtagattaccactggagtc ttttt ggaaa(SEQ ID NO：5)；以及 

(f)gatcc gactccagtggtaatctac ttcaagaga gtagattaccactggagtc ttttt ggaaa(SEQ ID NO：6) 

在本发明的一具体实施方案中，例如，经修饰的慢病毒逆转录病毒载体中，该多接头序列可含有AgeI限制位点和EcoRI限制位点，从而可插入如下所示的目标基因插入片段： 

AgeI  +1                      茎环             终止子 EcoRI 

CCGGT G(20个或20个以上碱基)TTCAAGAGA(21个碱基)TTTTT GGAA G 

A C(20个或20个以上碱基)AAGTTCTCT(21个碱基)AAAAA CCTT CTTAA 

该插入片段含有AgeI和EcoRI这两个限制性位点。上述“20个或20个以上碱基”可以是目标基因插入片段之双链核苷酸序列的反义链或有义链。自然，“21个碱基”也可以是有义链或反义链。但关键的是，这两条链互补并退火退火而使得该双链RNA折回自身。此外，上述插入片段中之9碱基茎环仅是一个例子，其它大小的茎环也可方便地应用于本发明。 

如本文中所用，术语“感染”指的是细胞受到本发明的逆转录病毒载体的污染，其中该细胞在其基因组内含有基因目标。因此，以具有适当目标基因插入片段的本发明的逆转录病毒载体感染细胞，将导致对被感染细胞内目标基因的表达的调节。 

如本文中所用，术语“调节”指的是改变被感染细胞内目标基因的正常表达。该术语尤其指的是，与该细胞被本发明的逆转录病毒载体感染之前的目标基因的表达量相比，被感染细胞目标基因的表达量的降低；或与未被感染的对照细胞的目标基因的表达量相比，被感染细胞目标基因的表达量的降低。 

逆转录病毒载体

如上所述，本发明延伸至将目标基因特异性插入片段导入细胞以改变目标基因表达的逆转录病毒载体，该载体包含： 

(a)启动子； 

(b)多接头区域； 

(c)含有双链RNA的目标基因特异性插入片段，该双链RNA包括有义部分和反义部分，其中该有义部分与目标基因反义链的一部分互补，该反义部分则与该有义部分互补，使得该有义部分与反义部分退火，而且该双链RNA折回自身。 

逆转录病毒是感染分裂细胞的整合病毒。逆转录病毒基因组包括两个LTR、一个包装序列和三个编码区域(gag、pol和env)。应用于本发明的逆转录病毒的具体例子包括、但绝不限于HIV、MoMuLV(莫洛尼鼠白血病病毒)、MSV(莫洛尼鼠肉瘤病毒)、HaSV(哈威肉瘤病毒)、SNV(脾坏死病毒)、RSV(劳氏肉瘤病毒)、弗兰德(Friend)病毒、以及如WO95/02697专利所公开的缺陷型逆转录病毒载体。该专利全文系作为参考引述在此。 

一般而言，为了构建含有核酸序列的重组逆转录病毒，须构建含有核酸序列的质粒。在本发明的情况下，该核酸序列是含有如上所述目标基因特异性插入片段和多接头区域的RNA序列。该RNA序列还可任选地含有编码报告蛋白质的核酸。然后，这种构建被用于转染一包装细胞株，该细胞株能够反式提供该质粒所缺乏的逆转录病毒功能。一般而言，该包装细胞株从而能够表达gag、pol和env基因。这类包装细胞株在现有技术中已有所叙述，尤其是细胞株PA317(US4,861,719)；PsiCRIP细胞株(WO90/02806)以及GP+envAm-12细胞株(WO89/07150)。在构建之后，本发明的逆转录病毒载体可通过本技术领域内一般技术人员所熟知的标准技术予以纯化。下文提供了关于本发明的逆转录病毒载体构建的详细叙述。 

可用于本发明的逆转录病毒载体的一种特殊类型的逆转录病毒是经修饰的慢病毒，它能感染有丝分裂后细胞和/或非分裂细胞。这类细胞可以在肝脏和肌肉神经元内找到。在本发明的经修饰的慢病毒载体中，慢病毒的 内源性CMV启动子已被去除，而且REV元件被插入了该病毒。 

可用于本发明的逆转录病毒载体的另一种逆转录病毒是鼠干细胞病毒(MSCV)。 

通过感染、转染或转化导入本发明的逆转录病毒载体

本发明进一步延伸至被本发明的逆转录病毒载体感染的细胞，该被感染的细胞在其基因组内含有目标基因。因此，用本发明逆转录病毒载体感染的细胞可调节、尤其是降低细胞内目标基因的表达。这种感染可以发生在体外(in vitro)、体内(in vivo)，或取体内细胞经体外感染后再输回体内(exvivo)。许多类型的细胞均可被本发明的逆转录病毒载体感染。例如，这样的细胞可以是原核细胞或真核细胞，例如，大肠杆菌类细胞如E.Coli，酵母细胞或哺乳动物细胞。此外，这样的细胞可获自生物样品，诸如头发或皮肤之类的样品或诸如血液、唾液或精液之类的体液等。但是，如上所述，重要的是该细胞在其基因组内含有目标基因。 

使用本发明的逆转录病毒载体进行细胞的转化和转染时，可以任选地采用常规实验室技术。这些技术包括，例如转染、电穿孔、显微注射、转导、细胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸钙沉淀、脂质转染(溶酶体融合)、使用基因枪或DNA载体输送蛋白(参阅如，Wu等人，1992，J.Biol.Chem.267：963-967；Wu和Wu，1988，J.Biol.Chem.263：14621-14624；Hartmut等人，加拿大专利申请号2,012,311，1990年3月15日申请)。 

自然，转染或转化也可以在体内发生。例如，本发明的逆转录病毒载体可以通过脂质转染而导入体内。脂质体已被用于在体外进行核酸的包装和转染。某些合成的阳离子脂质是专为限制脂质体介导的转染所遭遇的困难和危险而设计的。它们可用于制备在体内转染本发明的逆转录病毒载体的脂质体。这些阳离子脂类的应用可促进带负电核酸的包装，也能促进与带负电细胞膜的融合[Felgner和Ringold，Science 337：387-388(1989)]。为了将本发明的逆转录病毒载体导入特定的器官而使用体内脂质转染，具有一定的实用方面的优越性。脂质体能在分子水平上靶向特定的细胞就是一 方面的好处。很明显，针对特定细胞类型的转染，对于具有细胞异质性的器官，例如胰脏、肝脏、肾脏以及大脑等器官将是特别有益的。尤其是，这样的针对性转染对于本发明的经修饰的慢病毒载体是特别有用的，因为慢病毒能够感染可在肝脏和肌肉神经元内存在的有丝分裂后细胞和/或非分裂细胞。 

含有本发明逆转录病毒载体的药物组合物

本发明还可延伸至药物组合物，其含有本发明的逆转录病毒载体以及用于导入本发明的逆转录病毒载体的可药用载体。如本文中所用，术语“可药用”指的是生理上可容忍的而且通常不会产生过敏或类似不利反应如反胃、头晕等现象的分子成分和组合物。优选地，如本文中所用，术语“可药用”意思是经联邦或州政府的监管机构批准或在美国药典或其它公认的药典中所列出可用于动物、尤其是人类的物质。术语“载体(carrier)”指的是与该化合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂、或运载体。这种药学载体可以是无菌的液体，例如水和油，包括那些来自石油、动物，植物或合成途径的油，例如花生油、豆油、矿物油、芝麻油等。水或水溶液、盐水溶液以及葡萄糖和甘油的水溶液，是作为载体的首选，尤其是当用于注射时。“雷氏药学大全”(E.W.Martin：Remington’s Pharmaceutical Sciences)叙述了某些适宜的药学载体。 

本发明的药物组合物可通过注射或口服、或经由肺部、鼻腔或其它各种方式施用，而且可包括含有多种缓冲成分(如Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)和具有多种pH值和离子强度的稀释剂；添加剂，例如洗涤剂和增溶剂(如吐温80、多乙氧基醚(Polysorbate 80))；抗氧化剂(如抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠)；防腐剂(如硫柳汞、苯甲醇)以及填充物质(如乳糖、甘露醇)；包括将该物质掺入聚合化合物如聚乳酸、聚甘醇酸等的颗粒制剂，或掺入脂质体。还可以使用醛醣酸(hylauronic acid)。这样的药物组合物可能会影响物理状态、稳定性，以及在体内释放的速率。可参阅例如“雷氏药学大全”(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，第18版(1990，Mack Publishing Co.， Easton，PA 18042)，p1435-p1712，其作为参考引述在此。该药物组合物可制成液体的形式，也可制成干粉，例如冻干的形式。 

通过参考以下非限制性实施例，将能更好地理解本发明。这些实施例是作为本发明的示范而提供的。举出以下实施例是为了更充分地说明本发明一些优选的实施方案。然而，它绝不应被解释为是限制本发明的广阔范围。 

实施例 

将shRNA克隆入名为LUG的慢病毒载体内： 

首先，获得发夹状短核苷酸序列之上段链和下段链(21碱基的有义链、9碱基的茎环以及21碱基的反义链)。可以自行制备或购自寡核苷酸供应商。然后，将这两种链置于96孔板的同一孔内。 

然后，将上述的链50pmol/ul进行退火，并将0.05pmole退火后的链用于连接。寡核苷酸的上段链和下段链在96孔板的同一孔内被结合在一起。所有过程都是以96孔板高产模式进行的。 

为了进行该退火反应，将5μl寡核苷酸混合物加入45μl退火混合物(40μl水+5μl NEB缓冲液2)。将该混合物在热循环仪内加热至98℃2分钟，再在实验桌上冷却至少2小时进行退火。然后将退火后的寡核苷酸稀释至1∶100，再将1μl稀释的退火后寡核苷酸即目标基因插入片段的双链DNA连接入逆转录病毒载体主链的多接头区域(预先用AgeI和EcoRI切割)。该连接过程于4℃温度下持续过夜。取2μl连接产物用于转化40μl的SURE细胞(Stratagene)，将转化物在12孔的卡比西林(carbenicillin)(50微克/毫升)栅板上培养。于第二天，将菌落挑入超级汤-卡比西林(50微克/毫升)并送去进行HTP测序。然后小量制备该培养液并进行测序。测序后，大量制备阳性培养液以提供制备病毒用的DNA。 

在293FT细胞内产生经修饰的慢病毒： 

转染步骤： 

在转染前一天，进行293FT细胞的胰蛋白酶化和细胞计数，在每个10厘 米培养皿内涂布5×10⁶个细胞。将细胞置于10毫升含血清的生长培养基中。 

在转染当天，除去293FT细胞的培养基并代之以5毫升含血清的生长培养基(或含血清的Opti-MEM 

I培养基)。不得含有抗生素。 

按照以下步骤为每个转染样品制备DNA-Lipofectamine Z 2000复合体： 

·将9微克优化的包装混合物和3微克pLenti表达质粒DNA(总共12微克)稀释于1.5毫升不含血清的Opti-MEM 

I培养液中。轻轻地混合。 

·在使用前轻轻地混合Lipofectamine 2000试剂，然后取36μl稀释于1.5毫升不含血清的Opti-MEM I培养液中。轻轻地混合且在室温下培养5分钟。 

·培养5分钟后，将稀释的DNA与稀释的Lipofectamine 2000试剂合并。轻轻地混合。 

·在室温下培养20分钟，以形成DNA-Lipofectamine 2000复合体。该溶液可能会呈现浑浊，但这并不妨碍转染。 

4.将DNA-Lipofectamine 2000复合体滴加入每个培养皿内。来回摇晃该培养皿使其轻轻地混合。在CO₂培养箱内于37℃培养该细胞过夜。 

5.次日，除去含有DNA-Lipofectamine 2000复合体的培养液，而代之以完全培养基[即含有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、0.1mM MEM非必需氨基酸以及1％青霉素(penicillin)/链霉素(streptomycin)的D-MEM]。 

熟悉此项技术者应该注意到，VSV G糖蛋白的表达引起了293FT细胞的融合，从而导致了多核融合细胞的出现。这种形态上的改变是正常的，且不会影响慢病毒的产生。还应注意的是，在实现本发明的过程中，你所接触的是具有感染性的材料。 

6.在转染后48至72小时期间，将培养液移入15毫升无菌、加盖的锥形管内，以获取含有病毒的上清液。无论上清液是在转染后48小时还是72小时收集的，所能观察到的病毒产率方面的区别极小。 

7.于+4℃以3000转/分钟离心15分钟以沉淀细胞碎片。 

8.必要时可进行过滤。 

9.吸取病毒上清液置于1毫升试剂瓶内。将病毒储备液储存于-80℃。 

在GP2-293细胞内产生MSCV： 

在含有10％FBS、100微克/毫升链霉素及100单位/毫升青霉素G的DMEM完全培养液中培养细胞。 

从冷冻储备液繁殖细胞：

1.在37℃水浴中解冻试样瓶。 

2.将细胞转入盛有9毫升经预热的完全培养液的离心管。 

3.以每分钟1500转离心5分钟。 

4.移去上清液。 

5.仔细地将细胞重新悬浮在10毫升完全培养液中，并置于包被有多聚-D-赖氨酸的10厘米培养皿内。 

6.在37℃与5％CO₂条件下培养细胞。 

在第一个星期内可使用包被有多聚-D-赖氨酸的培养皿，以促进解冻后的粘附。随后，可以在常规的培养皿内培养细胞。 

培养包装细胞

1.吸取培养液，用经预热的PBS洗涤细胞一次。 

2.于培养皿内加1毫升胰蛋白酶-EDTA。培养30秒钟至1分钟。 

3.再加4毫升完全培养液以抑制胰蛋白酶。 

4.用吸移管将培养液吸起、放下多次，使细胞重新悬浮。 

5.将1毫升细胞移到含有9毫升完全培养液的10厘米培养皿内。 

每过三天当细胞密度达80％时应该按1∶5比例将细胞分开。此外，细胞的胰蛋白酶化不应过度，因为其结果将使细胞趋于结块而且不能涂得很均匀。再者，切勿让细胞过分密集，因为这将影响它们的包装能力，传了40代以后的细胞不应再使用，因为它们的滴度被降低了。 

GP2-293细胞的感染：

第1天：(下午3时左右) 

在每个10厘米培养皿内放置3-3.9×10⁶个细胞(使用包被有多聚-D-赖氨 酸的培养皿)。 

第2天：(中午12时左右) 

在感染前4小时，用10毫升新鲜培养液(无抗生素)再次培养细胞。 

转染方法1(磷酸钙/HBS)

1.每转染一块10厘米培养皿，使用12微克表达载体(pMK0.1)(DNA1)和12微克VSV-G质粒(DNA2)。 

2.在一支试管内加入： 

12微克DNA1 

12微克DNA2 

本发明的逆转录病毒载体可作为dsDNA载体而存在，使它可在例如质粒内增殖。但是，当它被包装后，它是一种逆转录病毒，而且感染将导致病毒核蛋白核体(主要由gag衍生的蛋白质、RNA载体以及反转录酶蛋白质组成)的注入。反转录酶将本发明的逆转录病毒载体转化回DNA，并让它稳定地整合入已感染细胞的基因组内。而且，此被整合的(或瞬时转染的)DNA载体用作RNA聚合酶III的模板，它与U6启动子结合并从克隆进该载体的shDNA转录shRNA。上述DNA1是DNA载体(以递送shRNA)，而DNA2是包装质粒。 

水 

2M CaCl₂ 62μl 

总体积500μl 

3.在另一支试管内，加入500μl的2X HBS。 

4.在以涡旋方式混合的同时，以滴加方式将2X HBS加入此DNA/CaCl₂ 混合物。 

5.在室温下培养20分钟。 

6.轻轻地以涡旋方式混合此DNA/CaCl₂混合物。 

7.用吸移管以滴加方式将该混合物加至包装细胞。 

8.来回摇晃该培养皿以使溶液分布均匀。 

9.在37℃与5％CO₂条件下培养细胞。 

转染方法2(Lipofectamine 2000)

1.每转染一个10厘米培养皿，使用6微克表达载体(pMK0.1)和6微克VSV-G质粒。 

2.在一支试管内加入DNA。 

3.吸取Lipofectamine 200072μl，加入另一支试管内的1.5毫升无血清培养液(Optimem)。 

4.轻轻地混合。在室温下培养5分钟。 

5.将该Lipofecatamine/Optimem混合物加入DNA，轻轻地混合。 

6.在室温下培养15分钟。 

7.用吸移管以滴加方式将此DNA/Lipo/Optimem混合物加至包装细胞。 

8.来回摇晃该培养皿以使溶液分布均匀。 

9.在37℃与5％CO₂条件下培养细胞。 

勿让该转染复合体在细胞上滞留超过16个小时。 

第3天：(上午) 

1.吸取培养液。 

2.用经预热的PBS轻轻地洗涤细胞一次。 

3.按每个10厘米培养皿加5毫升完全培养液，以浓缩该病毒上清液。 

4.在37℃与5％CO₂条件下培养细胞。 

第4天：(上午) 

1.收集培养液，并以0.45微米针筒过滤器加以过滤。 

2.分装该病毒，储存于-80℃。 

3.用5毫升完全培养液再次培养细胞。 

这就是所谓的“24小时病毒上清液”。24小时后从包装细胞株收集的病毒则为24小时病毒上清液。 

第5天：(上午) 

1.收集培养液，并以0.45微米针筒过滤器加以过滤。 

2.分装该病毒，储存于-80℃。 

3.将该培养皿丢弃。 

这就是所谓的“48小时病毒上清液”。48小时后从包装细胞株收集的病 毒则为48小时病毒上清液。 

对于亲嗜性病毒，则包装在EcoPack包装细胞株内。对于AN双嗜性病毒，则包装在AmphoPack包装细胞株内。对于多嗜性病毒，则包装在GP2-293包装细胞内(共转染病毒载体与VSV-G表达质粒) 

结果

利用上述操作制备本发明的逆转录病毒载体，再用本发明的逆转录病毒载体来感染基因组内具有目标基因的细胞，成功地降低了该目标基因的表达。尤其是，使用了针对p38的目标基因插入片段，用于此目标基因插入片段的序列如下： 

CCGGTGCAGGAGTTGAACAAGACAATACCTGATTGTCTTGTTCA 

GCTCCTGCTTTTTGGAAG(SEQ ID NO：13). 

图7清楚地显示，本发明的经修饰的慢病毒具有SEQ ID NO：13的双链RNA的目标基因插入片段，它是设计用来干扰细胞中p38的表达；相对于对照细胞中p38的表达，它明显地降低了细胞中p38的表达。 

本发明的范围不受本文中所述诸具体实施方案的限制。确实，对于本技术领域内熟悉此项技术者来说，除了以上已经说明的内容以外，对本发明的各种修改也将通过以上说明及附图而变得显而易见。这类修改应属于所附的专利权要求范围之内。 

应进一步理解的是，以上所提供的核酸或多肽的所有碱基或氨基酸的长度，以及所有的分子重量或分子质量的值，均是近似的，而且仅为说明的目的而提供。 

此处引用了多种出版物，其公开的内容是作为整体而引述在此。 

序列表

<110>安万特药物公司

 

<120>用于递送干扰性RNA的逆转录病毒载体

 

<130>USAV2002/0187 PCT

 

<140>未获得

<141>2004-10-22

 

<150>60/513,313

<151>2003-10-22

 

<160>14

 

<170>PatentIn版本3.2

 

<210>1

<211>62

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>多接头序列

 

<400>1

aattcgactg gcacagcctc caggttcaag agacctggag gctgtgccag tctttttgga    60

aa                                                                   62

 

<210>2

<211>62

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>多接头序列

 

<400>2

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aa                                                                   62

<210>3

<211>62

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>多接头序列

 

<400>3

gatccgactg gcacagcctc caggttcaag agacctggag gctgtgccag tctttttgga    60

aa                                                                   62

 

<210>4

<211>62

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>多接头序列

 

<400>4

gatccgctgg gactcctttg catgttcaag agacatgcaa aggagtccca gctttttgga    60

aa                                                                   62

 

<210>5

<211>62

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>多接头序列

 

<400>5

aattcgactc cagtggtaat ctacttcaag agagtagatt accactggag tctttttgga    60

aa                                                                   62

 

<210>6

<211>62

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>多接头序列

 

<400>6

gatccgactc cagtggtaat ctacttcaag agagtagatt accactggag tctttttgga    60

aa                                                                   62

 

<210>7

<211>241

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>U6启动子序列

 

<400>7

ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag ataattagaa   60

ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga aagtaataat  120

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g                                                                  241

 

<210>8

<211>6498

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>经修饰的慢病毒(pLenti-U6-Blasti)

 

<400>8

aatgtagtct tatgcaatac tcttgtagtc ttgcaacatg gtaacgatga gttagcaaca   60

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attaatttga ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata cgtgacgtag aaagtaataa    1920

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cgtaacttga aagtatttcg atttcttggc tttatatatc ttgtggaaag gacgaaacac    2040

cgaattcacc ggtcggttag taatgagttt ggaattaatt ctgtggaatg tgtgtcagtt    2100

agggtgtgga aagtccccag gctccccagg caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca    2160

attagtcagc aaccaggtgt ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga agtatgcaaa    2220

gcatgcatct caattagtca gcaaccatag tcccgcccct aactccgccc atcccgcccc    2280

taactccgcc cagttccgcc cattctccgc cccatggctg actaattttt tttatttatg    2340

cagaggccga ggccgcctct gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg    2400

gaggcctagg cttttgcaaa aagctcccgg gagcttgtat atccattttc ggatctgatc    2460

agcacgtgtt gacaattaat catcggcata gtatatcggc atagtataat acgacaaggt    2520

gaggaactaa accatggcca agcctttgtc tcaagaagaa tccaccctca ttgaaagagc    2580

aacggctaca atcaacagca tccccatctc tgaagactac agcgtcgcca gcgcagctct    2640

ctctagcgac ggccgcatct tcactggtgt caatgtatat cattttactg ggggaccttg    2700

tgcagaactc gtggtgctgg gcactgctgc tgctgcggca gctggcaacc tgacttgtat    2760

cgtcgcgatc ggaaatgaga acaggggcat cttgagcccc tgcggacggt gccgacaggt    2820

gcttctcgat ctgcatcctg ggatcaaagc catagtgaag gacagtgatg gacagccgac    2880

ggcagttggg attcgtgaat tgctgccctc tggttatgtg tgggagggct aagcacaatt    2940

cgagctcggt acctttaaga ccaatgactt acaaggcagc tgtagatctt agccactttt    3000

taaaagaaaa ggggggactg gaagggctaa ttcactccca acgaagacaa gatctgcttt    3060

ttgcttgtac tgggtctctc tggttagacc agatctgagc ctgggagctc tctggctaac    3120

tagggaaccc actgcttaag cctcaataaa gcttgccttg agtgcttcaa gtagtgtgtg    3180

cccgtctgtt gtgtgactct ggtaactaga gatccctcag acccttttag tcagtgtgga    3240

aaatctctag cagtagtagt tcatgtcatc ttattattca gtatttataa cttgcaaaga    3300

aatgaatatc agagagtgag aggaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa    3360

gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt    3420

tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg tctggctcta gctatcccgc ccctaactcc    3480

gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc cgcccattct ccgccccatg gctgactaat    3540

tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc ctcggcctct gagctattcc agaagtagtg    3600

aggaggcttt tttggaggcc tagggacgta cccaattcgc cctatagtga gtcgtattac    3660

gcgcgctcac tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa    3720

cttaatcgcc ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc    3780

accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg aatgggacgc gccctgtagc    3840

ggcgcattaa gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc    3900

gccctagcgc ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt    3960

ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac    4020

ctcgacccca aaaaacttga ttagggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag    4080

acggtttttc gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa    4140

actggaacaa cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg atttataagg gattttgccg    4200

atttcggcct attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattttaac    4260

aaaatattaa cgcttacaat ttaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta    4320

tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat    4380

aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc    4440

ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga    4500

aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca    4560

acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt    4620

ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg    4680

gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc    4740

atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata    4800

acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt    4860

tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag    4920

ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca    4980

aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg    5040

aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg    5100

ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag    5160

atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg    5220

aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag    5280

accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga    5340

tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt    5400

tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc    5460

tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc    5520

cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac    5580

caaatactgt tcttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac    5640

cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt    5700

cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct    5760

gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat  5820

acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt  5880

atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg  5940

cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt  6000

gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt  6060

tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg  6120

tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg  6180

agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc  6240

ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg  6300

gcagtgagcg caacgcaatt aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac  6360

actttatgct tccggctcgt atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag  6420

gaaacagcta tgaccatgat tacgccaagc gcgcaattaa ccctcactaa agggaacaaa  6480

agctggagct gcaagctt                                                6498

 

<210>9

<211>6702

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>经修饰的慢病毒(pLenti-U6-hrGFP)

 

<400>9

aatgtagtct tatgcaatac tcttgtagtc ttgcaacatg gtaacgatga gttagcaaca   60

tgccttacaa ggagagaaaa agcaccgtgc atgccgattg gtggaagtaa ggtggtacga  120

tcgtgcctta ttaggaaggc aacagacggg tctgacatgg attggacgaa ccactgaatt  180

gccgcattgc agagatattg tatttaagtg cctagctcga tacataaacg ggtctctctg  240

gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc  300

tcaataaagc ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg     360

taactagaga tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca gtggcgcccg     420

aacagggact tgaaagcgaa agggaaacca gaggagctct ctcgacgcag gactcggctt     480

gctgaagcgc gcacggcaag aggcgagggg cggcgactgg tgagtacgcc aaaaattttg     540

actagcggag gctagaagga gagagatggg tgcgagagcg tcagtattaa gcgggggaga     600

attagatcgc gatgggaaaa aattcggtta aggccagggg gaaagaaaaa atataaatta     660

aaacatatag tatgggcaag cagggagcta gaacgattcg cagttaatcc tggcctgtta     720

gaaacatcag aaggctgtag acaaatactg ggacagctac aaccatccct tcagacagga     780

tcagaagaac ttagatcatt atataataca gtagcaaccc tctattgtgt gcatcaaagg     840

atagagataa aagacaccaa ggaagcttta gacaagatag aggaagagca aaacaaaagt     900

aagaccaccg cacagcaagc ggccgctgat cttcagacct ggaggaggag atatgaggga     960

caattggaga agtgaattat ataaatataa agtagtaaaa attgaaccat taggagtagc    1020

acccaccaag gcaaagagaa gagtggtgca gagagaaaaa agagcagtgg gaataggagc    1080

tttgttcctt gggttcttgg gagcagcagg aagcactatg ggcgcagcgt caatgacgct    1140

gacggtacag gccagacaat tattgtctgg tatagtgcag cagcagaaca atttgctgag    1200

ggctattgag gcgcaacagc atctgttgca actcacagtc tggggcatca agcagctcca    1260

ggcaagaatc ctggctgtgg aaagatacct aaaggatcaa cagctcctgg ggatttgggg    1320

ttgctctgga aaactcattt gcaccactgc tgtgccttgg aatgctagtt ggagtaataa    1380

atctctggaa cagatttgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa    1440

ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga    1500

acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa    1560

ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat    1620

agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt    1680

tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg    1740

tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtaatcgat    1800

tttcccatga ttccttcata tttgcatata cgatacaagg ctgttagaga gataattaga    1860

attaatttga ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata cgtgacgtag aaagtaataa    1920

tttcttgggt agtttgcagt ttttaaaatt atgttttaaa atggactatc atatgcttac    1980

cgtaacttga aagtatttcg atttcttggc tttatatatc ttgtggaaag gacgaaacac    2040

cgaattcacc ggtcggttag taatgagttt ggaattaatt ctgtggaatg tgtgtcagtt    2100

agggtgtgga aagtccccag gctccccagg caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca    2160

attagtcagc aaccaggtgt ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga agtatgcaaa    2220

gcatgcatct caattagtca gcaaccatag tcccgcccct aactccgccc atcccgcccc    2280

taactccgcc cagttccgcc cattctccgc cccatggctg actaattttt tttatttatg    2340

cagaggccga ggccgcctct gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg    2400

gaggcctagg cttttgcaaa aagctcccgg gatggtgagc aagcagatcc tgaagaacac    2460

cggcctgcag gagatcatga gcttcaaggt gaacctggag ggcgtggtga acaaccacgt    2520

gttcaccatg gagggctgcg gcaagggcaa catcctgttc ggcaaccagc tggtgcagat    2580

ccgcgtgacc aagggcgccc ccctgccctt cgccttcgac atcctgagcc ccgccttcca    2640

gtacggcaac cgcaccttca ccaagtaccc cgaggacatc agcgacttct tcatccagag    2700

cttccccgcc ggcttcgtgt acgagcgcac cctgcgctac gaggacggcg gcctggtgga    2760

gatccgcagc gacatcaacc tgatcgagga gatgttcgtg taccgcgtgg agtacaaggg    2820

ccgcaacttc cccaacgacg gccccgtgat gaagaagacc atcaccggcc tgcagcccag    2880

cttcgaggtg gtgtacatga acgacggcgt gctggtgggc caggtgatcc tggtgtaccg    2940

cctgaacagc ggcaagttct acagctgcca catgcgcacc ctgatgaaga gcaagggcgt    3000

ggtgaaggac ttccccgagt accacttcat ccagcaccgc ctggagaaga cctacgtgga    3060

ggacggcggc ttcgtggagc agcacgagac cgccatcgcc cagctgacca gcctgggcaa    3120

gcccctgggc agcctgcacg agtgggtgta aggtaccttt aagaccaatg acttacaagg    3180

cagctgtaga tcttagccac tttttaaaag aaaagggggg actggaaggg ctaattcact    3240

cccaacgaag acaagatctg ctttttgctt gtactgggtc tctctggtta gaccagatct    3300

gagcctggga gctctctggc taactaggga acccactgct taagcctcaa taaagcttgc    3360

cttgagtgct tcaagtagtg tgtgcccgtc tgttgtgtga ctctggtaac tagagatccc    3420

tcagaccctt ttagtcagtg tggaaaatct ctagcagtag tagttcatgt catcttatta    3480

ttcagtattt ataacttgca aagaaatgaa tatcagagag tgagaggaac ttgtttattg    3540

cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt    3600

tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat catgtctggc    3660

tctagctatc ccgcccctaa ctccgcccat cccgccccta actccgccca gttccgccca    3720

ttctccgccc catggctgac taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc    3780

ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga ggcctaggga cgtacccaat    3840

tcgccctata gtgagtcgta ttacgcgcgc tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac    3900

tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc    3960

tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat    4020

ggcgaatggg acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc    4080

agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc    4140

tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg    4200

ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca    4260

cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc    4320

tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc ggtctattct    4380

tttgatttat aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa    4440

caaaaattta acgcgaattt taacaaaata ttaacgctta caatttaggt ggcacttttc    4500

ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc    4560

cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga    4620

gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt    4680

ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag    4740

tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag    4800

aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta    4860

ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg    4920

agtactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca    4980

gtgctgccat aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag    5040

gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc    5100

gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg    5160

tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc    5220

ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg    5280

cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg    5340

gtatcattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga    5400

cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac    5460

tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa    5520

aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca    5580

aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag    5640

gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac    5700

cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa    5760

ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc    5820

accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag  5880

tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac  5940

cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc  6000

gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc  6060

ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca  6120

cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc  6180

tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg  6240

ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct  6300

ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata  6360

ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc  6420

gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcacg  6480

acaggtttcc cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgtg agttagctca  6540

ctcattaggc accccaggct ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg tgtggaattg  6600

tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gctatgacca tgattacgcc aagcgcgcaa  6660

ttaaccctca ctaaagggaa caaaagctgg agctgcaagc tt                     6702

 

<210>10

<211>7244

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>MSCV载体(MSCV-U6-Hygro)

 

<400>10

tgaaagaccc cacctgtagg tttggcaagc tagcttaagt aacgccattt tgcaaggcat     60

ggaaaataca taactgagaa tagagaagtt cagatcaagg ttaggaacag agagacagca    120

gaatatgggc caaacaggat atctgtggta agcagttcct gccccggctc agggccaaga    180

acagatggtc cccagatgcg gtcccgccct cagcagtttc tagagaacca tcagatgttt    240

ccagggtgcc ccaaggacct gaaatgaccc tgtgccttat ttgaactaac caatcagttc    300

gcttctcgct tctgttcgcg cgcttctgct ccccgagctc aataaaagag cccacaaccc    360

ctcactcggc gcgccagtcc tccgatagac tgcgtcgccc gggtacccgt attcccaata    420

aagcctcttg ctgtttgcat ccgaatcgtg gactcgctga tccttgggag ggtctcctca    480

gattgattga ctgcccacct cgggggtctt tcatttggag gttccaccga gatttggaga    540

cccctgccca gggaccaccg acccccccgc cgggaggtaa gctggccagc ggtcgtttcg    600

tgtctgtctc tgtctttgtg cgtgtttgtg ccggcatcta atgtttgcgc ctgcgtctgt    660

actagttagc taactagctc tgtatctggc ggacccgtgg tggaactgac gagttctgaa    720

cacccggccg caaccctggg agacgtccca gggactttgg gggccgtttt tgtggcccga    780

cctgaggaag ggagtcgatg tggaatccga ccccgtcagg atatgtggtt ctggtaggag    840

acgagaacct aaaacagttc ccgcctccgt ctgaattttt gctttcggtt tggaaccgaa    900

gccgcgcgtc ttgtctgctg cagcgctgca gcatcgttct gtgttgtctc tgtctgactg    960

tgtttctgta tttgtctgaa aattagggcc agactgttac cactccctta agtttgacct   1020

taggtcactg gaaagatgtc gagcggatcg ctcacaacca gtcggtagat gtcaagaaga   1080

gacgttgggt taccttctgc tctgcagaat ggccaacctt taacgtcgga tggccgcgag   1140

acggcacctt taaccgagac ctcatcaccc aggttaagat caaggtcttt tcacctggcc   1200

cgcatggaca cccagaccag gtcccctaca tcgtgacctg ggaagccttg gcttttgacc   1260

cccctccctg ggtcaagccc tttgtacacc ctaagcctcc gcctcctctt cctccatccg   1320

ccccgtctct cccccttgaa cctcctcgtt cgaccccgcc tcgtatcctc cctttatcca   1380

gccctcactc cttctctagg cgccggaatt agatctttcc catgattcct tcatatttgc   1440

atatacgata caaggctgtt agagagataa ttagaattaa tttgactgta aacacaaaga   1500

tattagtaca aaatacgtga cgtagaaagt aataatttct tgggtagttt gcagttttta   1560

aaattatgtt ttaaaatgga ctatcatatg cttaccgtaa cttgaaagta tttcgatttc    1620

ttggctttat atatcttgtg gaaaggacga aacacctctg aggttaacgg atccgcggcc    1680

gcacgcgtgt taacgaattc taccgggtag gggaggcgct tttcccaagg cagtctggag    1740

catgcgcttt agcagccccg ctgggcactt ggcgctacac aagtggcctc tggcctcgca    1800

cacattccac atccaccggt aggcgccaac cggctccgtt ctttggtggc cccttcgcgc    1860

caccttctac tcctccccta gtcaggaagt tcccccccgc cccgcagctc gcgtcgtgca    1920

ggacgtgaca aatggaagta gcacgtctca ctagtctcgt gcagatggac agcaccgctg    1980

agcaatggaa gcgggtaggc ctttggggca gcggccaata gcagctttgc tccttcgctt    2040

tctgggctca gaggctggga aggggtgggt ccgggggcgg gctcaggggc gggctcaggg    2100

gcggggcggg cgcccgaagg tcctccggag gcccggcatt ctgcacgctt caaaagcgca    2160

cgtctgccgc gctgttctcc tcttcctcat ctccgggcct ttcgacctgc atcccgccac    2220

catgaaaaag cctgaactca ccgcgacgtc tgtcgagaag tttctgatcg aaaagttcga    2280

cagcgtctcc gacctgatgc agctctcgga gggcgaagaa tctcgtgctt tcagcttcga    2340

tgtaggaggg cgtggatatg tcctgcgggt aaatagctgc gccgatggtt tctacaaaga    2400

tcgttatgtt tatcggcact ttgcatcggc cgcgctcccg attccggaag tgcttgacat    2460

tggggaattc agcgagagcc tgacctattg catctcccgc cgtgcacagg gtgtcacgtt    2520

gcaagacctg cctgaaaccg aactgcccgc tgttctgcag ccggtcgcgg aggccatgga    2580

tgcgatcgct gcggccgatc ttagccagac gagcgggttc ggcccattcg gaccgcaagg    2640

aatcggtcaa tacactacat ggcgtgattt catatgcgcg attgctgatc cccatgtgta    2700

tcactggcaa actgtgatgg acgacaccgt cagtgcgtcc gtcgcgcagg ctctcgatga    2760

gctgatgctt tgggccgagg actgccccga agtccggcac ctcgtgcacg cggatttcgg    2820

ctccaacaat gtcctgacgg acaatggccg cataacagcg gtcattgact ggagcgaggc    2880

gatgttcggg gattcccaat acgaggtcgc caacatcttc ttctggaggc cgtggttggc    2940

ttgtatggag cagcagacgc gctacttcga gcggaggcat ccggagcttg caggatcgcc    3000

gcggctccgg ggcgtatatg ctccgcattg gtcttgacca actctatcag agcttggttg    3060

acggcaattt cgatgatgca gcttgggcgc agggtcgatg cgacgcaatc gtccgatccg    3120

gagccgggac tgtcgggcgt acacaaatcg cccgcagaag cgcggccgtc tggaccgatg    3180

gctgtgtaga agtactcgcc gatagtggaa accgacgccc cagcactcgt ccgagggcaa    3240

aggaatagag tagatgccga ccgaacaaga gctgatttcg agaacgcctc agccagcaac    3300

tcgcgcgagc ctagcaaggc aaatgcgaga gaacggcctt acgcttggtg gcacagttct    3360

cgtccacagt tcgctaagct cgctcggctg ggtcgcggga gggccggtcg cagtgattca    3420

ggcccttctg gattgtgttg gtccccaggg cacgattgtc atgcccacgc actcgggtga    3480

tctgactgat cccgcagatt ggagatcgcc gcccgtgcct gccgattggg tgcagatccg    3540

tcgacctgca gccaagctta tcgataaaat aaaagatttt atttagtctc cagaaaaagg    3600

ggggaatgaa agaccccacc tgtaggtttg gcaagctagc ttaagtaacg ccattttgca    3660

aggcatggaa aatacataac tgagaataga gaagttcaga tcaaggttag gaacagagag    3720

acagcagaat atgggccaaa caggatatct gtggtaagca gttcctgccc cggctcaggg    3780

ccaagaacag atggtcccca gatgcggtcc cgccctcagc agtttctaga gaaccatcag    3840

atgtttccag ggtgccccaa ggacctgaaa tgaccctgtg ccttatttga actaaccaat    3900

cagttcgctt ctcgcttctg ttcgcgcgct tctgctcccc gagctcaata aaagagccca    3960

caacccctca ctcggcgcgc cagtcctccg atagactgcg tcgcccgggt acccgtgtat    4020

ccaataaacc ctcttgcagt tgcatccgac ttgtggtctc gctgttcctt gggagggtct    4080

cctctgagtg attgactacc cgtcagcggg ggtctttcat gggtaacagt ttcttgaagt    4140

tggagaacaa cattctgagg gtaggagtcg aatattaagt aatcctgact caattagcca    4200

ctgttttgaa tccacatact ccaatactcc tgaaatagtt cattatggac agcgcagaag    4260

agctggggag aattaattcg taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc    4320

cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct    4380

aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa    4440

acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta    4500

ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc    4560

gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg    4620

caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt    4680

tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa    4740

gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct    4800

ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc    4860

cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg    4920

tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct    4980

tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag    5040

cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga    5100

agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga    5160

agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg    5220

gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag    5280

aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag    5340

ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat    5400

gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct    5460

taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac    5520

tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa    5580

tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg    5640

gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt    5700

gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca    5760

ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt    5820

cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct    5880

tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg    5940

cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg    6000

agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg    6060

cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa    6120

aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt    6180

aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt    6240

gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt    6300

gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca    6360

tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat    6420

ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata    6480

aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc    6540

tctgacacat gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca    6600

gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg    6660

cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat    6720

gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg    6780

aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg    6840

caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg    6900

cgcaaggaat ggtgcatgca aggagatggc gcccaacagt cccccggcca cggggcctgc    6960

caccataccc acgccgaaac aagcgctcat gagcccgaag tggcgagccc gatcttcccc    7020

atcggtgatg tcggcgatat aggcgccagc aaccgcacct gtggcgccgg tgatgccggc    7080

cacgatgcgt ccggcgtaga ggcgattagt ccaatttgtt aaagacagga tatcagtggt  7140

ccaggctcta gttttgactc aacaatatca ccagctgaag cctatagagt acgagccata  7200

gataaaataa aagattttat ttagtctcca gaaaaagggg ggaa                   7244

 

<210>11

<211>6561

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>MSCV载体(MSCV-U6-Puro)

 

<400>11

tgaaagaccc cacctgtagg tttggcaagc tagcttaagt aacgccattt tgcaaggcat   60

ggaaaataca taactgagaa tagagaagtt cagatcaagg ttaggaacag agagacagca  120

gaatatgggc caaacaggat atctgtggta agcagttcct gccccggctc agggccaaga  180

acagatggtc cccagatgcg gtcccgccct cagcagtttc tagagaacca tcagatgttt  240

ccagggtgcc ccaaggacct gaaatgaccc tgtgccttat ttgaactaac caatcagttc  300

gcttctcgct tctgttcgcg cgcttctgct ccccgagctc aataaaagag cccacaaccc  360

ctcactcggc gcgccagtcc tccgatagac tgcgtcgccc gggtacccgt attcccaata  420

aagcctcttg ctgtttgcat ccgaatcgtg gactcgctga tccttgggag ggtctcctca  480

gattgattga ctgcccacct cgggggtctt tcatttggag gttccaccga gatttggaga  540

cccctgccca gggaccaccg acccccccgc cgggaggtaa gctggccagc ggtcgtttcg  600

tgtctgtctc tgtctttgtg cgtgtttgtg ccggcatcta atgtttgcgc ctgcgtctgt  660

actagttagc taactagctc tgtatctggc ggacccgtgg tggaactgac gagttctgaa  720

cacccggccg caaccctggg agacgtccca gggactttgg gggccgtttt tgtggcccga  780

cctgaggaag ggagtcgatg tggaatccga ccccgtcagg atatgtggtt ctggtaggag  840

acgagaacct aaaacagttc ccgcctccgt ctgaattttt gctttcggtt tggaaccgaa  900

gccgcgcgtc ttgtctgctg cagcgctgca gcatcgttct gtgttgtctc tgtctgactg     960

tgtttctgta tttgtctgaa aattagggcc agactgttac cactccctta agtttgacct    1020

taggtcactg gaaagatgtc gagcggatcg ctcacaacca gtcggtagat gtcaagaaga    1080

gacgttgggt taccttctgc tctgcagaat ggccaacctt taacgtcgga tggccgcgag    1140

acggcacctt taaccgagac ctcatcaccc aggttaagat caaggtcttt tcacctggcc    1200

cgcatggaca cccagaccag gtcccctaca tcgtgacctg ggaagccttg gcttttgacc    1260

cccctccctg ggtcaagccc tttgtacacc ctaagcctcc gcctcctctt cctccatccg    1320

ccccgtctct cccccttgaa cctcctcgtt cgaccccgcc tcgatcctcc ctttatccag    1380

ccctcactcc ttctctaggc gccggaatta gatctttccc atgattcctt catatttgca    1440

tatacgatac aaggctgtta gagagataat tagaattaat ttgactgtaa acacaaagat    1500

attagtacaa aatacgtgac gtagaaagta ataatttctt gggtagtttg cagtttttaa    1560

aattatgttt taaaatggac tatcatatgc ttaccgtaac ttgaaagtat ttcgatttct    1620

tggctttata tatcttgtgg aaaggacgaa acacctctga ggttaacgga tccgcggccg    1680

cacgcgtgtt aacgaattct accgggtagg ggaggcgctt ttcccaaggc agtctggagc    1740

atgcgcttta gcagccccgc tgggcacttg gcgctacaca agtggcctct ggcctcgcac    1800

acattccaca tccaccggta ggcgccaacc ggctccgttc tttggtggcc ccttcgcgcc    1860

accttctact cctcccctag tcaggaagtt cccccccgcc ccgcagctcg cgtcgtgcag    1920

gacgtgacaa atggaagtag cacgtctcac tagtctcgtg cagatggaca gcaccgctga    1980

gcaatggaag cgggtaggcc tttggggcag cggccaatag cagctttgct ccttcgcttt    2040

ctgggctcag aggctgggaa ggggtgggtc cgggggcggg ctcaggggcg ggctcagggg    2100

cggggcgggc gcccgaaggt cctccggagg cccggcattc tgcacgcttc aaaagcgcac    2160

gtctgccgcg ctgttctcct cttcctcatc tccgggcctt tcgacctgca gcccaagctt    2220

accatgaccg agtacaagcc cacggtgcgc ctcgccaccc gcgacgacgt ccccagggcc    2280

gtacgcaccc tcgccgccgc gttcgccgac taccccgcca cgcgccacac cgtcgatccg    2340

gaccgccaca tcgagcgggt caccgagctg caagaactct tcctcacgcg cgtcgggctc    2400

gacatcggca aggtgtgggt cgcggacgac ggcgccgcgg tggcggtctg gaccacgccg    2460

gagagcgtcg aagcgggggc ggtgttcgcc gagatcggcc cgcgcatggc cgagttgagc    2520

ggttcccggc tggccgcgca gcaacagatg gaaggcctcc tggcgccgca ccggcccaag    2580

gagcccgcgt ggttcctggc caccgtcggc gtctcgcccg accaccaggg caagggtctg    2640

ggcagcgccg tcgtgctccc cggagtggag gcggccgagc gcgccggggt gcccgccttc    2700

ctggagacct ccgcgccccg caacctcccc ttctacgagc ggctcggctt caccgtcacc    2760

gccgacgtcg aggtgcccga aggaccgcgc acctggtgca tgacccgcaa gcccggtgcc    2820

tgacgcccgc cccacgaccc gcagcgcccg accgaaagga gcgcacgacc ccatgcatcg    2880

ataaaataaa agattttatt tagtctccag aaaaaggggg gaatgaaaga ccccacctgt    2940

aggtttggca agctagctta agtaacgcca ttttgcaagg catggaaaat acataactga    3000

gaatagagaa gttcagatca aggttaggaa cagagagaca gcagaatatg ggccaaacag    3060

gatatctgtg gtaagcagtt cctgccccgg ctcagggcca agaacagatg gtccccagat    3120

gcggtcccgc cctcagcagt ttctagagaa ccatcagatg tttccagggt gccccaagga    3180

cctgaaatga ccctgtgcct tatttgaact aaccaatcag ttcgcttctc gcttctgttc    3240

gcgcgcttct gctccccgag ctcaataaaa gagcccacaa cccctcactc ggcgcgccag    3300

tcctccgata gactgcgtcg cccgggtacc cgtgtatcca ataaaccctc ttgcagttgc    3360

atccgacttg tggtctcgct gttccttggg agggtctcct ctgagtgatt gactacccgt    3420

cagcgggggt ctttcatggg taacagtttc ttgaagttgg agaacaacat tctgagggta    3480

ggagtcgaat attaagtaat cctgactcaa ttagccactg ttttgaatcc acatactcca    3540

atactcctga aatagttcat tatggacagc gcagaagagc tggggagaat taattcgtaa    3600

tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata    3660

cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta    3720

attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa    3780

tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg    3840

ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag    3900

gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa    3960

ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc    4020

cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca    4080

ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg    4140

accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct    4200

catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt    4260

gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag    4320

tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc    4380

agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac    4440

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gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc    4560

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gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca    4680

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atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca    4800

gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg    4860

atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca    4920

ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt    4980

cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt    5040

agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca    5100

cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca    5160

tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga    5220

agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact    5280

gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga    5340

gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg    5400

ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc    5460

tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga    5520

tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat    5580

gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt    5640

caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt    5700

atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac    5760

gtctaagaaa ccattattat catgacatta acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc    5820

tttcgtctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag    5880

acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca    5940

gcgggtgttg gcgggtgtcg gggctggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg    6000

agagtgcacc atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc    6060

aggcgccatt cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct    6120

tcgctattac gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa ggcgattaag ttgggtaacg    6180

ccagggtttt cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcgc aaggaatggt gcatgcaagg    6240

agatggcgcc caacagtccc ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag    6300

cgctcatgag cccgaagtgg cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg    6360

cgccagcaac cgcacctgtg gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagaggc    6420

gattagtcca atttgttaaa gacaggatat cagtggtcca ggctctagtt ttgactcaac  6480

aatatcacca gctgaagcct atagagtacg agccatagat aaaataaaag attttattta  6540

gtctccagaa aaagggggga a                                            6561

 

<210>12

<211>6464

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>MSCV载体(MSCV-U6-hrGFP)

 

<400>12

tgaaagaccc cacctgtagg tttggcaagc tagcttaagt aacgccattt tgcaaggcat   60

ggaaaataca taactgagaa tagagaagtt cagatcaagg ttaggaacag agagacagca  120

gaatatgggc caaacaggat atctgtggta agcagttcct gccccggctc agggccaaga  180

acagatggtc cccagatgcg gtcccgccct cagcagtttc tagagaacca tcagatgttt  240

ccagggtgcc ccaaggacct gaaatgaccc tgtgccttat ttgaactaac caatcagttc  300

gcttctcgct tctgttcgcg cgcttctgct ccccgagctc aataaaagag cccacaaccc  360

ctcactcggc gcgccagtcc tccgatagac tgcgtcgccc gggtacccgt attcccaata  420

aagcctcttg ctgtttgcat ccgaatcgtg gactcgctga tccttgggag ggtctcctca  480

gattgattga ctgcccacct cgggggtctt tcatttggag gttccaccga gatttggaga  540

cccctgccca gggaccaccg acccccccgc cgggaggtaa gctggccagc ggtcgtttcg  600

tgtctgtctc tgtctttgtg cgtgtttgtg ccggcatcta atgtttgcgc ctgcgtctgt  660

actagttagc taactagctc tgtatctggc ggacccgtgg tggaactgac gagttctgaa  720

cacccggccg caaccctggg agacgtccca gggactttgg gggccgtttt tgtggcccga  780

cctgaggaag ggagtcgatg tggaatccga ccccgtcagg atatgtggtt ctggtaggag  840

acgagaacct aaaacagttc ccgcctccgt ctgaattttt gctttcggtt tggaaccgaa  900

gccgcgcgtc ttgtctgctg cagcgctgca gcatcgttct gtgttgtctc tgtctgactg     960

tgtttctgta tttgtctgaa aattagggcc agactgttac cactccctta agtttgacct    1020

taggtcactg gaaagatgtc gagcggatcg c tcacaacca gtcggtagat gtcaagaaga   1080

gacgttgggt taccttctgc tctgcagaat ggccaacctt taacgtcgga tggccgcgag    1140

acggcacctt taaccgagac ctcatcaccc aggttaagat caaggtcttt tcacctggcc    1200

cgcatggaca cccagaccag gtcccctaca tcgtgacctg ggaagccttg gcttttgacc    1260

cccctccctg ggtcaagccc tttgtacacc ctaagcctcc gcctcctctt cctccatccg    1320

ccccgtctct cccccttgaa cctcctcgtt cgaccccgcc tcgtatcctc cctttatcca    1380

gccctcactc cttctctagg cgccggaatt agatctttcc catgattcct tcatatttgc    1440

atatacgata caaggctgtt agagagataa ttagaattaa tttgactgta aacacaaaga    1500

tattagtaca aaatacgtga cgtagaaagt aataatttct tgggtagttt gcagttttta    1560

aaattatgtt ttaaaatgga ctatcatatg cttaccgtaa cttgaaagta tttcgatttc    1620

ttggctttat atatcttgtg gaaaggacga aacacctctg aggttaacgg atccgcggcc    1680

gcacgcgtct gtggaatgtg tgtcagttag ggtgtggaaa gtccccaggc tccccaggca    1740

ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccaggtgtgg aaagtcccca    1800

ggctccccag caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccatagtc    1860

ccgcccctaa ctccgcccat cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc    1920

catggctgac taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctctgc ctctgagcta    1980

ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga ggcctaggct tttgcaaaaa gctcccggga    2040

tggtgagcaa gcagatcctg aagaacaccg gcctgcagga gatcatgagc ttcaaggtga    2100

acctggaggg cgtggtgaac aaccacgtgt tcaccatgga gggctgcggc aagggcaaca    2160

tcctgttcgg caaccagctg gtgcagatcc gcgtgaccaa gggcgccccc ctgcccttcg    2220

ccttcgacat cctgagcccc gccttccagt acggcaaccg caccttcacc aagtaccccg    2280

aggacatcag cgacttcttc atccagagct tccccgccgg cttcgtgtac gagcgcaccc    2340

tgcgctacga ggacggcggc ctggtggaga tccgcagcga catcaacctg atcgaggaga    2400

tgttcgtgta ccgcgtggag tacaagggcc gcaacttccc caacgacggc cccgtgatga    2460

agaagaccat caccggcctg cagcccagct tcgaggtggt gtacatgaac gacggcgtgc    2520

tggtgggcca ggtgatcctg gtgtaccgcc tgaacagcgg caagttctac agctgccaca    2580

tgcgcaccct gatgaagagc aagggcgtgg tgaaggactt ccccgagtac cacttcatcc    2640

agcaccgcct ggagaagacc tacgtggagg acggcggctt cgtggagcag cacgagaccg    2700

ccatcgccca gctgaccagc ctgggcaagc ccctgggcag cctgcacgag tgggtgtaag    2760

tcgacctgca gccaagctta tcgataaaat aaaagatttt atttagtctc cagaaaaagg    2820

ggggaatgaa agaccccacc tgtaggtttg gcaagctagc ttaagtaacg ccattttgca    2880

aggcatggaa aatacataac tgagaataga gaagttcaga tcaaggttag gaacagagag    2940

acagcagaat atgggccaaa caggatatct gtggtaagca gttcctgccc cggctcaggg    3000

ccaagaacag atggtcccca gatgcggtcc cgccctcagc agtttctaga gaaccatcag    3060

atgtttccag ggtgccccaa ggacctgaaa tgaccctgtg ccttatttga actaaccaat    3120

cagttcgctt ctcgcttctg ttcgcgcgct tctgctcccc gagctcaata aaagagccca    3180

caacccctca ctcggcgcgc cagtcctccg atagactgcg tcgcccgggt acccgtgtat    3240

ccaataaacc ctcttgcagt tgcatccgac ttgtggtctc gctgttcctt gggagggtct    3300

cctctgagtg attgactacc cgtcagcggg ggtctttcat gggtaacagt ttcttgaagt    3360

tggagaacaa cattctgagg gtaggagtcg aatattaagt aatcctgact caattagcca    3420

ctgttttgaa tccacatact ccaatactcc tgaaatagtt cattatggac agcgcagaag    3480

agctggggag aattaattcg taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc    3540

cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct    3600

aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa    3660

acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta    3720

ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc    3780

gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg    3840

caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt    3900

tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa    3960

gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct    4020

ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc    4080

cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg    4140

tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct    4200

tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag    4260

cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga    4320

agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga    4380

agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg    4440

gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag    4500

aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag    4560

ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat    4620

gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct    4680

taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac    4740

tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa    4800

tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg    4860

gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt    4920

gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca    4980

ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt    5040

cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct    5100

tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg    5160

cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg    5220

agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg    5280

cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa    5340

aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt    5400

aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt    5460

gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt    5520

gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca    5580

tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat    5640

ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata    5700

aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc    5760

tctgacacat gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca    5820

gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg    5880

cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat    5940

gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg    6000

aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg    6060

caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg    6120

cgcaaggaat ggtgcatgca aggagatggc gcccaacagt cccccggcca cggggcctgc    6180

caccataccc acgccgaaac aagcgctcat gagcccgaag tggcgagccc gatcttcccc    6240

atcggtgatg tcggcgatat aggcgccagc aaccgcacct gtggcgccgg tgatgccggc    6300

cacgatgcgt ccggcgtaga ggcgattagt ccaatttgtt aaagacagga tatcagtggt    6360

ccaggctcta gttttgactc aacaatatca ccagctgaag cctatagagt acgagccata    6420

gataaaataa aagattttat ttagtctcca gaaaaagggg ggaa                     6464

 

<210>13

<211>62

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>p38目标基因插入片段

 

<400>13

ccggtgcagg agttgaacaa gacaatacct gattgtcttg ttcagctcct gctttttgga    60

ag                                                                   62

 

<210>14

<211>100

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<223>H1启动子序列

 

<400>14

ccctttctca ccagagtatg tcttgaatat tctaagggtt taggtttctg taaagtgcaa    60

ataccactaa agggtcttgt gtatcgctgt acgtttataa                         100

Claims (6)

1.用于携带双链RNA进入细胞从而调节具有有义链和反义链的目标基因表达的经修饰的慢病毒载体，其中：

(a)慢病毒的内源性CMV启动子已被去除，且所述经修饰的慢病毒载体含有：

(i)所插入的与REV应答元件(RRE)结合的REV元件；

(ii)如下所示的U6启动子序列：

ttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagtttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttgcctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccg(SEQ ID NO：7)；以及

(b)多接头区域，其包含如下所示的核苷酸序列：

gatcc gctgggactcctttgcatg ttcaagaga catgcaaaggagtcccagc ttttt ggaa a(SEQ IDNO：4)

其中，所述双链RNA包含有义部分和反义部分，其中该有义部分与目标基因反义链的一部分互补，该反义部分则与该有义部分互补，使得该有义部分与反义部分退火，而且该双链RNA折回自身。

2.权利要求1的经修饰的慢病毒载体，其还包含报告基因。

3.权利要求2的经修饰的慢病毒载体，其中所述报告基因选自Blasti和hrGFP。

4.权利要求3的经修饰的慢病毒载体，其中所述载体为pLenti-U6-Blasti，其含有SEQ ID NO：8的核苷酸序列。

5.经修饰的慢病毒pLenti-U6-Blasti，其包含SEQ ID NO：8的核苷酸序列。

6.用权利要求5的经修饰的慢病毒转化或转染的细胞。

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