JP2007508842A - 干渉rnaを運搬するためのレトロウイルスベクター - Google Patents
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Abstract
【選択図】 図6
Description
ttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagtttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttgcctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccg(配列番号7)。
−1
ccctttctcaccagagtatgtcttgaatattctaagggtttaggtttctgtaaagtgcaaataccactaaagggtcttgtgtatcgctgtacgtttataa−100(配列番号14)で示されるヌクレオチド配列を有する。
(a)aattc gactggcacagcctccagg ttcaagaga cctggaggctgtgccagtc ttttt ggaa a(配列番号1);
(b)aattc gctgggactcctttgcatg ttcaagaga catgcaaaggagtcccagc ttttt ggaa a(配列番号2);
(c)gatcc gactggcacagcctccagg ttcaagaga cctggaggctgtgccagtc ttttt ggaa a(配列番号3);
(d)gatcc gctgggactcctttgcatg ttcaagaga catgcaaaggagtcccagc ttttt ggaa a(配列番号4);
(e)aattc gactccagtggtaatctac ttcaagaga gtagattaccactggagtc ttttt ggaa a(配列番号5);および、
(f)gatcc gactccagtggtaatctac ttcaagaga gtagattaccactggagtc ttttt ggaa a(配列番号6)。
AgeI +1 ループ ターム EcoRI
CCGGT G (20を超える塩基) TTCAAGAGA (21塩基) TTTTT GGAA G
A C (20を超える塩基) AAGTTCTCT (21塩基) AAAAA CCTT CTTAA
(a)レンチウイルスの内因性CMVプロモーターが除去されており、ここにおいて:
(i)REV応答配列(RRE)に結合するREV要素が挿入されており;
(ii)ttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagtttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttgcctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccg(配列番号7)のU6プロモーター配列;および、
(iii)ポリリンカー領域;
(iv)前記二本鎖RNAを含む標的遺伝子インサート;
を含み、ここにおいて、この二本鎖RNAは、センス部分とアンチセンス部分とがアニールして二本鎖RNAが折り畳まれるように、標的遺伝子のアンチセンス鎖の部分に相補的なセンス部分、および、そのセンス部分に相補的なアンチセンス部分を含む。
(a)aattc gactggcacagcctccagg ttcaagaga cctggaggctgtgccagtc ttttt ggaa a(配列番号1);
(b)aattc gctgggactcctttgcatg ttcaagaga catgcaaaggagtcccagc ttttt ggaa a(配列番号2);
(c)gatcc gactggcacagcctccagg ttcaagaga cctggaggctgtgccagtc ttttt ggaa a(配列番号3);
(d)gatcc gctgggactcctttgcatg ttcaagaga catgcaaaggagtcccagc ttttt ggaa a(配列番号4);
(e)aattc gactccagtggtaatctac ttcaagaga gtagattaccactggagtc ttttt ggaa a(配列番号5);および、
(f)gatcc gactccagtggtaatctac ttcaagaga gtagattaccactggagtc ttttt ggaa a(配列番号6)。
AgeI +1 ループ ターム EcoRI
CCGGT G (20を超える塩基) TTCAAGAGA (21塩基) TTTTT GGAA G
A C (20を超える塩基) AAGTTCTCT (21塩基) AAAAA CCTT CTTAA
(a)pLenti−U6−Blasti(配列番号8のヌクレオチド配列を含む)(図1);および、
(b)pLenti−U6−hrGFP(配列番号9のヌクレオチド配列を含む)(図2)。
(a)プロモーター;および、
(b)ポリリンカー領域;
(c)前記二本鎖RNAを含む標的遺伝子インサート;
を含み、ここにおいて、センス部分とアンチセンス部分とがアニールして二本鎖RNAが折り畳まれるように、該インサートは順に、標的遺伝子のアンチセンス鎖の部分に相補的なセンス部分、および、そのセンス部分に相補的なアンチセンス部分を含む。
(a)aattc gactggcacagcctccagg ttcaagaga cctggaggctgtgccagtc ttttt ggaa a(配列番号1);
(b)aattc gctgggactcctttgcatg ttcaagaga catgcaaaggagtcccagc ttttt ggaa a(配列番号2);
(c)gatcc gactggcacagcctccagg ttcaagaga cctggaggctgtgccagtc ttttt ggaa a(配列番号3);
(d)gatcc gctgggactcctttgcatg ttcaagaga catgcaaaggagtcccagc ttttt ggaa a(配列番号4);
(e)aattc gactccagtggtaatctac ttcaagaga gtagattaccactggagtc ttttt ggaa a(配列番号5);および、
(f)gatcc gactccagtggtaatctac ttcaagaga gtagattaccactggagtc ttttt ggaa a(配列番号6)。
(a)MSCV−U6−Hygro(配列番号10のヌクレオチド配列を含む)(図3);
(b)MSCV−U6−Puro(配列番号11のヌクレオチド配列を含む)(図4);および、
(c)MSCV−U6−hrGFP(配列番号12のヌクレオチド配列を含む)(図5)。
図1:本発明の、Blastiレポーター遺伝子およびU6プロモーター配列を含む改変レンチウイルスベクターであるpLenti−U6−Blastiのヌクレオチド配列である。特定の遺伝子を調節するための標的遺伝子インサートは、細胞をベクターで感染させる前に、容易に、このベクターのポリリンカーに挿入することができる。
図2:本発明の、hrGFPレポーター遺伝子およびU6プロモーター配列を含む改変レンチウイルスベクターであるpLenti−U6−hrGFPのヌクレオチド配列である。特定の遺伝子を調節するための標的遺伝子インサートは、細胞をベクターで感染させる前に、容易に、このベクターのポリリンカーに挿入することができる。
図3:本発明の、Hygroレポーター遺伝子およびU6プロモーター配列を含むMSCVベクターであるMSCV−U6−Hygroのヌクレオチド配列である。特定の遺伝子を調節するための標的遺伝子インサートは、細胞をベクターで感染させる前に、容易に、このベクターのポリリンカーに挿入することができる。
図5:本発明の、hrGFPレポーター遺伝子およびU6プロモーター配列を含むMSCVベクターであるMSCV−U6−hrGFPのヌクレオチド配列である。特定の遺伝子を調節するための標的遺伝子インサートは、細胞をベクターで感染させる前に、容易に、このベクターのポリリンカーに挿入することができる。
図6:本発明の、GFPレポーター遺伝子を含む改変レンチウイルスの模式図である。(1)は、標的遺伝子インサート、すなわち折り畳まれる二本鎖RNAである。
図7:標的遺伝子インサートを欠失させた本発明の改変レンチウイルスで感染させた細胞(コントロール)におけるp38の発現と、細胞の内因性p38遺伝子の部分に相補的になるように設計された標的遺伝子インサートを有する本発明の改変レンチウイルスで感染させた細胞におけるp38の発現とを比較した、ウェスタンブロットである。このブロットによれば、明確に、本発明の改変レンチウイルスは、p38の発現を、コントロールにおける発現に対して減少させたことが示されている。
(a)プロモーター、
(b)ポリリンカー領域、および、
(c)二本鎖RNAを含む標的遺伝子に特異的なインサート、
を含み、ここにおいて、この二本鎖RNAは、センス部分とアンチセンス部分とがアニールして二本鎖RNAが折り畳まれるように、標的遺伝子のアンチセンス鎖の部分に相補的なセンス部分、および、そのセンス部分に相補的なアンチセンス部分を含む。
ttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagtttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttgcctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccg(配列番号7)。
(a)aattc gactggcacagcctccagg ttcaagaga cctggaggctgtgccagtc ttttt ggaa a(配列番号1);
(b)aattc gctgggactcctttgcatg ttcaagaga catgcaaaggagtcccagc ttttt ggaa a(配列番号2);
(c)gatcc gactggcacagcctccagg ttcaagaga cctggaggctgtgccagtc ttttt ggaa a(配列番号3);
(d)gatcc gctgggactcctttgcatg ttcaagaga catgcaaaggagtcccagc ttttt ggaa a(配列番号4);
(e)aattc gactccagtggtaatctac ttcaagaga gtagattaccactggagtc ttttt ggaa a(配列番号5);および、
(f)gatcc gactccagtggtaatctac ttcaagaga gtagattaccactggagtc ttttt ggaa a(配列番号6)。
AgeI +1 ループ ターム EcoRI
CCGGT G (20を超える塩基) TTCAAGAGA (21塩基) TTTTT GGAA G
A C (20を超える塩基) AAGTTCTCT (21塩基) AAAAA CCTT CTTAA
上記で説明したように、本発明は、標的遺伝子の発現を改変するために、細胞へ標的遺伝子に特異的なインサートを運搬するレトロウイルスベクターに関し、本ベクターは:
(a)プロモーター;
(b)ポリリンカー領域;
(c)二本鎖RNAを含む標的遺伝子に特異的なインサート、
を含み、ここにおいて、上記二本鎖RNAは、センス部分とアンチセンス部分とがアニールして二本鎖RNAが折り畳まれるように、標的遺伝子のアンチセンス鎖の部分に相補的なセンス部分、および、そのセンス部分に相補的なアンチセンス部分を含む。
本発明はさらに、本発明のレトロウイルスベクターで感染させた細胞に関し、ここにおいて、感染した細胞は、そのゲノム内に標的遺伝子を含む。従って、本発明のレトロウイルスベクターで細胞を感染させることにより、細胞内で標的遺伝子の発現を調節でき、特に、減少させることができる。このような感染は、インビボ、インビトロ、または、エクスビボのいずれで発生したものでもよい。多数の細胞のタイプを、本発明のレトロウイルスベクターで感染させることができる。例えば、このような細胞は、原核細胞でもよいし、または真核細胞でもよく、例えば、細菌細胞、例えばE.coli、酵母細胞または哺乳動物細胞である。その上、このような細胞は、例えば、毛髪もしくは皮膚、または、体液、例えば血液、唾液もしくは精液等のような生物学的サンプルから得ることができる。しかしながら、上記で説明したように、細胞が、そのゲノム内に標的遺伝子を含むことが重要である。
本発明はまた、本発明のレトロウイルスベクターを投与するための、本発明のレトロウイルスベクター、および、製薬上許容できるキャリアーを含む医薬組成物に関する。本発明で用いられる成句「製薬上許容できる」は、生理学的に許容でき、典型的には、例えば異常亢進、眩暈などのアレルギー反応または同様の不都合な反応を起こさない分子団および組成物を意味する。好ましくは、本発明で用いられる用語「製薬上許容できる」は、連邦政府もしくは州政府の管理機関で承認されていること、または、米国薬局方、または、動物、より具体的にはヒトで使用するのに一般的に認識されているその他の薬局方に列挙されていることを意味する。用語「キャリアー」は、化合物がそれらと共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを意味する。このような製薬用のキャリアーは、滅菌液が可能であり、例えば、水、および、鉱油、動物性、植物性または合成源のオイル、例えば落花生油、ダイズ油、ミネラルオイル、ゴマ油などが挙げられる。特に注射用溶液に関して、好ましくは、水または食塩水、および、デキストロース水溶液およびグリセロール溶液がキャリアーとして用いられる。適切な製薬用キャリアーは、E.W.Martin著の「Remington’s Pharmaceutical Sciences」で説明されている。
まず、ショートヘアピンヌクレオチド配列(21塩基のセンス鎖、9塩基のループ、および、21塩基のアンチセンス)の、上部の鎖と下部の鎖を得た。これらは、生産してもよいし、または、オリゴ販売業者から購入してもよい。次に、この2種の鎖を96ウェルフォーマットのウェル中で一緒にした。
トランスフェクション手順:
トランスフェクションの1日前に、トリプシン処理し、293FT細胞数をカウントし、それらを10cmプレート1枚あたり5×106細胞でプレーティングした。細胞を、血清を含む増殖培地10mlにプレーティングした。
・Opti−MEM(R)I培地(血清非含有)1.5ml中に、最適化したパッケージングミックス9μgと、pLenti発現プラスミドDNA3μg(総量で12μg)を希釈した。穏やかに混合した。
8.必要に応じてろ過工程を行った。
9.ウイルス上清をクライオバイアルにピペットで移し、1mlのアリコートにした。ウイルスのストックを−80℃で保存する。
10%FBS、100μg/mlストレプトマイシン、100ユニット/mlペニシリンGが追加されたDMEMの完全培地中で、細胞を維持した。
1.バイアルを水槽中で37℃で融解させた。
2.細胞を、予め温めた完全培地9mlを含むチューブに移した。
3.1500rpmで5分間遠心分離した。
4.上清を除去した。
5.細胞を完全培地10ml中に穏やかに再懸濁し、10cmのポリ−D−リシンでコーティングしたプレートにプレーティングした。
6.細胞を、37℃で、5%CO2中で、インキュベートした。
ポリ−D−リシンでコーティングしたプレートは、融解後の付着を促進するために最初の一週間用いた。その後、この細胞は、通常のプレートで培養された。
1.培地を吸引し、細胞を予め温めたPBSで1回洗浄した。
2.このプレートに、トリプシン−EDTA1mlを添加した。30秒〜1分間インキュベートした。
3.トリプシンを阻害するために、完全培地4mlを添加した。
4.この細胞を上下に数回ピペッティングすることによって再懸濁した。
5.細胞1mlを、10cmの完全培地9mlを含むプレートに移した。
1日目:(午後三時前後)
10cmプレート1枚あたり3〜3.9×106細胞でプレーティングした(ポリ−D−リシンでコーティングしたプレート使用)。
2日目:(昼12時前後)
感染の4時間前に、細胞に新鮮な培地(抗生物質を含まない)10mlを再度与えた。
1.10cmのプレート1枚のトランスフェクションあたり、発現ベクター(pMK0.1)(DNA1)12μg、および、VSV−Gプラスミド(DNA2)12μgを使用した。
2.チューブに、以下を添加した:
DNA1 12μg
DNA2 12μg。
2MのCaCl2 62μl
総量 500μl。
4.ボルテックスで混合しながら、DNA/CaCl2混合物に2XHBSを滴下して添加した。
5.室温で20分間インキュベートした。
6.DNA/CaCl2混合物を穏やかにボルテックスで混合した。
7.この混合物を、ピペットを用いてパッケージング細胞に滴下して添加した。
8.溶液が平らに分布するようにこのプレートを前後に揺すった。
9.この細胞を、37℃で、5%CO2でインキュベートした。
1.10cmプレート1枚のトランスフェクションあたり、発現ベクター(pMK0.1)6μg、および、VSV−Gプラスミド6μgを使用した。
2.チューブにDNAを添加した。
3.別個のチューブで、リポフェクトアミン2000(72μl)をピペットを用いて無血清培地(Optimem)1.5mlに移した。
4.穏やかに混合した。室温で5分間インキュベートした。
5.DNAにリポフェクトアミン/Optimem混合物を添加し、穏やかに混合した。
6.室温で15分間インキュベートした。
7.DNA/リポフェクトアミン(Lipo)/Optimem混合物を、ピペットを用いてパッケージング細胞に滴下して添加した。
8.溶液が平らに分布するようにこのプレートを前後に揺すった。
9.この細胞を、37℃で、5%CO2でインキュベートした。
トランスフェクション複合体を、16時間を超えて細胞と接触させないようにすること。
1.培地を吸引した。
2.予め温めたPBSで1回、細胞を穏やかに洗浄した。
3.ウイルス上清を濃縮するために、10cmプレート1枚あたり完全培地5mlを添加した。
4.この細胞を、37℃で、5%CO2でインキュベートした。
1.培地を回収し、0.45ミクロンシリンジフィルターを通過させてろ過した。
2.ウイルスをアリコートにし、−80℃で保存した。
3.細胞に完全培地5mlを再度与えた。
これは、「24時間のウイルス上清」である。24時間後のパッケージング細胞株からウイルスを回収したものが、24時間のウイルス上清である。
1.培地を回収し、0.45ミクロンシリンジフィルターを通過させてろ過した。
2.ウイルスをアリコートにし、−80℃で保存した。
3.プレートを捨てた。
これは、「48時間のウイルス上清」である。48時間後のパッケージング細胞株からウイルスを回収したものが、48時間のウイルス上清である。
上述の手法を用いて、本発明のレトロウイルスベクターを生産し、続いて、ゲノム中に標的遺伝子を有する細胞を本発明のレトロウイルスベクターで感染させることによって、標的遺伝子の発現がうまく減少した。特に、p38のための標的遺伝子インサートが用いられたが、この標的インサートに関する配列は以下の通りである。
CCGGTGCAGGAGTTGAACAAGACAATACCTGATTGTCTTGTTCAGCTCCTGCTTTTTGGAAG(配列番号13)。
Claims (22)
- (a)プロモーター;
(b)ポリリンカー領域;
(c)二本鎖RNAを含む標的遺伝子に特異的なインサート、
を含み、ここにおいて、該二本鎖RNAは、センス部分とアンチセンス部分とがアニールして二本鎖RNAが折り畳まれるように、標的遺伝子のアンチセンス鎖の部分に相補的なセンス部分、および、そのセンス部分に相補的なアンチセンス部分を含む、標的遺伝子の発現を改変するために、細胞へ標的遺伝子に特異的なインサートを運搬するレトロウイルスベクター。 - プロモーターは、
(a)ttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagtttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttgcctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccg(配列番号7)のU6プロモーター配列;および、
(b)H1プロモーター(配列番号14)、
からなる群より選択される、請求項1に記載のレトロウイルスベクター。 - ポリリンカー領域は:
(a)aattc gactggcacagcctccagg ttcaagaga cctggaggctgtgccagtc ttttt ggaa a(配列番号1);
(b)aattc gctgggactcctttgcatg ttcaagaga catgcaaaggagtcccagc ttttt ggaa a(配列番号2);
(c)gatcc gactggcacagcctccagg ttcaagaga cctggaggctgtgccagtc ttttt ggaa a(配列番号3);
(d)gatcc gctgggactcctttgcatg ttcaagaga catgcaaaggagtcccagc ttttt ggaa a(配列番号4);
(e)aattc gactccagtggtaatctac ttcaagaga gtagattaccactggagtc ttttt ggaa a(配列番号5);および、
(f)gatcc gactccagtggtaatctac ttcaagaga gtagattaccactggagtc ttttt ggaa a(配列番号6)
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載のレトロウイルスベクター。 - 標的遺伝子に特異的なインサートのセンスおよびアンチセンス領域は、それぞれ19〜30個の長さのヌクレオチドを含む、請求項1に記載のレトロウイルスベクター。
- 標的遺伝子に特異的なインサートのセンスおよびアンチセンス領域は、それぞれ19〜25個の長さのヌクレオチドを含む、請求項4に記載のレトロウイルスベクター。
- 標的遺伝子に特異的なインサートのセンスおよびアンチセンス領域は、それぞれ19〜23個の長さのヌクレオチドを含む、請求項5に記載のレトロウイルスベクター。
- 標的遺伝子は、腫瘍遺伝子である、請求項1に記載のレトロウイルスベクター。
- レトロウイルスベクターは、マウス幹細胞ウイルス(MSCV)である、請求項1に記載のレトロウイルスベクター。
- (a)レンチウイルスの内因性CMVプロモーターが除去されており;そして、
(b)REV応答配列(RRE)に結合するREV要素が挿入されている改変レンチウイルスである、請求項1に記載のレトロウイルスベクター。 - ゲノム中に前記標的遺伝子を含む、請求項1に記載のレトロウイルスベクターで感染させた細胞。
- (a)レンチウイルスの内因性CMVプロモーターが除去されており、ここにおいて:
(i)REV応答配列(RRE)に結合するREV要素が挿入されており;
(ii)ttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagtttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttgcctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccg(配列番号7)のU6プロモーター配列;および、
(iii)ポリリンカー領域;
を含み、ここにおいて、該二本鎖RNAは、センス部分とアンチセンス部分とがアニールして二本鎖RNAが折り畳まれるように、標的遺伝子のアンチセンス鎖の部分に相補的なセンス部分、および、そのセンス部分に相補的なアンチセンス部分を含む、標的遺伝子の発現を改変するために二本鎖RNAを細胞に運搬するための改変レンチウイルスベクター。 - ポリリンカー領域は:
(a)aattc gactggcacagcctccagg ttcaagaga cctggaggctgtgccagtc ttttt ggaa a(配列番号1);
(b)aattc gctgggactcctttgcatg ttcaagaga catgcaaaggagtcccagc ttttt ggaa a(配列番号2);
(c)gatcc gactggcacagcctccagg ttcaagaga cctggaggctgtgccagtc ttttt ggaa a(配列番号3);
(d)gatcc gctgggactcctttgcatg ttcaagaga catgcaaaggagtcccagc ttttt ggaa a(配列番号4);
(e)aattc gactccagtggtaatctac ttcaagaga gtagattaccactggagtc ttttt ggaa a(配列番号5);および、
(f)gatcc gactccagtggtaatctac ttcaagaga gtagattaccactggagtc ttttt ggaa a(配列番号6)、からなる群より選択される、請求項11に記載の改変レンチウイルスベクター。 - レポーター遺伝子をさらに含む、請求項12に記載の改変レンチウイルスベクター。
- レポーター遺伝子は、BlastiおよびhrGFPからなる群より選択される、請求項13に記載の改変レンチウイルスベクター。
- (a)pLenti−U6−Blasti(配列番号8のヌクレオチド配列を含む);および、
(b)pLenti−U6−hrGFP(配列番号9のヌクレオチド配列を含む)、
からなる群より選択される、請求項14に記載の改変レンチウイルスベクター。 - (a)プロモーター;および、
(b)ポリリンカー領域、
を含み、ここにおいて、該二本鎖RNAは、センス部分とアンチセンス部分とがアニールして二本鎖RNAが折り畳まれるように、標的遺伝子のアンチセンス鎖の部分に相補的なセンス部分、および、そのセンス部分に相補的なアンチセンス部分を含む、標的遺伝子の発現を改変するために二本鎖RNAを細胞に運搬するための、マウス幹細胞ウイルス(MSCV)ベクター。 - プロモーターは:
ttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagtttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttgcctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccg(配列番号7)、
のU6プロモーター配列である、請求項26に記載のMSCVベクター。 - ポリリンカー領域は:
(a)aattc gactggcacagcctccagg ttcaagaga cctggaggctgtgccagtc ttttt ggaa a(配列番号1);
(b)aattc gctgggactcctttgcatg ttcaagaga catgcaaaggagtcccagc ttttt ggaa a(配列番号2);
(c)gatcc gactggcacagcctccagg ttcaagaga cctggaggctgtgccagtc ttttt ggaa a(配列番号3);
(d)gatcc gctgggactcctttgcatg ttcaagaga catgcaaaggagtcccagc ttttt ggaa a(配列番号4);
(e)aattc gactccagtggtaatctac ttcaagaga gtagattaccactggagtc ttttt ggaa a(配列番号5);および、
(f)gatcc gactccagtggtaatctac ttcaagaga gtagattaccactggagtc ttttt ggaa a(配列番号6)、からなる群より選択される、請求項17に記載のMSCVベクター。 - レポーター遺伝子をさらに含む、請求項18に記載のMSCVベクター。
- レポーター遺伝子は、Hygro、PuroおよびhrGFPからなる群より選択される、請求項19に記載のMSCVベクター。
- (a)MSCV−U6−Hygro(配列番号10のヌクレオチド配列を含む);
(b)MSCV−U6−Puro(配列番号11のヌクレオチド配列を含む);および、
(c)MSCV−U6−hrGFP(配列番号12のヌクレオチド配列を含む)、
からなる群より選択される、請求項20に記載のMSCVベクター。 - 請求項16に記載のMSCVベクターで感染させた細胞。
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