CN102131929A - 一种内源性短发夹rna及其用途 - Google Patents

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Abstract

提供了一种具有SEQ.ID.NO.：1序列的内源性短发夹RNA或其互补物，该内源性短发夹RNA通过特异性地抑制EID1来诱导造血细胞形成，并提供了其用途。还提供了一种含有SEQ.ID.NO.：1序列的表达构建体、载体和多核苷酸。SEQ.ID.NO.：1序列为5’-CAA AUA CUCACC GUG UUA CA-3’。

Description

一种内源性短发夹RNA及其用途
技术领域
本发明涉及一种RNA分子，特别是一种内源性短发夹RNA以及该RNA通过抑制分化-1的E1A样抑制子(在下文也称为EID1)诱导造血细胞形成的应用。本申请由中华人民共和国科学技术部项目、国家自然基金、北京科学技术委员会以及长江学者项目资助。
背景技术
骨髓间充质干细胞(本文也称为BMSC)和造血干细胞(本文称为HSC)的特征均为具有通过自我更新来提供生物体一生所需要的分化细胞的能力。在培养体系中扩增的所述BMSC由于不表达CD45和CD34(G.Chamberlain，J.Fox，B.Ashton，J.Middleton，Stem Cells.25，2739-49(2007).)而可以与HSC区分开来。由于在临床应用中，获取大量的HSC仍是一个难题(B.P.Sorrentino，Nat Rev Immunol.4(11)：878-88(2004).)，因此，如果能将BMSC诱导分化成造血细胞，则BMSC就可替代HSC。已知骨髓间充质干细胞(BMSC)是多能干细胞，其能够分化成骨细胞、内皮细胞、脂肪组织细胞、软骨细胞、肌肉细胞和神经细胞。但是，BMSC能否在体内和体外分化成造血干细胞(HSC)仍存在争议(Y.Jiang等人，Nature 418，41-49(2002)；M.Serafini等人，J Exp Med.204，129-39(2007)；M.F.Pittenger，Science.284，143-7(1999)；K.W.Liechty等人，Nat Med.6，1282-6(2000)和M.Angelopoulou等人，Exp.Hematol 31，413-420(2003))。在本发明中已经证明，当BMSC在含有多种细胞因子和生长因子的培养基中培养时，表达Flk-1(胎肝激酶1)而不表达CD34和CD31并且可以容易地进行扩增。表达Flk-1似乎使BMSC具有更为强大的分化潜能(L.Liao，L Li，R.C.Zhao，Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.362：1107-12(2007))。这些Flk-1+的细胞甚至可以被诱导分化成造血细胞，虽然发生频率很低(H.Guo等人，Exp.Hematol.31：650-658(2003))。此外，对本领域技术人员而言，为使BMSC能够替代HSC，理解调控BMSC自我更新和分化的分子机制非常重要。
现有技术表明，miRNAs在不同造血细胞类型中表达有差异，且具有重要的调控作用。例如，miR-181与B淋巴细胞发育有关(C.Z.Chen等人，Science 303，83-86(2004).)，miR-142和-223与T淋巴细胞生成有关(S.H.Ramkissoon等人，Leukemia Research，30，643-647(2005).)，miR-221和-222与红细胞生成有关(N.Felli等人，Proc Natl Acad Sci US A.102，18081-18086(2005).)，miR-223与粒细胞分化有关(F.Fazi等人，Cell，123，819-831(2005).)，miR-10，-126，-17与巨核细胞生成有关(R.Garzon等人，Proc Natl Acad Sci U S A.103，5078-5083(2006).)。此外，已经显示一些miRNAs(miR-128和-181)抑制HSC分化(III，R.W.Georgantas等人，Proc Natl Acad Sci U S A.104，2750-2755(2007).)。虽然已经发现一些miRNAs(如miR-130a和miR-10a)靶向作用于重要的细胞分化转录因子HOXA1和MAFB(R.Garzon等人，Proc Natl AcadSci U S A.103，5078-5083(2006))，但在BMSC和HSC早期发育阶段，一些miRNAs或其他小RNAs是否参与调控自我更新和分化尚不清楚。实际上，对于BMSC命运决定的内部因素，我们知之甚少。
近期，我们报道了人细胞的蛋白编码基因的内含子处生成的一类新的内源性shRNAs(Yin JQ和Zhao RC.Methods.43(2)：123-30(2007)。T.Gu等人(随稿)2008。见随稿)。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种具有SEQ.ID.NO.：1序列，通过抑制EID1来诱导造血细胞生成的内源性短发夹RNA或其互补物。该SEQ.ID.NO.：1序列如下：
5’-CAAAUA CUC ACC GUG UUA CA-3’。
该SEQ.ID.NO.：1序列主要包括核苷酸5’-CAAAUA CUC A-3’。
本发明的第二个目的是提供一种含有SEQ.ID.NO.：1序列的表达构建体。
本发明的第三个目的是提供一种具有含有SEQ.ID.NO.：1序列表达构建体的载体。
本领域技术人员知道的所有载体均可应用于本发明。在本发明的一个具体实施方案中，优选的载体是一种表达SEQ.ID.NO.：1序列的逆转录病毒质粒(逆转录病毒载体pMSCV)。
本发明的第四个目的是提供具有SEQ.ID.NO.：1序列的本发明的RNA或其互补物的一种用来诱导造血细胞形成的应用，或者一种治疗罹患血细胞生成障碍的病人的方法，或者一种治疗哺乳动物包括人类的血液疾病的方法。
换言之，本发明还提供了一种具有SEQ.ID.NO.：1序列或SEQ.ID.NO.：2序列的内源性短发夹RNA在制备用于治疗罹患哺乳动物包括人类中的造血障碍的患者的药物中的用途。所述SEQ.ID.NO.：2序列为5’-UGU AAC ACA AUG GUG AGU AUU UG-3’。
多核苷酸的％同一性是由GAP(Needleman和Wunsch，1970)分析(GCG程序)测定的，空位产生罚分＝5，空位延伸罚分＝0.3。除非另外提及，询问序列的长度至多是23个核苷酸。优选的，序列长度至少是10个核苷酸，并且GAP分析在最多23个核苷酸的区域上比对两个序列。且GAP分析在最少10个核苷酸的区域比对两个序列。
对于确定的多核苷酸，人们理解，高于上述那些数值的％同一性数值包括优选的具体实施方案。
因此，在可以实施的情况下，对最小的％同一性数值而言，优选本发明的多核苷酸包含与相关的称为SEQ ID NO.：1的具有至少下述数值的同一性的序列：至少40％，更优选至少45％，更优选至少50％，更优选至少55％，更优选至少60％，更优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选至少99％更优选至少99.1％，更优选至少99.2％，更优选至少99.3％，更优选至少99.4％，更优选至少99.5％，更优选至少99.6％，更优选至少99.7％，更优选至少99.8％，更优选甚至至少99.9％。
本发明的多核苷酸是天然的多核苷酸，并且可能具有一个或多个突变，该突变可以是核苷酸的缺失、插入或取代。突变体可以是自然发生的(也就是说，从天然来源中分离得到的)，也可以是合成的(例如，通过在核酸上进行位点特异的诱变)。
本发明的寡核苷酸和/或多核苷酸在严谨条件下可以与本发明的一个基准基因，或该基因侧翼区域杂交。
术语“严谨的杂交条件”和本文中使用的类似术语指的是本领域熟悉的参数，包括杂交温度随寡核苷酸长度而改变。核酸杂交参数可在汇编了这样的方法的文献Sambrook等(上述)和Ausubel等(所述)中找到。例如，如本文中用到的，严谨的杂交条件指在65℃、在杂交缓冲液中杂交(3.5×SSC、0.02％Ficoll、0.02％聚烯吡酮、0.02％胎牛血清BSA、2.5Mm NaH2PO4(pH7)、0.05％SDS、2niM EDTA)，随后在0.2×SSC、0.01％BSA、在500C洗脱一遍或多遍。此外，核酸和/或寡核苷酸(也可称为“引物”或“探针”)可在核酸扩增技术如PCR采用的条件下，与目的昆虫的基因组，如蜜蜂的基因组的区域杂交。
用本发明新发现的短发夹RNA(shRNA)转染的BMSC能在体外分化成造血干细胞(HSC)以及它们的具有进一步分化成血细胞能力的子代多能造血祖细胞，依据本发明，转染的人BMSC移植到受亚致死量照射的NOD/SCID小鼠后，可以植入，并分化成包括淋巴细胞和髓细胞在内的所有造血谱系。此外，这种新型shRNA通过抑制EID1的翻译来改变BMSC的命运。因此，建立了一个内源性shRNA能够赋予BMSC明确分化方向的模式，并且揭示了一个在HSC中编程造血相关基因的内在途径。
同人造shRNAs一样，它们的茎的两条链是完全互补的，长度至少是21个核苷酸。为了找出在干细胞自我更新和定向分化中起重要调控作用的shRNAs，我们采用定制的芯片进行高通量筛选(见表1)。
表1BMSC和HSC之间sRNA的差异表达模式
名称      强度    强度      比例
(sRNA)    (BMSC)  (HSC)     (HSC/BMSC)
ZK-693    2943    9         0.0031
ZK-871    1853    9         0.0049
ZK-125    1846    12        0.0063
ZK-633    5281    62        0.0117
ZK-313    2360    39        0.0167
ZK-428    2582    48        0.0186
ZK-358    3800    178    0.0468
ZK-381    2505    160    0.0639
ZK-290    2147    138    0.0641
ZK-401    3000    197    0.0658
ZK-574    1598    106    0.0661
ZK-1011   3176    253    0.0797
ZK-266    2641    216    0.0818
ZK-921    2225    248    0.1116
ZK-826    11330   1388   0.1225
ZK-960    11452   1643   0.1434
ZK-1040   9095    1454   0.1598
ZK-768    4641    939    0.2023
ZK-296    4722    1011   0.2141
ZK-630    3109    766    0.2463
ZK-588    4896    1264   0.2582
ZK-798    3122    854    0.2735
ZK-548    2367    694    0.2932
ZK-908    1055    5329   5.0533
ZK-249    309     1571   5.0852
ZK-907    298     4168   14.0090
*本发明中命名ZK-249为shR-CH。
在本发明的这些实验中，已经识别出数百种来自于人内含子的新型短发夹RNAs。定制的芯片分析成功揭示出人BMSC和HSC之间shRNAs的表达差异。大部分shRNAs在BMSC中的表达水平比HSC中高。根据本发明，两个shRNAs，即具有SEQ.ID.NO.：1序列的shR-CH和具有SEQ.ID.NO.：2的shR-CH的互补序列，在HSC中显示了比MSC中更强的信号(图1A)。预计shR-CH前体具有与shR-CH同样的效用。为了确认shR-CH的差异表达模式，采用了实时定量PCR。在HSC中，shR-CH的表达至少比MSC中高10倍。克隆该内源性shR-CH，以便测定其长度。如图2B所示，成熟的shR-CH长约21nt，其前体形成完全互补的发夹结构。该shR-CH位于5号染色体上的SH3PXD2B基因的第一个内含子区，并且不像大多数内源性shRNAs那样具有系统发生保守性(17随稿)。
为了找出shR-CH的潜在靶基因，采用了与之前文献中使用的预测miRNAs潜在靶基因的生物信息学方法相似的方法。在预测的shR-CH靶基因中(见下方表2)，
表2shR-CH靶基因预测
Figure BDA0000047669480000061
选择EID1(分化-1的E1A样抑制剂)(NM_014335.2)并用qRT-PCR和Western blot测定来确定，因为该基因的3’UTR区含有5个自然存在的、可能的shR-CH结合位点(见图1C)。更为重要的是，已表明EID1与造血相关的两个重要转录共激活子之间有密切关系(S.Miyake等人，Mol Cell Biol.20，8889-902(2000)；W.Xu等人，Blood.107，4407-16(2006).)。许多研究报道了转录共激活子CBP(单磷酸环腺苷反应元件结合蛋白(CREB结合蛋白)和它的同种异型基因p300至少能与312种蛋白作用，其中至少65种由对造血生成必不可少的基因编码(D.N.Messina，J.Glasscock，W.Gish，M.Lovett.Genome Res.14：2041-2047(2004)；L.H.Kasper，Nature.419，738-43(2002))。认为CBP/p300能够为调控基因表达的多种转录因子和组蛋白提供组装平台以及蛋白乙酰化转移酶功能(V.V.Ogryzko等人，Cell 87，953-959(1996)；X.Liu等人，Nature.451，846-50(2008))。shR-CH在人BMSC和HSC之间的分化表达提示该分子可能是HSC保持其干细胞性的一个关键因子，从而引导BMSC向HSC的定向分化。为了研究这一可能性，在BMSC中构建了含有小鼠干细胞逆转录病毒骨架、RNA聚合酶III(pol III)特异的U6基因启动子以及shR-CH或模拟的shRNA的载体(图2A)。为了检验易位表达shR-CH对BMSC分化的生物学效应，用上述载体感染取自人骨髓的间充质干细胞。如图2B所示，与感染对照或模拟载体的细胞相比，转化shR-CH载体的细胞中，shR-CH水平显著增加。在感染shR-CH的BMSC中，shR-CH水平的增加能够持续很长时间(数据未显示)。接下来测定了shR-CH水平的增加能否影响靶mRNA的表达。用shR-CH载体转化后2天，用RT-PCR分析EID1mRNA的水平。如图2C和2D所示，EID1mRNA的水平差异很小，但用western Blot测定EID1的蛋白水平显著下降。与EID1可能参与依赖shR-CH的造血分化一致的是，与伴随发生的CD45标志分子的表达相连，内源性EID1蛋白表达水平在HSC中下调。
在BMSC和HSC中，请注意，EID1的表达和血细胞特征性标志物CD45的表达之间具有相互关系。此外，shR-CH诱导EID1抑制后，CD45被上调，提示EID1可能在BMSC中参与抑制造血程序。根据本发明，用单细胞克隆的方法克隆单个BMSC，以达到该目的并排除HSC污染的可能性。荧光激活细胞分类术的结果表明，克隆的BMSC的特征是存在特异的CD29、CD105和CD44表面抗原和Flk-1核抗原，不存在HSC特异的CD34、CD45和CD133(补充图1)。然后，用表达shR-CH或模拟shRNA的载体感染这些克隆的细胞，并接种到包被有纤维粘连蛋白和胶原的24孔板中，补充造血细胞因子和生长因子。在载体携带的绿色荧光蛋白(GFP)标记物的基础上鉴定出起源于转化的BMSC的细胞，并且，BMSC向造血细胞分化的特征是表达特异性CD45表面抗原(图3A)。采用改进的CFU测定方法测定感染的BMSC的体外扩增。每组挑选5000个种子细胞，并再培养14天。在这14天的培养中，shR-CH的过表达使细胞具有显著的生长优势，这是通过体外集落形成能力(CFU-GM)分析得到的。此外，shR-CH培养物中GFP和CD45阳性细胞数量占优也可以反映以上发现(图3B)。虽然在3种情况下，一开始接种的细胞数相同(约5000个)，但在第14天时，shR-CH转化的细胞增殖和分化明显(图3C)，而只有很少的模拟物感染的BMSC细胞表型发生变化，这提示，未感染的BMSC和模拟物感染的BMSC未能在这些条件下存活。与此相反，感染shR-CH载体的许多细胞能够形成CD45阳性的集落。该造血细胞的显著增加提示，增加的shR-CH水平诱导BMSC的造血分化。这种诱导造血分化是shR-CH特异性的，因为转化模拟载体的对于CD45的表达和CFU的形成没有作用。这些结果强烈提示，增强表达shR-CH能够克服造血分化的阻碍，启动BMSC向造血定向分化的程序。
如果BMSC的明确分化需要增加shR-CH的水平，那么直接抑制其靶基因EID1应该对BMSC的分化具有同样的作用。因此，我们测定了EID1基因对于诱导BMSC的定向分化是否具有重要的功能。实时定量RT-PCR分析提示，在感染的BMSC中，EID1-siR有效降低内源性EID1的表达水平至在用模拟siRNA感染的BMSC中观察到的表达水平的40％(图2C)。与预料的一样，用EID1-siRNA处理的BMSC确实诱导分化成造血细胞，这由CD45抗原的特异性表达可以测定(图3)。该si-EID1对其靶mRNA是高度特异的，因为模拟的siRNA对于BMSC的分化没有作用。因此，与shR-CH的异位表达相同，BMSC中EID1表达敲降也能够导致这些干细胞向造血细胞分化。总之，上述研究的发现为shR-CH通过抑制EID1来控制MSC分化提供了直接的证据。
为了直接评价shR-CH异位表达能否在体内诱导人BMSC定向分化，测定了感染的BMSC在小鼠体内向多系造血细胞分化的能力。在开始的实验中，将人BMSC感染表达shR-CH的逆转录病毒或表达不相干shRNA的对照载体，然后将这些细胞移植到受亚致死量照射的小鼠体内。在感染的BMSC移植后60天内，检测来自于BMSC且表达GFP的造血细胞。采用相应的特异性针对人细胞的抗原的抗体对小鼠骨髓进行免疫组化染色，发现这些BMSC来源的细胞能够分化成多系造血细胞，如表达造血祖细胞的标记分子所显示的，然后进一步分化成特征为CD33的髓系细胞和表达CD3标记分子的淋巴细胞(图4A)。与此相反，在对照和模拟物转化组的骨髓切片中，很少有CD45、CD33或CD3阳性的细胞。对照和模拟物转化组中发现的少量人CD45、CD33或CD3阳性的细胞可能反映出Flk-1+的BMSC本身具有分化成HSC的能力。此外，还收集了一些器官，通过GFP荧光来测定人BMSC来源的细胞的存在。然而，没有获得阳性结果。这些发现强烈提示，shR-CH诱导BMSC向造血细胞定向分化，但不能向其他类型的细胞分化。
为了确定骨髓中BMSC来源细胞的表型，利用流式细胞仪并用三种抗人淋巴细胞和干细胞标记分子的抗体分析细胞。与骨髓切片的观察一致，来自接收者的骨髓细胞的FACS结果也显示了BMSC来源的细胞在髓腔中植入明显(图4B)。8周后，对髓腔中来自于感染的人BMSC(GFP+细胞)的细胞的谱系组成进行了检测。人BMSC中shR-CH的表达使髓腔中淋巴细胞(CD3)明显增高(2.8％vs 0.5％对照)。相似的，CD33阳性的髓系细胞也明显升高(图4B)。在受体小鼠骨髓中存在人BMSC来源的造血细胞提示，人BMSC中异位表达shR-CH启动了造血谱系分化的程序。
shR-CH在HSC中的优化表达提示，shR-CH在造血生成中具有重要作用。本发明的这些发现显示，异位表达shR-CH能够在体外和体内启动和定向人BMSC向造血细胞的分化(图3和4)，证实了上述观点。通过抑制EID1，shR-CH可能上调了CBP和p300等造血相关基因的活性(图4C)。据报道，CBP和p300敲除或点突变的小鼠骨髓中，最终的红系、髓系和B淋巴细胞前体的数目显著下降(L.H.Kasper，Nature.419，738-43(2002)；Y.Chen，P.Haviernik，K.D.Bunting，Y.C.Yang，Blood.110，2889-98(2007)；A.L.Kung等人，Genes Dev.14，272-7(2000))。其他研究进一步表明，CBP和p300是HSC的命运决定因子，分别负责HSC的自我更新和造血分化(V.I.Rebel等人，Proc NatlAcad Sci U S A.99，14789-94(2002)；M.L.Sandberg等人，Dev Cell.8，153-66(2005))。为了测试shR-CH和EID1的变化能否影响CBP/p300下游基因的表达，也测定了表达shR-CH的BMSC和用si-EID1处理的BMSC中RUNX1的表达(一个重要的造血相关转录因子)。如图4D所示，两种情况下，RUNX1都被明显升高，提示CBP/p300的转录活性被增强。
BMSC具有生成所有的三胚层的细胞的能力，这使得它们成为再生医学中潜在的细胞来源(Y.Jiang等人，Nature 418，41-49(2002)。3，Y.S.Yoon等人，J.Clin.Invest 115，326-338(2005)；M.T.Reyes等人，Blood 98，2615-2625(2001).)。然而，在临床实验之前，开发出使BMSC具有可再生分化能力的方法是重要的。根据本发明的研究，首次显示了移植shR-CH-感染的BMSC能够在受体骨髓中生成大量BMSC来源的造血细胞。这些发现也为人BMSC和HSC的共移植导致的增强的髓系生成和巨核细胞生成提供了另外一种解释(K.W.Liechty等人，NatMed.6，1282-6(2000))。此外，已显示，BMSC能够预防致命的移植物抗宿主病，促进造血迅速恢复(X.Chen，H.Xu，C.M.Wan，McCaigue，G.Li，.Stem Cells.24，2052-9(2006)；G.Ren等人，Cell Stem Cell 2，141-150(2008))。换句话说，shR-CH感染的BMSC能够作为造血干细胞的替代细胞应用于移植。
总之，这些研究特征性描述了一种新型的内源性shRNA的结构和功能，并鉴定了内源性shRNA参与调控间充质干细胞定向分化的调控途径。
附图说明
图1显示了人干细胞中一种新型shR-CH的鉴定和特性描述，其中图1A显示新鉴定的shR-CH的差异表达。数据是至少3次独立测定的平均值。误差线表示标准偏差。*P＜0.01和**P＜0.001，分别使用芯片或qRT-PCR测定比较检测BMSC和HSC中shR-CH表达的差异。图1B显示成熟shR-CH的克隆和测序及其二级结构。红色实线代表成熟shR-CH的序列。图1C显示成熟shR-CH和其在EID1mRNA的3’UTR区域的3个可能的结合位点。
图2显示异位表达shR-CH能在翻译水平有效抑制内源性EID1基因的表达。其中，图2A表示本研究中使用的模拟sRNA/GFP和shR-CH/GFP逆转录病毒载体的构建。图2B表示新鉴定的shR-CH在不同情况下的差异表达。数据是至少3次独立实验的平均值。误差线表示标准偏差。*P＜0.001。图2C表示了在不同条件下用实时定量PCR来分析EID1mRNA的表达水平，并用GAPDH的表达水平归一化，且在不同情况下得到的表达水平与其对照的水平归一化。数据是至少3次独立实验的平均值。误差线表示标准偏差。图2D显示用WesternBlotting分析的不同情况下EID1蛋白的水平。Western blot显出条带并用肌动蛋白的抗体重新探测来确定总蛋白上样量相同。
图3显示shR-CH异位表达能够在体外诱导人BMSC增殖和分化。使用单克隆来源的细胞。图3A显示了用不同染色方法显示的正常BMSC、模拟、shR-CH和siEID1感染的BMSC的形态变化。图3B显示了CD45+造血细胞的CFC测定。转染后，细胞在生长培养基中培养24h，然后转移到分化培养基中培养12h，然后对造血细胞特异的CD45免疫染色。在倒置显微镜下的观察显示，shR-CH感染的BMSC和siEID1感染的BMSC均有效生成集落。图3C显示了三个不同情况下集落的定量分析。在第14天，shR-CH、siEID1或模拟载体感染的BMSC形成的集落的数目给出了n＞6/组：*P＜0.001的结果。柱形图中数值代表增加的倍数。
图4显示了shR-CH强制表达在体内对造血谱系分化的作用，其中，图4A显示移植60天后的小鼠骨髓切片的免疫荧光和Hochest33342染色。用人特异性抗移植60天后获得的对照、模拟shRNA和shR-CH的骨髓切片中的CD45、CD3或CD133的抗体染色细胞的计算。图4B表明人BMSC植入到NOD-SCID小鼠体内的造血重建。105GFP+CD45+BMSC移植到受亚致死量照射的NOD-SCID小鼠体内。移植后≥8周，代表性的NOD-SCID(人CD45)小鼠BM中流式细胞的谱证实有多系(淋巴系和髓系细胞)重建。给出了每个象限中，细胞在小鼠骨髓所有细胞中所占的比例。图4C和图4D显示，不同条件下，用实时PCR来分析RUNX1mRNA的表达水平，并用GAPDH的表达归一化，且在不同情况下得到的表达水平与其对照的水平归一化。数据是至少3次独立实验的平均值。误差线表示标准偏差。
具体实施方式
实施例1
细胞和细胞培养
根据北京协和医学院人体组织使用和研究委员会准则，供者知情同意，人骨髓(BM)由30名健康供者提供(年龄20到50岁)。从健康供者分离和培养BM起源的Flk1+CD31-CD34-的细胞方法按照先前的报道实施，有些许改动。简而言之，基于本领域已知的方法，用Ficoll-Paque梯度离心(具体的重力为1.077g/ml；Nycomed Pharma AS，Oslo，挪威)分离单核细胞，并在37℃和5％CO2潮湿环境下接种于DF12培养基中，所述培养基含有5％FCS、20ng/mL EGF、100U/mL的青霉素和100g/mL的链霉素(Gibco Life Technologies)。18h后去掉悬浮细胞。每2天换一次培养基。6天后收集细胞并用磁性活细胞分类(MACS)CD45、GlyA及CD34微磁珠去除造血细胞(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)。然后将细胞再铺板并传代。用胰蛋白酶消化第四代细胞，用逆转录病毒载体转染并用于移植测定。在其他测定中应用来自单克隆的细胞。为了保证每个细胞集落都是单细胞来源的，将每个病人的分选的细胞接种到包被有纤维粘连蛋白(Sigma，St Louis，MO)和胶原(Sigma)的孔中。培养基是达尔伯克氏改良伊格尔培养基和哈姆F12培养基(DF12)，均含有40％的包括痕量成分(MCDB)的MCDB-201(Sigma)、2％胎牛血清(FCS；Gibco Life Technologies，Paisley，英国)、1×胰岛素-转铁因子-硒(Gibco Life Technologies)、10-9M地塞米松(Sigma)、10-4M抗坏血酸2-磷酸(Sigma)、20ng/mL白介素6(Sigma)、10ng/mL表皮生长因子(Sigma)、10ng/mL血小板来源细胞生长因子BB(Sigma)、50ng/mL胎肝酪氨酸激酶3(Flt-3)配体(Sigma)、30ng/mL骨形态发生蛋白4(Sigma)和100U/mL青霉素和100g/mL链霉素。每4到6天换一次培养基。开始24小时，鉴定带有单个贴壁细胞的孔。每天检查细胞集落的出现。去掉含有多于一个集落的孔。培养4周后，单个细胞克隆来源的细胞通常达到90％汇合。然后用胰蛋白酶消化收集这些细胞，培养扩增。用FACS来评估细胞的表型。CD133+的造血干细胞用CD133阳性的免疫磁珠(MACS)从脐带血中分离(由北京脐血库提供)。
实施例2质粒构建
用本领域的方法(Michael T Hemann 2003)构建了由U6启动子表达的编码shRNAs的逆转录病毒载体pMSCV，与pre-shR-CH一致的短发夹DNA序列(SEQ.ID.NO.：3和SEQ.ID.NO.：4，表4)作为构建体化学合成。含有shR-CH表达盒的逆转录病毒由H293T细胞包装。如根据转移的H293T细胞的GFP表达所评估的，模拟-GFP和shR-CH-GFP生产细胞的逆转录病毒滴度分别是3×105/ml和4×105/ml。(图2A)
实施例3RNA分离和纯化
如本领域所描述的，用TRIzol(Invitrogen)从不同细胞中提取总RNA，并按照厂商说明书，用mirVana miRNA分离试剂盒(Ambion，Austin，TX)从大RNA中分离小RNA。于260nm处的紫外吸光值测得小RNA的浓度。
实施例4shRNA克隆和测序
在50ul的含有1.5ug RNA和5U poly(A)聚合酶(Takara)的反应容积中将短发夹RNAs在37℃中多腺苷酸化30分钟。加poly(A)尾的小RNA用酚/氯仿抽提和乙醇沉淀回收。采用1.5ug RNA和1ug RT引物(SEQ.ID.NO.：5，表4)和200U的SuperScript III逆转录酶(Invitrogen)进行反转录。采用特异性靶向新型shRNA shR-CH的引物SEQ.ID.NO.：6(表4)和SEQ.ID.NO.：7(表4)，在最终的退火温度60℃下进行40个cDNA扩增循环。用T4 RNA连接酶(TAKARA)将5’适配子(SEQ ID NO.：8，表4)连接到小RNA上，连接产物用酚/氯仿抽提和随后的乙醇沉淀来回收。采用1.5ug RNA和1ug特异性RT引物，SEQ.ID.NO.：9(表4)，进行逆转录。采用引物SEQ.ID.NO.：10和SEQ.ID.NO.：11(表4)，在最终的退火温度60℃下，进行40个cDNA扩增循环。PCR产物用2％琼脂糖分离，Goldview染色。切下100nt内部标准附近的凝胶片段，在37℃下用洗脱缓冲液(0.5M NH4Ac，10mM Mg(Ac)2和1mM EDTA)洗脱DNA，并用酚/氯仿抽提和随后的乙醇沉淀来回收。插入处附近的PCR产物直接送去测序(上海生工生物工程技术服务有限公司)。(图1B)
实施例5实时PCR
小RNA及相关基因的表达水平用实时RT-PCR测定。在7500HT实时PCR仪器(Applied Biosysems)上用SYBR Premix Ex TaqTM(TAKARA)运行SYBR green分析。使用1.5ug RNA和1ug shR-CH特异性RT引物(SEQ.ID.NO.：9，表4)进行小RNA的逆转录。
下述实时PCR中采用了引物SEQ.ID.NO.：6和SEQ.ID.NO.：11(表4)。使用1.5ug RNA和1ug通用引物oligo-dT(18)对造血相关基因进行逆转录。用于cDNA扩增的引物在表3中列出。这些结果见图1A、图2B、图2C、图4D。
表3用于cDNA扩增的引物
Figure BDA0000047669480000141
表4本发明中提到的核苷酸序列
Figure BDA0000047669480000142
实施例6Western Blotting
细胞用冷PBS洗涤2遍，然后于4℃在20ul RIPA裂解缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.5；1％NP-40；150mM NaCl；1mg/ml抑肽酶；1mg/ml亮抑蛋白酶肽；1mM Na3VO4；1mM NaF；1mM PMSF)中抽提30分钟。总蛋白用10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，蛋白条带转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上(Amersham)。该膜于RT用5％脱脂牛奶TBS缓冲液封闭过夜，然后与一抗孵育2小时。β肌动蛋白的表达作为上样对照。使用的抗体包括β肌动蛋白(Santa Cruz Biotechnology)和EID1(UPSTATE)。然后将膜与连接有HRP的兔抗山羊二抗孵育1小时。免疫复合物用商品化的ECL试剂盒可视化(图2D)。
实施例7生物信息学分析
本发明采用运算法则miRanda 3.0和targetscan 3.1(Miranda KC等人，Cell.126，1203-1217(2006)；Grimson A，Farh KK等人，Mol Cel.27，92-105(2007))来预测shRNA的靶基因。挑选在HSC中过表达的人shR-CH来对靶基因进行验证。在数百个预测的靶基因中，挑选出EID1(一个人shR-CH的潜在靶基因)进行进一步的实验验证。结果见图1C。
实施例8小RNA芯片和粒细胞-巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)测定
小RNA芯片
1.用户定制的sRNA芯片由CapitoBio Corporation提供。详细内容请见上述内容(Yin JQ和Zhao RC.Methods.43(2)：123-30(2007))。
粒细胞-巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)测定
采用CFU-GM测定来分析稳定表达shR-CH的骨髓来源间充质干细胞，以评估造血集落形成能力。本测定中采用来自于单个克隆的细胞。收集悬于上清中的细胞并接种到CFU混合物中。然后将细胞在37℃、5％CO2、潮湿环境下培养。在第14天，根据集落的形态和大小计数集落形成单位(CFU)(CFU，定义为＞50细胞/集落)的数目(图3B，图3C)。
实施例9细胞和组织的免疫染色
单克隆来源的细胞用4％多聚甲醛在室温固定30分钟，然后用PBS洗涤3遍。用含有0.2％Triton的PBS渗透化处理细胞5分钟。再用PBS洗涤4遍，然后将细胞用封闭缓冲液(Dako)封闭30分钟，然后在含有抗白蛋白(Dako)或抗CD45、CD34、CD19、CD71、CD3和CD33的抗体(PE；Becton Dickinson)或含有作为阴性对照的兔IgG(JacksonImmunoResearch)的PBS/BSA 0.1％中于室温下孵育1小时。染色后，细胞用PBS洗涤3遍，然后在含有抗兔完整IgG-Cy3(JacksonImmunoResearch)或抗兔完整IgG-Cy2(Jackson ImmunoResearch)的PBS/BSA 0.1％中室温孵育1小时。细胞再次洗涤(用PBS洗涤4遍)，细胞核用PBS稀释的Hochest33342在室温下染色5分钟。用荧光显微镜(Leica DMIRB)观察染色的细胞并用Magnafire软件获取图像。结果见图3A和图4A。
实施例10移植和FACS测定
6到8周龄的雄性非肥胖糖尿病(NOD)/LtSz-scid/scid(SCID)小鼠在独立通风(高效、无颗粒的过滤空气)的无菌隔离笼中(Techniplast，Milan，意大利)的限定菌群条件下饲养和维持。所有动物操作和实验过程均由中国医学科学院动物保护和使用委员会批准。移植前，小鼠经铯源(MDS Nordion；Gammacell，Ottawa，QC，加拿大)亚致死量照射(300cGy)。经尾静脉将溶于0.4ml生理盐水(PS)的转化或未转化shR-CH载体或模拟载体的BMSC(2.5×105细胞/小鼠)分别注射到受照射的小鼠体内。每周计数外周血白细胞。2个月后采用断颈法处死小鼠。收集股骨和胫骨的骨髓。将其风干后用詹纳-吉姆萨染色(BDH Ltd，Poole，英国)。脱钙胫骨的常规4um组织切片从福尔马林固定、石蜡包埋的材料切下并染色。采用FACS来评估接受了移植物的小鼠骨髓中人细胞的存在。单核细胞用前述章节中描述的方法获取，通过加入8.3％的氯化铵裂解红血细胞。然后制备单个细胞悬液。用人血清封闭Fc受体后，通过用抗CD45、CD33或CD3藻红蛋白的抗体(PE；Becton Dickinson)标记来测定细胞。抗免疫球蛋白G(anti-IgG)单抗(mAb)标记的细胞作为对照。此外，细胞设置门时包括淋巴系和髓系部分二者的细胞(图4B)。
统计分析
数据描述为指定数目的不同实验组中的平均值±SEM。多重比较时采用方差单向分析。如果处理组和对照组之间差异明显，则用学生双尾t检验来比较平均值。
已经通过参考本发明的优选的具体实施方案详细公开了本发明。然而，本领域技术人员理解，通过参考本公开，可以在下述权利要求中限定的本发明的精神和范围内做出修饰和改进。
Figure IDA0000047669600000011
Figure IDA0000047669600000021
Figure IDA0000047669600000031
Figure IDA0000047669600000041
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种通过抑制EID1来特异性诱导造血细胞形成的具有SEQ.ID.NO.：1序列的内源性短发夹RNA。
2.一种根据权利要求1所述的内源性短发夹RNA的具有SEQ.ID.NO.：2序列的互补物。
3.根据权利要求1所述的内源性短发夹RNA，其中所述SEQ.ID.NO.：1序列主要含有5’-CAA AUA CUC A-3’的核酸。
4.一种包含SEQ.ID.NO.：1序列的表达构建体，其中表达构建体具有SEQ.ID.NO.：3序列。
5.一种包含SEQ.ID.NO.：1序列的表达构建体，其中表达构建体具有拥有SEQ.ID.NO.：4序列的互补物。
6.一种含有包括SEQ.ID.NO.：3或SEQ.ID.NO.：4序列的表达构建体的载体。
7.根据权利要求6所述的载体，其中载体是逆转录病毒质粒。
8.一种多核苷酸，其含有与相关的命名为SEQ.ID.NO.：3或SEQ.ID.NO.：4的序列至少70％同一性的序列。
9.一种多核苷酸，其含有与相关的命名为SEQ.ID.NO.：3或SEQ.ID.NO.：4的序列至少80％同一性的序列。
10.一种多核苷酸，其含有与相关的命名为SEQ.ID.NO.：3或SEQ.ID.NO.：4的序列至少90％同一性的序列。
11.根据权利要求1或2所述的具有SEQ.ID.NO.：1序列的RNA或其互补物在制备用于治疗患有血细胞形成不良疾病的个体的药物中的用途。
12.根据权利要求11所述的用途，其中血细胞形成不良疾病包括造血障碍。
13.根据权利要求11或12所述的用途，其中个体是包括人在内的哺乳动物。
14.一种治疗患有血细胞形成不良疾病的个体的方法，其中给予足可以诱导造血细胞形成的有效量的具有SEQ.ID.NO.：1序列的或权利要求2的RNA或其互补物。

Claims (14)

1.一种通过抑制EID1来特异性诱导造血细胞形成的具有SEQ.ID.NO.：1序列的内源性短发夹RNA。
2.一种根据权利要求1所述的内源性短发夹RNA的具有SEQ.ID.NO.：2序列的互补物。
3.根据权利要求1所述的内源性短发夹RNA，其中所述SEQ.ID.NO.：1序列主要含有5’-CAA AUA CUC A-3’的核酸。
4.一种包含SEQ.ID.NO.：1序列的表达构建体，其中表达构建体具有SEQ.ID.NO.：3序列。
5.一种包含SEQ.ID.NO.：1序列的表达构建体，其中表达构建体具有拥有SEQ.ID.NO.：4序列的互补物。
6.一种含有具有包括SEQ.ID.NO.：1序列的表达构建体的表达构建体的载体。
7.根据权利要求6所述的载体，其中载体是逆转录病毒质粒。
8.一种多核苷酸，其含有与相关的命名为SEQ.ID.NO.：1的序列至少70％同一性的序列。
9.一种多核苷酸，其含有与相关的命名为SEQ.ID.NO.：1的序列至少80％同一性的序列。
10.一种多核苷酸，其含有与相关的命名为SEQ.ID.NO.：1的序列至少90％同一性的序列。
11.根据权利要求1或2所述的具有SEQ.ID.NO.：1序列的RNA或其互补物在制备用于治疗患有血细胞形成不良疾病的个体的药物中的用途。
12.根据权利要求11所述的用途，其中血细胞形成不良疾病包括造血障碍。
13.根据权利要求11或12所述的用途，其中个体是包括人在内的哺乳动物。
14.一种治疗患有血细胞形成不良疾病的个体的方法，其中给予足可以诱导造血细胞形成的有效量的具有SEQ.ID.NO.：1序列的或权利要求2的RNA或其互补物。
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