CN1490052A

CN1490052A - 共表达HIV－1CNB结构蛋白与hIL－6的重组鸡痘病毒活载体疫苗

Info

Publication number: CN1490052A
Application number: CNA021332363A
Authority: CN
Inventors: 金宁一; 江文正; 李子健; 张立树; 金洪涛; 王宏; 夏志平; 张洪勇
Original assignee: INST OF MILITARY VETERINARY SCIENCES PLA'S MILITARY SUPPLIES UNIV
Current assignee: INST OF MILITARY VETERINARY SCIENCES PLA'S MILITARY SUPPLIES UNIV
Priority date: 2002-10-18
Filing date: 2002-10-18
Publication date: 2004-04-21

Abstract

一种共表达HIV－1_CNB结构蛋白与hIL－6的重组鸡痘病毒活载体疫苗，属于生物技术领域。该疫苗提供三株共表达中国流行株I型人免疫缺陷病毒B亚型(HIV－1_CNB)结构蛋白与细胞因子人白细胞介素6(hIL－6)的重组鸡痘病毒vPUTAIL6－GAG、vPUTAIL6－GP和vPUTAIL6－GE，它们分别共表达HIV－1_CNB核心蛋白gag、外膜蛋白gp120或gag－gp120嵌合蛋白与hIL－6，该三株重组病毒均可刺激机体产生抗HIV－1的特异性体液免疫和细胞免疫。本发明得到的三株重组鸡痘病毒对实验动物是安全的，无任何病理现象出现。具有很好的遗传稳定性，经多次传代后外源基因不丢失，且可在非禽属动物(如哺乳动物)细胞中表达外源蛋白。所使用的目的基因为中国流行株HIV－1 B亚型的结构蛋白基因，从而构建的重组鸡痘病毒可作为我国预防和治疗AIDS的活载体疫苗。本发明中重组鸡痘病毒表达的细胞因子hIL－6起到了免疫佐剂的作用。

Description

共表达HIV-1CNB结构蛋白与hIL-6的重组鸡痘病毒活载体疫苗

技术领域：

本发明提供三株分别共表达中国流行株I型人免疫缺陷病毒B亚型(HIV--1_CNB)核心蛋白gag、外膜蛋白gp120或gag-gp120嵌合蛋白与细胞因子人白细胞介素6(hIL-6)的重组鸡痘病毒，属于生物技术领域。

背景技术：

艾滋病(AIDS)是人免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的对人类威胁最严重，最难控制而且耗资最大的一种病毒性传染性疾病。据世界卫生组织报道，AIDS自80年代初流行至今，全球约有3000～4000万感染者，每天约有16000人感染HIV。我国自1985年在北京首例发现AIDS患者以来，我国AIDS流行已进入快速增长期，到2010年可达1000万以上。因此加强AIDS防治，研制切实可行的AIDS疫苗和治疗药物是科研工作者的严峻课题。

HIV属反转录病毒科慢病毒属灵长类慢病毒群，它有2个亚科成员：HIV-1和HIV-2，二者的细胞嗜性、基因组结构和功能以及转录复制等病毒增殖过程极为相似。前病毒基因组长9.7kb，中间部分为结构蛋白编码区，包括外膜蛋白基因(Env)、核心蛋白基因(Gag)和多聚酶基因(Pol)，另有若干个调节基因Tat、Rev、Nef及辅助基因Vif、Vpr、Vpu(HIV-1)和Vpx(HIV-2)，基因组的两侧为长末端重复序列(LTR)。我国主要以HIV-1 B亚型毒株感染为主。

HIV-1 Env基因编码糖蛋白前体gp160，经宿主细胞蛋白酶剪切修饰加工成gp120和gp41。gp120构成HIV囊膜上外膜蛋白，gp41构成穿膜蛋白。gp120在HIV吸附CD₄ ⁺T细胞单核/巨噬细胞表面并与CD₄受体分子结合过程中起重要作用，gp120与CD₄分子相互作用使囊膜蛋白空间构象发生改变，gp41充分暴露，使病毒的脂质囊膜与宿主细胞膜发生融合，病毒粒子穿入细胞，HIV-1通过直接作用和间接作用破坏CD₄ ⁺T细胞，CD₄ ⁺T细胞数量的减少和功能减退导致细胞免疫缺陷，最终发展成为AIDS。gp160上有抗体中和部位和诱导CTL反应的决定簇，故成为AIDS疫苗开发研究的重点，某些疫苗已进入I、II、III期临床实验阶段。

Gag蛋白是HIV-1的主要结构蛋白之-，它在病毒感染的晚期由一条长的mRNA产生，未经加工的蛋白前体分子量为55kDa(p55gag)，酶解加工后形成四种成熟蛋白，自N端起依次为p17、p24、p9和p7，p17gag位于病毒粒子的外膜和衣壳蛋白之间，称为基质蛋白(Matrixprotain，MA)，p24gag形成病毒粒子的衣壳(Capsid，CA)，Gag蛋白中诱导机体产生体液免疫和细胞免疫的抗原决定簇主要存在于这两种蛋白中。它们也可以诱导机体产生细胞免疫和体液免疫，而且Gag蛋白氨基酸序列相对保守，抗原变异较少，使用Gag蛋白作为AIDS疫苗有可能克服Env蛋白不能有效抵抗异源变异病毒攻击的缺陷。再者Gag蛋白还有自我装配功能，在HIV-1病毒粒子的其它成分如囊膜蛋白、反转录酶等缺失的情况下，仍能装配成病毒样粒子(Virus likeparticle，VLP)，这对于构建巨分子颗粒化抗原十分有用，因而Gag也成为疫苗研究的新热点。Gag蛋白的这种自我装配功能不因外源基因的嵌合而丧失，如将Gag和Env蛋白在同一系统中表达，其产物仍能装配成VLP。VLP的免疫原性较好，而且容易从其它蛋白中分离出来，具有作为疫苗的发展前途。

对于抗HIV-1的药物研究在过去的十几年里，无论从天然药物研究，还是从化学合成药物方面都取得了很大进展。从一种核苷酸逆转录酶抑制剂药物到多种核苷酸逆转录酶抑制药物，进而发展到蛋白酶抑制剂、糖苷酶抑制剂、病毒装配抑制剂、病毒进入抑制剂、整合酶抑制剂等多种抗HIV药物。尽管AIDS药物化疗日臻完善，但都普遍存在以下缺点：不能彻底治疗艾滋病，价格昂贵，毒副作用大，长期使用会出现耐药毒株，HIV感染者和AIDS病人需要长期或终身用药等。如国外推广使用的鸡尾酒疗法，其费用每人每年需1.5~5.0万美元，如此高的治疗费用对于发展中国家而言是无法接受的。因此，世界各国都把目标转向实用疫苗的开发研究。鉴于HIV-1的突变性和重组危险性，大多数研究普遍已放弃对减毒活疫苗的研究。正在进行的研究多为亚单位疫苗和多肽疫苗及基因工程疫苗。但多肽疫苗造价高，抗感染免效果不佳，所以人们普遍寄希望于基因工程活疫苗和巨分子亚单位疫苗，以期诱导机体产生坚强的细胞免疫和体液免疫。目前AIDS疫苗的开发大多围绕外膜蛋白gp160、gp120和gp41展开，某些疫苗已进入I、II、III期临床实验阶段。

鸡痘病毒(Fowlpox Virus，FPV)表达载体系统是类似于金丝雀痘病毒载体的又一种动物病毒载体。FPV作为载体具有与金丝雀痘病毒载体相同的优点，此外，相比于金丝雀痘病毒载体，其基因组结构更为庞大，能容纳较大的外源基因而不丧失其感染性；被表达的外源蛋白，在感染细胞中，能忠实地进行修饰，如糖基化、羧基化等；外源基因的表达产物具有良好的免疫原性，可诱导机体产生持续时间较长的细胞免疫和体液免疫；严格的胞浆内复制，避免了病毒基因重组入宿主细胞染色体的可能性，消除了重组病毒应用后对人畜的潜在威胁。FPV的宿主特异性使重组FPV(Recombinant FPV，rFPV)接种哺乳动物后仅产生流产性感染，但仍然可在较广范围的动物中正确表达外源基因，在细胞膜表面产生构像正确的抗原，从而诱发机体产生保护性免疫，且安全、有效，尤其是对免疫缺陷和免疫低下的动物是更为理想的载体。所以，FPV不仅可以用于研制禽类的基因工程活疫苗，而且可以作为非复制型病毒载体，研制哺乳动物基因工程活疫苗，用于禽类以外的动物乃至人类的免疫。因此，FPV载体的研究，尤其是FPV作为非复制型载体的研究日益受到人们的重视。

细胞因子对免疫系统具有刺激作用，但体外注射细胞因子，因其半衰期短，降解很快，在体内不能维持较高水平，到达特定靶细胞，需反复注射，随之而来的是严重的副作用。因此，体外注射细胞因子的疗效具有一定的局限性。而细胞因子在体内的与目的基因的共表达既可起到免疫佐剂的作用，又可以长期在体内进行表达而存在。IL-6属Th2型细胞因子，它能诱导B细胞增殖分化，并产生抗体，诱导B细胞克隆形成。IL-6对T淋巴细胞的作用，主要在CTL生成的晚期，其效应主要是通过增加靶细胞的有效溶解，来诱导机体产生体液免疫应答。

发明内容：

本发明的目的在于，提供一种重组鸡痘病毒，该重组鸡痘病毒可刺激小鼠产生有效的体液免疫和细胞免疫反应，可作为预防和治疗我国AIDS感染的活载体疫苗。

本发明方案是：

该疫苗提供三株共表达中国流行株I型人免疫缺陷病毒B亚型(HIV-1_CNB)结构蛋白与细胞因子人白细胞介素6(hIL-6)的重组鸡痘病毒vPUTAIL6-GAG、vPUTAIL6-GP和vPUTAIL6-GE，它们分别共表达HIV-1_CNB核心蛋白gag、外膜蛋白gp120或gag-gp120嵌合蛋白与hIL-6，该三株重组病毒均可刺激机体产生抗HIV-1的特异性体液免疫和细胞免疫。

将HIV-1_CNB核心蛋白gag基因和外膜蛋白gp120基因以及二者嵌合后，分别插入到鸡痘病毒表达载体pUTAL复合启动子ATI-P7.5×20下游，同时将细胞因子hIL-6插入到串联启动子P7.5×16下游，构建含HIV-1_CNB gag、gp120或gag-gp120嵌合基因和hIL-6基因的重组鸡痘病毒表达质粒；将构建的重组质粒与鸡痘病毒株在鸡胚成纤维细胞内进行同源重组，并用5-溴脱氧核糖尿苷(BUdR)进行加压筛选；重组病毒分别经PCR、Western blot和免疫荧光试验进行检测，筛选阳性重组鸡痘病毒；将筛选的阳性重组鸡痘病毒分别免疫BALBc小鼠并进行免疫学指标的检测。

本发明的优点和积极效果为：

1、本发明得到的三株重组鸡痘病毒可同时表达HIV-1_CNB结构蛋白和细胞因子hIL-6，且表达的蛋白可分别与相应的单克隆抗体发生特异性反应。

2、本发明得到的三株重组鸡痘病毒可刺激小鼠产生有效的体液免疫和细胞免疫。

3、本发明得到的三株重组鸡痘病毒对实验动物是安全的，无任何病理现象出现。

4、本发明得到的三株重组鸡痘病毒具有很好的遗传稳定性，经多次传代后外源基因不丢失，且可在非禽属动物(如哺乳动物)细胞中表达外源蛋白。

5、本发明所使用的目的基因为中国流行株HIV-1B亚型的结构蛋白基因，从而构建的重组鸡痘病毒可作为我国预防和治疗AIDS的活载体疫苗。

6、本发明中重组鸡痘病毒表达的细胞因子hIL-6起到了免疫佐剂的作用。

附图说明：

图1：重组质粒pUTAIL6-GAG构建流程图。

具体方法是将人白细胞介素6用HindIII和XhoI双酶切后插入到鸡痘病毒表达载体pUTAL P7.5串联启动子下游，同时将HIV-1 gag基因用BamHI和XhoI双酶切后，插入到鸡痘病毒表达载体pUTALATI-P7.5复合启动子下游，构建了共表达HIV-1 gag和人白细胞介素6的重组鸡痘病毒表达质粒pUTAIL6-GAG。

图2：重组质粒pUTAIL6-GP构建流程图。

具体方法是将人白细胞介素6用HindIII和XhoI双酶切后插入到鸡痘病毒表达载体pUTAL P7.5串联启动子下游，同时将HIV-1gp120基因用BamHI和XhoI双酶切后，插入到鸡痘病毒表达载体pUTAL ATI-P7.5复合启动子下游，构建了共表达HIV-1 gp120和人白细胞介素6的重组鸡痘病毒表达质粒pUTAIL6-GP。

图3：重组质粒pUTAIL6-GE构建流程图。

具体方法是将人白细胞介素6用HindIII和XhoI双酶切后插入到鸡痘病毒表达载体pUTAL P7.5串联启动子下游，同时将含有HIV-1gag-gp120嵌合基因的中间质粒用BamHI和XhoI双酶切后，插入到鸡痘病毒表达载体pUTAL ATI-P7.5复合启动子下游，构建了共表达HIV-1 gag-gp120和人白细胞介素6的重组鸡痘病毒表达质粒pUTAIL6-GE。

图4：中国株HIV-1 gag核苷酸序列。

图5：中国株HIV-1 gp120核苷酸序列。

图6：人白细胞介素6核苷酸序列。

图7：P7.5单一启动子的每个重复单位的核苷酸序列。

图8：牛痘病毒A型包涵体启动子(ATI)的核苷酸序列。

具体实施方式：

1、分子生物学常规的基因操作

大肠杆菌感受态细胞的制备与转化、质粒的提取及限制性内切酶消化、DNA片段的回收、线性DNA片段的连接、重组质粒的筛选与鉴定、PCR扩增反应等参照金冬雁、黎孟枫等译《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社(1992)相关章节进行。

2.重组表达质粒的构建

2.1嵌合基因gag-gp120中间质粒的构建

用限制性内切酶Xba I、Bgl II双酶切pKSGAG质粒后，回收HIV-1gag基因，同时用Xba I、BamH I双酶切pKSGP120质粒后，回收含HIV-1 gp120基因的大片段。将后者与gag基因定向连接，构建含嵌合基因的中间质粒pKSGE。

2.2含细胞因子hIL-6重组鸡痘病毒载体质粒的构建

用Hind III和Not I双酶切pKSIL6后回收IL-6，与用相同限制性内切酶双酶切的pET28a载体片段相连接，构建含IL-6的中间质粒pETIL-6。用HindIII和Xho I双酶切pETIL-6后回收IL-6片段，用HindIII和SalI双酶切pUTAL后回收不含LacZ基因的片段，两回收片段相连接后构建含细胞因子hIL-6的重组鸡痘病毒质粒pUTAIL6。

2.3共表达重组质粒的构建

分别用BamH I和Xho I双酶切质粒pKSGAG、pKSGP120和pKSGE，回收gag、gp120和gag-gp120嵌合基因，用Klenow补平后分别与经SmaI酶切并去磷的pUTAIL6相连接，构建gag、gp120和gag-gp120嵌合基因分别与IL6共表达重组鸡痘病毒载体质粒pUTAIL6-GAG，pUTAIL6-GP，pUTAIL6-GE。

3.同源重组及重组病毒的筛选、纯化

3.1 FPV毒价测定

用于同源重组的FPV经细胞传代复壮，计算空斑形成单位(PFU)，并用HE染色，鉴定病毒。将FPV按10²~10⁶稀释倍数接种于传代生长的6×30mm培养板CEF单层，补加含1％甲基纤维素和1％小牛血清(FCS)的MEM作为维持液，37℃，5％CO₂培养120h后，弃培养液，PBS(pH7.2)洗2次，室温下1％甲醛固定15min，自来水洗涤，0.1％结晶紫染色5min，自来水洗涤，统计病毒空斑数计算出每毫升病毒液中所含的空斑形成单位(Plaque forming units，PFU)。

PFU＝(病毒空斑数×稀释倍数)/染毒体积(ml)

3.2体内同源重组

质粒转染细胞采用脂质体法：于6×30mm培养板中接种传代的CEF 1×10⁵~3×10⁵个/ml，当细胞长至80％融合时，感染0.1MOI(Multiplicity of infection)的FPV，37℃，5％CO₂吸附2h后，与在室温下作用15~30min的转染试剂DOTAP和重组质粒的混合物共转染。即在500μl MEM中，加入15μl DOTAP Liposomal，轻轻混匀，另取500μl MEM加入重组质粒DNA 10μg混匀。然后将后者滴加于前一液体中轻轻混匀，温室下作用15~30min。转染后12~18h，更换新鲜配制的含2％FCS的MEM，继续培养48~72h，收获病毒。测重组病毒的毒价。

3.3重组病毒的筛选和纯化

在6×30mm培养板制备CEF单层，在接毒前24小时用含40μg/mlBUdR(5-溴脱氧核糖尿苷)的MEM营养液培养，然后按10MOI接种重组表达质粒转染后收获的病毒，5％CO2吸附2h后，再用含40μg/ml BUdR的MEM营养液培养120h，收获细胞。重复上述实验，然后将收获细胞反复冻融三次，在无BUdR的营养液中培养，待细胞出现病变后，分别挑出单个病毒蚀斑，纯化3次后，分别进行扩毒。用无BudR的MEM营养液培养，待出现细胞病变后挑出单个病毒蚀斑，并分别进行扩毒。

4.重组病毒的PCR鉴定

取20ul细胞培养物(冻融3次)加入到25ul蛋白酶K溶液(0.2mg/ml蛋白酶K，0.25％SDS，5mM EDTA，10mM Tris-HCl pH8.0)中，56℃反应2h，置95℃作用10min灭活蛋白酶K。加入1×PCR缓冲液使总体积为450ul，PCR时取5～25ul即可。PCR反应条件为97℃预变性5min后，按94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min共30个循环，最后72℃延伸10min。其中gag基因的PCR扩增引物为：5′-atgggtgcgagagcgtcagtatta-3′(上游引物)和5′-ccttcctttccacatttccaacag-3′(下游引物)；gp120基因的PCR扩增引物为：5′-ccttgggatgttgatgat-3′(上游引物)和5′-actcttctctttgccttggtg-3′(下游引物)；gag-gp120基因的PCR扩增引物为：5′-atgggtgcgagagcgtcagtatta-3′(上游引物)和5′-actcttctctttgccttggtg-3′(下游引物)。

5.重组病毒表达产物的检测

5.1间接免疫荧光鉴定重组病毒

取适量初步筛选并纯化的重组病毒，接种于飞片上CEF单层细胞，同时设FPV和细胞对照。37℃，5％CO₂感作2h，加入含1％FCS及0.5g甲基纤维素的MEM培养液，继续培养到细胞出现明显病变后，取出飞片，PBS(pH7.2)洗一次，100％丙酮固定10~15min，PBS冲洗。在用3％牛血清白蛋白缓冲液(10mmol/L Tris·Cl，pH7.5，150mmol/LNaCl，0.05％ Tween20)溶液封闭2h后，与中国人HIV-1阳性血清(1∶300)反应2h，PBS洗涤3次，然后与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗人IgG反应2h，PBS洗涤3~5次，载玻片上加一滴甘油缓冲液(50％甘油PBS)，将载有细胞的飞片倒置于载玻片上，于荧光显微镜下观察和拍照。

5.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

将扩增后的纯化重组病毒，以10MOI分别接种于10ml培养瓶1×10⁶个/ml CEF细胞中，同时设FPV对照和细胞对照，至细胞出现明显病变时，弃培养液，用1ml 37℃预热的TEN(40mmol/L Tris·ClpH7.5，1mmol/L EDTA，150mmol/L NaCl)洗脱细胞，收集于Eppendorf管中，3000r/min离心5min，弃上清，细胞沉淀用PBS洗一次，加60μl裂解缓冲液(10mmol/L Tris·Cl，pH7.4，1mmol/L MgCl₂，0.5％NP40，20μg/ml DNase I)裂解，冰浴30min，煮沸3min，5000r/min离心5min，-20冻存。

取30μl细胞裂解液与等量2×样品缓冲液(100mmol/L Tris·Cl，pH6.8，4％SDS，0.2％溴酚蓝，20％甘油，使用前加入2.5％β-巯基乙醇)混匀，于10％凝胶进行SDS-PAGE电泳。

5.3免疫印迹(Western blot)

经SDS-PAGE分离蛋白后，将其电转移至硝酸纤维素膜上。5％脱脂乳或3％牛血清白蛋白缓冲液(10mmol/L Tris·Cl，pH7.5，150mmol/LNaCl，0.05％Tween20)37℃封闭2h，洗涤缓冲液(10mmol/L Tris·ClpH7.5，150mmol/L NaCl，0.05％Tween20)洗涤3次，每次5~10min，中国人HIV-1阳性血清用封闭缓冲液稀释(1∶300)覆盖膜上，室温感作2h，洗涤3~5次，碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG(1∶1000)室温感作2h，洗涤3~5次后，每次5~10min，用10ml碱性磷酸酶缓冲液(100mmol/L NaCl，5mmol/L MgCl₂，100mmol/L Tris·Cl pH9.5)加入66μl NBT(0.5g NBT，70％二甲基甲酰胺)，混匀后再加33μlBCIP(0.5gBCIP，100％二甲基甲酰胺)，显色10~20min，用蒸馏水中止反应。

进行细胞因子hIL-6的Western blot检测时，一抗为兔抗人白细胞介素6单克隆抗体，二抗为碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG，其余试剂及步骤同上。

6.重组病毒表达外源蛋白的稳定性

将获得的重组病毒，用CEF细胞连续传10代，分别用第5和第10代重组病毒以10MOI的量接种同等量的CEF细胞，对收获的细胞总蛋白作SDS-PAGE和Western blot分析，检测目的蛋白的相对表达量。

7.重组FPV在非禽属细胞中对目的蛋白的表达

将获得的重组病毒以10MOI感染P815(小鼠的肥大细胞瘤细胞)和HeLa(人宫颈癌细胞)细胞。于感染后48h收获细胞，对细胞总蛋白作SDS-PAGE和Western blot分析，检测目的蛋白的表达量。

8.重组病毒的免疫原性研究

8.1重组病毒免疫小鼠

重组病毒接种CEF单层细胞，培养40h，收取感染细胞。4℃3000r/min离10min，细胞沉淀(培养液上清待用)悬浮于10mmol/LTris·Cl(pH8.0)溶液，于冰上超声波破碎4×15秒，将此悬液4℃3000r/min离心10min，取上清测定病毒PFU，调整病毒的滴度使其达到10⁷PFU。

BALB/c雌性小鼠84只，体重18～20g，随机分7组，采取足垫皮下注射方式，分别注射含细胞因子hIL-6的重组鸡痘病毒vUTAIL6-GAG、vUTAIL6-GP和vUTAIL6-GE，不含细胞因子hIL-6的重组鸡痘病毒vUTAGAG、vUTAGP和vUTAGE，和不含任何外源基因的FPV野生毒各0.5ml。上述各组均免疫三次，间隔20天，最后一次免疫后的第7天摘眼球取血，颈椎脱臼处死，凝血分离血清供ELISA检测抗HIV抗原的IgG抗体。无菌取其脾脏分别检测细胞毒性T细胞活性和用流式细胞仪分析T淋巴细胞亚类的数量。

8.2脾脏免疫学指标的检测

8.2.1脾脏单淋巴细胞悬液制备

颈椎脱臼处死小鼠，无菌条件下取出脾脏，置于盛有RPMI 1640培养基的平皿中，用玻片研磨，200目尼龙网过滤制成单细胞悬液，1500r/min，离心5min，弃上清。用Hanks液离心洗细胞两次，重悬于含10％NBS的RPMI 1640培养液中，计数，调至2×10⁷个/ml备用。

8.2.2脾T淋巴细胞亚类数量的检测

取脾细胞悬液0.1ml，加5ml PBS，1500r/min，离心10min，洗细胞两次，在0.5ml PBS细胞悬浮液中分别加荧光标记大鼠抗小鼠CD4⁺和CD8⁺单克隆抗体(此抗体用PBS按1∶10稀释)室温避光放置30min，再加5ml PBS洗一次，1500r/min离心10min，将管底细胞用200μl PBS悬浮，待上流式细胞仪检测。FACS检测10000个细胞，所得数据进行统计学处理。

8.2.3脾细胞特异性CTL细胞毒活性检测

采用脂质体法将纯化的真核表达质粒pdisplay-GE，在Lipofectin Reagent包裹后转染体外培养呈60％~80％单层的P815细胞，在G418加压下，转染细胞长成单层。单层细胞传代后，处于对数生长期时，加入740KBq/20μl的³H-TdR，混匀后于37℃，5％CO₂条件下培养4~6h，每1/2h振荡一次。标记后用Hanks液充分洗去未标记上的游离的³H-TdR，用NBS-1640培养液调成2×10⁵个/ml，作为靶细胞备用。将脾细胞悬液调成5×10⁶个/ml，作为效应细胞备用。96孔板加入效应细胞100μl和靶细胞50μl(三复孔)，设自发释放孔(单纯靶细胞孔)，37℃，5％CO₂条件下培养18h，终止培养前半小时加入含胰酶和DNA酶的Hanks液50μl，用多头细胞收集器收集细胞于49型玻璃纤维滤膜上，液闪法测定³H-TdR参入量，结果以cpm值表示。

CTL杀伤活性(³H-TdR释放率，％)＝(1-实验孔cpm/对照孔cpm)×100％

8.3 ELISA试剂盒测定免疫小鼠血清中抗HIV抗体

ELISA试剂盒中的包被抗原为灭活的全病毒，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体。在酶联免疫仪450nm测量各孔OD值。

检测结果：

获得的三株重组鸡痘病毒vUTAIL6-GAG、vUTAIL6-GP和vUTAIL6-GE提取基因组后进行PCR扩增，均得预期大小的目的片段。间接免疫荧光试验和Western blot检测均为阳性结果，说明构建的重组鸡痘病毒可分别表达HIV-1 gag蛋白、gp120蛋白和gag-gp120融合蛋白。三株重组鸡痘病毒均可在非禽属动物细胞中表达，且重组病毒具有良好的遗传稳定性。将重组鸡痘病毒大量扩增后进行小鼠免疫实验，可在免疫小鼠血清中检测到抗HIV-1结构蛋白和人白细胞介素6的抗体，表明重组病毒刺激小鼠机体产生了特异性体液免疫。免疫小鼠脾T细胞亚类数量的检测及CTL杀伤试验结果均显示小鼠产生了特异性细胞免疫。以不含细胞因子的重组病毒做对照，结果显示人白细胞介素6起到了免疫佐剂的作用。

研究结果表明，三株重组鸡痘病毒是一种安全、有效的基因工程活载体疫苗，具有开发成为用于艾滋病预防性和治疗性疫苗的良好前景。

Claims

1、一种共表达HIV-1_CNB结构蛋白与hIL-6的重组鸡痘病毒活载体疫苗，其特征在于：该疫苗提供三株共表达中国流行株I型人免疫缺陷病毒B亚型(HIV-1_CNB)结构蛋白与细胞因子人白细胞介素6(hIL-6)的重组鸡痘病毒vPUTAIL6-GAG、vPUTAIL6-GP和vPUTAIL6-GE，它们分别共表达HIV-1_CNB核心蛋白gag、外膜蛋白gp120或gag-gp120嵌合蛋白与hIL-6，该三株重组病毒均可刺激机体产生抗HIV-1的特异性体液免疫和细胞免疫。

2、根据权利要求1所述的共表达HIV-1_CNB结构蛋白与hIL-6的重组鸡痘病毒活载体疫苗的构建方法，其特征在于：将HIV-1_CNB核心蛋白gag基因和外膜蛋白gp120基因以及二者嵌合后，分别插入到鸡痘病毒表达载体pUTAL复合启动子ATI-P7.5×20下游，同时将细胞因子hIL-6插入到串联启动子P7.5×16下游，构建含HIV-1_CNB gag、gp120或gag-gp120嵌合基因和hIL-6基因的重组鸡痘病毒表达质粒；将构建的重组质粒与鸡痘病毒株在鸡胚成纤维细胞内进行同源重组，并用5-溴脱氧核糖尿苷(BUdR)进行加压筛选；重组病毒分别经PCR、Western blot和免疫荧光试验进行检测，筛选阳性重组鸡痘病毒；将筛选的阳性重组鸡痘病毒分别免疫BALBc小鼠并进行免疫学指标的检测。