CN107955815B - 抗hiv-1基因、该基因的应用、具有该基因的dc疫苗及疫苗制备方法 - Google Patents

抗hiv-1基因、该基因的应用、具有该基因的dc疫苗及疫苗制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了抗HIV‑1基因、该基因的应用、具有该基因的DC疫苗及疫苗制备方法，所述基因由GM‑CSF核酸人工序列与gp120‑CD4模块串联组成，所述gp120‑CD4模块含有以下基因片段中的至少一条；(1)gp120(B)核酸人工序列、G4S核酸人工序列、CD4核酸人工序列；(2)gp120(C)核酸人工序列、G4S核酸人工序列、CD4核酸人工序列；(3)gp120(AE)核酸人工序列、G4S核酸人工序列、CD4核酸人工序列。本发明为将gp120与CD4类似物或CD4“迷你蛋白”连接在一起，使其构象发生改变并在CD4结合位点上暴露出抗原表位，使抗体识别并与暴露出的抗原相结合，从而刺激机体产生细胞免疫和体液免疫反应。

Description

抗HIV-1基因、该基因的应用、具有该基因的DC疫苗及疫苗制 备方法
技术领域
本发明涉及基因技术领域，尤其涉及抗HIV-1基因、该基因的应用、具有该基因的DC疫苗及疫苗制备方法。
背景技术
艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)是由Ⅰ型人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus 1，HIV-1)感染引起的一种死亡率极高的慢性传染病，已成为威胁人类最严重的病毒病之一。据世界卫生组织的估计，目前全球约有4000万人受艾滋病病毒感染，其中200万为儿童，死亡人数达到3500万。目前已有40多种HIV疫苗用于预防或治疗艾滋病，包括灭活疫苗、减毒活疫苗、重组亚单位疫苗、重组活载体疫苗、DNA疫苗，但由于HIV-1(HIV)变异快、亚型多、攻击自身免疫系统等特点，HIV疫苗虽已进入临床试验但是均未达到预期的效果，从而限制了其应用。因此，迫切需要研发一种安全、有效、具有良好免疫保护作用的HIV疫苗。
目前，发现艾滋病、结核及乙型肝炎等一些慢性疾病在持续性、周期性感染中，应用其治疗性疫苗后，可控制感染并增强机体的天然免疫力，成为当前病毒研究的热点。利用包膜蛋白(ENV)诱发有效的中和抗体，一直是HIV疫苗研发的重要策略。专利申请号为201010126144.3的中国专利，公开了密码子优化的HIV-1gp120基因共有序列及gp120核酸疫苗。本发明应用多序列比对分析，获得中国HIV-1流行病毒株(A/E重组亚型、B/C重组亚型和ThB亚型)包膜蛋白gp120共有氨基酸序列；应用人工合成的方法制备编码共有氨基酸序列的gp120基因片段，该基因经密码子优化，兼顾了哺乳动物细胞和大肠杆菌密码子使用偏好；在此基础上，构建了由gp120基因和真核表达载体pJW4303组成的HIV-1gp120核酸疫苗。该核酸疫苗可以应用于动物和人体免疫，也可以应用于gp120蛋白的表达和生产。但是，在试验中发现，抗原表位比较难暴露，导致结合位点亲和力较弱，病毒突变免疫逃逸的可能性大大增加。
因此，开发一种新抗HIV-1基因，并利用其制备成疫苗，不但具有迫切的研究价值，也具有良好的经济效益和医用潜力，这正是本发明得以完成的动力所在和基础。
发明内容
为了克服上述所指出的现有技术的缺陷，本发明人对此进行了深入研究，在付出了大量创造性劳动后，从而完成了本发明。
具体而言，本发明所要解决的技术问题是：提供抗HIV-1基因、该基因的应用、具有该基因的DC疫苗及疫苗制备方法，以提高结合度。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
第一方面，本发明提供了抗HIV-1基因，该基因由GM-CSF核酸人工序列与gp120-CD4模块串联组成，所述gp120-CD4模块含有以下基因片段中的至少一条；
(1)gp120(B)核酸人工序列、G4S核酸人工序列、CD4核酸人工序列；
(2)gp120(C)核酸人工序列、G4S核酸人工序列、CD4核酸人工序列；
(3)gp120(AE)核酸人工序列、G4S核酸人工序列、CD4核酸人工序列；
当所述gp120-CD4模块含有两条或以上的基因片段时，含有的所述基因片段串联。
更详细的说，本发明的抗HIV-1基因可以为如下基因序列：GM-CSF-(1)、GM-CSF-(2)、GM-CSF-(3)、GM-CSF-(1)-(2)、GM-CSF-(1)-(3)、GM-CSF-(2)-(3)、GM-CSF-(1)-(2)-(3)；也可以是GM-CSF-(2)-(1)、GM-CSF-(3)-(1)、GM-CSF-(3)-(2)、GM-CSF-(2)-(1)-(3)、GM-CSF-(2)-(3)-(1)、GM-CSF-(3)-(1)-(2)、GM-CSF-(3)-(2)-(1)、GM-CSF-(1)-(3)-(2)。
本发明中，作为一种优选的技术方案，所述抗HIV-1基因为以下基因序列顺序串联：
GM-CSF核酸人工序列，如SEQ ID NO.1；
gp120(B)核酸人工序列，如SEQ ID NO.2；
G4S核酸人工序列，如SEQ ID NO.5；
CD4核酸人工序列，如SEQ ID NO.6；
gp120(C)核酸人工序列，如SEQ ID NO.3；
G4S核酸人工序列，如SEQ ID NO.5；
CD4核酸人工序列，如SEQ ID NO.6；
gp120(AE)核酸人工序列，如SEQ ID NO.4；
G4S核酸人工序列，如SEQ ID NO.5；
CD4核酸人工序列，如SEQ ID NO.6。
本发明中，将上述的基因定义为GM-CSF-gp120(B)-CD4-gp120(C)-CD4-gp120(AE)-CD4(或HIV-gp120-CD4)。
第二方面，本发明提供了该基因的应用。该基因在制备抑制HIV病毒药物方面的应用。尤其是在抑制HIV-1的B、C、CRF01_AE三种亚型中国流行株病毒药物方面的应用。在应用时，可以将该基因制成DC疫苗。
第三方面，本发明提供了具有该基因的DC疫苗。所述DC疫苗是指具有所述抗HIV-1基因的DC细胞。
第四方面，本发明提供了疫苗制备方法，包括如下步骤：
(1)人工合成所述抗HIV-1基因的整个表达框，插入到慢病毒表达载体plent-C-GFP，纯化后获得重组表达载体的高品质质粒；
(2)将步骤(1)得到的质粒与慢病毒包装质粒采用磷酸钙转染法共转染293T细胞，培养后得到g120-CD4病毒液；
(3)利用步骤(2)得到的g120-CD4病毒液感染未成熟的DC细胞，并培养未成熟的DC细胞至成熟，即得到表达gp120-CD4的DC疫苗。
采用了上述技术方案后，本发明的有益效果是：
HIV的包膜蛋白是一种约160KD的糖蛋白(gp160)，在病毒感染宿主细胞过程中，gp160被宿主细胞蛋白酶裂解，形成gp120和整体膜蛋白gp41，gp41蛋白在病毒粒子的膜层中固定，gp120则固定在膜上段向周围环境突出，gp120多肽有助于介导HIV病毒进入宿主细胞。研究表明，HIV的感染机制是gp120与宿主表面的CD4相互作用，从而导致辅助受体结合位点(如V3环以及桥片层的形成和暴露)，进一步与辅助受体(CCR5或是CXCR4)的结合导致病毒膜和细胞膜的融合并使病毒进入，最终造成人类免疫细胞的大量死亡。CD4的结合能够使gp120结构更加紧凑和稳定的构象，降低了gp120结构的构象多样性，将gp120局限于有限的构象状态。根据此感染机制的启发，本发明采用HIV-1包膜多肽，将gp120与CD4类似物或CD4“迷你蛋白”连接在一起，即gp120-CD4，其构象发生改变并在CD4结合位点上暴露出抗原表位，使抗体识别并与暴露出的抗原相结合，从而刺激机体产生细胞免疫和体液免疫反应(见图1)。
更详细的说，本发明具有如下优势：
1、选取包膜蛋白gp120为抗原识别位点，该包膜蛋白为逆转录病毒所共有，也含有CTL和TH决定簇，既克服了HIV亚型多、变异快的缺点，又能激发特异性T细胞产生较强的免疫反应，促使机体产生更强的抗HIV的细胞免疫反应。
2、首次将gp120与CD4类似物或CD4“迷你蛋白”连接在一起，即gp120-CD4，诱导ENV构象发生变化并在CD4受体结合位点上暴露出抗原表位，进而抑制病毒突变的免疫逃逸，并可诱导机体产生更强的体液免疫反应。
3、相对于现存的治疗HIV的抗逆转录病毒药物和疫苗，本发明研究的艾滋病DC疫苗能有效抑制病毒，并防止病毒反弹，诱导产生的体液免疫反应较强，持续时间较长等优点。
4、本发明研究的携带gp120-CD4复合物的HIV DC疫苗的基因序列来自HIV-1的B、C、CRF01_AE三种亚型中国流行株，该疫苗可作为我国预防和治疗艾滋病的DC疫苗。
附图说明
图1为gp120与CD4相结合暴露抗原表位的示意图；
图2为本发明DC疫苗质粒HIV-gp120-CD4的模块图；
图3为本发明所述的GM-CSF-gp120(B)-CD4-gp120(C)-CD4-gp120(AE)-CD4重组基因设计图；
图4为小鼠免疫4周和6周后，ELISPOT法检测DC-gp120-CD4疫苗组、HIV DNA疫苗组、DC疫苗组和空白对照组中野生型小鼠gp120特异性细胞免疫反应对比图；
图5为小鼠免疫6周后，ELISA检测DC-gp120-CD4疫苗组、HIV DNA疫苗组、DC疫苗组和空白对照组中野生型小鼠血清中的抗体水平对比图；
图6为DC-gp120-CD4疫苗治疗组和DC疫苗对照组对靶细胞的杀伤活性比较图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明进一步说明。但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。
实施例1
抗HIV-1基因，该基因由GM-CSF核酸人工序列与gp120-CD4模块串联组成，所述gp120-CD4模块含有以下基因片段中的至少一条；
(1)gp120(B)核酸人工序列、G4S核酸人工序列、CD4核酸人工序列；
(2)gp120(C)核酸人工序列、G4S核酸人工序列、CD4核酸人工序列；
(3)gp120(AE)核酸人工序列、G4S核酸人工序列、CD4核酸人工序列；
当所述gp120-CD4模块含有两条或以上的基因片段时，含有的所述基因片段串联。
更详细的说，本发明的抗HIV-1基因可以为如下基因序列：GM-CSF-(1)、GM-CSF-(2)、GM-CSF-(3)、GM-CSF-(1)-(2)、GM-CSF-(1)-(3)、GM-CSF-(2)-(3)、GM-CSF-(1)-(2)-(3)；也可以是GM-CSF-(2)-(1)、GM-CSF-(3)-(1)、GM-CSF-(3)-(2)、GM-CSF-(2)-(1)-(3)、GM-CSF-(2)-(3)-(1)、GM-CSF-(3)-(1)-(2)、GM-CSF-(3)-(2)-(1)、GM-CSF-(1)-(3)-(2)。
本实施例选择了其中一条为例进行说明。本实施例的抗HIV-1基因为以下基因序列顺序串联：GM-CSF核酸人工序列，如SEQ ID NO.1；gp120(B)核酸人工序列，如SEQ IDNO.2；G4S核酸人工序列，如SEQ ID NO.5；CD4核酸人工序列，如SEQ ID NO.6；gp120(C)核酸人工序列，如SEQ ID NO.3；G4S核酸人工序列，如SEQ ID NO.5；CD4核酸人工序列，如SEQ IDNO.6；gp120(AE)核酸人工序列，如SEQ ID NO.4；G4S核酸人工序列，如SEQ ID NO.5；CD4核酸人工序列，如SEQ ID NO.6。该基因下称HIV-gp120-CD4。
分别按SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.3、SEQID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6的核酸编码序列委托生工生物工程(上海)有限公司合成其整个表达框。
实施例2
HIV-gp120-CD4基因的纯化。
更详细的说，上述步骤为：
将合成的HIV-gp120-CD4基因插入标准载体pUC上，因此命名为pUC-HIV-gp120-CD4，将pUC-HIV-gp120-CD4进行Fast Digest AsiSI(购自ThermoFisher公司)和FastDigest NotI(购自ThermoFisher公司)双酶切，37℃，酶切20min。100μl酶切体系为：10×buffer：10μl；DNA 6μg；AsiSI酶：3μl；NotI酶：3μl；去离子水补足体积。
利用琼胶电泳将把含有HIV-gp120-CD4DNA片段的琼胶部位切下，放在两个离心管中。采用DNA extraction kit(购自ThermoFisher公司)将DNA从琼胶中溶出并浓缩，首先往上述离心管加入500μl DF buffer，55℃作用10分钟，每2-3分钟摇晃一次，直至琼胶完全溶解。再将琼胶溶液全部吸入DF Column，并套上Collection Tube(收集过滤液)。8000rpm离心1分钟，将过滤液倒掉。再加入500μl Wash Buffer，8000rpm离心1分钟，过滤液倒掉。12000rpm离心2分钟确保乙醇被去除。最后将DF Column转移至上另一干净的微量离心管，加入25μl Elution Buffer，室温静置2分钟后，14000rpm离心2分钟，微量离心管内的液体即为纯化的HIV-gp120-CD4片段。
实施例3
含有HIV-gp120-CD4基因的质粒制备。
将实施例2合成的HIV-gp120-CD4基因插入到慢病毒表达载体pLent-C-GFP(Invitrogen)NotI-AsiSI位点(见图2)。
更详细的说，采用如下方法制备：
同时将pUC-HIV-gp120-CD4(实施例2第一步骤中制备得到)和pLent-C-GFP载体进行Fast Digest AsiSI(购自ThermoFisher公司)和Fast Digest NotI(购自ThermoFisher公司)双酶切，37℃，酶切20min。100μl酶切体系为：10×buffer：10μl；DNA 6μg；AsiSI酶：3μl；NotI酶：3μl；去离子水补足体积。利用琼胶电泳将分别把含有HIV-gp120-CD4DNA片段和线性化的pLent-C-GFP DNA片段的琼胶部位切下，放在两个离心管中。采用DNA extractionkit(购自ThermoFisher公司)将DNA从琼胶中溶出并浓缩，首先往上述离心管加入500μl DFbuffer，55℃作用10分钟，每2-3分钟摇晃一次，直至琼胶完全溶解。再将琼胶溶液全部吸入DF Column，并套上Collection Tube(收集过滤液)。8000rpm离心1分钟，将过滤液倒掉。再加入500μl Wash Buffer，8000rpm离心1分钟，过滤液倒掉。12000rpm离心2分钟确保乙醇被去除。最后将DF Column转移至上另一干净的微量离心管，加入25μl Elution Buffer，室温静置2分钟后，14000rpm离心2分钟，微量离心管内的液体即为纯化的HIV-gp120-CD4DNA片段和线性化的pLent-C-GFP DNA片段。
将上述两种DNA片段在16℃进行过夜连接形成pLent-HIV-gp120-CD4质粒。连接体系为：10×buffer：1μl；T4连接酶：1μl；HIV-1-CD4-CAR DNA：4μl；线性化的pLent-C-GFPDNA：4μl。
实施例4
质粒的纯化实施例。
将上述pLent-HIV-gp120-CD4转化到E.coli(DH5α)。具体步骤如下：将质粒和感受态细胞混匀在冰上孵育半小时，再42度热激90秒，再冰上放置2min，最后加液体LB培养基缓摇1个小时左右再3000rpm离心5min，将100μl菌液涂布在含有氨苄LB固体平板。
次日挑取单菌落进行过夜培养，采用质粒提取纯化试剂盒(购自Invitrogen公司)提取pLent-HIV-gp120-CD4质粒，具体步骤如下：(1)取1.5ml菌液室温10000×g离心1min。(2)去上清，加250μl溶液Ⅰ(含RNase A)，涡漩振荡器震荡至菌体完全悬浮。(3)加入250μl溶液Ⅱ，温和颠倒离心管4～6次，获得澄清的裂解液。最好室温孵育2min。(4)加350μl溶液Ⅲ，温和颠倒数次混合，至出现白色絮状沉淀，室温10000×g离心10min。(5)特别小心吸取上清，移至洁净的装配好容积2ml离心管的吸收柱中。要保证没有吸入沉淀和细胞碎片。室温10000×g离心1min，至裂解物完全通过吸收柱。(6)弃滤过液，加500μl Buffer HBC，10000×g离心1min，清洗吸收柱，除去残余蛋白质保证DNA的纯度。(7)弃滤过液，再用100％乙醇稀释的750μl Wash Buffer清洗吸收柱，10000×g离心1min。(8)再加750μl Wash Buffer清洗吸收柱。(9)必须将吸收柱10000×g离心2min确保乙醇被去除。(10)将吸收柱放入干净1.5ml离心管，加50-100μl(取决于需要的终浓度)无菌去离子水或TE缓冲液在滤膜上，10000×g离心5min，收集质粒DNA。(11)和预知浓度DNA样品(Marker)一起做琼脂糖凝胶电泳，对比结果，得出pLent-HIV-gp120-CD4质粒浓度为332ng/μl。
将上述的pLent-HIV-gp120-CD4质粒委托生工生物工程(上海)有限公司进行测序。经测序正确后备用。
实施例5
DC疫苗，该DC疫苗是指具有所述抗HIV-1基因的DC细胞。该抗HIV-1基因可以为如下基因序列：GM-CSF-(1)、GM-CSF-(2)、GM-CSF-(3)、GM-CSF-(1)-(2)、GM-CSF-(1)-(3)、GM-CSF-(2)-(3)、GM-CSF-(1)-(2)-(3)；也可以是GM-CSF-(2)-(1)、GM-CSF-(3)-(1)、GM-CSF-(3)-(2)、GM-CSF-(2)-(1)-(3)、GM-CSF-(2)-(3)-(1)、GM-CSF-(3)-(1)-(2)、GM-CSF-(3)-(2)-(1)、GM-CSF-(1)-(3)-(2)。本实施例同样以GM-CSF-(1)-(2)-(3)为例。
实施例6
疫苗制备。
疫苗制备方法，包括如下步骤：
(1)人工合成所述抗HIV-1基因的整个表达框，插入到慢病毒表达载体plent-C-GFP，纯化后获得重组表达载体的高品质质粒；
(2)将步骤(1)得到的质粒与慢病毒包装质粒采用磷酸钙转染法共转染293T细胞，培养后得到g120-CD4病毒液；
(3)利用步骤(2)得到的g120-CD4病毒液感染未成熟的DC细胞，并培养未成熟的DC细胞至成熟，即得到表达gp120-CD4的DC疫苗。
更详细的说，步骤为：
采用实施例1-4的方法，获得重组表达载体的高品质质粒；
慢病毒包装及滴度检测
将慢病毒包装细胞系293T接种于含有DMEM+10％FBS 10cm培养皿中，37℃，5％的CO2条件下培养，贴壁率为70％-80％后进行转染。将实施例1中的重组质粒(约10μg)和空载质粒(约10μg)分别与慢病毒包装质粒采用磷酸钙转染法共转染293T细胞，轻轻混匀，置于37℃、5％CO2培养箱中培养12h，加入含10％FBS的DMEM液体培养基8mL，继续培养至48小时。48h后在倒置荧光显微镜下观察到细胞内有绿色荧光蛋白表达。72h后，收集上清，除去细胞碎片，收获病毒后进行浓缩，获得高浓缩的g120-CD4病毒液，-70℃低温冰箱中保存备用。根据Lenti-XTMGo StixTM试剂盒(北京华夏远洋科技有限公司产品)测定病毒滴度，结果表明，重组慢病毒的滴度3.08×106pfu/mL。
未成熟DC(imDC)的扩增和培养
采集正常人的外周血50ml，利用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，培养基(购自TaKaRa公司，GT-T551)中，37℃、5％的CO2条件下培养3小时后，洗去悬浮T细胞，留取贴壁细胞，贴壁细胞为未成熟DC。未成熟DC加入细胞因子IL-4(20ng/ml)，GM-CSF(40ng/ml)，37℃、5％的CO2条件下培养5天(每隔1天换液)，完成imDC的扩增培养。
重组慢病毒分别感染imDC及DC细胞的成熟
将imDC以1×106个细胞/孔的量接种在12孔培养板中，以MOI＝10的重组慢病毒感染上述imDC，感染8-12h后，用PBS洗涤细胞2-3次，然后在含有成熟因子的DC培养基中，其中含IL-4(20ng/ml)、GM-CSF(40ng/ml)、TNF-α40ng/ml)，继续培养48h，到成熟的DC细胞(mDC)。通过倒置显微镜观察DC成熟后细胞形态，探针检测gp120-CD4基因表达情况；流式细胞仪分析DC细胞成熟标志的表达情况。重组慢病毒感染DC前体细胞后，带有CD86、CD80及CD11c成熟标记的阳性细胞率为92.5％、93.8％和83.6％，利用流式细胞技术对其进行分析，结果表明，gp120-CD4负载的DCs中表达gp120-CD4的细胞占总细胞比率为86.3％。
实施例7
该抗HIV-1基因在抑制HIV-1的B、C、CRF01_AE三种亚型中国流行株病毒药物方面能够得到有效的应用。在应用时，可以将该基因制成DC疫苗。下述的实施例则以实施例6制备得到的DC疫苗为例进行试验。
实施例8
HIV特异性DC疫苗的免疫原性
1.DC疫苗免疫BALB/C小鼠
每组10只6-8周龄的雌性BALB/C小鼠(购自广州中医药大学，雌性，属SPF(III)级动物)，分为4组，将收获的DC-gp120-CD4疫苗、HIV DNA疫苗(阳性对照)、DC疫苗(阴性对照)分别肌肉注射小鼠2×105细胞/只，共免疫两次，间隔2周，另外设置，生理盐水作为空白对照。分别在免疫后4周和6周，摘眼球取血并处死小鼠，分离血清(-20℃保存)，进行免疫检测。
2.ELISPOT法检测细胞免疫水平
采用ELISPOT(品牌：Millipore，购自达科为生物科技有限公司试剂盒)检测4组小鼠体内淋巴细胞的特异性细胞免疫反应。见图4。免疫4周后，DC-gp120-CD4疫苗可诱发小鼠产生较强的特异性细胞免疫反应，免疫6周后，针对抗原的特异性细胞免疫应答显著增强，且明显高于阳性对照组HIV DNA疫苗，表明本发明所制备的DC疫苗能够诱导小鼠产生抗原特异性细胞免疫应答，并促进其杀伤作用。
3.抗-HIV IgG抗体水平的检测
ELISA试剂盒检测，空白组和DC疫苗组小鼠血清抗-HIV IgG均为阴性；DC-gp120-CD4疫苗组小鼠血清全部阳转，HIV DNA疫苗组小鼠血清80％阳转；DC-gp120-CD4疫苗组抗体滴度明显高于HIV DNA疫苗组、DC疫苗组和空白组，见图4。结果表明，本发明研发的DC-gp120-CD4疫苗的阳转数较高，选取的检测时间为免疫后6周，抗体滴度已开始下降，而DC-gp120-CD4疫苗免疫原在小鼠体内持续时间较长，说明DC-gp120-CD4疫苗可诱导机体产生体液免疫反应，且持续时间较长。
实施例9
DC疫苗诱导的特异性CTL及靶细胞杀伤实验
1.T淋巴细胞的诱导活化
将实施例4得到的gp120-CD4负载的DCs加入丝裂素(25g/ml)孵育45min，使其失去增殖活性，用PBS洗2遍，用培养基重悬并调细胞浓度为1×105/ml，分离培养正常人的T淋巴细胞也用培养基重悬并调细胞浓度为2×106/ml。按DC:T浓度比为1:20的比例混合于24孔培养板共培养，隔3天换1次液并加入400μ/ml的IL-2维持T细胞生长。培养至第四天加入等量的gp120-CD4负载的DCs，通过重复刺激诱导特异性CTL克隆的活化增殖，继续培养，倒置显微镜观察细胞形态、大小、数量等变化，台芬兰拒染法检测细胞活性并观察细胞增殖情况，至第7天收集活化的T淋巴细胞即CTL。
2.特异性CTL对靶细胞的杀伤活性
将gp120-CD4负载的DCs诱导活化的T淋巴细胞为效应细胞，表达HIV的阳性gp120细胞系(委托北京合生基因科技有限公司构建)作为靶细胞进行杀伤活性测定。分组如下：gp120-CD4负载的DCs诱导活化的T淋巴细胞为治疗组，DCs(未负载gp120-CD4的DCs)诱导活化的T淋巴细胞为对照组，按照效应细胞与靶细胞数量比例为2：1加入96孔培养板中，每孔总体积为200μl，每组3个重复，同时设置单独的效应细胞与靶细胞作为空白对照，置于5％CO2、37℃培养箱培养12h，用MTT显色法鉴定实验孔和对照孔OD570nm值并计算杀伤率，杀伤率＝[单独靶细胞OD值+单独效应细胞OD值-实验孔OD值]/单独靶细胞OD值
由图6看出，gp120-CD4负载的DCs诱导活化的CTL对gp120靶细胞的杀伤活性明显高于未经抗原负载的DCs诱导活化的CTL(P<0.01)，未经HIV抗原感染的对照组由于DC无抗原呈递对象，其本身不能刺激T细胞产生CTL反应，故在杀伤试验中，其识别及杀伤率极低。另外测得该效应细胞对正常细胞的杀伤率接近为0，表明对正常组织细胞无杀伤作用。
上述实验表明，本发明所制备的DC疫苗能够有效地将抗原呈递给T细胞并使其激活并产生特异性的CTL反应，诱导机体产生HIV-1抗原的特异性细胞免疫应答和体液免疫应答，且持续时间较长，从而达到预防和治疗HIV的疗效。
应当理解，这些实施例的用途仅用于说明本发明而非意欲限制本发明的保护范围。此外，也应理解，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改和/或变型，所有的这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的保护范围之内。

Claims (5)

1.DC疫苗，其特征在于：包含抗HIV-1基因，所述抗HIV-1基因由GM-CSF核酸人工序列与gp120-CD4模块串联组成，且为以下基因序列顺序串联：
GM-CSF核酸人工序列，如SEQ ID NO.1；
gp120(B)核酸人工序列，如SEQ ID NO.2；
G4S核酸人工序列，如SEQ ID NO.5；
CD4核酸人工序列，如SEQ ID NO.6；
gp120(C)核酸人工序列，如SEQ ID NO.3；
G4S核酸人工序列，如SEQ ID NO.5；
CD4核酸人工序列，如SEQ ID NO.6；
gp120(AE)核酸人工序列，如SEQ ID NO.4；
G4S核酸人工序列，如SEQ ID NO.5；
CD4核酸人工序列，如SEQ ID NO.6。
2.如权利要求1所述的DC疫苗，其特征在于：所述抗HIV-1基因采用包括如下步骤的方法合成：
(1)分别按GM-CSF核酸人工序列、gp120(B)核酸人工序列、G4S核酸人工序列、CD4核酸人工序列、gp120(C)核酸人工序列、G4S核酸人工序列、CD4核酸人工序列、gp120(AE)核酸人工序列、G4S核酸人工序列、CD4核酸人工序列，合成其整个表达框并插入标准载体pUC上得到pUC-HIV-gp120-CD4；
(2)将pUC-HIV-gp120-CD4进行双酶切，利用琼胶电泳将含有HIV-gp120-CD4 DNA片段琼胶部位切下，利用DNA extraction kit溶胶液处理、过DF柱弃滤液、漂洗DF柱、空离、洗脱DF柱、收集离心物，得到纯化的HIV-gp120-CD4片段，即所述抗HIV-1基因。
3.如权利要求1所述的DC疫苗在制备抑制HIV病毒药物方面的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：在制备抑制HIV-1的B、C、CRF01_AE三种亚型中国流行株病毒药物方面的应用。
5.制备如权利要求1所述疫苗的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)人工合成所述抗HIV-1基因的整个表达框，插入到慢病毒表达载体pLent-C-GFP，纯化后获得重组表达载体的质粒；
(2)将步骤(1)得到的质粒与慢病毒包装质粒采用磷酸钙转染法共转染293T细胞，培养后得到g120-CD4病毒液；
(3)利用步骤(2)得到的g120-CD4病毒液感染未成熟的DC细胞，并培养未成熟的DC细胞至成熟，即得到表达gp120-CD4的DC疫苗。
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