JPH05501654A - 霊長類レンチウイルスワクチン - Google Patents
霊長類レンチウイルスワクチンInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
霊長類レンチウィルスワクチン
１豆立１１
この発明は、一般に、霊長類レンチウィルス及びそれらの防御ワクチンとしての
利用の分野にある。
ヒト免疫不全ウィルス１型（ＨＩ Ｖ−ｉ ） （レトロウィルスのレンチウィ
ルスサブファミリーの一員）は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）という病気
の病因子である（ Ｆ、 Ｂａｒｒｅ−Ｓｉｎｏｕｓｓｉ等、５ｃｉｅｎｃｅ
２２０：８６８．１９８３、Ｒ，Ｃ，Ｇａ１ｌｏ等、５ｃｉｅｎｃｅ ２２４：
５００．１９８４ ） ａこのウィルスは免疫系を抑制し、様々な日和見感染及
び新生物に対して宿主を高度に感受性にする。このＡＩＤＳ伝染病は世界中に広
まっており、数千人のヨーロッパ人及び恐らく数百万人のアフリカ人がこのウィ
ルスに感染している（Ｔ、仁Ｑｕｉｎｎ等、５ｃｉｅｎｃｅ ２３４：９５５．
１９１１１６ ） 。
１９８７年１２月現在で４７．０００例のＡＩＤＳが合衆国内にあり、更に百〜
二百万人が感染でいる（しかし、その時点では無症候である）と見積もられた（
Ｕ、Ｓ。
Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ ５ｅｒｖｉｃｅ、 Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ
Ｒｅｐ、 １０１：３４１゜１９８６） 、 ＨＩ Ｖ感染は性的接触により
、感染血液又は血液製剤により、モして周産期に母親から幼児に広がる（Ａ、
Ｓ、 Ｆａｕｃｉ等、＾ｎｎ、 Ｉｎｔｅｒｎ、 Ｍｅｄ、、出：９２．１９＋
１４゜Ｊ、 Ｗ、 Ｃｕｒｒａｎ 等、５ｃｉｅｎｃｅ ２２９：１３５２．１
９８５） ｍ密接に関係しているが全く別のウィルスであるヒト免疫不全ウィル
ス２型（）ＩＩＶ−２）がＨＩＶ−１誘発ＡＩＤＳに類似する臨床的症候群を有
する患者から単離された。ＨＩＶ−２は、ＨＩＶ−１と有意の程度の配列ホモロ
ジー及び血清学的反応性を共有する（Ｆ、 Ｃ１ａｖｅｌ。
Ｎ、 Ｅｎｇ、 Ｊ、 ｏｆ Ｍａｄ、 ３１６：１１ｇ０．１９８７ ） 。
Ｂ、 Ｈａｈｎ等（Ｎａｔｕｒｅ ３１２：１６Ｂ、 １９ｇ４）及びＧ、 Ｍ
、 Ｓｈａｗ等（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２６：１１６５．１９８４）は、培養細胞
に感染することの出来るＨＩＶ−１のＤＮＡクローンの単離を報告している。
１． Ｒａｔｎｅｒ等（Ｎａｔｕｒｅ ３１３：２７７、１９８５）及びＳ、
１ａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ等（Ｃｅ１ｌ ４０：９．１９８５）はＨＩＶ−１の完
全なヌクレオチド配列を報告している。
ＨＩＶ−１ゲノムは少な（とも９つのオープンリーディングフレームを含む＊
Ｃｕ１ｌｅｎ及び胃、 Ｃ，Ｇｒｅｅｎ （Ｃｅ１１５８：４２３．１９８９）
によって目録化、されたように、これらは構造蛋白質（Ｇａｇ、 Ｐａｌ、 Ｅ
ｎｖ ） 、ウィルス粒子の形態形成及び成熟に必要な蛋白質（Ｖｉｆ、 Ｖｐ
ｕ） 、非構造用の制御蛋白質（Ｔａｔ、 Ｒｅｖ、 Ｎｅｆ ） 、及び機能
未知の蛋白質（Ｖｐｒ ）をコードしている。
サルの免疫不全ウィルス（Ｓ Ｉ Ｖ）は、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２の最も近
い既知の近縁種である非ヒト霊長類レンチウィルスである。それらは、遺伝的構
成及び生物学的特性において、それらのヒトにおける同等物と類似している。Ｈ
ＩＶとＳＩＶとの間の類似性は、レンチウィルス的形態、ＣＤ４リンパ球及びマ
クロファージに対する向性；一般に他のレトロウィルスには存在しないｔａｔ、
ｒｅｖ、ｖｉｆ、 ｖ３４．及びゴと呼ばれる外来遺伝子（ｅｘｔｒａ ｇｅ
ｎｅｓ ） ；宿主細胞上のＣＤ４レセプターとの相互作用；細胞変性；及び慢
性病を引き起こし、（少なくとも幾つかのウィルスにおける）長期の持続的感染
の後に死亡させる能力を含む（Ｒ，Ｃ，Ｄｅｓｒｏｓｉｅｒｓ、 Ａｎｎｕ。
Ｒｅｖ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 ４２：６０７．１９１１８） 。
ＳＩＶ分子クローンは、マンガベー等の他の種がそれらの自然の宿主であるにも
かかわらず、マカック属のサルから単離され、一般にＳＩＶｍａｃと呼ばれる（
Ｌ。
Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ等、Ｎａｔｕｒｅ ３２８：５４３．１９８７． Ｖ、
）ｌｉｒｓｃｈ等、Ｃｅ１ｌ ４９：３０７．１９８７． Ｇ、 Ｆｒａｎｃ
ｈｉｎｉ等、Ｎａｔｕｒｅ ３２ｇ＋５３９．１９８７）。マカック属の末梢血
液リンパ球において良好に生育する能力により選択された１つのクローンはＳＩ
Ｖｍａｃ２３９と呼ばれた（ Ｙ、 Ｍ、 Ｎａ１ｄｕ等、Ｊ。
Ｖｉｒｏｌ、 ６２：４６９１．１９８ｇ） 、クローン化ＳＩＶｍａｃ２３９
ＤＮＡから得られた株化ウィルスを接種されたアカゲザルはＡＩＤＳ様の病気を
起こし、結局死亡した（Ｈ，Ｋｅｓｔｌｅｒ等、５ｃｉｅｎｃｅ ２４８：１１
０７．１９９０）。
今日まで、ＨＩＶに対する防御免疫応答を誘発する努力が、一般に、ＨＩＶにコ
ードされた蛋白質等の特定の抗原に集中してなされてきた。ＨＩＶ−１に感染し
た患者の血清は、ウィルスのエンベロープ（ｅｎｖ）遺伝子ｉ物、ｇｐ１２０の
前駆体及びプロセッシングを受けた型を認識する抗体を含む（Ｊ、 Ｓ、＾１ｌ
ａｎ等、５ｃｉｅｎｃｅ ２２８：１０９１、 １９８５． Ｆ、Ｂａｒｉｎ等
、５ｃｉｅｎｃｅ ２２８：１０９４． １９８５） 。
これらの抗体は、報告によれば、少な（とも感染者の大多数において、ＡＩＤＳ
に対する免疫を与えるためには十分でない（Ｊ、 ５ｃｈｕｐｂａｃｈ等、５ｃ
ｉｅｎｃｅ ２２４：５（１３，１９８４゜Ｍ、Ｅｓ５ｅｘ等、５ｃｉｅｎｃｅ
２２０：８５９． １９８３． Ｂａｒｒｅ−Ｓｉｎｏｕｓｓｉ等、５ｃｉｅ
ｎｃｅ ２２０：８６１１．１９８３ ） 、しかしながら、様々なＥｎｖに基
づくワクチンが、現在、研究されている（例えば、 Ｄ、 Ｚａｇｕｒｙ等、Ｎ
ａｔｕｒｅ ３３２ニア２８．１９８８． Ｗ、 Ｃ。
Ｋｏｆｆ及びＡ、Ｓ、Ｆａｕｃｉ、ＡＩＤｓ １９８９３ （別冊） ：５１２
５．１９８９を参照）。
殺した、非感染性の、エンベロープを減らした（ｅｎｖｅｌｏｐｅ−ｄｅｐｌｅ
ｔｅｄ ）全ＨＩＶ−１ウィルスも又、既にＨＩＶ−１に感染している患者にお
いて試験された（ Ａ、 Ｌｅｖｉｎｅ等、Ｆｉｆｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏ
ｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎＡＩＤＳ、 Ｔｈｅ ５ｃｉｅｎｔｉｆｉ
ｃ ａｎｄ ５ｏｃｉａｌ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ、、 ｐ、２１９゜１９８９
） 。
Ｄ、 Ｂａ１ｔｉａ＋ｏｒｅ （Ｎａｔ、ｕｒｅ ３３５：３９５．１９８８）
は、ヒト患者に、“ＨＩＶの細胞内増殖を優性に妨害することの出来るＲＮＡ又
は蛋白質をコードするウィルス又はＤＮＡ構築物により感染又はトランスフェク
トされた”骨−骨髄幹細胞を導入するための提出された方法を報告し、それを“
細胞内免疫”と呼ぶことを提案している。
Ｍ、 Ｈ，Ｍａｌｉｍ等（Ｃｅｌｌ ５８：２０５．１９８９ ）は、トランス
優性（ｔｒａｎｓ−ｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ）に野生型のＲｅｖ機能を阻止し且っ
ＨＩＶ−１の複製を阻止するＲｅｖ変異株の単離を報告しており、トランス優性
Ｒｅｖ変異株が”ＨＩＶ〜１に対する細胞内免疫”を与える手段として有用であ
り得ると言う。
Ｄ、 Ｔｒｏｎｏ等（Ｃｅｌｌ ５９：１１３．１９ｇ９ ）は、野生型ＨＩＶ
−１ウィルスの複製は優性の負（ｎｅｇａｔｉｖｅ）のＧａｇ蛋白質の同時発現
（ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ）により阻止されると報告しており、これらの
変異蛋白質は“細胞内免疫に基づ（抗ウイルス計画を展開するための適当な基質
を構成するようである”と言う。
Ｍ、 Ｇｒｅｅｎ等（Ｃｅｌｌ ５１１：２１５．１９８９ ）は、不完全なＴ
ａｔペプチドがＨＩＶ−１のＬＴＲのトランス活性化をブロックすると報告して
おり、それらの結果は″ＡＩＤＳ治療の開発の興味深いアプローチを示唆する”
と言う。
Ｉ豆二Ｉ上
１つの面において、この発明は、ｎｅｆ遺伝子の不可逆的ヌル変異（ｎｕｌｌ
ｍｕｔａｔｉｏｎ ）を含む感染性の非病原性霊長類レンチウィルス（ＦＬＹ）
のゲノムのＤＮＡクローンを記述する。”霊長類レンチウィルスゲノム”とは、
レトロウィルスから得られる遺伝物質を意味し、それは、野生型形態において、
（ａ）ｔａユ、ｒ ｅ ｖ 及Ｕｎｅｆ遺伝子を含み、（ｂ）霊長類宿主のＴ４
細胞に感染することが出来、そして（Ｃ）レンチウィルスサブファミリーの特徴
のウィルス形態形成及び形態を有する。この用語は、制限することなく、ＨＴＬ
Ｖ−ＩＩＩ 、 ＡＲＶ 、 ＬＡＶ 、 ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶｍ
ａｃ、ＳＩＶａｇｍ、ＳＩＶｍｎｄ、ＳＩＶｓｍｍ、ＳＩＶｍａｎ、ＳＩＶｍａ
ｎｄ及び５ＩＶｃｐｚを含む、ＨＩＶ及びＳＩＶのすべての変異体を含む。
“ヌル変異”とは、遺伝子が機能的蛋白質産物の発現を出来ないようにするヌク
レオチド配列における変化を意味する。“不可逆的゛とは、野生型ウィルス又は
意図的な遺伝的操作が存在しない場合に機能的蛋白質産物を作成する能力を得る
ことが出来ないことを意味する。
この発明による好ましいクローンは、単離されたレンチウィルスから得られるが
、例えば、それらは、自然に生じた分離株を改変して所望のｎｅｆ変異を造り出
すか又は自然に生じた分離株の配列に一般的に対応するが所望の１！」変異を有
する核酸を合成することにより作成される。従って、この発明は如何なる特定の
ウィルス性クローンにも限定されない、当業者は、例えば、グリシンのアラニン
での置換等の変化させたコドンが非冨に類似したアミノ酸配列をコードするよう
に、保存的置換により核酸配列を変えた等価なりＮＡクローンを、容易に、単離
又は製造することが出来る。更に、核酸配列は、子孫のウィルスを作るウィルス
の能力を破壊しない１つ以上の非保存的コドン置換又は１つ以上の欠失を有して
良い、そのような等価なりＮＡクローンは標準的な組換えＤＮＡ技術（例えば、
ランダム又は部位特異的なイン・ビトロ変異誘発又は制限部位間の配列の欠失）
によって製造することが出来、且つ標準的組換えＤＮＡ技術（ＰＣＲ及びラムダ
、プラスミツド、コスミッド、及び／又は他のクローニングベクターの利用を含
むが５これらに制限されない）によって単離することが出来る。
更に、この発明は、図に示した１！」遺伝子の特定の不可逆的ヌル変異に限定さ
れない；当業者は、ｎｓｆ遺伝子の檀能的蛋白質産物を作る能力を妨害し且つ不
可逆な他の変異（例えば、ｎｅｆ遺伝子配列の一層大きい又は小さい欠失）を容
易に単離することが出来る。そのような等価な変異は標準的組換えＤＮＡ技術（
例えば、イン・ビトロ変異誘発）によって製造又は単離することが出来る６
関係する面において、この発明は、ゲノムがｎｅｆ遺伝子における製造された（
即ち、意図的に造られるか又は意図的に選択され、単離された）不可逆的な、ヌ
ル変異を含む霊長類レンチウィルス（即ち、ＲＮＡクローン又はウィルス的にパ
ッケージされたＲＮＡ）を記述する。そのようなウィルスは感染性であるが病原
性ではなく、そして、それは上述のＤＮＡクローンの１つを培養霊長類細胞にト
ランスフェクトして子孫ウィルスを採集することにより容易に単離することが出
来る。
両方の面の好ましい実施態様において、霊長類レンチウィルスのＤＮＡクローン
の核酸配列は霊長類レンチウィルス、詳細にはＨＩＶ又は５ＩＶ（特に、ｓｒｖ
ｍａｃ）から得られ、且つ変異は１工ユ遺伝子配列を無傷で残す。
他の好ましい実施態様において、霊長類レンチウィルスのＤＮＡクローンの核酸
配列は、（前述の）ｎｅｆ変異に加えて、１つ以上の下記の配列における不可逆
ヌル変異を含む： ＮＲＥ、 ｖ３４．又は！ｉ！（サルレンチウィルスの場合
）又は± （ヒトレンチウイルスの場合）、特に、この発明による好ましいＤＮ
ＡクローンはＳＩＶｍａｃ２３９Δｎｅｆ△ＮＲＥ、ＳＩＶｍａｃ２３９Δ３、
ＳＩＶｍａｃ２３９△４．ＨＩＶ−１△ｎｅｆΔＮＲＥ、ＨｒＶ−１△３．及び
ＨＩＶ−１△４を含む。
他の面において、この発明は、精製した霊長類レンチウィルス又はそのＤＮＡク
ローンを製薬上許容されるキャリアー中に含むＡＩＤＳ及び関連する病気に対す
る防御を引き出すワクチンを記述する。そのようなりＮＡＡｃ−ンはｎｅｆ遺伝
子の不可逆的ヌル変異を含んでおり且つＮＲＥ、 ｖ５２；、 ｖ３４．及び／
又は±配列の１つ以上における不可逆的ヌル変異をも含み得る。更に、この発明
は免疫量のワクチンを患者（即ち、生きている病原性ウィルスの宿主）に投与す
る方法を記述する。
最後に、この発明は、培養霊長類細胞をこの発明による霊長類レンチウィルス核
酸（即ち、１！ユ遺伝子の製造した不可逆的ヌル変異を含み且つＮＲＥ、 ｖ２
Ｈ，ｖ２３．及び／又は上記列中の不可逆的ヌル変異をも含み得るもの）でトラ
ンスフェクトし、ゲノムが１且ｌ遺伝子の変異を含むレンチウィルスを単離し、
そして、そのウィルスを製薬上許容されるワクチンに混合することによりそのよ
うなワクチンを製造する方法を記述する。
本発明のワクチンは、生きている、感染性であるが非病原性の親ウィルスからの
誘導体を用いて、霊長類レンチウィルスに対する免疫的防御を与える。不可逆的
変異の導入は、弱毒化ウィルスワクチンを製造するために以前に用いられた方法
（例えば、野生型配列に先祖返りすることの出来るゲノムの点突然変異を含むウ
ィルス株の単離）を上回る利点を与える。更に、製造したウィルスＤＮＡクロー
ンの構築、及び嗜乳類細胞培養中での弱毒化ウィルスの増殖によるワクチンの製
造方法は早く且つ安価である。
この発明の他の特徴及び利点は下記の好ましい実施態様及び請求の範囲から明ら
かとなるであろう。
しい の・
図面を先ず説明する。
図面の簡単な説明
図１は、ＳＩＶｍａｃ２３９ （この発明において有用な霊長類レンチウィルス
の１例）ゲノムの完全な核酸及びアミノ酸配列の描写である。１二」オーブンリ
ーディングフレームの境界及び突然変異クローンにおけるｎｅｆ欠失の範囲（ｐ
ＳＩＶｍａｃ２３９ ｎ ｅ ｆ欠失）を示す。
図２は、ＨＩ Ｖ−１の単離株の完全な核酸及びアミン酸配列の描写である＊
ｎ （９ｆオーブンリーディングフレームはＥｏで示され、その境界を示しであ
る。
図３ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５ ）は、ＨＩＶ ＮＬ４３の完全な核酸配列の
描写である。
レンチウィルスクローン
今から、この発明によるＳＩＶｍａｃ２３９又はＨＩｖ−１のｎｅｔ遺伝遺伝子
犬失を含むＤＮＡクローンの実施例を記す、今日までに単離されたすべてのｎｅ
ｆ遺伝子配列は、ヌクレオチド及びアミノ酸レベルにおいてホモロジーを示して
いる（Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄＡＩＤＳ １９９０．
Ａ Ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉ
ｃＡｃｉｄ ａｎｄ Ａｍ１ｎｏ Ａｃ１ｄ ５ｅｑｕｅｎｃｅｓ、 Ｇ、 Ｍ
ｙｅｒｓｌｌ、 ＬｏｓＡｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ、ニューメキシコ）。更に、レンチウィルスゲノムに
おけるｎｅｆ遺伝子の位置（即ち、１旦ユ遺伝子と３’ ＬＴＲとの間）は保存
されている（Ｈｕｍａｎ ＲｅｔｒｏｖＬｒｕｓｅｓ ａｎｄ ＡＩＤＳ １９
９０゜Ａ Ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ ａｎｄＡｍｉｎｏ Ａｃ１ｄ ５ｅｑｕｅｎｃｅｓ、Ｇ、
Ｍｙｅｒｓ ！１． Ｌｏｓ ＡｌａｍｏｓＮａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ、ニューメキシコ ） 、 それ故、任意の既知
の又は新たに単離された霊長類レンチウィルスにおける１工ユ遺伝子配列を同定
することは当業者が行ない得ることである。上述した様な標準的技術を用いて、
前記の１旦」遺伝子を適当に変異させ、病原性を試験し、そしてＡＩＤＳに対す
る防御を引き出す適したワクチンに混合することが出来る。
下記のクローンをこの発明を説明するために記載する（制限するためではない）
、下記のように、当業者はＡＩＤＳに対する非病原性ウィルスワクチンの製造に
おいて類似の利用性を有するＤＮＡクローンを、他のＳＩＶ又はＨＩＶ単離株か
ら容易に製造することが出来る。
ＳＩＶ ａｃ２３９ｎｅｆ
親ウィルスＳＩＶｍａｃ２３９を、低下したＴ細胞機能、リンパ増殖性疾患、及
び日和見感染（Ｓ Ｉ Ｖ感染の特徴的症状）を示すマカックサル（Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄＲｅｇｉｏｎａｌ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔ
ｅｒ）から単離した。この動物からの無細胞血清試料をＨｕｔ−７！ｌ細胞（Ａ
ＨｒｉｃａｎＴｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、 １２３０１
Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ。
Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、メリーランド２０８５２から受入れ番号ＴｌＢ１６１にて
、入手可能なヒト腫瘍子細胞系統）と−緒に培養し、そしてＭ、 Ｄ、 Ｄａｎ
ｉｅｌ等（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１２０１．１９８５）に記載されたように
Ｈｕｔ−７８細胞上清から感染性ＳＩＶｍａｃ２３９ウィルスを単離した。この
細胞上清は、−緒に培養を始めてから１２−１８日後に始まる検出可能な逆転写
酵素活性を有することを示された（Ｍ、 Ｄ。
Ｄａｎｉｅｌ等、５ｃｉｅｎｃｅ ２２８：１２０１．１９８５の方法による）
。この細胞系統中におけるウィルス粒子の存在は電子顕微鏡観察により確実にさ
れる；ＳＩＶｍａｃ２３９感染細胞は、霊長類レンチウィルスの形態的特徴を有
する出芽中のウィルス粒子を見せた。
ウィルスゲノムの全長のクローニングを容易にするために、エンドヌクレアーゼ
ＥｃｏＲＩがＳＩＶｍａｃ２３９ ＤＮＡを切断しないことを確認した。全細胞
ＤＮＡをＳＩＶｍａｃ２３９感染Ｈｕｔ−７８細胞から調製し、ＥｃｏＲＩで消
化した。シ３糖密度勾配でサイズ分画した１０〜２０キロ塩基対のＥｃｏＲＩ断
片をラムダクローニングベクターＥＭＢＬ４のＥｃｏＲＩ部位に挿入した。この
ライブラリーをｐ Ｋ ２ Ｂ ａｍＡ （Ｖ、 Ｈｉｒｓｃｈ等、Ｃｅ１ｌ
４９：３０？、 １９８７に記載）をプローブとして用いてスクリーニングし、
全長を有する分子クローンＳＩＶｍａｃ２３９を単離した０両鎖のヌクレオチド
配列を、シーケナーゼ（即ち、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ）バージョン１．０又は
２ 、０ （Ｕｎｉｔｅｄ ５ｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅａ＋１ｃａｌ。
Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、オハイオ）を用いて、Ｓａｎｇｅｒ等のプライマー指示（
ｐｒｉｍｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ）ジデオキシチェーンターミネーション法（
Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ７４：５４６３．
１９７７）により決定した。１″’Ｓ ［ｍ配列決定反応生成物を緩衝液勾配（
０，７５〜２．５％トリスホウ酸緩衝液）を有する６％ポリアクリルアミド／８
Ｍ尿素ゲル上で電気泳動にかけた。配列をＩＢＩゲルリーダー及びデジタイザー
を用いてＩＢＭ−ＰＣコンピューターに入力し、よりＩパステルＤＮＡ分析ソフ
トウェア（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎ
ｃ、、Ｎｅｗ ）ｌａｖｅｎ、コネチカブト） によ リ 分析した。 ＥＭＢ
Ｌ４中のＳＩＶｍａｃ２３９クローンを、次いで、下記の２つのプラスミツドサ
ブクローンを生成するために用いた。ＥＭＢＬ−ＳＩＶｍａｃ２３９を５ｐｈＩ
で消化し、６７０６塩基対断片（左隣接細胞ＤＮＡ配列中の５ｐｈＩ部位からウ
ィルスのヌクレオチド番号６４５１の５ｐｈＩ部位までの配列を含む）をベク
ター ｐ Ｂ Ｓ （＋ ） （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、カ
リ本ルニ７）の５ｐｈＩ部位に挿入してサブクローンｐ２３９ＳｐＳｐ５゛を作
成した０分離反応において、ＥＭＢＬ−ＳＩＶｍａｅ２３９を５ｐｈＩ及びＥｃ
ｏＲＩで消化し、６３６１塩基対断片（ウィルスヌクレオチド６４５２の５ｐｈ
Ｉ部位から右隣接細胞性配列中のＥｃｏＲＩ部位までの配列を含む）をＳ ｐ
ｈ Ｉ ／ Ｅ ｃ ｏ ＲＩで開裂したベク ター ｐ Ｂ Ｓ （） （Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、カリ本ルニア）に挿入してサブクロー
ンｐ２３９ＳｐＥ３″を作成した。これらのサブクローンを下記のように全長を
有するゲノム配列を生成するために用いた。ｐ２３９ＳｐＳｐ５°及びｐ２３９
ＳｐＥ３’の両者を５ｐｈＩで消化し、で互いに結合し、そして培養細胞（例え
ば、マカツク属の末梢血液リンパ球）に直接トランスフェクトするために用いた
。
不可逆性のヌル変異（欠失）をＳＩＶｍａｃ２３９クローンのｎｅｆ遺伝子内に
下記のようにして造った。
１旦ｌ遺伝子のＣ末端（ｐ２３９ＳｐＥ３’の５ｓｔｌ断片内に含まれ、ヌクレ
オチド９２３０〜１１，４３６を包含する）をＭｌ３中にクローン化してＭｌ
３−５ＳＴＢを作成した。このＭ１３クローンを、Ｍ、 Ｊ、 Ｚｏｌｌｅｒ及
びＭ、 ５ｗ１ｔｈ （ＤＮＡ ３：４７９．１９８４ ）又はＭ、 ５ｔｒａ
ｕｓｓ等（Ｇｅｎｅ ４９：３３１．１９８６ ）に記載の方法を用いて、オリ
ゴヌクレオチド部位特異的欠失突然変異誘発にかけた。塩基（９２１５〜９２５
０）及び（９４３３〜９４６９）に相補的な７３塩基対のオリゴヌクレオチドを
合成した。この２つの部分は隣接させた（即ち、塩基９２５１〜９４３２は、こ
の７３量体上に存在しない）、このオリゴヌクレオチドを、相補鎖の合成を促進
するために、に１ｅｎｏｖポリメラーゼ及び４種のデオキシリボヌクレオチドの
存在下で１本ＭＭ１３−３ＳＴＢにアニールさせた。塩基９２５１〜９４３２は
このオリゴヌクレオチドブライマーに含まれていないので、それらの相補物は、
同様に、新たに合成された完全な負ＩＡ （ｎｅｇａｔｉｖｅｓｔｒａｎｄ ）
には含まれなかった。２本鎖複製形態（ＲＦ）のファージＤＮＡで、Ｅ、ｃｏｌ
ｉ宿主ＪＭ１０９をトランスホームした。その結果生じたＭ１３プラークからの
ＤＮＡを標準的技術（胃、 Ｄ、 Ｂｅｎｔｏｎ及びＲ，Ｗ。
Ｄａｖｉｓ、 ５ｃｉｅｎｃｅ １９６：１ｇ０．１９７７）によりニトロセル
ロースフィルター上に固定し、欠失配列に相補的なオリゴヌクレオチドプローブ
を用いて欠失領域の配列についてスクリーニングした。負の信号が、クローンが
ｎｅｆ欠失を含んでいるという指示として得られた。ＤＮＡ配列決定により所望
の欠失を有することが確実にされた１つのＭ１３クローンを、続いて、下記のよ
うに、ウィルス性配列の全長を再構築するために用いた。欠失を含む断片を、欠
失したＭｌ ３−５ＳＴＢの５ｓｔＩでの消化により遊離させた。前記の断片を
、次いで、ｐ２３９ＳｐＥ３°中にクローン化してｐ２３９ＳｐＥ３° （ｎｅ
ｆ欠失）を産出した。プラスミツドサブクローンｐ２３９ＳｐＳｐ５°及びｐ２
３９ＳｐＥ３° （ｎｅｆ欠失）をｓｐｈ Ｉで消化し、互いに結合し、そして
培養細胞（例えば、マカック属の末梢血液リンパ球）を直接トランスフェクトす
るために用いた。
図１に示すように、ＳＩＶｍａｃ２３９ｎ旦ユ遺伝子はｅｎｖ遺伝子配列と重複
するａ ＳＩＶｍａｃ２３９ゲノムのｅｎｖ遺伝子配列の、又は、一般に、任意
のＰＬＶゲノムの崩壊は、レンチウィルスを非感染性にし且つ、それ故、効果的
な生ワクチンの製造に有用ではない、この理由のため、ｐ２３９ＳｐＥ３’ （
ｎｅｆ欠失）に含まれるｎｅｆ欠失はｅｎｖ遺伝子を無傷に残す。
プラスミツドクローンｐ２３９ＳｐＳｐ５°及びｐ２３９ＳｐＥ３° （ｎｅｆ
欠失）をＡｍｅｒｉｃａｎ ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに
寄託し、それらはそれぞれ受入れ番号＋ＡＴＣＣＮｏ、６８３６５及びＮｏ、６
８３６４を有する。出願人の譲受人（Ｐｒｅｓｉｄｅｎｔ ａｎｄ Ｆｅｌｌｏ
ｗｓｏｆ Ｈａｒｖａｒｄ ［Ｊｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ）は、ここに発行された
特許の期間の終了前にそれらが死んだ場合には、これらの培養物を交換するべき
彼らの責任を認め、且つそのような特許の発行をＡＴＣＣに知らせるべき彼らの
責任を認めるが、その時点において、その寄託物は公衆が利用出来るようになる
。その時までは、この寄託物は、米国特許法規則３７ＣＦＲ１，１４及び米国特
許法１１２条の下で米国特許庁長官に入手されよう。
図１に与えられたＳＩＶｍａｃ２３９配列を用いて、当業者は、１！ユ遺遺伝子
列中の他の不可逆的ヌル変異を製造することが出来る。ＳＩＶのｎｅｆオープン
リーディングフレームの一部（≧１０％）を除去する欠失は制限地図により容易
に確認することが出来る。そのようなＮｅｆをコードしている核酸の欠失、又は
Ｎｅｆ制御又は応答配列を崩壊させる欠失は、殆どの場合、遺伝子がＮｅｆ遺伝
子産物を産生ずることを出来な（する。
Ｎｅｆ遺伝子産物の不存在は、Ｎｅｆ蛋白質に対する精製された抗体又は霊長類
レンチウィルスに感染した霊長類からの血清を用いて、イムノアッセイ（例えば
、ウェスタンプロット分析）によって確認することが出来る。
他の型のヌル変異が達成された場合（例えば、もつと小さい欠失）には、それら
の効力はイン・ビポアツセイを用いて試験することが出来る０手短に言えば、サ
ル免疫不全ウィルスについては、突然変異の１旦ｌクローンから得られた精製し
たウィルスのアリコートを静脈経由で生きている許容的宿主（好ましくは、アカ
ゲザル）に投与して、病原性（即ち、ＡＩＤＳ様の病気の症状を誘導する能力）
について試験することが出来る。１！ｌ遺伝子中にヌル変異を有するゲノムを含
んでいるウィルス（例えば、ＳＩＶｍａｃ２３９ｎｅｆ欠損）は非病原性である
。
ＳＩＶｍａｃ２３９ ｎｅｆ ＮＲＥ
この発明による５ＩＶＤＮＡクローンの他の実施例（即ち、ｎｅｆ遺伝子中の欠
失及びロングターミナルリピート（ＬＴＲ）のＮＲＥ配列中の欠失を含むもの）
を下記のように構成した。
プラスミツドｐ２３９ＳｐＥ３° （ｎｅｆ欠失）をＮ５ｉＩ及び５ｔｕＩ （
ＳＩＶｍａｃＬＴＲのＮＲＥ領域内に独自の部位で切断する酵素）で消化した。
このプラスミツド配列の大部分を含む（しかし、を内部ＮＲＥ断片を欠（）ＤＮ
Ａ断片を単離し、突き出ている末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑化し
、そしてその平滑末端を互いに結合して環状プラスミツドを再生した。このプラ
スミツドを再単離し、ヌクレオチド配列分析により、ヌクレオチド９６６０〜９
８３１ （ＮＲＥ領域内）の欠失を確認した（このプラスミツドをｐ２３９Ｓｐ
Ｅ３°ΔｎｅｆΔＮＲＥと呼ぶ）。
プラスミツドｐ２３９ＳｐＳｐ５°及びｐ２３９ＳｐＥ３’ΔｎｅｆΔＮＲＥを
それぞれ５ｐｈＩで消化し、互いに結合し、そして、上述のように、許容的培養
細胞（例えば、マカツク属の末梢血液リンパ球）を直接トランスフェクトするた
めに用いた。そのような細胞は、ゲノムが１旦」遺伝子中の欠失及びＮＲＥ配列
中の欠失を含むＳＩＶｍａｃ２３９ウィルスを生成した（即ち。
ＳＩＶｍａｃ２３９ΔｎｅｆΔＮＲＥ）。
ＳＩＶｍａｃ２３９ ３
この発明によるＳ Ｉ ＶＤＮＡクローンの他の実施例（即ち、ｎｅｆ及びＵ遺
伝子並びにＮＲＥ配列中の欠失を含むもの）を下記のように構成した。
プラスミツドｐ２３９ＳｐＳｐ５°を、ＨＯ等の方法（Ｇｅｎｅ ７７：５１．
１９８９）によりポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）部位特異的突然変異誘発にか
けた。３５ｂｐのオリゴヌクレオチド（ＳＩＶｒｎａｃ２３９の塩基（６１３５
〜６１５２）及び（６２５４〜６２７０）に相補的）をそれぞれ合成し、ＰＣＲ
プライマーとして用いた。具体的には、そのようなオリゴヌクレオチドは下記の
配列である：
５°ＴＣＣＡＧＧＡＣＴＡＧＣＡＴＡＡＡＴＴＴＧＡＴＣＣＴＣＧＣＴＴＧＣＴ
Ａ ３°（ＳＥＱｌｏ Ｎｏ：１）及び
５’ ＴＡＧＣＡＡＧＣＧＡＧＧＡＴＣＡＡＡＴＴＴＡＴＧＣＴＡＧＴＣＣＴＧ
ＧＡ ３° （ＳＥＱＩＤ Ｎｏ：Ｚ） 。
その結果生じたプラスミツド（ｐ２３９ＳｐＳｐ５°△ｖｐｒと呼ぶ）は、Ｌ２
工遺伝子のヌクレオチド６１５３〜６２５３の欠失を含んだ。
プラスミツドｐ２３９ＳｐＳｐ５°Δｖｐｒ及びｐ２３９ＳＰＥ３°ΔｎｅｆΔ
ＮＲＥを各々５ｐｈＩで消化し、互いに結合し、そして、上述のように、許容的
培養細胞（例えば、マカツク属の末梢血液リンパ球）を直接トランスフェクトす
るために用いた。そのような細胞は、ゲノムが１！」及び二二二遺伝子中の並び
にＮＲＥ配列中の欠失を含むＳＩＶｍａｃ２３９ウィルスを生成した（即ち、Ｓ
ＩＶｍａｃ２３９Δ３）。
ＳｒＶｍａｃ２３９ ４
この発明によるＳ Ｉ ＶＤＮＡクローンの他の実施例（即ち、１立ユ、Ｌ２工
及び１二上遺伝子並びにＮＲＥ配列中の欠失を含むもの）を下記のように構成し
た。
プラスミツドｐ２３９ＳｐＳｐ５°を、上述のようにＰＣＲ部位特異的突然変異
誘発にかけた。３０ｂｐのオリゴヌクレオチド（ＳＩＶｍａｃ２３９の塩基（５
９７３〜５９８７）及び（６２５４〜６２６８）に相補的）をそれぞれ合成し、
ＰＣＲプライマーとして用いた。具体的には、そのようなオリゴヌクレオチドは
下記の配列である：
５’ ＡＴＡＣＴＧＧＣＡＴＧＡＴＧＡＴＴＧＡＴＣＣＴＣＧＣＴＴＧＣ３°
（ＳＥＱ ＩＤＮｏ：３）
及び５’ ＧＣＡＡＧＣＧＡＧＧＡＴＣＡＡＴＣＡＴＣＡＴＧＣＣＡＧＴＡＴ
３° （ＳＥＱ ＩＤＮｏ・４）６
その結果生じたプラスミツド（ｐ２３９ＳｐＳｐ５°△ｖｐｘ△ｖｐｒと呼ぶ）
は、Ｕλ及びＬＬ工遺伝子のヌクレオチド５９８８〜６２５３の欠失を含んだ。
プラスミツドｐ２３９ＳｐＳｐ５’ △ｖｐｘ△ｖｐｒ及びｐ２３９ＳｐＥ３°
△ｎｅｆ△ＮＲＥを各々Ｓｐｈ工で消化し、互いに結合し、そして、上述のよう
に、許容的培養細胞（例えば、マカック属の末梢血液リンパ球）を直接トランス
フェクトするために用いた。そのような細胞は、ゲノムが１旦」、ＬＬ工及びｍ
遺伝子中の並びにＮＲＥ配列中の欠失を含むＳＩＶｍａｃ２３９ウィルスを生成
した（即ち、ＳＩＶｍａｃ２３９Δ４）。
他の霊長類レンチウィルスゲノム（例えば、ＨＩＶ−１）のゲノムｎｅｆ配列中
に不可逆的ヌル変異を製造することも出来る。図２は、ＨｒＶ−１単離株の完全
なヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す、この図に示されているように、１互」
遺伝子（Ｅ’で示す）はヌクレオチド８，３４７と８，９９２の間の配列を含む
、前記の配列は見立Σ遺伝子と３°ＬＴＲとの間に位置し、サルレンチウィルス
単離株ＳＩＶｍａｃ２３９のｎｅｆ遺伝子に対するヌクレオチド及びアミノ酸配
列のホモロジーを示す。不可逆的ヌル変異を、標準的組換えＤＮＡ技術（例えば
、部位指示（ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ）イン・ビトロ突然変異誘発又は制
限部位間の配列の欠失）によってＨＩＶ−１のｎｅｆ配列に導入することが出来
る。又、ＨＩｖ−１オーブンリーデイングフレームの全部又は大部分を除去する
欠失は、制限地図又はイムノアッセイによって確認することが出来る。Ｎｅｆｌ
ｌｌ＠又は応答エレメントを崩壊させる欠失も、殆どの場合、遺伝子がＮｅｆ遺
伝子産物を生成することを出来なくし、この出来事も又上記のように５ＩＶＮｅ
ｆについてのイムノアッセイによって試験することが出来た。他の型のヌル変異
（例えば、もっと小さい欠失）が達成された場合、それらの効力はイン・ビボア
ッセイを用いて試験するべきである。
変異ＨＩＶクローンの病原性を直接イン・ビボで試験するための許容的宿主はな
い（ヒトを除く）、シかしながら、下記のごとく、ヒト及びサルのｎｅｆ配列に
おける類似性のために等価の５ＩＶｎｅｆ変異クローン（即ち、対応する５ＩＶ
Ｎｅｆ領域内の欠失を有する）を製造して、上記のように、アカゲザルにおいて
病原性を試験することが出来る。
今から、この発明によるＨＩＶ−１クローンの特定の実施例を記載する。これら
の実施例は、この発明を説明することを目的としており、制限するものではない
。
ＨＩＶ−１△ｎｅｆ ＮＲＥ
この発明によるＨ Ｉ ＶＤＮＡクローンの１つの実施例（即ち、ｎｅｆ遺伝子
及びＮＲＥ配列中に欠失を含むもの）を下記のように構成する。ｐＮＬ４−３と
いうプロウィルスクローン（Ａｄａｃｈｉ等、Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、 ５９：２８
４．１９８６；＾ＩＤＳ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒ
ｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ、 ＮＩＡＩＤ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎ５ｔｉ
ｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、メリーランドかう入手可能
）を用いて始めて、ＨＩＶ−１配列を２つの別個のベクター中にサブクローン化
する。詳細には、ｐＮＬ４−３をＡｐａＬＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、ｂｐ−１
５４（隣接する細胞性配列内）からｂｐ５７４３（隣接する細胞性配列内）（即
ち、ウィルス性遺伝子り且１、Ｌ旦工、Ｌ工ｌ、及びＬＰ！ｉ）を含む５８９７
ｂｐ断片をｐＤＲ８と呼ばれるプラスミツドベクターに挿入してｐＬＥＦＴを作
成する。
プラスミツドｐＤＲ８は、ｐＵｃ１９をＮｄｅ ｒ及びＥａｒＩで消化しく即ち
、１ ａｃＺ及び１ａｃＩ遺伝子並びにポリリンカーを欠失する）、突き出てい
る末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化することによって構築した。このバッ
クボーンに、平滑化末端結合により、下記の配列のオリゴヌクレオチドを挿入し
てｐＤＲ８を作製した：
５°ＴＧＧＴＧＡＣＣＴＴＣＧＡ ＡＧ ＧＡＴＣＣＣＡＴＡＴＧＴＣＴＡＧＡ
ＧＡＡＴＴＣＧ ＧＴＣＡＣＣＡ ３゜３ ’ Ａ ＣＣＡＣＴＧＧＡＡＧ（
：ＴＴＣＣＴＡＧＧＧＴＡＴＡＣ：ＡＧＡＴ（：Ｔ（：ＴＴＡＡＧ（：ＣＡＧＴ
ＧＧＴ５゜（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）。
分離反応において、ｐＮＬ４−３をＥｃｏＲＩ及びＴｈａＩで消化し、図３の塩
基対５７４３ （ＳＥＱ ＩＤＮｏ ： ５）から塩基対９７４５ （隣接する
細胞性配列内）を含む４００２ｂｐ断片（即ち、ウィルス遺伝子ｔａｔ、 ｒｅ
ｖ、 ｖｐｕ、 ｅｎｖ、 ｎｅｆ、及びＬＴＲ）をプラスミツドベクターｐＤ
Ｒ８に挿入してｐＲＩＧＨＴを作製する。
ｎｅｆ及びＮＲＥ遺伝子を突然変異させるために、ｐＲＩ ＧＨＴをＮｄｅ Ｉ
又はＡｐａＬＩ及びＴｈａＩで消化し、それぞれ、３２４７ｂｐ又は３１３６ｂ
ｐにてウィルス性断片を単離し、プラスミツドベクターｐＤＲ８に挿入してｐＲ
Ｉ ＧＨＴ−３ＵＢ １を造る＊ｎｅｆ遺伝子及びＮＲＥ配列を、Ｈｏ等の方法
（前出）によりＰＣＲ部位特異的突然変異誘発によって突然変異させる。大部分
又はすべてのｎｅｆ及びＮＲＥ配列が欠失するようにＰＣＲプライマーを選択す
る０例えば、ｎｅｆ遺伝子の欠失を下記の配列のＰＣＲプライマーを用いて達成
することが出来る：
５°ＡＡＧＧＡＴＴＴＴＧＣＴＡＴＡＡＴＡＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＴＡＡＡＡ
３°（ＳＥＱ ＩＤＮ０：６）及び
５°ＴＴＴＴＡＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＴＴＡＴＴＡＴＡＧＣＡＡＡＡＴＣＣＴＴ
３°（ＳＥＱ ＩＤＮ０ニア）、
（図３（７）ＨＩ Ｖ−１配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）（７）塩基（８７７
０〜８７８５）及び（９０４７〜９０６２）と相補的である）。
ＮＲＥ配列の欠失は下記の配列のＰＣＲプライマーを用いて達成することが出来
る：
５°ＡＣＴＧＡ（：ＣＴＴＴＧＧＡＴＧＧＣＡＴＣＣＧＧＡＧＴＡＣＴＴＣＡ
（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：８）及び
５°ＴＧＡＡＧＴＡＣＴＣＣＧＧＡＴＧＣＣＡＴＣＣＡＡＡＧＧＴＣＡＧＴ ３
” （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）、
（図３のＨＩ Ｖ−１配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）の塩基（９１９４〜９２
０９）及び（９３８１〜９３９６）と相補的である）、ｐＲＩＧＨＴ−５ＵＢＩ
の変異型をＮｄｅ ｒ又はＡｐａＬＩ （上で選択した酵素に対応する）及びＴ
ｈａＩで消化し、３０７５ｂｐ又は２９６４ｂｐ断片をそれぞれ単離し、Ｎｄｅ
Ｉ又はＡｐａＬＩ及びＴｈａｒ消化したｐＨＩＧＨＴに再挿入してｐＲＩＧＨ
Ｔ−ＭＵＴ １を造る。ｐＲＩＧＨＴ−ＭＵＴＩ及びｐＬＥＦＴをＥｃｏＲＩで
消化し、互いに結合し、そしてＳｏｍｐａｙｒａｃとＤａｎｎａ （Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ７８ニア５７５、１９８１）又
はＭｉｌｍａｎとＨｅｒｚｂｅｒｇ （Ｓｏａ＋ａｔ、 Ｃｅ１ｌＧｅｎｅｔ、
ヱ：１６１．１９８１）又はＮａ１ｄｕ等（Ｊ、 ＶＬｒｏｌ、 ６２：４６９
１、１９８８ ）に記載されたように、許容的培養細胞（例えば、ヒトの末梢血
液リンパ球）を直接トランスフェクトするために用いる。そのような細胞は、ゲ
ノムがｎｅｆ遺伝子中及びＮＲＥ配列中の欠失を含むＨＩ Ｖ−１ウイルスを生
成する（即ち、ＨＩＶ−１△ｎｅｆ△ＮＲＥ）。
ＨＩ Ｖ−１△３
この発明によるＨＩＶＤＮＡクローンの他の実施例（即ち、ｎｅｆ及びＬＬ工遺
伝子並びにＮＲＥ配列中の欠失を含むもの）を下記のように構成する。
プラスミツドｐＲＩＧＨＴ−ＭＵＴＩ及びｐＬＥＦＴを上述のようにして構成す
る。Ｌ且工遺伝子を含む断片を更にサブクローン化する。特に、ｐＬＥＦＴをＢ
ｓｐＭｌ又はＮｄｅ Ｉ及びＥｃｏＲＩで消化し、６９７ｂｐ又は６２１ｂｐの
ウィルス性断片をそれぞれ単離し、プラスミツドベクターｐＤＲ８に挿入してｐ
ＬＥＦＴ−３ＵＢＩを造る。ム！工遺伝子をＰＣＲ部位特異的突然変異誘発によ
って突然変異させる（Ｈｏ等の方法（前出）による）、ＰＣＲプライマーをＬ２
工遺伝子の大部分又はすべてを欠失するように選定する。例えば、プライマーは
下記の配列であって良い：
５° ＡＡＴＧＡＡＴＧＧＡＣＡＣＴＡＧＴＡＡＴＡＡＧＡＡＴＴＣ３° （Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）及び
５’ ＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＡＣＴＡＧＴＧＴ（：（：ＡＴＴＧＡＴＴ ３°
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、
（図３（７）ＨＩ Ｖ−１配列（ＳＥＱ ｒＤ ＮＯ：５）の塩基（５６０４〜
５６１９）及び（５７３７〜５７４８）と相補的である） ＠ ｐＬＥＦＴ−３
ＯＢ １をＢｓｐＭＩ又はＮｄｅＩ（上で選択した酵素に対応する）及びＥｃｏ
Ｒｒで消化し、５〜．７９ｂｐ又は５０３ｂｐのウィルス性断片をそれぞれ単離
し、Ｂ ｓ ｐ Ｍ Ｉ又はＮｄｅ Ｉ及びＥｃｏＲＩ消化したｐＬＥＦＴに再
挿入してｐＬＥＦＴ−ＭＵＴを造る。ｐＬＥＦＴ−ＭＵＴ及びｐＲＩＧＨＴ−Ｍ
ＵＴＩをＥｃｏＲＩで消化し、互いに結合し、そしてＳｏｍｐａｙｒａｃとＤａ
ｎｎａ （Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
ＵＳＡ ７８ゴ５７５．１９８１）又はＭｉｌｍａｎとＨｅｒｚｂｅｒｇ （Ｓ
ｏｏ＋ａｔ。
Ｃｅ１ｌ Ｇｅｎｅｔ、ヱ：１６１．１９８１）又はＮａ１ｄｕ等（Ｊ、 Ｖｉ
ｒｏｌ。
６２：４６９１．１９８８ ）に記載されたように、許容的培養細胞（例えば、
ヒトの末梢血液リンパ球）を直接トランスフェクトするために用いる。そのよう
な細胞は、ゲノムがｎｅｆ及びＬ且工遺伝子中及びＮＲＥ配列中の欠失を含むＨ
Ｉ Ｖ−１ウイルスを生成する（即ち、ＨＩ Ｖ−１Δこの発明によるＨ Ｉ
ＶＤＮＡクローンの他の実施例（即ち、ｎｅｆ、ｖエエ及びｍ遺伝子並びにＮＲ
Ｅ配列中の欠失を含むもの）を下記のように構成する。
プラスミツドｐＬＥＦＴ−ＭＵＴ、ｐＲＩＧＨＴ及びｐ ＲＩ ＧＨＴ−ＭＵＴ
１を上述のようにして構成する。
Ｕ遺伝子を含む断片をサブクローン化する。特に、ｐＲＩＧＨＴをＥｃｏＲＩ及
びＮｄｅ Ｉ又はＡｐａＬｌで消化し、８６４ｂｐ又は６５６ｂｐの断片をそれ
ぞれ単離し、プラスミツドベクターｐＤＲ８に挿入してｐＲＩ ＧＨＴ−３ＵＢ
２を造る。Ｌ旦！遺伝子をＰＣＲ部位特異的突然変異誘発によって突然変異させ
る（Ｈｏ等の方法（前出）による）、ＰＣＲプライマーをＬＬ！遺伝子の大部分
又はすべてを欠失するように選定する０例えば、プライマーは下記の配列であっ
て良い：５’ ＧＴＡＡＧＴＡＧＴＡＣＡＴＧＴＡＡＴＧＡＧＡＧＴＧＡＡＧＧ
ＡＧＡ ３°（ＳＥＱ ｒＤＮＯ：１２）及び
５°Ｔ（：ＴＣＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＴＴＡＣＡＴＧＴＡＣＴＡＣＴＴＡＣ３
°（ＳＥＱ ＩＤＮ０：１３）、
（図３のＨＩＶ−１配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５））塩基（６０４５〜６０６
０）及び（６２２１〜６２３６）と相補的である）、 ｐＲＩＧＨＴ−３ＵＢ２
の変異型をＥｃｏＲＩ及びＮｄｅ Ｉ又はＡｐａＬＩ （上で選択した酵素に対
応する）で消化し、４７５ｂｐ又は６８６ｂｐのウィルス性断片をそれぞれ単離
し、ＥｃｏＲＩ及びＮｄｅ Ｉ又はＡｐａＬＩ消化したｐＲＩＧＨＴ−ＭＵＴエ
バツクボーンに挿入してｐＲＩＧＨＴ−ＭＵＴ２を造る。ｐＬＥＦＴ−ＭＵＴ２
及びｐＬＥＦＴ−ＭＵＴをＥｃｏＲＩで消化し、互いに結合し、そしてＳｏｍｐ
ａｙｒａｃとＤａｎｎａ （Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、
ＵＳＡ ７８ゴ５７５．１９８１）又はＭｉｌ＋ｅａｎとＨｅｒｚｂｅｒｇ （
Ｓｏ＋ｍａｔ、 （：ｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ、 ７：１６１、、１９８１）又はＮ
ａ１ｄｕ等（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、 ６２：４６９１．１９８８ ）に記載されたよ
うに、許容的培養細胞（例λば、ヒトの末梢血液リンパ球）を直接トランスフェ
クトするために用いる。そのような細胞は、ゲノムが１且」、ｌ及びｌ遺伝子中
及びＮＲＥ配列中の欠失を含むＨＩＶ−１ウイルスを生成する（即ち、ＨＩＶ−
１△４）。
レンチウィルスの
この発明によるｎｅｆ変異を含む感染性ＤＮＡクローンを生成したので、そのク
ローンを適当な細胞（例えば、不滅化されたリンパ球（Ｈ９細胞又はＨｕＴ−７
８細胞等）、又はドナー動物からの末梢血液リンパ球）をトランスフェクトする
ために用いる。感染した細胞を培賞した後、ワクチンを作るのに適した霊長類レ
ンチウィルスを、野生型ウィルスを単離するために用いられるのと同じ方法を用
いて、遠心分離及び濾過の後に細胞上清から単離することが出来る。
霊長類レンチウィルスを単離する方法を一層十分に説明するために、下記の実施
例を提供する。
ＳＩＶｍａｃ２３９ｎｅｆ ウィルスのｐ２３９ＳｐＳｐ５°及びｐ２３９Ｓｐ
Ｅ３° （ｎｅｆ欠失）ＤＮＡをｓｐｈ Ｉで消化し、互いに結合し、そしてＳ
ｏｍｐａｙｒａｃとＤａｎｎａ （Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃ
ｉ、ＵＳＡ７８ニア５７５．１９８１）及びＭｉｌｍａｎとＨｅｒｚｂｅｒｇ
（Ｓｏｍａ、ｔ、 Ｃｅ１ｌよりＨｕＴ−７８細胞にトランスフェクトし、その
後、下記の様に子孫のウィルスを単離することによりＳＩＶｍａｃ２３９ｎｅｆ
欠失ウィルスを単離することが出来る。
ウィルス性ＤＮＡの５つのアリコート（３μｇの結合したＤＮＡ／アリコート）
を、１２５ｕｇ／ｍｌのＤＥＡＥ−デキストラン及び５０ｍＭトリス（ｐＨ７，
３）を含む１．４ｍｌの無血清のダルベツコ改変イーグル培地（ＧＩＢＣＯ，Ｇ
ｒａｎｄ ｌ５ｌａｎｄ、 Ｎ、Ｙ、 ）に、断続的に攪拌しながら、続けて加
える。Ｈｕｔ−７８細胞を１：２又は１：３に分け、３Ｘ１０“細胞／プレート
にまで生長させ（即ち、２４時間又は２４時間未満）、ダルベツコ改変イーグル
培地で２回洗い、１．４ｍｌのＤＮＡ溶液と混合し、そして３７℃で１時間イン
キュベートする。その細胞を、続いて、無血清のダルベツコ改変イーグル培地で
洗い、無血清のＲＰＭ１１６４０培地（ＧＩＢＧＯ。
Ｇｒａｎｄ ｌ５ｌａｎｄ、 ＮＹ）で洗い、そして１０％ウシ胎児血清を含む
ＲＰＭ１１６４０培地中で３７℃でインキュベートする。トランスフェクトした
細胞を、週に２回、１：２又は１：３に分ける。
別法として、欠失していないＳＩＶｍａｃ２３９を上の方法によりＨ９細胞をト
ランスフェクトすることにより、又は、本質的に上の方法によりマカック属の末
梢血液リンパ球をトランスフェクトすることにより増殖させることが出来る（但
し、その細胞をトランスフェクシヨンに先立って１μｇ ／ ｍ １フイトヘマ
グルチニン（ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ ｌ５ｌａｎｄ、 ＮＹ ）で４８時間刺
激し、トランスフェクション後、１０％インターロイキン２（レクチンフリーの
Ｔ細胞生長因子； Ｅｌｅｃｔｒｏ−Ｎｕｃｌｅｏｎｉｃｓ。
Ｉｎｃ、、Ｆａｆｒｆｉｅｌｄ、ニューンヤージー ） を含む ＲＰＭＩ １
６４０培地中で生長させる）。
一般に、トランスフェクションの７〜１４日後に、細胞を遠心分離（１５００ｇ
、１０分、４℃）により除去し、上清を使い捨ての０．４５ミクロンフィルター
（Ｃｏｒｎｉｎｇ、 Ｃｏｒｎｉｎｇ、 ＮＹ）を通して濾過する。無細胞の上
清を、Ｍ、 Ｄ、 Ｄａｎｉｅｌ等の方法（５ｃｉｅｎｃｅ ２２８：１２０１
゜１９１１５）を用いて、逆転写酵素活性について、又はＧａｇ抗原の量につい
て、抗原捕捉により監視する（ＣＨ１ｔｅｒ１＋＋＋ｍｕｎｏｌｏｇｙ、 Ｈｉ
ａｌｅａｈ、フロリダ）＠無細胞上清（検出可能な逆転写酵素活性及びウィルス
性抗原を有する）をウィルスストックとして保存する。ストックは、液体窒素中
に、長期間（例えば、１〜２年間）にわたって、ウィルスの生存力の有意の損失
を生じることなく保存し得る。
しかしながら、凍結と融解のサイクルはウィルスの感染性を約１０倍減少し得る
。
二久土之１１
ｎｅｆ遺伝子中に不可逆的ヌル変異を含むウィルス又はそのような変異ゲノムを
含むウィルスを、上述の方法を用いて、適当な霊長類細胞（例えば、不滅化Ｈｕ
Ｔ細胞又はＨ９細胞、或は末梢血液リンパ球）をトランスフェクトするため又は
感染させるために用いる。標準的インキュベーション時間（例えば、７〜１４日
間）の後、培養培地を吸引により除去し、細胞をリン酸緩衝塩溶液（１３７ｍＭ
ＮａＣ１，２，７ｍＭＫＣｌ、４．３ｍＭＮａ、ＨＰＯ，・７Ｈｘ ０．１．４
ｍＭＫＨ，ＰＯ，、ｐＨ７，３）で２回洗浄し、そして培地を無細胞ＲＰＭ１１
６４０で置換する。無血清培地中での適当なインキュベーション時間（約１２〜
２４時間）の後、ウィルスを遠心分離により採集し、更に無細胞上清を上記の０
゜４５ミクロンフィルターを通すことにより精製する。ウィルスストックの力価
を標準的技術（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １ｎＨＩＶ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、 Ａ、
Ａｌｄｏｖｉｎｉ及びＢ、 Ｄ、 １ｌａｌｋｅｒＷ、５ｔｏｃｋｔｏｎ Ｐ
ｒｅｓｓ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 ＮＹ）により測定し、必要ならば生理的塩溶
液等の製薬上許容されるキャリアーで希釈し、そして１回の免疫用の投与量とし
て適当なアリコートにて凍結保存する。安定剤（例えば、ＭｇＣｌ２、加水分解
したゼラチン、又はソルビトール）、抗生物質（例λば、ストレプトマイシン又
はネオマイシン）、及びｐＨ指示薬（例えば、フェノールレッド）も又、貯蔵の
直前にワクチンに加えて良い。
ワクチン の ゛
このワクチンの免疫化量（即ち、感染投与量）を任意の標準的方法１例＾ば、筋
肉注射）により投与する。この投与量は少な（とも１２か月の経過にわたって効
果的である。
他の実施態様は下記の請求の範囲内にある６例えば、このゲノムは、上で論じた
１！ユ変異及び感染性に必須でない１つ以上の他のＰＬＶ遺伝子、例えば、ｍ、
Ｕ、又はｖｉｆ（例えば、上述のもの）中の不可逆的ヌル変異又はウィルス複製
に必須でないＬＴＲ配列の欠失がなければ、実質的に、ＰＬＶゲノムと同一であ
る。
−５Ｎ５ Ｐ＋？ ＋″５１′＋５ −： ｈ−〇９ ａｑ Ｃ＋シ −セゼ
へψ彎Ｆ’ｌ！、！？ ｗε？ で〒１ ！？５−チク ！？、乙 か曾９９５
− ＝曾ぶ 祷り！２−二５！シヒ ９＝５ ？セＩＩ ６％−Ｈａシ！＾＾９
亡−号幣 ６ （ｅ セ ９９５−＋ｔｑｑａａｑｑｑｃ【ＪＪＬＩＩｑｑＬＣ
ｅｃａａａｒａａｑａｃｉａｇａｇａｔｅｃｔ＋ｑａｒｃ＋ｑｘｑｑｆｒｅｅ龜
ｃｍｎｅｆ遺伝子中に製造された不可逆的ヌル変異を含み且つ更に１つ以上のＮ
ＲＥ、ｖｐｒ、ｖｐｘ、及び／又はｖｐｕ配列中に不可逆的変異を含み得る霊長
類レンチウィルスの分子クローンを開示する。そのような変異ゲノムを含む無傷
のウィルスをも開示する。これらの感染性の非病原性ウィルスは防御的宿主免疫
応答を引き出すことが出来、従って、ヒト患者においてＡＩＤＳに対する防御を
与えるワクチンとして有用である。
国際調査報告
°″′□Ａ″に＠′＃に、 、、、圃傭
Claims (70)
- １．ｎｅｆ遺伝子中に製造した不可逆的ヌル変異を含む霊長類レンチウイルスの ＤＮＡクローン。
- ２．前記の変異がゲノムｅｎｖ遺伝子配列を無傷で残す、請求項１に記載のＤＮ Ａクローン。
- ３．前記のクローンをヒト免疫不全ウイルスから得る、請求項１に記載のＤＮＡ クローン。
- ４．前記のクローンをＨＩＶ−１のゲノムから得る、請求項３に記載のＤＮＡク ローン。
- ５．前記のクローンをサル免疫不全ウイルスのゲノムから得る、請求項１に記載 のＤＮＡクローン。
- ６．前記のクローンをＳＩＶｍａｃのゲノムから得る、請求項５に記載のＤＮＡ クローン。
- ７．ＡＴＣＣに寄託され、Ｎｏ．６８３６４及びＮｏ．６８３６５と指定された ＤＮＡクローンを含む、請求項６に記載のＤＮＡクローン。
- ８．ＥＲＥ配列中に製造された不可逆的ヌル変異を更に含む、請求項１に記載の ＤＮＡクローン。
- ９．ｖｐｒ遺伝子配列中に製造された不可逆的ヌル変異を更に含む、請求項１に 記載のＤＮＡクローン。
- １０．ｖｐｘ遺伝子配列中に製造された不可逆的ヌル変異を更に含む、請求項１ に記載のＤＮＡクローン。
- １１．ｖｐｕ遺伝子配列中に製造された不可逆的ヌル変異を更に含む、請求項１ に記載のＤＮＡクローン。
- １２．前記のクローンがＳＩＶｍａｃ２３９ΔｎｅｆΔＮＲＥである、請求項６ に記載のＤＮＡクローン。
- １３．前記のクローンがＳＩＶｍａｃ２３９Δ３である、請求項６に記載のＤＮ Ａクローン。
- １４．前記のクローンがＳＩＶｍａｃ２３９Δ４である、請求項６に記載のＤＮ Ａクローン。
- １５．前記のクローンがＨＩＶ−１ΔｎｅｆΔＮＲＥである．請求項４に記載の ＤＮＡクローン。
- １６．前記のクローンがＨＩＶ−１Δ３である、請求項４に配置のＤＮＡクロー ン。
- １７．前記のクローンがＨＩＶ−１Δ４である、請求項４に記載のＤＮＡクロー ン。
- １８．ゲノムがｎｅｆ遺伝子中に製造された不可逆的ヌル変異を含む霊長類レン チウイルス。
- １９．前記のウイルスをヒト免疫不全ウイルスから得る、請求項１８に記載の霊 長類レンチウイルス。
- ２０．前記のウイルスをＨＩＶ−１から得る、請求項１９に記載の霊長類レンチ ウイルス。
- ２１．前記のウイルスをサル免疫不全ウイルスから得る、請求項１８に記載の霊 長類レンチウイルス。
- ２２．前記のウイルスをＳＩＶｍａｃから得る、請求項２１に記載の霊長類レン チウイルス。
- ２３．前記のウイルスをＡＴＣＣに寄託され、Ｎｏ．６８３６４及びＮｏ．６８ ３６５と指定されたＤＮＡクローンから得る、請求項２２に記載の霊長類レンチ ウイルス。
- ２４．前記のゲノムが更にＥＲＥ配列中に製造された不可逆的ヌル変異を含む、 請求項１８に記載の霊長類レンチウイルス。
- ２５．前記のゲノムが更にｖｐｒ遺伝子配列中に製造された不可逆的ヌル変異を 含む、請求項１８に記載の霊長類レンチウイルス。
- ２６．前記のゲノムが更にｖｐｘ遺伝子配列中に製造された不可逆的ヌル変異を 含む、請求項１８に記載の霊長類レンチウイルス。
- ２７．前記のゲノムが更にｖｐｕ遺伝子配列中に製造された不可逆的ヌル変異を 含む、請求項１８に記載の霊長類レンチウイルス。
- ２８．前記のレンチウイルスをＳＩＶｍａｃ２３９ΔｎｅｆΔＮＲＥから得る、 請求項２２に記載の霊長類レンチウイルス。
- ２９．前記のレンチウイルスをＳＩＶｍａｃ２３９Δ３から得る、請求項２２に 記載の霊長類レンチウイルス。
- ３０．前記のレンチウイルスをＳＩＶｍａｃ２３９Δ４から得る、請求項２２に 記載の霊長類レンチウイルス。
- ３１．前記のレンチウイルスをＨＩＶ−１ΔｎｅｆΔＮＲＥから得る、請求項２ ０に記載の霊長類レンチウイルス。
- ３２．前記のレンチウイルスをＨＩＶ−１Δ３から得る、請求項２０に記載の霊 長類レンチウイルス。
- ３３．前記のレンチウイルスをＨＩＶ−１Δ４から得る、請求項２０に記載の霊 長類レンチウイルス。
- ３４．霊長類レンチウイルスに対する防御を与えるワクチンの製造方法であって 、 培養霊長類細胞をｎｅｆ遺伝子の製造された不可逆的ヌル変異を含む霊長類レン チウイルスの核酸でトランスフェクトし、 ゲノムが前記のｎｅｆ遺伝子の変異を含むレンチウイルスを単離し、そして 前記のウイルスを製薬上許容されるワクチンに混合することを含む、前記の製造 方法。
- ３５．前記のレンチウイルスの核酸が更にＮＲＥ配列中に製造された不可逆的ヌ ル変異を含む、請求項３４に記載の方法。
- ３６．前記のレンチウイルスの核酸が更にｖｐｒ遺伝子配列中に製造された不可 逆的ヌル変異を含む、請求項３４に記載の方法。
- ３７．前記のレンチウイルスの核酸が更にｖｐｘ遺伝子配列中に製造された不可 逆的ヌル変異を含む、請求項３４に記載の方法。
- ３８．前記のレンチウイルスの核酸が更にｖｐｕ遺伝子配列中に製造された不可 逆的ヌル変異を含む、請求項３４に記載の方法。
- ３９．ゲノムがｎｅｆ遺伝子中に製造された不可逆的ヌル変異を含む単離した霊 長類レンチウイルス又はそれらの感染性ＤＮＡクローンを製薬上許容されるキャ リアー中に含むワクチン。
- ４０．前記の霊長類レンチウイルスをヒト免疫不全ウイルスから得る、請求項３ ９に記載のワクチン。
- ４１．前記の霊長類レンチウイルスをＨＩＶ−１から得る、請求項４０に記載の ワクチン。
- ４２．前記の霊長類レンチウイルスをサル免疫不全ウイルスから得る、請求項３ ９に記載のワクチン。
- ４３．前記の霊長類レンチウイルスをＳＩＶｍａｃから得る、請求項４２に記載 のワクチン。
- ４４．前記の霊長類レンチウイルスをＡＴＣＣに寄託され、Ｎｏ．６８３６４及 びＮｏ．６８３６５と指定されたＤＮＡクローンから得る、請求項４３に記載の ワクチン。
- ４５．前記の霊長類レンチウイルスゲノムが更にＮＲＥ配列中に製造された不可 逆的ヌル変異を含む、請求項３９に記載のワクチン。
- ４６．前記の霊長類レンチウイルスゲノムが更にｖｐｒ遺伝子配列中に製造され た不可逆的ヌル変異を含む、請求項３９に記載のワクチン。
- ４７．前記の霊長類レンチウイルスゲノムが更にｖｐｘ遺伝子配列中に製造され た不可逆的ヌル変異を含む、請求項３９に記載のワクチン。
- ４８．前記の霊長類レンチウイルスゲノムが更にｖｐｕ遺伝子配列中に製造され た不可逆的ヌル変異を含む、請求項３９に記載のワクチン。
- ４９．前記の霊長類レンチウイルスをＳＩＶｍａｃ２３９ΔｎｅｆΔＮＲＥから 得る、請求項４３に記載のワクチン。
- ５０．前記の霊長類レンチウイルスをＳＩＶｍａｃ２３９Δ３から得る、請求項 ４３に記載のワクチン。
- ５１．前記の霊長類レンチウイルスをＳＩＶｍａｃ２３９Δ４から得る、請求項 ４３に記載のワクチン。
- ５２．前記の霊長類レンチウイルスをＨＩＶ−１ΔｎｅｆΔＮＲＥから得る、請 求項４１に記載のワクチン。
- ５３．前記の霊長類レンチウイルスをＨＩＶ−１Δ３から得る、請求項４１に記 載のワクチン。
- ５４．前記の霊長類レンチウイルスをＨＩＶ−１Δ４から得る、請求項４１に記 載のワクチン。
- ５５．ゲノムがｎｅｆ遺伝子中に製造された不可逆的ヌル変異を含む単離した霊 長類レンチウイルス又はそれらの感染性ＤＮＡクローンを製薬上許容されるキャ リアー中に含むワクチンを患者に投与することを含むワクチン接種の方法。
- ５６．前記の霊長類レンチウイルスをヒト免疫不全ウイルスから得る、請求項５ ５に記載の方法。
- ５７．前記の霊長類レンチウイルスをＨＩＶ−１から得る、請求項５６に記載の 方法。
- ５８．前記の霊長類レンチウイルスをサル免疫不全ウイルスから得る、請求項５ ５に記載の方法。
- ５９．前記の霊長類レンチウイルスをＳＩＶｍａｃから得る、請求項５８に記載 の方法。
- ６０．前記の霊長類レンチウイルスをＡＴＣＣに寄託し、Ｎｏ．６８３６４及び Ｎｏ．６８３６５と指定されたＤＮＡクローンから得る、請求項５９に記載の方 法。
- ６１．前記の霊長類レンチウイルスゲノムが更にＮＲＥ配列中に製造された不可 逆的ヌル変異を含む、請求項５５に記載の方法。
- ６２．前記の霊長類レンチウイルスゲノムが更にｖｐｒ遺伝子配列中に製造され た不可逆的ヌル変異を含む、請求項５５に記載の方法。
- ６３．前記の霊長類レンチウイルスゲノムが更にｖｐｘ遺伝子配列中に製造され た不可逆的ヌル変異を含む、請求項５５に記載の方法。
- ６４．前記の霊長類レンチウイルスゲノムが更にｖｐｕ遺伝子配列中に製造され た不可逆的ヌル変異を含む、請求項５５に記載の方法。
- ６５．前記のレンチウイルスをＳＩＶｍａｃ２３９ΔｎｅｆΔＮＲＥから得る、 請求項５９に記載の方法。
- ６６．前記のレンチウイルスをＳＩＶｍａｃ２３９Δ３から得る、請求項５９に 記載の方法。
- ６７．前記のレンチウイルスをＳＩＶｍａｃ２３９Δ４から得る、請求項５９に 記載の方法。
- ６８．前記のレンチウイルスをＨＩＶ−１ΔｎｅｆΔＮＲＥから得る、請求項５ ７に記載の方法。
- ６９．前記のレンチウイルスをＨＩＶ−１Δ３から得る、請求項５７に記載の方 法。
- ７０．前記のレンチウイルスをＨＩＶ−１Δ４から得る、請求項５７に記載の方 法。
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