CN109715649A - 新型融合蛋白和其用于制备疫苗的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种免疫原性融合蛋白，其至少包含以下两种肽：a)‑在C端侧，由以下构成的第一种肽：‑人类乙型肝炎病毒(HBV)分离株的蛋白S或蛋白M的氨基酸序列，所述蛋白S或蛋白M在其N末端任选地缺失，和b)‑在N端侧，由以下构成的第二种肽：‑寨卡病毒分离株的至少一种蛋白质的至少一个跨膜结构域和胞外域的氨基酸序列，所述寨卡病毒分离株选自包膜蛋白E或包含包膜蛋白E和蛋白质prM的融合肽。

Description

新型融合蛋白和其用于制备疫苗的用途
本发明适用于新型融合蛋白和其用于制备疫苗的用途。
寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)于1947年首次在乌干达的一只猴子中检测出。20世纪70年代在非洲(乌干达、坦桑尼亚、埃及、中非共和国、塞拉利昂、加蓬和塞内加尔)，然后在某些亚洲国家(印度、马来西亚、菲律宾、泰国、越南和印度尼西亚)鉴别出第一批人类病例。
今天已经确认了许多病例，例如2013年与2014年之间在法属波利尼西亚鉴别出55,000例寨卡病毒感染病例。2015年5月，巴西首次检测到寨卡病毒，迄今为止，已报告了440,000与1,500,000例之间的疑似病例。因此，寨卡病毒流行病在过去几年中愈演愈烈，并且世界卫生组织(World Health Organization)在2016年2月特别指示，寨卡病毒构成了国际关注的突发公共卫生事件。
感染寨卡病毒的大多数人没有出现任何症状(大约70％到80％的病例)。在余下人群中，寨卡病毒引起的症状类似于流感症状：疲劳、发烧、头痛以及肌肉和关节疼痛。也可能出现皮疹、结膜炎、眼后疼痛、消化紊乱或甚至手或足水肿，以及严重的感染后神经系统并发症，如吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barrésyndrome)或孕妇胎儿畸形。
目前，没有疫苗可以预防寨卡病毒感染，也没有特效用药来治疗所述感染。
因此，真正地需要提供预防和/或治疗寨卡病毒感染的方法。
特别是，真正地需要提供针对寨卡病毒的疫苗。
因此，本发明的目的之一在于提供预防和/或治疗病毒寨卡感染的方式。
因此，本发明的目的之一在于提供针对寨卡病毒的疫苗。
本发明基于发明人的意外结果，根据所述结果，寨卡-HBV融合蛋白能够形成结构良好并且有效分泌的亚病毒、非感染性和免疫原性颗粒，并且这些颗粒可用于预防和/或治疗寨卡病毒感染。
对这类融合蛋白的兴趣在于预防和/或治疗寨卡病毒感染和/或乙型肝炎病毒感染，即诱导针对寨卡病毒和乙型肝炎病毒的双重免疫。
本发明的另一个兴趣在于它可以很容易地适应现有的目前用于针对乙型肝炎的商业化疫苗的工业制造链。
这就是为什么本发明的目的之一是免疫原性寨卡-HBV融合蛋白。
本发明的另一目的是一种核酸分子，其编码免疫原性寨卡-HBV融合蛋白。
本发明的另一个目的是一种载体，其包含编码免疫原性寨卡-HBV融合蛋白的核酸分子。
本发明的另一个目的是包含至少一种免疫原性寨卡-HBV融合蛋白的亚病毒、非感染性和免疫原性颗粒。
本发明的另一个目的是用作药物的免疫原性寨卡-HBV融合蛋白。
本发明的另一个目的是免疫原性寨卡-HBV融合蛋白，其用于预防和/或治疗乙型肝炎和/或寨卡病毒感染。
本发明的另一个目的是表达包含至少一种免疫原性寨卡-HBV融合蛋白的亚病毒、非感染性和免疫原性颗粒的细胞系。
最后，本发明的另一个目的是生产包含至少一种免疫原性寨卡-HBV融合蛋白的亚病毒、非感染性和免疫原性颗粒的方法。
在一第一实施例中，本发明因此涉及包含至少两个以下肽的免疫原性融合蛋白：
a)-在C端侧，第一种肽由以下构成：
-人类乙型肝炎病毒(HBV)分离株的蛋白S或蛋白M的氨基酸序列，所述蛋白S或蛋白M在其N末端任选地缺失，或者
-与在其N末端任选地缺失的所述蛋白S或所述蛋白M的所述氨基酸序列具有至少91％、特别是至少93％、具体来说至少95％、并且更具体来说至少97％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对所述HBV病毒的免疫原性特性，或，
-来自所述HBV的另一种分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自在其N末端任选地缺失的所述蛋白S或所述蛋白M的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对所述HBV病毒的免疫原性特性，并且
b)-在N端侧，第二种肽由以下构成：
-选自包膜蛋白的寨卡病毒分离株的至少一种蛋白质的至少一个跨膜结构域和胞外域的氨基酸的序列，
-与寨卡病毒分离株的至少一种蛋白质的至少一个跨膜结构域和胞外域的所述氨基酸序列具有至少90％、特别是至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对HBV病毒的免疫原性特性，或
-来自另一种寨卡病毒分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自寨卡病毒分离株的至少一种蛋白质的至少一个跨膜结构域和胞外域的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对寨卡病毒的免疫原性，
所述寨卡病毒分离株的蛋白质选自包膜蛋白E或包含包膜蛋白E和蛋白质prM的融合肽。
表述“融合蛋白”是指任何人工/嵌合蛋白，其至少包含在其N末端任选地缺失的HBV的蛋白S或蛋白M和寨卡病毒分离株的至少一种包膜蛋白E的至少一个跨膜结构域和胞外域。这类融合蛋白的实例呈现于图8、10、12、14、16、18、20和22中。
术语“蛋白S”或“野生型蛋白S”或“S”或“HBs-S(HBV)”是指：
-特别是包含226个氨基酸并且包含四个跨膜结构域的HBV分离株的包膜蛋白(图1)，以及特别是HBVadw分离株的包膜蛋白，或
-与HBV分离株的蛋白S的氨基酸序列具有至少91％的同一性百分比的任何氨基酸序列，或
-所有HBV分离株的蛋白S的天然变体，或所述蛋白S的合成变体。
野生型蛋白S含有四个跨膜结构域，但不含胞外域。它具有抗原环，其对应于位于跨膜结构域2与3之间的氨基酸。野生型蛋白S例如由SEQ ID NO.2表示。
术语“蛋白M”或“野生型蛋白M”或“M”或“HBs-M(HBV)”是指：
-特别是包含281个氨基酸并且包含四个跨膜结构域的HBV分离株的包膜蛋白(图2A和2B)，并且特别是HBVadw分离株的包膜蛋白，或
-与HBV分离株的蛋白M的氨基酸序列具有至少91％的同一性百分比的任何氨基酸序列，或
-所有HBV分离株的蛋白M的天然变体，或所述蛋白M的合成变体。
通过55个额外氨基酸的N末端的存在，蛋白M序列与蛋白S序列不同。这55个氨基酸对应于preS2结构域。
野生型蛋白M含有四个跨膜结构域和一个preS2结构域。野生型蛋白M例如由SEQID NO.4表示。
表述“在其N末端任选地缺失”是指蛋白S或蛋白M的全部(或几乎全部)或部分用于本发明的融合蛋白中。更确切地说：
-如果蛋白S在其N末端没有缺失，那么如上定义的所有(或几乎所有)蛋白S序列用于本发明的融合蛋白中；
-如果蛋白S在其N末端缺失，那么所述蛋白S从位于其N末端的跨膜结构域中缺失，并且在这种情况下称为缺失S。因此在这种情况下，所述蛋白S基本上由位于其C末端的三个跨膜结构域构成。因此，在上面定义的蛋白S中，这也被理解为从HBV分离株的蛋白S的第1位氨基酸到第23位氨基酸的区域的缺失；
-如果蛋白M在其N末端没有缺失，那么如上定义的所有(或几乎所有)蛋白M序列用于本发明的融合蛋白中。在这一特定实施例中，所述蛋白M因此在其preS2结构域中不缺失；
-如果蛋白M在其N末端缺失，那么所述蛋白M从其preS2结构域(即由位于N末端的第1位到第55位的氨基酸构成的结构域)缺失并且在这种情况下被命名为缺失M。因此，所述蛋白M从位于其N末端的1到54个氨基酸的序列中缺失。1到54个氨基酸的序列的缺失应理解为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53和54个氨基酸的缺失。在本发明的一具体实施例中，所述蛋白M从位于其N末端的54个氨基酸的序列中缺失。在这种情况下，尽管缺失，但所述蛋白M因此基本上由其四个跨膜结构域构成。从其preS2结构域完全缺失的蛋白M对应于未缺失的蛋白S。
在其N末端缺失的蛋白S例如由SEQ ID NO.1表示。
在其N末端缺失的蛋白M例如由SEQ ID NO.3表示。
在本发明的一具体实施例中，缺失的氨基酸是连续的。
表述“几乎全部”是指当蛋白S或M存在于根据本发明的融合蛋白中时，其可以从其N或C末端的一些氨基酸中缺失。举例来说，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4的第1位的蛋氨酸(M)可能不存在于根据本发明的融合蛋白序列中。
表述“N末端”应理解为“N端侧”或“N端”。
表述“C末端”应理解为“C端侧”或“C端”。
在根据本发明的融合蛋白中，当所述蛋白S在其N末端缺失时，寨卡病毒分离株的蛋白质的跨膜结构域，特别是包膜蛋白E，取代在HBV蛋白S的N末端缺失的蛋白质。
或者，在根据本发明的融合蛋白中，当所述蛋白S在其N末端未缺失时，寨卡病毒分离株的蛋白质的C末端，并且更具体地说寨卡病毒的包膜蛋白E的第二跨膜结构域与HBV蛋白S的N末端的第一个氨基酸融合。
或者，在根据本发明的融合蛋白中，当所述蛋白M在其N末端缺失时，寨卡病毒分离株的蛋白质的跨膜结构域取代从HBV蛋白M的N端中的1到54个氨基酸中缺失的序列。
或者，在根据本发明的融合蛋白中，当所述蛋白M在其N末端没有缺失时，寨卡病毒分离株的蛋白质的跨膜结构域与HBV蛋白M的N末端处的preS2结构域融合。
表述“人类乙型肝炎病毒的分离株”或“人类HBV的分离株”意指属于家族嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)和原嗜肝DNA病毒属(Orthohepadnavirus)的任何分离株，或由国际病毒分类委员会(the International Committee for the Taxonomy ofViruses，ICTV)分类为与HBV相关的任何分离株[Schaefer S.《乙型肝炎病毒分类和乙型肝炎病毒基因型(Hepatitis B virus taxonomy and hepatitis B virus genotypes)》.《世界胃肠病学杂志(World J Gastroenterol)》.2007年1月7日：13(1)∶14-21]。
在一具体实施例中，上文提到的融合蛋白中的人类HBV分离株是HBVadw分离株。
术语“寨卡病毒分离株”意指属于家族黄病毒科(Flaviviridae)和黄病毒属(genus Flavivirus)，或由国际病毒分类委员会(ICTV)分类为与寨卡病毒关联的任何分离株。
在一具体实施例中，上文提到的融合蛋白中的寨卡病毒分离株是以GenBank登录号KU312312.1描述的分离株(Enfissi等人，《柳叶刀(Lancet)》.2016年1月16日：387(10015)：227-8.Doi：10.1016/S0140-6736(16)00003)。在一具体实施例中，所述寨卡病毒分离株由SEQ ID NO.29表示。
在一具体实施例中，上文提到的融合蛋白中的寨卡病毒分离株是以GenBank登录号KU321639描述的分离株(《在巴西中来自当地传染的寨卡病毒(黄病毒科，黄病毒)的第一全基因组序列(First Complete Genome Sequence of Zika Virus(Flaviviridae，Flavivirus)from an Autochtonous Transmission in Brazil.)》Cunha MS，EspositoDL，Rocco IM，Maeda AY，Vasami FG，Nogueira JS，de Souza RP，Suzuki A，Addas-Carvalho M，Barjas-Castro Mde L，Resende MR，Stucchi RS，Boin Ide F，Katz G，Angerami RN，da Fonseca BA.《基因组通告(Genome Announc.)》2016年3月3日：4(2).Pii：e00032-16.Doi：0.1128/genomeA.00032-16)。在一具体实施例中，所述寨卡病毒分离株由SEQ ID NO.52表示。SEQ ID NO.52用于确定本发明中寨卡的制图。
在本发明的一具体实施例中，寨卡病毒是人类寨卡病毒。
表述“同一性百分比”意指通过确定两个序列共有的核酸或氨基酸残基的数量，然后将其除以两个序列中较长的核酸或氨基酸残基的数量，并且将结果乘以100来直接比较两个序列(核酸或蛋白质)确定的百分比。
表述“至少91％”意指91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％。
表述“至少90％”意指90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％。
表述“保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力”是指任何蛋白质、特别是人类HBV病毒的蛋白S、具体来说从其N末端处的其跨膜结构域缺失的蛋白S、并且更具体来说包含例如在N端缺失的蛋白S的本发明的融合蛋白在野生型蛋白S存在下组装的能力。这也是指野生型蛋白S将其自身组装到丝状或球形亚病毒颗粒中的能力。
任选地从位于其N末端的1到54个氨基酸的序列中缺失的人类HBV病毒的蛋白M也具有在野生型蛋白S存在下组装的能力。
任选地从其N末端的跨膜结构域缺失的寨卡病毒的蛋白E也具有在野生型蛋白S存在下组装的能力。
寨卡病毒的蛋白质prM也具有在野生型蛋白S存在下组装的能力。
所述形成亚病毒颗粒的能力也可以通过观察来证实，特别是通过电子显微镜分析，并且特别是通过实例1和2中提到的测试。
术语“组装(assemble/assembly)”是指蛋白质通过与野生型蛋白S组合形成亚病毒颗粒的能力。术语“自组装”应理解为蛋白质独自形成亚病毒颗粒的能力。
术语“免疫原性/免疫原性特性”意指根据本发明的融合蛋白具有抗原特性并且能够诱导反应或免疫应答。
具体来说，如果在免疫后它诱导抗S和/或抗M体液应答，那么在检测时认为蛋白质对HBV具有免疫原性，例如：
-根据由Huzly等人，2008[Huzly D，Schenk T，Jilg W，Neumann-Haefelin D.《为定量对乙型肝炎病毒表面抗原的抗体应答比较九种商业上可获得的分析(Comparison ofnine commercially available assays for quantification of antibody response tohepatitis B virus surface antigen)》.《临床微生物学杂志J Clin Microbiol)》.2008年4月，46(4)：1298-306]描述的方案，或
-通过进行与由抗HBs抗体揭示相关的免疫印迹(例如，R247抗体，如Jenna，S.，和C.Sureau.《小乙型肝炎病毒包膜蛋白的羧基端结构域中的突变削弱肝炎δ病毒颗粒的组装(Mutations in the carboxyl-terminal domain of the small hepatitis B virusenvelope protein impair the assembly of hepatitis delta virus particles)》.《病毒学杂志(J.Virol)》.1999.73：3351-3358)所提到。这类抗体可以证实根据本发明的更大尺寸的融合蛋白。这类测试允许确定，例如，根据本发明的氨基酸序列或融合蛋白是否保持针对人类HBV的免疫原性特性。
如果在免疫后蛋白质诱导抗E和/或抗prM体液应答，那么在检测时认为蛋白质对寨卡具有免疫原性，例如：
-通过涉及4G2抗体的夹心ELISA测试(克隆D1-4G2-4-15，由Millipore以参考号MAB10216商业化)。这种抗体针对黄病毒抗原，并且因此它允许免疫捕获包含这类抗原的颗粒并且使用免疫酶技术进行检测；或
-通过进行与抗寨卡抗体的揭示相关的免疫印迹，所述抗寨卡抗体由BiofrontTechnologies以参考号BF-1176-56(克隆0302156)商业化。这类测试允许确定，例如，根据本发明的氨基酸序列或融合蛋白是否保持针对寨卡病毒的免疫原性特性。
表述“天然变体”是指单一物种或单一群体的分离株之间的DNA序列、等位基因、蛋白质序列或更一般地任何蛋白质或核酸序列的所有可变性、所有多态性、所有多样性。天然可变性的百分比通过直接比较两个分子(多肽或多核苷酸)(其衍生自野生型参考分子，具有感兴趣的生物学特性，例如免疫原性特性和/或形成亚病毒颗粒的能力)来确定。通过确定两个序列之间相同的氨基酸或核酸残基的确切数目，然后将其除以两个序列中较短的氨基酸或核酸残基的数目并且将结果乘以100来定量。
表述“合成变体”是指通过添加、缺失或取代所述野生型参考分子中的一个或多个核酸或氨基酸而重组野生型参考分子从而衍生的根据本发明的任何多肽分子(氨基酸序列)或多核苷酸分子(核酸序列)，其限制条件是其保持感兴趣的生物学特性，例如免疫原性特性和/或形成亚病毒颗粒的能力。通过直接比较衍生自所述野生型参考分子的所述分子，通过确定两个序列之间相对于其位置和性质相同的氨基酸或核酸残基的精确数目，这两个序列就其位置和性质而言，然后将除以除以两个序列中较短的氨基酸或核酸残基的数目，并且将结果乘以100来确定合成可变性的百分比。
术语“包膜蛋白E”或“野生型包膜蛋白E”或E(寨卡)是指寨卡病毒分离株的结构蛋白，并且特别是指：
-特别地包含504个氨基酸并且由两个跨膜结构域组成的寨卡病毒分离株的蛋白质(图3)，并且特别是具有SEQ ID NO.29或SEQ ID NO.52的寨卡分离株的蛋白质，或
-与寨卡病毒分离株的包膜蛋白E的氨基酸序列呈现至少90％的同一性百分比的任何氨基酸序列，或
-所有寨卡病毒分离株的包膜蛋白E的天然变体，或包膜蛋白E的合成变体。
野生型蛋白E包含2个跨膜结构域和一个胞外域。野生型蛋白E例如由SEQ IDNO.15表示。
在本发明的一个实施例中，在上文提到的融合蛋白中，所述包膜蛋白E包含其两个跨膜结构域。
在本发明的另一个实施例中，在上文提到的融合蛋白中，所述包膜蛋白E仅包含其两个跨膜结构域中的一个。在这种情况下，它总是缺失的E的第二跨膜结构域(即位于其C末端，从第485位到第504位的第二跨膜结构域)。在这种情况下，所述包膜蛋白E被命名为缺失的E。包膜蛋白E的第一跨膜结构域从不参与缺失。
在本发明的一个实施例中，包膜蛋白E的胞外域被理解为第1位氨基酸到第455位氨基酸。
在本发明的一个实施例中，包膜蛋白E的第一跨膜结构域应理解为第456位氨基酸到第484位氨基酸。C端位置的最后七个氨基酸(即第478位到第484位氨基酸)对应于结合第一和第二跨膜结构域的膜外环。
在本发明的一个实施例中，包膜蛋白E的第二跨膜结构域被理解为485位氨基酸到第504位氨基酸。
根据本发明的一特别有利的实施例，包膜蛋白E的跨膜结构域从位于C端位置的最后三个氨基酸中的至少一个中并且特别是从最后三个氨基酸中缺失。C端位置中的三个氨基酸中的至少一个并且特别是最后三个氨基酸的所述缺失呈现使肽酶切割位点失活的优点，这对于寨卡多蛋白的成熟是必需的，但是在本发明的嵌合构建体的范围内不是必需的。
术语“蛋白质prM”或“野生型蛋白质prM”是指寨卡病毒分离株的结构蛋白，并且特别是：
-特别是包含164个氨基酸并且含有两个跨膜结构域的寨卡病毒分离株的蛋白质(图4)，并且特别是来自SEQ ID NO.29或SEQ ID NO.52的寨卡病毒分离株的蛋白质，或
-与寨卡病毒分离株的蛋白质prM的氨基酸序列呈现至少90％的同一性百分比的任何氨基酸序列，或
-所有寨卡病毒分离株的蛋白质prM的天然变体，或蛋白质prM的合成变体。
蛋白质prM在包含根据本发明的融合蛋白的多蛋白中呈其天然形式：蛋白质prM的序列在包含根据本发明的融合蛋白的多蛋白中是完整的。换句话说，蛋白质prM从不从根据本发明的融合蛋白中的一个或两个跨膜结构域中缺失。
野生型蛋白质prM包含2个跨膜结构域和一个胞外域。蛋白质prM由前肽部分和M部分(prM＝前肽(pr)+M)构成。蛋白质pr/M经历两次切割，一次位于前肽与M之间的连接处，第二次位于M与E之间的连接处；这些切割由两个细胞蛋白酶在细胞中组装颗粒之前发生。在本发明中，寻求在含有融合蛋白的多蛋白的情形下产生蛋白质prM，以允许包括于嵌合蛋白中的寨卡包膜蛋白E的正确三维折叠。这种三维折叠对于最小化包括于嵌合蛋白中的寨卡蛋白E的非特异性聚集是必要的，这是一种能够通过蛋白酶体诱导嵌合蛋白过早降解的事件。同样地，在prM的依赖下蛋白E的三维折叠允许包括于嵌合蛋白质中的蛋白E在其用作抗寨卡病毒免疫原的范围内最佳呈递给免疫系统。认为整合蛋白质prM是寨卡蛋白E的伴随蛋白，因为这一功能在关于黄病毒的文献中有描述(Roby JA，Setoh YX，Hall RA，KhromykhAA，J Gen Virol.2015年7月：96(Pt 7)：1551-69.Doi：10.1099/vir.0.000097)。
在本发明的一个实施例中，未切割的蛋白质prM的胞外域被理解为第1位氨基酸到第123位氨基酸。
在本发明的一个实施例中，切割的蛋白质prM的胞外域被理解为第90位氨基酸到第123位氨基酸。
在本发明的一个实施例中，如果第一跨膜结构域还包含与结合第一和第二跨膜结构域的膜外环对应的第144位到第149位氨基酸，那么蛋白质prM的第一跨膜结构域被理解为第124位氨基酸到第143位氨基酸或第124位氨基酸到第149位氨基酸。
在本发明的一个实施例中，蛋白质prM的第二跨膜结构域被理解为第150位氨基酸到第164位氨基酸。
在本发明的一个实施例中，蛋白质prM的前肽部分应理解为第1位氨基酸到第89位氨基酸。因此，前肽部分是胞外域的一部分。
在本发明的一个实施例中，蛋白质prM的M部分应理解为第90位氨基酸到第164位氨基酸。
野生型蛋白质prM例如由SEQ ID NO.50表示。
例如，对使用蛋白质prM的兴趣可以是改善根据本发明的融合蛋白的寻址和/或免疫原性。
本发明还涉及一种融合蛋白，其具有与上文提到的融合蛋白的氨基酸序列呈现至少83％、特别是至少85％、具体来说至少90％并且更具体来说至少95％的同一性百分比的氨基酸序列。
在一具体实施例中，在所述上文提到的融合蛋白中，位于C端侧的第一种肽由以下构成：
-人类HBV分离株的蛋白S的氨基酸序列，所述蛋白S从位于其N末端的其跨膜结构域中缺失，或
-与从位于其N末端的其跨膜结构域缺失的蛋白S的所述氨基酸序列呈现至少91％、特别是至少93％、具体来说至少95％、并且更具体来说至少97％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV的免疫原性特性，或，
-来自人类HBV分离株的另一变体的天然变体的氨基酸序列，或衍生自从位于其N末端的其跨膜结构域中缺失的蛋白S的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV的免疫原性特性。
在另一个具体实施例中，在所述上文提到的融合蛋白中，位于C端侧的第一种肽由以下构成：
-人类HBV分离株的蛋白S的氨基酸序列，所述蛋白S不从位于其N末端的其跨膜结构域中缺失，或
-与不从位于其N末端的其跨膜结构域中缺失的蛋白S的所述氨基酸序列呈现至少91％、特别是至少93％、具体来说至少95％、并且更具体来说至少97％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV的免疫原性特性，或，
-来自人类HBV分离株的另一变体的天然变体的氨基酸序列，或衍生自不从位于其N末端的其跨膜结构域中缺失的蛋白S的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV的免疫原性特性。
在另一个具体实施例中，在所述上文提到的融合蛋白中，位于C端侧的第一种肽由以下构成：
-人类HBV分离株的蛋白M的氨基酸序列，所述蛋白M从位于其N末端的1到54个氨基酸的序列中缺失，或
-与从位于其N末端的1到54个氨基酸的序列中缺失的蛋白M的所述氨基酸序列呈现至少91％、特别是至少93％、具体来说至少95％、并且更具体来说至少97％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV的免疫原性特性，或，
-来自人类HBV分离株的另一变体的天然变体的氨基酸序列，或衍生自从位于其N末端的1到54个氨基酸的序列中缺失的蛋白M的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV的免疫原性特性。
在另一个具体实施例中，在所述上文提到的融合蛋白中，位于C端侧的第一种肽由以下构成：
-人类HBV分离株的蛋白M的氨基酸序列，所述蛋白M不从位于其N末端的1到54个氨基酸的序列中缺失，或
-与不从位于其N末端的1到54个氨基酸的序列中缺失的蛋白M的所述氨基酸序列呈现至少91％、特别是至少93％、具体来说至少95％、并且更具体来说至少97％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV的免疫原性特性，或，-来自人类HBV分离株的另一变体的天然变体的氨基酸序列，或衍生自不从位于其N末端的1到54个氨基酸的序列中缺失的蛋白M的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV的免疫原性特性。
在另一个具体实施例中，在所述上文提到的融合蛋白中，位于N端侧的第二种肽由以下构成：
-寨卡病毒分离株的包膜蛋白E的至少一个跨膜结构域和胞外域的氨基酸序列，或
-与寨卡病毒分离株的包膜蛋白E的至少一个跨膜结构域和胞外域的所述氨基酸序列呈现至少90％、特别是至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对寨卡病毒的免疫原性特性，或
-来自另一种寨卡病毒分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自寨卡病毒分离株的包膜蛋白E的至少一个跨膜结构域和胞外域的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对寨卡病毒的免疫原性特性。
在另一个具体实施例中，在所述上文提到的融合蛋白中，位于N端侧的第二种肽由以下构成：
-仅包含寨卡病毒分离株的包膜蛋白E的两个跨膜结构域之一和胞外域的氨基酸序列，或
-与仅包含寨卡病毒分离株的包膜蛋白E的两个跨膜结构域之一和胞外域的所述氨基酸序列呈现至少90％、特别是至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对寨卡病毒的免疫原性特性，或
-来自另一种寨卡病毒分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自仅包含寨卡病毒分离株的包膜蛋白E的两个跨膜结构域之一和胞外域的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对寨卡病毒的免疫原性特性。
在另一个具体实施例中，在所述上文提到的融合蛋白中，位于N端侧的第二种肽由以下构成：
-包含寨卡病毒分离株的包膜蛋白E的两个跨膜结构域和胞外域的氨基酸序列，或
-与包含寨卡病毒分离株的包膜蛋白E的两个跨膜结构域和胞外域的所述氨基酸序列呈现至少90％、特别是至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对寨卡病毒的免疫原性特性，或
-来自另一种寨卡病毒分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自包含寨卡病毒分离株的包膜蛋白E的两个跨膜结构域和胞外域的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对寨卡病毒的免疫原性特性。
在另一个具体实施例中，在所述上文提到的融合蛋白中，位于N端侧的第二种肽由以下构成：
-融合肽的氨基酸序列，所述融合肽包含寨卡病毒分离株的包膜蛋白E和寨卡病毒分离株的蛋白质prM的至少一个跨膜结构域和胞外域，或
-与所述融合肽的所述氨基酸序列呈现至少90％、特别是至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对寨卡病毒的免疫原性特性，或
-来自另一种寨卡病毒分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自所述融合肽的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对寨卡病毒的免疫原性特性。
在另一个具体实施例中，在所述上文提到的融合蛋白中，位于N端侧的第二种肽由以下构成：
-融合肽的氨基酸序列，所述融合肽包含寨卡病毒分离株的包膜蛋白E和寨卡病毒分离株的蛋白质prM的两个跨膜结构域和胞外域，或
-与所述融合肽的所述氨基酸序列呈现至少90％、特别是至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对寨卡病毒的免疫原性特性，或
-来自另一种寨卡病毒分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自所述融合肽的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对寨卡病毒的免疫原性特性。
在另一个具体实施例中，在所述上文提到的融合蛋白中，位于N端侧的第二种肽由以下构成：
-融合肽的氨基酸序列，所述融合肽仅包含寨卡病毒分离株的包膜蛋白E和寨卡病毒分离株的蛋白质prM的两个跨膜结构域和胞外域中的一者，或
-与所述融合肽的所述氨基酸序列呈现至少90％、特别是至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对寨卡病毒的免疫原性特性，或
-来自另一种寨卡病毒分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自所述融合肽的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对寨卡病毒的免疫原性特性。
在一具体实施例中，本发明涉及免疫原性融合蛋白，其包含至少两种以下肽：
a)-在C端侧，第一种肽由以下构成：
-人类HBV分离株的蛋白S的氨基酸序列，所述蛋白S从位于其N末端的其跨膜结构域中缺失，或
-与从位于其N末端的其跨膜结构域中缺失的蛋白S的所述氨基酸序列呈现至少91％、特别是至少93％、具体来说至少95％、并且更具体来说至少97％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV病毒的免疫原性特性，或
-来自另一种人类HBV病毒分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自从位于其N末端的其跨膜结构域中缺失的蛋白S的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV病毒的免疫原性特性，并且
b)-在N端侧，第二种肽由以下构成：
-仅包含寨卡病毒分离株的包膜蛋白E的两个跨膜结构域之一和胞外域的氨基酸序列，或
-与仅包含寨卡病毒分离株的包膜蛋白E的两个跨膜结构域之一和胞外域的所述氨基酸序列呈现至少90％、特别是至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对寨卡病毒的免疫原性特性，或
-来自另一种寨卡病毒分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自仅包含寨卡病毒分离株的包膜蛋白E的两个跨膜结构域之一和胞外域的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类寨卡病毒的免疫原性特性。
在另一个具体实施例中，本发明涉及免疫原性融合蛋白，其包含至少两种以下肽：
a)-在C端侧，第一种肽由以下构成：
-人类HBV分离株的蛋白S的氨基酸序列，所述蛋白S从位于其N末端的其跨膜结构域中缺失，或
-与从位于其N末端的其跨膜结构域中缺失的蛋白S的所述氨基酸序列呈现至少91％、特别是至少93％、具体来说至少95％、并且更具体来说至少97％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV病毒的免疫原性特性，或
-来自另一种人类HBV病毒分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自从位于其N末端的其跨膜结构域中缺失的蛋白S的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV病毒的免疫原性特性，并且
b)-在N端侧，第二种肽由以下构成：
-融合肽的氨基酸序列，所述融合肽仅包含寨卡病毒分离株的包膜蛋白E和寨卡病毒分离株的蛋白质prM的两个跨膜结构域和胞外域中的一者，或
-与所述融合肽的所述氨基酸序列呈现至少90％、特别是至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对寨卡病毒的免疫原性特性，或
-来自另一种寨卡病毒分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自所述融合肽的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类寨卡病毒的免疫原性特性。
在另一个具体实施例中，本发明涉及免疫原性融合蛋白，其包含至少两种以下肽：
a)-在C端侧，第一种肽由以下构成：
-人类HBV分离株的蛋白S的氨基酸序列，所述蛋白S从位于其N末端的其跨膜结构域中缺失，或
-与从位于其N末端的其跨膜结构域中缺失的蛋白S的所述氨基酸序列呈现至少91％、特别是至少93％、具体来说至少95％、并且更具体来说至少97％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV病毒的免疫原性特性，或
-来自另一种人类HBV病毒分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自从位于其N末端的其跨膜结构域中缺失的蛋白S的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV病毒的免疫原性特性，并且
b)-在N端侧，第二种肽由以下构成：
-包含寨卡病毒分离株的包膜蛋白E的两个跨膜结构域和胞外域的氨基酸序列，或
-与包含寨卡病毒分离株的包膜蛋白E的两个跨膜结构域和胞外域的所述氨基酸序列呈现至少90％、特别是至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对寨卡病毒的免疫原性特性，或
-来自另一种寨卡病毒分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自包含寨卡病毒分离株的包膜蛋白E的两个跨膜结构域和胞外域的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类寨卡病毒的免疫原性特性。
在另一个具体实施例中，本发明涉及免疫原性融合蛋白，其包含至少两种以下肽：
a)-在C端侧，第一种肽由以下构成：
-人类HBV分离株的蛋白S的氨基酸序列，所述蛋白S从位于其N末端的其跨膜结构域中缺失，或
-与从位于其N末端的其跨膜结构域中缺失的蛋白S的所述氨基酸序列呈现至少91％、特别是至少93％、具体来说至少95％、并且更具体来说至少97％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV病毒的免疫原性特性，或
-来自另一种人类HBV病毒分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自从位于其N末端的其跨膜结构域中缺失的蛋白S的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV病毒的免疫原性特性，并且
b)-在N端侧，第二种肽由以下构成：
-融合肽的氨基酸序列，所述融合肽包含寨卡病毒分离株的包膜蛋白E和寨卡病毒分离株的蛋白质prM的两个跨膜结构域和胞外域，或
-与所述融合肽的所述氨基酸序列呈现至少90％、特别是至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对寨卡病毒的免疫原性特性，或
-来自另一种寨卡病毒分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自所述融合肽的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类寨卡病毒的免疫原性特性。
在另一个具体实施例中，本发明涉及免疫原性融合蛋白，其包含至少两种以下肽：
a)-在C端侧，第一种肽由以下构成：
-人类HBV分离株的蛋白S的氨基酸序列，所述蛋白S不从位于其N末端的其跨膜结构域中缺失，或
-与不从位于其N末端的其跨膜结构域中缺失的蛋白S的所述氨基酸序列呈现至少91％、特别是至少93％、具体来说至少95％、并且更具体来说至少97％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV病毒的免疫原性特性，或
-来自另一种人类HBV病毒分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自不从位于其N末端的其跨膜结构域中缺失的蛋白S的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV病毒的免疫原性特性，并且
b)-在N端侧，第二种肽由以下构成：
-融合肽的氨基酸序列，所述融合肽仅包含寨卡病毒分离株的包膜蛋白E的两个跨膜结构域之一和胞外域，或
-与仅包含寨卡病毒分离株的包膜蛋白E的两个跨膜结构域之一和胞外域的所述氨基酸序列呈现至少90％、特别是至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对寨卡病毒的免疫原性特性，或
-来自另一种寨卡病毒分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自仅包含寨卡病毒分离株的包膜蛋白E的两个跨膜结构域之一和胞外域的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类寨卡病毒的免疫原性特性。
在另一个具体实施例中，本发明涉及免疫原性融合蛋白，其包含至少两种以下肽：
a)-在C端侧，第一种肽由以下构成：
-人类HBV分离株的蛋白S的氨基酸序列，所述蛋白S不从位于其N末端的其跨膜结构域中缺失，或
-与不从位于其N末端的其跨膜结构域中缺失的蛋白S的所述氨基酸序列呈现至少91％、特别是至少93％、具体来说至少95％、并且更具体来说至少97％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV病毒的免疫原性特性，或
-来自另一种人类HBV病毒分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自不从位于其N末端的其跨膜结构域中缺失的蛋白S的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV病毒的免疫原性特性，并且
b)-在N端侧，第二种肽由以下构成：
-融合肽的氨基酸序列，所述融合肽仅包含寨卡病毒分离株的包膜蛋白E和寨卡病毒分离株的蛋白质prM的两个跨膜结构域和胞外域中的一者，或
-与所述融合肽的所述氨基酸序列呈现至少90％、特别是至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对寨卡病毒的免疫原性特性，或
-来自另一种寨卡病毒分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自所述融合肽的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类寨卡病毒的免疫原性特性。
在另一个具体实施例中，本发明涉及免疫原性融合蛋白，其包含至少两种以下肽：
a)-在C端侧，第一种肽由以下构成：
-人类HBV分离株的蛋白S的氨基酸序列，所述蛋白S不从位于其N末端的其跨膜结构域中缺失，或
-与不从位于其N末端的其跨膜结构域中缺失的蛋白S的所述氨基酸序列呈现至少91％、特别是至少93％、具体来说至少95％、并且更具体来说至少97％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV病毒的免疫原性特性，或
-来自另一种人类HBV病毒分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自不从位于其N末端的其跨膜结构域中缺失的蛋白S的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV病毒的免疫原性特性，并且
b)-在N端侧，第二种肽由以下构成：
-包含寨卡病毒分离株的包膜蛋白E的两个跨膜结构域和胞外域的氨基酸序列，或
-与包含寨卡病毒分离株的包膜蛋白E的两个跨膜结构域和胞外域的所述氨基酸序列呈现至少90％、特别是至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对寨卡病毒的免疫原性特性，或
-来自另一种寨卡病毒分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自包含寨卡病毒分离株的包膜蛋白E的两个跨膜结构域和胞外域的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类寨卡病毒的免疫原性特性。
在另一个具体实施例中，本发明涉及免疫原性融合蛋白，其包含至少两种以下肽：
a)-在C端侧，第一种肽由以下构成：
-人类HBV分离株的蛋白S的氨基酸序列，所述蛋白S不从位于其N末端的其跨膜结构域中缺失，或
-与不从位于其N末端的其跨膜结构域中缺失的蛋白S的所述氨基酸序列呈现至少91％、特别是至少93％、具体来说至少95％、并且更具体来说至少97％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV病毒的免疫原性特性，或
-来自另一种人类HBV病毒分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自不从位于其N末端的其跨膜结构域中缺失的蛋白S的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV病毒的免疫原性特性，并且
b)-在N端侧，第二种肽由以下构成：
-融合肽的氨基酸序列，所述融合肽包含寨卡病毒分离株的包膜蛋白E和寨卡病毒分离株的蛋白质prM的两个跨膜结构域和胞外域，或
-与所述融合肽的所述氨基酸序列呈现至少90％、特别是至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对寨卡病毒的免疫原性特性，或
-来自另一种寨卡病毒分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自所述融合肽的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类寨卡病毒的免疫原性特性。
在另一个具体实施例中，本发明涉及免疫原性融合蛋白，其包含至少两种以下肽：
a)-在C端侧，第一种肽由以下构成：
-人类HBV分离株的蛋白M的氨基酸序列，所述蛋白M从位于其N末端的1到54个氨基酸的序列中缺失，或
-与从位于其N末端的1到54个氨基酸的序列中缺失的蛋白M的所述氨基酸序列呈现至少91％、特别是至少93％、具体来说至少95％、并且更具体来说至少97％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV病毒的免疫原性特性，或
-来自另一种人类HBV病毒分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自从位于其N末端的1到54个氨基酸的序列中缺失的蛋白M的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV病毒的免疫原性特性，并且
b)-在N端侧，第二种肽由以下构成：
-仅包含寨卡病毒分离株的包膜蛋白E的两个跨膜结构域之一和胞外域的氨基酸序列，或
-与仅包含寨卡病毒分离株的包膜蛋白E的两个跨膜结构域之一和胞外域的所述氨基酸序列呈现至少90％、特别是至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对寨卡病毒的免疫原性特性，或
-来自另一种寨卡病毒分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自仅包含寨卡病毒分离株的包膜蛋白E的两个跨膜结构域之一和胞外域的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类寨卡病毒的免疫原性特性。
在另一个具体实施例中，本发明涉及免疫原性融合蛋白，其包含至少两种以下肽：
a)-在C端侧，第一种肽由以下构成：
-人类HBV分离株的蛋白M的氨基酸序列，所述蛋白M从位于其N末端的1到54个氨基酸的序列中缺失，或
-与从位于其N末端的1到54个氨基酸的序列中缺失的蛋白M的所述氨基酸序列呈现至少91％、特别是至少93％、具体来说至少95％、并且更具体来说至少97％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV病毒的免疫原性特性，或
-来自另一种人类HBV病毒分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自从位于其N末端的1到54个氨基酸的序列中缺失的蛋白M的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV病毒的免疫原性特性，并且
b)-在N端侧，第二种肽由以下构成：
-融合肽的氨基酸序列，所述融合肽仅包含寨卡病毒分离株的包膜蛋白E和寨卡病毒分离株的蛋白质prM的两个跨膜结构域和胞外域中的一者，或
-与所述融合肽的所述氨基酸序列呈现至少90％、特别是至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对寨卡病毒的免疫原性特性，或
-来自另一种寨卡病毒分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自所述融合肽的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类寨卡病毒的免疫原性特性。
在另一个具体实施例中，本发明涉及免疫原性融合蛋白，其包含至少两种以下肽：
a)-在C端侧，第一种肽由以下构成：
-人类HBV分离株的蛋白M的氨基酸序列，所述蛋白M从位于其N末端的1到54个氨基酸的序列中缺失，或
-与从位于其N末端的1到54个氨基酸的序列中缺失的蛋白M的所述氨基酸序列呈现至少91％、特别是至少93％、具体来说至少95％、并且更具体来说至少97％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV病毒的免疫原性特性，或
-来自另一种人类HBV病毒分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自从位于其N末端的1到54个氨基酸的序列中缺失的蛋白M的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV病毒的免疫原性特性，并且
b)-在N端侧，第二种肽由以下构成：
-包含寨卡病毒分离株的包膜蛋白E的两个跨膜结构域和胞外域的氨基酸序列，或
-与包含寨卡病毒分离株的包膜蛋白E的两个跨膜结构域和胞外域的所述氨基酸序列呈现至少90％、特别是至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对寨卡病毒的免疫原性特性，或
-来自另一种寨卡病毒分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自包含寨卡病毒分离株的包膜蛋白E的两个跨膜结构域和胞外域的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类寨卡病毒的免疫原性特性。
在另一个具体实施例中，本发明涉及免疫原性融合蛋白，其包含至少两种以下肽：
a)-在C端侧，第一种肽由以下构成：
-人类HBV分离株的蛋白M的氨基酸序列，所述蛋白M从位于其N末端的1到54个氨基酸的序列中缺失，或
-与从位于其N末端的1到54个氨基酸的序列中缺失的蛋白M的所述氨基酸序列呈现至少91％、特别是至少93％、具体来说至少95％、并且更具体来说至少97％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV病毒的免疫原性特性，或
-来自另一种人类HBV病毒分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自从位于其N末端的1到54个氨基酸的序列中缺失的蛋白M的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV病毒的免疫原性特性，并且
b)-在N端侧，第二种肽由以下构成：
-融合肽的氨基酸序列，所述融合肽仅包含寨卡病毒分离株的包膜蛋白E和寨卡病毒分离株的蛋白质prM的两个跨膜结构域和胞外域中的一者，或
-与所述融合肽的所述氨基酸序列呈现至少90％、特别是至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对寨卡病毒的免疫原性特性，或
-来自另一种寨卡病毒分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自所述融合肽的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类寨卡病毒的免疫原性特性。
在另一个具体实施例中，本发明涉及免疫原性融合蛋白，其包含至少两种以下肽：
a)-在C端侧，第一种肽由以下构成：
-人类HBV分离株的蛋白M的氨基酸序列，所述蛋白M不从位于其N末端的1到54个氨基酸的序列中缺失，或
-与不从位于其N末端的1到54个氨基酸的序列中缺失的蛋白M的所述氨基酸序列呈现至少91％、特别是至少93％、具体来说至少95％、并且更具体来说至少97％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV病毒的免疫原性特性，或
-来自另一种人类HBV病毒分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自不从位于其N末端的1到54个氨基酸的序列中缺失的蛋白M的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV病毒的免疫原性特性，并且
b)-在N端侧，第二种肽由以下构成：
-仅包含寨卡病毒分离株的包膜蛋白E的两个跨膜结构域之一和胞外域的氨基酸序列，或
-与仅包含寨卡病毒分离株的包膜蛋白E的两个跨膜结构域之一和胞外域的所述氨基酸序列呈现至少90％、特别是至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对寨卡病毒的免疫原性特性，或
-来自另一种寨卡病毒分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自仅包含寨卡病毒分离株的包膜蛋白E的两个跨膜结构域之一和胞外域的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类寨卡病毒的免疫原性特性。
在另一个具体实施例中，本发明涉及免疫原性融合蛋白，其包含至少两种以下肽：
a)-在C端侧，第一种肽由以下构成：
-人类HBV分离株的蛋白M的氨基酸序列，所述蛋白M不从位于其N末端的1到54个氨基酸的序列中缺失，或
-与不从位于其N末端的1到54个氨基酸的序列中缺失的蛋白M的所述氨基酸序列呈现至少91％、特别是至少93％、具体来说至少95％、并且更具体来说至少97％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV病毒的免疫原性特性，或
-来自另一种人类HBV病毒分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自不从位于其N末端的1到54个氨基酸的序列中缺失的蛋白M的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV病毒的免疫原性特性，并且
b)-在N端侧，第二种肽由以下构成：
-融合肽的氨基酸序列，所述融合肽仅包含寨卡病毒分离株的包膜蛋白E和寨卡病毒分离株的蛋白质prM的两个跨膜结构域和胞外域中的一者，或
-与所述融合肽的所述氨基酸序列呈现至少90％、特别是至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对寨卡病毒的免疫原性特性，或
-来自另一种寨卡病毒分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自所述融合肽的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类寨卡病毒的免疫原性特性。
在另一个具体实施例中，本发明涉及免疫原性融合蛋白，其包含至少两种以下肽：
a)-在C端侧，第一种肽由以下构成：
-人类HBV分离株的蛋白M的氨基酸序列，所述蛋白M不从位于其N末端的1到54个氨基酸的序列中缺失，或
-与不从位于其N末端的1到54个氨基酸的序列中缺失的蛋白M的所述氨基酸序列呈现至少91％、特别是至少93％、具体来说至少95％、并且更具体来说至少97％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV病毒的免疫原性特性，或
-来自另一种人类HBV病毒分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自不从位于其N末端的1到54个氨基酸的序列中缺失的蛋白M的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV病毒的免疫原性特性，并且
b)-在N端侧，第二种肽由以下构成：
-包含寨卡病毒分离株的包膜蛋白E的两个跨膜结构域和胞外域的氨基酸序列，或
-与包含寨卡病毒分离株的包膜蛋白E的两个跨膜结构域和胞外域的所述氨基酸序列呈现至少90％、特别是至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对寨卡病毒的免疫原性特性，或
-来自另一种寨卡病毒分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自包含寨卡病毒分离株的包膜蛋白E的两个跨膜结构域和胞外域的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类寨卡病毒的免疫原性特性。
在另一个具体实施例中，本发明涉及免疫原性融合蛋白，其包含至少两种以下肽：
a)-在C端侧，第一种肽由以下构成：
-人类HBV分离株的蛋白M的氨基酸序列，所述蛋白M不从位于其N末端的1到54个氨基酸的序列中缺失，或
-与不从位于其N末端的1到54个氨基酸的序列中缺失的蛋白M的所述氨基酸序列呈现至少91％、特别是至少93％、具体来说至少95％、并且更具体来说至少97％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV病毒的免疫原性特性，或
-来自另一种人类HBV病毒分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自不从位于其N末端的1到54个氨基酸的序列中缺失的蛋白M的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV病毒的免疫原性特性，并且
b)-在N端侧，第二种肽由以下构成：
-融合肽的氨基酸序列，所述融合肽包含寨卡病毒分离株的包膜蛋白E和寨卡病毒分离株的蛋白质prM的两个跨膜结构域和胞外域，或
-与所述融合肽的所述氨基酸序列呈现至少90％、特别是至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对寨卡病毒的免疫原性特性，或
-来自另一种寨卡病毒分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自所述融合肽的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类寨卡病毒的免疫原性特性。
在一具体实施例中，本发明涉及上文提到的融合蛋白，所述蛋白还在其N末端(即在第二种肽的N末端)包含另一种肽，其由以下构成：
-寨卡病毒分离株的转移起始肽的氨基酸序列，或
-与寨卡病毒分离株的转移起始肽的所述氨基酸序列呈现至少83％、特别是至少85％、具体来说至少90％、并且更具体来说至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持转移起始肽的特性，
-来自另一种寨卡病毒分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自所述转移起始肽的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持转移起始肽的特性。
在本发明的一具体实施例中，转移起始肽序列对应于编码寨卡病毒的衣壳(核心)蛋白的序列的19个C端氨基酸，并且特别是由SEQ ID NO.25表示。这种转移起始肽(以及因此融合蛋白)的合成由编码衣壳蛋白的序列内部的起始密码子(特别是由SEQ ID NO.27表示)引发，所述起始密码子定位编码这种转移起始肽的第一个密码子之前的17个密码子。有利地，本领域的转移起始肽用于融合蛋白，其寨卡病毒分离株蛋白质包含融合肽，所述融合肽包含包膜蛋白E和蛋白质prM。
在本发明的另一个实施例中，转移起始肽序列对应于prM的第二跨膜结构域，即对应于位于prM的C末端的15个氨基酸，并且特别是由SEQ ID NO.26表示。这种转移起始肽的合成是通过定向诱变起始密码子(特别是由SEQ ID NO.28表示)的引入而引发的，所述起始密码子定位编码这种转移起始肽的第一个密码子之前的9个密码子。有利地，本领域的转移起始肽用于融合蛋白，其寨卡病毒分离株蛋白质仅包含包膜蛋白E。
在上文提到的融合蛋白的N末端插入转移起始肽是特别有利的，因为它将转移起始肽的特性添加到根据本发明的融合肽中。具体来说，这允许本发明共同翻译到内质网，使得其正确地糖酵解，并且其三维构象和/或其抗原品质不存在与野生型蛋白质有关的实质性改变。
在一具体实施例中，本发明涉及上文提到的融合蛋白，其中第一和第二种肽是连续的，并且第二种肽的C末端共价键结到第一种肽的N末端。
在一具体实施例中，上文提到的融合蛋白能够形成球形和/或丝状亚病毒、非感染性和免疫原性颗粒。
在本发明的一具体实施例中，结合肽结合构成上文提到的融合蛋白的第一和第二种肽，所述结合肽由1个氨基酸、或由2个氨基酸、或由3个氨基酸、或由4个氨基酸、或由5个氨基酸构成，其限制条件是所述融合蛋白保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性。
在另一个具体实施例中，本发明涉及上文提到的融合蛋白，其中C端位置的第一种肽由以下构成：
-由位于人类HBV分离株的蛋白S的第24位到第226位的连续氨基酸限定的氨基酸序列，特别是由SEQ ID NO.1表示的氨基酸序列，或
-与从位于其N末端的其跨膜结构域中缺失的蛋白S的所述氨基酸序列呈现至少91％、特别是至少93％、具体来说至少95％、并且更具体来说至少97％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对HBV病毒的免疫原性特性，或，
-来自HBV的另一种分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自从其N末端的其跨膜结构域中缺失的蛋白S的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对HBV病毒的免疫原性特性。
术语“第24位”是指人类HBV的蛋白S的序列的氨基酸24，氨基酸1是N端侧的第一个氨基酸，并且氨基酸226是C端侧的第一个氨基酸。
在另一个具体实施例中，本发明涉及上文提到的融合蛋白，其中C端位置的第一种肽由以下构成：
-由位于人类HBV分离株的蛋白S的第1位到第226位的连续氨基酸限定的氨基酸序列，特别是由SEQ ID NO.2表示的氨基酸序列，或
-与不从位于其N末端的其跨膜结构域中缺失的蛋白S的所述氨基酸序列呈现至少91％、特别是至少93％、具体来说至少95％、并且更具体来说至少97％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对HBV病毒的免疫原性特性，或，
-来自HBV的另一种分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自不从其N末端的其跨膜结构域中缺失的蛋白S的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对HBV病毒的免疫原性特性。
在其N末端不缺失的蛋白S的序列，SEQ ID NO.2对应于蛋白S的完整序列，特别是人类HBVadw分离株的蛋白S。
在另一个具体实施例中，本发明涉及上文提到的融合蛋白，其中C端位置的第一种肽由以下构成：
-由位于人类HBV分离株的蛋白M的第55位到第281位的连续氨基酸限定的氨基酸序列，特别是由SEQ ID NO.3表示的氨基酸序列，或
-与从位于其N末端的1到54个氨基酸的序列中缺失的蛋白M的所述氨基酸序列呈现至少91％、特别是至少93％、具体来说至少95％、并且更具体来说至少97％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对HBV病毒的免疫原性特性，或，
-来自HBV的另一种分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自从位于其N末端的1到54个氨基酸的序列中缺失的蛋白M的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对HBV病毒的免疫原性特性。
在另一个具体实施例中，本发明涉及上文提到的融合蛋白，其中C端位置的第一种肽由以下构成：
-由位于人类HBV分离株的蛋白M的第1位到第281位的连续氨基酸限定的氨基酸序列，特别是由SEQ ID NO.4表示的氨基酸序列，或
-与不从位于其N末端的1到54个氨基酸的序列中缺失的蛋白M的所述氨基酸序列呈现至少91％、特别是至少93％、具体来说至少95％、并且更具体来说至少97％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对HBV病毒的免疫原性特性，或，
-来自HBV的另一种分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自不从位于其N末端的1到54个氨基酸的序列中缺失的蛋白M的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对HBV病毒的免疫原性特性。
不从其N末端处的1到54个氨基酸的序列中缺失的蛋白M的序列，SEQ ID NO.4对应于蛋白M的完整序列，特别是人类HBVadw分离株的蛋白M。
在另一个具体实施例中，本发明涉及上文提到的融合蛋白，其中N端位置的第二种肽由以下构成：
-由位于寨卡病毒分离株的包膜蛋白E的第1位到第484位的连续氨基酸限定的氨基酸序列，特别是由SEQ ID NO.5表示的氨基酸序列，或
-与寨卡病毒分离株的包膜蛋白E的所述氨基酸序列呈现至少90％、特别是至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对寨卡病毒的免疫原性特性，或，
-来自寨卡病毒的另一种分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自寨卡病毒的包膜蛋白E的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对寨卡病毒的免疫原性特性。
在另一个具体实施例中，本发明涉及上文提到的融合蛋白，其中N端位置的第二种肽由以下构成：
-由位于寨卡病毒分离株的包膜蛋白E的第1位到第504位的连续氨基酸限定的氨基酸序列，特别是由SEQ ID NO.15表示的氨基酸序列，或
-与寨卡病毒分离株的包膜蛋白E的所述氨基酸序列呈现至少90％、特别是至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对寨卡病毒的免疫原性特性，或，
-来自寨卡病毒的另一种分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自寨卡病毒的包膜蛋白E的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对寨卡病毒的免疫原性特性。
在另一个具体实施例中，本发明涉及上文提到的融合蛋白，其中N端位置的第二种肽由以下构成：
-融合肽的氨基酸序列，所述融合肽包含位于寨卡病毒分离株的包膜蛋白E的第1位到第484位的连续氨基酸和位于寨卡病毒分离株的蛋白质prM的第1位到第164位的连续氨基酸，所述氨基酸序列特别是由SEQ ID NO.6表示的氨基酸序列，或
-与所述融合肽的所述氨基酸序列呈现至少90％、特别是至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对寨卡病毒的免疫原性特性，或，
-来自寨卡病毒的另一种分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自所述融合肽的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对寨卡病毒的免疫原性特性。
在另一个具体实施例中，本发明涉及上文提到的融合蛋白，其中N端位置的第二种肽由以下构成：
-融合肽的氨基酸序列，所述融合肽包含位于寨卡病毒分离株的包膜蛋白E的第1位到第504位的连续氨基酸和位于寨卡病毒分离株的蛋白质prM的第1位到第164位的连续氨基酸，所述氨基酸序列特别是由SEQ ID NO.16表示的氨基酸序列，或
-与所述融合肽的所述氨基酸序列呈现至少90％、特别是至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对寨卡病毒的免疫原性特性，或，
-来自寨卡病毒的另一种分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自所述融合肽的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对寨卡病毒的免疫原性特性。
在一具体实施例中，例如上文提到的那些的融合蛋白包含以下或由以下构成：
-由SEQ ID NO.7表示的氨基酸序列或
-与所述SEQ ID NO.7呈现至少88％、特别是至少89％、具体来说至少92％、并且更具体来说至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性，或
-衍生自所述SEQ ID NO.7的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性。
如本专利申请的表1中所示，SEQ ID NO.7对应于融合蛋白序列“缺失的E+缺失的S”。SEQ ID NO.7因此对应于SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.1的融合。但是，应该注意到在SEQID NO.7中，SEQ ID NO.5的C端(D，天冬氨酸)中的最后一个氨基酸不存在。这展示使肽酶切割位点失活的优点。这一推理已作必要的修正适用于根据本发明的其它融合蛋白序列。
在一具体实施例中，上文提到的SEQ ID NO.7的融合蛋白也包含位于N端侧上的转移起始肽并且包含以下或由以下构成：
-由SEQ ID NO.17表示的氨基酸序列，或
-与所述SEQ ID NO.17呈现至少83％、特别是至少85％、具体来说至少90％、并且更具体来说至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性，或
-衍生自所述SEQ ID NO.17的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性。
在一具体实施例中，例如上文提到的那些的融合蛋白包含以下或由以下构成：
-由SEQ ID NO.8表示的氨基酸序列，或
-与所述SEQ ID NO.8呈现至少88％、特别是至少89％、具体来说至少92％、并且更具体来说至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性，或
-衍生自所述SEQ ID NO.8的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性。
在一具体实施例中，上文提到的SEQ ID NO.8的融合蛋白也包含位于N端侧上的转移起始肽并且包含以下或由以下构成：
-由SEQ ID NO.18表示的氨基酸序列，或
-与所述SEQ ID NO.18呈现至少83％、特别是至少85％、具体来说至少90％、并且更具体来说至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性，或
-衍生自所述SEQ ID NO.18的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性。
在一具体实施例中，例如上文提到的那些的融合蛋白包含以下或由以下构成：
-由SEQ ID NO.9表示的氨基酸序列，或
-与所述SEQ ID NO.9呈现至少88％、特别是至少89％、具体来说至少92％、并且更具体来说至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性，或
-衍生自所述SEQ ID NO.9的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性。
在一具体实施例中，上文提到的SEQ ID NO.9的融合蛋白也包含位于N端侧上的转移起始肽并且包含以下或由以下构成：
-由SEQ ID NO.19表示的氨基酸序列，或
-与所述SEQ ID NO.19呈现至少83％、特别是至少85％、具体来说至少90％、并且更具体来说至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性，或
-衍生自所述SEQ ID NO.19的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性。
在一具体实施例中，例如上文提到的那些的融合蛋白包含以下或由以下构成：
-由SEQ ID NO.10表示的氨基酸序列，或
-与所述SEQ ID NO.10呈现至少88％、特别是至少89％、具体来说至少92％、并且更具体来说至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性，或
-衍生自所述SEQ ID NO.10的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性。
在一具体实施例中，上文提到的SEQ ID NO.10的融合蛋白也包含位于N端侧上的转移起始肽并且包含以下或由以下构成：
-由SEQ ID NO.20表示的氨基酸序列，或
-与所述SEQ ID NO.20呈现至少83％、特别是至少85％、具体来说至少90％、并且更具体来说至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性，或
-衍生自所述SEQ ID NO.20的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性。
在一具体实施例中，例如上文提到的那些的融合蛋白包含以下或由以下构成：
-由SEQ ID NO.11表示的氨基酸序列，或
-与所述SEQ ID NO.11呈现至少88％、特别是至少89％、具体来说至少92％、并且更具体来说至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性，或
-衍生自所述SEQ ID NO.11的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性。
在一具体实施例中，上文提到的SEQ ID NO.11的融合蛋白也包含位于N端侧上的转移起始肽并且包含以下或由以下构成：
-由SEQ ID NO.21表示的氨基酸序列，或
-与所述SEQ ID NO.21呈现至少83％、特别是至少85％、具体来说至少90％、并且更具体来说至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性，或
-衍生自所述SEQ ID NO.21的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性。
在一具体实施例中，例如上文提到的那些的融合蛋白包含以下或由以下构成：
-由SEQ ID NO.12表示的氨基酸序列，或
-与所述SEQ ID NO.12呈现至少88％、特别是至少89％、具体来说至少92％、并且更具体来说至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性，或
-衍生自所述SEQ ID NO.12的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性。
在一具体实施例中，上文提到的SEQ ID NO.12的融合蛋白也包含位于N端侧上的转移起始肽并且包含以下或由以下构成：
-由SEQ ID NO.22表示的氨基酸序列，或
-与所述SEQ ID NO.22呈现至少83％、特别是至少85％、具体来说至少90％、并且更具体来说至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性，或
-衍生自所述SEQ ID NO.22的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性。
在一具体实施例中，例如上文提到的那些的融合蛋白包含以下或由以下构成：
-由SEQ ID NO.13表示的氨基酸序列，或
-与所述SEQ ID NO.13呈现至少88％、特别是至少89％、具体来说至少92％、并且更具体来说至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性，或
-衍生自所述SEQ ID NO.13的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性。
在一具体实施例中，上文提到的SEQ ID NO.13的融合蛋白也包含位于N端侧上的转移起始肽并且包含以下或由以下构成：
-由SEQ ID NO.23表示的氨基酸序列，或
-与所述SEQ ID NO.23呈现至少83％、特别是至少85％、具体来说至少90％、并且更具体来说至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性，或
-衍生自所述SEQ ID NO.23的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性。
在一具体实施例中，例如上文提到的那些的融合蛋白包含以下或由以下构成：
-由SEQ ID NO.14表示的氨基酸序列，或
-与所述SEQ ID NO.14呈现至少88％、特别是至少89％、具体来说至少92％、并且更具体来说至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性，或
-衍生自所述SEQ ID NO.14的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性。
在一具体实施例中，上文提到的SEQ ID NO.14的融合蛋白也包含位于N端侧上的转移起始肽并且包含以下或由以下构成：
-由SEQ ID NO.24表示的氨基酸序列，或
-与所述SEQ ID NO.24呈现至少83％、特别是至少85％、具体来说至少90％、并且更具体来说至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性，或
-衍生自所述SEQ ID NO.24的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性。
所述SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24在其N末端也包含使所述转移起始肽合成的氨基酸序列(并且特别是SEQ ID NO.27或SEQ ID NO.28的起始序列)。
起始SEQ ID NO.27在根据本发明的融合蛋白包含蛋白质prM时更具体地使用。
起始SEQ ID NO.28在根据本发明的融合蛋白不包含蛋白质prM时更具体地使用。
在第二个实施例中，本发明还涉及编码上文提到的融合蛋白的核酸分子。
表达“核酸分子”是指包含以下的核酸分子：编码在其N末端缺失的人类HBV分离株的蛋白S或蛋白M的至少一个序列和至少编码寨卡病毒分离株的至少一种包膜蛋白E的跨膜结构域和胞外域的至少一个序列，或任何来自上文所定义的分子和在其遗传密码自然变性之后经过修饰的分子。
在本发明的一实施例中，这种核酸分子是杂合体。
在一具体实施例中，编码上文提到的融合蛋白的上文提到的核酸分子包含至少以下两个核酸序列：
a)-在3′侧，第一个构成的核酸序列，其编码人类乙型肝炎病毒(HBV)分离株的蛋白S或蛋白M，所述蛋白S或蛋白M在其N末端任选地缺失，或
-与在其N末端任选地缺失的蛋白S或蛋白M的所述氨基酸序列呈现至少91％、特别是至少93％、具体来说至少95％、并且更具体来说至少97％的同一性百分比的核酸序列，其限制条件是通过所述核酸序列来编码的所述蛋白质保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV的免疫原性特性，或
-来自另一种人类HBV分离株的天然变体的核酸序列，或衍生自在其N末端任选地缺失的蛋白S或蛋白M的所述核酸序列的合成变体的核酸序列，其限制条件是通过所述核酸序列来编码的所述蛋白质保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV的免疫原性特性，以及
b)-在第一序列的5′侧，编码寨卡病毒分离株的至少一种蛋白质的至少一个跨膜结构域和胞外域的第二核酸序列，或
-与编码寨卡病毒分离株的至少一种蛋白质的至少一个跨膜结构域和胞外域的所述氨基酸序列呈现至少90％、特别是至少95％的同一性百分比的核酸序列，其限制条件是通过所述核酸序列来编码的至少一个跨膜结构域和胞外域保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对寨卡病毒的免疫原性特性，或
-来自另一种寨卡分离株的天然变体的核酸序列，或衍生自寨卡病毒分离株的至少一种蛋白质的至少一个跨膜结构域和胞外域的所述核酸序列的合成变体的核酸序列，其限制条件是通过所述核酸序列来编码的至少一个跨膜结构域和胞外域保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对寨卡病毒的免疫原性特性，寨卡病毒分离株的所述蛋白质选自包膜蛋白E或包含包膜蛋白E和蛋白质prM的融合肽。
核酸分子还可以在第二序列的5′侧包含编码转移起始肽的核酸序列。
在另一个具体实施例中，本发明涉及上文提到的核酸分子，其在其5′端(即在第二种肽的5′末端)还包含由以下构成的另一种肽其：
-编码寨卡病毒分离株的转移起始肽的核酸序列，或
-与编码寨卡病毒分离株的转移起始肽的核酸序列呈现至少83％、特别是至少85％、具体来说至少90％、并且更具体来说至少95％的同一性百分比的核酸序列，
-来自另一种寨卡分离株的天然变体的核酸序列，或衍生自编码转移起始肽的所述核酸序列的合成变体的核酸序列，其限制条件是所述核酸序列保持转移起始肽的特性。
在本发明的一具体实施例中，编码转移起始肽的核酸序列对应于编码寨卡病毒的衣壳(核心)蛋白的序列的57个C端核酸，并且特别是由SEQ ID NO.30表示。这种转移起始肽(以及因此融合蛋白)的合成由编码衣壳蛋白的序列内部的起始密码子(特别是由SEQ IDNO.32表示)引发，所述起始密码子定位编码这种转移起始肽的第一个密码子之前的17个密码子。有利地，本领域的转移起始肽用于编码融合蛋白的核酸分子，其寨卡病毒分离株的蛋白质包含融合肽，所述融合肽包含包膜蛋白E和蛋白质prM。
在本发明的另一个实施例中，转移起始肽序列对应于prM的第二跨膜结构域，即对应于位于prM的C末端的45个核酸，并且特别是由SEQ ID NO.31表示。这种转移起始肽的合成是通过定向诱变起始密码子(特别是由SEQ ID NO.33表示)的引入而引发的，所述起始密码子定位编码这种转移起始肽的第一个密码子之前的9个密码子。有利地，本领域的转移起始肽用于编码融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白的寨卡病毒分离株蛋白质仅包含包膜蛋白E。
在本发明的一个实施例中，编码跨膜结构域的核酸序列，特别是编码包膜蛋白E的跨膜结构域的核酸序列从3′位的一个、两个或三个密码子中缺失以使C端位置中一个、两个或三个氨基酸缺失，这呈现使肽酶切割位点失活的优点，这对于寨卡多蛋白的成熟是必需的，但是在本发明的嵌合构建体的范围内不是必需的。
在本发明的另一个实施例中，编码上文提到的免疫原性融合蛋白的上文提到的核酸分子的第一和第二核酸序列是连续的，并且第一核酸序列的5′末端与第二核酸序列的3′末端共价键结。
术语“5′末端”应理解为核酸序列的5′位或5′侧。
术语“3′末端”应理解为核酸序列的3′位或3′侧。
在一具体实施例中，编码上文提到的融合蛋白的所述核酸分子包含以下或由以下构成：
-由SEQ ID NO.34表示的核酸序列，或
-与所述SEQ ID NO.34呈现至少80％、特别是至少85％、具体来说至少90％、并且更具体来说至少95％的同一性百分比的核酸序列，其限制条件是通过所述核酸序列来编码的融合蛋白保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性，或
-衍生自SEQ ID NO.34的合成变体的核酸序列，其限制条件是通过所述核酸序列来编码的所述融合蛋白保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性。
表述“至少80％”意指80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％。
在一具体实施例中，上文所提到的SEQ ID NO.34的核酸分子在5′侧上也包含编码转移起始肽的核酸序列，所述核酸分子包含以下或因此由以下构成：
-由SEQ ID NO.42表示的核酸序列，或
-与所述SEQ ID NO.42呈现至少78％、特别是至少80％、具体来说至少85％、并且更具体来说至少90％的同一性百分比的核酸序列，其限制条件是通过所述核酸序列来编码的所述融合蛋白保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性，或
-衍生自SEQ ID NO.42的合成变体的核酸序列，其限制条件是通过所述核酸序列来编码的所述融合蛋白保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性。
表述“至少78％”意指78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％。
在一具体实施例中，编码上文提到的融合蛋白的所述核酸分子包含以下或由以下构成：
-由SEQ ID NO.35表示的核酸序列，或
-与所述SEQ ID NO.35呈现至少80％、特别是至少85％、具体来说至少90％、并且更具体来说至少95％的同一性百分比的核酸序列，其限制条件是通过所述核酸序列来编码的融合蛋白保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性，或
-衍生自SEQ ID NO.35的合成变体的核酸序列，其限制条件是通过所述核酸序列来编码的所述融合蛋白保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性。
在一具体实施例中，上文所提到的SEQ ID NO.35的核酸分子在5′侧上也包含编码转移起始肽的核酸序列，所述核酸分子包含以下或因此由以下构成：
-由SEQ ID NO.43表示的核酸序列，或
-与所述SEQ ID NO.43呈现至少78％、特别是至少80％、具体来说至少85％、并且更具体来说至少90％的同一性百分比的核酸序列，其限制条件是通过所述核酸序列来编码的所述融合蛋白保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性，或
-衍生自SEQ ID NO.43的合成变体的核酸序列，其限制条件是通过所述核酸序列来编码的所述融合蛋白保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性。
在一具体实施例中，编码上文提到的融合蛋白的所述核酸分子包含以下或由以下构成：
-由SEQ ID NO.36表示的核酸序列，或
-与所述SEQ ID NO.36呈现至少80％、特别是至少85％、具体来说至少90％、并且更具体来说至少95％的同一性百分比的核酸序列，其限制条件是通过所述核酸序列来编码的融合蛋白保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性，或
-衍生自SEQ ID NO.36的合成变体的核酸序列，其限制条件是通过所述核酸序列来编码的所述融合蛋白保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性。
在一具体实施例中，上文所提到的SEQ ID NO.36的核酸分子在5′侧上也包含编码转移起始肽的核酸序列，所述核酸分子包含以下或因此由以下构成：
-由SEQ ID NO.44表示的核酸序列，或
-与所述SEQ ID NO.44呈现至少78％、特别是至少80％、具体来说至少85％、并且更具体来说至少90％的同一性百分比的核酸序列，其限制条件是通过所述核酸序列来编码的所述融合蛋白保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性，或
-衍生自SEQ ID NO.44的合成变体的核酸序列，其限制条件是通过所述核酸序列来编码的所述融合蛋白保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性。
在一具体实施例中，编码上文提到的融合蛋白的所述核酸分子包含以下或由以下构成：
-由SEQ ID NO.37表示的核酸序列，或
-与所述SEQ ID NO.37呈现至少80％、特别是至少85％、具体来说至少90％、并且更具体来说至少95％的同一性百分比的核酸序列，其限制条件是通过所述核酸序列来编码的融合蛋白保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性，或
-衍生自SEQ ID NO.37的合成变体的核酸序列，其限制条件是通过所述核酸序列来编码的所述融合蛋白保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性。
在一具体实施例中，上文所提到的SEQ ID NO.37的核酸分子在5′侧上也包含编码转移起始肽的核酸序列，所述核酸分子包含以下或因此由以下构成：
-由SEQ ID NO.45表示的核酸序列，或
-与所述SEQ ID NO.45呈现至少78％、特别是至少80％、具体来说至少85％、并且更具体来说至少90％的同一性百分比的核酸序列，其限制条件是通过所述核酸序列来编码的所述融合蛋白保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性，或
-衍生自SEQ ID NO.45的合成变体的核酸序列，其限制条件是通过所述核酸序列来编码的所述融合蛋白保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性。
在一具体实施例中，编码上文提到的融合蛋白的所述核酸分子包含以下或由以下构成：
-由SEQ ID NO.38表示的核酸序列，或
-与所述SEQ ID NO.38呈现至少80％、特别是至少85％、具体来说至少90％、并且更具体来说至少95％的同一性百分比的核酸序列，其限制条件是通过所述核酸序列来编码的融合蛋白保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性，或
-衍生自SEQ ID NO.38的合成变体的核酸序列，其限制条件是通过所述核酸序列来编码的所述融合蛋白保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性。
在一具体实施例中，上文所提到的SEQ ID NO.38的核酸分子在5′侧上也包含编码转移起始肽的核酸序列，所述核酸分子包含以下或因此由以下构成：
-由SEQ ID NO.46表示的核酸序列，或
-与所述SEQ ID NO.46呈现至少78％、特别是至少80％、具体来说至少85％、并且更具体来说至少90％的同一性百分比的核酸序列，其限制条件是通过所述核酸序列来编码的所述融合蛋白保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性，或
-衍生自SEQ ID NO.46的合成变体的核酸序列，其限制条件是通过所述核酸序列来编码的所述融合蛋白保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性。
在一具体实施例中，编码上文提到的融合蛋白的所述核酸分子包含以下或由以下构成：
-由SEQ ID NO.39表示的核酸序列，或
-与所述SEQ ID NO.39呈现至少80％、特别是至少85％、具体来说至少90％、并且更具体来说至少95％的同一性百分比的核酸序列，其限制条件是通过所述核酸序列来编码的融合蛋白保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性，或
-衍生自SEQ ID NO.39的合成变体的核酸序列，其限制条件是通过所述核酸序列来编码的所述融合蛋白保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性。
在一具体实施例中，上文所提到的SEQ ID NO.39的核酸分子在5′侧上也包含编码转移起始肽的核酸序列，所述核酸分子包含以下或因此由以下构成：
-由SEQ ID NO.47表示的核酸序列，或
-与所述SEQ ID NO.47呈现至少78％、特别是至少80％、具体来说至少85％、并且更具体来说至少90％的同一性百分比的核酸序列，其限制条件是通过所述核酸序列来编码的所述融合蛋白保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性，或
-衍生自SEQ ID NO.47的合成变体的核酸序列，其限制条件是通过所述核酸序列来编码的所述融合蛋白保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性。
在一具体实施例中，编码上文提到的融合蛋白的所述核酸分子包含以下或由以下构成：
-由SEQ ID NO.40表示的核酸序列，或
-与所述SEQ ID NO.40呈现至少80％、特别是至少85％、具体来说至少90％、并且更具体来说至少95％的同一性百分比的核酸序列，其限制条件是通过所述核酸序列来编码的融合蛋白保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性，或
-衍生自SEQ ID NO.40的合成变体的核酸序列，其限制条件是通过所述核酸序列来编码的所述融合蛋白保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性。
在一具体实施例中，上文所提到的SEQ ID NO.40的核酸分子在5′侧上也包含编码转移起始肽的核酸序列，所述核酸分子包含以下或因此由以下构成：
-由SEQ ID NO.48表示的核酸序列，或
-与所述SEQ ID NO.48呈现至少78％、特别是至少80％、具体来说至少85％、并且更具体来说至少90％的同一性百分比的核酸序列，其限制条件是通过所述核酸序列来编码的所述融合蛋白保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性，或
-衍生自SEQ ID NO.48的合成变体的核酸序列，其限制条件是通过所述核酸序列来编码的所述融合蛋白保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性。
在一具体实施例中，编码上文提到的融合蛋白的所述核酸分子包含以下或由以下构成：
-由SEQ ID NO.41表示的核酸序列，或
-与所述SEQ ID NO.41呈现至少80％、特别是至少85％、具体来说至少90％、并且更具体来说至少95％的同一性百分比的核酸序列，其限制条件是通过所述核酸序列来编码的融合蛋白保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性，或
-衍生自SEQ ID NO.41的合成变体的核酸序列，其限制条件是通过所述核酸序列来编码的所述融合蛋白保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性。
在一具体实施例中，上文所提到的SEQ ID NO.41的核酸分子在5′侧上也包含编码转移起始肽的核酸序列，所述核酸分子包含以下或因此由以下构成：
-由SEQ ID NO.49表示的核酸序列，或
-与所述SEQ ID NO.49呈现至少78％、特别是至少80％、具体来说至少85％、并且更具体来说至少90％的同一性百分比的核酸序列，其限制条件是通过所述核酸序列来编码的所述融合蛋白保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性，或
-衍生自SEQ ID NO.49的合成变体的核酸序列，其限制条件是通过所述核酸序列来编码的所述融合蛋白保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对人类HBV和/或寨卡病毒的免疫原性特性。
所述SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49在其5′末端也包含编码所述转移起始肽的核酸序列(并且特别是SEQ ID NO.32或SEQ ID NO.33的起始序列)。
SEQ ID NO.32的起始序列用于包含编码蛋白质prM的核酸序列的核酸分子。
SEQ ID NO.33的起始序列用于不包含编码蛋白质prM的核酸序列的核酸分子。
在第三个实施例中，本发明还涉及包含上文提到的核酸分子的载体，其编码上文提到的融合蛋白，以及其表达所必需的构件。所述表达所必需的方式可操作地与所述核酸分子结合。
在本发明的一个实施例中，包含在上文提到的部分中的所述核酸分子包含SEQ IDNO.34；SEQ ID NO.35；SEQ ID NO.36；SEQ ID NO.37；SEQ ID NO.38；SEQ ID NO.39；SEQ IDNO.40；SEQ ID NO.41；SEQ ID NO.42；SEQ ID NO.43；SEQ ID NO.44；SEQ ID NO.45；SEQ IDNO.46；SEQ ID NO.47；SEQ ID NO.48和/或SEQ ID NO.49。
表述蛋白质“表达所必需的方式”(术语蛋白质用于任何氨基酸分子，例如蛋白质、融合蛋白、蛋白质片段、肽、多蛋白、多肽等)被理解为允许获得蛋白质，特别是启动子、转录终止子、复制起点、并且优选选择标记的任何方式。表达肽所必需的方式可操作地与编码所述肽(感兴趣的肽)的核酸序列结合。
表达肽所必需的方式可以是同源方式，即包括在所用载体的基因组中，或是异源的。在后一种情况下，所述方式用要表达的感兴趣的肽克隆。
表述“可操作地结合”是指表达所需的所述元件和编码所述肽(感兴趣的肽)的基因的并置，其关系使得其允许其以预期的方式起作用。举例来说，在启动子与目的基因之间可能存在另外的碱基，只要其功能关系得以维持即可。
在一具体实施例中，所述载体选自质粒、慢病毒载体、塞姆利基载体(Semlikivector)、腺病毒、痘病毒、疫苗病毒、杆状病毒(baculovirus)、沙门氏菌细菌载体(Salmonella bacterial vector)和BCG。
在一特别优选实施例中，所述载体是慢病毒载体(lentiviral vector)，特别是pLenti载体。这是先前已描述过的(Naldini，L.，Blomer，U.，Gallay，P.，Ory，D.，Mulligan，R.，Gage，F.H.，Verma，I.M.，和Trono，D.(1996).《通过慢病毒载体的活体内基因传递和稳定的未分裂细胞转导(In vivo gene delivery and stable transduction ofnondividing cells by a lentiviral vector)》.《科学(Science)》272(5259)，263-7)。
在一特别优选实施例中，所述载体是塞姆利基载体。
在一特别优选实施例中，所述载体是衍生自塞姆利基森林病毒(Semliki Forestvirus)基因组的缺陷型病毒载体，特别是pSFV1载体。
这些病毒先前已由Schlesinger，S.，和T.M.Dubensky，Jr.1999.《用于基因表达和疫苗的α病毒载体(Alphavirus vectors for gene expression and vaccines)》.《现代生物技术观点(Curr.Opin.Biotechnol)》.10：434-439描述。
在一具体实施例中，上文提到的载体还包含启动子，特别是异源启动子，选自：
-(i)病毒启动子，例如SV40启动子(猿猴病毒40(simian virus 40))、单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(thymidine-kinase gene of the herpes simplex virus，TK-HSV-1)的启动子、劳氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)的LTR、巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)的启动子和腺病毒主要晚期启动子(major late promoter，MLP)；
-(ii)控制在高等真核生物中编码四种肽的基因转录的任何细胞启动子，例如磷酸甘油酸激酶(phosphoglycerate-kinase，PGK)基因的组成型启动子((Adra等人，1987，《基因(Gene)》，60：65-74))、对α-1抗胰蛋白酶肝脏和FIX具有特异性的基因的启动子以及对平滑肌组织具有特异性的SM22启动子(Moessler等人，1996，《发展(Development)》，122：2415-2425)。
在一优选实施例中，启动子是巨细胞病毒(CMV)的启动子。
在第四实施例中，本发明还涉及包含以下蛋白质的亚病毒、非感染性和免疫原性颗粒：
-由乙型肝炎病毒分离株的表面抗原的野生型结构域S构成的蛋白质，和
-至少一种上文提到的融合蛋白。
在一个实施例中，本发明还涉及包含以下蛋白质的亚病毒、非感染性和免疫原性颗粒：
-由乙型肝炎病毒分离株的表面抗原的野生型结构域S构成的蛋白质，和
-至少一种由以下表示的融合蛋白：SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQID NO.22、SEQ ID NO.23或SEQ ID NO.24。
因此，根据本发明的颗粒结构良好并且有效地分泌，并且能够诱导高品质的抗原应答。
表述“亚病毒、非感染性颗粒”是指丝状或球形颗粒，其由HBV的野生型蛋白S和/或从其N端跨膜结构域中缺失的蛋白S的组装产生，所述颗粒缺乏病毒基因组，并且特别是以非常多的过量合成和分泌，并且可以通过任何方案进行分析，证实不存在对HBV或寨卡具有特异性的核苷酸片段，例如先前描述的PCR或RT-PCR扩增：
-关于寨卡，由[Faye O1，Faye O，Dupressoir A，Weidmann M，Ndiaye M，AlphaSall A.《用于检测寨卡病毒的一步RT-PCR(One-step RT-PCR for detection of Zikavirus)》.《临床病毒学杂志(J Clin Virol.)》2008年9月；43(1)：96-101]；
-关于HBV，由[Thibault V，Pichoud C，Mullen C，Rhoads J，Smith JB，Bitbol A，Thamm S，Zoulim F.《使新型敏感PCR分析特征化以用于定量从患有乙型肝炎病毒感染的患者分离的病毒DNA(Characterization of a new sensitive PCR assay forquantification of viral DNA isolated from patients with hepatitis B virusinfections)》.《临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol.)》2007年12月.45(12)：2948-53]；
而且其结果是否定的。
在第五实施例中，本发明还涉及其用作药物的上文提到的融合蛋白。
本发明还涉及其用作药物的上文提到的亚病毒颗粒。
在优选的实施例中，所述药物是疫苗。
在一个实施例中，本发明还涉及由以下表示的其用作药物的融合蛋白：SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ IDNO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ IDNO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23或SEQ ID NO.24。
在另一个实施例中，本发明还涉及包含以下蛋白质的亚病毒、非感染性和免疫原性颗粒：
-由乙型肝炎病毒分离株的表面抗原的野生型结构域S构成的蛋白质，和
-至少一种由以下表示的其用作药物的融合蛋白：SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23或SEQ ID NO.24。
在一具体实施例中，本发明还涉及包含上文提到的融合蛋白作为活性物质的组合物。
本发明还涉及包含上文提到的亚病毒颗粒作为活性物质的组合物。
在一优选实施例中，所述组合物是疫苗组合物。
在一个实施例中，本发明还涉及包含由以下表示的作为活性物质的融合蛋白：SEQID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ IDNO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ IDNO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23或SEQ ID NO.24。
在另一个实施例中，本发明还涉及包含作为活性物质的包含以下蛋白质的亚病毒、非感染性和免疫原性颗粒的组合物：
-由乙型肝炎病毒分离株的表面抗原的野生型结构域S构成的蛋白质，和
-至少一种由以下表示的融合蛋白：SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQID NO.22、SEQ ID NO.23或SEQ ID NO.24。
在第六实施例中，本发明还涉及上文提到的融合蛋白，其用于预防和/或治疗乙型肝炎和/或寨卡病毒感染。
本发明还涉及上文提到的亚病毒颗粒，其用于预防和/或治疗乙型肝炎和/或寨卡病毒感染。
表述“寨卡病毒感染”被理解为寨卡病毒感染或与寨卡病毒有关的感染。
在一个实施例中，本发明还涉及由以下表示的融合蛋白：SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ IDNO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ IDNO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23或SEQ ID NO.24，其用于预防和/或治疗乙型肝炎和/或寨卡病毒感染。
在另一个实施例中，本发明还涉及包含以下蛋白质的亚病毒、非感染性和免疫原性颗粒：
-由乙型肝炎病毒分离株的表面抗原的野生型结构域S构成的蛋白质，和
-至少一种由以下表示的融合蛋白：SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQID NO.22、SEQ ID NO.23或SEQ ID NO.24
其用于预防和/或治疗乙型肝炎和/或寨卡病毒感染。
在第七实施例中，本发明还涉及表达上文提到的亚病毒、非感染性和免疫原性颗粒的细胞系。
在一个实施例中，本发明还涉及表达包含以下蛋白质的亚病毒、非感染性和免疫原性颗粒的细胞系：
-由乙型肝炎病毒分离株的表面抗原的野生型结构域S构成的蛋白质，和
-至少一种由以下表示的融合蛋白：SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQID NO.22、SEQ ID NO.23或SEQ ID NO.24。
在一具体实施例中，所述细胞系选自：
-酵母，例如来自以下家族的酵母：酵母(Saccharomyces)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)、克鲁维酵母(Kluveromyces)、毕赤酵母(Pichia)、汉逊酵母(Hanseluna)、耶氏酵母(Yarowia)、施氏酵母(Schwaniomyces)、接合酵母(Zygosaccharomyces)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、卡氏酵母(Saccharomycescarlsbergensis)和乳酸克鲁维酵母(Kluveromyces lactis)；
-细菌，例如大肠杆菌和以下家族的细菌：乳酸杆菌(Lactobillicus)、乳球菌(Lactococcus)、沙门氏菌(Salmonella)、链球菌(Streptococcus)、芽孢杆菌(Bacillus)和链霉菌(Streptomyces)。
在一具体实施例中，所述细胞系选自真核细胞，特别是来自动物，如哺乳动物、爬行动物、昆虫和等同物的细胞，并且更具体地说：
-来自中国仓鼠的细胞(CHO细胞)；
-来自猴子的细胞(COS和Vero细胞)；
-来自矮小仓鼠肾脏的细胞(BHK细胞)；
-来自猪肾脏的细胞(PK 15细胞)；
-来自兔肾脏的细胞(RK13细胞)；
-骨肉瘤的人类细胞系(143B细胞)；
-HeLa人类细胞；
-肝细胞瘤的人类细胞系(Hep G2细胞)；
-昆虫细胞系(例如来自草地夜蛾(Spodopterafrugiperda))。
在一特别优选实施例中，所述细胞系是中国仓鼠，称为CHO的卵巢系。有关这方面的更多信息，参见例如Michael ML，PontissoP，Sobczak E，MalpièceY，Streeck RE，Tiollais P.《携带聚合人类血清白蛋白受体的乙型肝炎表面抗原颗粒的动物细胞中的合成(Synthesis in animal cells of hepatitis B surface antigen particlescarrying a receptor for polymerized human serum albumin)》.《美国国家科学院院刊(Proc NatlAcadSci USA.)》1984年12月；81(24)7708-12。
在一特别优选实施例中，所述细胞系是酵母，特别是酿酒酵母(Saccharomycescerevisae)。
在一特别优选实施例中，所述细胞系是来自新生仓鼠肾脏(BHK)的细胞系，并且具体来说是来自新生仓鼠肾脏(BHK-21)的细胞系。有关这方面的更多信息，参见例如GoldmanRD，Follet EA.《BHK-21细胞中双折射丝状细胞器和其在细胞扩散和动力中起的可能作用(Birefringent filamentous organelle in BHK-21cells and its possible role incell spreading and motility)》.《科学》..1970年17日；169(942)：286-8。
在第八实施例中，本发明还涉及一种由上文提到的细胞系产生上文提到的颗粒的方法，所述方法包含以下步骤：
1-用包含编码乙型肝炎病毒分离株的野生型蛋白S的核酸序列的慢病毒载体转导细胞系的细胞的步骤，
2-培养所述细胞以产生能够表达乙型肝炎病毒的野生型包膜的亚病毒颗粒的细胞系的步骤，
3-选择呈现乙型肝炎病毒的野生型包膜的亚病毒颗粒的最佳分泌的克隆的步骤，
4-用上文提到的载体超导所述克隆的步骤，
5-培养所述细胞以产生能够表达上文提到的亚病毒、非感染性和免疫原性颗粒的细胞系的步骤，
6-选择能够最佳分泌上文提到的亚病毒、非感染性和免疫原性颗粒的所述细胞的步骤，
7-培养所述细胞以产生上文提到的亚病毒、非感染性和免疫原性颗粒的步骤，和
8-从收集的培养环境中纯化亚病毒颗粒的步骤(离心、梯度超速离心、嵌合亚病毒颗粒的阳性部分收集、透析)。
表1指示本发明中描述的核酸序列与氨基酸序列之间的对应关系，以及与这些序列相关的基因/蛋白质。
术语“TIP”意指：
-根据本发明的融合蛋白序列中存在起始序列(允许合成转移起始肽)和所述转移起始肽的序列，或
-编码起始序列的序列和编码所述转移起始肽的序列存在于编码根据本发明的融合蛋白的序列中。
SEQ ID NO.34；SEQ ID NO.35；SEQ ID NO.36；SEQ ID NO.37；SEQ ID NO.38；SEQID NO.39；SEQ ID NO.40；SEQ ID NO.41；SEQ ID NO.42；SEQ ID NO.43；SEQ ID NO.44；SEQID NO.45；SEQ ID NO.46；SEQ ID NO.47；SEQ ID NO.48和SEQ ID NO.49在其3′末端具有“taa”终止密码子。
通过以下实例和附图将更好地说明本发明。以下实例旨在阐明本发明的目的并且说明有利的实施例，但决不意图限制本发明的范围。
图例：
图1说明了HBV的野生型蛋白S，其特别包含四个跨膜结构域，由黑色竖直矩形表示；其N末端和C末端朝向内质网(ER)的光。在HBVadw分离株的情况下，这种约45kD的蛋白质包含226个氨基酸残基。
图2A说明了HBV的野生型蛋白M，其特别包含四个跨膜结构域，由黑色竖直矩形表示；其N末端和C末端朝向内质网(ER)的光。在HBVadw分离株的情况下，这种约33kD的蛋白质包含281个氨基酸残基。这一图2A显示了蛋白M的第一跨膜拓扑结构。
图2B说明了HBV的蛋白M，其包含三个跨膜结构域，由黑色竖直三角形表示；其C末端朝向内质网(ER)的光。与图2A不同，N末端朝向胞质溶胶，并且因此，位于N端侧的第一跨膜结构域由黑色水平矩形表示。这一图2B显示了蛋白M的第二种跨膜类型。
图3说明了寨卡病毒的野生型包膜蛋白E，其特别包含两个跨膜结构域，由深灰色竖直矩形表示；其N末端是内质网(ER)的光中，但是朝向胞质溶胶，并且其C末端朝向内质网(ER)的光。这种约54kD的蛋白质包含504个氨基酸残基。
图4说明了寨卡病毒的野生型蛋白质prM，其特别包含两个跨膜结构域，由灰色竖直矩形表示；其N末端是内质网(ER)的光中，但是朝向胞质溶胶，其C末端朝向内质网(ER)的光。这种约18kD的蛋白质包含164个氨基酸残基。还指示蛋白水解切割位点，其允许蛋白质prM的pr部分和M部分被切割。
图5说明了寨卡病毒的某些蛋白质的构型，并且特别是蛋白质prM(pr和M)和包膜蛋白E(E)的衣壳蛋白质(C)相对于膜的构型。
衣壳蛋白(C)在C端侧包含跨膜结构域，由浅灰色竖直矩形表示；其N末端朝向胞质溶胶。
蛋白E和prM如图3和4的图例中所述。
图6说明了合成基因的制图，其允许获得融合肽prM+E，即包含寨卡的包膜蛋白E和蛋白质prM的融合肽。蛋白质C、蛋白质prM和包膜蛋白E的跨膜结构域的位置由短的深灰色箭头表示。
图7说明了合成基因的制图，其允许获得融合蛋白“prM+缺失的E+缺失的S”，即包含蛋白质prM的融合蛋白，从跨膜结构域中缺失的蛋白E和从跨膜结构域中缺失的蛋白S，并且特别是由以下表示的融合蛋白：SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.35或SEQ ID NO.18或SEQ IDNO.43。蛋白质prM和包膜蛋白E的跨膜结构域的位置用短箭头表示(用数字3并且用深灰色指示)。起始序列的位置由数字1指示的深灰色矩形表示，并且转移起始肽的位置由数字2表示的白色箭头表示。
图8说明了融合蛋白“prM+缺失的E+缺失的S”的跨膜拓扑结构，即包含从跨膜结构域中缺失的蛋白质prM、蛋白E和从跨膜结构域中缺失的蛋白S的融合蛋白，特别是由以下表示的融合蛋白：SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.35或SEQ ID NO.18或SEQ ID NO.43。
图9说明了合成基因的制图，其允许获得融合蛋白“prM+E+S”，即包含蛋白质prM、蛋白E和蛋白S的融合蛋白，特别是由以下表示的融合蛋白：SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.37或SEQ ID NO.20或SEQ ID NO.45。蛋白质prM和包膜蛋白E的跨膜结构域的位置由短箭头表示(由数字3并且以深灰色指示)。起始序列的位置由数字1指示的灰色矩形表示，并且转移起始肽的位置由数字2指示的白色箭头表示。
图10说明了融合蛋白“prM+E+S”的跨膜拓扑结构，即包含蛋白质prM、蛋白E和蛋白S的融合蛋白，特别是由以下表示的融合蛋白：SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.37或SEQ IDNO.20或SEQ ID NO.45。
图11说明了合成基因的制图，其允许获得融合蛋白“prM+E+M”，即包含蛋白质prM、蛋白E和蛋白M的融合蛋白，特别是由以下表示的融合蛋白：SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.41或SEQ ID NO.24或SEQ ID NO.49。蛋白质prM和包膜蛋白E的跨膜结构域的位置用短箭头表示(用数字3并且用深灰色指示)。起始序列的位置由数字1指示的灰色矩形表示，并且转移起始肽的位置由数字2指示的白色箭头表示。
图12说明了融合蛋白“prM+E+M”的跨膜拓扑结构，即包含蛋白质prM、蛋白E和蛋白M的融合蛋白，特别是由以下表示的融合蛋白：SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.41或SEQ IDNO.24或SEQ ID NO.49。
图13说明了合成基因的制图，其允许获得融合蛋白“prM+缺失的E+M”，即包含蛋白质prM、从跨膜结构域中缺失的蛋白E和蛋白M的融合蛋白，特别是由以下表示的融合蛋白：SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.39或SEQ ID NO.22或SEQ ID NO.47。蛋白质prM和包膜蛋白E的跨膜结构域的位置用短箭头表示(用数字3并且用深灰色指示)。起始序列的位置由数字1指示的灰色矩形表示，并且转移起始肽的位置由数字2指示的白色箭头表示。
图14说明了融合蛋白“prM+缺失的E+M”的跨膜拓扑结构，即包含蛋白质prM、从跨膜结构域中缺失的蛋白E和蛋白M的融合蛋白，特别是由以下表示的融合蛋白：SEQ IDNO.12或SEQ ID NO.39或SEQ ID NO.22或SEQ ID NO.47。
图15说明了合成基因的制图，其允许获得融合蛋白“缺失的E+缺失的S”，即包含从跨膜结构域中缺失的蛋白E和从跨膜结构域中缺失的蛋白S的融合蛋白，特别是由以下表示的融合蛋白：SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.37或SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.42。包膜蛋白E的跨膜结构域的位置由短箭头表示(由数字3并且以深灰色指示)。起始序列的位置由数字1指示的灰色矩形表示，并且转移起始肽的位置由数字2指示的白色箭头表示。
图16说明融合蛋白“缺失的E+缺失的S”的跨膜拓扑结构，即包含从跨膜结构域中缺失的蛋白E和从跨膜结构域中缺失的蛋白S的融合蛋白，特别是由以下表示的融合蛋白：SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.34或SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.42。
图17说明了合成基因的制图，其允许获得融合蛋白“E+S”，即包含蛋白E和蛋白S的融合蛋白，特别是由以下表示的融合蛋白：SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.36或SEQ ID NO.19或SEQ ID NO.44。包膜蛋白E的两个跨膜结构域的位置由短箭头表示(由数字3并且以深灰色指示)。起始序列的位置由数字1指示的灰色矩形表示，并且转移起始肽的位置由数字2指示的白色箭头表示。
图18说明了融合蛋白“E+S”的跨膜拓扑结构，即包含蛋白E和蛋白S的融合蛋白，特别是由以下表示的融合蛋白：SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.36或SEQ ID NO.19或SEQ IDNO.44。
图19说明了合成基因的制图，其允许获得融合蛋白“E+M”，即包含蛋白E和蛋白M的融合蛋白，特别是由以下表示的融合蛋白：SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.40或SEQ ID NO.23或SEQ ID NO.48。包膜蛋白E的两个跨膜结构域的位置由短箭头表示(由数字3并且以深灰色指示)。起始序列的位置由数字1指示的灰色矩形表示，并且转移起始肽的位置由数字2指示的白色箭头表示。
图20说明融合蛋白“E+M”的跨膜拓扑结构，即包含蛋白E和蛋白M的融合蛋白，特别是由以下表示的融合蛋白：SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.40或SEQ ID NO.23或SEQ IDNO.48。
图21说明了合成基因的制图，其允许获得融合蛋白“缺失的E+M”，即包含从跨膜结构域中缺失的蛋白E和蛋白M的融合蛋白，特别是由以下表示的融合蛋白：SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.38或SEQ ID NO.21或SEQ ID NO.46。包膜蛋白E的两个跨膜结构域的位置由短箭头表示(由数字3并且以深灰色指示)。起始序列的位置由数字1指示的灰色矩形表示，并且转移起始肽的位置由数字2指示的白色箭头表示。
图22说明了融合蛋白“缺失的E+M”的跨膜拓扑结构，即包含从跨膜结构域中缺失的蛋白E和蛋白M的融合蛋白，特别是由以下表示的融合蛋白：SEQ ID NO.11或SEQ IDNO.38或SEQ ID NO.21或SEQ ID NO.46。
图23说明了由质粒pSFV1-HBV-S和/或pSFV1-prM+缺失的E+缺失的S体外转录的RNA转染的细胞的免疫荧光，并且由抗HBV-S抗体(ADRI-2F3)或抗寨卡抗体(D1-4G2-4-15)显示。具体来说，通过识别寨卡病毒的包膜蛋白的抗体或通过识别蛋白质HBV-S(系2)的抗体检测嵌合蛋白HBV-寨卡缺失的E+缺失的S具有相当的功效。这两个荧光信号完全共定位，这表明嵌合蛋白HBV-寨卡缺失的E+缺失的S在其表达过程中不被降解或切割。
图24说明了由质粒pSFV1-HBV-S和/或pSFV1-prM+E+S体外转录的RNA转染的细胞的免疫荧光，并且通过抗HBV-S抗体(ADRI-2F3)或抗寨卡抗体(D1-4G2-4-15)显示。具体地说，通过识别寨卡病毒的包膜蛋白的抗体或通过识别蛋白质HBV-S的抗体检测嵌合蛋白HBV-寨卡-E+S具有相当的功效。这两种荧光信号完全共定位，这表明嵌合蛋白HBV-寨卡-E+S在其表达过程中不会降解或切割。
图25说明了抗寨卡抗体D1-4G2-4-15(A)或抗-HBV-S抗体70-HG15(B)从质粒pSFV1-prM+E+S、pSFV1-HBV-S或pSFV3在体外转录的RNA转染的细胞裂解物上显示的蛋白质印迹。裂解物CHO-S用作阳性对照。在与抗HBV-S抗体一起温育的免疫印迹上特异性地检测到两种乙二醇化形式的蛋白质HBV-S(p24和p27)。嵌合蛋白HBV-寨卡-E+S由两种抗体特异性检测，预期理论大小为80kDa(p80)。这证实了嵌合蛋白HBV-寨卡-E+S的令人满意的产生以及整合，其在其表达过程中不经历切割。
图26说明了抗HBV-S抗体(70-HG15)对由质粒pSFV1-prM+缺失的E+缺失的S和/或pSFV1-HBV-S转录的RNA转染的细胞裂解物揭示的蛋白质印迹。具有预期理论大小75kDa(p75)的嵌合蛋白HBV-寨卡缺失的E+缺失的S的特异性检测显示其在其表达期间未降解或切割。还以其两种糖基化形式(p24和p27)检测到蛋白质HBV-S。
图27对应于差异超速离心表达从质粒pSFV1-prM+E+S和pSFV1-HBV-S体外转录的RNA的细胞的裂解物后收集的级分的ELISA分析(HBV-S检测)。收集富含嵌合颗粒的级分8和9，透析，然后通过负染色观察(图28和29)。
图28对应于透射电子显微镜观察，对从BHK-21细胞中质粒pSFV-1-prM+E+S和pSFV1-HBV-S转录的RNA的共表达纯化的嵌合颗粒进行负染色观察。这些嵌合颗粒以带状和珠状的形式存在，其特征在于HBV包膜蛋白组装的大小和结构(患者R，Hourioux C，SizaretPY，Trassard S，Sureau C，Roingeard P.《病毒学杂志(J Virol.)》2007年4月；81(8)：3842-51)。
图29对应于透射电子显微镜观察，对从BHK-21细胞中质粒pSFV-1-prM+E+S和pSFV1-HBV-S转录的RNA的共表达纯化的嵌合颗粒进行负染色观察。抗寨卡抗体D1-4G2-15的免疫标记(免疫金)证实嵌合蛋白HBV-寨卡-E+S在疫苗颗粒中的有效掺入(在颗粒表面存在金珠，箭头)。
图30说明了通过由pHR′puro-HBV-寨卡-prM+E+S、pHR′puro-HBV-寨卡-prM+缺失的E+缺失的S(克隆1和2)和pHR′puro-HBV-寨卡-prM+E+M(克隆1和2)转导的CHO-S细胞的裂解物上抗HBV-S抗体70-HG15揭示的蛋白质印迹。克隆CHO-S用作阳性对照。
图31说明了通过由pHR′puro-HBV-寨卡-prM+E+S、pHR′puro-HBV-寨卡-prM+缺失的E+缺失的S(克隆1和2)和pHR′puro-HBV-寨卡-prM+E+M(克隆1和2)转导的CHO-S细胞的上清液上抗HBV-S抗体70-HG15揭示的蛋白质印迹。克隆CHO-S用作阳性对照。
实例：
实例1：稳定生成细胞系CHO的克隆中的野生型HBV-S的野生型包膜蛋白S和嵌合蛋白HBV-寨卡
使用基于慢病毒表达载体pHR′的策略稳定转导中国仓鼠的卵巢细胞(CHO)(由Dull等人的《具有条件包装系统的第三代慢病毒载体(A third-generation lentivirusvector with a conditional packaging system)》，1998，《病毒学杂志》，第72卷，第8463-8471页描述)。基于慢病毒表达载体pHR′的策略描述于以下文章中：Patient等人的《嵌合乙型肝炎和丙型肝炎病毒包膜蛋白可以形成亚病毒颗粒：对新疫苗策略的设计的启示(Chimeric Hepatitis B and C viruses envelope proteins can form subviralparticles：implications for the design of new vaccine strategies)》，2009，《新生物技术(New Biotechnology)》，第25卷，第4期，第226-234页。
嵌合HBV-寨卡包膜蛋白的DNA序列转移到质粒pHR′gfp的限制性位点BamH1和/或XHO1(由质粒pHR′构建并且编码GFP作为筛选标记)以产生质粒pHR′gfp-HBV-寨卡。慢病毒在HEK-293T细胞(人胚肾细胞)中生成，保存在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中。
转染前二十四小时，使用3×106个细胞来接种测量为75cm2的培养皿使细胞经质粒pHR′gfp-HBV-寨卡、编码VSV-G(水泡性口炎病毒的包膜糖蛋白)的质粒pHCMVG(以参考pHCMV-G(75497TM)参考于ATCC中)和包装构建体p8.74的等摩尔混合物(各1pmol)通过磷酸钙法转染。
第二天，移除转染溶液并用新鲜的完全培养基替换。
培养24和48小时后，收集上清液，通过具有测量为0.45μm孔隙的低蛋白质结合过滤器(赛多利斯(Sartorius))过滤，并通过在20％蔗糖垫上在4℃下以100,000×g离心90分钟来浓缩。
将残余物再悬浮于500μLPBS中并储存在-80℃下直至使用。
通过定量蛋白质p24(HIV抗原mAb试剂盒，Innogenetics)来测定转导单位(TU)滴度。
在DMEM-F12(由飞世尔科技(Fisher Scientific)商业化)中培养的克隆CHO-S(稳定生成蛋白HBV-S，先前在以下文章中描述：Patient等人的《嵌合乙型肝炎和丙型肝炎病毒包膜蛋白可以形成亚病毒颗粒：对新疫苗策略的设计的启示》，2009，《新生物技术》，第25卷，第4期，第226-234页)经重组慢病毒载体HR′gfp-HBV-寨卡转导。
在转导前一天，使用105个CHO-S细胞/孔来接种六孔细胞培养板
在新鲜的完全培养基中使细胞与载体HR′gfp-HBV-寨卡(感染复数：2.5)和4μg/mL聚凝胺(西格玛(Sigma))一起温育。
转导后三天，细胞以1个细胞/孔的密度接种96孔细胞培养板
温育板3周。
分离并扩增GFP的阳性细胞克隆，名称为CHO-S+寨卡-S或CHO-S+寨卡-M。
用细胞裂解物的蛋白质印迹分析蛋白质HBV-S和嵌合HBV-寨卡的细胞内生成，如先前在以下文章中所描述：Patient等人的《嵌合乙型肝炎和丙型肝炎病毒包膜蛋白可以形成亚病毒颗粒：对新疫苗策略的设计的启示》，2009，《新生物技术》，第25卷，第4期，第226-234页。
在4℃下使膜与多克隆兔抗HBsAg抗体(R247)或针对寨卡包膜蛋白(4G2)的单克隆抗体一起温育一夜。
实例2：稳定共生成包膜蛋白HBV-S和嵌合HBV-寨卡的细胞上清液的分析
通过氯化铯(CsCl)的梯度离心从细胞上清液中纯化分泌的亚病毒包膜颗粒，如先前在以下文章中所描述：Patient等人的《嵌合乙型肝炎和丙型肝炎病毒包膜蛋白可以形成亚病毒颗粒：对新疫苗策略的设计的启示》，2009，《新生物技术》，第25卷，第4期，第226-234页。
总之，澄清200 mL上清液，并且通过添加45％(NH4)2SO4溶液(pH 7.5)来沉淀总蛋白质。
通过在4℃下以10,000×g离心15分钟来收集沉淀物，并将残余物溶解于最小体积的Tris-NaCl-EDTA(TNE)垫(10 mM Tris/HCl pH 7.5/100 mM NaCl/1 mM EDTA)中。
用TNE垫透析溶液，并添加氯化铯直至实现1.22g/cm3密度。
在45Ti转子(贝克曼(Beckman))中以40,000rpm在15℃下进行两个连续的等密度离心循环24小时。
从上面收集级分并使用ELISA测试来测试HBsAg抗原。收集峰级分并在4℃下用TNE垫透析。
如先前所描述，通过负染色电子显微镜和蛋白质印迹来分析最终制备物。
实例3：瞬时生成BKH-21细胞系的克隆中的野生型HBV包膜蛋白S(HBV-S)和嵌合HBV-寨卡蛋白(HBV-寨卡-E+S、HBV-寨卡-E+M或HBV-寨卡缺失的E+缺失的S).
I.1)构建质粒pSFV1-prM+E+S和pSFV1-prM+缺失的E+缺失的S
具有11033pb的双顺反子结构的载体pSFV1(Invitrogen)用于以下构建。此载体具有插入第一顺反子的5′的SP6-ARN聚合酶的启动子序列以通过体外转录来引发具有正极性(RNA命名的42S(+))的完整RNA的合成。在转染到哺乳动物细胞中后，这些加帽重组RNA在存在SFV(塞姆利基森林病毒)的复制酶nsP1-4的情况下体外自我复制，并用于通过名称为26S(+)的中间二级mRNA生成感兴趣的蛋白质。
I.1.1)克隆载体pSFV1中的嵌合蛋白HBV-寨卡-prM+E+S和HBV-寨卡-prM+缺失的E +缺失的S的序列
在质粒pSFV1的BamHI位点处克隆杂交核酸分子的片段，所述质粒预先经此酶线性化。包含本发明的融合蛋白的不同质粒(特别是质粒pSFV1-prM+E+S和pSFV1-prM+缺失的E+缺失的S)通过细菌转化而放大，然后使用苯酚/氯仿用DNA大量制备物纯化。通过酶限制验证插入的方向，并通过测序验证所有构建体。
I.2)通过衍生自SFV的不同构建体的RNA获得瞬时转染的细胞
新生仓鼠肾细胞(BHK-21)培养程序以及基质质粒SFV的体外转录方案和自我复制重组RNA的转染质粒与先前所描述的内容相同[Patient，R.，Hourioux，C.，Sizaret，P.Y.，Trassard，S.，Sureau，C.和Roingeard，P.，(2007)《乙型肝炎病毒亚病毒包膜颗粒形态发生和细胞内运输(Hepatitis B Virus Subviral Envelope Particle Morphogenesis andIntracellular Trafficking)》，《病毒学杂志》，81(8)：3842-51]。表达野生型HBV蛋白S并且先前在前述文章中描述的构建体pSFV-HBV-S用作对照物。
I.3)分析野生型和嵌合包膜蛋白的细胞内生成
用于通过共聚焦显微镜免疫荧光法和蛋白质印迹对感兴趣的蛋白质(特别是HBV-S、HBV-寨卡-E+S和HBV-寨卡缺失的E+缺失的S、HBV-寨卡-E+M等)进行生物化学分析的程序、用于用透射电子显微镜法对转染细胞进行超微结构分析的程序以及用于定量(ELISA)/纯化(蔗糖梯度然后透析)嵌合包膜HBV-寨卡(HBV-寨卡-E+S、HBV-寨卡缺失的E+缺失的S、HBV-寨卡-E+M))的亚病毒颗粒的程序是先前所描述的程序[Patient，R.，Hourioux，C.，Sizaret，P.Y.，Trassard，S.，Sureau，C.和Roingeard，P.，(2007)《乙型肝炎病毒亚病毒包膜颗粒形态发生和细胞内运输》，《病毒学杂志》，81(8)：3842-51]。
用用于蛋白质印迹分析的抗HBV-S抗体70-HG15(interchim)、抗寨卡抗体D1-4G2-15(密理博(millipore))检测蛋白质HBV-S、HBV-寨卡-E+S、HBV-寨卡缺失的E+缺失的S。用用于免疫荧光分析的抗HBV-S抗体ADRI-2F3和抗寨卡抗体D1-4G2-15检测蛋白质HBV-S、HBV-寨卡-E+S、HBV-寨卡缺失的E+缺失的S(Cerino A.等人，2015，10(4)：e0125704)。
I.4)分析培养物上清液
转染后，通过以1500g离心10分钟澄清具有约107个经转染细胞的培养物上清液，然后使用SW41转子(L70 Ultracecentrifuge，贝克曼)以35,000rpm在4℃下超速离心16小时。用50μL裂解垫重悬浮残余物，然后用蛋白质印迹分析。
I.5)生成本发明的融合蛋白HBV-寨卡-E+S和HBV-寨卡缺失的E+缺失的S
在通过包含本发明的杂交核酸分子并且由质粒pSFV1-prM+E+S和pSFV1-prM+缺失的E+缺失的S转录的SFV RNA转染后16小时内，裂解BHK-21细胞然后使用抗体D1-4G2-4-15和70-HG15用蛋白质印迹进行分析。在BHK-21细胞中瞬时生成后，对于蛋白质HBV-寨卡-E+S，检测到融合蛋白HBV-寨卡-E+S和HBV-寨卡缺失的E+缺失S的尺寸为约80kD，并且对于蛋白质HBV-寨卡缺失的E+缺失的S，尺寸为约75kD，即恰好与理论确定的尺寸相当的尺寸。此外，这些结果表明prM和嵌合蛋白之间的裂解是有效的。此外，通过检测本发明的所述融合蛋白与抗HBV-S抗体ADRI-2F3和抗寨卡抗体D1-4G2-15获得的免疫荧光信号的完美共定位显示其在细胞中适当地生成并且在其翻译后不会或仅略微经历内部裂解成其序列(图23、24、25A和B和26)。
为了恢复本发明的不同融合蛋白(HBV-寨卡-E+S和HBV-寨卡缺失的E+缺失的S)的分泌能力，通过向本发明的融合蛋白(HBV-寨卡-E+S和HBV-寨卡-缺失的E+缺失的S)中的每一种提供野生型形式的反式蛋白质HBV-S来进行共转染。转染后十六小时，将共转染的细胞压碎，并通过蔗糖梯度纯化细胞内亚病毒颗粒，然后进行亲和层析[Patient，R.，Hourioux，C.，Sizaret，P.Y.，Trassard，S.，Sureau，C.和Roingeard，P.，(2007)《乙型肝炎病毒亚病毒包膜颗粒形态发生和细胞内运输》，《病毒学杂志》，81(8)：3842-51]。在通过蛋白质HBV-S的特异性ELISA检测并收集富含亚病毒颗粒的级分(图27)之后，用使用抗HBS抗体(70-HG-15)的蛋白质印迹和电子显微镜法研究这些颗粒，并且必要时，使用抗体D1-4G2-1进行免疫检测。抗体如先前在实例I.3中所描述(图26、28和29)。
透射电子显微镜法图像显示，在共生成野生型蛋白质HBV-S与本发明的融合蛋白(HBV-寨卡-E+S和HBV-寨卡-缺失的E+缺失的S)中的一种的所有这些实验中，生成大量球形和丝状亚病毒颗粒(图28)是有可能的。蛋白质印迹分析表明，这些或多或少的丝状亚病毒颗粒富含本发明的融合蛋白(HBV-寨卡-E+S、HBV-寨卡缺失的E+缺失的S)，此外，在图29中呈现的阴性染色上具体观察到的抗体-寨卡免疫染色(免疫金)证实了这一点。
在“SFV”系统中进行的本发明的实施表明，本发明的融合蛋白(HBV-寨卡-E+S和HBV-寨卡-缺失的E+缺失的S)含有几乎全部或全部的聚集到与用于生成针对乙型肝炎的疫苗的亚病毒颗粒相同类型的嵌合亚病毒颗粒中的寨卡病毒的蛋白E，从而促进由本发明纯化所述嵌合亚病毒颗粒，并潜在地开发与针对HBV的疫苗的工业应用完全协调的针对寨卡病毒的疫苗的工业应用。
实例4：在慢病毒系统中从寨卡病毒获得亚病毒包膜粒子
使用基于慢病毒表达载体pHR′的策略稳定转导中国仓鼠卵巢细胞(CHO)(Dull等人，《具有条件封装系统的第三代慢病毒载体(A third-generation lentivirus vectorwith a conditional packaging system)》，1998，《病毒学杂志(Journal ofVirology)》，第72卷，第8463-8471页描述)。基于慢病毒表达载体pHR′的策略描述于以下文章中：Patient等人，《嵌合型肝炎B和C病毒包膜蛋白可以形成亚病毒颗粒：对新疫苗策略的设计的影响(Chimeric Hepatitis B and C viruses envelope proteins can form subviralparticles：implications for the design of new vaccine strategies)》，2009，《新生物技术(New Biotechnology)》，第25卷，第4期，第226-234页。
嵌合包膜蛋白HBV-Zika(prM+E+S、prM+E+M或prM+缺失E+缺失S)的DNA序列被引入线性化质粒pHR，puro的限制性位点Bam H1(由质粒PHR′构建，并将嘌呤霉素编码为选择基因)处以产生嵌合质粒pHR′puro-HBV-寨卡(pHR′puro-HBV-prM+E+S、pHR′puro-HBV-prM+缺失E+缺失S和pHR′puro-HBV-prM+E+M)。慢病毒在HEK-293T细胞(人胚肾细胞)中产生并保存在达尔伯克修饰的伊格尔培养基(Dulbecco′s Modified Eagle Medium；DMEM)中。
转染前24小时，使用3×106个细胞接种测量75cm2的培养皿(Falcon)。使用磷酸钙法，用以下各者的等摩尔混合物(各1pmol)转染细胞：编码VSV-G(水泡性口炎病毒的包膜糖蛋白)的质粒pHCMVG(以在ATCC中以参考pHCMV-G参考(75497TM))的嵌合质粒pHR′puro-HBV-寨卡(pHR′puro-HBV-prM+E+S、pHR′puro-HBV-prM+缺失E+缺失S和pHR′puro-HBV-prM+E+M)和衣壳化构建pCMVR8.74(Addgene，参考编号22036)。
第二天，消除转染溶液并用新鲜的完全培养基替换。
培养24和48小时后，收集上清液，通过具有测量0.45μm的孔的低蛋白质结合过滤器(Sartorius)过滤，并通过在20％蔗糖垫上在4℃下以26,000×g离心90分钟来浓缩。
将残余物再悬浮于500μLPBS中并储存在-80℃直至使用。
通过定量蛋白质p24(HIV抗原mAb试剂盒，Innogenetics)测定转导单位(TU)滴度。
用重组慢病毒载体嵌合HR′puro-HBV-寨卡(获自质粒pHR′puro-HBV-prM+E+S、pHR′puro-HBV-prM+缺失E+缺失S和pHR′puro-HBV-prM+E+M)转导在培养基DMEM-F12(由飞世尔科技公司商业化)中培育的克隆CHO-S(稳定产生蛋白质HBV-S，先前在文章Patient等人，《嵌合型肝炎B和C病毒包膜蛋白可以形成亚病毒颗粒：对新疫苗策略的设计的影响》，2009，《新生物技术》，第25卷，第4期，第226-234页中描述)。
在转导前一天，使用105个CHO-S细胞/孔接种六孔细胞培养板
在新鲜的完全培养基中使细胞与上文所定义的载体嵌合pHR′puro-HBV-寨卡(感染复数：2.5)和4μg/mL的聚凝胺(西格玛)一起培育。
转导后3天，使用细胞以1个细胞/孔的密度接种96孔细胞培养板
将板与嘌呤霉素选择(培养上清液中最终2.5μg/ml)一起培育3周。
自嘌呤霉素选择(称为CHO-S+Zika-prM+E+S、CHO-S+寨卡-prM+缺失E+缺失S或CHO-S+Zika-prM+E+M)分离细胞克隆并扩增。使用人类单克隆抗HB抗体和抗寨卡抗体，利用免疫荧光法分析HBV-S和嵌合HBV-寨卡(HBV-寨卡+E+S、HBV-寨卡缺失的E+缺失S和HBV-寨卡-E+M)的表达，如实例I.3中所述。
用细胞溶解产物的西方墨点法分析蛋白质HBV-S和嵌合HBV-寨卡(HBV-Zika-E+S、HBV-Zika-缺失的E+缺失S和HBV-Zika-E+M)的胞内产生，如先前在文章Patient等人，《嵌合型肝炎B和C病毒包膜蛋白可以形成亚病毒颗粒：对新疫苗策略的设计的影响》，2009，《新生物技术》，第25卷，第4期，第226-234页中描述。
将膜在4℃下与抗HBV-S抗体(70-HG15)或针对寨卡包膜蛋白(D1-4G2-4-15)的单克隆抗体一起培育一夜。对于蛋白质HBV-寨卡-E+S，融合蛋白HBV-寨卡-E+S和HBV-寨卡缺失的E+缺失S的大小约为80kD，并且对于蛋白质HBV-寨卡-缺失E+缺失S约为75kD，并且对于蛋白质HBV-寨卡-E+M为85kD。此外，这些结果表明prM和嵌合蛋白之间的裂解是有效的。基于其糖基化水平，蛋白质HBV-S呈现两种大小，一种形式为24kD(非糖基化)并一种为27kD(糖基化)。这些结果与通过用抗HBV-S抗体(ADRI-2F3)检测来自本发明的所述融合蛋白获得的强免疫荧光相关，表明其正确产生(图30)。
实例5：稳定共同产生包膜蛋白HBV-S和嵌合HBV-寨卡的细胞上清液的分析(HBV-寨卡-E+S，HBV-寨卡-E+M或HBV-寨卡缺失的E+缺失S)
收集上清液，通过具有测量0.45μm的孔的低蛋白质结合过滤器(Sartorius)过滤，并通过在20％蔗糖垫上在4℃下以26,000×g离心90分钟来浓缩。将残余物在悬浮于最小体积的PBS中，然后进行西方墨点分析。抗体70-HG15的培育展示，检测到嵌合蛋白HBV-寨卡，并因此与蛋白质HBV-S共同组装成亚病毒颗粒(图31)。
实例6：嵌合包膜蛋白的细胞内和细胞外产生的分析
通过共聚焦显微镜免疫荧光和西方墨点法对目标蛋白(尤其HBV-Zika-E+S、HBV-Zika缺失的E+缺失S和HBV-Zika-E+M)进行生物化学分析的程序、用透射电子显微镜对转染细胞进行超微结构分析的程序，以及用于定量(ELISA)/纯化(蔗糖梯度，随后亲和性层析法)嵌合包膜HBV-寨卡(HBV-Zika-E+S、HBV-寨卡-缺失E+缺失S和HBV-寨卡-E+M)的亚病毒颗粒的程序针对其对抗寨卡包膜抗体的反应性进行评估。举例来说，由BiofrontTechnologies(http://www.biofronttech.com/)商业化的抗体，如1176家族的抗体(1176-46、1176-56、1176-66、1176-76、1176-86)，或抗体7E5或7G6用于定性分析(免疫荧光、免疫显微镜、电子/免疫金)、使用西方墨点法测试(分析目标蛋白质的大小和其生产水平)的定性和半定性分析，和使用夹心ELISA测试的定量分析，从而允许测定培养上清液中分泌的目标蛋白的数量。使用由公司Absolute antibody(http://absoluteantibody.com)商业化的特异性参考抗体747(4)B7、752-2C8、753(3)C10和747(4)A11通过免疫荧光检测来评估寨卡包膜的蛋白质序列的二聚体构形的检测。用GeneTex(http://www.genetex.com)商业化的抗体GTX133305显着评估产生嵌合蛋白的细胞或嵌合HBV-寨卡的亚病毒嵌合包膜颗粒中蛋白质prM的检测。
实例7：小动物的免疫测定和免疫应答分析：
A.免疫方案
免疫接种在GLP条件(良好的实验室规范)下进行。新西兰兔在所有实验方案，特别是任何先前的免疫测试中均未处理。它们年轻并为雌性，年龄和体重均匀。通过每日临床检查监测动物，监测其死亡率和每周称重。
6只动物的批次经免疫接种每种疫苗制剂，所述疫苗制剂包含嵌合HBV-寨卡蛋白(HBV-寨卡-E+M、HBV-寨卡-E+S和HBV-寨卡缺失的E+缺失S)。一批6只动物用作对照，3只动物仅接受佐剂，并且3只动物接受由商业抗HBV疫苗(仅含HBV-S蛋白的制剂)构成的对照疫苗。进行皮下注射，最大体积不超过1ml。
疫苗接种方案包括在第0天(D0)初始注射，然后在D14天和D28的注射两次辅助剂。每次注射前从动物中取出三份至少5ml的血样；D0的样品在免疫前用作阴性对照(免疫前血清)。
为了完成免疫应答发展动力学的研究，在D42、D56和D70进行取样。每个批次中对抗寨卡和/或抗HBV-S抗体反应最好的两只动物在D70接受第四次疫苗注射，然后在D85放血。
B.分析小动物中诱导的抗寨卡病毒和抗乙型肝炎病毒免疫反应
使用真实寨卡病毒的标准化产物在体外进行免疫应答的分析。与其他黄病毒的交叉中和以与真正的登革热和西尼罗河病毒的制剂相同的方式测量。
1.在Vero细胞上生产标准化的寨卡、登革热和西尼罗河病毒
这三种病毒在BSL3环境(生物安全级别3)中生产。用三种病毒中的每一种感染Vero系( CCL81TM )，并且在3天(寨卡病毒)、4天(西尼罗病毒)至针对登革热病毒的7天范围内的不同时间收集含有病毒的培养物上清液。举例来说，就寨卡病毒而言，使用菌株H/PF/2013(基因银行登录号：KJ776791)感染亚汇合细胞，归因于在缺乏胎牛血清(FBS)的DMEM中MOI(感染复数)为0.01。24小时后，将培养基替换为完全营养培养基(特别是包含10％FBS)。培养3天后，收集这些细胞的上清液，然后以300×g离心澄清，并最后可能在蔗糖梯度上超速离心。可能用特定的定量方法Q-RT-PCR完成，根据Spearman-(G.Archivf.experiment.Pathol.u.Pharmakol.1931；162：480.)描述的方法，利用细胞方法(测定感染50％细胞组织的病毒剂量；TCID50)测定病毒滴度。
2.在小动物中诱导的抗体的反应性的动力学分析。
免疫之前和之后动物的血清用ELISA法给药，以测定它们对寨卡病毒的反应性。为此，使用由EUROIMMUN(euroimmun.com)商业化的ELISA抗寨卡病毒检测试剂盒(IgA/IgG/IgM)免疫捕获兔中的抗寨卡抗体，然后使用与过氧化物酶偶合的抗兔抗体揭露。比色显示和光密度(OD)的读数允许这种抗寨卡响应的演变随时间进行比较(D14和D28、D42、D56、D70)。免疫前血清以及仅用佐剂或商业专用抗HBV接种的动物血清用作对照。
所有兔血清也因其抗HBV反应性而服用。这是使用商业抗HB Architect系统试剂盒(雅培实验室)实现。
3.分析在小动物中引导的抗体对寨卡病毒感染的中和能力
对未获得任何感染之Vero细胞进行接种，24小时之后以2×103个细胞/孔在96孔板上感染。在感染之前，将血清稀释液(例如1/5、1/25、1/125、1/625和1/3125)与根据段落1产生的恒定病毒量(1×103)在37℃一起培育1小时。然后将这些血清+病毒混合物沉积在未处理Vero细胞上，并然后培养72小时。对于病毒+血清稀释混合物的每种感染条件，通过视觉确定细胞病变效应(细胞裂解斑块的存在)来测量细胞层的有效感染。然后考虑三次独立实验的结果以确定中和百分比。根据以下方法定义针对每种血清稀释液测定的中和百分比：当在任何孔中没有检测到单一稀释液的溶菌斑时，确定100％中和；50％中和对应于在50％孔中鉴定到溶菌斑。当所有孔都存在溶菌斑时，中和百分比为0％。对于这些实验，实施不同对照，例如在免疫前血清存在下的病毒预先培育，与仅用佐剂免疫接种的兔血清一起病毒预先培育和在没有与兔血清一起预先培育的情况下用病毒感染细胞层。

Claims (14)

1.一种免疫原性融合蛋白，其包含至少两种以下肽：
a)在C端侧，第一种肽由以下构成：
人类乙型肝炎病毒(HBV)分离株的蛋白S或蛋白M的氨基酸序列，所述蛋白S或蛋白M在其N末端任选地缺失，或者
与在其N末端任选地缺失的所述蛋白S或所述蛋白M的所述氨基酸序列具有至少91％、特别是至少93％、具体来说至少95％、并且更具体来说至少97％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对所述HBV病毒的免疫原性特性，或，
来自所述HBV的另一种分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自在其N末端任选地缺失的所述蛋白S或所述蛋白M的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对所述HBV病毒的免疫原性特性，并且
b)在N端侧，第二种肽由以下构成：
寨卡病毒分离株的至少一种蛋白质的至少一个跨膜结构域和胞外域的氨基酸序列，或
与寨卡病毒分离株的至少一种蛋白质的至少一个跨膜结构域和胞外域的所述氨基酸序列具有至少90％、特别是至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对所述寨卡病毒的免疫原性特性，或
来自所述寨卡病毒的另一种分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自寨卡病毒分离株的至少一种蛋白质的至少一个跨膜结构域和胞外域的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对所述寨卡病毒的免疫原性，
所述寨卡病毒分离株的蛋白质选自包膜蛋白E或包含包膜蛋白E和蛋白质prM的融合肽。
2.根据权利要求1所述的免疫原性融合蛋白，其中所述位于其C端侧的第一种肽由以下构成：
人类HBV分离株的蛋白S的氨基酸序列，所述蛋白S从位于其N末端的其跨膜结构域中缺失，或
与从位于其N末端的其跨膜结构域缺失的所述蛋白S的所述氨基酸序列呈现至少91％、特别是至少93％、具体来说至少95％、并且更具体来说至少97％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对所述人类HBV的免疫原性特性，或，
来自所述人类HBV分离株的另一变体的天然变体的氨基酸序列，或衍生自从位于其N末端的其跨膜结构域中缺失的蛋白S的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对所述人类HBV的免疫原性特性。
3.根据权利要求1所述的免疫原性融合蛋白，其中所述位于其C端侧的第一种肽由以下构成：
人类HBV分离株的蛋白S的氨基酸序列，所述蛋白S不从位于其N末端的其跨膜结构域中缺失，或
与不从位于其N末端的其跨膜结构域中缺失的所述蛋白S的所述氨基酸序列呈现至少91％、特别是至少93％、具体来说至少95％、并且更具体来说至少97％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对所述人类HBV的免疫原性特性，或，
来自所述人类HBV分离株的另一变体的天然变体的氨基酸序列，或衍生自不从位于其N末端的其跨膜结构域中缺失的所述蛋白S的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对所述人类HBV的免疫原性特性。
4.根据权利要求1所述的免疫原性融合蛋白，其中所述位于其C端侧的第一种肽由以下构成：
人类HBV分离株的蛋白M的氨基酸序列，所述蛋白M从位于其N末端的1到54个氨基酸的序列中缺失，或
与从位于其N末端的1到54个氨基酸的序列中缺失的所述蛋白M的所述氨基酸序列呈现至少91％、特别是至少93％、具体来说至少95％、并且更具体来说至少97％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对所述人类HBV的免疫原性特性，或，
来自所述人类HBV分离株的另一变体的天然变体的氨基酸序列，或衍生自从位于其N末端的1到54个氨基酸的序列中缺失的所述蛋白M的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对所述人类HBV的免疫原性特性。
5.根据权利要求1所述的免疫原性融合蛋白，其中所述位于其C端侧的第一种肽由以下构成：
人类HBV分离株的蛋白M的氨基酸序列，所述蛋白M不从位于其N末端的1到54个氨基酸的序列中缺失，或
与不从位于其N末端的1到54个氨基酸的序列中缺失的所述蛋白M的所述氨基酸序列呈现至少91％、特别是至少93％、具体来说至少95％、并且更具体来说至少97％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对所述人类HBV的免疫原性特性，或，
来自所述人类HBV分离株的另一变体的天然变体的氨基酸序列，或衍生自不从位于其N末端的1到54个氨基酸的序列中缺失的所述蛋白M的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对所述人类HBV的免疫原性特性。
6.根据权利要求1所述的免疫原性融合蛋白，其中所述位于其N端侧的第二种肽由以下构成：
寨卡病毒分离株的包膜蛋白E的至少一个跨膜结构域和胞外域的氨基酸序列，或
与寨卡病毒分离株的包膜蛋白E的至少一个跨膜结构域和胞外域的所述氨基酸序列呈现至少90％、特别是至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对所述寨卡病毒的免疫原性特性，或
来自另一种寨卡病毒分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自寨卡病毒分离株的包膜蛋白E的至少一个跨膜结构域和胞外域的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对所述寨卡病毒的免疫原性特性。
7.根据权利要求1所述的免疫原性融合蛋白，其中所述位于其N端侧的第二种肽由以下构成：
融合肽的氨基酸序列，所述融合肽包含寨卡病毒分离株的包膜蛋白E和寨卡病毒分离株的蛋白质prM的至少一个跨膜结构域和胞外域，或
与所述融合肽的所述氨基酸序列具有至少90％，特别是至少95％的同一性百分比的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对所述寨卡病毒的免疫原性，或
来自另一种寨卡病毒分离株的天然变体的氨基酸序列，或衍生自所述融合肽的所述氨基酸序列的合成变体的氨基酸序列，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对所述寨卡病毒的免疫原性特性。
8.根据前述权利要求中任一项所述的免疫原性融合蛋白，其中所述融合蛋白包含以下或由以下构成：
由以下表示的氨基酸序列：
SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.17，或
SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.18，或
SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.19，或
SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.20，或
SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.21，或
SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.22，或
SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.23，或
SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.24，或
与以下呈现至少88％，特别是至少89％，特别是至少92％，且更特别是至少95％的同一性百分比的氨基酸序列：所述SEQ ID NO7、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.18、SEQID NO.9、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.21、SEQID NO.12、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.24，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对所述人类HBV和/或所述寨卡病毒的免疫原性特性，或
衍生自以下的合成变体的氨基酸序列：所述SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.17、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.20、SEQ IDNO.11、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.23、SEQ IDNO.14、SEQ ID NO.24，其限制条件是所述氨基酸序列保持形成亚病毒、非感染性颗粒的能力和/或针对所述人类HBV和/或所述寨卡病毒的免疫原性特性。
9.一种核酸分子，其编码根据权利要求1到8中任一项所述的融合蛋白。
10.一种载体，其包含根据权利要求9所述的核酸分子以及其表达所必需的构件。
11.一种亚病毒、非感染性和免疫原性颗粒，其包含以下蛋白质：
由乙型肝炎病毒分离株的表面抗原的野生型结构域S构成的蛋白质，和
至少一种根据权利要求1到8中任一项所述的融合蛋白。
12.根据权利要求1到8中任一项所述的融合蛋白，其用作药物，特别是作为疫苗。
13.根据权利要求1到8中任一项所述的融合蛋白，其用于预防和/或治疗乙型肝炎和/或寨卡病毒感染。
14.一种细胞系，其表达根据权利要求11所述的亚病毒、非感染性和免疫原性颗粒。
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